CN1276732A - 控制细菌集群的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于控制细菌生长/集群的组合物。该组合物包括酶、连接在酶上形成酶—锚复合物的锚分子,所述锚能够附着在接近细菌菌落的底物上。附着在底物上可延长酶—锚复合物在有细菌菌落存在处的保留时间,以增加所述复合物的效用。本发明还涉及控制口腔中菌斑集群的方法、以及形成用于控制口腔中细菌菌落的组合物的方法。

Description

控制细菌集群的组合物
发明领域
本发明涉及用于控制细菌集群的组合物，更具体而言但不限于口腔应用来降低牙斑。本发明还涉及一种口腔治疗方法，其限制口腔中细菌集群的程度，并由此降低牙斑的量。用酶控制菌斑结构的范围或尺寸，由此可限制细菌菌落的增殖以及向牙龈组织中的侵入。本发明还涉及制备所述组合物的方法。
发明背景
牙周疾病是人类最古老和最常见的疾病之一。其在人类化石残留物中非常明显，而且在健康个体中也发生。目前，牙周疾病是世界性的主要健康问题。该疾病是由于牙斑在牙龈边缘积累导致的。根据病理学的程度或严重度大致分为两大类牙周疾病：牙龈炎和牙周炎。
牙龈炎是由于牙斑的积累导致的边缘牙龈组织炎症。对于大多数情况，牙龈炎的特征是牙龈组织的发红、肿胀和流血。这些特征的范围和严重度表明疾病的发展程度。牙周炎的特征不仅在于边缘牙龈的炎症，而且还有由于尖端迁移造成的牙周韧带附着的丢失、牙槽骨的丢失、以及上皮附着的丢失。这些生理丢失的病理学后果是形成牙周袋，该牙周袋可被感染，并由此成为细菌侵入宿主的源头。已形成的牙龈炎发展为更严重的损伤也是牙周炎的基础。
文献表明有明显的细菌菌落由牙龈炎症部位向龈下袋迁移。已知某些已确认和具体的细菌生物对人牙周疾病的产生有作用；但是，其他生物也有可能增加该疾病的严重性。另外，临床研究的结果表明在存在有某些微生物种类与不同类型和严重程度的牙周疾病之间有相关关系。包含多种集群菌株的菌斑的存在和量与牙周疾病之间有因果关系。因此可以得出以下结论：通过限制菌斑即可控制牙周疾病的范围和严重性。
慢性牙龈炎和慢性牙周炎有两个共同的重要特征，这可成为它们顺序关系的一个线索。两种病症通常在发展至更后期之前是不痛的，而且这两种疾病的病理学在病症发展顺序以及发展成更严重的牙周疾病之前都绝对需要菌斑。虽然存在影响该疾病程度的继发性系统和外界因素，但最重要而且能够最有希望控制的因素是菌斑和牙周疾病之间的关系。
该疾病的发展是由牙龈边缘处的菌斑积累开始的。作为病理学过程，有牙龈和牙周韧带的慢性炎症，随后是各种牙龈—牙齿结构的变性。由各种组织界面和牙周袋中的矿化菌斑形成的结石加重了慢性炎症。上皮组织迁移至发炎以及坏死区域中可加深菌斑结构，其结果是伴随有脓液的脓肿。牙周疾病最后而且是最严重的阶段是牙槽骨的重吸收以及牙齿的最终脱落。
菌斑是嵌在粘性基质中的细菌聚集体的异原混合物。虽然菌斑中的细菌组分为50-70％，但所述基质衍生于附着在多糖骨架上的死亡细胞、唾液糖蛋白和血清蛋白。作为在其自身集群过程中的一个步骤，细菌合成用于菌斑骨架的多糖。除存活的细菌和基质外，菌斑还包含食物残留物、少量的上皮细胞、白细胞和各种衍生于宿主和宿主活动的其他组分。
菌斑的形成和发展或增殖分为两个步骤。第一步需要在牙齿表面以及口腔软组织上的唾液糖蛋白基层。该基础有机层衍生于唾液，吸附在表面上，并形成获得性薄膜。该不溶性的获得性薄膜对于龈外菌斑的形成起到基础作用。第二步是获得性薄膜中的“前锋”细菌形成细菌集群。一旦细菌附着在结构表面上，它们就会聚集并发展成菌落，而且菌斑开始形成。
在各种牙斑中共有100种以上不同的细菌种类。该细菌种类的变化受食物、唾液组分以及细菌相互作用等影响。口腔中菌斑的位置、每天中的时间、患者年龄以及患者常规口腔卫生状况都对牙斑和牙周疾病的形成有影响。因此，菌斑是附着在牙齿上的细菌菌落异原集合物并产生各种生化和生理后果并不令人惊奇。所产生的两种主要的病理学症状是牙周疾病和龋齿。
酶作为治疗剂具有独特的可能性。但是，一些使用酶的早期口腔病理学研究是基于以下假设：这些酶对于菌斑中存在的生物菌落是杀菌性的，并因而可作为“消毒剂”。但是该方法没有结果。近来，已有人表明用蛋白酶治疗颊上皮细胞可改变细菌粘着；但是，该治疗方法会破坏各种细菌数量的比例。当将注意力由杀菌作用转移至改变菌斑形成时，可得到更有希望的结果。这些结果已在体内和体外以及在动物模型和人的临床实验中见到。但是，这些方法仍没有产生所希望的治疗效果，这最有可能是因为有效作用所需要的时间超过了酶在口腔中的保留时间。简言之，口腔中的唾液、其他流体以及食物移动和正常的机械搅动都可降低酶的保留时间。这些因素缩短了酶的停留时间，使得不能产生所希望的临床效果。
