DE69026295T2

DE69026295T2 - Pharmazeutische Zusammensetzung gegen durch Vasokonstriktion hervorgerufene Krankheiten

Info

Publication number: DE69026295T2
Application number: DE1990626295
Authority: DE
Inventors: Toshiyuki Edano; Mitsuteru Hirata; Shoichi Kondo; Tomoyuki Koshi; Akiyoshi Ohhira; Masao Ohkuchi; Tetsuro Okabe
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1989-01-26
Filing date: 1990-01-24
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2010-01-25
Also published as: CA2008122A1; EP0384144B1; DE69026295D1; EP0384144A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft eine neue pharmazeutische Zusammensetzung und insbesondere eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Anti-Endothelin-Antikörper als wirksame Komponente umfaßt und zur Heilung von Erkrankungen geeignet ist, die durch Gefäßverengung (Vasokonstriktion) hervorgerufen werden.

Beschreibung des Hintergrundes:

Bluthochdruck, coronare Arterienverengung, basilare Arterienkontraktur, Asthma und dergleichen sind Erkrankungen, die durch Gefäßverengung hervorgerufen werden. Noradrenalin, Adrenalin, Serotonin, Thrombin, Thromboxan As, Prostaglandin F2α, Neuropeptid, Oxyhämoglobin und dergleichen sind als Stoffe bekannt, die derartige Erkrankungen hervorrufen.
In den letzten Jahren wurden zwei Arten von Gefäßverengung untersucht, d.h. Gefäßverengung, die vom vaskulären Endothelium abhängig ist und Gefäßverengung, die vom vaskulären Endothelium unabhängig ist. Das Vorliegen von Vasokonstriktoren, die von den vorstehend genannten Stoffen verschieden sind, wurde für die vom vaskulären Endothelium abhängige, durch Anoxie hervorgerufene Gefäßverengung angenommen [Vanhoutte et al., Circ. Res. 51, 439-447 (1982)]. Dem folgend wurde das Vorliegen einer Peptid-ähnlichen gefäßverengenden Verbindung im Überstand von endothelialen Kulturzellen aus Rinderaorta bestätigt [Highsmith et al., Am. J. Physiol., 284, H432-437 (1985)]. Diese Verbindung erwies sich als Peptid mit 21 Aminosäuren. Außerdem wurde die Struktur dieser Verbindung ermittelt und ihre cDNA kloniert. Die Verbindung wurde Endothelin-1 genannt [Yanagisawa et al., Nature, 332, 411-415 (1988)]. Es gibt weitere Verbindungen mit ähnlichen gefäßverengenden Wirkungen wie Endothelin-1. Derartige Verbindungen schließen Endothelin-2, Endothelin-3 [Akihiro Inoue et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 2863 (1989)], VIC [gefäßaktiver intestinaler Kontraktor; Nario Ishihara et al., FEBS Letters, 247, 337 (1989)] und Sarafotoxine S6a1, S6a2, S6b und S6 (Chikahisa Takahashi et al., Toxicon, 26, 543 (1988)] ein. Sie werden Verbindungen der Endothelinfamilie genannt.
Diese Verbindungen zeigen verengende Wirkung der Glattmuskulatur, die stärker als die anderer bekannter Vasokonstriktoren ist, d.h. etwa 100 mal stärker als Angiotensin II. Es wurde gefunden, daß die Verbindungen allein durch endotheliale Zellen erzeugt werden und daß ihre Erzeugung an endothelialen Zellen im mRNA-Spiegel durch die Wirkung von Thrombin oder Adrenalin beschleunigt wurde. Ihr mRNA-Spiegel wurde auch in Kulturzellen als höher gefunden als in vaskulären endothelialen Zellen (Yanagisawa et al., Experimental Medicine, 6, 297-302 (1988)]. Die Verabreichung eines Endothelin an ein Tier erwies sich andererseits als Vasopressor beim Tier [Watanabe et al., 73. Kinki-Branch Meeting, Japan Association of Pharmacology, (1988)], senkte den Blutkreislauf und induzierte Ischämie [Ashino et al., 31. Meeting of Kidney Society of Japan (1988)]. Eine Literaturstelle berichtet, daß eine große Verabreichungsdosis Herzversagen induziert, die zum Tod des Betroffenen führen kann [Yanagisawa et al., Nature, 335, 303 (1988)].
Auf der Grundlage der vorstehenden Tatsachen ist es leicht ersichtlich, daß die Erzeugung eines Endothelins im Körper eines Lebewesens Erkrankungen, wie Bluthochdruck, coronare Arterienverengung, basilare Arterienverengung, Asthma und dergleichen, hervorruft.
Polyklonale Antikörper und monoklonale Antikörper mit einer spezifischen Affinität für Endothelin wurden in EP-A-0 331 100 und in EP-A-0 423 333, die Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ sind, beschrieben. Letztere Druckschrift offenbart, daß monoklonale Anti-Endothelin-Antikörper die Wirkung von Endothelin in vivo neutralisieren können, und erwähnt ihre mögliche Verwendung als Arzneimittel.
Es gibt jedoch keinen Arzneistoff, der eine spezifische Aktivität gegen Endotheline aufweist und somit zur Heilung von Erkrankungen, die durch Endotheline hervorgerufen werden, genutzt werden kann. Die Entwicklung eines derartigen Arzneistoffes ist äußerst wünschenswert.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung unternahmen ausgiebige Untersuchungen zur Entwicklung eines derartigen Arzneistoffes und fanden, daß Antikörper von Endothelinen zur Heilung von Erkrankungen, hervorgerufen durch Gefäßverengung, wirksam wären. Diese Erkenntnis führte zur Ausführung der vorliegenden Erfindung.

KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Folglich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die einen Anti-Endothelin-Antikörper als wirksame Komponente umfaßt und die zur Heilung von Erkrankungen, hervorgerufen durch Gefäßverengung, geeignet ist.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden nachstehend aus der nun folgenden Beschreibung leichter ersichtlich.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt die Änderungen im Blutdruck, in der Herzfrequenz, im Herzminutenvolumen und im gesamten peripheren Blutgefäßwiderstand über die Zeit bei Ratten, denen Endothelin-1 mit oder ohne anschließende Verabreichung eines Anti-Endothelin-1 polyklonalen Kaninchen IgG verabreicht wurde.
Figur 2 zeigt den Grad der Endothelin-1-Absorption durch den in Beispiel 1 präparierten Endothelin-1-Antikörper.
Figur 3 zeigt den Grad der Endothelin-1-Absorption durch den in Beispiel 2 präparierten monoklonalen Anti-Endothelin-1-Antikörper.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN

Anti-Endothelin-Antikörper, die als wirksame Komponente in erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden, können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper schließen murine monoklonale Antikörper, humane monoklonale Antikörper und durch Gentechnik erzeugte monoklonale Antikörper ein.
Polyklonale Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können durch übliche immunologische Verfahren hergestellt werden. Ein bevorzugtes Beispiel eines derartigen Verfahrens umfaßt die Kombination eines Endothelin-Antigens mit einem anderen Protein, Verabreichen des kombinierten Proteins an ein Tier, Sammeln des Serums aus dem immunisierten Tier und Isolieren eines Antikörpers mit einer Spezifität gegen Endotheline.
Endotheline, die die in dem Verfahren verwendeten Antigene darstellen, können beispielsweise durch Züchtung porciner endothelialer Zellen unter Serum-freien Bedingungen, gefolgt von Trennung und Reinigung des Zielantigens aus dem Überstand gewonnen werden. [Yanagisawa et al., Nature, 332, 411-415 (1988)]. Ein Peptid-Syntheseverfahren kann ebenfalls zur Herstellung derartiger Antigene verwendet werden [Yanagisawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 6964 (1988)].
Thyroglobulin, Rinderserumalbumin, Myoglobin oder dergleichen können als Protein zur Kombination mit einem Endothelin verwendet werden.
Ein Endothelin-Protein-Konjugat kann durch Kondensation sowohl durch die Bildung einer Peptidbindung als auch durch Kombination einer Aminogruppe des Endothelins und einer des Proteins durch eine Alkylendicarbonylgruppe, Alkandiylidengruppe, Phenylendithiocarbamoylgruppe oder dergleichen hergestellt werden.
Ein übliches Peptid-Syntheseverfahren kann zur Kondensation eines Endothelins und eines Proteins durch Herstellung einer Peptidbindung verwendet werden, beispielsweise Umsetzung des Endothelins und des Proteins in einem Lösungsmittel, vorzugsweise in einer Pufferlösung in Gegenwart eines Kondensationsmittels. Als Kondensationsmittel können 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid oder dergleichen verwendet werden.
Eine bevorzugte Gruppe, die eine Aminogruppe eines Endothelins und jene eines Proteins überbrückt, ist eine Alkylendicarbonyl-Gruppe oder eine Alkandiyliden-Gruppe mit 2-8 Kohlenstoffatomen, Phenylendithiocarbamoyl oder dergleichen. Die Kohlenstoffkette von Alkylendicarbonyl oder Alkandiyliden kann entweder linear oder verzweigt sein und kann ungesättigte Bindungen darin enthalten. Zur Überbrückungsumsetzung verwendete Mittel sind beispielsweise Bis(sulfosuccinimidyl)suberat, Disuccinimidylsuberat oder dergleichen für die Alkylendicarbonyl-Gruppe, Glutaraldehyd oder dergleichen für die Alkandiyliden-Gruppe und p-Phenylendiisothiocyanat oder dergleichen für die Phenylendithiocarbamoyl-Gruppe.
Reinigung des so hergestellten kombinierten Endothelin-Protein-Konjugats kann gemäß üblichen Verfahren ausgeführt werden. Eines der bevorzugten Verfahren ist die Dialyse des Produkts gegen eine physiologische Kochsalzlösung, die einen Phosphatpuffer enthalt. Es ist möglich, die angestrebte Immunquelle in Pulverform aus der dialysierten Lösung zu erhalten. Bevorzugter jedoch ist es, die dialysierte Lösung im folgenden Schritt so zu verwenden, wie sie anfällt.
