MXPA00003618A - Composiciones para controlar la colonizacion bacteri - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una composición para controlar el crecimiento/colonización bacteriana. La composición comprende una enzima, una molécula de anclaje acoplada a la enzima para formar un complejo de enzima-anclaje, con el anclaje que es capaz de unirse o fijarse a un substrato próximo a una colonia bacteriana. La unión o fijación al substrato permite el tiempo de retención prolongado del complejo de enzima-anclaje en donde la colonia bacteriana esta presente para incrementar la efectividad del complejo. La invención también es un método para controlar la colonización, de la placa bacteriana en la cavidad oral, asícomo también un método para formar una composición para controlar la proliferación de colonias de bacterias en la cavidad or

Description

COMPOSICIONES PARA CONTROLAR LA COLONIZACIÓN BACTERIANA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a composiciones para controlar la colonización bacteriana, particularmente, pero sin restringirse a, una aplicación oral para reducir la placa dental. La invención también es para un tratamiento terapéutico oral el cual limitará o restringirá la extensión de colonización de bacterias en la cavidad oral reduciendo asi la cantidad de placa dental. Controlando la extensión o tamaño de las estructuras de placas con enzimas, la proliferación de colonia bacteriana y su invasión en tejido gingival puede ser limitada. La invención también se refiere a método de fabricación de tales composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad periodontal es una de las enfermedades del hombre más viejas y más comunes. Es evidente en restos fósiles en humanos y ocurre de otra REF.: 119468 forma en individuos sanos. En la actualidad, la enfermedad periodontal representa un principal problema de salud en el mundo. La enfermedad es un resultado de la acumulación de placa dental al margen del gingival. Existen dos clases amplias de enfermedad periodontal la cual se aproxima ásperamente al grado o severidad de la patología: gingivitis y periodontitis. La gingivitis es una inflamación del tejido gingival marginal debido a la acumulación de placa dental. Para la mayor parte, la gingivitis se caracteriza por calidad de rojizo, hinchado y matizado del tejido gingival. La extensión y severidad de estas características indica el grado al cual la enfermedad ha progresado. La periodontitis se caracteriza no sólo por la inflamación de las encias marginales, sino también por pérdida de la unión del ligamento periodontal, pérdida de hueso alveolar y pérdida de la unión epitelial debido a la migración apical. Las consecuencias patológicas de estas pérdidas fisiológicas es la formación de una bolsa o cavidad periodontal, la cual puede llegar a infectarse, y asi ser la fuente de infiltración bacteriana en el huésped. El progreso de la gingivitis establecida a una lesión avanzada, puede inducir también a la fundación para periodontitis.

La literatura indica que existe desplazamiento de población microbiana significante desde sitios de inflamaciones gingivales a cavidades subgingivales . Ciertos organismos bacterianos identificados y específicos son conocidos por ser responsables de la enfermedad periodontal en humanos; sin embargo, otros organismos también pueden contribuir a la severidad de la enfermedad. Además, resultados a partir de los estudios clínicos muestran una correlación entre la presencia de ciertas especies microbianas y tipos diferentes y grados de severidad de la enfermedad periodontal. Existe una relación causa y efecto entre la presencia y cantidad de placa, que contiene una amplia variedad de cepas de bacterias colonizadas, y enfermedad periodontal. Por lo tanto, resulta que, limitando la placa, - el grado y severidad de la enfermedad periodontal pueden ser controlados. Tanto la gingivitis crónica como la periodontitis crónica forman dos características importantes las cuales pueden ser indicio de su relación secuencial. Ambas condiciones usualmente no causan dolor hasta sus estados más avanzados y ambas patologías tienen un requerimiento absoluto para placa bacteriana antes de que la secuencia de estas condiciones progrese y se desarrolle en enfermedad periodontal avanzada. Mientras que existen factores externos y sistémicos secundarios los cuales afectan la prolongación de la enfermedad, el factor más importante, y uno que proporciona la promesa más grande de ser controlable, es la relación entre placa bacteriana y enfermedad periodontal . La enfermedad inicia su progreso a través de una acumulación de placa bacteriana al margen gingival. Cuando la patología progresa, existe inflamación crónica de la encia y ligamento periodontal, con degeneración subsecuente de varias estructuras encia-diente . La inflamación crónica es exacerbada por cálculos formados de placa mineralizada en las diverjas interfases o entrecaras del tejido y en la bolsa o cavidad periodontal. La migración del tejido epitelial en áreas inflamadas y necróticas pueden rodear las estructuras de la placa, resultando en abscesos acompañados por exudado purulento. El estado final y más severo de enfermedad periodontal es la resorción de hueso alveolar y la exfoliación eventual del diente. La placa es una mezcla heterogénea de agregaciones bacterianas embebidas en una matriz pegajosa. Mientras que la composición bacteriana de la placa varia desde 50 a 70 por ciento, la matriz se deriva de células muertas, glicoproteina salival y proteínas de suero que son depositadas en un esqueleto de polisacárido. La bacteria sintetiza los polisacáridos para el esqueleto de la placa como un paso en su proceso de colonización. Además de la bacteria viable y la matriz, también la placa contiene residuos de alimentos, pequeños número de células epiteliales, células de la sangre blancas y varios componentes diferentes los cuales se derivan del huésped o paciente y las actividades del paciente. La formación y desarrollo o proliferación de placa ocurre en dos estados. El primer paso puede requerir una capa de base de glicoproteinas salivales en la superficie del diente asi como también en el tejido suave o blando en la cavidad oral. Esta capa orgánica de base, derivada de la saliva, se absorbe en la superficie y forma una película adquirida. Esta película adquirida insoluble sirve como la fundación para placa supragingival . El segundo paso es la colonización bacteriana por la "promoción o colonización" de bacteria de la película adquirida. Una vez que la bacteria se ha unido a la superficie de una estructura, el mismo agregado, desarrolla colonias y placa que empieza a formarse.

