JP3098050B2 - 作用物質のデリバリー - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、標的部位に結合させる
ための、活性物質の標的部位へのデリバリーに関する。
作用物質は通常治療薬物質であるが、化粧品物質であっ
てもよい。
ための、活性物質の標的部位へのデリバリーに関する。
作用物質は通常治療薬物質であるが、化粧品物質であっ
てもよい。
【０００２】
【発明の背景】治療薬物質としてグルコースオキシダー
ゼを使用する場合、前記治療薬物質を標的部位に付着さ
せるために抗体を使用することは既に提案されている。
この酵素は分子状酸素によるグルコースからグルコン酸
への酸化を促進してその過程で過酸化水素を発生させ
る。
ゼを使用する場合、前記治療薬物質を標的部位に付着さ
せるために抗体を使用することは既に提案されている。
この酵素は分子状酸素によるグルコースからグルコン酸
への酸化を促進してその過程で過酸化水素を発生させ
る。
【０００３】過酸化水素はインビボにおいて急速に分解
するが、過酸化水素が標的細胞に接近すると該細胞に毒
性を与える。
するが、過酸化水素が標的細胞に接近すると該細胞に毒
性を与える。
【０００４】
【従来の技術】Knowles らは、J. Clinical Investigat
ion ，52，1443(1973)において、標的細胞に結合し得る
抗体に化学的に接合(conjugate) したグルコースオキシ
ダーゼを使用して、選択性を除去したい細胞に対する細
胞破壊活性をターゲットすることを記載している。しか
しながら、他の（非標的）酵素が毒性のより強い種を発
生させるために周囲の媒体中に存在している場合にの
み、細胞破壊が達成される。
ion ，52，1443(1973)において、標的細胞に結合し得る
抗体に化学的に接合(conjugate) したグルコースオキシ
ダーゼを使用して、選択性を除去したい細胞に対する細
胞破壊活性をターゲットすることを記載している。しか
しながら、他の（非標的）酵素が毒性のより強い種を発
生させるために周囲の媒体中に存在している場合にの
み、細胞破壊が達成される。
【０００５】Okuda らは、Infection and Immunity，2
7，690(1980) においてKnowles らの研究の続編を記載
している。Okuda らは、標的細胞に対する抗体に化学的
に接合２種の酵素を使用した。酵素は、ペルオキシドよ
りもむしろスーパーオキシドを少なくとも優先的に形成
するキサンチンオキシダーゼとラクトペルオキシダーゼ
であった。インビトロにおいて、90分経過すると、生き
たCandida albicans細胞の減数が見られ、この結果はラ
クトペルオキシダーゼ溶液を使用した時よりも１〜２倍
の間の等級であった。
7，690(1980) においてKnowles らの研究の続編を記載
している。Okuda らは、標的細胞に対する抗体に化学的
に接合２種の酵素を使用した。酵素は、ペルオキシドよ
りもむしろスーパーオキシドを少なくとも優先的に形成
するキサンチンオキシダーゼとラクトペルオキシダーゼ
であった。インビトロにおいて、90分経過すると、生き
たCandida albicans細胞の減数が見られ、この結果はラ
クトペルオキシダーゼ溶液を使用した時よりも１〜２倍
の間の等級であった。
【０００６】Arnoldらは、J. Dent. Res. ，59B ，961
(1980) において、口腔バクテリアに対してグルコース
オキシダ−ゼ／抗体の化学的接合体を使用することを記
載しているが、この使用では細胞破壊よりむしろ可逆的
な静菌作用が達成されるにすぎない。
(1980) において、口腔バクテリアに対してグルコース
オキシダ−ゼ／抗体の化学的接合体を使用することを記
載しているが、この使用では細胞破壊よりむしろ可逆的
な静菌作用が達成されるにすぎない。
【０００７】Lal らは、Journal of Immunological Met
hods，79，307(1985) において、マウス抗−ラット抗体
に化学的に接合した酵素と一緒に標的細胞に対するラッ
ト抗体を使用することを記載している。大量の標的細胞
を破壊し得た。
hods，79，307(1985) において、マウス抗−ラット抗体
に化学的に接合した酵素と一緒に標的細胞に対するラッ
ト抗体を使用することを記載している。大量の標的細胞
を破壊し得た。
【０００８】
【発明の要旨】本発明においては、標的細胞にデリバリ
ーされるべき作用物質が、作用物質と標的部位との間に
橋を形成する複数の抗体または抗体フラグメントにより
標的部位に結合されている。得られた複合体は集合する
能力を有する。
ーされるべき作用物質が、作用物質と標的部位との間に
橋を形成する複数の抗体または抗体フラグメントにより
標的部位に結合されている。得られた複合体は集合する
能力を有する。
【０００９】従って、本発明においては、１種またはそ
れ以上のビヒクルが、同一もしくは別個のビヒクル中
に、 ｉ）標的部位に結合する第一の抗体または抗体フラグメ
ント、及び ii）１つまたはそれ以上の、抗体−抗原結合により活性
物質と第一の抗体または抗体フラグメントに集合的に結
合することによって標的部位に活性物質を付着させ得る
第二の(further) 抗体または抗体フラグメント、を含
む。
れ以上のビヒクルが、同一もしくは別個のビヒクル中
に、 ｉ）標的部位に結合する第一の抗体または抗体フラグメ
ント、及び ii）１つまたはそれ以上の、抗体−抗原結合により活性
物質と第一の抗体または抗体フラグメントに集合的に結
合することによって標的部位に活性物質を付着させ得る
第二の(further) 抗体または抗体フラグメント、を含
む。
【００１０】本発明は上記ビヒクルからなる製品を提供
する。本発明は活性物質、特に酵素をビヒクルを投与し
てデリバリーする方法をも提供する。
する。本発明は活性物質、特に酵素をビヒクルを投与し
てデリバリーする方法をも提供する。
【００１１】活性物質をビヒクルの１つに配合してもよ
いが、活性物質がインビボで標的部位の近傍に存在する
物質であってもよい。その場合、抗体または抗体フラグ
メントは活性物質を標的部位上に集中させるべく作用
し、これにより標的に対する活性が増強され得る。
いが、活性物質がインビボで標的部位の近傍に存在する
物質であってもよい。その場合、抗体または抗体フラグ
メントは活性物質を標的部位上に集中させるべく作用
し、これにより標的に対する活性が増強され得る。
【００１２】抗体−抗原結合により、活性物質は、その
構成部分が集ったとき自然と集合する複合体として標的
部位に結合され得る。
構成部分が集ったとき自然と集合する複合体として標的
部位に結合され得る。
【００１３】（図面の説明） 本発明を具体化する幾つかの態様を添附図面に示す。図
中、標的部位及び結合酵素は模式図である。G.Oxはグル
コースオキシダーゼ、HRP はホースラディシュペルオキ
シダーゼ、PEI はポリエチレンイミンを示す。
中、標的部位及び結合酵素は模式図である。G.Oxはグル
コースオキシダーゼ、HRP はホースラディシュペルオキ
シダーゼ、PEI はポリエチレンイミンを示す。
【００１４】
【具体例の詳細な説明】前記したように、第一の抗体ま
たは抗体フラグメントは標的部位に結合し、１つまたは
それ以上の第二の抗体または抗体フラグメントは標的部
位に対して作用物質を集合的に付着させる。
たは抗体フラグメントは標的部位に結合し、１つまたは
それ以上の第二の抗体または抗体フラグメントは標的部
位に対して作用物質を集合的に付着させる。
【００１５】本発明を全抗体(whole antibodies)を用い
て実施する場合、第二の抗体は、橋として作用し且つ自
然と複合体を形成し得るように、標的部位に対する抗体
と同一の種に由来する活性物質に対する抗体及び第一の
種のイムノグロブリンに対する別の種の抗体であり得
る。
て実施する場合、第二の抗体は、橋として作用し且つ自
然と複合体を形成し得るように、標的部位に対する抗体
と同一の種に由来する活性物質に対する抗体及び第一の
種のイムノグロブリンに対する別の種の抗体であり得
る。
【００１６】例えば、ストレプトコッカス・ミュータン
ス（S. mutans）（標的として）及びグルコースオキシ
ダーゼ（治療薬として）に対する家兎抗体が家兎イムノ
グロブリンに対するヤギ抗体と一緒に使用され得る。ヤ
ギ抗体は、家兎イムノグロブリン抗原に対して複数の結
合部位を有しており、したがって酵素を抗体／抗原結合
の鎖を介して結合し得る。この構成では、標的（S. mut
ans）が家兎抗−S. mutansに結合し、ヤギ抗−家兎イム
ノグロブリンが家兎抗−S. mutansに結合しかつグルコ
ースオキシダーゼそのものに結合する家兎抗−グルコー
スオキシダーゼにも結合している。
ス（S. mutans）（標的として）及びグルコースオキシ
ダーゼ（治療薬として）に対する家兎抗体が家兎イムノ
グロブリンに対するヤギ抗体と一緒に使用され得る。ヤ
ギ抗体は、家兎イムノグロブリン抗原に対して複数の結
合部位を有しており、したがって酵素を抗体／抗原結合
の鎖を介して結合し得る。この構成では、標的（S. mut
ans）が家兎抗−S. mutansに結合し、ヤギ抗−家兎イム
ノグロブリンが家兎抗−S. mutansに結合しかつグルコ
ースオキシダーゼそのものに結合する家兎抗−グルコー
スオキシダーゼにも結合している。
【００１７】前記した配置が図１に示されている。図
中、１０は抗原部位１２を有する標的のストレプトコッ
カス・ミュータンス（S. mutans）である。１４は第一
抗体の家兎抗−S. mutansである。１８は酵素（G. Ox）
に結合する家兎抗−グルコースオキシダーゼである。２
０は橋かけ抗体のヤギ抗−家兎である。この配置によ
り、特定の標的部位に対する特定の抗体を介して標的部
位に細胞毒性酵素を結合することができる。我々は、前
記結合をインビトロで使用すると標的細胞が破壊される
ことを確認した。
中、１０は抗原部位１２を有する標的のストレプトコッ
カス・ミュータンス（S. mutans）である。１４は第一
抗体の家兎抗−S. mutansである。１８は酵素（G. Ox）
に結合する家兎抗−グルコースオキシダーゼである。２
０は橋かけ抗体のヤギ抗−家兎である。この配置によ
り、特定の標的部位に対する特定の抗体を介して標的部