Es gibt keine speziellen Beschränkungen hinsichtlich des Verfahrens, mit dem die vorstehend genannte Immunquelle dem Tier verabreicht wird, um es zu immunisieren. Ein beliebiges übliches Verfahren kann verwendet werden. Tiere, die zur Immunisierung verwendet werden können, sind beispielsweise Maus, Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziege und dergleichen. Die Immunquelle wird in einem kompletten Freundschen Adjuvans, nichtkompletten Freundschen Adjuvans, Alaun-Adjuvans oder dergleichen emulgiert und wird subcutan, intradermal oder intraperitoneal verabreicht. Es ist erwünscht, die Immunquelle in einem Intervall von 1-5 Wochen für einen Zeitraum von 1-20 Monaten zur Erzeugung des Antikörpers zu verabreichen. Exsanguination gemäß einem üblichen Verfahren wird ausgeführt, wenn der Antikörper-Titer ansteigt, gefolgt von Abtrennen des Serums unter Gewinnung des den Antikörper enthaltenden Anti-Serums.
Das Anti-Serum wird dann durch ein bekanntes Verfahren gereinigt. Aussalzen unter Verwendung eines Neutralsalzes, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder dergleichen; Alkoholfällung oder ein Fällungsverfahren unter Verwendung von Polyethylenglycol, einem Schwermetall oder dergleichen, Elektrophorese, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätssäulenchromatographie oder dergleichen wird unabhängig oder in Kombination zur Reinigung verwendet. Da erfindungsgemäße Anti-Endothelin-Antikörper jene sind, die zur IgG-Klasse gehören, ist die Verwendung eines Reinigungsverfahrens, das in der Lage ist, speziell derartige Antikörper abzutrennen, beispielsweise Gelfiltration, Affinitätssäulenchromatographie unter Verwendung von Protein A oder dergleichen, bevorzugt. Um speziell einen Antikörper gegen das Protein, das mit Endothelin kombiniert, zu eliminieren, wird die Verwendung von Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Trägers, an den das Protein kombiniert, bevorzugt.
Erfindungsgemäße monoklonale Antikörper können ebenfalls durch ein übliches Verfahren hergestellt werden. Ein typisches Verfahren umfaßt die Immunisierung einer Maus in gleicher Weise wie bei der Herstellung eines polyklonalen Antikörpers unter Verwendung derselben oder ähnlichen Immunquelle, Sammeln der Antikörper erzeugenden Zellen, Hybridisieren mit Mausmyelom, selektives Züchten des Hybridoms, Nachweis des Antikörper erzeugenden Hybridoms, Klonieren und Züchten des Hybridoms und Sammeln von monoklonalem Antikörper.
Geeignete humane monoklonale Antikörper, die verwendet werden können, sind jene, die durch ein Verfahren unter Verwendung von human-human Hybridom, ein Verfahren unter Verwendung von human-Maus Hetero-Hybridom, ein Verfahren unter Verwendung von human-Maus-human Tripel-Hybridom oder ein Verfahren unter Verwendung von hergestellten Zellen, die unter Verwendung des Epstein-Barr-Virus transformiert wurden.
Die erfindungsgemaße pharmazeutische Zusammensetzung kann sehr wirksam zur Heilung von Erkrankungen verwendet werden, die durch Gefäßverengung hervorgerufen wurden, wie Bluthochdruck, coronare Arterienverengung, basilare Arterienverengung und dergleichen. Endothelin-Antikörper, welche die wirksamen Komponenten der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung darstellen, weisen einen LD&sub5;&sub0;-Wert von 200 mg/kg oder mehr bei akuten Toxizitätstests auf, bei denen sie intravenös an Ratten verabreicht wurden, wodurch gezeigt wurde, daß sie sicher an Menschen verabreicht werden können.
Die zu verabreichende Dosis hängt von dem Patienten und dessen Symptomen ab. Im allgemeinen ist es erwünscht, die Zusammensetzung in einer Menge von 0,01-3000 mg pro Tag einmal oder 2-4 mal verteilt zu verabreichen. Eine bevorzugte Verabreichungsweise ist Injektion, obwohl direkte Verabreichung an das Rektum akzeptabel ist. Injektionszubereitungen werden durch Lösen des Antikörpers in Puffer und gegebenenfalls Zusatz eines Stabilisators eines löslich machenden Mittels und dergleichen hergestellt. Die Zubereitungen werden in Fläschchen gefüllt und intravenös, subcutan oder intramuskular injiziert. In Fläschchen gefüllte und gefriergetrocknete Antikörper können nach Auflösung in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung zur Injektion verwendet werden.
Andere Merkmale der Erfindung werden im Verlauf der nachstehenden Beschreibung der Versuchsbeispiele ersichtlich, die die Heilungswirkung durch die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung zeigen, und den Beispielen zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörpers, die zur Erläuterung der Erfindung angeführt sind und nicht vorgesehen sind, diese einzuschränken.