Existen también arriba de 100 diferentes especies bacterianas en varias placas dentales. Esta variación en los tipos de bacteria es influenciada por dieta, componentes de la saliva e interacciones bacterianas, por nombrar algunas. La localización de la placa en la cavidad oral, el tiempo del dia, edad del paciente y el estado de la higiene oral general del paciente contribuye a las implicaciones y consecuencias de placa dental y enfermedad periodontal. En consecuencia, no es sorprendente que la placa sea una colección heterogénea de comunidades bacterianas unidas al diente proporcionando un vasto arreglo o bioquímico y consecuencias fisiológicas. Dos principales condiciones patológicas como consecuencias son la enfermedad periodontal y caries dental. Las enzimas como agentes terapéuticos presentan posibilidades únicas. Sin embargo, algunas de las enzimas que se usan en la búsqueda de la patología oral más temprana, se basa en la hipótesis de que las mismas podrían ser bactericidas para colonias de organismos encontrados en la placa y por lo tanto podrían actuar como "desinfectantes". Este planteamiento, sin embargo, no fue provechoso. Recientemente, se mostró que el tratamiento de células epiteliales bucales con adhesión bacteriana alterada por proteasa; sin embargo, este tratamiento también distorsiona las variaciones de diversas poblaciones bacterianas. Se obtuvieron resultados más prometedores cuando el foco se desplazó desde la < 5 acción bacteriana para alterar la formación de placa. Estos últimos resultados se observaron in vitro e in vivo asi como también en modelos de animales y humanos en ensayos clínicos. Sin embargo, estas hipótesis también resultan deficientes de efectividad 10 terapéutica deseada, más probablemente a causa del tiempo requerido por una acción efectiva excedida del tiempo de retención de la enzima en la cavidad oral. En suma, el flujo de saliva, otro fluido y movimiento de_ alimentos y agitación mecánica normal en la cavidad 15 oral reducen el tiempo de retención de la(s) enzima (s). Estos factores acortan el tiempo de residencia de las enzimas, resultando en menos eficacia clínica deseable. Cuando las enzimas se probaron in vitro, la 20 importancia del tiempo de residencia dentro de la cavidad oral no se identificó como una resultado importante. No hay indicación de que el diseño de estos estudios in vitro identifique mejor esta variable importante. Estos sistemas in vitro, que 25 demuestran actividad de enzimas en la reducción de placa, sin embargo, realizan la identificación de otros factores importantes. Estos otros factores incluyen: (1) posiblemente sea necesaria más de una enzima; (2) se puede requerir mayor actividad especifica; (3) se puede requerir una enzima más apropiada; o (4) puede ser más efectiva una combinación de enzimas. La placa por si misma es una mezcla extremadamente compleja de varios componentes, principalmente, macromoléculas, células vivas y muertas (bacteria completa y células epiteliales desechadas del huésped) , los fragmentos de células y varias contribuciones diferentes de material a partir del huésped ,y la flora bacteriana. La colonización trabaja en los aspectos químicos de la placa enfocada en el carbohidrato o esqueleto de polisacárido (PS) de placa. Este fue un lugar ideal para iniciar a causa de que el esqueleto de PS no sólo sirve como un elemento estructural para la matriz de la placa, pero también sirve como un almacenamiento de alimentos de carbohidratos para las colonias de crecimiento de bacteria. Más de la búsqueda en PS se centro alrededor de determinar las propiedades y estructura de glucanos; sin embargo, existen muchos otros componentes que forman la composición de la placa. En vista de la literatura científica que describe la búsqueda terapéutica dental previa que involucra las enzimas, ciertas configuraciones emergen. Más de la búsqueda de enzimas para controlar placa se condujo -*• 5 bajo la protección de la prevención de caries; sin embargo, está bien establecido que el control de la placa es un resultado fundamental relacionado con la prevención de la caries y la prevención de enfermedades periodontales . Los tipos de 10 investigaciones se realizan incluyendo el examen in vitro de efectos bactericidas, estudios de animales e investigaciones clínicas que involucran la experimentación humana. Además, más estudios clínicos usan un enjuague bucal como el vehículo para 15 suministrar las enzimas, mientras que los pocos estudios usan goma de mascar. La Patente Norteamericana No. 4,138,476 (Simonson) enseña las enzimas que dispersan la placa como agente terapéuticos por alteración molecular. Una 20 glucanohidrolasa se combina con un grupo portador de fosfato de modo que la enzima por si misma tuvo afinidad incrementada para las superficies de los dientes. La enzima, de glucanohidrolasa modificada reticula covalentemente con el portador, en la 25 presencia de un agente de reacción tal como cloroformato de etilo, y tuvo una capacidad de enlace aumentada a componentes de hidroxiapatita de los dientes . La Patente Norteamericana No. 5,490,988 (Beggs) se refiere al suministro de agentes terapéuticos a un sitio de blanco. La patente enseña un proceso altamente específico por el cual un fragmento de anticuerpo es capaz de unirse a un sitio de blanco a través del enlace antígeno-anticuerpo, y proporciona un agente terapéutico para ser conectado al fragmento de anticuerpo a través de un péptido adicional unido al fragmento de anticuerpo. El producto está constituido así por el fragmento de anticuerpo, el péptido y el agente. El examen de los protocolos clínicos publicados para evaluar enzimas muestra que fueron dos razones de porqué las enzimas seleccionadas no ejercieron completamente sus efectos deseados, a pesar de que la eficiencia clínica limitada se observó: a. las enzimas no se modificaron de modo que las mismas podrían ser mantenidas en la cavidad oral por un periodo prolongado de tiempo; y b. el enjuague oral se dio por varias duraciones y varios periodos seleccionados durante el día sin atención particular para dosificar previo a un periodo de actividad oral limitada (tragar, masticar y generar saliva, etc.) semejante a descansar.

. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto principal de la invención se une en dos conceptos, ambos de los cuales son necesarios para una terapia exitosa para la prevención de enfermedad periodontal. El primero de estos es la regulación de la cantidad y arquitectura de la estructura de la placa dentro de la cavidad oral usando enzimas; el segundo es el medio de mantener las enzimas en la cavidad oral. Ambos de estos conceptos preferiblemente se deben implementar para que ocurra el control efectivo de la enfermedad periodontal. En un aspecto, la presente invención modifica las enzimas seleccionadas de una manera que las mismas tienen la capacidad de limitar la placa o sus componentes. Las enzimas seleccionadas son preferiblemente algunas que degradan específicamente los polisacáridos. De esta forma, la estructura del esqueleto de la matriz de placa se puede limitar sin ya sea muerte de espectro amplio o selectiva de bacteria, permitiendo así cualquier falta de equilibrio bacteriana. La invención se proporciona para el control selectivo de la colonización bacteriana proliferativa y, por lo tanto, está dirigida a prevenir antes que el tratamiento. La invención no es dependiente de la actividad bactericida en la cavidad oral la cual elimina la (a) falta de equilibrio potencial en las poblaciones bacterianas normales, por ejemplo, sobrecrecimiento en la actividad oral o a otra, locaciones remotas en o sobre el huésped; (b) el requerimiento para considerar respuestas sistémicas del huésped el cual puede ser ya sea inmunológico y tóxico; y (c) la necesidad por suministrar los agentes activos debajo del margen gingival. La énfasis está así sobre la adhesión bacteriana, específicamente en la cavidad oral. La enzima modificada se une preferiblemente a la(s) molécula (s) de "anclaje" para ser mantenida en la cavidad oral. La retención de las enzimas en la cavidad oral se maximiza preferiblemente acoplando las enzimas a moléculas específicas que se adherirán a las estructuras y que existen biopelículas dentro de la cavidad oral. La actividad enzimática deberá ser mantenida después del acoplamiento. Es importante que el proceso para conectar las enzimas seleccionadas a las moléculas de "anclaje" específicas, no destruya completamente la actividad enzimática, aunque es posible que tal actividad se pueda reducir a causa del acoplamiento. Sin embargo, al menos una cantidad efectiva mínima de actividad enzimática debería estar presente después del acoplamiento. En otro aspecto, la invención también proporciona un método para determinar la prolongación a la cual las enzimas seleccionadas y modificadas inhiben el crecimiento de la placa bacteriana oral en un sistema de prueba in vitro, e in vivo. Las. enzimas seleccionadas las cuales mantienen esta actividad enzimática después de ser acoplada o derivada a moléculas de "anclaje" son adecuadas para su uso para inhibir el crecimiento de la placa. El producto de la invención, puede, pero necesita no necesariamente, tomar la forma de un enjuague oral el cual puede ser usado a la hora de acostarse. Las enzimas modificadas en el enjuague oral están retenidas preferiblemente en la cavidad oral durante un tiempo cuando la agitación mecánica y salival es baja. Además, la longitud del tiempo de retención (seis a ocho horas durante el descanso) puede proporcionar un periodo prolongado para las enzimas terapéuticas para realizar sus reacciones bioquímicas deseadas. La invención se dirige a la paradoja con respecto a la placa dental: por una parte, los factores patogénicos tales como bacteria y placas son mantenidos en la cavidad oral, pero, por otra parte, es difícil mantener los agentes potencialmente terapéuticos, tales como enzimas, en la cavidad oral. Esta paradoja puede ser usada como ventaja para controlar la placa dental proporcionando enzimas seleccionadas, el trato específico que la bacteria usa para causar la enfermedad periodontal, es decir, la capacidad para adherir superficies en la cavidad oral. En esta invención, se ha proporcionado una consideración significante a la idea importante y necesaria para incrementar el tiempo de retención en la cavidad oral de la composición antiplaca, puesto que es únicamente por la extensión del periodo de mantenimiento de la composición en la cavidad oral, que tiene la capacidad de prevenir efectivamente la acumulación de la placa. En donde las composiciones antiplaca consumen únicamente una duración muy corta de tiempo en la cavidad oral, su efecto es por la definición muy limitativa. Para lograr la muerte o exterminio de bacterias, puede ser adecuado un periodo de retención corto; sin embargo, con el nuevo concepto de alterar y limitar la arquitectura estructural del medio de soporte de crecimiento de la colonia bacteriana, se puede requerir un periodo de retención *_*_ t 5 más largo. La búsqueda previa para reducir o eliminar la enfermedad periodontal, se ha pretendido directamente, para la mayor parte, para la eliminación de bacterias; sólo la búsqueda menor se ha dirigido para controlar 10 el ambiente bacteriano. La presente invención intenta controlar el crecimiento de la colonia bacteriana mientras que al mismo tiempo mantiene un equilibrio entre las diversas cepas de bacteria en la cavidad oral. Controlando la cantidad de placa y limitando la 15 cantidad del esqueleto polisacárido extracelular, se puede controlar el tamaño de las colonias bacterianas. Este control se puede lograr a través de las composiciones enzimáticas y procesos de la invención. 20 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una vista esquemática del complejo de enzima-anclaje de la invención, cuando se 25 une o fija a un diente; La Figura 2 es una vista esquemática del complejo de enzima-anclaje de la invención, cuando se une a una película u otra superficie en la cavidad oral ; La Figura 3 es una vista esquemática de una modalidad adicional del complejo enzima-anclaje de la invención, cuando se une o fija en la cavidad oral; La Figura 4 es una vista esquemática del complejo de enzima-anclaje de la invención, cuando se une a una matriz de colonia bacteriana en la cavidad oral; y La Figura 5 es una vista esquemática del complejo de enzima-anclaje de la invención, cuando se une o fija a una bacteria en la matriz de la colonia bacteriana en la cavidad oral.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención proporciona la retención de enzimas seleccionadas en la cavidad oral. A menos que se incorporen enzimas libres y nacientes en un dentífrico o enjuague oral (en donde los efectos son únicamente momentáneos), a las enzimas se les permite tener una oportunidad prolongada para realizar sus reacciones bioquímicas deseadas y efectos benéficos modificándolas de modo que las mismas pueden ser retenidas dentro de la cavidad oral. Además, las enzimas específicas se seleccionan preferiblemente para minimizar las respuestas tóxicas en la bacteria para mantener el equilibrio bacteriano normal y a la vez no afectar adversamente otras biopeliculas necesarias y protectoras, por ejemplo, la "película adquirida" . Ciertos polisacáridos que degradan las enzimas son modificados de modo que los mismos son capaces de absorber superficies y estructuras en la cavidad oral e inhibir la colonización bacteriana proliferativa asociada con la matriz de placa. Las enzimas son derivadas o acopladas a moléculas de "anclaje". La porción de "anclaje" del complejo enzima-anclaje puede adherirse también a estructuras en la cavidad oral, inhibiendo la acumulación de la placa. Los Streptoccoccus utans y la placa son reconocidos como que están involucrados íntimamente en la formación de caries dental. Esta bacteria cariogénica utiliza sucrosa para producir substratos para el metabolismo para la población microbiana completa en la cavidad oral. Los productos finales de este metabolismo soportado por sucrosa son ácidos orgánicos que inician la secuencia de pasosinvolucrados en la formación de caries dental. Además, el Streptococcus mutans también usa sucrosa para mejorar la colonización de la flora oral usando el pozo de substrato soportado por sucrosa para producir polisacáridos que son complejos y agua soluble. Este escenario tiene lugar más probablemente con muchas otras bacterias que son colonizadas con la placa dental. Las estructuras de polisacáridos insolubles proporcionan el esqueleto para la colonización bacteriana prolongada la cual, cuando se agrega, es la película observable reconocida como placa. Mientras que los polisacáridos no son un requerimiento para la unión o fijación inicial de las bacterias "colonizadoras" a la superficie del diente, la colonización y perpetuidad de colonias requiere estos polisacáridos insolubles. Es probable que los polisacáridos complejos, por su naturaleza insoluble, no sólo causan la colonización y proliferación de las bacterias iniciales, sino que también pueden escudar las bacterias de agentes terapéuticos. En consecuencia, esta invención se puede usar en conjunción con agentes que resultan en el exterminio de bacterias, ya sea específicas o no específicas. La restricción y control de la cantidad de polisacáridos insolubles, y finalmente la colonización bacteriana en la placa, tuvo un efecto benéfico para la prevención y progreso de la enfermedad periodontal. Uno de estos complejos, polisacáridos insolubles es glucano . Por lo tanto, la degradación enzimática de glucano es uno de los objetos de esta invención. La invención proporciona una composición y método para inmovilizar ciertas enzimas que degradan el glucano a las superficies y estructuras en la cavidad oral. Esto inhibe la acumulación de placa que es un paso precursor necesario para la enfermedad periodontal. Inhibir la colonización bacteriana proliferativa puede evitar también cualquier distorsión de la ecología microbiana o equilibrio entre las diversas cepas bacterianas. En general, evitar el desplazamiento de la problación bacteriana es deseable a causa de la potencia del sobrecrecimiento de bacterias oportunistas, algunas de las cuales pueden ser patogénicas. La composición de la invención busca retener las relaciones o proporciones relativas normales de las diversas cepas bacterianas en la cavidad oral. Sin embargo, los números absolutos de la menos ciertas cepas de las bacterias se reducirán a causa de que las colonias de las mismas serán más pequeñas. El desarrollo de un mecanismo para incrementar el tiempo de residencia de la enzima en la cavidad oral proporciona la oportunidad para la eficacia clínica aumentada. Para lograr esta meta, las enzimas efectivas deben permanecer en la cavidad oral más grande para realizar su acción pretendida. El tiempo de retención aumentada de las enzimas en la cavidad oral controlará la placa limitando el esqueleto de polisacárido de la matriz de la placa. La composición de la invención está diseñada así para facilitar un tiempo de residencia más largo p rara las enzi tmas en la cavidad oral. Este acercamiento involucra la derivación, o acoplamiento, la(s) enzima (s) apropiadas con una molécula de "anclaje" la cual se unirá a estructuras en la cavidad oral con la porción de "anclaje" del complejo enzima-anclaje derivado. La molécula de anclaje se elegirá específicamente para unirse a, por ejemplo, placa existente o la película adquirida que cubre el diente. Debido al movimiento relativamente rápido del tejido epitelial, la capa de tejido de mucosa dentro de la cavidad oral es una elección menos preferida de un sitio de enlace que la placa existente o película.

