CZ20001237A3 - Kompozitum k regulaci bakteriálních kolonií, způsob regulace bakteriální kolonizace, způsob přípravy kompozitu pro regulaci proliferace bakteriálních kolonií a způsob regulace kolonizace bakteriálního plaku v ústní dutině - Google Patents

Description

Kompozitum k regulaci bakteriálních kolonií, způsob regulace bakteriální kolonizace, způsob přípravy kompozitu pro regulaci proliferace bakteriálních kolonií a způsob regulace kolonizace bakteriálního plaku v ústní dutině.

Oblast techniky

Vynález se týká kompozit určených k regulaci bakteriálních kolonií, zvláště - ne však pouze k aplikaci v ústní dutině k omezení výskytu zubního plaku. Vynálezem je i forma perorální léčby, omezující rozsah bakteriální kolonizace v ústní dutině a omezující tak množství zubního plaku. Regulací rozsahu nebo velikosti plakových struktur pomocí enzymů lze omezit šíření bakteriálních kolonií a jejich invazi do dásňových struktur. Vynález zahrnuje i technologii výroby takových kompozit.

Dosavadní stav techniky

Paradentóza je jedním z nej starších a nejčastějších onemocnění člověka. Lze ji vysledovat ve fosilních pozůstatcích lidí a vyskytuje i u jinak zdravých jedinců. Paradentóza v současnosti představuje jeden z nej závažnějších celosvětových zdravotních problémů lidstva. Onemocnění je výsledkem akumulace zubního plaku na okraji dásní. Existují dvě základní třídy parodontózy, které zhruba vystihují stupen nebo závažnost patologie: gingivitida a paradentóza.

Gingivitida je zánět okraje tkáně dásní v důsledku hromadění zubního plaku. Většinou je gingivitida charakterizovaná zarudnutím, otoky a krvácením tkáně dásní. Rozsah a závažnost těchto prvků ukazují na stupeň progrese postižení. Charakteristickým rysem paradentózy je nejenom zánět okraje dásní, ale i ztráta attachment/připojení paradentálního vaziva, ztráta alveolámí kosti a ztráta připojení epitelu v důsledku apikální migrace. Patologické důsledky těchto fyziologických úbytků/procesů je tvorba paradentální kapsy, v níž může dojít k infekci a může se tak stát zdrojem infiltrace baktérií do hostitele. Progrese etablované gingivitidy do pokročilé formy postižení může položit základ pro paradentózu.

Příslušná literatura uvádí významné přesuny v mikrobiálních koloniích z míst zánětů dásní do subgingiválních kapes. Bylo zjištěno, že u člověka způsobují paradontózu jisté identifikované a specifické bakteriální mikroorganismy; k závažnosti onemocnění však mohou přispívat i φ φ · φ « φ ···· • · · · · φ · · φ φφ » φφ φφφφ ΦΦΦΦΦΦ φφφφ φφ φ φφφφ φφ φφ φφ φφφ φφ φφ jiné mikroorganismy. Kromě toho výsledky klinických studií ukazují korelaci mezi přítomností a některých druhů mikrobů a různých druhů a stupňů závažnosti paradentózy. Existuje vztah příčiny a účinku mezi přítomností a množstvím plaku, který obsahuje velké množství kolonizovaných bakteriálních kmenů a parodontózou. Z toho vyplývá, že omezením plaku lze regulovat rozsah a závažnost paradentózy.

Jak klinická gingivitida, tak i chronická paradentóza mají společné dva významné rysy, které mohou představovat vodítko k jejich sekvenčnímu vztahu. Obě postižení jsou obvykle nebolestivá až do pokročilejší formy a u obou postižení existuje absolutní nezbytnost bakteriálního plaku dříve, než dojde k progresi sekvence těchto onemocnění a rozvoji do pokročilé formy parodontózy. I když existují sekundární systémové a vnější faktory, které mohou ovlivnit rozsah onemocnění, nejdůležitějším faktorem a faktorem, který je nejslibnější z hlediska možné regulace, je vztah mezi bakteriálním plakem a parodontózou.

Onemocnění začíná svou progresí při akumulaci bakteriálního platu na okraji dásní. S progresí postižení dochází k chronickému zánětu dásní a parodontálního vaziva s následnou degenerací různých struktur dásní a zubů. Chronický zánět se exacerbuje zubním kamenem tvořícím se z mineralizovaného plaku na rozhraních různých tkání a parodontální kapse. Migrace epitelové tkáně do zanícených a nekrotických oblastí může vést k obklopení plakových struktur s výslednou tvorbou abscesů doprovázené purulentním exsudátem. Posledním a nej závažnějším stádiem parodontózy je resorpce alveolámí kosti a konečná exfoliace zubu.

Plak je heterogenní směsí bakteriálních agregací fixovanou v lepivé matrici. I když se bakteriální složení plaku pohybuje v rozmezí od 50 do 70 procent, je matrix tvořena mrtvými buňkami, slinnými glykoproteiny a sérovými proteiny, které jsou uloženy na podkladu z póly sacharidů. Baktérie syntetizují polysacharidy pro základ plaku jako jeden z kroků ve vlastním procesu kolonizace. Krom živých baktérií a matrix obsahuje plak i zbytky jídla, malý počet epiteliálních buněk, bílých krvinek a různé další složky, pocházejících z hostitele a jeho činnosti.

Tvorba a rozvoj nebo šíření plaku probíhá ve dvou fázích. První stupeň si může vyžádat base vrstvu slinných glykoproteinů na povrhu zubů a jakož i na měkké tkáni v ústní dutině. Tato ·· 0··0 0· 0000 00 ·· • 0 0 0·0 · · 9 ·

0 0 9 0000 0 09 ·

0000 9 · 0 9 0 0

0909 09 9 0000

0« 09 900 90 09 base organická vrstva, vytvořená ze slin, se absorbuje do povrchu a vytvoří získaný pellicle. Tento nerozpustný získaný pellicle slouží jako základ pro supragingivální plak. Druhým krokem je bakteriální kolonizace „průkopnickými“ baktériemi získaný pellicle. Jakmile baktérie přilnou k povrch struktury, dochází k jejich agregaci, vzniku kolonií a začíná se vytvářet plak.

Existuje hodně přes 100 různých druhů baktérií v různých zubních plácích. Tato různorodost ve smyslu typů baktérií je - mezi jiným - ovlivněna stravou, složkami slin a interakcemi bakterii. Lokalizace plaku v ústní dutině, denní doba, věk pacienta a obecná ústní hygiena pacienta - to vše přispívá k důsledkům a následkům zubního plaku a parodontózy. Nepřekvapuje proto, že plak je heterogenním souborem bakteriálních komunit připojených k zubu a vedoucí k dlouhé řadě biochemických a fyziologických důsledků. Dvěma hlavními patologickými stavy jako důsledku jsou paradentóza a zubní kaz.

