DE3851645T2

DE3851645T2 - DNS, die ein Koagulationshemmendes Polypeptid codiert.

Info

Publication number: DE3851645T2
Application number: DE3851645T
Authority: DE
Inventors: Akio Iwasaki; Yushi Saino; Makoto Suda
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1987-02-20
Filing date: 1988-02-19
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2008-02-20
Also published as: ES2064324T3; EP0279459B1; CA1339992C; EP0279459A3; JPS6420095A; US5591633A; KR880009991A; JP2660514B2; DE3851645D1; EP0279459A2; KR960013386B1

Description

Hintergrund der Erfindung:

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine DNA (DNS), die für ein Polypeptid codiert, das gerinnungshemmende Aktivitäten aufweist, wie ein aus menschlichem Gewebe verfügbarer plazentaler Koagulationsinhibitor (forthin "PCI" genannt), der von menschlicher Plazenta abgeleitet ist, ein rekombinantes Plasmid, das die DNA enthält, eine Transformante, die das rekombinante Plasmid enthält und ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Heparin, Heparincofactor-II, Antithrombin-II, α&sub2;- Macroglobulin, α&sub1;-Trypsininhibitor, C&sub1;-Esteraseinhibitor, Protein C u. dgl. sind als gerinnungshemmende Mittel bekannt. Heparin jedoch fand lediglich praktische Verwendung. Heparin hat jedoch Nebenwirkungen, indem es Blutungsneigung induziert. Außerordentliche Einschränkungen werden daher seiner Verabreichungsart und seiner Dosierung auferlegt. Heparin kann folglich vom Standpunkt der Sicherheit als nicht zufriedenstellendes gerinnungshemmendes Mittel angesehen werden.
Unter den vorstehend genannten Umständen waren die Autoren der vorliegenden Anmeldung bereits erfolgreich bei der Abtrennung und Reinigung von PCI aus menschlicher Plazenta und reichten auf diesen Gegenstand eine Anmeldung ein (Japanische Patentanmeldung Nr. 217512/1985).
PCI ist ein Stoff mit nachstehenden Eigenschaften und ist als Arzneimittel verwendbar.
(1) Molekulargewicht (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, reduzierter Zustand): 34000 ± 2000.
(2) Isoelektrischer Punkt (isoelektrische Säulenelektrophorese, unter Verwendung eines Ampholyten): 4,7 ± 0,1.

(3) Stabilität:

(a) Wird durch Wärmebehandlung bei 50ºC für 30 Minuten inaktiviert.
(b) Stabil in einem pH-Bereich von 4 - 10.
(c) Stabil in Plasma bei 37ºC für 30 Minuten.

(4) Wirkungen:

(a) Ist in der Lage, die Recalcifizierungszeit zu verlängern.
(b) Ist in der Lage, die Prothrombinzeit zu verlängern.
(c) Ist in der Lage, die aktivierte partiale Thromboplastinzeit zu verlängern.

(5) Analyse der Aminosäuren:

Durch Aminosäureanalyse wurden Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, 1/2 Cystin, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Lysin und Arginin festgestellt.
Die Autoren der vorliegenden Anmeldung stellten auch einen monoklonalen Antikörper, der für PCI spezifisch ist, her und reichten bereits eine Patentanmeldung dafür ein (Japanische Patentanmeldung Nr. 269588/1986). Durch Verwendung dieses monoklonalen Antikörpers wird die Durchführung hochempfindlicher Bestimmungen, Reinigung, usw., durchführbar.
Es entstanden jedoch verschiedene Probleme, da zur Gewinnung von PCI Gewebe von menschlicher Plazenta derzeit als Ausgangsstoff unabdingbar ist. Beispielsweise gibt es eine Einschränkung, die durch die im menschlichen Gewebe verfügbare Menge an PCI auferlegt wird. Schwierigkeiten sind mit der Sammlung von menschlichem Gewebe als Ausgangsstoff immer verbunden, wodurch eine stabile Zuführung des Ausgangsmaterials schwierig wird. Darüberhinaus ist die potentielle Gefahr pathogener Viren, die in menschlichen Geweben enthalten sein können, nicht zu ignorieren.
Es war daher wünschenswert, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem PCI zu einem geringeren Preis, in einem größeren Ausmaß stabiler und sicherer bereitgestellt wird, oder einen Stoff zu entwickeln, der Wirkungen ähnlich wie PCI aufweist.
Ein gerinnungshemmendes Polypeptid mit der in Figur 2 der vorliegenden Anmeldung dargestellten Aminosäure, jedoch ohne das N-endständige Methionin, wird in der EP-A- 0 293 567 offenbart. Dies ist ein Dokument, das unter Artikel 54 (3) EPC fällt und ist daher nicht relevant für Fragen der erfinderischen Tätigkeit.

Zusammenfassung der Erfindung:

Die Autoren der vorliegenden Erfindung führten Untersuchungen hinsichtlich der Lösung der Probleme aus. Im Ergebnis fanden sie, daß ein DNA-Fragment, das in der Lage ist, für das PCI-Peptid zu codieren, aus der menschlichen plazentalen cDNA-Genbank unter Verwendung des PCI-spezifischen Antikörpers als Sonde gewonnen werden kann und ebenfalls ein PCI-ähnliches Polypeptid durch Transformieren von Zellen eines Mikroorganismus mit einem rekombinanten Plasmid erzeugt werden können, bei denen das DNA-Fragment eingesetzt wurde und anschließend die resultierende Transformante zum Exprimieren des PCI-Gens veranlaßt wird, was zur Schaffung der vorliegenden Erfindung führte.
Die Erfindung stellt daher ein DNA-Fragment gemäß Anspruch 1 bereit; ein Plasmid mit einem solchen DNA-Fragment gemäß Anspruch 2 oder 3; eine Transformante, enthaltend ein derartiges Plasmid gemäß Anspruch 4 oder 5; und ein Verfahren zur Herstellung des entsprechenden Polypeptids gemäß Anspruch 6.
Da das mit der erfindungsgemäßen DNA erhältliche Polypeptid starke gerinnungshemmende Eigenschaften aufweist, ist ein gerinnungshemmendes Mittel, das dieses als Wirkstoff enthält, zur Verhinderung oder Behandlung verschiedener Erkrankungen, hervorgerufen durch Exasperation von coagulativen Aktivitäten, beispielsweise von Thrombosen, DIC (disseminierende intravaskuläre Koagulation) und ähnliches in Hirn, Herz und den peripheren Blutgefäßen, wie Hirnschlag und Herzinfarkt, verwendbar.
Außerdem hat das Polypeptid Eigenschaften, die ähnlich sind zu denen des plazentalen Gerinnungsinhibitors (PCI), der sich von menschlicher Plazenta ableitet. Es ist daher ein sicherer Stoff ohne Antigenität gegen den Menschen. Trotz der Tatsache, daß PCI als gerinnungshemmendes Mittel verwendbar ist, ist es mit dem Nachteil verbunden, daß es nicht im großen Ausmaß hergestellt werden kann aufgrund der schwierigen Verfügbarkeit von menschlicher Plazenta. Dagegen kann das Polypeptid in großem Ausmaß und kostengünstig hergestellt werden.
Die vorstehenden und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die nachstehende Beschreibung und die beigefügten Ansprüche zusammen mit den beigefügten Zeichnungen ersichtlich.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 ist eine Darstellung, die die Restriktionsendonucleasenkarte des rekombinanten Plasmids pMKT7 der Erfindung zeigt. Fig. 2 ist die schematische Darstellung der Nukleotidsequenz von PCI cDNA gemäß der Erfindung, bei der die Nukleotide nacheinander beziffert sind, mit A des Translationsstartcodons ATG markiert als Nr. 1. Fig. 3 ist eine Darstellung, die die Restriktionsenzymkarte des zur Expression des Polypeptids vorgesehenen Plasmids pMKTX1 zeigt. Fig. 4 zeigt schematisch die Western-Blot-Ergebnisse des Polypeptids nach dessen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (10% Gel), wobei Bahn 1 durch Elektrophorese des Zellextrakts von E. coli JM105/pMKTX1 gezüchtet in Gegenwart von IPTG erhalten wurde, Bahn 2 durch Elektrophorese des Zellextrakts von E. coli JM105/pMKTX1 gezüchtet ohne Zugabe von IPTG aufgezeichnet wurde, Bahn 3 aus der Elektrophorese des Zellextrakts E. coli JM105/ pKK233-2 gezüchtet in Gegenwart von zugegebenem IPTG resultiert, Bahn 4 durch Elektrophorese des Zellextrakts von E. coli JM105/pKK233-2 gezüchtet ohne Zugabe von IPTG erhalten wurde und Bahn 5 durch Elektrophorese von PCI gebildet wurde. Fig. 5 ist eine Darstellung, die die Elution von E. coli Extrakt von der DEAE-Toyopearlsäule mit einem linearen NaCl-Gradienten in Beispiel 4 zeigt, wobei die schraffierten Fraktionen gesammelt wurden. Fig. 6 ist eine Darstellung, die die Elution des Peptids der Erfindung von der Antikörpersäule in Beispiel 4 zeigt, in der die schraffierten Fraktionen gesammelt wurden.