En una modalidad, dos enzimas con el tipo de actividad enzimática que ha mostrado ser efectiva para controlar el esqueleto estructural de carbohidrato de ,k la placa, están conectadas a tres moléculas de '. . 5 "anclaje". Los seis complejos de enzima-anclaje resultantes son probados en un sistema de prueba in vitro que contiene saliva (bacteria normal y glicoproteinas huésped) para determinar su capacidad para controlar placa y limitar su proliferación 10 uniéndose a la placa y causando la escisión hidrolítica del esqueleto del polisacárido de la placa. Estos complejos de enzima-anclaje se valoran para eficacia clínica y optimizan, cuando sea necesario. 15 Se hace referencia a las Figuras 1 y 2 de los dibujos, los cuales ilustran " esquemáticamente el complejo de anclaje-enzima de la invención. Los dibujos son representaciones diagramáticas, no se pretende que sean a escala y son únicamente para 20 propósitos de ilustración. En la Figura 1, se muestra un diente 10 que tiene una superficie 12. En la superficie 12, una colonia 14 de bacterias dentro de una matriz se une o fija al diente 10. También una molécula de anclaje 16 está unida o fijada sobre la 25 superficie 12 del diente, la cual puede ser un péptido de adhesión. Una enzima inmovilizada 10 está unida o fijada a las moléculas de anclaje 16, y la moléculas de anclaje 16 y la enzima inmovilizada 18 conjuntamente forman el complejo de anclaje-enzima 20. El complejo de anclaje-enzima 20 compite con la colonia 14 para unirse a la superficie 12 del diente 10 y reducir así los sitios del substrato potencial por la unión de la colonia 14. Adicionalmente, y de manera más importante, la enzima 18 ejercita su efecto catalítico sobre la colonia 14, degradando la matriz de la placa y/o el esqueleto del polisacárido. En la Figura 1, la terminación 22 de la matriz por la enzima 18 se puede observar. La colonia 14 por consiguiente, será severamente dañada en su capacidad de expansión. Además, el complejo anclaje-enzima 20 tiene el tiempo de retención significante en la superficie del diente 12, proporcionando así más de un obstáculo temporal a la matriz de la placa y la proliferación de la colonia 14. Otra modalidad de la invención se muestra en la Figura 2. En esta figura, los elementos que corresponden a aquéllos en la Figura 1 se han acordado con la misma referencia numérica. En la modalidad mostrada en la Figura 2, la superficie del diente 12 tiene en el mismo una película 24 a la cual se une la enzima. La película, la cual incluye péptidos, proteínas y semejantes, puede proporcionar o constituir el anclaje, o se puede usar una molécula de anclaje separado preunido a la enzima. En la Figura 4, se muestra un detalle de una matriz de colonia bacteriana 14, incluyendo bacteria individual 44. En esta modalidad, la molécula de anclaje 26 del complejo 20 se une a la matriz de bacteriana, y la terminación 22 de la matriz se puede observar claramente. En la Figura 5, el anclaje 16 del complejo 20 se une directamente a una bacteria 44 dentro de la matriz 14. Esta dentro del alcance de esta invención expandir el, complejo de enzima-"anclaj e" para incorporar enzimas de degradación de polisacáridos menos aquéllos que hidrolizan o degradan glucanos, por ejemplo, enzimas que degradan enzimas de polisacáridos a base de fructosa que hidroliza glicoproteínas, etc. El complejo también podría extenderse para cubrir las moléculas de "anclaje" basadas en ligandos que simulan las superficies celulares exteriores de bacterias para crear enlace competitivo directo entre los complejos de enzima de "anclaje" y bacterias. Además, el complejo puede incluir moléculas basadas en receptores que simulan los sitios de unión bacteriana de modo que las enzimas "ancladas" se pueden adsorber en superficies bacterianas que están ya para adherirse a la placa. Finalmente, se pueden usar las moléculas de anclaje comprendidas de polipéptidos que son moléculas de adhesión conocidas. La purificación de enzimas hidrolíticas potencialmente adecuadas (hidrolasas de polisacáridos, enzimas de degradación de glicoproteínas, etc), se realiza para lograr la actividad específica más grande y un tipo de reacción específica más enfocada. Posteriormente, los procedimientos para determinar la extensión o grado de acoplamiento entre la enzima y las moléculas de "anclaje" también se pueden realizar, estableciendo así el número de moléculas de "anclaje" unidas a la enzima que proporcionará la mejor combinación de actividad enzimática y grado de enlace. Se apreciará que cualquier enzima efectiva que previene o reduce la colonización bacteriana se puede usar en esta invención. Preferiblemente, un grupo de enzimas las cuales tienen una acción hidrolítica, o hidrolasas, son útiles puesto que las mismas son particularmente efectivas. Este grupo facilita la hidrólisis de enlaces químicos que enlaza porciones, que después de que la reacción de hidrólisis ocurre, puede existir como entidades químicas separadas. Las enzimas preferidas las cuales se pueden usar en esta invención, se pueden seleccionar de uno o más de las siguientes: esterasas Cr 5 - aquellas enzimas que desdoblan enlaces de éster; las enzimas de desdoblamiento glicolíticas - aquellas enzimas que desdoblan enlaces que se encuentran en oligo- y polisacáridos; enizmas de desdoblamiento de enlace de éter; enzimas de desdoblamiento de enlace de 10 péptidos en donde las proteínas son el substrato (reactivo); desdoblamiento de enlace carbono-nitrógeno en donde el substrato (reactivo) no es una proteina; enzimas de desdoblamiento del anhídrido ácido; desdoblamientp del enlace carbono-carbono; 15 desdoblamiento del enlace de haluro; desdoblamiento del enlace de fósforo-nitrógeno; desdoblamiento del enlace de azufre-nitrógeno; y desdoblamiento del enlace carbono-fósforo. Las moléculas de anclaje y estructuras para 20 el anclaje de las enzimas en la cavidad oral se pueden seleccionar de un número de categorías diferentes, como se describe posteriormente: A. proteínas, fragmentos de proteínas y polipéptidos 25 a. presentes de manera natural b. presentes de manera natural, pero modificados c. polipéptidos sintéticos i. usar aminoácidos presentes de manera natural ii. usar aminoácidos presentes de manera no natural, sintéticos, por ejemplo, D-aminoácidos, aminoácidos ß-substituidos, alfa, alfa-disubstituidos, etc. d. frecuencia de carga i. catiónica (aminoácidos básicos) ii. aniónicos (aminoácidos ácidos) iii. neutrales (aminoácidos alifáticos) e. cualquier combinación de los anteriores B. Sacáridos y oligosacáridos a. presente en forma natural, por ejemplo, glucosa, mañosa, galactosa, ramnosa, fucosa, fructosa, sucrosa, etc. b. amino azúcares presentes de manera natural, por ejemplo, glucosamina, galactosamina, N- actilglucosamina, N-acetilgalactosamina, ácido neuraménico, ácido siálico, etc. ¿ c. sacáridos sintéticos o presentes de manera no 5 natural y amino azúcares i. esteres de azúcares, por ejemplo, esteres de ácido orgánico-azúcar, etc. ii. azúcares químicamente combinados y proteínas/polipéptidos, por ejemplo, glicoproteínas 10 sintéticas C. Glicoproteínas/proteoglicanos a. presentes en forma natural por ejemplo 15 elastina, lectinas, etc. b. sintéticas por ejemplo, glicoproteinas/proteoglicanos presentes de manera natural 20 D. Glicolipidos a. presentes en forma natural,, por ejemplo, esfingomielina, cerebrosida, gangliosidas, etc. b. Sintéticos, por ejemplo, glicol natural modificado; lípidos a través de algunos procedimientos químicos tales como esterificación, amidación o proceso químicos similares.