Enzymy jako nástroj terapie nabízejí jedinečné možnosti. Některé oblasti dřívějšího výzkumu v oblasti patologií ústní dutiny s použitím enzymů však vycházely z představy, že budou mít baktericidní účinky na kolonie bakterií nacházejících se v plaku a tedy budou působit jako „dezinfekční“ prostředky. Tento přístup se však ukázal jako neúčinný. V poslední době se ukázalo, že aplikace epiteliálních buněk ústní dutiny proteázami vede ke změně adheze bakterií; tato forma léčby však vedla ke změně i poměrů mezi různými populacemi baktérií. Slibnější výsledky byly získány při přeunu pozornosti z účinků baktérií na změnu tvorby plaku. Výsledky tohoto úsilí byly pozorovány in vitro i in vivo jakož i u zvířecích modelů a u lidí „dezinfekční“ prostředky. Tento přístup se však ukázal jako neúčinný. V poslední době se ukázalo, že aplikace epiteliálních buněk ústní dutiny proteázami vede ke změně adheze bakterií; tato forma léčby však vedla ke změně i poměrů mezi různými populacemi baktérií. Slibnější výsledky byly získány při přesunu pozornosti z účinku bakterií na ovlivnění tvorby plaku. Tyto výsledky byly pozorovány in vitro i in vivo i u zvířených modelů a u lidí v klinických studiích. Přesto ani tyto přístupy nedosáhly požadované terapeutické účinnosti, nejspíše proto, že potřebný čas pro rozvinutí účinku překračuje dobu uchování enzymu v ústní dutině. Stručně řečeno, proud slin, jiných tekutin a pohyb potravy i normální mechanické agitace v ústní dutině snižovaly dobu retence enzymu (nebo enzymů). Tyto faktory zkracovaly dobu pobytu enzymů v ústech a výsledkem byla nedostatečná klinická účinnost.

Pokud byly enzymy zkoušeny in vitro, nezdálo se, že by délka pobytu enzymu v ústní dutině byla důležitá. Nejsou k dispozici ani náznaky toho, že by v uspořádání těchto in vitro studií na tuto důležitou proměnnou vůbec pomýšlelo. Tyto in vitro systémy, které prokázaly účinnost enzymů při omezování tvorby plaku však zjistily jiné důležité faktory. Mezi tyto faktory patří: (1) je možné, že je zapotřebí více než jeden enzym, (2) může být nutná větší specifická aktivita enzymu, (3) může být nutný vhodnější enzym nebo (4) účinnější může být kombinace enzymů.

Samotný plak je nesmírně složitou směsí různých složek, totiž makromolekul, živých a mrtvých buněk (celých baktérií a odloupnutých epiteliálních buněk z hostitele), buněčných fragmentů a různých dalších materiálů z hostitele a bakteriální flóry. Průkopnická práce zabývající se chemickými aspekty plaku se zaměřila na karbohydrátový neboli polysacharidový (PS) základ plaku. Jednalo o ideální východisko, protože PS základ nejenže slouží jako strukturální molekula matrix plaku, ale slouží i jako zásobárna karbohydrátů pro rostoucí kolonie baktérií. Větší část výzkumu PS se zaměřila na zjištění vlastností a struktury glukanů; existují však i další složky, které jsou součástí plaku. Při prohlídce vědecké literatury popisující dřívější výzkum v oblasti léčby zubů s použitím enzymů se objevily některé základní rysy. Většina výzkumu v oblasti použití enzymů k regulaci plaku se prováděla pod hlavičkou prevence zubního kazu, je však jednoznačně prokázáno, že regulace plaku je zásadním momentem prevence vzniku zubního kazu i parodontózy. Byla provedena in vitro vyšetření baktericidních účinků, studie se zvířaty i klinické studie zahrnující experimenty u lidí. Dále, většina klinických studií používala jako vehikulum do dopravení enzymů do úst ústní vodu, méně studií použilo žvýkací gumy.

U.S. patent číslo 4,138,476 (Simonson) popisuje enzymy zjišťující disperzaci plaku jako přípravcích s terapeutickým účinkem prostřednictvím změny molekul. Glukanohydroláza se kombinuje s fosfátovou skupinou nosiče tak, že samotný enzym vykazuje zvýšenou afinitu vůči povrchům zubů. Modifikovaný enzym glukanohydroláza se kovalentně zkříženě spojuje s nosičem v přítomnosti reagencia jako je etylchloroformát, a vykazuje zvýšenou schopnost vazby na hydroxyapatitovou složku zubů.

• · · · • · • · · · • · · · · · ···· • · · · ···· · ·· · • · · · · · ··· ·· · ···· · · · · · · · • · · · ····· ·· ··

U.S. patent číslo 5,490,988 (Beggs) se týká dodávání terapeutických látek na místo určení. Patent popisuje vysoce specifický proces, v němž se fragment protilátky dokáže vázat na místo určení vazbou antigenu a protilátky, a nabízí terapeutickou látku, kterou lze napojit na fragment protilátky dodatečným peptidem, připojeným k fragmentu protilátky. Výsledný produkt je tak tvořen fragmentem protilátky, peptidem a látkou.

Prošetření publikovaných klinických protokolů s cílem posoudit enzymy vede ke zjištění, že byly dva důvody, proč zvolené enzymy úplně nevyvíjely požadované účinky, i když bylo možno pozorovat omezenou klinickou účinnost: a) enzymy nebyly modifikovány tak, aby zůstaly v ústní dutině po delší dobu a b) výplach úst se prováděl po různě dlouhou dobu a v různou denní dobu se zvláštním zřetelem na podání dávky těsně před dobou s omezenou aktivitou v ústní dutině (polykání, žvýkání a tvorba slin, atd.) jako je spánek.

Podstata vynálezu

Hlavním aspektem vynálezu jsou dvě koncepce, z nichž obě jsou nezbytné pro úspěšnou terapii s cílem zabránit vzniku parodontózy. První je regulace množství a architektury struktury plaku v ústní dutině pomocí enzymů, druhou je způsob udržení enzymů v ústní dutině. Pro účinnou prevenci vzniku parodontózy je nutno ideálně zajistit oba tyto momenty.

V jednom ohledu předkládaný vynález modifikuje zvolené enzymy způsobem, aby byly schopné omezovat plak nebo jeho složky. Zvolené enzymy jsou ideálně enzymy, které konkrétně rozkládají polysacharidy. Tímto způsobem lze omezit základní strukturu matrix plaku bez buď selektivního nebo širokospektrálního baktericidního účinku, a tak se zabrání jakékoli případné nerovnováze v přítomnosti bakterií v ústní dutině.

Vynález zajišťuje selektivní regulaci proliferační bakteriální kolonizace a je tedy zaměřen spíše na prevenci než na léčbu. Vynález nezávisí na baktericidní aktivitě v ústní dutině, což odstraňuje (a) případnou nerovnováhu u normálních bakteriálních populací, například přerůstání buď v ústní dutině nebo na jiných, vzdálených místech v nebo na hostiteli, (b) požadavek zvážení systémových odpovědí hostitele, které mohou být buď imunologické a toxické a (c) potřeba dodání aktivních látek pod okraj dásní. Důraz je tedy kladen na adhezi bakterií, zvláště v ústní dutině.

• 4 ···· ·* ···· ·· ·· ·· · 4 4 4 · · · · ·· · 4 4 4 44 4 · 4 · • · · · · · · · · 4 4 · • 4 · · ·· 4 4 4 4 4 • · 4 4 · 4 4 4 4 4 4 44

Modifikovaný enzym se ideálně připojuje ke zvolené „kotevní“ molekule (molekulám), která má zůstat v ústní dutině. Retence enzymů v ústní dutině se ideálně maximálně podpoří napojením enzymů na specifické molekuly, která přilnou ke strukturám a existujícím biologickým vrstvičkám v ústní dutině. Enzymatická aktivita by měla být po napojení zachována. Je nezbytné, aby proces připojení zvolených enzymů ke konkrétním „kotevním“ molekulám nezničil úplně enzymatickou aktivitu, i když je možné, že důvodu napojení dojde k oslabení této aktivity. Přesto by alespoň minimální účinné množství enzymatické aktivity mělo zůstat přítomno po napojení.

