DD249977A1

DD249977A1 - Verfahren zur qualitativen oder quantitativen bestimmung von str. b iii oder 1a str. b iii

Info

Publication number: DD249977A1
Application number: DD29114686A
Authority: DD
Inventors: Wolfgang Mueller; Herta-Lore Borkhardt; Giesela Schuster; Mathilde Herrmann; Hans Dauf; Gudrun Koch
Original assignee: Magdeburg Medizinische Akad
Priority date: 1986-06-10
Filing date: 1986-06-10
Publication date: 1987-09-23

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des typenspezifischen Antigens von Streptokokken der serologischen Gruppe B (Streptococcus agalactiae) Typ III. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur Bestimmung von Streptokokken der serologischen Gruppe B Typ III (weiterhin bezeichnet als Str. B III) und ihres loeslichen typenspezifischen Antigens (lA Str. B III) anzugeben, das sich durch hohe Spezifitaet, hohe Sensitivitaet, Reproduzierbarkeit sowie einer moeglichen Standardisierung auszeichnet. Die Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Str. B III und des lA Str. B III in biologischen Materialien zu schaffen, welches auf der Verwendung der monoklonalen Antikoerper MAM-E1 und MAM-E2 als neue Immunreagenzien beruht. Diese Antikoerper werden von den Hybridomen H-MAM-E1 und H-MAM-E2 sezerniert.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Str. Bill oder IA Str. Bill mittels zweier monoklonaler Antikörper, die spezifisch mit dem typenspezifischen Antigen von Streptokokken der serologischen Gruppe B Typ III reagieren. Das Auffinden von löslichem typenspezifischem Antigen des Typs III und der Str. Bill ist in der Diagnostik perinataler Infektionen bei Neugeborenen und Schwangeren von Nutzen. Das Verfahren ist weiterhin für den hochspezifischen Nachweis von kulturell angezüchteten Streptokokken in der mikrobiologischen Routinediagnostik vorteilhaft zu verwenden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die bisherigen Methoden der qualitativen und quantitativen Bestimmung von IA Str. Bill und Str. B.Ill sind durch die Verwendung von konventionellen Antiseren, die normalerweise durch Immunisierung mit Str. Bill induziert werden und durch aufwendige Absorptionen mit Streptokokken anderer Typen spezifisch gemacht werden, gekennzeichnet. Diese Absorption ist zeit-, material- und kostenaufwendig. Zudem unterscheiden sich Antiseren verschiedener Individuen einer Art durch die qualitative und quantitative Zusammensetzung ihrer Antikörperpopulation. Selbst die Antiseren eines Tieres unterscheiden sich

von Blutabnahme zu Blutabnahme deutlich, besonders hinsichtlich des Gehalts an Antikörpern bestimmter Affinität. Für die meisten Bestimmungsverfahren sind jedoch hauptsächlich die hochaffinen Antikörper erforderlich. Der Gehalt eines konventionellen Antiserums an hochaffinen Antikörpern schwankt von Charge zu Charge, was für die notwendige gleichmäßige Qualität von in der Diagnostik eingesetzten Verfahren nachteilig ist.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein hochempfindliches Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Str. BIN und IA Str. Bill in Körperflüssigkeiten und mikrobiologischem Untersuchungsmaterial anzugehen, welches durch eine hohe Sensitivität, hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit sowie niedrige Kosten gekennzeichnet ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung '

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch den Einsatz von zwei neuen immunologischen Reagenzien, die spezifische Erkennung von Str. Bill und des IA Str. Bill wesentlich zu verbessern.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die qualitative und quantitative Bestimmung des IA Str. B III und der Str. Bill unter Verwendung der monoklonalen Antikörper MAM-E1 und MAM-E2 erfolgt. Die spezifischen Eigenschaften der monoklonalen Antikörper MAM-E1 und MAM-E 2, insbesondere ihre Bindungseigenschaften für das Antigen, garantieren eine Bindung an Epitope des typenspezifischen Antigens der Str. BIN. Diese spezifische Bindung zwischen den monoklonalen Antikörpern MAM-E1 und MAM-E2 und dem typenspezifischen Antigen der Str. Bill ist die Grundlage für Nachweisreaktionen für Str. Bill und IA Str. Bill und für ihre Abtrennung aus Gemischen mit anderen Stoffen. Die Abtrennung und der anschließende Nachweis der Str. B III bzw. IA Str. Bill aus Stoffgemischen wie Körperflüssigkeiten des Menschen erfolgt dabei in der Weise, daß der monoklonale Antikörper MAM-E1 oder der monoklonal Antikörper MAM-E 2 an einen festen Träger adsorbiert oder kovalent angekoppelt wird. Als Träger für adsorptive Bindung eignen sich insbesondere Polystyren, Polyminylchlorid und für kovalente Bindung Nitrozellulosepapier. In einer bevorzugten Anwendungsform haben die Plastmaterialien Vertiefungen, wie sie z. B. Mikrotestplatten aufweisen. Durch Inkubation des so insolubilisierten MAM-E1 oder MAM-E2 mit der Körperflüssigkeit (z. B. Harn, Serum, Liquor) werden das in dieser enthaltene IA Str. Bill oder die Str. Bill spezifisch gebunden und durch nachfolgende Waschung von nicht spezifisch gebundenen Bestandteilen der jeweiligen Körperflüssigkeit befreit. Die Ankopplung an die Träger erfolgt durch an sich bekannte Verfahren z. B. durch kovalente Bindung mit Glutardialdehyd oder adsorptive Kopplung mit Karbonatpuffer pH9,6. Das über die monoklonalen Antikörper MAM-E1 oder MAM-E 2 gebundene IA Str. Bill oder die gebundenen Str. Bill werden durch eine nachfolgende Behandlung der sensibilisierten Träger mit einem isotopen- oder enzymmarkierten monoklonalen Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2 nachgewiesen.

Die qualitative und quantitative Bestimmung der Str. Bill in Körperflüssigkeiten oder mikrobiologischem Untersuchungsmaterial wird erfindungsgemäß auch dadurch gelöst, daß diese biologischen Materialien durch an sich bekannte Verfahren an feste Träger (z. B. Objektträger aus Glas oder Kunststoff) gebunden und die Str. Bill in ihnen durch eine nachfolgende Behandlung mit einem Fluorochrom-markierten Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2 nachgewiesen werden. Es ist aber auch möglich, die als Indikatorreagens für Str. Bill dienenden Antikörper MAM-E1 oder MAM-E 2 durch eine Komponente nachzuweisen, die mit den MAM-E1 oder MAM-E2 spezifisch reagiert und mit einem Marker wie z.B. einem Fluorochrom gekoppelt ist. Dazu eignen sich anti-Mausimmunglobulin-Antikörper, die mit an sich bekannten Methoden mit den bereits beschriebenen Markern direkt gekoppelt werden. Die Bestimmung des Gehalts an Str. Bill oder IA Str. Bill in Körperflüssigkeit ist besonders vorteilhaft, wenn die monoklonalen Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2 an Trägerpartikel durch an sich bekannte Verfahren gebunden und diese sensibilisierten Partikel mit den Körperflüssigkeiten gemischt werden. Bei den Trägerpartikeln kann es sich um geometrisch einheitliche Kügelchen aus Polystyren, Polyvinylchlorid oder Bentonit sowie Erythozyten handeln. Die qualitative Bestimmung der Str. Bill, angezüchtet über an sich bekannte Kulturverfahren aus mikrobiologischem Untersuchungsmaterial wird erfindungsgemäß auch dadurch erreicht, daß die Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2 an Mikrotestplatten oderTablettenblister aus Polystyren bzw. Polyvinylchlorid adsorptiv gebunden und anschließend mit der zu typisierenden Streptokokkensuspension inkubiert werden. Über die monoklonalen Antikörper MAM-E 1 oder MAM-E2 werden spezifisch Str. Bill gebunden, was als positiver Reaktionsausfall visuell sichtbar wird.

Die monoklonalen Antikörper MAM-E1 und MAM-E 2 werden von den im Institut für Medizinische Mikrobiologie der Medizinischen Akademie Magdeburg hergestellten Hybridomen H-MAM-E1 und H-MAM-E2 sezerniert und können in ausreichender Menge zu jeder Zeit hergestellt werden. Die Erfindung soll anschließend durch einige Anwendungsbeispiele näher erläutert werden.

Anwendungsbeispiele Beispiel 1

Bestimmung von Str. B III in Körperflüssigkeiten und mikrobiologischen Untersuchungsmaterialien unter Verwendung der monoklonalen Antikörper MAM-E1 oder MAM-E 2 mittels direkter Immunofluoreszenztechnik. Für diese Methode muß der monoklonale Antikörper nach an sich bekanntem Verfahren mit einem Fluorochrom, besonders geeignet ist Fluoreszeinisothiozyanat, markiert werden.