位に細胞毒性酵素を結合することができる。我々は、前
記結合をインビトロで使用すると標的細胞が破壊される
ことを確認した。
【００１８】本発明は、抗体フラグメント、特に標的部
位に結合する第一の抗体フラグメントを１つまたはそれ
以上の、活性物質を第一フラグメントに結合させるため
の第二のフラグメントと一緒に使用して実施することも
でき、これにより活性物質を標的部位に付着させること
ができる。
位に結合する第一の抗体フラグメントを１つまたはそれ
以上の、活性物質を第一フラグメントに結合させるため
の第二のフラグメントと一緒に使用して実施することも
でき、これにより活性物質を標的部位に付着させること
ができる。
【００１９】第一抗体フラグメントは、所望標的に対す
る抗体のＦｖフラグメントであり得る。前記フラグメン
トは、抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインのみを含む。
フラグメントは２つの結合部位を与えるＦ(ab)2 フラグ
メントであり得る。あるいは、抗体の１つの鎖の単一の
可変ドメインであってもよい。
る抗体のＦｖフラグメントであり得る。前記フラグメン
トは、抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインのみを含む。
フラグメントは２つの結合部位を与えるＦ(ab)2 フラグ
メントであり得る。あるいは、抗体の１つの鎖の単一の
可変ドメインであってもよい。
【００２０】生物学的に活性な抗体フラグメントをE. c
oli において効率的に産生する方法は、A. Skevia 及び
A. Pluckthun，Science ， 240，1083(1988)；M. Bette
r ら，Science ， 240，1041(1988)；及びE. S. Ward
ら，Nature， 341，544(1989)に記載されている。抗体
フラグメントをコードする遺伝子のE. Coli におけるク
ローニング及び発現はＥＰ−Ａ−３６８６８４（Medica
l Research Council）にも記載されている。
oli において効率的に産生する方法は、A. Skevia 及び
A. Pluckthun，Science ， 240，1083(1988)；M. Bette
r ら，Science ， 240，1041(1988)；及びE. S. Ward
ら，Nature， 341，544(1989)に記載されている。抗体
フラグメントをコードする遺伝子のE. Coli におけるク
ローニング及び発現はＥＰ−Ａ−３６８６８４（Medica
l Research Council）にも記載されている。
【００２１】好ましくは、第一の抗体フラグメントが該
フラグメントに付随した追加のペプチド鎖を有し、第二
のフラグメントが活性物質をこのペプチド鎖に結合させ
る。バクテリアは、ドメインのＣ末端に既に付着した外
(extra) ペプチド鎖を有する可変ドメインを産生すべく
作製され得る。これは、標準の遺伝子技術により達成さ
れる。例えば、可変ドメインをコードする遺伝子は、可
変領域に付随するペプチドをコードするインビトロで合
成されたオリゴヌクレオチドを使用して部位特異的突然
変異誘発技術により容易に延長することができる。部位
特異的突然変異誘発は現在広く使用されている技術であ
り、そのプロトコールは複数の刊行物、例えばSambrook
ら，Molecular Cloning （第２版），Cold Spring Harb
our Laboratory Press，New York(1989)に十分に記載さ
れている。付着した外ペプチドは治療薬を付着させるた
めの非常に便利な“ハンドル”を提供する。
フラグメントに付随した追加のペプチド鎖を有し、第二
のフラグメントが活性物質をこのペプチド鎖に結合させ
る。バクテリアは、ドメインのＣ末端に既に付着した外
(extra) ペプチド鎖を有する可変ドメインを産生すべく
作製され得る。これは、標準の遺伝子技術により達成さ
れる。例えば、可変ドメインをコードする遺伝子は、可
変領域に付随するペプチドをコードするインビトロで合
成されたオリゴヌクレオチドを使用して部位特異的突然
変異誘発技術により容易に延長することができる。部位
特異的突然変異誘発は現在広く使用されている技術であ
り、そのプロトコールは複数の刊行物、例えばSambrook
ら，Molecular Cloning （第２版），Cold Spring Harb
our Laboratory Press，New York(1989)に十分に記載さ
れている。付着した外ペプチドは治療薬を付着させるた
めの非常に便利な“ハンドル”を提供する。
【００２２】活性物質を第一フラグメントに結合させる
第二の抗体フラグメントは、好ましくは、抗体−抗原結
合により活性物質に結合し得る第二の抗体フラグメン
ト、並びに第一及び第二の抗体フラグメント、特に第一
及び第二の抗体フラグメントに付随する抗原ペプチドに
結合し得る（２価の）Ｆ(ab)2 フラグメントである。
第二の抗体フラグメントは、好ましくは、抗体−抗原結
合により活性物質に結合し得る第二の抗体フラグメン
ト、並びに第一及び第二の抗体フラグメント、特に第一
及び第二の抗体フラグメントに付随する抗原ペプチドに
結合し得る（２価の）Ｆ(ab)2 フラグメントである。
【００２３】本発明は、種々の異なる標的部位、特に体
表面に対して局所適用により接近可能な標的部位、口内
の標的部位、体から一時的に除かれる材料内の標的部位
にデリバリーするために使用され得る。１つの重要な適
用は、細胞毒性物質を歯肉上の口腔細菌叢の種にデリバ
リーすることである。
表面に対して局所適用により接近可能な標的部位、口内
の標的部位、体から一時的に除かれる材料内の標的部位
にデリバリーするために使用され得る。１つの重要な適
用は、細胞毒性物質を歯肉上の口腔細菌叢の種にデリバ
リーすることである。
【００２４】口腔細菌叢は、各種の細菌種を含有する複
雑な生態系である。これらの種の１つを標的部位として
選択し得る。しかしながら、１つの種をターゲットする
により、複数の種及び隣接して存在する別の種をも攻撃
する。したがって、細胞毒性物質を歯垢中に存在する１
つの種にデリバリーすることによって、前記物質は歯垢
にデリバリーされ、歯垢形成に関与する種も含め歯垢中
に存在するすべての種に対して作用するであろう。
雑な生態系である。これらの種の１つを標的部位として
選択し得る。しかしながら、１つの種をターゲットする
により、複数の種及び隣接して存在する別の種をも攻撃
する。したがって、細胞毒性物質を歯垢中に存在する１
つの種にデリバリーすることによって、前記物質は歯垢
にデリバリーされ、歯垢形成に関与する種も含め歯垢中
に存在するすべての種に対して作用するであろう。
【００２５】微生物より産生される細胞外デキストラン
が標的部位として使用され、この場合第一の抗体または
抗体フラグメントはデキストランに対して結合親和性を
有する。
が標的部位として使用され、この場合第一の抗体または
抗体フラグメントはデキストランに対して結合親和性を
有する。
【００２６】１つの考えられ得る標的種がストレプトコ
ッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）であ
る。この種は歯垢の主因物質と同定されており、１回の
感染(mono-infection)で無菌動物に齲食病巣を誘発させ
得ることが判明している。ストレプトコッカス・ミュー
タンス（S. mutans）は、不溶性の多糖類マトリックス
を合成するために食物炭水化物を利用する能力を有し、
硬質表面に付着及び硬質表面のコロニー化、並びにエナ
メルを溶解し得る酸の生成が促進される。これらの特徴
は重要なビルレンス決定因子として同定された。他の種
及び属も無菌動物において酸及びプラークを生成させた
り齲食を進行させることが知られているが、ストレプト
コッカス・ミュータンス（S. mutans）は、その酸及び
多糖類の生成の点で齲食の重要な原因の少なくとも１つ
として広く認識されている。
ッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）であ
る。この種は歯垢の主因物質と同定されており、１回の
感染(mono-infection)で無菌動物に齲食病巣を誘発させ
得ることが判明している。ストレプトコッカス・ミュー
タンス（S. mutans）は、不溶性の多糖類マトリックス
を合成するために食物炭水化物を利用する能力を有し、
硬質表面に付着及び硬質表面のコロニー化、並びにエナ
メルを溶解し得る酸の生成が促進される。これらの特徴
は重要なビルレンス決定因子として同定された。他の種
及び属も無菌動物において酸及びプラークを生成させた
り齲食を進行させることが知られているが、ストレプト
コッカス・ミュータンス（S. mutans）は、その酸及び
多糖類の生成の点で齲食の重要な原因の少なくとも１つ
として広く認識されている。
【００２７】標的種として選択され得る他の種は、スト
レプトコッカス・サングイス（S. sanguis）、アクチノ
マイセス・ビスコーサス（A. viscosus）及びアクチノ
マイセス・ネスランディ（A. naeslundii）である。こ
れらはすべて、歯垢中に通常認められる種の主たる部分
として歯垢中に存在する。頻繁に存在するために、これ
ら３つの種は好ましい標的種である。
レプトコッカス・サングイス（S. sanguis）、アクチノ
マイセス・ビスコーサス（A. viscosus）及びアクチノ
マイセス・ネスランディ（A. naeslundii）である。こ
れらはすべて、歯垢中に通常認められる種の主たる部分
として歯垢中に存在する。頻繁に存在するために、これ
ら３つの種は好ましい標的種である。
【００２８】従って、本発明の特に意図された用途で
は、第一抗体はストレプトコッカス・ミュータンス（S.
mutans）、ストレプトコッカス・サングイス（S. sang
ui s）、アクチノマイセス・ビスコーサス（A. viscosu
s）またはアクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslu
ndii）に対する抗体であり、活性物質は酵素のグルコー
スオキシダーゼである。
は、第一抗体はストレプトコッカス・ミュータンス（S.