V jiném aspektu nabízí vynález i metodu k určení rozsahu, v němž zvolené a modifikované enzymy inhibují růst bakteriálního plaku v in vitro zkušebním systému a in vivo. Zvolené enzymy, které uchovávají tuto enzymatickou aktivitu po napojení nebo derivaci na „kotevní“ molekuly jsou vhodné k použití při inhibici růstu plaku.

Výrobek podle vynálezu může, ale nutně nemusí, mít podobu ústní vody, které lze použít před spaním. Modifikované enzymy v ústní vodě ideálně zůstávají v ústní dutině v době nízké slinného a mechanického dráždění. Kromě toho délka doby retence (šest až osm hodin během spánku) může znamenat delší dobu k tomu, aby terapeutické enzymy mohly vyvíjet požadované biochemické reakce.

Tento vynález řeší paradox zubního plaku: na jedné straně patogenní faktory jako jsou baktérie a plak zůstávají v ústní dutině, ale, na druhé straně, je těžké ponechat potenciálně terapeutické látky jako jsou enzymy v ústní dutině. Tohoto paradoxu lze s výhodou využít k regulaci zubního plaku tím, že se zvoleným enzymům udělí konkrétní vlastnost, které baktérie využívají k vyvolání parodontózy, tedy schopnosti přilnout na různé povrchy v ústní dutině. V tomto vynálezu se věnovala značná pozornost důležité a nutné okolnosti prodloužení doby uchování látky působící proti plaku v ústní dutině, protože pouze prodloužením doby uchování - v ústní dutině - může uvedená sloučenina účinně zabránit hromadění plaku. V případech, kdy sloučeniny s účinkem proti plaku zůstanou v ústní dutině pouze po krátkou dobu, je jejich účinnost přirozeně velmi omezená. K dosažení baktericidního účinku může krátká doba uchování v ústní dutině postačit, avšak nová koncepce změny a omezení strukturální architektury látek podporujících růst bakteriálních kolonií si vyžaduje delší doby • · · · · · uchování v ústní dutině.

Předchozí výzkum s cílem omezit nebo vyloučit vznik parodontózy se většinou zaměřoval přímo na odstranění baktérií; výzkum zaměřený na regulaci bakteriálního prostředí se prováděl pouze v malé míře. Předložený vynález se snaží regulovat růst bakteriálních kolonií a zároveň zachovat rovnováhu mezi různými kmeny baktérií v ústní dutině. Regulací množství plaku a omezením množství extracelulámího polysacharidového základu lze regulovat velikost bakteriálních kolonií. Této regulace lze dosáhnout použitím enzymatických sloučenin a procesů popsaných ve vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je schématické znázornění komplexu enzymu a kotevní látky vynálezu, když je připojen k zubu;

Obrázek 2 je schématické znázornění komplexu enzymu a kotevní látky vynálezu, když je připojen k pellicle nebo jinému povrchu v ústní dutině;

Obrázek 3 je schématickým znázorněním další aplikace komplexu enzym-kotevní látka vynálezu, když je připojen v ústní dutině;

Obrázek 4 je schématickým znázorněním komplexu enzymu a kotevní molekuly vynálezu, když je připojen k matrix bakteriální kolonie v ústní dutině; a

Obrázek 5 je schématickým znázorněním komplexu enzym a kotevní látka vynálezu, když je připojen k baktérii v matrix bakteriální kolonie v ústní dutině.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález navrhuje uchovat zvolené enzymy v ústní dutině. Na rozdíl na inkorporace volných a nascentních enzymů v zubní pastě nebo ústní vodě (kdy jsou účinky pouze přechodné), zde se enzymům ponechá na delší dobu možnost, aby proběhly jimi zprostředkované biochemické reakce a příznivé účinky jejich modifikací tak, aby zůstaly v ústní dutině. Kromě toho jsou ideálně specifické enzymy zvoleny s cílem omezit na minimum toxické odezvy v baktériích tak, aby se zachovala normální rovnováha baktérií a zároveň aby se negativně neovlivnily další nezbytné a ochranné biologické vrstvy, například „získaný pellicle“.

o ···· *4 44

4 4 4

4 4 ·

4 4 4 4

Některé polysacharidy rozkládající enzymy jsou modifikovány tak, aby se dokázaly adsorbovat na povrchy a struktury v ústní dutině, a inhibovat proliferační bakteriální kolonizaci v souvislosti s matrix plaku. Enzymy se derivatizují nebo napojují na „kotevní“ molekuly. „Kotevní“ část komplexu enzym-kotva pak mohou přilnout ke strukturám v ústní dutině a zabránit tak hromadění plaku.

Zjistilo se, že Streptococcus mutans a plak se významně podílejí na tvorbě zubního kazu. Tato kariogenní baktérie používá sukrózu k produkci substrátů pro metabolismus pro celou populaci mikrobů v ústní dutině. Koncovými produkty tohoto sukrózou podporovaného metabolismu jsou organické kyseliny, které spouštějí sekvenci kroků účastnících se na tvorbě zubního kazu. Kromě toho Streptococcus mutans také používá sukrózu k podpoře kolonizace ústní flóry pomocí sukrózou podporovaného „poolu“ substrátů k produkci polysacharidů, které jsou komplexní a ve vodě nerozpustné. Tento scénář se nejspíše odehrává v případě mnoha baktérií, které jsou kolonizovány zubním plakem.

Struktury nerozpustných polysacharidů tvoří základ pro rozšířenou bakteriální kolonizaci, která - jestliže je agregována - vytváří viditelnou vrstvu označovanou termínem plak. I když polysacharidy nejsou podmínkou pro počáteční připojení „průkopnické“ baktérie k povrchu zubů, kolonizace a neustálé vytváření kolonií tyto nerozpustné polysacharidy potřebuje. Je pravděpodobné, že komplexní polysacharidy svou nerozpustností nejen že vedou ke kolonizaci a proliferaci počátečních baktérií, ale mohou i představovat štít, chránící baktérie před terapeutickými látkami. Proto lze tohoto vynálezu použít ve spojení s látkami, které specificky nebo nespecificky zajistí zničení baktérií. Omezení a regulace množství nerozpustných polysacharidů, a konečně bakteriální kolonizace plaku, má příznivý vliv na prevenci a progresi parodontózy. Jedním z těchto komplexních nerozpustných polysacharidů je glukan. Enzymatický rozklad glukanu je proto jedním z cílů tohoto vynálezu.

Vynález se týká sloučeniny a způsobu znehybnění některých enzymů rozkládajících glukan na površích a ve strukturách ústní dutiny. Zabrání se tak hromadění plaku, který je nezbytným krokem předcházejícím parodontóze. Inhibice proliferační bakteriální kolonizace může docela dobře předejít narušení mikrobiální ekologie nebo rovnováhy mezi různými kmeny baktérií. Obecně lze říci, že předejít posunům v populacích baktérií je žádoucí vzhledem k možnosti • Φ · ··· • · · 9 t tt· 9 9 9 9 • · · · · · 9 · · · 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·

9 9 99 999 9 9 99 přerůstání oportunistických baktérií, z nichž některé mohou být patogenní. Kompozice podle vynálezu se snaží zachovat normální relativní poměry různých bakteriálních kmenů v ústní dutině. Absolutní počty alespoň některých kmenů baktérií se však sníží, protože jejich kolonie budou menší.