当体外测试酶时，在口腔中的停留时间的重要性并没有被作为一个主要问题。没有人指出这些体外研究的设计甚至鉴别出该重要变量。这些体外系统的确证实了酶降低菌斑的活性，但也鉴别了其他重要因素。这些其他因素包括：(1)可能需要1种以上的酶；(2)需要酶具有更大的特异性活性；(3)需要更合适的酶；或者(4)酶的组合可能更有效。
菌斑本身是各种组分的极其复杂的混合物，所述组分例如是大分子、活或死的细胞(完整细菌和从宿主中脱落的上皮细胞)、细胞片段和来自于宿主及细菌菌群的物质的各种其他贡量。对菌斑的化学方面的先锋工作集中于菌斑碳水化合物或多糖(PS)骨架。其是一个理想的开始位置，这是因为PS骨架不仅对于菌斑基质起到结构因素的作用，而且对于细菌菌落的生长起到碳水化合物食物库的作用。对PS的大多数研究都集中于测定葡聚糖的性质和结构；但是，构成菌斑组成的还有许多其他成分。在参考描述涉及酶的现有牙齿治疗研究的科学文献时，出现某些模式。大多数控制菌斑的酶研究是在防止龋齿的庇护下进行的；但是，已经确认菌斑控制是涉及防止龋齿和防止牙周疾病的基本问题。所进行的研究类型包括杀菌作用的体外检查、动物研究和涉及人实验的临床研究。另外，大多数的临床研究使用漱口剂作为释放酶的载体，而几乎没有研究使用口香糖。
第4,138,476号美国专利(Simonson)公开了通过分子改变使用菌斑分散酶作为口腔治疗剂。葡聚糖水解酶与磷酸盐载体组组合，使酶本身增加了与牙齿表面的亲和性。该经改性的葡聚糖水解酶在反应剂如氯甲酸乙酯存在时共价键地与载体交联，并对牙齿的羟基磷灰石组分具有更高的结合能力。
第5,490,988号美国专利(Beggs)涉及向目标部位释放治疗剂。该专利公开了一种高度特异性的方法，其中抗体片段能够通过抗原—抗体结合而结合在目标部位上，并使治疗剂通过附着在抗体片段上的其他肽而连接在抗体片段上。该产物因此由抗体片段、肽和治疗剂组成。
检查用于评估酶的已发表的临床研究表明，即使可见到有限的临床效果，但仍有两个原因使得所选择的酶不能完全发挥它们令人希望的作用：a、酶未经改性，使得它们可在口腔中保留更长的时间；以及b、在白天时口腔冲洗各种长度的时间以及各种所选择的次数，没有特别注意仅在限制口腔活动(吞咽、咀嚼和产生唾液)之前如睡觉时给药。
发明简述
本发明的主要方面是在于两个概念，它们对于防止牙周疾病的成功治疗方法是必须的。第一个是用酶调节口腔中菌斑结构的量及构成；第二个是在口腔中保持酶的方法。这两种概念必须优选用于有效地控制牙周疾病的发生。
在一个方面中，本发明改性所选择的酶，其方式是使它们具有限制菌斑或其组分的能力。所选择的酶优选是特异性降解多糖的酶。以此方式，菌斑基质的骨架结构即可被限制，而不会选择性或者广谱地杀死细菌，并由此避免任何细菌失衡。
本发明提供选择性控制增殖性细菌集群，并因此针对预防而不是治疗。本发明不取决于在口腔中的杀菌活性，这消除了(a)正常细菌数量的潜在失衡，例如在口腔或在宿主中或上的其他遥远部位处的过度生长；(b)需要考虑宿主的全身反应，这可以是免疫性或毒性的；以及(c)需要在牙龈边缘之下给药活性药物。因此，重点在于细菌粘着，特别是在口腔中。
经改性的酶优选连接在“锚”分子上以保留在口腔中。酶在口腔中的保留优选通过将酶连接在特异性分子上来使其最大化，所述特异性分子将粘结在口腔中的结构和已有的生物膜上。在连接后应保持酶活性。重要的是，将所选择的酶连接在特异性“锚”分子上的过程不完全损坏酶活性，但由于连接的原因有可能使该活性下降。然而，在连接后至少应有最小有效量的酶活性。
在另一个方面中，本发明还提供在体外测试系统以及在体内测定所选择并经改性的酶抑制口腔菌斑生长程度的方法。所选择的酶在连接于或衍生至“锚”分子上后可以保持酶活性，这样的酶适合用于抑制菌斑生长。
本发明的产物可以但不是必须为在睡觉时可以使用的口腔冲洗液的形式。优选在唾液和机械搅动较低时将口腔冲洗液形式的改性酶保持在口腔中。另外，保留时间的长度(在睡觉期间6-8小时)对于治疗酶进行所希望的生化反应提供了更长的时间。