1. Aufbringen des Untersuchungsmaterials auf Objektträger und Fixierung durch Lufttrocknung.

2. Aufbringen des Fluoreszeinisothiozyanat-markierten Antikörpers in Gebrauchsverdünnung. Für die Herstellung der Gebrauchsverdünnung wird eine PBS (0,15 M NaCI, 0,01 M Phosphat, pH7,4) mit 0,1 %Tween 20 verwendet.

3. Inkubation für 10min bei 37°C in einer feuchten Kammer.

4. Abgießen und Waschen für 2 χ 5min in PBS.

5. Lufttrocknen, eindecken mit einer Lösung aus 9 Teilen Glyzerin p.a. und 1 Teil PBS. Mikroskopieren im Fluoreszenzmikroskop. Str. Bill zeigen eine intensive Fluoreszenz der Zellperipherie.

Beispiel 2

Bestimmung von Str. Bill in Körperflüssigkeiten und mikrobiologischen Untersuchungsmaterialien unter Verwendung der monoklonalen Antikörper MAM-E1 oder MAM-E 2 mittels der indirekten Immunfluoreszenztechnik.

2. Aufbringen des monoklonalen Antikörpers MAM-E1 oder MAM-E2 in Gebrauchsverdünnung. Die Gebrauchsverdünnung . wird mit PBS hergestellt.

3. Inkubation für 30 min in einer feuchten Kammer.

4. Abgießen und Waschen für 2 x 5min in PBS.

5. Aufbringen eines Anti-Mausglobulin, Fluoreszeinisothiozyanat — markiert von der Ziege oder einer anderen Tierspezies in der vom Hersteller empfohlenen Gebrauchslösung. t

6. wie Punkt 3. und 4. ^:

7. Lufttrocknen, eindecken mit einer Lösung aus9Teiien Glyzerin p.a. und 1 Teil PBS. Mikroskopieren im Fluoreszenzmikroskop. Str. B. Ill zeigen eine intensive Fluoreszenz der Zellperipherie. j

Es muß damit gerechnet werden, daß in dem Anti-Mausglobulin-Konjugat auch markierte Antikörper gegen die verschiedensten kokkenartigen Infektionserreger enthalten sind, die zu Fehlinterpretationen führen können. Darum muß ein Objektträger als Kontrolle mitgeführt werden, der nicht mit den monoklonalen Antikörpern, sondern nur mit der Konjgatgebrauchsverdünnung zu behandeln ist. Die Punkte 2., 3., 4. entfallen bei dieser Kontrolle.

Beispiel 3

Bestimmung von Str. Bill in mikrobiologischem Untersuchungsmaterial unter Verwendung der monoklonalen Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2 durch eine Festphasen-Agglutination.

1. Die zu untersuchenden Streptokokken werden kulturell angezüchtet und eine Suspension von 3x10 (hoch 8) Keimen/ml hergestellt. ·

2. Mikrotestplatten aus Plaste (Polystyren oder Polyvinylchlorid) mit Rundboden oder Tablettenblister aus Polyvinylchlorid mit rundem Boden werden mit dem monoklonalen Antikörpern MAM-E 1 oder MAM-E 2 beschichtet. Dazu werden die Vertiefungen mit einer Verdünnung der monoklonalen Antikörper (5—30g/ml) in Karbonatpuffer pH 9,6 gefüllt und für 12 h bei +44⁰C inkubiert.

3. Dreimaliges Waschen mit PBS

4. Zugabe von 1001 der Streptokokkensuspension

5. Inkubation für 2 h bei 37⁰C und 12h bei +4⁰C in einer feuchten Kammer

6. Ablesung des Reaktionsaüsfallsmit der-Lupe. Str. Bill führen zu einem gleichmäßigen hauchförmigen Niederschlag, Kokken anderer Typen- und Spezieszugehörigkeit bilden auf dem Grund der Vertiefungen einen Knopf.

Beispiel 4

Bestimmung von IA Str. Bill und Str. BIN in Körperflüssigkeiten durch den double sandwich Immunassay.

1. Mikrotestplatten aus Plaste (Polystyren oder Polyvinylchlorid) mit Flachboden werden mit den monoklonalen Antikörpern MAM-E1 oder MAM-E 2 beschichtet. Dazu werden die Vertiefungen mit einer Verdünnung der monoklonalen Antikörper (5-30 g/ml) in Karbonatpuffer pH 9,6 gefüllt und für 12 h bei +4 Grad C inkubiert.