Vypracování mechanismu zvýšení rezidenční doby enzymů v ústní dutině umožňuje zvýšit jejich klinickou účinnost. K zajištění tohoto cíle musí zůstat účinné enzymy v ústní dutině déle, aby se dosáhlo zamýšleného účinku. Prodloužení doby retence enzymů v ústní dutině zajistí sníženou tvorbu plaku omezením polysacharidového základu plakové matrix.

Přípravek podle vynálezu má tedy usnadnit prodloužení doby pobytu enzymů v ústní dutině. Tento přístup zahrnuje derivatizaci, neboli napojení příslušného enzymu (enzymů) s „kotevní“ molekulou, která se naváže na struktury v ústní dutině s „kotevní“ částí derivatizovaného komplexu enzym - kotva. Kotevní molekula bude specificky vybrána tak, aby se vázala, například na již existující plak nebo získanou pellicle, který pokrývá zub. Vzhledem k relativně rychlému obratu epiteliální tkáně představuje vrstva slizniční tkáně v ústní dutině méně preferovanou místo volby pro vazbu než buď již existující plak nebo pellicle.

V jednom provedení vynálezu dva enzymy s typem enzymatické aktivity, u níž byla prokázána účinnost při kontrole karbohydrátové strukturálního základu plaku, jsou připojeny na tři „kotevní“ molekuly. Šest výsledných komplexů enzymů-kotevních elementů je zkoušeno v in vitro testovacím systému obsahujícím sliny (normální baktérie a hostitelské glykoproteiny) s cílem posoudit jejich schopnost kontrolovat plak a omezit jeho šíření navázáním na plak a vyvoláním hydrolytického štěpení polysacharidového základu plaku. Tyto komplexy enzymu-kotevního elementu jsou vyhodnoceny z hlediska klinické účinnosti a optimálně upraveny podle potřeby.

Odkazujeme na obrázky 1 a 2, které schematicky znázorňují komplex kotevního elementuenzymu podle vynálezu. Nákresy jsou diagramy, nejsou vypracovány v přesném měřítku a jsou určeny pouze pro ilustraci. Na obrázku 1 je zub 10 s povrchem 12, na povrchu 12 je kolonie 14 baktérií v matrix připojen k zubu 10. K povrchu 12 zubu je připojen i kotevní ·· ···· ··> ···* ·· »» • * · · · · · · * · • « · · · · · · 9 9 9 9 • · · · » · ······ • » · · · · · · · · · ·· ·· ·· ··· ·· ·· molekula 16, která může být adhezním peptidem. Imobilizovaný enzym 18 je připojen ke kotevní molekule 1_6 a kotevní molekula 16 a imobilizovaný enzym j_8 dohromady tvoří komplex 20 kotevní molekula-enzym. Komplex 20 kotevní molekula-enzym soutěží s kolonií 14 o připevnění k povrchu 12 zubu 10 a omezuje tak počet potenciálních substrátových míst pro připevnění kolonie 14. Navíc - a co je nej důležitější - enzym 18 vyvíjí svůj katalytický účinek na kolonii 14, rozkládá matrix plaku a/nebo polysacharidový základ. Na obr. 1 lze vidět terminaci 22 matrix enzymem 1_8. Schopnost expanze kolonie 14 tak bude silně narušena. Navíc vykazuje komplex 20 kotevního elementu a enzymu významnou retenční dobu na povrchu 12 zubu a představuje tak více než pouhou dočasnou překážku pro proliferaci matrix plaku a kolonie 14.

Další provedení vynálezu je ukázáno na obrázku 2. Na tomto obrázku prvky byla odpovídajícím prvkům z obr. 1 přidělena stejná referenční čísla. V provedení na obr. 2 je na povrchu 12 zubu pellicle 24, k němuž se enzym připojuje. Pellicle, který obsahuje peptidy, proteiny a jim podobné látky, může tvořit nebo představovat kotvu, nebo lze použít samostatnou kotevní molekulu předem připojen enzymu.

Na obrázku 4 je ukázán detail matrix 14 bakteriální kolonie, včetně jednotlivých baktérií 44.

V tomto provedení se kotevní molekula 16 komplexu 20 připojuje k bakteriální matrix a lze jasně vidět konec 22 matrix. Na obrázku 5 se kotevní molekula 16 komplexu 20 připojuje přímo na baktérii 44 v matrix 14.

V rámci tohoto vynálezu lze rozšířit komplex enzym-kotevní molekula tak, že bude obsahovat jiné póly sacharidy pro rozkládání enzymů než ty, které hydrolyzují nebo rozkládají glukany, například enzymy, které rozkládají póly sacharidové enzymy na bázi fruktózy, hydrolyzující glykoproteiny a tak dále. Komplex by mohl zahrnovat i „kotevní“ molekuly na bázi ligandů, které napodobují vnější povrchy bakteriálních buněk a vytvářejí tak přímé soutěžní vazby mezi baktériemi a komplexy „kotevních“ elementů a enzymů. Dále komplex může obsahovat „kotevní“ molekuly na bázi receptorů, které napodobují místa připojení baktérií, takže „ukotvené“ enzymy se mohou adsorbovat na povrchy baktérií, které již adherují k plaku. Konečně lze použít „kotevních“ molekul, tvořenými polypeptidy, které jsou známé jako adhezivní molekuly.

• to ···· ·· • · · · · · · · · · • · · · to ··< · ·· to • to to·· to ··· ·· · ···· ·· · ···· ···· ·· ··· ·· ··

K dosažení vyšší specifické aktivity a přesněji cíleného specifického typu reakce lze potenciálně vhodné hydrolytické enzymy (polysacharidové hydrolázy, glykoprotein degradujících enzymy, atd.) vyčistit.

Potom lze provést i procedury k určení rozsahu nebo stupně napojení mezi enzymem a „kotevními“ molekulami, a stanovit tak počet „kotevních“ molekul připojených k enzymu, který bude představovat nejlepší kombinaci enzymatické aktivity a stupeň navázání.

Bude se považovat za výhodné, že kterýkoli účinný enzym, který zabrání nebo omezí bakteriální kolonizaci, se bude moci použít v tomto vynálezu. Ideálně se používá skupina enzymů s hydrolytickým účinkem, neboli hydrolázy, protože ty jsou obzvláště účinné. Tato skupina usnadňuje hydrolázu chemických vazeb, které spojují molekuly, které po hydrolyzační reakci mohou existovat jako samostatné chemické jednotky. Ideální enzymy, kterých lze v tomto vynálezu použít, lze vybrat z jedné nebo více následujících skupin: esterázy - enzymy, které štěpí esterové vazby; glykolytické štěpící enzymy - enzymy, které štěpí vazby, přítomné v oligo- a polysacharidech; enzymy štěpící eterové vazby; enzymy štěpící peptidové vazby, kde jsou substrátem (reaktantem) proteiny; štěpení uhlíkodusíkových vazeb, kde substrát (reaktant) není proteinem; enzymy štěpící kyselé anhydrydy; štěpení uhlíko-uhlíkových vazeb; štěpení halidových vazeb; štěpení fosforo-dusíkových vazeb; štěpení síro-dusíkových vazeb; a štěpení uhlíko-fosforových vazeb.