Beschreibung der Erfindung im einzelnen:

Die erfindungsgemäße DNA, die für das Polypeptid codiert, das rekombinante Plasmid und die Transformante können beispielsweise in folgender Weise hergestellt werden.
(1) Ein antikörperpositiver Klon wird aus der cDNA Genbank von menschlicher Plazenta unter Verwendung des PCI-spezifischen Antikörpers ausgesucht. (2) Die rekombinante DNA wird aus dem so isolierten antikörperpositiven Klon präpariert und die cDNA-Fragmente werden aus der rekombinanten Phagen-DNA durch Behandlung Letzterer mit einer Restriktionsendonuclease gespleißt und werden dann in einen Plasmidvektor eingesetzt. (3) Wirtszellen werden mit dem erhaltenen cDNA rekombinanten Plasmid transformiert, wodurch die erfindungsgemäßen Transformanten erhalten werden. Die so erhaltenen Transformanten der Erfindung werden gezüchtet, wodurch ein erfindungsgemäßes rekombinantes Plasmid, das das DNA-Fragment der Erfindung enthält, aus den so gezüchteten Zellen erhalten wird. Erfindungsgemäße DNA-Fragmente können dann durch Schneiden des so erhaltenen rekombinanten Plasmids mit einer geeigneten Restriktionsendonuclease gewonnen werden.
Die vorstehenden Schritte werden nun im einzelnen beschrieben.
(1) Absuchen in der menschlichen Plazenta cDNA Genbank nach dem antikörperpositiven Klon:
Die cDNA Genbank kann durch Präparieren von mRNA aus einer menschlichen Plazenta und anschließend Behandeln von mRNA mit einer reversen Transkriptase und einer geeigneten Vektor DNA hergestellt werden. Eine kommerzielle cDNA Genbank, beispielsweise die menschliche cDNA Genbank (λgtll), hergestellt von Clontech Laboratories, Inc., kann ebenfalls als Alternative verwendet werden.
Die unter Verwendung von λgtll als Vektor hergestellte cDNA Genbank kann Screening unter Verwendung eines bestimmten Antikörpers als Sonde gemäß einem von Young und Davis vorgeschlagenen Verfahren unterzogen werden [Huynh, T.V., Young R.A. und Davis, R.W. (1985) in: DNA Cloning: A Practical Approach, Bd. 1 (D.M. Glover, Herausg.), Seiten 49-78, IRL Press, Oxford], so daß ein zu dem einzelnen Antikörper spezifischer Klon isoliert werden kann.
Zur Verwendung als primäre Antikörper, die als Sonden geeignet sind, können PCI-spezifische Antikörper, beispielsweise anti-PCI Kaninchen polyklonale Antikörper, anti-PCI Maus polyklonale Antikörper und anti-PCI monoklonale Antikörper, genannt werden. Von diesen sind anti- PCI monoklonale Antikörper, insbesondere anti-PCI Maus monoklonale Antikörper, bevorzugt. Der Antikörper kann in Serum, aszitischer Flüssigkeit, Hybridomenkulturflüssigkeit, gereinigter Immunoglobulinformen, verwendet werden.
Der Nachweis von primärem Antikörper, konjugiert mit einem Antigen, kann durch Autoradiographie ausgeführt werden unter Verwendung von Protein A, markiert mit radioaktivem Jod (¹²&sup5;I) oder einem Anti-Immunoglobulin-Antikörper, markiert mit radioaktivem Jod (¹²&sup5;I), oder durch ein Enzymimmunoassay, bei dem ein Anti-Immunoglobulin-Antikörper, markiert mit einer Peroxidase oder einem Antiimmunoglobulin-Antikörper, markiert mit einer alkalischen Phosphatase, zur Anwendung kommt.
Übrigens kann der anti-PCI monoklonale Antikörper beispielsweise durch das Verfahren, beschrieben in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 269588/1986, die vorstehend angeführt wurde, hergestellt werden; d. h. eine Maus wird mit PCI, das nach seiner Extraktion aus menschlicher Plazenta gereinigt wurde, immunisiert. Milzzellen werden von der Maus gesammelt und dann Zellfusion mit Maus-Myelomzellen unterzogen. Die der Zellfusion ausgesetzten Zellen werden unter Verwendung eines HAT-selektiven Mediums gezüchtet, wodurch sich Hybridomen allein vermehren können. Unter Verwendung von PCI als Antigen wird die Kultur der so vervielfältigten Hybridomen anschließendem Screening durch Enzymimmunoassay unterzogen, wodurch Hybridomen erhalten werden, die in der Lage sind, einen zu PCI-spezifischen monoklonalen Antikörper zu erzeugen. Der monoklonale Antikörper wird aus einer Kultur erhalten, in der die so erhaltenen Hybridomen gezüchtet wurden oder aus der aszitischen Flüssigkeit einer Maus, die mit den Hybridomen beimpft wurde.

(2) Herstellung von PCI cDNA rekombinanten Plasmids:

Rekombinante λgtll-Phage DNA wird in einer gereinigten Form aus dem so isolierten antikörperpositiven Klon gemäß dem Verfahren, vorgeschlagen von Perbal [Bernard Perbal, PREPARATION OF λ PHAGE DNA in A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING, Seiten 175-184, für Wiley-Interscience Publication (1984), New York, U.S.A.] gewonnen. cDNA kann aus der Vektor-DNA durch Aufschluß der so erhaltenen rekombinanten λgtll-Phagen-DNA mit einer Restriktions-Endonuclease EcoRI abgetrennt werden. Die erhaltene cDNA wird mit verschiedenen klonierenden Plasmidvektoren wieder zusammengesetzt, die durch Aufschluß mit EcoRI erhalten wurden, wodurch rekombinante Plasmide hergestellt werden. Als übliche Plasmidvektoren können beispielsweise pBR322, pBR325, pUC18, pUC118, pTZ18R u. dgl. angeführt werden.

(3) Transformation von Wirtszellen mit dem PCI cDNA rekombinanten Plasmid sowie Herstellung des rekombinanten Plasmids der Erfindung und DNA der Erfindung:

Das erhaltene PCI cDNA rekombinante Plasmid wird in verschiedene Wirtszellen eingeführt, die in der Lage sind, den Genmarker, der das rekombinante Plasmid aufweist, zu einem maximalen Ausmaß zu verwenden, wodurch die Wirtszellen transformiert werden. Als Wirtszellen ist E. coli bevorzugt. Verschiedene Varianten von E. coli K12- Stamm, beispielsweise HB101, C600K, JM101, JM105, χ1776, MV1304 u. dgl. können verwendet werden. Das Verfahren der kompetenten Zelle, das auf einer Calciumbehandlung oder einem ähnlichen Verfahren beruht, kann zur Einführung des rekombinanten Plasmids verwendet werden.
Die Transformante wird dann in einem selektiven Medium gezüchtet, das für den Genmarker des Vektorplasmids geeignet ist und das erfindungsgemäße rekombinante Plasmid wird aus den Zellen gewonnen.
Wenn pUC118 oder pTZ18R als Vektor verwendet wird, kann eine einsträngige DNA durch Infektion der resultierenden Transformanten von E. coli, die den rekombinanten Vektor enthält, mit einem Helferphagen M13K07, hergestellt werden. Die DNA-Basensequenz der erhaltenen einsträngigen DNA kann durch das Didesoxynucleotidketten-Terminationsverfahren [Sanger, F., Nicklen, S. und Coulson, A.R.: DNA Sequencing mit Chain Terminating Inhibitors, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)] bestimmt werden.
Die vorstehende Nucleotidsequenz, die Nucleotidsequenz des Teils, das für das Polypeptid codiert, einem der vorgesehenen Stoffe der vorliegenden Erfindung, kann beispielsweise wie nachstehend wiedergegeben werden:
Das DNA-Fragment der Erfindung ist nicht notwendigerweise auf die vorstehend ausgewiesene Nucleotidsequenz begrenzt, solange es in der Lage ist, die Aminosäuresequenz, die vorstehend beschrieben wird, zu codieren. Das erfindungsgemäße rekombinante Plasmid kann von Ligierung mit einer anderen Vektor-DNA, abgeleitet von E. coli, B. subtilis, Hefe, o. dgl., resultieren, vorausgesetzt, daß das rekombinante Plasmid der Erfindung eine Nucleotidsequenz aufweist, die in der Lage ist, die vorstehend beschriebene Aminosäuresequenz zu codieren und daß sie replizierend ist.
Das Polypeptid gemäß dieser DNA kann durch Züchten einer Transformante, die das erfindungsgemäße rekombinante Plasmid enthält, und Gewinnen des Polypeptids aus der sich ergebenden Kultur, erzeugt werden. Zur wirksamen Erzeugung des Polypeptids ist es jedoch erforderlich, ein Plasmid zur Expression von PCI cDNA zu konstruieren, das die nachstehenden Bereiche (1) bis (6) enthält, in der Reihenfolge der Transkriptionsrichtung stromabwärts:
(1) ein Promotor,
(2) eine Ribosombindungsstelle,
(3) ein Startcodon,
(4) eine DNA mit einer Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, für eine Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids zu codieren, ein Stoppcodon und
(6) einen Transkriptionsterminator, um anschließend die Wirtszellen mit dem Plasmidklonierungsvektor zu transformieren.
Als Vektorwirt zur Gewinnung eines derartigen Plasmids zur Expression von PCI cDNA ist ein einzelliger Mikroorganismus, wie Bakterien, insbesondere E. coli, B. subtilis oder Streptomyces, bevorzugt. Wenn E. coli als Wirt ausgewählt ist, können verschiedene Varianten des K12-Stamms von E. coli, beispielsweise HB101, C600K, JM101, JM105, JM109, χ1776, MV1304, u. dgl., verwendet werden.
Als Vektor verwendete DNA kann vorzugsweise ein Plasmid sein. Wenn E. coli beispielsweise als Wirt verwendet wird, hat Plasmid-DNA eine DNA-Sequenz, die erforderlich ist für die Vermehrung des Plasmids von Zellen von E. coli, beispielsweise die DNA-Sequenz des Startbereiches zur Replikation von ColEl-Plasmid und auch eine weitere DNA-Sequenz aufweist, die in der Lage ist, als Promotor zu dienen und als Transkriptionsterminator. Es ist bevorzugter, daß die Plasmid-DNA ein Gen enthält, das in der Lage ist, als selektiver Marker in einer Transformante von E. coli zu wirken. Erläuternde Beispiele des Promotors können Promotoren, wie λPL, lac, trp, tac, trc und lpp einschließen. Als beispielhafter Transkriptionsterminator kann rrnB ribosomaler RNA-Transkriptionsterminator o. dgl. genannt werden. Als selektive Markergene können ampicillinresistente Gene, kanamycinresistente Gene, tetracyclinresistente Gene, chloramphenicolresistente Gene, usw., angeführt werden. Diese Gene können entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden.
Der Einbau einer DNA mit einer Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, für die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids zu codieren, nämlich das DNA- Fragment der Erfindung, in die vorstehend beschriebene Vektor-DNA, kann durch Schneiden der DNA mit einer geeigneten Restriktionsendonuclease und anschließend Addieren eines geeigneten Linkers, falls erforderlich, Binden des erhaltenen DNA-Fragments mit einer Vektor-DNA, die mit einer geeigneten Restriktionsendonuclease geschnitten wurde, bewirkt werden. Im Fall einer DNA mit der Basensequenz von Fig. 2, können als Restriktionsendonucleasen beispielsweise Nco I und Sac I, Nco I und Sph I, Nco I und Hind III o. dgl. angeführt werden.
Einführung des erhaltenen Plasmids zur Expression von PCI cDNA in Wirtszellen durch das kompetente Zellen- Verfahren, Protoplastenverfahren, Calciumcopräzipitationsverfahren, elektrische Impulsverfahren. o. dgl., erlaubt die Erzeugung einer Transformante, die die Fähigkeit besitzt, das Polypeptid in wirksamer Weise zu erzeugen.
Das Polypeptid kann durch Züchten der erhaltenen Transformante und anschließend Extrahieren und Isolieren des Polypeptids aus den so gezüchteten Zellen und/oder der sich ergebenden Kultur erzeugt werden.
Nach Züchten der Transformante können verschiedene natürliche und synthetische Züchtungsmedien angewendet werden. Das Medium kann wünschenswerterweise eine Kohlenstoffquelle enthalten, wie Zucker, Alkohol oder organische Säuresalze; Stickstoffquellen, die ein Proteingemisch, Aminosäuren oder Ammoniumsalz und anorganische Salze enthalten. Es ist ebenfalls erwünscht, Vitamine und ein Antibiotikum entsprechend dem gemeinsamen Selektions-Markergen zu verwenden. Wenn das Plasmid die Steuerung der Expression erlaubt, ist es notwendig, im Verlauf der Züchtung ein Verfahren auszuführen, bei dem die Expression induziert wird. Nach dem Züchten wird Zentrifugieren ausgeführt, um die erhaltene Kulturbrühe in Kultur und Kulturzellen zu trennen. Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid in den gezüchteten Zellen akkumuliert ist, wird es erforderlich, die Zellen auf zubrechen durch Gefrier-Auftauen, Ultrabeschallen, Frenchpressen, Enzymbehandlung, Homogenisieren, o. dgl. und anschließend das Polypeptid der Erfindung beispielsweise mit EDTA, Tensid, Harnstoff, Guanidinhydrochlorid, o. dgl., zu solubilisieren.
Die erhaltene Kultur oder der erhaltene Kulturzellextrakt, die/der das Polypeptid enthält, wird Chromatographie an einer oder verschiedenen Säulen unterzogen, so daß das Polypeptid in gereinigter Form erhalten werden kann. Als Säulen-Chromatographie kann Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie und Gel-Chromatographie einzeln oder in Kombination angewendet werden.
Das so erhaltene Polypeptid hat die nachstehenden Eigenschaften.

(1) Aminosäuresequenz:

Unter Verwendung eines "JEOL JAS-570K Sequence Analyzer" (Warenzeichen; hergestellt von JEOL Ltd.) wurde die Aminosäuresequenz an einem N-terminalen Bereich durch Umwandeln des N-terminalen Bereiches in PTH Aminosäuren analysiert. Im Ergebnis wurde die Sequenz von 10 Aminosäuren vom N-terminalen Ende des Polypeptids der Erfindung wie nachstehend bestimmt:
Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp
Im Ergebnis kann die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids wie nachstehend aus der Basensequenz des DNA-Fragments der Erfindung bestimmt werden:

(2) Molekulargewicht:

35805, berechnet aus der Aminosäuresequenz.
34000 ± 1000 (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, reduzierter Zustand).

(3) Isoelektrischer Punkt (isoelektrische Elektrophorese, unter Verwendung eines Ampholyten):

5,0 ± 0,1.

(4) Stabilität:

Stabil in Plasma bei 37ºC für 30 Minuten.

(5) Wirkungen:

(a) Ist in der Lage, die Recalcifizierungszeit zu verlängern.
(b) Ist in der Lage, die Prothrombinzeit zu verlängern.
(c) Ist in der Lage, die aktivierte partiale Thromboplastinzeit zu verlängern.
Wie vorstehend beschrieben wurde, weist das Polypeptid ausgezeichnete gerinnungshemmende Aktivitäten auf und ist folglich als ein gerinnungshemmendes Mittel verwendbar.
Als Dosierungsform bei der Verwendung des Polypeptids als Wirkstoff für ein gerinnungshemmendes Mittel kann die Injektion angeführt werden. Für die Injektion ist es bevorzugt, das Polypeptid zu lyophilisiertem Pulver zu verarbeiten, so daß es, wann immer es gebraucht wird, in destilliertem Wasser zur Injektion, physiologischer Kochsalzlösung, o. dgl., zur Verabreichung gelöst werden kann. Ein geeigneter Verabreichungsweg ist intravenös.
Obwohl die Dosierung des Polypeptids in Abhängigkeit von der Schwere der Erkrankung, dem Körpergewicht jedes Patienten, usw., abhängt, ist es im allgemeinen bevorzugt, 10 ug - 10 mg/kg · Tag zu verabreichen. Das Polypeptid ruft keine nennenswerte Abnormität hervor und ist sicher, solange es innerhalb der vorstehend angeführten Dosierbereiche verabreicht wird.
Nachdem die Erfindung im allgemeinen beschrieben wurde, wird besseres Verständnis durch Hinweis auf bestimmte ausgewiesene Beispiele ermöglicht, die hierin zum Zwecke der Erläuterung angegeben sind und nicht vorgesehen sind, einzuschränken, sofern nicht anders ausgewiesen.