BEISPIELE

Versuchsbeispiel 1

Inhibierung von Endothelin-induzierter Verengung von isolierter Rattenaorta

Männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 200-300 g wurden decapitiert und die Thoraxaorta isoliert. Die Aorta wurde in Ringe mit etwa 3 mm Breite geschnitten. Ein Organbad, gefüllt mit 3 ml Krebs-Henseleit-Lösung, wurde mit einem Mischgas (95% O&sub2;, 5% CO&sub2;) belüftet und bei 37ºC gehalten. Die Aortasegmente wurden zwischen Haken angeordnet, wobei die Ruhespannung auf 2 g eingestellt wurde und für 1 Stunde ins Gleichgewicht gebracht, gefolgt von maximaler Reaktion durch Kaliumchlorid (80 mM), bis eine stetige Antwort erhalten wurde. Mono- oder polyklonales Anti-Endothelin-1-Kaninchen- IgG wurden in Krebs-Henseleit-Lösung gelöst und dann zu dem Organbad gegeben. Nach 10 Minuten wurde in 10 mM Phosphatpuffer, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin, gelöstes Endothelin-1 oder -2 zu einer Endkonzentration von 10 ng/ml gegeben, wodurch Verengung der Aorta hervorgerufen wurde. Jede Verengungsreaktion wurde isometrisch gemessen und aufgezeichnet. Die durch Endothelin-1 oder Endothelin-2 hervorgerufene Verengung wurde 30 Minuten nach der Verabreichung gemessen und ihr Verengungsgrad wurde als Verhaltnis der maximalen Verengung in 80 mM Kaliumchlorid ermittelt. Die für 6 Versuche erhaltenen Ergebnisse aus jeder Behandlung sind als Mittelwerte in Tabelle 1 angegeben.
Aus den Ergebnissen kann geschlußfolgert werden, daß monoklonales oder polyklonales Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG wirksam und dosisabhängig Endothelin-1- und Endothelin-2-induzierte Verengung bei isolierter Rattenthoraxaorta inhibiert. TABELLE 1 Verengungsgrad (%) Behandlung Endothelin-1 Endothelin-2 unbehandelt polyklonales Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG µg/ml monoklonales Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG µg/ml