E. Lipoproteína, por ejemplo, quilomicras, Lipoproteínas de Muy Baja Densidad (por sus siglas en inglés, VLDL) , Lipoproteínas de Baja Densidad (por sus siglas en inglés, LDL), Lipoproteínas de Alta Densidad' (por sus siglas en inglés, HDL), etc.

F. Lipidos a. no polares, naturales o sintéticos, por ejemplo, triglicéridos, colesterol u otros esteróles de plantas o animales, etc. b. polares, naturales o sintéticos, por ejemplo, fosfolipidos (serina de fosfatidilo) , etc.

G. Fragmentos de células y espectros de células segmentos o porciones de bacteria exterior o paredes de células animales o membranas que podrían simular células de animales o bacterias vivas y viables para el propósito de asegurar una enzima a la superficie dentro de la cavidad oral.

H. materiales polimérico, no biológicos a. homopolímeros, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , etc. b. copolímeros, por ejemplo, polímeros de estireno-butadieno, etc.

Las conexiones entre las moléculas de anclaje y las enzimas también pueden tomar un número de formas. Estas conexiones pueden así ser enlaces químicos, quimisorción, o covalentes, incluyendo: amida (péptido) ; éster; glicosídico (enlaces de azúcar); y/o éter. Las conexiones también pueden ser físicas, fisisorció tales como: fuerzas atractivas de van der Waals, incluyendo lipofilicidad; atracciones/interacciones de carga-carga, incluyendo interacciones electrostáticas; y/o enlaces de hidrógeno, incluyendo hidrofilicidad. Las conexiones entre el anclaje del complejo de anclaje-enzima y el substrato de la superficie dentro de la cavidad oral típicamente podrían ser las mismas que aquéllas listadas en el párrafo precedente. Con referencia a la Figura 3 de los dibujos, se muestra en la forma esquemática de un substrato 30 el cual es una superficie en la cavidad oral tal como un diente, placa existente, una aplicación o tejido mucosal, y un complejo de anclaje-enzima 32 unido al mismo. El complejo de anclaje-enzima 32 comprende una porción de anclaje 34 y una porción de enzima 36. Existe una interfase de anclaje-superficie 38 entre el complejo 32 y el substrato 30 y una conexión de anclaje-enzima 40. Se cree que habrá una mayor tendencia para la conexión entre la porción de enzima 36 y la otra porción 34 a ser del tipo químico, mientras que la interacción entre la porción de anclaje 34 del complejo de anclaje-enzima 32 y el substrato 30 es más probable que sea del tipo físico. Existirá una mayor tendencia para la conexión entre la enzima y el anclaje a ser del tipo químico. La interacción de la porción de anclaje del complejo de anclaje-enzima será más probablemente del tipo físico .

Ej emplo Una modalidad de la invención involucra la selección de dos enzimas conocidas que tienen actividad sobre la degradación del esqueleto de polisacáridos de la matriz de la placa dental. Dos de (* 5 tales enzimas son: 1) a-Glucosidasa EC 3.2.1.20 ; [(1">3) 3- glucanohidrolasa] . a-Glucosidasa está disponible comercialmente. Mientras que la enzima muestra la 10 actividad más grande hacia en enlace de a-1,4 glucosa, también hidrolizará enlaces de a-1,2 y a-1,3. La enzima también hidrolizará enlaces de a-1,6, pero sólo a una relación muy lenta.