Beispiele:

Die vorliegende Erfindung wird hierin mit Hinweis auf das nachstehende Bezugsbeispiel und die Beispiele beschrieben.

Bezugsbeispiel:

Herstellung von Anti-PCI monoklonalem Antikörper

(1) Reinigung des Antigens (PCI):

(a) Fünf menschliche Plazenta (etwa 2500 g) wurden zerkleinert und anschließend zur Entfernung von Membranen u. dgl. sorgfältig mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die so zerkleinerten Plazenta wurden in einem Waringmischer weiter zerkleinert und anschließend 2 Liter 50 mM Tris-Salzsäure-Puffer (pH 7,4) zugegeben, gefolgt von Feinzerkleinern im "Polytron". Das erhaltene Homogenisat wird dann Zentrifugentrennung bei 7000 U/min. für 15 Minuten unterzogen, unter Sammlung eines Sediments. Zwei Liter des 50 mM Tris-Salzsäure-Puffers (pH 7,4) wurden wiederum zu dem so gesammelten Sediment gegeben und das erhaltene Gemisch wurde im "Polytron" homogenisiert und anschließend bei 7000 U/min für 15 Minuten unter Gewinnung eines gewaschenen Sediments zentrifugiert. Das vorstehende Verfahren wurde einige Male wiederholt, bis die Blutbestandteile entfernt waren, unter Gewinnung von etwa 930 g eines letztlichen gewaschenen Sediments.
(b) Etwa 2 Liter eines 50 mM Tris-Salzsäure-Puffers (pH 7,4), enthaltend 50 mM EDTA, wurden zu 900 g des in dem vorstehenden Verfahren (a) erhaltenen Sediments gegeben, gefolgt von Homogenisierung in dem Waring-Mischer. Das erhaltene Homogenisat wurde über Nacht bei 4ºC bewegt, gefolgt von Zentrifugentrennung bei 7000 U/min. für 15 Minuten, unter Gewinnung von 2 Litern eines Extrakts.
(c) Festes Ammoniumsulfat wurde zu dem im vorstehenden Verfahren (b) erhaltenen Extrakt zu 35% seiner gesättigten Konzentration gegeben. Nach Belassen des erhaltenen Gemisches bei 4ºC für 30 Minuten bis einige Stunden wurde es bei 7000 U/min. für 15 Minuten unter Sammeln eines Überstandes zentrifugiert. Ammoniumsulfat wurde zusätzlich zu dem Überstand zu 85% von dessen gesättigter Konzentration gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde bei 4ºC für 2 Stunden belassen, gefolgt von Zentrifugieren bei 7000 U/min. für 15 Minuten unter Sammeln eines Sediments. Das so erhaltene Sediment wurde in einer kleinen Menge eines 20 mM Tris-Salzsäure-Puffers gelöst und sorgfältig über Nacht bei 4ºC gegen denselben Puffer dialysiert. Während der Dialyse gebildete Niederschläge wurden durch Zentrifugieren bei 7000 U/min. für 15 Minuten entfernt unter Bereitstellung von 390 ml eines Dialysats.
(d) Das so erhaltene Dialysat wurde an DEAE-Toyopearl ( 5,5 · 19 cm) absorbiert, das mit 20 mM Tris-Salzsäure-Puffer (pH 7,4) ins Gleichgewicht gebracht wurde und sorgfältig mit demselben Puffer gewaschen wurde. Unter Verwendung von 4-Liter-Portionen desselben Puffers, deren Anteile 0-0,3 M Natriumchlorid enthielten, wurde Elution mit einer Geschwindigkeit von 20 ml pro Fraktion gemäß dem linearen Konzentrationsgradientenverfahren durchgeführt. Aktive Fraktionen wurden um eine Natriumchloridkonzentration von etwa 0,15 M herum eluiert, wodurch 380 ml von aktiven Fraktionen erhalten wurden.
(e) Die erhaltenen aktiven Fraktionen wurden dann sorgfältig über Nacht bei 4ºC gegen 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und das Dialysat wurde dann durch eine Säule ( 2,5 cm · 12 cm) "Blue Sepharose" geleitet, die vorher mit demselben Puffer ins Gleichgewicht gebracht wurde. Säulenausflußfraktionen (480 ml), die eine Absorption von A&sub2;&sub8;&sub0; zeigten, wurden gesammelt und dann durch ein "DIAFLOW Membrane Filter YM-10" konzentriert.
(f) Das in dem vorstehenden Verfahren (e) erhaltene Konzentrat wurde Gelfiltration unter Verwendung von "Sephadex G-100" ( 4,5 · 75 cm) unterzogen und mit einer Geschwindigkeit von 8 ml pro Fraktion mit physiologischer Kochsalzlösung eluiert.
Aktive Fraktionen Nr. 88-104 wurden gesammelt und durch Ultrafiltration unter Bereitstellung von 14,5 ml PCI konzentriert (Proteingewicht: 136,1 mg, Lowry-Verfahren).
Außerdem werden die Ausbeuten der in den betreffenden Reinigungsstufen erhaltenen Proteine nachstehend beschrieben:

Schritt Proteingewicht (mg)

Schritt (b) (EDTA-Extraktion) 7226
Schritt (c) (Ammoniumsulfat- Fraktionierung und Dialyse) 3184
Schritt (d) (DEAE-Toyopearl- Adsorption) 531
Schritt (e) (Blue Sepharose- Adsorption) 163
Schritt (f) (Sephadex G-100- Adsorption) 136

(2) Herstellung von immunisierten Milzzellen:

Das vorstehend gereinigte PCI (100 ug) wurde in Freund'schem vollständigem Adjuvans emulgiert und intravenös an BALB/c-Mäuse verabreicht.
PCI (50 ug/Verabreichung) und eine Adjuvansemulsion wurden anschließend zweimal in einem Intervall von 2 Wochen verabreicht und schließlich wurden 50 ug PCI einzeln verabreicht, um die Immunisierung zu vervollständigen.
Drei Tage später wurden die Mäuse geopfert. Nach Herausnahme der Milz und Zerkleinerung derselben wurde diese durch ein 100-mesh-Nylonnetz filtriert unter Gewinnung isolierter Milzzellen.

(3) Herstellung von Hybridomen:

Eine hypotonische Lösung (155 mM Ammoniumchlorid) wurde zu den so erhaltenen immunisierten Milzzellen gegeben, um roter Blutzellen-Hämolyse zu unterziehen. Die Zellen wurden dann dreimal mit Iscove-modifiziertem Dulbecco- Medium (IMDM) gewaschen. Andererseits wurden Mausmyelomzellen PAI ebenfalls dreimal mit IMDM gewaschen. Beide Zellen wurden gezählt. Die Milzzellen und die PAI-Zellen wurden in einem Verhältnis von 5 : 1 vereinigt, gefolgt von Zentrifugieren. Der Überstand wurde abdekantiert und nach Lockerung und Trennung des erhaltenen Zellsediments wurden sorgfältig 0,5 ml einer 45%-igen Lösung, erhalten durch Verdünnen von Polyethylenglycol (PEG) 4000, mit einem Kulturmedium unter Bewirkung von Fusion zugegeben. Nach Belassen des erhaltenen Gemisches bei 37ºC für 30 Sekunden wurde 1 ml IMDM vorsichtig innerhalb 1 Minute zugegeben. Anschließend wurden 10 ml IMDM innerhalb 5 Minuten zu einem Endvolumen von 40 ml in einem Zentrifugenröhrchen zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde bei 1000 U/min. zentrifugiert.
Das erhaltene Sediment wurde in IMDM suspendiert, dem 10% fötales Kalbsserum (FCS) zugegeben wurde. Die Suspension wurde erneut zentrifugiert und der erhaltene Überstand wurde abdekantiert.
Das so erhaltene Sediment wurde erneut in 10% FCS-versetztem IMDM suspendiert, worin 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4 · 10&supmin;&sup7; M Aminopterin und 1,6 x 10&supmin;&sup5; M Thymidin (HAT-) vor-her zugegeben wurden.
Die erhaltene Suspension wurde in 100-ul-Portionen in die einzelnen Vertiefungen einer 96-Vertiefungen Microtiterplatte gegeben. In jede Vertiefung wurden 50 ul des Mediums jeden dritten - vierten Tag gegeben. Der Aufwuchs der Zellen wurde beobachtet.
Es wurde bestätigt, daß Hybridomen lediglich aufgrund selektiver Wirkung von HAT wachsen konnten.