Kotevní molekuly a struktury k ukotvení enzymů v ústní dutině lze vybrat z řady různých kategorií, j ak uvedeno dále:

A. Proteiny, fragmenty proteinů a polypeptidy

a. Přirozeně se vyskytující

b. Přirozeně se vyskytující, ale modifikované

c. Syntetické polypeptidy

i. S pomocí přirozeně se vyskytujících aminokyselin ii. S pomocí syntetických, ne přirozeně se vyskytujících aminokyselin, např. D-aminokyselin, beta-substituovaných aminokyselin, alfa, alfa-desubstituovaných atd.

d. Prevalence náboje «φ φφφφ φφ «φφφ φφ φφ • φ · · » φ · φ · · φφφ φ φ Φ·· · φ · φ φ φ φφφφ φφφ φφφ φφφφ φφ φ φφφφ φφ φφ φφ φφφ φφ φφ

i. Kationické (zásadité aminokyseliny) ii. Anionické (kyselé aminokyseliny) iii. Neutrální (alifatické aminokyseliny)

e. Jakákoli kombinace výše uvedeného

B. Sacharidy a oligosacharidy

a. Přirozeně se vyskytující, např. glukóza, manóza, galaktóza, rhamóza, fukóza, fruktóza, sukróza, atd.

b. Přirozeně se vyskytující aminocukry, např. glukosamin, galaktosamin, N-actylglukosamin, N-acetylgalaktosamin, kyselina neuraminová, kyselina sialová atd.

c. syntetické nebo ne přirozeně se vyskytující sacharidy a aminocukry

i. Estery cukrů, např. estery cukru-organické kyseliny atd.

ii. Chemicky kombinované cukry a proteiny/polypeptidy, např. syntetické glykoproteiny

C. Glykoproteiny/proteoglykany

a. Přirozeně se vyskytující, např. elastin, lektiny, atd.

b. Syntetické, např. modifikované přirozeně se vyskytující glykoproteiny/proteoglykany

D. Glykolipidy

a. Přirozeně se vyskytující, např. sfingomyelin, cerebrosid, gangliosidy, atd.

b. Syntetické, např. modifikovaný přírodní glykol; lipidy po nějaké chemické proceduře, jako např. esterifikaci, amidaci nebo podobném chemickém procesu

E. Lipoproteiny, např. chylomikron, velmi nízkodenzitní lipoproteiny (VLDL), nízkodenzitní lipoproteiny (LDL), vysokodenzitní lipoproteiny (HDL), atd.

F. Lipidy

a. Nepolární, přírodní nebo syntetické, např. triglyceridy, cholesterol nebo jiné rostlinné nebo živočišné steroly, atd.

b. Polární, přírodní nebo syntetické, např. Fosfolipidy (fosfatidylserin), atd.

G. Fragmenty buněk a buněčné ghosts - segmenty nebo části vnějších stěn neboli membrán bakteriálních nebo živočišných buněk, které by napodobovaly živé a viabilní bakteriální nebo živočišné buňky pro účely připevnění enzymu k povrchu uvnitř ústní dutiny.

H. Nebiologické, polymerové materiály

a. Homopolymery, např. polyetylénglykol (PEG), atd.

b. Kopolymery, např. styrén-butadienové polymery, atd.

Spojení mezi kotevními molekulami a enzymy může mít také řad podob. Tato spojení mohou být chemické, chemisorpční nebo kovalentní vazby včetně: aminů (peptidů), esterů; glykosidy (spojení cukrem); a/nebo éter. Spojení mohu být i fyzikální povahy, fyziosorpční jako například: van der Waalsovy přitažlivé síly, včetně lipofilicity; přitahování/interakce mezi náboji, včetně elektrostatických interakcí; a/nebo vazby hydrogenové, včetně hydrofilicity.

Spojení mezi kotevním elementem komplexu kotevní molekula-enzym a povrchovým substrátem uvnitř ústní dutiny bude za normálních okolností stejné, jak je uvedeno v předchozím odstavci. Obrázek 3 ukazuje schéma substrátu 30, který je povrchem v ústní dutině, například zub, přítomný plak, protéza, nebo slizniční tkáň, a komplex kotevní molekula-enzym 32 k němu připojený. Komplex 32 kotevní molekula-enzym sestává z kotevní části 34 a enzymové části 36. Mezi komplexem 32 a substrátem 30 a spojením 40 kotevní molekula a enzym je rozhraní 38 kotevního elementu a povrchu. Předpokládá se, že bude existovat tendence k tomu, aby spojení mezi enzymatickou částí 36 a kotevní částí 34 bylo chemického typu, zatímco interakce mezi kotevní částí 34 komplexu kotevní molekula a enzym a substrátem 30 bude spíše fyzikálního typu.

Bude existovat tendence spíše k tomu, aby spojení mezi enzymem a kotevním elementem bylo chemického typu. Interakce kotevní části komplexu kotevní molekula a enzym bude spíše fyzikálního typu.

Příklad

Provedení tohoto vynálezu zahrnuje výběr dvou enzymů, u nichž je známo, že rozkládají polysacharidový základ matrix zubního plaku. Těmito dvěma enzymy jsou:

1) α-glukosidáza EC 3.2.1.20; [(1 -> 3) 3-glukanohydroláza]. α-Glukosidáza je komerčně dostupná. Zatímco tento enzym vykazuje největší aktivitu vůči navázání a-1,4 glukózy, bude hydrolyzovat i navázání a-1,2 a a-1,3. Enzym bude hydro lyžovat i navázání a-1,6, ale pouze velmi pomalu.

2) dextranáza EC 3.2.1.11; [(1 -> 6) 6-glukanohydroláza], Dextranáza je též komerčně dostupná. Tento enzym štěpí molekuly glukózy z polysacharidů, které jsou napojeny α -> 6.

• · · · • · • · · · · · · · · · ·· · ····· ···· • · ···· ······ ···· ·· · ···· ·· ·· · · ··· · · ··

Mnozí odborníci ve výzkumu popisují glukanovou strukturu jako a-1 -» 3 a a-1 -> 6. Uvádí se také, že glukan má typy napojení a-1 4 a a-1 -> 2. Z hlediska struktury udělují typy napojení a-1 —> 6 glukanu jeho délku a typy napojení a-1 —> 3, a-1 -» 4 a a-1 -> 2 udělují glukanu jeho větvící strukturu. Není známo, zda délka glukanu nebo jeho větvení má nějaký význam pro bakteriální kolonizaci. Z tohoto důvodu byly zvoleny dva komerčně dostupné enzymy: a glukosidáza, zajišťující štěpící aktivitu pro a-1 -> 4, a-1 a 2 a a-1 -> 3, to znamená štěpení na místě větvení ve struktuře glukanu; a Dextranáza, která zajistí štěpení napojení a-1 -» 6, to znamená štěpení při prodlužovacím napojení.

Tyto enzymy budou samostatně spojeny s každou z následujících „kotevních“ molekul:

1) základním polypeptidem, např. Lys-Lys-Glu-Lys-Lys nebo některým podobným základním polypeptidem;

2) acidickým polypeptidem, např. Glu-Glu-Lys-Glu-Glu nebo některým podobným acidickým polypeptidem.

Kyselina teichoová a lipoteichoová představují významné složky stěny bakteriálních buněk pro vazbu. Tyto složky jsou též spojeny s fosfátovými estery, které představují aniontový charakter vnější části povrchu bakteriálních buněk. Z tohoto důvodu je „kotevní“ molekula, Lys-Lys-Glu-Lys-Lys, což je druh kationtu, přitahována ke stěně bakteriální buňky.

Protože dostupné průkazy nasvědčují tomu, že povrch bakteriálních buněk je povahou aniontový, lze se oprávněně domnívat, že k bakteriální kolonizaci bude docházet na částech plaku, které jsou povahou zásadně kationtové. Pokud skutečně existují oblasti kationtové povahy související s plakem, pak „kotevní“ molekula, Glu-Glu-Lys-Glu-Glu, která je druhem aniontu, by byla přitahována ke kationtovým oblastem plaku, a byla by skutečně dobrou volbou.