本发明在牙斑方面有矛盾性：一方面，如细菌和菌斑的致病因素保留在口腔中，但另一方面，在口腔中很难保持强效治疗剂如酶。该矛盾性可有利地用于通过赋予所选酶具有特殊性质来控制牙斑，所述特殊性质是细菌用于产生牙周疾病者，例如粘着在口腔表面上的能力。在本发明中，已重点考虑了增加抗菌斑组合物在口腔中的保留时间的重要性和必要性，这是因为仅通过增加该组合物在口腔中的保留时间即可使其具有有效防止菌斑增加的能力。如果仅在口腔中非常短时间地使用抗菌斑组合物，它们的效果是非常有限的。为杀死细菌，短的保留时间有可能就足以；但是，对于改变和限制细菌菌落生长载体介质的结构构成的新概念，更长的保留时间是必须的。
以前降低或消除牙周疾病的研究大多数都直接针对于消除细菌；几乎没有研究针对控制细菌环境。本发明试图在保持口腔中各种菌株之间的平衡的同时控制细菌菌落生长。控制菌斑的量并限制胞外多糖骨架的量，由此即可控制细菌菌落的大小。该控制可通过本发明的酶组合物及方法来实现。
附图简述
图1是本发明的酶—锚复合物在附着于牙齿上时的示意图；
图2是本发明的酶—锚复合物在附着于口腔中的薄膜或其他表面上时的示意图；
图3是本发明的酶—锚复合物的其他实施方案在附着于口腔中时的示意图；
图4是本发明的酶—锚复合物在附着于口腔中细菌菌落基质上时的示意图；以及
图5是本发明的酶—锚复合物在附着于口腔中细菌菌落基质中的细菌上时的示意图。
详细描述
本发明提出在口腔中保持所选择的酶。与在牙粉或口腔冲洗液中(在此效果仅是暂时的)掺入游离且新制的酶不同，酶通过改性可保留在口腔中，并由此具有更多的机会进行所希望的生化反应和有益的作用。另外，特异性酶的选择优选使细菌中的毒性反应最小化，以保持正常的细菌平衡，并同时不会负面影响必须的而且是保护性的生物膜，例如“获得性薄膜”。
改性某些多糖降解酶，以使它们能够吸附在口腔中的表面和结构上，并抑制与菌斑基质有关的增殖性细菌集群化。酶衍生或连接至“锚”分子上。酶—锚复合物中的“锚”部分则可接着粘结在口腔中的结构上，抑制菌斑的增加。
已经认识到Streptococcus mutans和菌斑最终涉及龋齿的形成。该生龋细菌使用蔗糖来产生用于口腔中整个微生物群代谢的底物。该蔗糖支持的代谢的最终产物是诱发涉及龋齿形成的顺序步骤的有机酸。另外，Streptococcus mutans也使用蔗糖支持的底物池来产生复杂的而且不溶于水的多糖，并由此使用蔗糖增加口腔菌群的集群化。该过程大多数情况下伴随着与牙斑集群的许多其他细菌而发生。
不溶性的多糖结构对于增强的细菌集群提供了骨架，这些细菌集群聚集时，成为被认为是菌斑的可观察到的膜。虽然多糖对于“前锋”细菌初始粘着在牙齿表面上并不是必须的，但菌落的集群和渗透需要这些不溶性的多糖。由于它们的不溶性，复杂的多糖有可能不仅导致初始细菌的集群和增殖，而且还有可能保护细菌不受治疗剂的攻击。因此，本发明可与杀死细菌的药物一起使用，该药物可以是特异性的或非特异性的。限制和控制不溶性的多糖的量以及最终细菌在菌斑中的集群，对于防止牙周疾病的发展具有有益作用。这些复杂而且不溶性的多糖之一是葡聚糖。因此，葡聚糖的酶降解作用是本发明的目的之一。
本发明提供将某些葡聚糖降解酶固定在口腔中的表面和结构上的组合物和方法。这可抑制菌斑的增加，而该菌斑是牙周疾病的必要前序步骤。抑制增殖性细菌集群可避免对各种细菌菌株之间微生物生态或平衡的任何损坏。通常情况下，由于机会细菌(其中一些是致病性的)的过度生长的潜力，避免细菌数量的移动是人们所希望的。本发明的组合物寻求保持口腔中各种细菌菌株的正常相对比例。但是，至少某些细菌菌株的绝对数量要降低，这是因为该种细菌的菌落较小。
增加酶在口腔中的保留时间的机理的发展给临床效果的增加提供了机会。为达到该目的，有效的酶必须保留在口腔中更长的时间，以完成其预期的作用。酶在口腔中的保留时间增加将通过限制菌斑基质的多糖骨架来控制菌斑。
因此，本发明的组合物有助于酶在口腔中保留更长的时间。该方法涉及将合适的酶衍生或连接至“锚”分子上，该分子用衍生的酶—锚复合物中的“锚”部分连接在口腔中的结构上。将具体地选择锚分子，以便连接在例如已有的菌斑或者覆盖牙齿的获得性薄膜上。由于上皮组织相对较快的周期，与已有的菌斑或薄膜相比，口腔中的粘膜组织层对于连接部位是不太优选的选择。