Versuchsbeispiel 2

Inhibierung von durch Endothelin-induzierter Verengung von isolierten Hundearterien

Männliche ausgewachsene Mongrelhunde mit einem Gewicht von 9-13 kg wurden mit Natriumpentobarbital anästhesiert (300 mg/kg, iv.). Ihre basilaren, coronaren und renalen Arterien wurden isoliert und in Ringe mit etwa 3 mm Breite geschnitten. Ein mit 3 ml Krebs-Henseleit-Lösung gefülltes Organbad wurde mit einem Mischgas (95% O&sub2;, 5% CO&sub2;) belüftet und bei 37ºC gehalten. Die Ringe wurden zwischen Haken angeordnet, die Ruhespannung wurde auf 2 g eingestellt und für eine Stunde ins Gleichgewicht gebracht, gefolgt von maximaler Reaktion durch Kaliumchlorid (80 mM), bis eine stetige Antwort erhalten wurde. Polyklonales Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG wurde in Krebs-Henseleit-Lösung gelöst und zu dem Organbad zu einer Endkonzentration von 100-300 µg/ml gegeben. Nach 10 Minuten wurde Endothelin-1 oder -2, gelöst in 10 mM Phosphatpuffer, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin, zu der Endkonzentration von 10 oder 30 ng/ml gegeben (sowohl für Endothelin-1 als auch Endothelin-2), wodurch somit die Arterien zur Verengung veranlaßt wurden. Jede Verengungsreaktion wurde isometrisch gemessen und aufgezeichnet. Die durch Endothelin-1 oder Endothelin-2 hervorgerufene Verengung wurde 30 Minuten nach Verabreichung gemessen und ihr Verengungsgrad wurde als Verhalmis der maximalen Verengung in 80 mM Kaliumchlorid ermittelt. Die für 4 Versuche erhaltenen Ergebnisse für jede Behandlung sind als Mittelwerte in Tabelle 2 angeführt. TABELLE 2 Verengungsgrad (%) Basilare Arterie Coronare Arterie Renale Arterie Behandlung Endothelin unbehandelt polyklonales Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG
Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß polyklonales Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG wirksam die durch Endothelin-1 und Endothelin-2 induzierte Verengung bei isolierten basilaren, coronaren und renalen Arterien vom Hund inhibiert.
Im nachstehenden Beispiel 2 präparierte monoklonale Anti-Endothelin-1-Antikörper inhibieren ebenfalls wirksam die Verengung von isolierten basilaren, coronaren und renalen Arterien vom Hund, induziert durch Endothelin-1 und Endothelin-2.

Versuchsbeispiel 3

Inhibierung von Endothelin-1-induzierten cardiovasculären Änderungen bei anästhesierten Ratten