Kromě nebo, nebo případně, jakákoli jiná hustě uspořádána lipidová struktura, jako jsou micely, může sloužit buď jako substrát v ústní dutině nebo jako kotevní molekula, k níž se komplex enzym-kotevní molekula připojuje.

• · • · · · • · • · · ··· ···« • · · ····· · · · · • · ··· · · · · · φ · φφφφ ·· · φφφφ • · ·· φ φ ··· · · φ φ

Vysvětlení přitažlivosti podle náboje, jako základu pro ukotvení zvolených enzymů k různým organickým strukturám v ústní dutině, může být jedním faktorem pro bakteriální připojení. Bakteriální adheze při kolonizaci plaku však také může zahrnovat jiné faktory, než samotnou přitažlivost podle náboje. Tak mohou být specifické proteiny odpovědné za vazbu v ústech pobývajících baktérií k polysacharidu (glukanu) a plaku. Vlastní mechanismus vazby baktérií v plaku však nevylučuje jiné vazebné mechanismy pro enzymy, které jsou napojeny na specifické „kotevní“ molekuly, a mohly by být součástí tohoto vynálezu.

Enzymy a kotevní molekuly, popsané v tomto příkladu, budou produkovat šest derivatizovaných enzymů s možností široké schopnosti nábojových vazeb.

Syntéza

Část syntézy derivatizovaných komplexů enzym-kotevní molekula zahrnuje připojení každé „kotevní“ molekuly ke dvěma samostatným enzymům. Základní polypeptid Lys-Lys-GluLys-Lys je napojen na ony dva enzymy prostřednictvím volné karboxylové skupiny rezidua Glu a dochází i k jistému stupni napojování konce „C“ polypeptidu. Kyselý polypeptid GluGlu-Lys-Glu-Glu se napojuje prostřednictvím volné amino skupiny rezidua Lys a dochází k jistému stupni napojování konce „N“ polypeptidu na uvedené dva enzymy.

Šest produktů reakce derivatizovaných enzymů lze vyčistit vyloučením podle velikosti molekul na kolonové chromatografii. Vyčištěné napojené enzymy lze analyzovat a srovnat s nederivatizovánými enzymy k určení, zda došlo k nějakým změnám v enzymatické aktivitě v důsledku napojení.

Šest komplexů kotevní molekula-enzym, získaných v tomto příkladu, nebo komplexy jiných enzymů a kotevních elementů lze před klinickou aplikací dále testovat v in vitro systému. Lze použít jakékoli vhodné procedury pro testování, například, procedury podle Drakea [Drake, D.R., Vargas, K., Cardenzana, A. A Srikantha, R. “Enhanced bactericidal activity of Arm and Hammerdental care.“ Am. J. Dent. 8, 308-312/1995] nebo její modifikaci.

Zásadité a kyselé polypeptidy, které jsou komerčně dostupné, například od firmy Peptides International, Louisville, Kentucky, jsou syntetizovány, například variací metody pevné fáze.

• · · · • · · · · · • · · ··· ···· ·· · ····· ···· • · · · · · ··· ·· · • · · · ·· · · · · · • · · · · · ··· · · ··

Těchto surovin lze použít bez čištění; ponechanou část každé suroviny je však ideálně podle potřeby nutno analyzovat z hlediska čistoty, například, k popsání neočekávaných reakčních produktů atd.

Enzymy, které jsou také komerčně dostupné a lze je zakoupit u firmy United States Biochemical, Cleveland, OH a Worthington Biochemical, Freehold, NJ, lze také použít bez čistění. Jiné enzymy, které lze použít a které nejsou komerčně dostupné, mohou být izolovány a vyčištěny z tkání a mikroorganismů s použitím standardních postupů. Ponechanou část každého enzymu je opět nutno analyzovat, pouze v případě potřeby stanovení čistoty. Tyto purifikační analýzy mohou být důležité v závislosti na výsledcích in vitro experimentů. Tyto analýzy lze provádět s použitím ponechaných částí enzymů.

Enzymatickou aktivitu je nejlépe určit jak před derivatizační (napojovací) reakcí, tak i po ní a to lze snadno provést s použitím, například 4-nitrofenyl-a-D-glukózy při standardní analýze.

Zásaditý polypeptid, Lys-Lys-Glu-Lys-Lys, lze napojit na každý z enzymů s použitím modifikace postupu popsaného Williamsem (1981). [Williams, A. A Ibrahim, I. A. “A mechanism involving cyclic tautomers for the reaction with nucleophiles of the water-soluble peptide coupling reagent l-ethyl-3-[-3-dimethylaminopropyl]-carbodiimide (EDC).“ J. Am. Chem. Soc. 103, 7090-7095(1981)]. Tento postup používá jako spojovací látky 1 -etyl-3-[-3dimetylaminopropylj-karbodiimidu (EDC). EDC-aktivovaná karboxylová skupina Glu v polypeptidu (stejně jako karboxylová skupina konce „C“ polypeptidu) se napojí na volné amino skupiny na enzymech, přičemž se vytvoří tak kovalentní ámino vazby.

Kyselý polypeptid, Glu-Glu-Lys-Glu-Glu, se může napojit na každý z enzymů s použitím modifikace postupu, který popsal 0'Shannessy (1987). [0'Shannessy, D. J. and Hofman, W.

L. “Coupling antibodies for site directed immobilization“ Biotech. Appl. Biochem. 9, 488496(1987)]. V tomto postupu se volná amino skupina Lys (jakož i volná amino skupina z konce „N“ polypeptidu) konvertuje na aldehyd a poté se naváže na volné amino skupiny na enzymech.

Při navazovacích i derivatizačních reakcích zahrnujících „kotevní“ molekuly polypeptidů ·· ·»·· «· ···· ·· ·· • · · · ♦ · · « · · • « · ····· · · · · • · · · · · ··· «· · ···· ·· · ···· • · ·· ·· · · · * · ·· bude vznikat velká řada vedlejších produktů; bude však existovat i velká rozmanitost ve velikosti molekul (molekulárních hmotností), což umožní clena-UPS proceduru s použitím, například, HPLC na koloně 3000 PW pro separaci na základě velikosti molekul.

Účelem tohoto separačního kroku je „clean-up“ (čisticí) reakce. Při tomto čištění se oddělí nereagující „kotevní“ molekuly polypeptidů, směsi polypeptidů vzniklé z „kotevních“ molekul, které spolu reagovaly navzájem a požadovaného produktu komplexů enzym“kotevní molekula“. Může vzniknout i řada požadovaných komplexů enzym-“kotevní molekula“ podle počtu „kotevních“ molekul připojených k enzymu. Nepovažuje se za nutné oddělit komplexy enzym-“kotevní molekula“ na jednotlivé frakce podle počtu „kotevních“ molekul; všechny typy komplexů enzym-“kotevní molekula“ lze spíše testovat a klinicky aplikovat dohromady. Oddělení typů komplexů enzym-“kotevní molekula“ na jednotlivé molekulární složky však lze provést v případech, kdy se to považuje za nutné.