mutans）、ストレプトコッカス・サングイス（S. sang
ui s）、アクチノマイセス・ビスコーサス（A. viscosu
s）またはアクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslu
ndii）に対する抗体であり、活性物質は酵素のグルコー
スオキシダーゼである。
【００２９】別の用途は、歯周病に関与する歯肉下の細
菌叢の種を攻撃することである。標的種はBacterioides
gingivalis である。
菌叢の種を攻撃することである。標的種はBacterioides
gingivalis である。
【００３０】任意の口腔用途（デンタルケア）に対し
て、製品中のビヒクルは口に進入することが許容される
ものでなければならず、例えば口内に局所適用するのに
適したビヒクルが使用される。
て、製品中のビヒクルは口に進入することが許容される
ものでなければならず、例えば口内に局所適用するのに
適したビヒクルが使用される。
【００３１】別の用途は、ヒト腫瘍細胞、特に放射線療
法を受けている患者の体内から一時的に取り出した骨髄
中の腫瘍細胞を攻撃するために治療薬をデリバリーする
ことである。
法を受けている患者の体内から一時的に取り出した骨髄
中の腫瘍細胞を攻撃するために治療薬をデリバリーする
ことである。
【００３２】各種の物質が本発明に従ってデリバリーさ
れ得る活性物質となり得る。１つの重要な可能性は、細
胞毒性産物を発生し得る酵素である。グルコースオキシ
ダーゼを上記したが、ガラクトースオキシダーゼも使用
し得る。標的部位が口内の場合、この酵素に対する基質
はヨーグルト中に天然に存在するガラクトースである。
他には、スーパーオキシドを産生するキサンチンオキシ
ダーゼ及びＮＡＤＰオキシダーゼが考えられ得る。
れ得る活性物質となり得る。１つの重要な可能性は、細
胞毒性産物を発生し得る酵素である。グルコースオキシ
ダーゼを上記したが、ガラクトースオキシダーゼも使用
し得る。標的部位が口内の場合、この酵素に対する基質
はヨーグルト中に天然に存在するガラクトースである。
他には、スーパーオキシドを産生するキサンチンオキシ
ダーゼ及びＮＡＤＰオキシダーゼが考えられ得る。
【００３３】標的部位にデリバリーされ得る他の酵素は
グラム陰性菌の細胞壁を攻撃するリゾチーム、または歯
垢の形成を助長する酵素のような細胞外酵素を攻撃する
プロテアーゼである。
グラム陰性菌の細胞壁を攻撃するリゾチーム、または歯
垢の形成を助長する酵素のような細胞外酵素を攻撃する
プロテアーゼである。
【００３４】本発明によりデリバリーされ得る他の種類
の物質は、標的生物の細胞外酵素を阻害すべく作用する
酵素阻害剤である。
の物質は、標的生物の細胞外酵素を阻害すべく作用する
酵素阻害剤である。
【００３５】標的部位の近傍の環境を変更すべく作用す
る酸素発生物質や酸生成物質も考えられ得る物質であ
る。標的部位が歯周ポケット内の場合に特に考えられ
る。前記した腔中に酸素を発生させたりｐＨを低下させ
ると、このポケットに侵入した嫌気性微生物にとって好
ましからざる状況が呈される。
る酸素発生物質や酸生成物質も考えられ得る物質であ
る。標的部位が歯周ポケット内の場合に特に考えられ
る。前記した腔中に酸素を発生させたりｐＨを低下させ
ると、このポケットに侵入した嫌気性微生物にとって好
ましからざる状況が呈される。
【００３６】更に考えられ得る用途は、制限的な栄養素
を除去し得る材料をテリバリーすることである。特に、
アエロバクチン、エンテロケリンまたはポルフィリンが
歯周ポケットの標的までデリバリーされ得る。これらは
鉄と複合体を形成し、このポケットに侵入した細菌が利
用する鉄の濃度を低下させる。これらの材料はそのまま
治療薬として使用され得るが、グリコシル鎖がこの鎖に
結合する抗体またはフラグメントに対して抗原性を有す
るグリコシル化形態で使用してもよい。あるいは、前記
材料は抗体が付着する他の部分に共有結合することもあ
る。
を除去し得る材料をテリバリーすることである。特に、
アエロバクチン、エンテロケリンまたはポルフィリンが
歯周ポケットの標的までデリバリーされ得る。これらは
鉄と複合体を形成し、このポケットに侵入した細菌が利
用する鉄の濃度を低下させる。これらの材料はそのまま
治療薬として使用され得るが、グリコシル鎖がこの鎖に
結合する抗体またはフラグメントに対して抗原性を有す
るグリコシル化形態で使用してもよい。あるいは、前記
材料は抗体が付着する他の部分に共有結合することもあ
る。
【００３７】他の活性物質は非酵素の触媒である。これ
は、リガンドに結合した遷移金属である。例えば、Borg
gaard, Farver 及びAndersenは、Acta Chem. Scand. ，
25，3541(1971)において、リガンドとしてエチレンジア
ミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含む鉄は過酸化水素から
ヒドロキシイオンとＯＨ遊離基（非常に短時間しか存在
しないが毒性が強い）への変換を促進することを記載し
ている。
は、リガンドに結合した遷移金属である。例えば、Borg
gaard, Farver 及びAndersenは、Acta Chem. Scand. ，
25，3541(1971)において、リガンドとしてエチレンジア
ミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含む鉄は過酸化水素から
ヒドロキシイオンとＯＨ遊離基（非常に短時間しか存在
しないが毒性が強い）への変換を促進することを記載し
ている。
【００３８】化粧品の分野で考えられ得る用途は、歯の
よごれを除去することである。この用途の場合、活性物
質は過酸化水素のような漂白物質を生成する酵素であ
る。標的部位は歯の表面である。本発明にしたがって標
的に結合すると、表面に隣接して酵素を配置することが
できる。その結果、漂白物質がよごれている歯の表面の
近傍で生成される。
よごれを除去することである。この用途の場合、活性物
質は過酸化水素のような漂白物質を生成する酵素であ
る。標的部位は歯の表面である。本発明にしたがって標
的に結合すると、表面に隣接して酵素を配置することが
できる。その結果、漂白物質がよごれている歯の表面の
近傍で生成される。
【００３９】本発明の範囲内で、活性物質及び抗体また
は抗体フラグメントは１つのビヒクル中に含まれている
か、または複数のビヒクル中に分散されている。前者の
場合、活性物質と抗体の複合体がビヒクル中に形成され
る。後者の場合、複合体の一部が連結して同一のビヒク
ル中に存在し得るならば、複合体の一部が連結すること
があり得る。しかしながら、すべての成分が会合したと
きのみ完全な複合体が形成され得る。
は抗体フラグメントは１つのビヒクル中に含まれている
か、または複数のビヒクル中に分散されている。前者の
場合、活性物質と抗体の複合体がビヒクル中に形成され
る。後者の場合、複合体の一部が連結して同一のビヒク
ル中に存在し得るならば、複合体の一部が連結すること
があり得る。しかしながら、すべての成分が会合したと
きのみ完全な複合体が形成され得る。
【００４０】我々は、ポリクローナル抗体を使用する場
合、貯蔵中ビヒクル中に完全な複合体が形成されるのを
避けるために活性物質及び抗体を少なくとも２つのビヒ
クル中に分散させなければならないことを知見した。我
々は、貯蔵中ポリクローナル抗体と完全な複合体が形成
されると標的部位に結合する能力が低下することを知見
した。部分的な複合体形成は許容され得る。例えば、単
一のビヒクル中で抗−酵素抗体に酵素を連結させること
は、得られた接合体が貯蔵中安定であるので許容でき
る。第一の（抗−標的）抗体が治療薬に結合する抗体に
直接結合しないならば、これら２つの抗体は同一のビヒ
クル中に配合され得る。この場合、第二の抗体は完全な
複合体を形成し得る抗体を含み得る。
合、貯蔵中ビヒクル中に完全な複合体が形成されるのを
避けるために活性物質及び抗体を少なくとも２つのビヒ
クル中に分散させなければならないことを知見した。我
々は、貯蔵中ポリクローナル抗体と完全な複合体が形成
されると標的部位に結合する能力が低下することを知見
した。部分的な複合体形成は許容され得る。例えば、単
一のビヒクル中で抗−酵素抗体に酵素を連結させること
は、得られた接合体が貯蔵中安定であるので許容でき
る。第一の（抗−標的）抗体が治療薬に結合する抗体に
直接結合しないならば、これら２つの抗体は同一のビヒ
クル中に配合され得る。この場合、第二の抗体は完全な
複合体を形成し得る抗体を含み得る。
【００４１】モノクローナル抗体を使用するときには、
複合体の成分を複数のビヒクル中に分散させる必要はな
い。一般に、モノクローナル抗体はより小さな複合体を
形成し、貯蔵中その活性をポリクローナル抗体と形成さ
れた複合体よりもうまく保持すると予想される。この現
象は抗体フラグメントを使用したときにも当てはまる。
抗体フラグメントの利点は、抗原−抗体結合により形成
する複合体が全抗体との複合体よりもかなり小さく且つ
より安定であることである。
複合体の成分を複数のビヒクル中に分散させる必要はな
い。一般に、モノクローナル抗体はより小さな複合体を
形成し、貯蔵中その活性をポリクローナル抗体と形成さ
れた複合体よりもうまく保持すると予想される。この現
象は抗体フラグメントを使用したときにも当てはまる。
抗体フラグメントの利点は、抗原−抗体結合により形成
する複合体が全抗体との複合体よりもかなり小さく且つ
より安定であることである。
【００４２】治療薬と抗体または抗体フラグメントとを
含む１つまたはそれ以上のビヒクルからなる製品は種々
の形態を取り得る。標的部位が口内の場合、うがい薬、
練り歯磨き及び口内で溶解する薬用ドロップが考えられ
得る。こうした形態の製品は、複数のビヒクルを必要と
するときでも使用される。例えば、製品は使用直前に使
用者が混合する２成分型うがい薬であり得る。
含む１つまたはそれ以上のビヒクルからなる製品は種々
の形態を取り得る。標的部位が口内の場合、うがい薬、
練り歯磨き及び口内で溶解する薬用ドロップが考えられ
得る。こうした形態の製品は、複数のビヒクルを必要と
するときでも使用される。例えば、製品は使用直前に使
用者が混合する２成分型うがい薬であり得る。
【００４３】２成分を有する練り歯磨きを、２成分が別
個に保持される、すなわち少なくとも混合しないように
歯磨き容器中に保存し、使用者の口内に一緒に挿入し混
合することも可能である。前記した歯磨き製品は公知で
ある。
個に保持される、すなわち少なくとも混合しないように
歯磨き容器中に保存し、使用者の口内に一緒に挿入し混
合することも可能である。前記した歯磨き製品は公知で
ある。
【００４４】複数のビヒクルを含む別の形態の製品は口
の中でなめる薬用ドロップであり、複合体の種々の成分
は薬用ドロップの別々の領域に含まれている。３つの領
域を使用し、複合体の成分が第一（抗−標的）抗体から
順次放出されるように配置するのが好ましい。こうする
と、複合体が標的部位に集合する。