(4) Screening von antikörperausschüttenden Hybridomen:

Die Kultur in einer Vertiefung, in der Hybridomen gezüchtet wurden, wurde gesammelt und ein Test durch Enzymimmunassay wurde ausgeführt zur Ermittlung, ob PCI-antikörperausschüttende Hybridomen darin enthalten waren. Zunächst wurde PCI in einer Menge von 0,1 ug/100 ul/Vertiefung in jede Vertiefung einer 96-Vertiefungen Microtiterplatte gegeben ("Immunoplate I", Produkt der NUNC Company). Die Microtiterplatte wurde bei 25ºC für 18 Stunden belassen, so daß PCI absorbiert wurde. Anschließend wurde eine Kultur als Probe bei einem Anteil von 100 ul/Vertiefung zugegossen unter Umsetzung bei 25ºC für 2 Stunden. Nach dreimaligem Waschen der Kultur mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung, die 0,05% "Tween 20" (PBS-Tween) enthielt, wurde Meerrettich-Peroxidase, konjugiert an Ziege-Anti-Maus-IgG (Produkt der KPL Laboratories, Inc.) in einem Anteil von 100 ul/Vertiefung zugegeben und 2 Stunden später die Kultur dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Jede Vertiefung wurde dann mit 0,1 M Zitronensäure-Natriumhydroxid-Puffer (pH 4,0) versetzt, der 0,001 % Wasserstoffperoxidlösung und 0,4 mg/ml Ortho-Phenylendiamin (Produkt der Sigma Chemical Company) enthielt und die Extinktion der Kultur in jeder Vertiefung wurde bei einer Wellenlänge von 492 nm gemessen.
Da die Farbentwicklung nur in Vertiefungen beobachtet wurde, in denen Antikörper zu PCI existierten, wurden Zellen aus den Vertiefungen, die angefärbt wurden, gesammelt.

(5) Klonierung der Hybridomen, die einen monoklonalen Antikörper, der zu PCI spezifisch ist, ausschütten:

Abdominale Zellen, gesammelt durch Injektion von IMDM (in die Bauchhöhle einer Maus) wurden als Feeder-Zellen verwendet.
Die abdominalen Zellen, suspendiert bei 1 · 10&sup5; Zellen/ml in 10% FCS-versetztem IMDM wurden in 10-ul- Portionen in die einzelnen Vertiefungen einer 96-Vertiefung-Microtiterplatte gegeben. Am anschließenden Tag wurden antikörperausschüttende Hybridomen bei einer Konzentration von 5 Zellen/ml hergestellt und in 100-ul-Portionen in die einzelnen Vertiefungen gegossen. Jeden dritten Tag wurde das Kulturmedium durch eine frische Zuführung desselben Mediums ersetzt und die Kulturüberstände wurden nacheinander als Probe aus 10 Vertiefungen gezogen, in denen die Hybridomen zu einem geeigneten Volumen gezüchtet wurden. Die Bestätigung der Ausschüttung des Antikörpers wurde in gleicher Weise ausgeführt wie vorstehend beschrieben. Die Kulturen der positiven Zellen wurden erneut geklont unter Bereitstellung von Hybridomen, die einen anti-PCI-monoklonalen Antikörper ausschütten. Sechs Arten von Hybridomen wurden erhalten. Sie wurden PCI-H39 (hinterlegt unter FERM BP-1701 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japanese Government), PCI-H46 (FERM BP-1702), PCI-H167 (FERM BP- 1703), PCI-H169 (FERM BP-1704), -PCI-H176 (FERM BP-1705) und PCI-H180 (FERM BP-1706) gemäß den Typen der anti-PCI monoklonalen Antikörper, die sie in betreffender Weise ausschütten, genannt.

(6) Herstellung des anti-PCI monoklonalen Antikörpers:

BALB/c-Mäuse im Alter von 7 Wochen oder älter wurden intraperitoneal mit 0,5 ml Pristane (Produkt von Aldrich Chemical Co., Inc.) versetzt. Etwa 1 Woche später wurden die Mäuse intraperitoneal mit den vorstehend erhaltenen Hybridomen bei einer Rate von 1 · 10&sup6; Zellen/Maus beimpft. Etwa 10 Tage später wurde aszitische Flüssigkeit aus der Bauchhöhle der Mäuse gesammelt. Die Flüssigkeit wurde bei 3000 Umdrehungen für 10 Minuten unter Sammlung eines Überstandes zentrifugiert. Ammoniumsulfat wurde zu 5 ml des Überstandes gegeben, bis die letztendliche Konzentration von Ammoniumsulfat 50% der Sättigung erreichte. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC belassen. Das Gemisch wurde dann bei 3000 U/min. für 15 Minuten zentrifugiert und das erhaltene Sediment wurde in einem 0,1 M Tris-Salzsäure-Puffer (pH 8) gelöst und anschließend gegen denselben Puffer dialysiert. Das erhaltene Dialysat wurde Chromatographie an einer mit "Protein A Sepharose CL-4B" gefüllten Säule (Produkt der Pharmacia AB) chromatographiert, die mit demselben Puffer vorher ins Gleichgewicht gebracht wurde.
Die Elution des monoklonalen Antikörpers wurde mit einem 0,1 M Glycin-0,15 M-Natriumchlorid-Puffer (pH 2,7) bewirkt, wodurch der anti-PCI monoklonale Antikörper erhalten wurde. Wenn PCI-H39 verwendet wurde, wurden 14,2 mg PCI-A39 erhalten, 20,2 mg PCI-A46 aus PCI-H46, 22,9 mg PCI-A167 aus PCI-H167, 25,0 mg PCI-A169 aus PCI-H169, 25,0 mg PCI-A176 aus PCI-H176 und 8,6 mg PCI-A180 aus PCI-H180.

Beispiel 1:

Klonierung von PCI cDNA

(1) Absuchen der menschlichen plazentalen cDNA Genbank:

(a) cDNA Genbank:

Die menschliche Plazenta cDNA Genbank war ein Produkt von Clontech Laboratories, Inc . . cDNA, die aus menschlicher plazentaler mRNA von 1,8 kb im Durchschnitt unter Verwendung einer reversen Transkriptase hergestellt wurde, wurde an die EcoR I-Stelle des λgtll-Phagen mit Hilfe eines EcoR I-Linkers gekuppelt. Die Genbank war ein rekombinanter λgtll-Phage, bestehend aus einem unabhängigen Klon von 1,0 · 10&sup6; Zellen.
(b) E. coli Wirtszellen Y1090 (ATCC 37197) wurden auf eine LB Agarplatte (10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid, 2 g Maltose, 15 g Agar, 1 Liter destilliertes Wasser; (pH 7,5) gestrichen, die Ampicillin (100 ug/ml) und Maltose enthielt, gefolgt von Züchten über Nacht bei 37ºC. Eine einzelne Kolonie, die dabei auftrat, wurde auf ein LB-Medium überführt (10 g Bacto- Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid, 5 g Maltose, 1 l destilliertes Wasser; (pH 7,5), das Ampicillin (100 ug/ml) und Maltose enthielt), gefolgt von Züchten unter Schütteln über Nacht bei 37ºC.

(c) Infektion der Phagen-Genbank:

Eine über Nacht gezüchtete Kultur (0,2 ml) von E. coli Y1090 Wirtszellen wurde mit 0,1 ml der Phagen-Genbank vermischt, die auf 3,7 - 5,5 · 10&sup5; pfu/ml zubereitet wurde mit einem λ-Verdünnungsmittel (10 mM tris-HCl-Puffer, 10 mM Magnesiumchlorid; pH 7,5). Das erhaltene Gemisch wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur belassen, so daß der Phage an den Wirtszellen adsorbiert. Durch Zugabe und Vermischen von 2,5 ml eines LB-Oberschicht-Agarmediums (10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid, 2 g Maltose, 7,2 g Agar, 1 l destilliertes Wasser; pH 7,5), das die Maltose enthielt und das bei 45ºC warmgehalten wurde, wurde das sich ergebende Gemisch auf einer Maltose enthaltenden LB-Agarplatte mit einem Durchmesser von 9 cm ausgebreitet und dann bei 42ºC für 3 ½ Stunden gezüchtet.