在一个实施方案中，将两种酶连接在三个“锚”分子上，所述两种酶的酶活性能够有效地控制菌斑中的碳水化合物结构骨架。在包含唾液(正常细菌和宿主糖蛋白)的体外测试系统中测试了6个所得到的酶—锚复合物，以估算它们通过连接菌斑并使菌斑的多糖骨架水解断裂来控制菌斑和限制其增殖的能力。估算了这些酶—锚复合物的临床效力，而且在必要时进行最佳化。
参考附图中的图1和2，它们示意性地说明了本发明的锚—酶复合物。这些图是示意图，并不是成比例的，而且仅用于说明。在图1中，其示出了具有表面12的牙齿10。在表面12上，基质中的细菌菌落14附着在牙齿10上。在牙齿的表面12上还附着有锚分子16，该分子可以是一种粘着肽。已固定的酶18连接在锚分子16上，而且锚分子16和固定的酶18一起形成锚—酶复合物20。该锚—酶复合物20与菌落14竞争附着在牙齿10的表面12上，并由此减少菌落14附着的潜在基底部位。另外，而且也是最重要的，酶18在菌落14上发挥其催化作用，降解菌斑基质和/或多糖骨架。在图1中，可以看见酶18对基质的终结22。因此，严重地破坏了菌落14的扩张能力。再者，锚—酶复合物20在牙齿表面12上有明显更长的保留时间，由此对菌斑基质和菌落14增殖产生了并不是暂时性的阻碍。
图2示出了本发明的另一个实施方案。在该图中，相应于图1中的部分用相同的参考数字表示。在图2所示的实施方案中，牙齿表面12上有薄膜24，其上附着有酶。该薄膜包含肽、蛋白等，并可提供或构成锚，或者可以使用预先附着在酶上的单独锚分子。
在图4中，详细地示出了细菌菌落基质14，其包括单个细菌44。在该实施方案中，复合物20中的锚分子16附着在细菌基质上，并可清楚地看见基质的终结22。在图5中，复合物20中的锚16直接附着在基质14内的细菌44上。
将酶—“锚”复合物扩展至包括除那些水解或降解葡聚糖以外的多糖降解酶，例如降解果糖基多糖的酶或水解糖蛋白的酶等，仍在本发明的范围内。复合物也可扩展至覆盖以配体为基础的“锚”分子，其可模拟细菌的外细胞表面，以在细菌和“锚”—酶复合物之间产生直接的竞争性结合。另外，复合物可包括以受体为基础的“锚”分子，其模拟细菌附着部位，使“已锚定”的酶可以被吸附在已附着在菌斑上的细菌表面上。最后，还可使用包括多肽而且已知为粘着分子的锚分子。
可纯制潜在合适的水解酶(多糖水解酶、糖蛋白降解酶等)，以达到更高的特异活性以及更集中的特异反应类型。
之后，也可进行测定酶和“锚”分子之间的连接度或程度的步骤，由此确定附着在酶上的“锚”分子的量，这可更好地组合酶活性和结合度。
可以理解的是，在本发明中可以使用任何可有效防止或降低细菌集群的酶。优选的是，可使用具有水解作用的一组酶或水解酶，因为它们特别有效。该组酶有助于连接各部分的化学键的水解，所述各部分在水解反应发生后可以单独的化学单位存在。可在本发明中使用的优选酶可从以下组的一种或多种中选择：酯酶—那些可以断裂酯键的酶；糖断裂酶—那些可以断裂寡糖和多糖中的键的酶；醚键断裂酶；肽键断裂酶，其中蛋白是底物(反应剂)；碳—氮键断裂酶，其中底物(反应剂)不是蛋白；酸酐断裂酶；碳—碳键断裂酶；卤化物键断裂酶；磷—氮键断裂酶；硫—氮键断裂酶；以及碳—磷键断裂酶。
在口腔中用于锚定酶的锚分子和结构可从如下所述的多种不同类型的物质中选择：A、蛋白、蛋白片段和多肽
a、天然的
b、天然但经改性的
c、合成的多肽
i、使用天然氨基酸
ii、使用合成的、非天然的氨基酸，例如D-氨基酸、β-取代的氨基酸、α，α-二取代的等。
d、带电荷的
i、阳离子(碱性氨基酸)
ii、阴离子(酸性氨基酸)
iii、中性(脂族氨基酸)
e、上述物质的任意组合B、糖和寡糖
a、天然的，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、果糖、蔗糖等。
b、天然的氨基糖，例如葡糖胺、半乳糖胺、N-乙酰基葡糖胺、N—乙酰基半乳糖胺、神经氨酸、唾液酸等。
c、合成或非天然的糖和氨基糖
i、糖的酯，例如糖—有机酸酯等
ii、化学组合的糖和蛋白/多肽，例如合成的糖蛋白C、糖蛋白/蛋白聚糖
a、天然的，如弹性蛋白、凝集素等
b、合成的，如经改性的天然糖蛋白/蛋白聚糖D、糖脂
a、天然的，如鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂等