の中でなめる薬用ドロップであり、複合体の種々の成分
は薬用ドロップの別々の領域に含まれている。３つの領
域を使用し、複合体の成分が第一（抗−標的）抗体から
順次放出されるように配置するのが好ましい。こうする
と、複合体が標的部位に集合する。
【００４５】複数のビヒクルを与えるように２つのビヒ
クル形態を一緒に使用してもよい。例えば、練り歯磨き
を使用後うがい薬または薬用ドロップを使用することも
できる。
クル形態を一緒に使用してもよい。例えば、練り歯磨き
を使用後うがい薬または薬用ドロップを使用することも
できる。
【００４６】活性物質が酵素の場合、製品に酵素作用に
対する基質を配合してもよく、標的部位に存在する酵素
基質を利用してもよい。酵素が口内の標的部位に指向さ
れるグルコースオキシダーゼの場合、製品は酵素基質と
して食物グルコースを利用してもよく、グルコースがグ
ルコースオキシダーゼと別個に保持されるならばグルコ
ースを含有させてもよい。
対する基質を配合してもよく、標的部位に存在する酵素
基質を利用してもよい。酵素が口内の標的部位に指向さ
れるグルコースオキシダーゼの場合、製品は酵素基質と
して食物グルコースを利用してもよく、グルコースがグ
ルコースオキシダーゼと別個に保持されるならばグルコ
ースを含有させてもよい。
【００４７】本発明は、共働する１つ以上の酵素を利用
し、抗体または抗体フラグメントを使用して両酵素を標
的部位に結合させようとするものである。したがって、
酵素は相互に且つ標的に対して近接して保持される。
し、抗体または抗体フラグメントを使用して両酵素を標
的部位に結合させようとするものである。したがって、
酵素は相互に且つ標的に対して近接して保持される。
【００４８】本発明は複数の方法で実施され得る。１つ
の方法は、活性物質に対して共通の媒介に引きつけられ
る２つの酵素を使用することである。
の方法は、活性物質に対して共通の媒介に引きつけられ
る２つの酵素を使用することである。
【００４９】２つの酵素を共通の媒介に付着させる場
合、媒介は、酵素を化学反応により付着させ得る化学的
機能を有する合成ポリマーであり得る。適当なポリマー
は枝の末端にアミノ基を有する分枝状ポリマーであるポ
リエチレンイミン（ＰＥＩ）である。この配置は図２に
示した通りである。符号１０及び２０は図１と同義であ
る。酵素はグルコースオキシダーゼ（G. Ox ）及びホー
スラディシュペルオキシダーゼ（HRP ）である。
合、媒介は、酵素を化学反応により付着させ得る化学的
機能を有する合成ポリマーであり得る。適当なポリマー
は枝の末端にアミノ基を有する分枝状ポリマーであるポ
リエチレンイミン（ＰＥＩ）である。この配置は図２に
示した通りである。符号１０及び２０は図１と同義であ
る。酵素はグルコースオキシダーゼ（G. Ox ）及びホー
スラディシュペルオキシダーゼ（HRP ）である。
【００５０】グルコースオキシダーゼ及びホースラディ
シュペルオキシダーゼは共にペンダントグリコシル鎖を
有する酵素である。前記酵素は、酵素を水溶液中で過ヨ
ウ化物により酸化してペンダントグリコシル鎖中にアル
デヒド基を形成することによりポリエチレンイミンに共
有結合され得る。次いで、これらの基はアルカリ性ｐＨ
（例えばｐＨ 9.5）でアミノ基とシッフ塩基を形成し、
その後水素化ホウ素によリ還元すると未反応のアルデヒ
ド基が還元され、シッフ塩基の還元により安定性が改良
され得る。
シュペルオキシダーゼは共にペンダントグリコシル鎖を
有する酵素である。前記酵素は、酵素を水溶液中で過ヨ
ウ化物により酸化してペンダントグリコシル鎖中にアル
デヒド基を形成することによりポリエチレンイミンに共
有結合され得る。次いで、これらの基はアルカリ性ｐＨ
（例えばｐＨ 9.5）でアミノ基とシッフ塩基を形成し、
その後水素化ホウ素によリ還元すると未反応のアルデヒ
ド基が還元され、シッフ塩基の還元により安定性が改良
され得る。
【００５１】２つの酵素を使用する別の方法では、１つ
の酵素を本発明による抗原−抗体結合により標的部位に
付着させ、他の酵素を該酵素の結合にかかわる１つの抗
体に化学的に（すなわち、共役結合の形成により）接合
させる。
の酵素を本発明による抗原−抗体結合により標的部位に
付着させ、他の酵素を該酵素の結合にかかわる１つの抗
体に化学的に（すなわち、共役結合の形成により）接合
させる。
【００５２】抗体に対する１つの酵素の化学的接合は、
上記したシッフ塩基の形成技術により実施される。この
場合、酵素は、使用時に抗−標的抗体と他の酵素に対す
る抗体とに結合する橋かけ抗体に接合され得る。この配
置は図３に示した通りである。符号は前記と同義であ
る。ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP ）はヤギ
抗−家兎イムノグロブリン２２，２０に化学的に接合さ
れる。
上記したシッフ塩基の形成技術により実施される。この
場合、酵素は、使用時に抗−標的抗体と他の酵素に対す
る抗体とに結合する橋かけ抗体に接合され得る。この配
置は図３に示した通りである。符号は前記と同義であ
る。ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP ）はヤギ
抗−家兎イムノグロブリン２２，２０に化学的に接合さ
れる。
【００５３】２つの酵素を利用する第３の方法では、両
方の酵素を本発明による抗体−抗原結合を介して標的に
別個に付着させる。通常、別個の抗体または抗体フラグ
メントを２つの酵素のそれぞれに結合させなければなら
ない。
方の酵素を本発明による抗体−抗原結合を介して標的に
別個に付着させる。通常、別個の抗体または抗体フラグ
メントを２つの酵素のそれぞれに結合させなければなら
ない。
【００５４】単一の第一抗体またはフラグメントを使用
してもよく、橋かけ抗体またはフラグメントを使用して
第一の（抗−標的）抗体またはフラグメントと各抗−酵
素抗体またはフラグメントとを結合させる場合、両方の
抗−酵素抗体またはフラグメントに結合し得る単一の橋
かけ抗体またはフラグメントが好ましい。異なる第一抗
体またはフラグメントと橋かけ抗体またはフラグメント
を含む別々の系を混合して使用し、両者を同一の標的部
位に結合することもできる。
してもよく、橋かけ抗体またはフラグメントを使用して
第一の（抗−標的）抗体またはフラグメントと各抗−酵
素抗体またはフラグメントとを結合させる場合、両方の
抗−酵素抗体またはフラグメントに結合し得る単一の橋
かけ抗体またはフラグメントが好ましい。異なる第一抗
体またはフラグメントと橋かけ抗体またはフラグメント
を含む別々の系を混合して使用し、両者を同一の標的部
位に結合することもできる。
【００５５】特に興味深いものは、グルコースまたはガ
ラクトースオキシダーゼのようなオキシダーゼとホース
ラディシュペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ
との組合せであり、ペルオキシダーゼを使用するとハロ
ゲンイオンをペルオキシドより毒性の強い酸化ハライド
に変換させることができる。ペルオキシダーゼは、チオ
シアネートをハイポチオシアネートに変換させるべくペ
ルオキシドを使用し得る。酸化（oxidised）ハライドま
たはハイポチオシアネートを歯のよごれを漂白する目的
で使用することもできる。
ラクトースオキシダーゼのようなオキシダーゼとホース
ラディシュペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ
との組合せであり、ペルオキシダーゼを使用するとハロ
ゲンイオンをペルオキシドより毒性の強い酸化ハライド
に変換させることができる。ペルオキシダーゼは、チオ
シアネートをハイポチオシアネートに変換させるべくペ
ルオキシドを使用し得る。酸化（oxidised）ハライドま
たはハイポチオシアネートを歯のよごれを漂白する目的
で使用することもできる。
【００５６】全抗体を使用する場合、２つの酵素の各々
に対する抗体が標的部位に対する抗体と同一の種に由来
することが好ましい。前記種に対して別の種の抗体は無
差別の（indiscriminate）橋かけ抗体として作用し、酵
素と標的部位とを連結する複合体を形成する。この配置
は図４に示した通りである。符号は前記と同義である。
符号２６は家兎抗−ホースラディシュペルオキシダーゼ
を示す。
に対する抗体が標的部位に対する抗体と同一の種に由来
することが好ましい。前記種に対して別の種の抗体は無
差別の（indiscriminate）橋かけ抗体として作用し、酵
素と標的部位とを連結する複合体を形成する。この配置
は図４に示した通りである。符号は前記と同義である。
符号２６は家兎抗−ホースラディシュペルオキシダーゼ
を示す。
【００５７】２つの酵素を使用する場合、製品は例えば
グルコースとハライドの両方に対する基質を含み得る。
あるいは、１つの基質のみ又は全く基質を含有させなく
てもよく、別の源に由来したまたま標的部位に存在する
基質を利用してもよい。
グルコースとハライドの両方に対する基質を含み得る。
あるいは、１つの基質のみ又は全く基質を含有させなく
てもよく、別の源に由来したまたま標的部位に存在する
基質を利用してもよい。
【００５８】図５は抗体フラグメントを使用する好まし
い配置を示す。
い配置を示す。
【００５９】抗原部位４２を有する標的４０に付着させ
るために、Ｆｖ抗体フラグメント４４が存在し、このフ
ラグメントはＦｖフラグメント４４の２つの鎖の一方の
遠位（Ｃ−末端）に付随したペプチド４６をいくつか反
復して有する。
るために、Ｆｖ抗体フラグメント４４が存在し、このフ
ラグメントはＦｖフラグメント４４の２つの鎖の一方の
遠位（Ｃ−末端）に付随したペプチド４６をいくつか反
復して有する。
【００６０】活性物質はグルコースオキシダーゼ１６及
びホースラディシュペルオキシダーゼ２４である。各々
が、当該酵素に対して特異性を有すると共にＦｖフラグ
メントの１つの鎖に付随した同一ペプチド４６の単一リ
ピートを有する各Ｆｖフラグメント４８，５０に結合し
ている。
びホースラディシュペルオキシダーゼ２４である。各々
が、当該酵素に対して特異性を有すると共にＦｖフラグ
メントの１つの鎖に付随した同一ペプチド４６の単一リ
ピートを有する各Ｆｖフラグメント４８，５０に結合し
ている。
【００６１】抗−酵素Ｆｖフラグメントに付随したペプ
チド４６は、これらのペフチドに対して特異的に結合す
るＦ（ab）2 フラグメント５２により抗−標的Ｆｖフラ
グメント上のペプチド４６に連結するようになる。Ｆ
（ab）2 フラグメントは２価であるので、抗−標的フラ
グメント４４に対して抗−酵素フラグメントを付着させ
る橋を形成することができる。
チド４６は、これらのペフチドに対して特異的に結合す
るＦ（ab）2 フラグメント５２により抗−標的Ｆｖフラ
グメント上のペプチド４６に連結するようになる。Ｆ
（ab）2 フラグメントは２価であるので、抗−標的フラ
グメント４４に対して抗−酵素フラグメントを付着させ
る橋を形成することができる。
【００６２】