Pokud je to žádoucí nebo se považuje za nezbytné, lze čisticí postup validovat definováním a nastavením provozních podmínek kolony (HPLC). Analýzy vzorků lze provádět:

1) samotným enzymem; 2) samotnou kotevní molekulou; a 3) reakční směsí bez přidání enzymu. Doba retence / počet frakcí pro celkový protein se určí za definovaných provozních podmínek, což umožní oddělení volných „kotevních“ molekul, produktů reakce mezi „kotevními“ molekulami, volného enzymu a derivatizovaných nebo napojených enzymů.

In vitro analýza

Před klinickým použitím lze určit účinnost jakéhokoli ze syntetizovaných komplexů enzymkotevní molekula v in vitro analýze. Jedna taková analýza je popsána dále.

U jedinců se zjišťuje tvorba slin a vysoké hladiny Streptococcus mutans a Actinomycens viscosus (počty na deskách), které jsou považovány za baktérie intenzivně tvořící plak. Tvorbu slin u zvolené populace lze stimulovat žvýkáním inertního materiálu jako je parafilm nebo carbowax. Sliny odebrané poslouží jako základní roztok inokula. Tento základní roztok se připraví smísením vzorků slin s největší populací identifikovaných kmenů (20 - 25 % celkového počtu odebraných vzorků).

·· ···· ·· ···· ·· ·· ·· · · · · « · · · ·· · ····· · · · · • · ··· · · · · ·· · • · · · · · · ···· • · · · ·· ··· · · ··

Poté se připraví následující roztoky:

a) obohacený sukrózový bujón.

b) pozitivní kontrolní roztok 20 mg/ml chlorhexidinu, což je známý inhibitor tvorby plaku.

c) dva současně otestované kontrolní roztoky, které mohou být připraveny z nederivatizovaného enzymu, tzn., enzymů bez „kotevních“ molekul.

d) 8 terapeutických roztoků (6 zkušebních a 2 současně otestované kontrolní roztoky) lze připravit se sukrózou obohaceným bujónem jako solventem, získají se tak základní roztoky s koncentracemi 10, 1,0 a 0,1 mg/ml.

Postup

Sterilní skleněná sklíčka se umístí do 50 ml zkumavek obsahujících 39 ml sukrózou obohaceného bujónu. Zkumavky se inokulují 1 ml základního roztoku s inokulem (slinami). Zkumavky se inkubují při teplotě 37 C pod 5% CO₂ po dobu 24 až 48 hodin, až do viditelného nástupu tvorby plaku. Sklíčka se vyjmou, přenesou do dávkovačích roztoků sukrózou obohaceného bujónu (39 ml v 50 ml zkumavkách), k němuž se přidá 1 ml odpovídajících zkušebního roztoku. Dávkovači roztoky mohou mít následující složení:

1) kontrola bez aplikace - sukrózou obohacený bujón.

2) pozitivní kontrola - 20 mg/ml chlorhexidinu.

3) kontrola související s aplikací typu ΙΑ, 1B a 1C -1,0 mg/ml ne“ukotvené“ a-glukosidázy.

4) kontrola související s aplikací typu 2A, 2B a 2C -1,0 mg/ml ne“ukotvené“ dextranázy.

5) zkušební aplikace 2A, 2B a 2C (3 dextranáza-“kotevní molekula“): 10,1,0 a 0,1 mg/ml.

6) zkušební aplikace 2A, 2B a 2C (3 dextranáza-“kotevní molekula“): 10,1,0 a 0,1 mg/ml.

Skleněná sklíčka zůstávají ve svých příslušných dávkovačích roztocích přibližně po dobu 1 hodiny. Poté se vyjmou a opláchnou ponořením v čistém sukrózou obohaceném bujónu.

Poté se sklíčka umístí do čerstvého sukrózou obohaceného bujónu a zkumavky se inkubují stejným způsobem po dobu 24 až 48 hodin. Zaznamená se (fotograficky) množství plaku pro každou aplikaci a plak z každého sklíčka se sejme, usuší a zváží.

Enzymatická aktivita obou enzymů před derivatizací a po ní se určí, stejně jako účinnosti reakce vyčištění. Při každém testu se provádí optické hodnocení; při každé aplikaci se pořídí • · · · · 9 · 999 9999

9 9 9 9999 9 99 9

9 999 9 999 99 9

9·· 9 9 9 9999

99 99 9 · 9 · · 99 fotografie (kombinovaný trojitý test každé aplikace v podobě jedné fotografie), a určí se množství (hmotnost) plaku vytvořeného při každém testu.

Při volbě enzymů, kotevních elementů a metod a postupů napojení je třeba vzít v úvahu řadu faktorů, aby se zajistilo vytvoření nej účinnějších komplexů enzym-kotevní molekula. Některé z těchto faktorů jsou uvedeny dále: vybrané enzymy a kotevní molekuly musí být vždy nejvhodnější k omezení matrix bakteriální kolonizace. Dosažení kritického omezení polysacharidového základu pro tvorbu plaku si může vyžádat víc než jeden enzym.

Možné výhody tohoto vynálezu jsou trojí:

1) nevyžaduje bakteriální aktivitu, 2) normální rovnováha mikrobů v ústní dutině se zachová a

3) pravděpodobnost nežádoucích účinků u hostitele na místech vyjmutých z ústní dutiny je omezena na minimum nebo vyloučena.

Claims (35)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kompozitum k regulaci bakteriálního růstu/kolonizace, vyznačující se tím, že sestává z enzymu a kotevní molekuly napojené na enzym tak, že se vytvoří komplex enzym-kotevní molekula, přičemž kotevní molekula je schopna napojení na substrát proximálně ke kolonii baktérií, kde připojení k substrátu je za účelem prodloužení doby zachování komplexu enzymkotevní molekula v případě, že je přítomna kolonie baktérií.
2. 2. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že enzym je vybrán z hlediska schopnosti rozkládat kolonizační matrix.
3. 3. Kompozitum podle nároku 2, vyznačující se tím, že kolonizační matrix obsahuje polysacharidy, a enzym je vybrán z hlediska své schopnosti rozkládat polysacharidy.
4. 4. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že se kotevní molekula je vybrána z hlediska připojení k libovolnému vhodnému substrátu v ústní dutině.
5. 5. Kompozitum podle nároku 4, vyznačující se tím, že kotevní molekula je vybrána z hlediska připojení na povrch zubu.
6. 6. Kompozitum podle nároku 4, vyznačující se tím, že kotevní molekula je vybrána z hlediska připojení na pellicle na povrchu zubu.
7. 7. Kompozitum podle nároku 4, vyznačující se tím, že kotevní molekula je vybrána z hlediska připojení na stěnu bakteriální buňky.
8. 8. Kompozitum podle nároku 4, vyznačující se tím, že kotevní molekulou je molekula na bázi ligandu, vytvořená tak, že napodobuje vnější povrchy buňky a vytváří tak kompetitivní vazbu mezi baktérií a komplexem enzym-kotevní molekula s povrchy v ústní dutině.