b、合成的，如经改性的天然甘醇；通过一些化学方法如酯化、酰胺化或类似化学方法得到的脂质E、脂蛋白，如乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等F、脂质
a、非极性的天然或合成的脂质，如甘油三酯、胆固醇或其他的植物或动物甾醇等
b、极性的天然或合成的脂质，如磷脂(磷脂酰丝氨酸)等G、细胞片段和细胞外壳—为细菌或动物细胞壁或膜的片段或部分，它们可模拟活细菌或动物细胞，以便将酶固定在口腔内的表面上。H、非生物的聚合性物质
a、均聚物，如聚乙二醇(PEG)等
b、共聚物，如苯乙烯—丁二烯聚合物等
锚分子和酶之间的连接也可采取多种形式。这些连接可以是化学的、化学吸附或共价键，包括酰胺(肽)；酯；糖苷(糖键)；和/或醚。所述连接也可以是物理的、物理吸附，如范德华力，包括亲脂性；电荷—电荷吸引/相互作用，包括静电相互作用；和/或氢键，包括亲水性。
锚—酶复合物中的锚与口腔中的表面底物之间的连接通常是与上述相同的类型。参考图3，其示意性地表示了底物30的形式，该底物是口腔中的一个表面，例如牙齿、已存在的菌斑、器具或粘膜组织、以及连接于其上的锚—酶复合物32。锚—酶复合物32包括锚部分34和酶部分36。在复合物32和底物30以及锚—酶连接40之间存在锚—表面界面38。据信，酶部分36和锚部分34之间的连接更趋向于是化学类型的，而锚—酶复合物32中的锚部分34与底物30之间的相互作用更有可能是物理类型的。
酶和锚之间的连接更趋向于是化学类型的。锚—酶复合物中的锚部分的相互作用更有可能是物理类型的。实施例
本发明的实施方案涉及选择两种已知对降解牙斑基质中的多肽骨架具有活性的酶。这两种酶可以是：
1)、α-葡糖苷酶EC 3.2.1.20；[(1→3)3-葡聚糖水解酶]。α-葡糖苷酶可市售得到。该酶对α-1，4-葡萄糖键具有最大的活性，但其还可水解α-1，2和α-1，3键。该酶也可水解α-1，6键，但速率非常低。
2)、葡聚糖酶EC 3.2.1.11；[(1→6)6-葡聚糖水解酶]。葡聚糖酶也可市售得到。该酶由α-1，6连接的多糖上断裂葡萄糖分子。
许多研究人员描述了葡聚糖的结构为α-1→3和α-1→6。葡聚糖还被描述为具有α-1→4和α-1→2键。从结构方面来说，α-1→6键使葡聚糖具有长度，而α-1→3、α-1→4和α-1→2键使葡聚糖具有分枝特征。尚未知晓葡聚糖长度或葡聚糖分枝对于细菌集群是否是重要的。为此原因，选择两种市售酶：α-葡糖苷酶，其对α-1→4、α-1→2和α-1→3具有断裂活性，即、在葡聚糖结构中的分枝点处断裂；以及葡聚糖酶，该酶产生α-1→6键的断裂，即、在增长键处断裂。
这些酶将分别与以下各“锚”分子连接：1、碱性多肽，如Lys-Lys-Glu-Lys-Lys或一些类似的碱性多肽；2、酸性多肽，如Glu-Glu-Lys-Glu-Glu或一些类似的酸性多肽。
磷壁酸和脂磷壁酸对于连接而言是重要的细菌细胞壁组分。这些组分还与磷酸酯有关，该磷酸酯将使细菌细胞表面的外侧部分呈现阴离子特征。为此，“锚”分子，阳离子类型的Lys-Lys-Glu-Lys-Lys，将连接在细菌细胞壁上。
因为已有的证据表明细菌细胞表面是阴离子性的，所以有理由怀疑细菌在基本上是阳离子性的菌斑部分上集群。的确，如果存在与菌斑有关的阳离子特性的区域或面积，“锚”分子，阴离子类型的Glu-Glu-Lys-Glu-Glu附着在菌斑的阳离子区域上，将是一个好的选择。
另外，任何其他密集设置的脂质如胶束可起到口腔中的底物或者酶—锚复合物附着于其上的锚分子的作用。
电荷吸引的基本理论是将所选择的酶锚定在口腔中的各种有机结构上的基础，其也有可能是细菌附着的一个因素。但是，菌斑集群中的细菌附着也可涉及除单独电荷吸引以外的因素。因此，特异性蛋白对于连接口腔细菌至多肽(葡聚糖)和菌斑上是有作用的。然而，细菌附着在菌斑中的实际机理尚不能排除连接在特异性“锚”分子上的酶的其他连接机理，而且也包括在本发明的范围内。
本实施例中举出的酶和锚将产生六种衍生的酶，其对于宽的电荷—连接能力是强效的。合成
衍生的酶—锚复合物的合成部分涉及将各“锚”分子连接在两个单独的酶上。碱性多肽Lys-Lys-Glu-Lys-Lys通过Glu残基的游离羧基连接在两个酶上，而且有一些是通过多肽的“C”端连接的。酸性多肽Glu-Glu-Lys-Glu-Glu通过Lys残基的游离氨基来连接，而且有一些是通过多肽的“N”端连接的。