【実施例】下記のインビトロにおける系の有効性を示す
実験例を参照しながら、本発明をさらに説明する。
実験例を参照しながら、本発明をさらに説明する。
【００６３】実施例中、ＰＢＳはｐＨ 6.5のリン酸緩衝
塩類を指す。グルコースオキシダーゼとしてAspergillu
s niger 由来の市販の酵素（Sigma Type VII）を使用し
た。ヤギ抗−家兎Ｉｇ抗体としてAtlantic Antibodies
から市販されているものを使用した。希釈は、ある量の
出発溶液を希釈剤と混合して出発溶液の濃度の１／ｎの
濃度の溶液を得たことを表す“１／ｎ”の形で表示し
た。実施例１ グルコースオキシダーゼ／抗−グルコースオキシダーゼ
複合体の構築 本実施例は、出発点として適当な、前記複合体の成分の
適当な作用濃度を示すべく使用され得る方法を示す。後
者の実施例は、濃度を変化させることが可能であること
を示す。
塩類を指す。グルコースオキシダーゼとしてAspergillu
s niger 由来の市販の酵素（Sigma Type VII）を使用し
た。ヤギ抗−家兎Ｉｇ抗体としてAtlantic Antibodies
から市販されているものを使用した。希釈は、ある量の
出発溶液を希釈剤と混合して出発溶液の濃度の１／ｎの
濃度の溶液を得たことを表す“１／ｎ”の形で表示し
た。実施例１ グルコースオキシダーゼ／抗−グルコースオキシダーゼ
複合体の構築 本実施例は、出発点として適当な、前記複合体の成分の
適当な作用濃度を示すべく使用され得る方法を示す。後
者の実施例は、濃度を変化させることが可能であること
を示す。
【００６４】複合体は、グルコースオキシダーゼ酵素と
３つの抗体、家兎抗−グルコースオキシダーゼ、ヤギ抗
−家兎Ｉｇ、家兎抗−S. mutans を用いて形成した。酵
素及び第一の２つの抗体に対する作用濃度は、S. mutan
s に付着させた家兎抗体に似せた（mimic ）固定化家兎
ＩｇＧからなる固相を用いてＥＬＩＳＡフォーマットに
より確立させた。これは次のように実施した。
３つの抗体、家兎抗−グルコースオキシダーゼ、ヤギ抗
−家兎Ｉｇ、家兎抗−S. mutans を用いて形成した。酵
素及び第一の２つの抗体に対する作用濃度は、S. mutan
s に付着させた家兎抗体に似せた（mimic ）固定化家兎
ＩｇＧからなる固相を用いてＥＬＩＳＡフォーマットに
より確立させた。これは次のように実施した。
【００６５】ナイロンペグをエタノールで洗浄し、次い
でカップリング剤としてのグルタルアルデヒド（ 2％水
溶液）、家兎ＩｇＧ溶液（50μｇたんぱく質／ml−ＰＢ
Ｓ）、過剰のカップリング剤を阻害するための牛血清ア
ルブミン（ 0.2％ＰＢＳ溶液）に順次暴露させた。
でカップリング剤としてのグルタルアルデヒド（ 2％水
溶液）、家兎ＩｇＧ溶液（50μｇたんぱく質／ml−ＰＢ
Ｓ）、過剰のカップリング剤を阻害するための牛血清ア
ルブミン（ 0.2％ＰＢＳ溶液）に順次暴露させた。
【００６６】これらの暴露の間及びその後、ペグをＰＢ
Ｓで洗浄した。このようにして家兎ＩｇＧを結合後、ペ
グを特製のホルダーに入れ、ホルダーからペグを突出さ
せた続いて、ホルダーを使用して微量滴定トレーのウェ
ルに突出させたペグを支持した。
Ｓで洗浄した。このようにして家兎ＩｇＧを結合後、ペ
グを特製のホルダーに入れ、ホルダーからペグを突出さ
せた続いて、ホルダーを使用して微量滴定トレーのウェ
ルに突出させたペグを支持した。
【００６７】ＰＢＳ中にグルコースオキシダーゼを濃度
40，20，10μｇ／ｍｌで含む３種の試験溶液を調製し
た。
40，20，10μｇ／ｍｌで含む３種の試験溶液を調製し
た。
【００６８】市販のヤギ抗−家兎ＩｇのＰＢＳ溶液を希
釈して、その原濃度の 1／125 ， 1／ 250， 1／500 及
び 1／1000の４種の試験溶液を調製した。
釈して、その原濃度の 1／125 ， 1／ 250， 1／500 及
び 1／1000の４種の試験溶液を調製した。
【００６９】家兎抗−グルコースオキシダーゼ血清を、
フロイント完全アジュバント中の水／油／水型エマルジ
ョンとしてAspergillus niger （Sigma type VIII ）由
来の精製グルコースオキシダーゼを家兎の筋肉内に免疫
化した後、フロイント不完全アジュバント中に２回ブー
スター接種して作製した。家兎血清中に特異な抗−グル
コースオキシダーゼ抗体が存在することが、標準の二重
免疫拡散法及びポリスチレン微量滴定トレー中の固相免
疫吸着捕獲(immunosorbent capture) により確認され
た。
フロイント完全アジュバント中の水／油／水型エマルジ
ョンとしてAspergillus niger （Sigma type VIII ）由
来の精製グルコースオキシダーゼを家兎の筋肉内に免疫
化した後、フロイント不完全アジュバント中に２回ブー
スター接種して作製した。家兎血清中に特異な抗−グル
コースオキシダーゼ抗体が存在することが、標準の二重
免疫拡散法及びポリスチレン微量滴定トレー中の固相免
疫吸着捕獲(immunosorbent capture) により確認され
た。
【００７０】家兎抗−グルコースオキシダーゼ抗体を含
む４種の試験溶液を、免疫化家兎血清のイムノグロブリ
ン分画から20，10， 5， 2.5μｇの家兎ＩｇＧ／ｍｌの
濃度で作製した。（これらは 1ｍｌ当り13ｍｇの家兎Ｉ
ｇＧを含有するストック溶液を希釈して得た。）複合体
を、それぞれグルコースオキシダーゼ、ヤギ抗−家兎Ｉ
ｇ及び家兎抗−グルコースオキシダーゼを含有する等量
の試験溶液を混合することにより標準の96ウェル微量滴
定トレーのウェル中に形成した。試験溶液を48の組み合
せで混合した。混合物を室温で45分間インキュベートし
た後、予め上記したように家兎ＩｇＧを感作させたナイ
ロンペグを各ウェルに挿入し、室温で１時間インキュベ
ートした。
む４種の試験溶液を、免疫化家兎血清のイムノグロブリ
ン分画から20，10， 5， 2.5μｇの家兎ＩｇＧ／ｍｌの
濃度で作製した。（これらは 1ｍｌ当り13ｍｇの家兎Ｉ
ｇＧを含有するストック溶液を希釈して得た。）複合体
を、それぞれグルコースオキシダーゼ、ヤギ抗−家兎Ｉ
ｇ及び家兎抗−グルコースオキシダーゼを含有する等量
の試験溶液を混合することにより標準の96ウェル微量滴
定トレーのウェル中に形成した。試験溶液を48の組み合
せで混合した。混合物を室温で45分間インキュベートし
た後、予め上記したように家兎ＩｇＧを感作させたナイ
ロンペグを各ウェルに挿入し、室温で１時間インキュベ
ートした。
【００７１】各ペグに結合した複合体の量を、ペグを取
出し、洗浄し、ｐＨ 6.5のリン酸／クエン酸緩衝液中に
テトラメチルベンジジン（TMB 100 μｇ／ｍｌ）、ホー
スラディシュペルオキシダーゼ（10μｇ／ｍｌ）及びグ
ルコース（ 150ｍＭ）を含む基質混合物中に置いてアッ
セイした。室温で30分間経過すると発色し、光学密度を
測定した。
出し、洗浄し、ｐＨ 6.5のリン酸／クエン酸緩衝液中に
テトラメチルベンジジン（TMB 100 μｇ／ｍｌ）、ホー
スラディシュペルオキシダーゼ（10μｇ／ｍｌ）及びグ
ルコース（ 150ｍＭ）を含む基質混合物中に置いてアッ
セイした。室温で30分間経過すると発色し、光学密度を
測定した。
【００７２】ヤギ抗−家兎ＩｇＧの希釈毎に、光学密度
を家兎抗−グルコースオキシダーゼの濃度に対してプロ
ットした。ヤギ抗−家兎ＩｇＧ試薬の最良希釈は 1／25
0 であり、この希釈濃度では家兎抗−グルコースオキシ
ダーゼを20μｇ／ｍｌの濃度で使用しなければならない
ことが明らかである。少なくとも10〜 400μｇ／ｍｌの
間でグルコースオキシダーゼの濃度は結合活性と微小な
差があるが、40μｇ／ｍｌのグルコースオキシダーゼが
最良の結果を与える。従って、任意のグルコースオキシ
ダーゼ濃度を使用できる。実施例２ 複合体の殺菌活性 実験手順は次の通りである。S. mutans を家兎抗−S. m
utans 、次いで前記実施例と同様の複合体、複合体によ
りS. mutans 細胞に結合して細胞を破壊せしめるグルコ
ースオキシダーゼに対する基質として機能するグルコー
スに暴露した。対照では、手順のステップを省略した。
を家兎抗−グルコースオキシダーゼの濃度に対してプロ
ットした。ヤギ抗−家兎ＩｇＧ試薬の最良希釈は 1／25
0 であり、この希釈濃度では家兎抗−グルコースオキシ
ダーゼを20μｇ／ｍｌの濃度で使用しなければならない
ことが明らかである。少なくとも10〜 400μｇ／ｍｌの
間でグルコースオキシダーゼの濃度は結合活性と微小な
差があるが、40μｇ／ｍｌのグルコースオキシダーゼが
最良の結果を与える。従って、任意のグルコースオキシ
ダーゼ濃度を使用できる。実施例２ 複合体の殺菌活性 実験手順は次の通りである。S. mutans を家兎抗−S. m
utans 、次いで前記実施例と同様の複合体、複合体によ
りS. mutans 細胞に結合して細胞を破壊せしめるグルコ
ースオキシダーゼに対する基質として機能するグルコー
スに暴露した。対照では、手順のステップを省略した。
【００７３】手順は次の一連のステップからなる。 １．Todd Hewitt ブイヨン中のS. mutans 培養物の10ｍ
ｌアリコートを殺菌したMcCartney ボトルに移した。細
菌を遠心分離してペレット化し、ＰＢＳで３回洗浄し、
ＰＢＳ 9ｍｌに再懸濁させた。 ２．家兎抗−S. mutans 懸濁液を添加した。この懸濁液
は、Edwards 及びEwingが“Identification of Enterob
acteriaceae”，Burgess Publishing Co., Minneapolis
，1955に記載した方法により得た家兎抗−S. mutans
血清のＰＢＳ中 1／40希釈物であった。McCartney ボト
ルに添加したときに達した希釈度は 1／400 であった。
また、ＰＢＳ 1ｍｌを対照として添加した。 ３．懸濁液を室温で１時間インキュベートし、細胞を遠
心分離してペレット化し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ
9ｍｌに再懸濁させた。 ４．グルコースオキシダーゼ／抗体複合体 1ｍｌを添加
した。この複合体は、予め等量のグルコースオキシダー
ゼ（ 500μｇ／ｍｌ）、ＰＢＳ中 1／200 希釈度の家兎
抗−グルコースオキシダーゼ、及びＰＢＳ中 1／100 希
釈度のヤギ抗−家兎ＩｇＧを混合し、室温にて１時間で
複合体を形成させることにより作製した。材料はすべて
前記実施例と同一のものを使用したが、その後の希釈を
考慮して高濃度のものとした。対照として、複合体の代
わりにＰＢＳ 1ｍｌを添加した。 ５．再び、懸濁液を室温で１時間インキュベートし、細
胞を遠心分離してペレット化し、ＰＢＳで３回洗浄し
た。 ６．細胞を 0.5％ｗ／ｖフィルター滅菌Ｄ−グルコース
10ｍｌに再懸濁させた。対照では、ＰＢＳを使用し、比
較としてグルコースの代りに 0.5％ｗ／ｖフィルター滅
菌Ｌ−アラビノースを使用した。 ７．得られた懸濁液を室温で24時間インキュベートし、