(d) Übertragung auf ein Nitrocellulosefilter:

Nachdem der sterilisierte Nitrocellulosefilter mit 10 mM Isopropyl-β-D-thioglactopyranosid (IPTG) gesättigt wurde, wurde er getrocknet. Der getrocknete Filter wurde über die LB-Agarplatte aufgelegt, die dann bei 42ºC für 3 ½ Stunden gezüchtet wurde und einen auftretenden λgtll- Phagenplaque enthielt. Nach Züchten bei 37ºC für weitere 3 ½ Stunden wurde der Filter abgezogen. Die Platte mit dem aufgetretenen Phagenplaque wurde bei 4ºC gelagert. Nach Waschen des Filters mit TBST (10 mM Tris-HCl-Puffer, 150 mM Natriumchlorid, 0,05% "Tween 20"; pH 8,0) wurde der Filter Blockieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten mit 1 % Procinserumalbumin/TBST unterzogen.

(e) Binden eines primären Antikörpers:

Der Filter wurde in einer Lösung des primären Antikörpers angeordnet und bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter leichtem Schütteln umgesetzt. Als primärer Antikörper wurde der anti-PCI-Maus monoklonale Antikörper (erhalten in Bezugsbeispiel) gelöst in dem TBST angewendet, nachdem das flüssige Gemisch bei Raumtemperatur für 30 Minuten belassen wurde und Fremdantikörper adsorbiert waren. Ein anti-PCI-Maus monoklonales Antikörperflüssiggemisch wurde angewendet, das PCI-A39 + PCI-A46 + PCI-A180 (1 : 1 : 0,5), 1 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,25 ug/ml - 0,04 ug/ml eines E. coli Extrakts (Produkt von der Promega Corporation) enthielt.
Nach Umsetzung mit dem primären Antikörper wurde der Filter dreimal für 10 Minuten jeweils mit TBST gewaschen.

(f) Binden eines sekundären Antikörpers:

Der Filter wurde dann in eine Lösung des sekundären Antikörpers überführt und bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter leichtem Rühren umgesetzt. Als sekundärer Antikörper wurde jener verwendet, der durch Verdünnen eines alkalische Phosphatase-konjugierten Anti-Maus-IgG (H+L) (Produkt der Promega Corporation) zu einer Konzentration von 1/7500 seiner ursprünglichen Konzentration mit TBST erhalten wurde.
Der Filter wurde dann dreimal für 10 Minuten jeweils mit TBST gewaschen, gefolgt von Waschen einmal mit einem AP-Puffer (100 mM Tris-HCl-Puffer, 100 mM Natriumchlorid, 5 mM Magnesiumchlorid; pH 9,5).

(g) Farbentwicklung:

Der Filter wurde in eine Farbentwicklungssubstratlösung getaucht, die durch Vermischen von 33 ul einer Nitrobluetetrazolium-Lösung (50 mg/ml) und 66 ul einer Lösung aus 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (50 mg/ml) erhalten wurde.
Nach Farbentwicklung bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde der Filter in eine Reaktionsstopplösung überführt (20 mM Tris-HCl-Puffer, 5 mM Natriumethylendiamintetraacetat; pH 8,0), so daß die Farbentwicklung beendet wurde.

(h) Zubereitung und Reinigung von positiven Plaques:

Plaques entsprechend den Positivflecken, bei denen die Entwicklung einer Färbung beobachtet wurde, wurden zusammen mit dem Agarmedium gesammelt und wurden dann in 0,1 ml eines TMG-Puffer (10 mM Tris-HCl-Puffer, 10 mM Magnesiumchlorid, 100 ug/ml Gelatine; pH 7,4) überführt. Zwei Tropfen Chloroform wurden zugegeben, gefolgt von Zentrifugieren bei 4ºC und 4000 U/min. für 15 Minuten. Ein Tropfen Chloroform wurde dann zu dem erhaltenen Überstand gegeben und das so hergestellte Gemisch wurde bei 4ºC gelagert.
Das vorstehend beschriebene Screening wurde an etwa 3 · 10&sup6; Phagenplaques ausgeführt. Im Ergebnis wurden 26 positive Plaques erhalten.
Hinsichtlich von 5 Plaques, die eine starke Stammentwicklung zeigten, wurden deren Phagenlösungen getrennt, zu einem geeigneten Ausmaß verdünnt und dann 2 Screenings unterzogen, um die Phagen zu reinigen.

(2) Herstellung der rekombinanten Phagen DNA:

E. coli Wirtszellen Y1088 (ATCC 337195) wurden mit den so erhaltenen 5 Stämmen rekombinanter Phagen infiziert und die Phagen wurden zum Auftreten bei 42ºC induziert. Gemäß einem Herstellungsverfahren von Phagen λ [Bernard Perbal, PREPARATION OF λ PHAGE DNA in A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING, Seiten 175-184, A Wiley-Interscience Publication (1984), New York, USA], wurde eine kleinvolumige Zubereitung und eine hochvolumige Zubereitung, beide durch das Plattenverfahren und eine hochvolumige Zubereitung, durch ein Flüssigkulturverfahren nacheinander ausgeführt, so daß 10&sup9; pfu/ml rekombinanter Phagen erhalten wurden.
Gemäß einem λDNA Herstellungsverfahren [Bernard Perbal, PREPARATION OF λ PHAGE DNA in A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING, Seiten 184-187, A Wiley-Interscience Publication (1984), New York, USA], wurde eine Phagenlösung, die auf 1011 pfu/ml durch Polyethylenglycolfällung konzentriert wurde, durch Ultrazentrifugieren in 2- Schritt-Konzentration mit Glycerin gereinigt, [verfaßt von Bernard Perbal, übersetzt von Shigeyasu Kobayashi: Practical Handbook of Gene Manipulation Experiments, Seiten 175 (1985), The Jatec Publishing Co.].
Unter Verwendung des gereinigten rekombinanten Phagen wurde auch rekombinante Phagen DNA gemäß dem Herstellungsverfahren von λDNA hergestellt. Etwa 30-160 ug DNA wurden von 300 ml der Kultur erhalten.

(3) Subklonieren von cDNA:

pUC118 (ein Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde als Vektor verwendet. pUC118 wurde mit EcoR I geschnitten. Die 5 Stämme der rekombinanten λgtll-Phagen DNA wurden separat mit dem so geschnittenen pUC118 unter Verwendung eines DNA Ligierungskits ligiert (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.).
Wenn so erhaltene rekombinante Vektoren separat in E. coli Wirtszellen MV1304 (ein Produkt der Takara Shuzo Co., Ltd.) eingeführt wurden, wurden 5 Arten rekombinanter Vektoren pMKT1, pMKT3, pMKT5, pMKT7 und pMKT9 entsprechend den 5 Stämmen der rekombinanten λgtll Phagen DNA aus den sich ergebenden Transformanten der Wirtszellen MV1304 erhalten.
Restriktionsendonucleasenkarten wurden unter Verwendung von verschiedenen Restriktionsendonucleasen hergestellt. Alle diese rekombinanten Vektoren enthalten gewöhnlich die geschnittenen Bereiche von Pst I, Sac I, Sph I und Hind III. Jeder der so inserierten Fragmente hat eine Länge von etwa 1,5 kb. Die Restriktionsendonucleasenkarte von pMKT7 mit dem längsten inserierten Fragment ist in Fig. 1 dargestellt. Die Länge von pMKT7 betrug etwa 4,8 kb.

(4) Bestimmung der Nucleotidsequenz von PCI cDNA:

Der erhaltene PCI cDNA rekombinante Vektor wurde unter Verwendung von verschiedenen Restriktionsendonucleasen und Exonuclease III - Mungobohnennuclease getrennt behandelt, so daß der Strang der cDNA gekürzt wurde. Ein kurzsträngiges Plasmid wurde dann unter Verwendung von pUC118 als Vektor rekonstruiert. E. coli Wirtszellen MV1304 wurden dann in das so erhaltene kurzsträngige Plasmid transformiert. Eine Kultur der erhaltenen Transformante wurde mit dem Helferphagen M13K08 (Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.) infiziert. Aus so gezüchteten Phagenteilchen wurde eine einsträngige DNA hergestellt. Dessen Nucleotidsequenz wurde durch das Didesoxynucleotidketten-Terminationsverfahren bestimmt.
Die Nucleotidsequenz ist in Fig. 2 dargestellt. Es war möglich, cDNA zu erhalten, die eine fast vollständige Länge in einer Länge von 1567 (Fig. 2) hatte. Es wurde gefunden, daß die 957 Basenpaare enthaltende Basensequenz, ausgehend von der vierten Base G und endend mit der 960-sten Base C, die Sequenz für 319 Aminosäuren des Polypeptids codiert.
E. coli MV1304/pMKT7, das Plasmid enthält, das für den gesamten offenen Leserahmen des erfindungsgemäßen Polypeptids codiert, wurde unter FERM BP-1262 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japanese Government, hinterlegt.