2. Dreimaliges Waschen mit PBS mit einem Zusatz von 0,1% Tween 20.

3. Einbringen der Körperflüssigkeit (Liquor, Serum, Harn) nach Konzentrierung oder in Originalform in die Vertiefungen der Mikrotestplatte. Inkubation bei 37°C für 90min.

4. Wiederholung des Punktes 2.

5. Einbringen der zuvor durch eine Titration ermittelten Gebrauchsverdünnung des enzymmarkierten monoklonalen Antikörpers. Es ist darauf zu achten, daß nicht der gleiche Antikörper zur Beschichtung der Mikrotestplatte und als enzymmarkiertes Konjugat eingesetzt wird. Das bedeutet, wenn MAM-E1 zur Beschichtung verwendet wurde, ist MAM-E 2 als Konjugat einzusetzen oder umgekehrt. Inkubation bei 37°C für 90 min.

6. Wiederholung des Punktes 2.

7. Einfüllen der dem Markierungsenzym entsprechenden Substratlösung. Bei Meerrettichperoxydase vorzugsweise eine Mischung von H202 und O-Phenylendiamin. Inkubation 30min 22⁰C im Dunkeln.

8. Abstoppen der Reaktion durch Zusatz von 2 M H2So4 und Extinktionsmessung bei einer Wellenlänge von 492 nm in einem Vertikalfotometer. Feststellen des Gehalts an Str. Bill oder IA Str. Bill in der Körperflüssigkeit an Hand der Extinktionswerte der Testflüssigkeit im Vergleich zu einer Negativ-und Positivkontrolle.

Claims

1. Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Str. Bill oder IA Str. Bill, dadurch gekennzeichnet, daß als Nachweisreagenzien die monoklonalen Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2, die mit Determinanten des typenspezifischen Antigens von Str. B III reagieren, eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2 an Mikrotestplatten bzw. Tiefziehfolien aus Polystyren, Polyvenylchlorid o. dgl. absorbiert werden.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2an Latex aus Polystyren, Polyvenylchlorid, Bentonit oder Erythrozyten adsorbiert bzw. kovalent gebunden werden.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß durch direkte, kovalente oder adsorptive Ankopplung eines Markers, wie z.B. ein Radioisotop, ein organischer Farbstoff, ein Enzym oder ein Anti-Enzym-Antikörper, an die Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2, dieses Konjugat als Indikatorreagenz für Str. BIN und IA Str. Bill verwendet wird.

5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die als Indikatorreagenzien für Str. Bill und IA Str. Bill dienenden Antikörper MAM-E1 und MAM-E2 durch eine Komponente nachgewiesen werden, die mit diesen spezifischen reagiert und direkt mit einem Marker versehen ist oder einen solchen direkt oder indirekt binden kann.

6. Verfahren nach Punkt 1 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2 mit einem Fluorochrom z. B. Fluoreszeinisothiozyanat markiert und als Nachweisreagens für Str. B III in dem bekannten Verfahren des direkten Immunfluoreszenztests eingesetzt werden.

7. Verfahren nach Punkt 1 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß die Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2 als Indikatorreagenzien für Str. Bill in dem bekannten Verfahren des indirekten Immunfluoreszenztests eingesetzt werden. -—— — —

8. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Antikörper MAM-E1 oder MAM-E2 an Mikrotestplatten oder Tiefziehfolien gebunden und für die Identifizierung von Str. BMI in Suspensionen verwendet werden.

9. Verfahren nach Punkt 1, 2, 4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß die Antikörper MAM-E 1 oder MAM-E2 an Mikrotestplatten oder Tiefziehfolien gebunden, mit derzu testenden •Körperflüssigkeiten inkubiert, die nicht spezifisch gebundenen Antigene ausgewaschen und die Str. Bill oder das IA Str. Bill durch markierte Antikörper MAM-E1 bzw. MAM-E2 nachgewiesen werden.

10. Verfahren nach Punkt 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß mit Anitkörpern MAM-E1 oder ΜΑΜΕ 2 beladene Erythrozytensuspensionen bzw. Latex-Partikel mit Körperflüssigkeiten oder Streptokokensuspensionen gemischt werden, so daß es zur spezifischen Ausflockung kommt, wodurch die Str. Bill oder das IA, Str. Bill nachgewiesen werden.