サンプル 0.5ｍｌを混合してすぐに、適当な間隔で採取
した。各サンプル中の細菌を、遠心分離してペレット化
し、ＰＢＳで３回洗浄して分離した。各サンプル中の生
存細胞を、J. Hygiene，38，732-749(1938) に記載され
ているMiles, Misra及びIrwin の方法によりアッセイし
た。添加した材料の組合せ及び生存細胞数を表１に示
す。
ｌアリコートを殺菌したMcCartney ボトルに移した。細
菌を遠心分離してペレット化し、ＰＢＳで３回洗浄し、
ＰＢＳ 9ｍｌに再懸濁させた。 ２．家兎抗−S. mutans 懸濁液を添加した。この懸濁液
は、Edwards 及びEwingが“Identification of Enterob
acteriaceae”，Burgess Publishing Co., Minneapolis
，1955に記載した方法により得た家兎抗−S. mutans
血清のＰＢＳ中 1／40希釈物であった。McCartney ボト
ルに添加したときに達した希釈度は 1／400 であった。
また、ＰＢＳ 1ｍｌを対照として添加した。 ３．懸濁液を室温で１時間インキュベートし、細胞を遠
心分離してペレット化し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ
9ｍｌに再懸濁させた。 ４．グルコースオキシダーゼ／抗体複合体 1ｍｌを添加
した。この複合体は、予め等量のグルコースオキシダー
ゼ（ 500μｇ／ｍｌ）、ＰＢＳ中 1／200 希釈度の家兎
抗−グルコースオキシダーゼ、及びＰＢＳ中 1／100 希
釈度のヤギ抗−家兎ＩｇＧを混合し、室温にて１時間で
複合体を形成させることにより作製した。材料はすべて
前記実施例と同一のものを使用したが、その後の希釈を
考慮して高濃度のものとした。対照として、複合体の代
わりにＰＢＳ 1ｍｌを添加した。 ５．再び、懸濁液を室温で１時間インキュベートし、細
胞を遠心分離してペレット化し、ＰＢＳで３回洗浄し
た。 ６．細胞を 0.5％ｗ／ｖフィルター滅菌Ｄ−グルコース
10ｍｌに再懸濁させた。対照では、ＰＢＳを使用し、比
較としてグルコースの代りに 0.5％ｗ／ｖフィルター滅
菌Ｌ−アラビノースを使用した。 ７．得られた懸濁液を室温で24時間インキュベートし、
サンプル 0.5ｍｌを混合してすぐに、適当な間隔で採取
した。各サンプル中の細菌を、遠心分離してペレット化
し、ＰＢＳで３回洗浄して分離した。各サンプル中の生
存細胞を、J. Hygiene，38，732-749(1938) に記載され
ているMiles, Misra及びIrwin の方法によりアッセイし
た。添加した材料の組合せ及び生存細胞数を表１に示
す。
【００７４】
【表１】 表１から明らかなように、複合体とグルコースとを組合
せることにより、複合体なしで家兎抗−S. mutans 抗体
を使用したときには達成できなかった細胞破壊が達成さ
れた。極微量の遊離グルコースオキシダーゼまたは非結
合の複合体しか洗浄ステップで流出されるにすぎないこ
とから、グルコースオキシダーゼが複合体を介して細胞
に付着していることが証明された。
せることにより、複合体なしで家兎抗−S. mutans 抗体
を使用したときには達成できなかった細胞破壊が達成さ
れた。極微量の遊離グルコースオキシダーゼまたは非結
合の複合体しか洗浄ステップで流出されるにすぎないこ
とから、グルコースオキシダーゼが複合体を介して細胞
に付着していることが証明された。
【００７５】驚くべきことに、家兎抗−S. mutans 抗体
なしでも若干の破壊が見られたことから、複合体がS. m
utans に直接結合している割合は低いことが示唆され
た。実施例３ 複合体によりグルコースオキシダーゼが細胞に結合する
ことを更に証明するために、実施例２のステップ５まで
繰返した。その後、遠心分離及びリン酸／クエン酸緩衝
液中への再懸濁を反復することによって細胞ペレットを
３回洗浄した。洗浄した細胞を、ＰＢＳ中のグルコース
（ 150ｍＭ）、ホースラディシュペルオキシダーゼ（10
μｇ／ｍｌ）及びテトラメチルベンジジン（ 100μｇ／
ｍｌ）の溶液に再懸濁させた。反応混合物を微量滴定ウ
ェル中で形成した。室温で30分間インキュベートし、次
いで光学密度を測定し、標準のグルコースオキシダーゼ
溶液を用いて得られた較正曲線と比較した。
なしでも若干の破壊が見られたことから、複合体がS. m
utans に直接結合している割合は低いことが示唆され
た。実施例３ 複合体によりグルコースオキシダーゼが細胞に結合する
ことを更に証明するために、実施例２のステップ５まで
繰返した。その後、遠心分離及びリン酸／クエン酸緩衝
液中への再懸濁を反復することによって細胞ペレットを
３回洗浄した。洗浄した細胞を、ＰＢＳ中のグルコース
（ 150ｍＭ）、ホースラディシュペルオキシダーゼ（10
μｇ／ｍｌ）及びテトラメチルベンジジン（ 100μｇ／
ｍｌ）の溶液に再懸濁させた。反応混合物を微量滴定ウ
ェル中で形成した。室温で30分間インキュベートし、次
いで光学密度を測定し、標準のグルコースオキシダーゼ
溶液を用いて得られた較正曲線と比較した。
【００７６】S. mutans 細胞への添加、及び比色法によ
り測定した結合グルコースオキシダーゼ量を表２に示
す。
り測定した結合グルコースオキシダーゼ量を表２に示
す。
【００７７】 表 ２ 添 加 グルコースオキシダーゼ量 ステップ２ ステップ４ Ａｂ ＰＢＳ Nil ＰＢＳ 複合体 13ｎｇ／ｍｌ Ａｂ 複合体 185ｎｇ／ｍｌ実施例４ 実施例２を繰返した。ただし、ステップ２の血清の希釈
及び複合体成分の濃度は変更した。
及び複合体成分の濃度は変更した。
【００７８】ステップ２では、抗−S. mutans 血清の３
つの異なる希釈度を使用した。ＰＢＳ中 1／4 、 1／10
及び 1／40の希釈度は McCartneyボトルに添加したとき
1／40、 1／100 及び 1／400 の最終希釈度を示した。
ステップ２の対照としてＰＢＳも使用した。
つの異なる希釈度を使用した。ＰＢＳ中 1／4 、 1／10
及び 1／40の希釈度は McCartneyボトルに添加したとき
1／40、 1／100 及び 1／400 の最終希釈度を示した。
ステップ２の対照としてＰＢＳも使用した。
【００７９】ステップ４では２つの複合体を作製し、使
用した。複合体の作製に使用した濃度は次の通りであっ
た： 複合体Ｉ 複合体II ヤギ抗−家兎ＩｇＧ 1／100 希釈 1／10 希釈 家兎抗−グルコースオキシダーゼ 1／200 希釈 1／100 希釈 グルコースオキシダーゼ 500μｇ／ｍｌ 200μｇ／ｍｌ 複合体Ｉは実施例２で使用したものであったが、複合体
IIは実施例１に示したものであった（複合体はMcCartne
y ボトルに添加したとき10倍希釈されていることに留意
されたい）。
用した。複合体の作製に使用した濃度は次の通りであっ
た： 複合体Ｉ 複合体II ヤギ抗−家兎ＩｇＧ 1／100 希釈 1／10 希釈 家兎抗−グルコースオキシダーゼ 1／200 希釈 1／100 希釈 グルコースオキシダーゼ 500μｇ／ｍｌ 200μｇ／ｍｌ 複合体Ｉは実施例２で使用したものであったが、複合体
IIは実施例１に示したものであった（複合体はMcCartne
y ボトルに添加したとき10倍希釈されていることに留意
されたい）。
【００８０】ステップ６では、実施例２と同じ 0.5％ｗ
／ｖフィルター滅菌グルコース溶液を使用し、生存細胞
数を実施例２と同様にして測定した。各種添加及び結果
を表３に示す。
／ｖフィルター滅菌グルコース溶液を使用し、生存細胞
数を実施例２と同様にして測定した。各種添加及び結果
を表３に示す。
【００８１】
【表３】 表３から明らかなように、複合体Ｉの場合標的抗血清の
量が変化しても細胞破壊の効率は変化せず、すべての希
釈度で24時間後に 100％の破壊率を示した。その前の任
意の時間においても実質的な差はなかった。標的抗血清
なしの複合体Ｉは（非特異的又は交差反応結合により）
若干の細胞毒性効果を示したが、完全な複合体ほど強力
ではなく、 100％破壊には至らなかった。
量が変化しても細胞破壊の効率は変化せず、すべての希
釈度で24時間後に 100％の破壊率を示した。その前の任
意の時間においても実質的な差はなかった。標的抗血清
なしの複合体Ｉは（非特異的又は交差反応結合により）
若干の細胞毒性効果を示したが、完全な複合体ほど強力
ではなく、 100％破壊には至らなかった。
【００８２】複合体IIも、 1／40希釈標的抗−血清の場
合にのみ24時間後に 100％の破壊率を示した。実施例５ 本実施例では、細胞にターゲットされるグルコースオキ
シダーゼ及びペルオキシダーゼを用いたヒト腫瘍細胞
（培養ＬｏＶｏ細胞）の破壊を示す。
合にのみ24時間後に 100％の破壊率を示した。実施例５ 本実施例では、細胞にターゲットされるグルコースオキ
シダーゼ及びペルオキシダーゼを用いたヒト腫瘍細胞
（培養ＬｏＶｏ細胞）の破壊を示す。
【００８３】ＬｏＶｏ細胞を組織培養物から分離し、Ｒ
ＭＩ1640組織培地中に懸濁させた。懸濁物のアリコート
を組織培養プレートのウェルに移し、37℃で４日間イン
キュベートしてＬｏＶｏ細胞をプレートに付着させた。
培地を培養プレートからチップオフし、マウス抗−Ｌｏ
Ｖｏ抗体懸濁物のアリコートを各ウェルに添加した。抗
体はＡＵＡ−１（ex Unipath Ltd. ）と称されるモノク
ローナル抗体であった。各アリコートはＡＵＡ−１抗体
懸濁物の 1／1000希釈物 200μｌであった。
ＭＩ1640組織培地中に懸濁させた。懸濁物のアリコート
を組織培養プレートのウェルに移し、37℃で４日間イン
キュベートしてＬｏＶｏ細胞をプレートに付着させた。
培地を培養プレートからチップオフし、マウス抗−Ｌｏ
Ｖｏ抗体懸濁物のアリコートを各ウェルに添加した。抗
体はＡＵＡ−１（ex Unipath Ltd. ）と称されるモノク
ローナル抗体であった。各アリコートはＡＵＡ−１抗体
懸濁物の 1／1000希釈物 200μｌであった。
【００８４】プレートを37℃で１時間インキュベート
し、抗体懸濁物をチップオフした。次に、各ウェルに、
グルコースオキシダーゼ（g. Ox ）10μｇ／ｍｌ、ホー
スラディシュペルオキシダーゼ（HRP ）10μｇ／ｍｌ、
マウス抗−G. Ox 抗体1250ｎｇ／ｍｌ、マウス抗−HRP
抗体 250ｎｇ／ｍｌ、家兎抗−マウス抗体50μｇ／ｍｌ
を含有する溶液の 200μｌアリコートを収容させた。
し、抗体懸濁物をチップオフした。次に、各ウェルに、
グルコースオキシダーゼ（g. Ox ）10μｇ／ｍｌ、ホー
スラディシュペルオキシダーゼ（HRP ）10μｇ／ｍｌ、
マウス抗−G. Ox 抗体1250ｎｇ／ｍｌ、マウス抗−HRP
抗体 250ｎｇ／ｍｌ、家兎抗−マウス抗体50μｇ／ｍｌ
を含有する溶液の 200μｌアリコートを収容させた。
【００８５】２種の複合体が ａ）ＬｏＶｏ：マウス抗−ＬｏＶｏ：家兎抗−マウス：
マウス抗−G. Ox ：G. Ox 、 ｂ）ＬｏＶｏ：マウス抗−ＬｏＶｏ：家兎抗−マウス：