Blutdruck, Herzgeschwindigkeit, Herzimnutenvolumen und gesamter peripherer vasculärer Widerstand bei männlichen Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 150-200 g, anästhesiert mit Urethan, wurden zur Ermittlung der Änderung dieser Parameter durch Verabreichung von polyklonalem Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG gemessen. Endothelin-1, gelöst in einem 10 mM Phosphatpuffer, enthaltend 0,1% kinderserumalbumin, wurde intravenös bei einer Dosis von 0,3 nM/kg injiziert. Polyklonales Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und intravenös bei einer Dosis von 16,5 mg/kg 5 Minuten vor Injektion von Endothelin-1 injiziert. Die Änderungen in den vorstehenden Parametern sind in Figur 1 dargestellt.
Der Blutdruck bei Gruppen, die nicht mit polyklonalem Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG behandelt wurden, sank zeitweilig, gefolgt von einem längeren Anstieg. Bei Gruppen, die mit polyklonalem Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG behandelt wurden, wurde andererseits eine deutliche Unterdrückung des Anstiegs des Blutdrucks beobachtet, obwohl der Blutdruck kontinuierlich nach zeitweiliger Abnahme anstieg. Die Herzfrequenz stieg bei Verabreichung von Endothelin-1 bei den Gruppen, die mit polyklonalem Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG behandelt wurden, an, jedoch war der Anstieg bei den mit Antikörper behandelten Gruppen abgeschwächt. Das Herzminutenvolumen bei beiden Gruppen zeigte eine Abnahme nach einem zeitweiligen Anstieg, obwohl die Antikörperverabreichung eine deutliche Unterdrückung beim Anstieg zeigte. Der gesamte periphere vaskuläre Widerstand bei Gruppen, die nicht mit Antikörper behandelt wurden, sank zeitweilig nach Verabreichung und stieg dann durch Verabreichung von Endothelin-1 kontinuierlich an. Der Anstieg wurde jedoch bei den mit Antikörper behandelten Gruppen signifikant unterdrückt.
Polyklonales Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG zeigte die gleichen Wirkungen gegen Endothelin-2. Monoklonale Anti-Endothelin-1-Antikörper, hergestellt in nachstehendem Beispiel 2, zeigten ebenfalls die gleichen Wirkungen wie polyklonales Anti-Endothelin-1-Kaninchen-IgG.

Bezugsbeispiel 1

In 4,4 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers (pH 7,4) wurden 1,1 mg (440 nM) Human-Endothelin und 4,4 mg (6,67 nM) Thyroglobulin gelöst. 110 mg 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid wurden zu der Lösung gegeben und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,4), der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, bei 4ºC für 2 Tage dialysiert unter Gewinnung von 8,5 ml Phosphatpuffer, der Endothelin-1-Thyroglobulin-Konjugat (0,52 mg Protein/ml) enthielt.
Die Lösung wurde gefroren und gelagert. Die erforderliche Menge an gefrorenem Material wurde zur Verwendung von Zeit zu Zeit herausgenommen und aufgetaut.

Bezugsbeispiel 2

In 440 µl eines 0,05 M Phosphatpuffers (pH 7,4) wurden 110 µg (44 nM) Endothelin-1 und 440 µg (6,67 nM) Rinderserumalbumin gelöst. 11 mg 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid wurden zu der Lösung gegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gegen einen 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,4), enthaltend 0, 15M Natriumchlorid, bei 4ºC für 2 Tage dialysiert unter Gewinnung von 0,9 ml Phosphatpuffer, der Endothelin-1-Rinderserumalbumin-Konjugat enthielt (0,49 mg Protein/ml).

Bezugsbeispiel 3

In 500 µl eines 0,05M Phosphatpuffers (pH 7,4) wurden 100 µg (40 nM) Endothelin-1 und 500 µg (7,58 nM) Rinderserumalbumin gelöst. 80 µl einer 1%igen wässerigen Glutaraldehydlösung wurden zu der Lösung gegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 23 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gegen einen 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,42), der 0,15M Natriumchlorid enthielt, bei 4ºC für 2 Tage dialysiert unter Gewinnung von 1 ml eines Phosphatpuffers, der Endothelin-1-Rinderserumalbumin-Konjugat, vernetzt mit einer 1,5-Pentandiyliden-Gruppe (0,5 mg Protein/ml), enthielt.

Bezugsbeispiel 4

In 500 µl eines 0,05M Phosphatpuffers (pH 7,4) wurden 100 µg (40 nM) Endothelin-1 und 500 µg (7,58 nM) Rinderserumalbumin gelöst. Eine Lösung von 456 µg Dimethylformamid in 80 µl Bis(sulfosuccinimidyl)suberat wurde zu der Lösung gegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur für 23 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gegen einen 0,01M Phosphatpuffer, der 0,15M Natriumchlorid enthielt, bei 4ºC für 5 Tage dialysiert unter Gewinnung von 1,4 ml eines Phosphatpuffers, der eine Endothelin-1-Rinderserumalbumin-Kombination, vernetzt mit einem 1,6-Hexamethylendicarbonylgruppen-Konjugat (0,36 mg Protein/ml) enthielt.