六种衍生的酶反应产物的纯制可在柱色谱上通过分子排阻来进行。分析经纯制并连接上的酶，并与未衍生的酶比较，以确定由于连接步骤引起的酶活性的任何变化。
在该实施例中产生的6种锚—酶复合物，或者其他酶和锚的复合物，可进一步在临床应用前于体外系统中测试。可使用任何合适的测试方法，例如Drake的方法(Drake，D.R.，Vargas，K.，Cardenzana，A.和Srikantha，R.，“臂和锤牙齿保护的杀菌活性增强(Enhanced bactericidalactivity of Arm and Hammer dental care.)”Am.J.Dent.8，308-312(1995))或其经改进的方法。
例如从Peptides Intemational，Louisville，Kentucky购得的碱性和酸性多肽是例如通过各种固相法合成的。这些起始物可不经纯制即使用；但是，如有必要，各起始物的保留部分应优选分析其纯度，以描述意料之外的反应产物等。
也可市售得到并从United States Biochemical，Cleveland，OH和Worthington Biochemical，Freehold，NJ购的酶也不经纯制即使用。可以使用但不能市售得到的其他酶可从组织和生物中使用标准方法来分离和纯制。仅在需要测定纯度时，应进行分析各种酶的保留部分。取决于体外实验的结果，所述纯制分析有可能是重要的。使用酶的保留部分进行这些分析。
优选在衍生(偶联)反应之前和之后测定酶活性，这可容易地通过使用标准分析方法中的4-硝基苯基-α-D-葡萄糖来完成。
碱性多肽，Lys-Lys-Glu-Lys-Lys可通过Williams(1981)描述的方法(Williams，A.和Ibrahim，I.A.“涉及用水溶性肽偶联剂1-乙基-3-[-3-二甲基氨基丙基]-碳化二亚胺(EDC)的亲核性的反应的环状互变异构体的机理(A mechanism involving cyclic tautomers for thereaction with nucleophiles of the water-soluble peptide coupling reagent l-ethyl-3-[-3-dimethylaminopropy]-carbodiimide(EDC).)”J.Am.Chem.Soc.103，7090-7095(1981))的改进法连接至各酶上。该方法使用1-乙基-3-[-3-二甲基氨基丙基]—碳化二亚胺(EDC)作为偶联剂。多肽中Glu的EDC活化羧基(以及多肽“C”端上的羧基)连接至酶的游离氨基上，形成共价酰胺键。
酸性多肽，Glu-Glu-Lys-Glu-Glu可使用O′Shannessy(1987)描述的方法(O′Shannessy，D.J.和Hofmann，W.L.“ 用于部位直接固定的连接抗体(Coupling antibodies for site directed immobilization.)”Biotech.Appl.Biochem.9，488-496(1987))的改进法来连接至各个酶上。在该方法中，Lys的游离氨基(以及多肽中的“N”端上的游离氨基)转化为醛，然后连接至酶的游离氨基上。
在上述两种涉及多肽“锚”分子的偶联或衍生反应中，存在多种副产物；但是，在分子大小(分子量)方面也有较大的差异，这使得能够进行使用例如HPLC的分离步骤，该HPLC带有3000 PW柱用于基于分子大小的分离。
该分离步骤的目的是清除反应物。该清除步骤除去未反应的多肽“锚”分子、“锚”分子之间相互反应所产生的多肽混合物、以及所希望的酶—“锚”复合物产物。根据连接在酶上的“锚”分子的数量，还有可能存在大量的所希望的酶—“锚”复合物。根据“锚”分子的数量将酶—“锚”复合物分离为各种组分被认为是不必要的；然而，可集体测试并临床应用所有类型的酶—“锚”复合物。但是，将各种类型的酶—“锚”复合物分离成独立的分子单位可在认为适当的时候进行。
如果需要或者认为必须时，清除步骤可通过限定和设定所述柱(HPLC)的操作条件来实施。样品可用以下物质制成：(1)单独使用酶；(2)单独使用锚分子；以及(3)没添加酶的反应混合物。在所限定的操作条件下测定总蛋白的保留时间/组分数量，所述条件可分离游离的“锚”分子、“锚”分子之间的反应产物、游离酶以及衍生或连接的酶。体外分析