マウス抗−HRP ：HRP 、を介して抗体−抗原結合により
形成された。
マウス抗−G. Ox ：G. Ox 、 ｂ）ＬｏＶｏ：マウス抗−ＬｏＶｏ：家兎抗−マウス：
マウス抗−HRP ：HRP 、を介して抗体−抗原結合により
形成された。
【００８６】これは、ＬｏＶｏ細胞を標的として図４に
示した配置である。
示した配置である。
【００８７】数個のウェルを対照として使用し、この中
には酵素のみを含有する溶液のアリコートを収容させ
た。
には酵素のみを含有する溶液のアリコートを収容させ
た。
【００８８】次いで、各ウェルにカタラーゼ溶液50μｌ
を収容させた。カタラーゼの濃度は種々変化させた。カ
タラーゼは過酸化水素を分解させる機能を有する。
を収容させた。カタラーゼの濃度は種々変化させた。カ
タラーゼは過酸化水素を分解させる機能を有する。
【００８９】プレートを37℃で１時間インキュベート
後、生存しているＬｏＶｏ細胞の数を調べた。そのため
に、この溶液 100μｌを各ウェルから取出し、（３−
（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジ
フェニル）テトラゾリウムブロミド（MTT ）（Sigma Ch
emical Co.) の 1ｍｇ／ｍｌ溶液50μｌと置換した。生
存細胞はホルマザンの青色結晶を生成した。各ウェルに
0.04Ｎ−ＨＣｌのイソプロパノール溶液 100μｌを添加
することにより、これらの青色結晶を溶解させた。ＥＬ
ＩＳＡプレート読取装置を用いて570 ｎｍの光学密度を
測定した。結果はいずれも、生存細胞が存在しないこと
を示すかなり低い吸光度、約 0.2であるか、生存細胞が
存在するときにはかなり高い吸光度、約 1.1であった。
後、生存しているＬｏＶｏ細胞の数を調べた。そのため
に、この溶液 100μｌを各ウェルから取出し、（３−
（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジ
フェニル）テトラゾリウムブロミド（MTT ）（Sigma Ch
emical Co.) の 1ｍｇ／ｍｌ溶液50μｌと置換した。生
存細胞はホルマザンの青色結晶を生成した。各ウェルに
0.04Ｎ−ＨＣｌのイソプロパノール溶液 100μｌを添加
することにより、これらの青色結晶を溶解させた。ＥＬ
ＩＳＡプレート読取装置を用いて570 ｎｍの光学密度を
測定した。結果はいずれも、生存細胞が存在しないこと
を示すかなり低い吸光度、約 0.2であるか、生存細胞が
存在するときにはかなり高い吸光度、約 1.1であった。
【００９０】結果は次の通りであった。
【００９１】 カタラーゼ濃度 570ｎｍにおける吸光度 （μｇ／ｍｌ） 酵素溶液 酵素＋抗体 ０ Ｌ Ｌ ２．５ Ｈ Ｌ ５ Ｈ Ｌ １０ Ｈ Ｌ ２０ Ｈ Ｌ ４０ Ｈ Ｈ ８０ Ｈ Ｈ 上記表中、Ｌは実験誤差内で０．２を示し、Ｈは実験誤
差内で１．１を示す。
差内で１．１を示す。
【００９２】カタラーゼが存在しないと、遊離酵素でも
ＬｏＶｏ細胞を破壊した。40μｇ／ｍｌ以上の濃度で
は、Ｈ2 Ｏ2 の捕捉により全ての細胞破壊が抑制され
た。低濃度のカタラーゼでは、遊離酵素による細胞破壊
が抑制されたが抗体が存在するときには抑制されなかっ
た。このことは、酵素が細胞を破壊し得たこと、抗体が
標的細胞に付着することによってより有効な酵素を作製
したことを示す。実施例６ 実施例５と同様に、本実施例は細胞にターゲットされる
グルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを用いた
細胞の破壊を示す。本実施例の細胞は、口内に存在する
S. sanguisであった。本実施例で使用した抗体は標準方
法により作製した。
ＬｏＶｏ細胞を破壊した。40μｇ／ｍｌ以上の濃度で
は、Ｈ2 Ｏ2 の捕捉により全ての細胞破壊が抑制され
た。低濃度のカタラーゼでは、遊離酵素による細胞破壊
が抑制されたが抗体が存在するときには抑制されなかっ
た。このことは、酵素が細胞を破壊し得たこと、抗体が
標的細胞に付着することによってより有効な酵素を作製
したことを示す。実施例６ 実施例５と同様に、本実施例は細胞にターゲットされる
グルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを用いた
細胞の破壊を示す。本実施例の細胞は、口内に存在する
S. sanguisであった。本実施例で使用した抗体は標準方
法により作製した。
【００９３】S. sanguis細胞を培養ブイヨンから遠心分
離し、ＰＢＳ中に再懸濁して遠心分離することにより３
回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。アリコートを複数
のチューブの各々に配置し、遠心分離し、マウスポリク
ローナル抗−S. sanguis抗体（腹水から得た）のフィル
ター滅菌懸濁物（ＰＢＳ中）に再懸濁させた。懸濁物を
室温で30分間インキュベートして抗体を細胞に結合させ
た。細胞を再び遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。
離し、ＰＢＳ中に再懸濁して遠心分離することにより３
回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。アリコートを複数
のチューブの各々に配置し、遠心分離し、マウスポリク
ローナル抗−S. sanguis抗体（腹水から得た）のフィル
ター滅菌懸濁物（ＰＢＳ中）に再懸濁させた。懸濁物を
室温で30分間インキュベートして抗体を細胞に結合させ
た。細胞を再び遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。
【００９４】対照として使用した数個のチューブにはマ
ウス抗−S. sanguis懸濁物の代りにＰＢＳを収容させ
た。
ウス抗−S. sanguis懸濁物の代りにＰＢＳを収容させ
た。
【００９５】次に、細胞を、グルコースオキシダーゼ
（G. Ox ） 100μｇ／ｍｌ、ホースラディシュペルオキ
シダーゼ（HRP ） 100μｇ／ｍｌ、マウス抗−G. Ox モ
ノクローナル抗体1.25μｇ／ｍｌ、マウス抗−HRP モノ
クローナル抗体1.25μｇ／ｍｌ、家兎抗−マウスポリク
ローナル抗体50μｇ／ｍｌを含有するＰＢＳ 1ｍｌに再
懸濁させた。（家兎抗−マウス抗体は他の４つの物質を
既に含む溶液に添加した。）数個のチューブには、酵素
及び抗体を含有する上記溶液に代えてＰＢＳのみを収容
させた。別のチューブには酵素及び抗体を含有する溶液
を使用したが、家兎抗−マウス抗体を省いた。
（G. Ox ） 100μｇ／ｍｌ、ホースラディシュペルオキ
シダーゼ（HRP ） 100μｇ／ｍｌ、マウス抗−G. Ox モ
ノクローナル抗体1.25μｇ／ｍｌ、マウス抗−HRP モノ
クローナル抗体1.25μｇ／ｍｌ、家兎抗−マウスポリク
ローナル抗体50μｇ／ｍｌを含有するＰＢＳ 1ｍｌに再
懸濁させた。（家兎抗−マウス抗体は他の４つの物質を
既に含む溶液に添加した。）数個のチューブには、酵素
及び抗体を含有する上記溶液に代えてＰＢＳのみを収容
させた。別のチューブには酵素及び抗体を含有する溶液
を使用したが、家兎抗−マウス抗体を省いた。
【００９６】すべての懸濁物を室温で30分間インキュベ
ートして酵素を細胞に結合させるようにした。次に、細
胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、15μｇ／ｍｌのヨウ
化カリウムと 5％ｗ／ｖグルコースを含有するＰＢＳ 1
ｍｌ中に再懸濁させた。
ートして酵素を細胞に結合させるようにした。次に、細
胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、15μｇ／ｍｌのヨウ
化カリウムと 5％ｗ／ｖグルコースを含有するＰＢＳ 1
ｍｌ中に再懸濁させた。
【００９７】これらの懸濁物を室温で24時間インキュベ
ートした。インキュベート前、インキュベート開始から
１，２，３，４及び２４時間経過後に各懸濁物からサン
プルを取り、各サンプル中の生存細胞を実施例１と同様
にしてアッセイした。結果を表４に示す。
ートした。インキュベート前、インキュベート開始から
１，２，３，４及び２４時間経過後に各懸濁物からサン
プルを取り、各サンプル中の生存細胞を実施例１と同様
にしてアッセイした。結果を表４に示す。
【００９８】
【表４】 両酵素が標的細胞に付着しているサンプルＢが他のサン
プルよりも非常に効果的に細胞を破壊した。実施例７ 本実施例は、歯のよごれを漂白するためのターゲットさ
れた酵素の使用をインビトロのモデルとして例示するも
のである。モデル表面としてニトロセルロース膜を使用
した。
プルよりも非常に効果的に細胞を破壊した。実施例７ 本実施例は、歯のよごれを漂白するためのターゲットさ
れた酵素の使用をインビトロのモデルとして例示するも
のである。モデル表面としてニトロセルロース膜を使用
した。
【００９９】膜を標準のマウス血清と１時間インキュベ
ートした。前記血清はマウスイムノグロブリンみを含
む。したがって、マウス抗体は膜に付着するようにな
る。次いで、膜を 3％牛血清アルブミン溶液とインキュ
ベートして、膜上に残存する結合サイトをブロックし
た。上記のようにして処理した膜のサンプルを対照及び
試験サンプルとして使用した（各々につき４個）。
ートした。前記血清はマウスイムノグロブリンみを含
む。したがって、マウス抗体は膜に付着するようにな
る。次いで、膜を 3％牛血清アルブミン溶液とインキュ
ベートして、膜上に残存する結合サイトをブロックし
た。上記のようにして処理した膜のサンプルを対照及び
試験サンプルとして使用した（各々につき４個）。
【００１００】膜の試験サンプルを、前記実施例で使用
した溶液と類似の構成を有する、グルコースオキシダー
ゼ（G. Ox ） 100μｇ／ｍｌ、ホースラディシュペルオ
キシダーゼ（HRP ） 100μｇ／ｍｌ、マウス抗−G. Ox
モノクローナル抗体1.25μｇ／ｍｌ、マウス抗−HRP モ
ノクローナル抗体1.25μｇ／ｍｌ、家兎抗−マウスポリ
クローナル抗体50μｇ／ｍｌを含有する溶液とインキュ
ベートした。
した溶液と類似の構成を有する、グルコースオキシダー
ゼ（G. Ox ） 100μｇ／ｍｌ、ホースラディシュペルオ
キシダーゼ（HRP ） 100μｇ／ｍｌ、マウス抗−G. Ox
モノクローナル抗体1.25μｇ／ｍｌ、マウス抗−HRP モ
ノクローナル抗体1.25μｇ／ｍｌ、家兎抗−マウスポリ
クローナル抗体50μｇ／ｍｌを含有する溶液とインキュ
ベートした。
【０１０１】図４に示すような複合体が形成された。ニ
トロセルロース膜が標的であった。
トロセルロース膜が標的であった。
【０１０２】次いで、試験サンプル及び対照サンプルを
紅茶で汚した。沸騰水中の紅茶の葉（２重量％）の滲出
液を放置して室温まで冷却し、試験サンプル及び対照サ
ンプルと５分間インキュベートした。その後、サンプル