I 15 2) Dextranasa EC 3.2.1.11 ; [ (1?6) 6- glucanohidrolasa] . Dextranasa también está disponible comercialmente. Esta molécula escinde o desdobla las moléculas de glucosa para polisacáridos que se enlazan a-1,6. 20 Muchas búsquedas describen la estructura de glucano como a-1— 3 y a-1—6. Glucano también se ha descrito como que tiene enlaces de a-l->4 y a-l->2. A partir de una perspectiva estructural, enlaces de a- 25 1— >6 proporcionan el glucano su longitud y los enlaces a-1—»3, a-1— 4 , y a-l->2 proporcionan el glucano sus características de ramificación. No se conoce si la longitud del glucano o ramificación del glucano es importante para la colonización bacteriana. Por esta ft 5 razón, las dos enzimas comercialmente disponibles se seleccionaron: a-Glucosidasa que proporciona la actividad de desdoblamiento para a-1—>4, a-1—»2, y a- l->3, es decir, desdoblamiento de los puntos de ramificación en la estructura de glucano; y 10 Dextranasa, que proporcionará el desdoblamiento del enlace a-l->6, es decir, desdoblamiento en los enlaces de alargamiento. Estas enzimas se acoplarán separadamente con cada una de ).as siguientes moléculas de "anclaje": 1) 15 un polipéptido básico por ejemplo, Lys-Lys-Glu-Lys-Lys o algún polipéptido básico similar; 2) un polipéptido ácido por ejemplo, Glu-Glu-Lys-Glu-Glu o algún polipéptido ácido similar. Los ácidos teichoicos y lipoteichoicos son 20 componentes de pared de células bacterianas importantes para el enlace. Estos componentes también están asociados con esteres de fosfato los cuales podrían presentar un carácter aniónico a la porción exterior de la superficie celular bacteriana. Por esta 25 razón, la moléculas de "anclaje", Lys-Lys-Glu-Lys-Lys, que es una especie catiónica, podría unirse a la pared celular bacteriana. Puesto que la evidencia disponible sugiere que la superficie celular bacteriana es aniónica en carácter, es razonable sospechar la colonización de bacterias en porciones de placa que son principalmente catiónicas en carácter. En efecto, si existen regiones o áreas de carácter catiónico asociadas con placa, la molécula de "anclaje", Glu-Glu-Lys-Glu-Glu, que es una especie aniónica que podría ser unida a las regiones catiónicas de placa, podría ser una buena elección. Adicionalmente, o de manera alternativa, cualquier o ro carácter del lípido densamente arreglado tal como micelas puede servir como un substrato en la cavidad oral o la molécula de anclaje a la cual se une el complejo de enzima-anclaje. La relación de atracciones de carga, como la base para el anclaje de las enzimas seleccionadas a varias estructuras orgánicas en la cavidad oral, puede ser un factor para la unión o fijación bacteriana. Sin embargo, la adhesión bacteriana en la colonización de placa también puede involucrar factores menos la atracción de carga sola. Así, las proteínas especificas. pueden ser responsables para el enlace de bacterias orales al polisacárido (glucano) y placa. Sin embargo, el mecanismo actual para el enlace bacteriano en la placa no previene otros mecanismos de enlace para enzimas que se conectan a moléculas de ( 5 "anclaje" específicas, y podrían ser incluidas por esta invención. Las enzimas y anclajes descritas en este ejemplo producirán seis enzimas derivadas con el potencial para una capacidad de enlace de la carga 10 amplia.

Síntesis 15 La síntesis parte de los complejos de enzima- anclaje derivados involucra acoplar cada molécula de "anclaje" a las dos enzimas individuales. El polipéptido básico Lys-Lys-Glu-Lys-Lys se acopla a las dos enzimas a través del grupo carboxilo libre del 20 residuo Glu y existe algún acoplamiento a través de la terminal "C" del polipéptido. El polipéptido ácido Glu-Glu-Lys-Glu-Glu se acopla a través del grupo amino libre del residuo Lys y existe algún acoplamiento a través de la terminal "N" del polipéptido a las dos 25 enzimas.

La purificación de los seis productos de reacción de las enzimas derivadas, puede realizarse por exclusión del tamaño molecular en cromatografía de columna. Las enzimas acopladas purificadas pueden ser probadas y comparadas a las enzimas no derivadas para determinar cualquier cambio en la actividad enzimática como una consecuencia del procedimiento de acoplamiento. Los seis complejos de anclaje-enzima producidos en este ejemplo, o complejos de otras enzimas y anclajes, se pueden probar adicionalmente en el sistema in vitro previo a la aplicación clínica. Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para probar, por ejemplo,, el procedimiento de Drake [Drake, D.R.,, Vargas, K. , Cardenzana, A. y Srikantha, R. "Enhanced bactericidal activity of Arm and Hammer dental care." Am. J. Dent . 8, 308-312 (1995)] o una modificación del mismo. Los polipéptidos básicos y ácidos, los cuales están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Peptides International, Louisville, Kentucky, son sintetizados, por ejemplo, por una variación del método de fase sólida. Estos materiales de partida se pueden usar sin purificación; sin embargo, una porción retenida de cada material de partida deberá ser probada preferiblemente por pureza, cuando sea necesario, por ejemplo, para describir los productos de reacción inesperados, etc. Las enzimas, las cuales también están disponibles comercialmente y se pueden comprar a partir de United States Biochemical, Cleveland, OH y Worthington Biochemical, Freehold, NJ, también se puede usar sin purificación. Otras enzimas que se pueden usar y las cuales no están disponibles comercialmente, se pueden aislar y purificar a partir de tejidos y organismos, usando procedimientos estándares. Una porción retenida de cada enzima, también deberá ser analizada, sólo si es necesario para determinar la pureza. Tal análisis de purificación ,puede ser importante dependiendo de los resultados de la experimentación in vitro. Estos análisis se pueden conducir, usando las porciones retenidas de las enzimas. La actividad enzimática se deberá determinar preferiblemente antes y después de la reacción de derivación (acoplamiento) y esto se puede realizar fácilmente usando, por ejemplo, 4-nitrofenil-a-D-glucosa en un procedimiento de ensayo estándar. El polipéptido básico, Lys .Lys-Glu-Lys-Lys se puede acoplar a cada una de las enzimas usando una modificación del procedimiento descrito por Williams (1981). (Williams, A. and Ibrahim, I. A. "A mechanism involving cyclic tautomers for the reaction with nucleophiles of the water-soluble peptide coupling reagent l-etil-3- [-3-dimetilaminopropil] -carbodiimida (EDC)." J. Am. Chem. Soc. 103, 7090-7095 (1981)]. Este procedimiento usa l-etil-3- [-3-dimetilaminopropil] -carbodiimida (EDC) como el agente de acoplamiento. El grupo carboxilo activado con EDC de Glu en el polipéptido (así como también el grupo carboxilo del extremo terminal "C" del polipéptido) se acoplará a grupos de amina libres sobre las enzimas, formando enlaces de amida covalentes. El polipéptido ácido, Glu-Glu-Lys-Glu-Glu, se puede acoplar a cada una de las enzimas usando una modificación del procedimiento descrito por O' Shannessy, D. J. and Hofmanh, W. L. "Coupling antibodies for site directed immobilization . " Biotech. Appl. Biochem. 9, 488-496(1987)]. En este procedimiento, el grupo de amina libre de Lys (así como también el grupo de amina libre de la terminal "N" del polipéptido) se convierte a un aldehido y luego se acopla a los grupos de amina libres en las enzimas . En ambas reacciones de acoplamiento o derivación que involucran las moléculas de "anclaje" de polipéptido, existirá una amplia variedad de subproductos producidos; sin embargo, también existirá una amplia diversidad entre los tamaños de las moléculas (pesos moleculares) que permitirán un l?> 5 procedimiento de erradicación usando, por ejemplo, HLPC con una columna de 3000 PP por una separación basada en el tamaño molecular. El propósito de este paso de separación es una "erradicación" de la reacción. La eliminación 10 remueve moléculas de "anclaje" del polipéptido sin reaccionar, mezclas de polipéptidos que resultan de las moléculas de "anclaje" que reaccionan entre sí, y el producto deseado de complejos de enzima-"anclaj e" . También puede ser un número de complejos de enzima- 15 "anclaje" deseado, dependiendo del número de moléculas de "anclaje" unido a la enzima. No se considera necesario separar los complejos de enzima-"anclaje" en fracciones discretas dependiendo del número de moléculas de "anclaje"; más bien, todos los tipos de 20 complejos de enzima-"anclaje" se puede probar y aplicar clínicamente de manera colectiva. Separando los tipos de complejos de enzima-"anclaje" en entidades moleculares discretas, se pueden realizar, sin embargo, en donde se considera apropiado.