在临床应用前，在体外分析中测定任何经合成的酶—锚复合物的效用。以下将描述一个此等分析法。
在唾液产出量以及高水平的Streptococcus mutans和Actinomycesviscosus(板计数)方面筛选受试者，上述两种细菌被认为是高菌斑形成细菌。所选受试者的唾液产出量可通过咀嚼惰性物质如parafilm或carbowax来刺激。所收集的唾液将作为原料接种溶液。该原料溶液将通过混合唾液样品和最大量的经鉴别的菌株(占总样品的20-25％)来制备。
然后，制备以下溶液：
a)富糖肉汤，
b)20mg/ml的洗必太阳性对照溶液，该物质是已知的菌斑形成抑制剂，
c)两种与测试有关的对照可以是未经衍生化的酶，即、没有“锚”分子的酶，
d)8种处理溶液(6个测试溶液和2个与测试有关的对照)可用富糖肉汤作为溶剂来制备，其产生浓度为10、1.0、和0.1mg/ml的原料溶液。方法
将无菌玻璃片放置在50ml试管中，该试管包含39ml的富糖肉汤。在该试管中接种1ml的原料接种(唾液)溶液。在37℃、5％CO2下温育试管24-48小时，直至肉眼观察到有菌斑形成。取出玻璃片，转移至新制富糖肉汤的定量(dosing)溶液(39ml，在50ml试管中)中，该该溶液中添加1ml适当的测试溶液。所述定量溶液具有以下组成：
1)未处理的对照—富糖肉汤
2)阳性对照-20mg/ml洗必太
3)涉及1A、1B和1C处理的对照-1.0mg/ml未“锚定”的α-葡糖苷酶
4)涉及2A、2B和2C处理的对照-1.0mg/ml未“锚定”的葡聚糖酶
5)测试处理2A、2B和2C(3葡聚糖酶-“锚”)：10、1.0和0.1mg/ml
6)测试处理2A、2B和2C(3葡聚糖酶-“锚”)：10、1.0和0.1mg/ml
将玻璃片保留在相应的定量溶液中约1小时。然后取出这些玻璃片，并通过浸没在清洗富糖肉汤中来冲洗。
然后将玻璃片放置在新制的富糖肉汤中，并在相同的方式下温育试管24-48小时。记录(照相)各处理中菌斑的量，然后从各玻璃片上收集菌斑，干燥并称重。
测定衍生化之前和之后的酶活性以及反应清除的效用。肉眼观察各个实验；对各种处理进行拍照(组合各处理的三个重复实验作单个照片)，然后测定各实验中形成的菌斑的量(重量)。
在选择酶、锚和连接方法及步骤时，应考虑多种因素，以提供最有效的酶-锚复合物。这些因素中的一些是：所选择的酶和锚分子对于限制细菌集群基质总是最适当的。1种以上的酶有可能是必要的，以对于用于菌斑形成的多糖骨架产生关键性的限制。
本发明有以下三个主要的优点：1)、它不需要杀菌活性；2)、仍可维持口腔中的正常微生物平衡；以及3)、在从口腔中除去的部位处对宿主的副作用的可能性被最小化或消除。

Claims (35)

1、一种用于控制细菌生长/集群的组合物，其包括：
酶；
连接在所述酶上以形成酶—锚复合物的锚分子，所述锚能够附着在邻近细菌菌落的底物上，
其中，附着在所述底物上能够延长酶—锚复合物在有细菌存在之处的保留时间。
2、如权利要求1所述的组合物，其中，所述酶能够降解集群基质。
3、如权利要求2所述的组合物，其中，所述集群基质包括多糖，而所述酶能够降解多糖。
4、如权利要求1所述的组合物，其中，所述锚分子能够附着在口腔中任何合适的底物上。
5、如权利要求4所述的组合物，其中，所述锚分子附着在牙齿表面上。
6、如权利要求4所述的组合物，其中，所述锚附着在牙齿表面的薄膜上。
7、如权利要求4所述的组合物，其中，所述锚分子附着在细菌细胞壁上。
8、如权利要求4所述的组合物，其中，所述锚分子是以配体为基础的分子，用于模拟细菌的外细胞表面，并由此在细菌和“锚”—酶复合物之间产生竞争性的与口腔表面的结合。
9、如权利要求1所述的组合物，其中，所述口腔中的表面是菌斑基质。
10、如权利要求7所述的组合物，其中，所述锚分子是以受体为基础的分子，用于模拟细菌附着部位的结合，使酶—锚复合物可以被吸附在细菌表面上。
11、如权利要求3所述的组合物，其中，所述多糖是葡聚糖。
12、如权利要求3所述的组合物，其中，所述多糖是许多不同的寡糖和多糖的异原且复杂的聚集物。
13、如权利要求3所述的组合物，其中，所述酶是具有水解活性的水解酶。