Bezugsbeispiel 5

In 100 µl einer 50%igen wässerigen N-Methylmorpholinlösung (eingestellt auf pH 9,5 mit Trifluoressigsäure) wurden 100 µg (40 nM) Endothelin-1 gelöst. Zu der so zubereiteten Lösung wurden 2,2 mg (11,4 µM) p-Phenylendiisothiocyanat in 200 µl Dimethylformamid gelöst und das Gemisch bei Raumtemperatur für 6 Stunden gerührt. Nach Zugabe von Ethanol und Ether wurde das Gemisch zentrifugiert. Ether wurde zu dem Rückstand gegeben und die Suspension wurde zentrifugiert. Der Niederschlag wurde dreimal mit Ether gewaschen, getrocknet und in einer Mischlösung von 50 µl N-Methyimorpholin-Trifluoressigsäure und 50 µl Dimethylformanid gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von 500 µg (7,58 nM) Rinderserumalbumin in 100 µl N-Methylmorpholin-Trifluoressigsäure gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht und unter Stickstoffatmosphäre gerührt, anschließend eine weitere Zugabe von 100 µl Dimethylformamid vorgenommen und für weitere 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde gegen 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,5), der 0,15M Natriumchlorid enthielt, für 4 Tage dialysiert unter Bereitstellung von 1,1 ml Phosphatpuffer, der durch p-Phenylendithiocarbamoyl-Gruppen vernetztes Endothelin-1-Rinderserumalbumin-Konjugat enthielt.

Beispiel 1

Zu dem Endothelin-1-Thyroglobulin-Konjugat enthaltenden Phosphatpuffer (pH 7,2), hergestellt in Bezugsbeispiel 1, wurde dieselbe Menge komplettes Freundsches Adjuvans unter Herstellung einer homogenen Emulsion gegeben. Die Emulsion wurde subeutan in die Fußsohle von 3 Kaninchen bei einer Dosis von 500 µg/kaninchen als Protein zur Immunisierung der Tiere injiziert. Nach anfanglicher Immunisierung wurde das im unvollständigen Freundschen Adjuvans emulgierte Antigen injiziert und in ähnlicher Weise die Kaninchen in zweiwöchigen Intervallen aufgefrischt. Nach Immunisierung wurde Blut aus der Ohrvene in einwöchigen Intervallen gesammelt. Elf Wochen, nachdem der Antikörper-Titer angestiegen war, wurde Exsanguination durch die carotische Arterie unter Bereitstellung von Anti-Serum ausgeftihrt. 30 ml gesättigte wässerige Ammoniumsulfatlösung wurden zu 30 ml Anti-Serum gegeben und das Gemisch bei 4ºC für 2 Stunden belassen und bei 7500 U/min für 10 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 10 mM Phosphatpuffer-physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,4) (forthin PBS genannt) gelöst und gegen PBS für 2 Tage dialysiert. Nach der Dialyse wurde PBS zu dem Dialysat zur Einstellung des Gesamtvolumens auf 45 ml gegeben. Diese Lösung wurde Affinitatschromatographie an einer Thyroglobulin-Celluofine- Säule (30 ml) unterzogen somit unter Bereitstellung von 60 ml einer Fraktion, die, ohne adsorbiert zu werden, durch die Säule lief. Diese Fraktion wurde Protein A-Celluofine-Affinitätssäulenchromatographie (30 ml) unterzogen. Die Säule wurde mit 30 ml einer 0,1M Glycin-HCl-Puffer-Lösung (pH 2,7), die 0,2M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Nach Neutralisation mit 1M Tris-Puffer wurde das Elutionsmittel gegen desionisiertes Wasser für 2 Tage dialysiert und unter Herstellung von 210 mg eines Antikörpers (IgG) mit Spezifität für Endothelin-1 als weißes Pulver lyophilisiert.
Dieses IgG hatte bei einer Konzentration von 7 mg/ml einen durch ELISA-Verfahren bestimmten Antikörper-Titer von 1:89200. Es absorbierte 80% von 10 ng/ml Endothelin-1 bei einer Konzentration von 700 µg/ml, wie in Figur 2 dargestellt.