Beispiel 2:

Konstruktion des Plasmids zur Expression von PCI cDNA und Transformation von Wirtszellen mit dem Plasmid.

(1) Auswahl des Expressionsvektors:

Wie in Fig. 2 ausgewiesen, ist die Startstelle ATG für die Translation von PCI cDNA innerhalb des Erkennungsbereiches der Restriktionsendonuclease Nco I angeordnet. Der codierende Bereich des Peptids der Erfindung kann daher leicht durch Ligieren eines DNA-Fragments mit einem Expressionsvektor, der den Nco I-Bereich stromabwärts eines starken Promotors aufweist, exprimiert werden.
Folglich wurde entschieden, einen Expressionsvektor pKK233-2 zu verwenden, der einen trc-Promotor, den starken Promotor von E. coli aufwies und die Ribosom-Bindungsstelle von LacZ wie die Translationsstartstelle ATG stromabwärts von 8 Basen der Ribosom-Bindungsstelle [Amann, E. und Brosius, J., Gene, 40, 183-190 (1985)] zu verwenden. Die Translationsstartstelle ATG von pKK233-2 liegt im Erkennungsbereich der Restriktionsendonuclease Nco I vor.

(2) Konstruktion eines Plasmids zur Expression von PCI cDNA:

Das Plasmid pMKT7, das in Beispiel 1 hergestellt wurde und PCI cDNA enthielt, wurde mit Restriktionsendonucleasen Nco I und Hind III geschnitten. Ein DNA-Fragment mit einer Länge von 1308 bp (Fig. 2) und mit einem Bereich, der das Polypeptid codiert, wurde durch Gelelektrophorese mit niedrigschmelzender Agarose isoliert. [Verfaßt von Bernard Perbal und übersetzt unter der Leitung von Shigeyasu Kobayashi: "Idenshi Sosa Jikken Jitsuyo Handbook, Practical Handbook of Gene Manipulation Experiments)", 211-212 (1985), the JATEC Publishing Co., Ltd.]. Der Vektor pKK233-2, der durch die Restriktionsendonucleasen Nco I und Hind III vorher geschnitten wurde und das vorstehende DNA-Fragment wurden dann unter Verwendung des DNA-Ligierungskits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert, wodurch ein Plasmid pMKTX1 konstruiert wurde (Fig. 3).
(3) Das Plasmid pMKTX1, konstruiert durch das vorstehende Verfahren (2), wurde in kompetente Zellen von E. coli Wirt JM105 [C. Yanisch-Perron, J. Vieira und J. Messing: Improved M13 Phage Cloning Vectors and Host Strains
- Nucleotide Sequences of the M13mp18 and pUC19 Vectors, Gene 33, 103-119 (1985)] eingeführt, wobei die kompetenten Zellen gemäß dem Verfahren, vorgeschlagen von Wiestars und Simmanis, hergestellt wurden [Hanahan, D.: DNA Cloning: A Practical Approach, Bd. 1, (D.M. Glover, Hrsg.), Seiten 121, (1985), IRL Press, Oxford]. Die Auswahl der Transformanten E. coli JM105/pMKTX1 wurde auf einer LB Agarplatte (1% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefe-Extrakt, 1% Natriumchlorid, 1,5% Agar) bewirkt, die 100 ug/ml Ampicillin enthielt.
Die sich ergebende Transformante E. coli JM105/ pMKTX1 wurde unter FERM BP-1407 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japanese Government, hinterlegt.

Beispiel 3:

Bestätigung der Expression des Polypeptids durch Western-Blot-Technik:

E. coli JM105/pMKTX1, hergestellt in Beispiel 2, wurde über Nacht bei 37ºC auf einer LB-Agarplatte, die 100 ug/ml Ampicillin enthielt, gezüchtet. Die erhaltene Kolonie wurde in 50-ml-Portionen von SOC-Medium (20 g Bacto- Trypton, 5 g Bacto-Hefe-Extrakt, 10 mM Natriumchlorid, 2,5 mM Kaliumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Magnesiumsulfat, 20 mM Glucose, 50 ug/ml Ampicillin, 1 l destilliertes Wasser; pH 7,0) überimpft, wobei die Portion einzeln in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gehalten wurden. Die Transformante wurde unter Schütteln bei 37ºC für 2 Stunden gezüchtet. Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid wurde zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, gefolgt von Züchten unter Schütteln für weitere 2 Stunden. Anschließend, zum Sammeln der Zellen, wurden sie in 0,2 ml TBS (10 mM Tris-HCl-Puffer, 150 mM Natriumchlorid, pH 8,0) suspendiert. Lysozym, Ribonuclease und Desoxyribonuclease wurden dann in einer Menge von 100 ug/ml jeweils zugegeben. Die erhaltene Suspension wurde in Trockeneis/Ethanol gefroren, gefolgt von Auftauen. Dieses Gefrieren und Tauen wurde wiederholt und die Suspension wurde dann bei Raumtemperatur für 15 Minuten belassen. EDTA wurde zu einer Endkonzentration von 20 mM zugegeben, wodurch ein Lysat erhalten wurde. Der Überstand vom Zentrifugieren des Lysats wurde durch ein "Millipore"-Filter geleitet, so daß ein Extrakt von E. coli JM105/pMKTX1 erhalten wurde.
Nach Vermindern von 15 ul des so erhaltenen Extraktes mit β-Mercaptoethanol wurde er SDS-Polyacrylamidelektrophorese (10% Gel) unterzogen. Western-Blot wurde unter Verwendung von Anti-Human-Placenta-abgeleiteten PCI monoklonalen Antikörper PCI-A46, ausgeführt und ein Protoblotimmunoassaysystem (Produkt von Promega Biotec Corp.) wurde verwendet. Im Ergebnis wurde die Expression des Polypeptids mit einem Molekulargewicht im wesentlichen äquivalent zu PCI, abgeleitet von menschlicher Plazenta, bestätigt. (Fig. 4).

Beispiel 4:

Erzeugung des Polypeptids:

(1) Kulturen:

Die Transformante E. coli JM105/pMKTX1 wurde über Nacht bei 37ºC auf einer LB Agarplatte gezüchtet, die 100 ug/ml Ampicillin enthielt. Die erhaltene Kolonie wurde zu vier 5-ml-Portionen eines LB-Mediums, (das durch Weglassen von Agar aus dem LB-Agarmedium erhalten wurde), enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, beimpft. Die vier 5-ml-Portionen wurden in L-förmigen Röhrchen aufbewahrt. Anschließend an die Über-Nacht-Kultur bei 37ºC unter Schütteln wurden 0,5-ml- Portionen jeder Kultur zu 40 50-ml-Portionen eines MMCA- Mediums getrennt überimpft (10,5 g Dikaliumphosphat, 4,5 g Kaliumphosphat, 1,0 g Ammoniumsulfat, 0,5 g Natriumcitrat, 0,2 g Magnesiumsulfat, 2,0 g Glucose, 5,0 ul Thiaminhydrochlorid, 5,0 g Casaminosäure, 50 ug/ml Ampicillin, 1 l destilliertes Wasser; pH 7,0). Die 40 50-ml-Portionen wurden in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben aufbewahrt. Nach Züchten der Transformante bei 37ºC für 4 Stunden unter Schütteln wurde Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, gefolgt von Züchten unter Schütteln für weitere 2,5 Stunden.