をＰＢＳ中で１時間すすいで、未結合のカラーを除去し
した。
紅茶で汚した。沸騰水中の紅茶の葉（２重量％）の滲出
液を放置して室温まで冷却し、試験サンプル及び対照サ
ンプルと５分間インキュベートした。その後、サンプル
をＰＢＳ中で１時間すすいで、未結合のカラーを除去し
した。
【０１０３】サンプルを、 5.4重量％のグルコースを含
有するｐＨ 7.2のＰＢＳ溶液中で一晩（18時間）インキ
ュベートした。これにより、結合酵素に対する基質が形
成され、紅茶のしみの近傍に反応性物質が生成されると
予測される。
有するｐＨ 7.2のＰＢＳ溶液中で一晩（18時間）インキ
ュベートした。これにより、結合酵素に対する基質が形
成され、紅茶のしみの近傍に反応性物質が生成されると
予測される。
【０１０４】サンプル中のしみの程度を、グルコース溶
液とインキュベートする前後でMinolta CR 200比色計を
用いて反射率を測定することにより評価した。結果を数
値で示す。
液とインキュベートする前後でMinolta CR 200比色計を
用いて反射率を測定することにより評価した。結果を数
値で示す。
【０１０５】反射率の増加及び標準偏差は次の通りであ
った。
った。
【０１０６】 試験サンプル（酵素含有） 1.17± 0.042 対照サンプル 0.15± 0.31 このことから、試験サンプルは対照サンプルに比べて漂
白度に有意な差（ｐ＜0.05）があることが明らかであ
る。
白度に有意な差（ｐ＜0.05）があることが明らかであ
る。
【図１】グルコースオキシダーゼを標的に付着させるべ
く使用される全抗体を示す。
く使用される全抗体を示す。
【図２】より複雑な治療薬の類似の付着を示す。
【図３】図１と同様のグルコースオキシダーゼの付着と
第二の酵素の化学的接合を示す。
第二の酵素の化学的接合を示す。
【図４】２種の酵素が全抗体により付着した場合の２種
の酵素の標的に対する付着を示す。
の酵素の標的に対する付着を示す。
【図５】抗体フラグメントを使用した場合の酵素の標的
に対する付着を示す。
に対する付着を示す。
１０，４０ 標的 １２，４２ 抗原部位 １４ 家兎抗−S. mutans １８ 家兎抗−グルコースオキシダーゼ ２０ ヤギ抗−家兎 ２２ ヤギ抗−家兎イムノグロブリン ２６ 家兎抗−ホースラディッシュペルオキシダーゼ ４４ Ｆｖ抗体フラグメント ４６ ペプチド ４８，５０ Ｆｖフラグメント ５０ Ｆ(ab)2 フラグメント
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ポール・ジエームズ・デイビス イギリス国、ベツドフオードシヤー・エ ム・ケー・43・７・イー・エツクス、フ エルマーシヤム、パベンハム・ロード、 ザ・ホーソーンズ（番地なし) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/395 A61K 7/16 ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (13)
- 【請求項１】 同一もしくは別個のビヒクル中に、 ｉ）標的部位に抗体−抗原結合により結合する第一の抗
体または抗体フラグメント、 ii）１つまたはそれ以上の、抗体−抗原結合により活性
物質と第一の抗体またはフラグメントの両方に集合的に
結合することによって標的部位に活性物質を付着させ得
る第二の抗体または抗体フラグメント、 を含む１つもしくはそれ以上のビヒクルからなることを
特徴とする製品。 - 【請求項２】 活性物質をも含むことを特徴とする請求
項１に記載の製品。 - 【請求項３】 第二の抗体またはフラグメントが活性物
質に結合する抗体または抗体フラグメント及び第一の抗
体またはフラグメントと活性物質に結合する抗体または
フラグメントの両方に結合し得る第三の抗体またはフラ
グメントであることを特徴とする請求項１または２に記
載の製品。 - 【請求項４】 第一の抗体及び第二の抗体が全抗体であ
り、活性物質に対する抗体及び第一の抗体はともに同一
の種に由来するものであり、第三の抗体は前記種に対し
て別の種の抗体であることを特徴とする請求項３に記載
の製品。 - 【請求項５】 活性物質が酵素であることを特徴とする
請求項１〜４のいずれかに記載の製品。 - 【請求項６】 酵素がオキシダーゼであることを特徴と
する請求項５に記載の製品。 - 【請求項７】 ビヒクルが２種の酵素を含有することを
特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の製品。 - 【請求項８】 複数の第二の抗体または抗体フラグメン
トが２種の酵素の各々に結合する別個の抗体またはフラ
グメント及びいずれの抗−酵素抗体またはフラグメント
をも第一の抗体またはフラグメントに結合させ得る第三
の抗体からなることを特徴とする請求項７に記載の製
品。 - 【請求項９】 酵素がペルオキシドを発生するオキシダ
ーゼ及びペルオキシダーゼであることを特徴とする請求
項７または８に記載の製品。 - 【請求項１０】 第一の抗体及び第二の抗体が全抗体で
あり、抗体の少なくとも１つはモノクローナル抗体であ
ることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の製
品。 - 【請求項１１】 ビヒクルが口内に局所適用するのに適
していることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに
記載の製品。 - 【請求項１２】 第一の抗体または抗体フラグメントが
ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）、ス
トレプトコッカス・サングイス（S. sanguis）、アクチ
ノマイセス・ビスコーサス（A. viscosus）またはアク
チノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）に対す
る抗体であることを特徴とする請求項１１に記載の製
品。 - 【請求項１３】 製品がうがい薬、練り歯磨きまたは薬
用ドロップであるか、あるいは少なくとも１つのビヒク
ルがうがい薬、練り歯磨きまたは薬用ドロップより供給
されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記
載の製品。
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| GB9006327.2 | 1990-03-21 | ||
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| GB909021671A GB9021671D0 (en) | 1990-10-05 | 1990-10-05 | Delivery of agents |
| GB9021671.4 | 1990-10-05 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05262669A JPH05262669A (ja) | 1993-10-12 |
| JP3098050B2 true JP3098050B2 (ja) | 2000-10-10 |
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ID=26296814
Family Applications (1)
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| JP (1) | JP3098050B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| NL1009834C2 (nl) * | 1998-08-10 | 2000-02-11 | Stanislaus Laurens Johan Woute | Antistoffen voor toepassing in de gerichte en tijdelijke behandeling van mens en dier. |
| WO2001019871A2 (en) * | 1999-09-16 | 2001-03-22 | Unilever Plc | Delivery system for antidandruff agent |
| US7807141B2 (en) | 2003-09-08 | 2010-10-05 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Peptide-based oral care surface reagents for personal care |
| US7220405B2 (en) | 2003-09-08 | 2007-05-22 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Peptide-based conditioners and colorants for hair, skin, and nails |
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| US7285264B2 (en) | 2003-09-08 | 2007-10-23 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Peptide-based body surface coloring reagents |
| US7736633B2 (en) | 2005-09-28 | 2010-06-15 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for enhancing effects of colorants and conditioners |
| MX2010013847A (es) | 2008-06-13 | 2011-03-15 | Oragenics Inc | Uso de bacteria productora de peroxido de hidrogeno para blanquear dientes. |
| US8481678B2 (en) | 2009-03-30 | 2013-07-09 | E I Du Pont De Nemours And Company | Peptide-based tooth whitening reagents |
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| US4943525A (en) * | 1987-11-02 | 1990-07-24 | Bioventures, Inc. | Simultaneous immunoassay for the determination of antigens and antibodies |
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