   ·· v··· •4 44·· ·· 4 · · · » · · · • 4 4 ·· 444 4 4 4 · ·· 4444 ······ ······ · ····

   44 · · 44 · · · ·· 4 ·
9. 9. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že povrchem v ústní dutině je matrix plaku.
10. 10. Kompozitum podle nároku 7, vyznačující se tím, že kotevní molekulou je molekula na bázi receptoru, vytvořená tak, aby se vázala na místa přilnutí baktérií pro absorpci komplexu enzym-kotevní molekula do povrchů baktérií.
11. 11. Kompozitum podle nároku 3, vyznačující se tím, že póly sacharidem je glukan.
12. 12. Kompozitum podle nároku 3, vyznačující se tím, že polysacharidem je heterogenní a komplexní agregát a směs různých oligo- a polysacharidů.
13. 13. Kompozitum podle nároku 3, vyznačující se tím, že vybraným enzymem je hydroláza s hydrolytickým účinkem.
14. 14. Kompozitum podle nároku 13, vyznačující se tím, že enzym je vybrán ze skupiny tvořené: esterázami pro štěpení esterových vazeb; glykolytickými štěpícími enzymy pro štěpení vazeb, které se nacházejí u oligo- a polysacharidů; enzymy, štěpícími éterové vazby; enzymy, štěpícími peptidové vazby, kdy proteiny jsou substrátem (reaktantem); enzymy, štěpícími vazbu uhlíku a dusíku, kdy substrátem (reaktantem) není protein; enzymy, štěpícími kyselé anhydridy; enzymy, štěpícími vazby uhlíku a uhlíku; enzymy, štěpícími halidové vazby; enzymy, štěpícími vazby fosforu a dusíku; enzymy, štěpícími vazby síry a dusíku; a enzymy, štěpícími vazby uhlíku a fosforu.
15. 15. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že kotevní molekula je vybrána ze skupiny sestávající z proteinů, fragmentů proteinů a polypeptidů, přičemž je z jedné nebo více následujících skupin nebo jejich kombinace:

    a. Přirozeně se vyskytující;

    b. Přirozeně se vyskytující, ale modifikované;

    c. Syntetických polypeptidů

    i. s použitím přirozeně se vyskytujících se aminokyselin ii. s použitím syntetických, ne přirozeně se vyskytujících amino kyselin, D-aminokyselin, beta-substituovaných aminokyselin, alfa,alfa desubstituovaných;

    • 4 · ·

    4 4 4 ·· • ·

    44 444 4

    d. Prevalence náboje; a

    i. kationtové (zásadité aminokyseliny) ii. aniontové (kyselé aminokyseliny).
16. 16. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že kotevními molekulami jsou sacharidy a oligosacharidy, přičemž sacharidy a oligosacharidy jsou vybrány ze skupiny tvořené

    a. přirozeně se vyskytujícími jako je glukóza, manóza, galaktóza, rhamnóza, fukóza, fruktóza, sukróza;

    b. přirozeně se vyskytujícími aminocukry, jako je například glukosamin, galaktosamin, Nacytglukosamin, N-acetylgalaktosamin, kyselina neuraminová, kyselina sialová;

    c. syntetické nebo ne přirozeně se vyskytujícími sacharidy a aminocukry jako jsou

    i. Estery cukrů, např. estery cukru-organické kyseliny; a ii. chemicky kombinované cukry a proteiny/polypeptidy a syntetické glykoproteiny.
17. 17. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že kotevními molekulami jsou glykoproteiny / proteoglykany, vybrané ze skupiny, obsahující:

    a. Přirozeně se vyskytující, například elastin, lektiny,

    b. Syntetické, například modifikované přirozeně se vyskytující glykoproteiny/proteoglykany.
18. 18. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že kotevními molekulami jsou glykolipidy, vybrané ze skupiny sestávající z:

    a. Přirozeně se vyskytujících, například sfingomyelinu, cerebrosidu, gangliosidů; a

    b. Syntetických, například jako je modifikovaný přírodní glykol; lipidy po určitém chemickém postupu, jako například po esterifikaci, amidaci nebo podobném chemickém procesu.
19. 19. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že kotevní molekuly jsou lipoproteiny vybrané ze skupiny, sestávající z chylomikronu, velmi nízkodenzitních lipoproteinů (VLDL), nízkodenzitních lipoproteinů (LDL a vysokodenzitních lipoproteinů (HDL).
20. 20. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že kotevní molekuly jsou lipidy vybrané φφ ··φ · • Φ φφφφ φφ φ φφφ φφφφ φφ φ ΦΦΦΦΦ φφφφ φφ φφφφ ΦΦΦΦΦΦ φφφφ φφ φ φφφφ φφ φφ ΦΦΦΦΦ φφ φφ ze skupiny, sestávající z

    a. nepolárních látek, přírodních nebo syntetických, jako jsou triglyceridy, cholesterol nebo jiné rostlinné nebo živočišné steroly; a

    b. polárních látek, přírodních nebo syntetických, jako jsou fosfolipidy (fosfatidylserin).
21. 21. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že kotevní molekuly jsou fragmenty buněk, buněčné ghosts nebo segmenty nebo části vnějších stěn nebo membrán bakteriálních nebo živočišných buněk, napodobujících živé nebo viabilní bakteriální nebo živočišné buňky, které by napodobovaly živé a viabilní bakteriální nebo živočišné buňky pro účely připojení enzymu k povrchu uvnitř ústní dutiny.
22. 22. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že kotevní molekuly jsou nebiologické, polymerové materiály, vybrané ze skupiny, sestávající zkopolymerů jako jsou styrénbutadienové polymery.
23. 23. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že enzym je a-glukosidáza.
24. 24. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že enzym je dextranáza.
25. 25. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že kotevní molekulou je zásaditý polypeptid.
26. 26. Kompozitum podle nároku 25, vyznačující se tím, že zásaditý polypeptid je Lys-Lys-GluLys-Lys.
27. 27. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že kotevní molekulou je kyselý polypeptid.
28. 28. Kompozitum podle nároku 27, vyznačující se tím, že kyselým polypeptidem je Glu-GluLys-Glu-Glu.
29. 29. Kompozitum podle nároku 1, vyznačující se tím, že substrát obsahuje micely.

    <0 0000 • 0 0000 00 00

    00 0 990 0000

    0 0 0 0 0000 9 00 0

    0 0 000 0 000 00 0 <000 09 0 0000

    00 00 00 000 0« 00
30. 30. Způsob regulace bakteriální kolonizace, zahrnující kroky:

    vytvoření komplexu enzym-kotevní molekula, sestávajícího z enzymu, vybraného pro schopnost rozkládat alespoň část kolonizační matrix, a kotevní molekuly, z níž část je napojena na enzym a vytváří tak komplex; a výběru kotevní molekuly na základě její schopnosti připojit se k substrátu a prodloužit tak retenční čas komplexu enzym-kotevní molekula v těsné blízkosti matrix.
31. 31. Způsob podle nároku 30, vyznačující se tím, že bakteriální kolonizace se reguluje uvnitř ústní dutiny.
32. 32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že kolonizační matrix je matrix plaku a kde matrix plaku obsahuje polysacharidy.
33. 33. Způsob přípravy kompozitu pro regulaci proliferace bakteriálních kolonií, který zahrnuje: volbu enzymu na základě jeho schopnosti rozkládat strukturální komponentu, kde dochází k bakteriální kolonizaci;

    volbu kotevní molekuly na základě její schopnosti napojit se na vybraný enzym tak, aby si tento enzym zachoval účinnou enzymatickou aktivitu ve smyslu rozkladu strukturální komponenty, přičemž kotevní molekula se dále vybírá pro schopnost napojit se na substrát proximálně k bakteriální kolonizaci; a napojení kotevní molekuly a enzymu tak, aby vznikl komplex enzym-kotevní molekula.
34. 34. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že je určen pro regulaci šíření bakteriálních kolonií v ústní dutině.
35. 35. Způsob regulace kolonizace bakteriálního plaku v ústní dutině, vyznačující se tím, že specifický enzym pro rozklad plaku se navazuje na kotevní molekulu, vybranou ze skupiny sestávající ze stěny buněk, fragmentů buněčné stěny, fragmentů buněk a buněčných ghostů.