Beispiel 2

Zu Endothelin-1-Thyroglobulin-Konjugat, hergestellt in Bezugsbeispiel 1, enthaltendem Phosphatpuffer (pH 7,2) wurde dieselbe Menge komplettes Freundsches Adjuvans unter Herstellung einer homogenen Emulsion gegeben. Die Emulsion wurde subcutan an 3 BALB/c-Mäuse bei einer Dosis von 50 µg/je Maus als Protein zur Immunisierung der Tiere gegeben. Zwei Wochen nach anfanglicher Immunisierung wurde das Antigen mit unvollständigem Freundschem Adjuvans emulgiert und den Mäusen mit einer Dosis von 50 µg/je Maus als Protein zu ihrer Immunisierung injiziert. Vier Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde Phosphatpuffer (pH 7,2) mit dem Antigen intraperitoneal den Mäusen bei einer Dosis von 50µg je Maus als Protein injiziert. Drei Tage nach dieser Injektion wurden Antikörper-Titer über das ELISA-Verfahren gemessen. Vier Tage nach der Messung des Titers wurden Milzzellen der Maus, die den höchsten Titer (1:347800) aufwiesen, isoliert. Die Milzzellen und die Mausmyelomzellen P3x63Ag 8U.1 wurden unter Verwendung von Ethylenglycol 1500 fusioniert. Anschließend wurde der Titer für Endothelin-1 des Hybridoms, ausgewählt über HAT-Medium, gemessen und Kolonien mit einem höheren Antikörper-Titer wurden kloniert. Ein Hybridom BT-H51 erzeugender monoklonaler Antikörper mit Spezifität für Endothelin-1 wurde somit hergestellt. Das Hybridom war ein neuer Stamm, der in der Lage ist, monoklonalen Antikörper mit Spezifität für Endothelin-1 zu erzeugen, und wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Hinterlegungsnummer 2596, FERM BP-2596) hinterlegt.
Das Hybridom wurde gezüchtet und intraperitoneal BALB/C-Mäusen geimpft, die 3 Wochen vorher eine intraperitoneale Pristan-Injektion erhalten hatten. Nach 10-12 Tagen wurde die aszitische Flüssigkeit der Maus gesammelt. Zu aliquoten 10 ml Mengen der aszitischen Flüssigkeit wurde die äquivalente Menge gesättigter Ammoniumsulfaflösung gegeben und das Gemisch bei 4ºC für 2 Stunden belassen und bei 7500 U/min für 10 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 15 ml PBS gelöst und gegen PBS für 2 Tage dialysiert. Nach der Dialyse wurde PBS zugegeben und das Dialysat auf ein Gesamtvolumen von 15 ml eingestellt. Diese Lösung wurde Protein G-Celluofine Affinitätssäulenchromatographie (10 ml) unterzogen. Die Säule wurde mit 0,1M Glycin-HCl-Puffer (pH 2,7), enthaltend 0,2M Natriumchlorid, eluiert. Nach Neutralisation mit 1M Tris-Puffer wurde das Elutionsmittel lyophilisiert unter Bereitstellung von 80 mg eines monoklonalen Anti-Endothelin-1-Antikörpers als weißes Pulver.
Dieses IgG hatte bei 7 mg/ml Konzentration einen durch ELISA-Verfahren bestimmten Antikörper-Titer von 1:102400. Er absorbierte 80% von 10 ng/ml Endothelin-1 bei einer Konzentration von 2,2 µg/ml, wie in Figur 3 dargestellt.
Der so hergestellte monoklonale Anti-Endothelin-1-Antikörper hatte nachstehende Eigenschaften, wobei das Molekulargewicht durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gemessen wurde. Der isoelektrische Punkt wurde unter Verwendung einer Pharmacia-LKB-Elektrophoreseausrüstung ermittelt und die Immunoglobulin-Unterklasse wurde durch das Immunodiffusionsverfahren nach Ouchterlony bestimmt.
(a) Molekulargewicht: 155000 ± 5000
(b) IgG Unterklasse: IgG&sub1;
(c) isoelektrischer Punkt: PI 6,6-7,2
(d) erkennt einen Schleifenbereich (1-15) von Endothelin-1 und die S-S-Bindungskonfiguration.
Zahlreiche Modifizierungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind natürlich angesichts vorstehender Lehren möglich.

Claims

1. Arzneimittel zur Heilung von Erkrankungen, die durch Gefäßverengung hervorgerufen werden, umfassend einen Anti-Endothelin-Antikörper als eine wirksame Komponente.