14、如权利要求13所述的组合物，其中，所述酶是从以下组中选择：用于断裂酯键的酯酶；用于断裂寡糖和多糖中的键的糖断裂酶；醚键断裂酶；肽键断裂酶，其中蛋白是底物(反应剂)；碳—氮键断裂酶，其中底物(反应剂)不是蛋白；酸酐断裂酶；碳—碳键断裂酶；卤化物键断裂酶；磷—氮键断裂酶；硫—氮键断裂酶；以及碳—磷键断裂酶。
14、如权利要求1所述的组合物，其中，所述锚分子从蛋白、蛋白片段和多肽组成的组中选择，它们是以下组中的一种或多种：
a、天然的；
b、天然但经改性的；
c、合成的多肽
i、使用天然氨基酸
ii、使用合成的、非天然的氨基酸、D-氨基酸、β-取代的氨基酸、α，α-二取代的；
d、带电荷的
i、阳离子(碱性氨基酸)
ii、阴离子(酸性氨基酸)；以及
e、上述物质的任意组合。
16、如权利要求1所述的组合物，其中，所述锚分子是糖和寡糖，而所述单糖和寡糖是以下组中的一种或多种：
a、天然的，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、果糖、蔗糖；
b、天然的氨基糖，例如葡糖胺、半乳糖胺、N-乙酰基葡糖胺、N—乙酰基半乳糖胺、神经氨酸、唾液酸；
c、合成或非天然的糖和氨基糖，例如
i、糖的酯、糖—有机酸酯，和
ii、化学组合的糖和蛋白/多肽以及合成的糖蛋白。
17、如权利要求1所述的组合物，其中，所述锚分子是选自于以下组中的糖蛋白/蛋白聚糖：
a、天然的，如弹性蛋白、凝集素，
b、合成的，如经改性的天然糖蛋白/蛋白聚糖。
18、如权利要求1所述的组合物，其中，所述锚分子是选自于以下组中的糖脂：
a、天然的，如鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂；以及
b、合成的或经改性的天然甘醇；通过一些化学方法如酯化、酰胺化或类似化学方法得到的脂质。
19、如权利要求1所述的组合物，其中，所述锚分子是选自于乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、和高密度脂蛋白(HDL)组成的组中的脂蛋白。
20、如权利要求1所述的组合物，其中，所述锚分子是选自于以下组中的脂质：
a、非极性的天然或合成的脂质，如甘油三酯、胆固醇或其他的植物或动物甾醇；以及
b、极性的天然或合成的脂质，如磷脂(磷脂酰丝氨酸)。
21、如权利要求1所述的组合物，其中，所述锚分子是细胞片段和细胞外壳或者外细菌或动物细胞壁或膜的片段或部分，它们模拟活细菌或动物细胞，以便将酶固定在口腔内的表面上。
22、如权利要求1所述的组合物，其中，所述锚分子是选自于由共聚物如苯乙烯—丁二烯聚合物组成的组中的非生物聚合性物质。
23、如权利要求1所述的组合物，其中，所述酶是α-葡糖苷酶。
24、如权利要求1所述的组合物，其中，所述酶是葡聚糖酶。
25、如权利要求1所述的组合物，其中，所述锚分子是碱性多肽。
26、如权利要求25所述的组合物，其中，所述碱性多肽是Lys-Lys-Glu-Lys-Lys。
27、如权利要求1所述的组合物，其中，所述锚分子是酸性多肽。
28、如权利要求27所述的组合物，其中，所述酸性多肽是Glu-Glu-Lys-Glu-Glu。
29、如权利要求1所述的组合物，其中，所述底物包括胶束。
30、一种控制细菌集群的方法，其包括以下步骤：
形成包含酶和锚的锚—酶复合物，所述酶能够降解至少部分集群基质，而所述锚的一部分连接至所述酶上以产生所述复合物；和
根据所述锚连接在底物上的能力选择锚，由此增加酶—锚复合物在非常接近所述基质的地方的保留时间。
31、如权利要求30所述的方法，其中，是在口腔内控制细菌集群。
32、如权利要求31所述的方法，其中，所述集群基质是菌斑基质，而该菌斑基质包括多糖。
33、一种形成用于控制细菌菌落增殖作用的组合物的方法，该方法包括：
根据其降解发生细菌集群处的结构组分的能力来选择酶；
根据其连接至所选择酶的能力选择锚分子，使所述酶保持有效的酶活性以降解所述结构组分，而所选择的锚分子应进一步具有附着在接近细菌集群的底物上的能力；以及
将所述锚和酶连接在一起形成酶—锚复合物。
34、如权利要求33所述的方法，其是用于控制口腔中细菌菌落的增殖作用。
35、一种用于控制口腔中菌斑集群的方法，其中，将特异性降解菌斑的酶连接至锚上，所述锚选自于以下组中：细胞壁、细胞壁片段、细胞片段和细胞外壳。
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