En donde sea deseado o considerado necesario, el procedimiento de eliminar puede ser validado definiendo y ajustando las condiciones de operación de la columna (HPLC) . Las series de muestras se pueden hacer con: 1) la enzima sola; 2) la molécula de anclaje sola; y 3) la mezcla de reacción sin la adición de la enzima. El número de tiempo de retención/fracción para la proteína total se determinará bajo las condiciones de operación definidas que permitirán la separación de moléculas de "anclaje" libre, los productos de reacción entre moléculas de "anclaje", enzima libre y enzimas derivadas o acopladas.

Ensayos In Vitro Previo a la aplicación clínica, la efectividad de cualquier complejo de enzima-anclaje sintetizado se puede determinar en un ensayo in vitro. Uno de tales ensayos se describe posteriormente. Los objetos se tamizan por salida de saliva y un alto nivel de Streptococcus mutans y Actinomyces viscosus (recuentos de placa) que se reconocen como bacterias de alta formación de placa. La salida de saliva de la población seleccionada se puede estimular masticando un material inerte tal como parapelículas o carboparafina . La saliva colectada servirá como la k solución de inoculo de almacenamiento o de base. Esta 5 solución madre se preparará combinando las muestras de saliva con la población más grande de las cepas identificadas (20 - 25% de las muestras totales tomadas) . 10 Posteriormente, las siguientes soluciones son preparadas : a) Caldo de Sucrosa Enriquecida. b) Solución de control positivo de 20 mg/ml 15 de clorhexidina, un inhibidor de formación de placa conocido . c) Los dos controles referidos a las pruebas pueden ser la enzima no derivada, es decir, enzimas 20 sin moléculas de "anclaje". d) Las 8 soluciones de tratamiento (6 soluciones de prueba y 2 controles relacionados con las pruebas) se pueden preparar con Caldo de Sucrosa 25 Enriquecida como el solvente, dando soluciones de base o soluciones madre con concentraciones de 10, 1.0, y 0.1 mg/ml .

Procedimiento Los portaobjetos de vidrio estériles son colocados en tubos de prueba de 50 ml que contienen 39 ml de Caldo de Sucrosa Enriquecida. Los tubos se inocularon con 1 ml de solución de inoculo (saliva) de base o de almacenamiento. Los tubos se incubaron a 37°C bajo C02 al 5% por 24 a 48 horas, hasta que la evidencia visual de la formación de placa aparece. Los portaobjetos son removidos, transferidos a soluciones de dosificación de Caldo de Sucrosa Enriquecida (39 ml en tubos de prueba de 50 ml ) al cual se agregó 1 ml de la solución de prueba apropiada. Las soluciones de dosificación pueden tener la siguiente composición: 1) Control sin tratamiento - Caldo de Sucrosa Enriquecida 2) Control Positivo - 20 mg/ml de clorohexidina 3) Control relacionado con tratamientos ÍA, IB y 1C - 1.0 mg/ml de a-Glucosidasa no "anclada" 4) Control relacionado con los tratamientos 2A, 2B y 2C - 1.0 mg/ml de Dextranasa no "anclada" 5) Tratamientos de prueba 2A, 2B y 2C (3-Dextranasa-"anclaje") : 10, 1.0 y 0.1 mg/ml. 6) Tratamientos de prueba 2A, 2B y 2C (3 Dextranasa-"anclaje") : 10, 1.0 y 0.1 mg/ml.

Los portaobjetos de vidrio permanecen en sus soluciones , de dosificación respectiva por aproximadamente una hora. Los mismos se remueven y enjuagan sumergiéndolos en un' Caldo de Sucrosa Enriquecida, limpio. Los portaobjetos entonces se pueden colocar en Caldo de Sucrosa Enriquecida, fresco, y los tubos se incuban de la misma manera por 24 a 48 horas. La cantidad de placa se registra (fotografiado) para cada tratamiento y la placa de cada portaobjetos se recoge, se seca y se pesa. La actividad enzimática de ambas enzimas antes y después de la derivación se determina, así como también la eficiencia de la eliminación de la reacción, la observación visual está hecha de cada prueba; fotografías son tomadas de cada tratamiento (prueba por triplicado combinada de cada tratamiento como una fotografía única) , y la cantidad (peso) de la placa formada en cada prueba se determina. En la selección de enzimas, anclajes y los métodos de acoplamiento y procedimientos, un número de factores deberán ser tomados en cuenta para proporcionar los complejos de enzima-anclaje más efectivos. Algunos de estos son como sigue: Las enzimas y moléculas de anclaje seleccionadas- deberán ser siempre las más apropiadas para limitar una matriz de colonización bacteriana. Más de una enzima puede ser necesaria para causar una limitación crítica del esqueleto de polisacáridos para l formación de placa. Las ventajas potenciales de esta invención están compuestas de tres: 1) no requieren actividad bactericida, 2) el equilibrio microbiano normal en la cavidad oral será mantenido, y 3) la probabilidad de efectos adversos en el huésped o receptor en sitios removidos desde la cavidad oral es minimizada o eliminada .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (35)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para controlar el crecimiento/colonización bacteriana caracterizada ft 5 porque comprende : una enzima, una molécula de anclaje acoplada a la enzima para formar un complejo enzima-anclaje, el anclaje es capaz de unirse o fijarse a un substrato próximo a una 10 colonia de bacterias, en donde la unión o fijación al substrato permite el tiempo de retención prolongado del complejo de enzima-anclaje en donde está presente la colonia bacteriana. , 15

2. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la enzima se selecciona por su capacidad a degradar una matriz de 20 colonización.

3. Una composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la matriz de 25 colonización incluye polisacáridos, y la enzima se selecciona por su capacidad para degradar los polisacáridos .

4. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de anclaje es capaz de unirse o fijarse a cualquier substrato adecuado dentro de la cavidad oral.

5. Una composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la molécula de anclaje se une o se fija a la superficie del diente.

6. Una composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el anclaje se une a una película sobre la superficie del diente.

7. Una composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la molécula de anclaje se une a una pared de células bacterianas.

8. Una composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la molécula de anclaje es una molécula de base de ligando designada para simular las superficies de células exteriores de bacterias por lo cual se crea el enlace competitivo entre las bacterias y el complejo de enzima-anclaje con las superficies en la cavidad oral.

9. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la superficie en la cavidad oral es una matriz de placa.

10. Una composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la molécula de anclaje es una molécula basada en el receptor designada a unirse a los sitios de fijación bacteriana de modo que el complejo enzima-anclaje se puede adsorber sobre superficies de bacterias.

11. Una composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el polisacárido es glucano.

12. Una composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el polisacárido es un agregado complejo y heterogéneo y mezcla de muchos oligo- y polisacáridos diversos.

13. Una composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la enzima seleccionada es una hidrolasa que tiene la actividad hidrólitica.

14. Una composición de conformidad con la reivindicaciqn 13, caracterizada porque la enzima se selecciona del grupo que consiste de: esterasas, para escisión de enlaces de éster; ' enzimas de escisión glicolítica, para enlaces de escisión que se encuentran en olio-polisacáridos ; enzimas de escisión de enlaces de éter; enzimas de escisión de enlaces de péptidos en donde la proteínas son los substratos (reactivos); enzimas de escisión de enlace carbono-nitrógeno en donde el substrato (reactivo) no es una proteína; enzimas de escisión del anhídrido ácido; enzimas de escisión del enlace carbono-carbono; enzimas de escisión del enlace de haluro; enzimas de escisión del enlace fósforo-nitrógeno; enzimas de escisión del enlace sulfuro-nitrógeno; y enzimas de escisión del enlace carbono-fósforo.

15. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de anclaje se selecciona del grupo que cosiste de proteínas, fragmentos de proteínas y polipéptidos, que es de uno o más de los siguientes grupos: a. presentes de manera natural; b. presentes de manera natural, pero pjodificados; c. polipéptidos sintéticos i. usar aminoácidos presentes de manera natural ii. usar aminoácidos, D-aminoácidos , aminoácidos beta-substituidos, alfa, alfa-disubstituido, que no están presentes de manera natural, sintéticos; d. prevalencia de carga; y i. catiónico (aminoácidos básicos) ii. aniónicos (aminoácidos ácidos e. cualquier combinación de los anteriores.

16. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las moléculas de anclaje son sacáridos y oligosacáridos, los sacáridos y oligosacáridos se selecciona del grupo que consiste de: a. que están presentes de manera natural tal como glucosa, mañosa, galactosa, ramnosa, fucosa, fructosa, sucrosa; b. azúcares de amino presentes de manera natural tal como glucosamina, galactosamina, N-actilglucosamina, N-acetilgalactosamina, ácido neuraménico, ácido siálico; c. sacáridos y amino azúcares que están presentes de manera no natural o sintéticos, tal como i. esteres de azúcares, azúcar-esteres de ácidos orgánicos; y ii. azúcares químicamente combinados y proteínas/polipéptidos y glicoproteínas sintéticas.

1 . Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las moléculas de anclaje son glicoproteínas/proteoglicanos, seleccionados del grupo que consiste de: a. presentes de manera natural tales como elastina, lectinas, b. sintéticos tales como glicoproteín^s/proteoglicanos presentes de manera natural modificados.

18. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las moléculas de anclaje son glicolípidos seleccionados del grupo que consiste de: a. que están presentes de manera natural, tales como esfingomielina, cerebrosida, gangliosidas; y b. glicol natural modificado o sintético; lípidos a través del mismo procedimiento científico tal como esterificación, amidación o proceso similar químico.

19. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las moléculas de anclaje son lipoproteínas seleccionadas del grupo que consiste de quilomicras, Lipoproteínas de Muy Baja Densidad (VLDL) , Lipoproteínas de Baja Densidad (LDL), y Lipoproteínas de Alta Densidad (HDL) .

20. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las moléculas de anclaje son lípidos seleccionados del grupo que consiste de a. grupos no polares, naturales o sintéticos, tales como triglicéridos, colesterol u otros esteróles de animales o plantas; y b. polares, naturales o sintéticos tales como fosfolípidos (serina de fosfatidilo) .

21. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las moléculas de anclaje son fragmentos de células, espectros o segmentos de células o porciones de paredes de células de animales o bacterias exteriores o membranas que simulan células de animales o bacterias viables y vivas para el propósito de asegurar una enzima a la superficie dentro de la cavidad oral.

22. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las moléculas de anclaje son materiales no biológicos, poliméricos seleccionados, del grupo que consiste de copolímeros tales como polímero de estireno-butadieno.

23. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la enzima es una a-Glucosidasa.

24. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la enzima es Dextranasa.

25. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de anclaje es un polipéptido básico. f.

.26. Una composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el polipéptido básico es Lys-Lys-Glu-Lys-Lys. 10

27. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de anclaje es un polipéptido ácido. 15

28. Una composición de' conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el polipéptido ácido es Glu-Glu-Lys-Glu-Glu . 20

29. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el substrato comprende micelas. 25

30. Un método para controlar la colonización bacteriana caracterizada porque comprende los pasos de : á'* formar un complejo anclaje-enzima comprendido 5 de una enzima seleccionada por su capacidad para degradar al menos la porción de una matriz de colonización, y un anclaje, una porción de la cual se acopla a la enzima para producir el complejo; y seleccionar el anclaje basado en la capacidad 10 del anclaje para unirse a un substrato, por lo cual se incrementa el tiempo de retención del complejo de enzima-anclaje en la proximidad más estrecha a la matriz . 15

31. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la colonización bacteriana es controlada dentro de la cavidad oral. 20

32. Un método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la matriz de colonización es una matriz de placa, y en donde la 25 matriz de placa comprende polisacáridos.

33. Un método para formar una composición para controlar la proliferación de colonias bacterianas, el método se caracteriza porque comprende: 5 seleccionar una enzima basada en su capacidad a degradar el componente estructural en donde ocurre la colonización bacteriana; seleccionar una molécula de anclaje basada en su capacidad a acoplarse a la enzima seleccionada de 0 tal modo que la enzima retiene la actividad enzimática efectiva para degradar el componente estructural, la molécula de anclaje se selecciona además por su capacidad para unirse a un substrato próximo a la colonización 'bacteriana; y 5 acoplar el anclaje y enzima para producir un complejo de enzima-anclaje. ,

34. Un método de conformidad con la 0 reivindicación 33, caracterizado porque es para controlar la proliferación de colonias de bacterias en la cavidad oral. 5

35. Un método para controlar la colonización de placa bacteriana en la cavidad oral por lo cual una enzima específica para degradar la placa se acopla a un anclaje seleccionado del grupo que consiste de la pared celular, fragmentos de pared celular, fragmentos de células y espectros de células.