(2) Extraktion und Reinigung:

(a) Nach Gewinnen wurden die Zellen in 50 ml eines 25 mM Tris-HCl-Puffers (pH 7,4) suspendiert, der 25 mM EDTA enthielt. Die Suspension wurde unter Gewinnen gewaschener Zellen zentrifugiert. Die gewaschenen Zellen wurden in 75 ml desselben Puffers suspendiert und anschließend an das Gefrieren und Tauen wurde der Überstand durch Zentrifugieren erhalten. Der Rückstand wurde wiederum in 75 ml desselben Puffers suspendiert und nach Gefrieren und Auftauen wurde ein weiterer Überstand durch Zentrifugieren erhalten. Beide Überstände wurden kombiniert und Verunreinigungen wurden daraus mit einer wässerigen Ammoniumsulfatlösung von 30%-iger Sättigung entfernt. Die erhaltene Lösung wurde gegen 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) unter Bereitstellung von 244 ml eines E. coli Extrakts dialysiert.
(b) Der in vorstehendem Verfahren (a) enthaltene E. coli Extrakt wurde an einer DEAE-Toyopearl-Säule ( 1,6 · 10 cm) absorbieren lassen, die mit einem 50 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,4) ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Säule wurde sorgfältig mit demselben Puffer gewaschen. Unter Verwendung von 240 ml desselben Puffers, dessen Portionen jeweils 0-0,3 M Natriumchlorid enthielten, wurde Elution mit einer Menge von 3 ml pro Fraktion gemäß der linearen Konzentrationsgradientenmethode ausgeführt, so daß die Fraktionen mit Polypeptid in einem Gesamtvolumen von 39 ml erhalten wurden (Fig. 5). Die Menge an Polypeptid in jeder Fraktion wurde durch ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) bestimmt.
(c) Fraktionen, die das Polypeptid enthielten und die im vorstehenden Verfahren (b) erhalten wurden, wurden in eine Antikörpersäule ( 3 · 4 cm) gefüllt, in der monoklonale Antikörper PCI-A46 an Bromcyan-aktivierte "Sepharose 4B" gebunden waren. Nach sorgfältigem Waschen der Säule mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, wurde Elution mit einer Menge von 2 ml pro Fraktion bei 50 ml eines 0,1 M Natriumacetat-Puffers (pH 5,0), der 0,5 M Natriumchlorid enthielt, ausgeführt, wodurch die Fraktionen, die das Polypeptid enthielten, in einem Gesamtvolumen von 20 ml erhalten wurden (Fig. 6). Jene Fraktionen wurden durch "Immersible CX-10" (ein Produkt der Millipore Corporation) eingeengt und dann gegen einen 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, dialysiert, wodurch 3,75 ml einer Polypeptidprobe in reiner Form (Proteingewicht 4,7 mg - bestimmt durch BIO-RAD PROTEIN ASSAY) erhalten wurden. Da das so erhaltene Polypeptid eine einzelne Bande bei dessen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte, wird angenommen, daß es ein einzelner Stoff ist, frei von jeglichen Verunreinigungen.
Des weiteren werden die Ausbeuten an erhaltenen Proteinen in den betreffenden Reinigungsstufen nachstehend beschrieben.

Stufe Proteingewicht (mg)

Schritt (a) (E. coli Extrakt) 95,2
Schritt (b) (DEAE-Toyopearl- Adsorption) 21,5
Schritt (c) (Antikörper Säulen-Adsorption) 4,7

Beispiel 5:

Eigenschaften des Polypeptids

(1) Bestimmung der Aminosäuresequenz des N-terminalen Endes:

Anschließend an die Dialyse von 2 mg des Polypeptids gegen destilliertes Wasser wurde es lyophilisiert. Unter Verwendung eines JEOL JAS-570K Sequence Analyzer wurde es in PTH-Aminosäuren umgewandelt und analysiert. Die Ergebnisse der Analyse sind in nachstehender Tabelle aufgeführt. Zyklus-Nr. Aminosäure nMol
* n.d.: bedeutet nicht detektiert.
Aus den vorstehenden Ergebnissen wurde die Aminosäuresequenz am N-terminalen Ende des Polypeptids wie nachstehend bestimmt:
Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp

(2) Messung des Molekulargewichts:

Nach Reduktion des Polypeptids mit 2-Mercaptoethanol wurde dessen Molekulargewicht durch 12,5% SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gemäß dem Verfahren, vorgeschlagen von Laemmli, gemessen [Laemmli, U.K.: Nature, 227, 680-685 (1970)]. Als Molekulargewichtsmarker war Phosphorylase b (M.W. 94000) Rinderserumalbumin (M.W. 67000), Eiweißalbumin (M.W. 43000), Kohlensäureanhydrase (M.W. 30000), Soyabohnentrypsininhibitor (M.W. 20100) und α-Lactoalbumin (M.W. 14400) verwendet.
Das Molekulargewicht des Polypeptids wurde mit 34000 ± 1000 berechnet.

(3) Messung des isoelektrischen Punktes:

Unter Verwendung von "AMPHOLINE PAGPLATE" (Warenzeichen; pH 3,5-9,5; Produkt von LKB) wurde der isoelektrische Punkt durch isoelektrische Polyacrylamidgel-Fokussierung gemäß dem Verfahren, vorgeschlagen von Wrigley, gemessen [Wrigley, C.W.: Methods Enzymol., 21, 559-564 (1971)].
Der isoelektrische Punkt des Polypeptids wurde mit 5,0 ± 0,1 berechnet.

(4) Bestimmung der Stabilität:

Die Stabilität des Polypeptids in Plasma wurde bestimmt.
Gemischt wurden 5 ul-Portionen von Polypeptid (60 ug/ml) mit 100 ul-Portionen Humanplasma. Die erhaltenen Gemische wurden bei 37ºC getrennt, periodisch in unterschiedlichen Zeiträume im Bereich von 0-30 Minuten, inkubiert. Jedes der Gemische wurde dann mit 200 ul 0,0125 M Calciumchlorid zur Messung einer Verlängerung der Koagulationszeit gemäß dem Recalcifizierungsverfahren versetzt. Die Messungen sind in nachstehender Tabelle aufgeführt, in der die betreffenden Grade der Verlängerung in Form von Prozentsätzen verlängerter Gerinnungszeit ausgedrückt sind unter der Annahme, daß die Gerinnungszeit 100% ist, wenn das Polypeptid dieser Erfindung nicht verwendet wird.
Inkubationszeit (Minuten) O 10 20 30 prozentuale Verlängerung
der Gerinnungszeit (n=2) (%) 223 220 209 200
Das Polypeptid blieb für 30 Minuten bei 37ºC in dem Plasma stabil.

(5) Bestimmung der Antigerinnungsaktivitäten:

(i) Messung der Recalcifizierungszeit:

Ein kleines, mit Silicon behandeltes Glasröhrchen, wurde mit 100 ul einer Lösung, die das Polypeptid enthielt, und 100 ul üblichen Humanplasma vermischt. Nach Belassen des erhaltenen Gemisches bei 37ºC für 3 Minuten wurden 100 ul einer 0,025 M wässerigen Lösung von Calciumchlorid zugegeben. Sie wurden gut vermischt und die Zeit wurde gemessen bis das Blut gerann.
In der nachstehenden Tabelle werden die Meßergebnisse im Hinblick auf die prozentuale Verlängerung der Gerinnungszeit dargestellt, unter der Annahme, daß die Gerinnungszeit 100% war, wenn das Polypeptid nicht zugegeben wurde.
Menge an zugegebenem Polypeptid (ug/ml) 0 1
prozentuale Verlängerung der Gerinnungszeit (n=2) (%) 100 137

(ii) Messung der Prothrombinzeit:

In einer Glasküvette wurden 50 ul einer Lösung, enthaltend Polypeptid, 50 ul eines 20 mM Tris-HCl-Puffers (pH 7,4), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 0,5% Humanserumalbumin und 100 ul Tromboplastin ("Lyoplastin", Warenzeichen; Produkt der Mochida Pharmaceutical Co, Ltd.) gegeben und auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml mit einer 20 mM wässerigen Lösung von Calciumchlorid verdünnt. Nach Belassen des erhaltenen Gemisches bei 37ºC für 3 Minuten wurden 200 ul des Standard-Humanplasmas zugegeben, das zweimal mit 0,15 M Kochsalzlösung verdünnt wurde. Die Gerinnungszeit wurde dann unter Verwendung von "COAGTEC TE- 600" (Warenzeichen; ein Produkt der Erma Inc., Tokio) gemessen.
In der nachstehenden Tabelle werden die Meßergebnisse in Bezug auf die prozentuale Verlängerung der Gerinnungszeit angeführt, unter der Annahme, daß die Gerinnungszeit 100% war, wenn das Polypeptid nicht zugegeben wurde.
Menge an zugegebenem Polypeptid (ug/ml) 0 12,5 25 50 100
prozentuale Verlängerung der Gerinnungszeit (n=2) (%) 100 132 184 284 380

(iii) Messung der aktivierten Teil-Thromboplastinzeit:

In eine Glasküvette wurden 50 ul Lösung, enthaltend das Polypeptid, und 50 ul "ACTIVATED THROMBOFAX" (Warenzeichen; Produkt der Ortho Pharmaceutical Corp.) gegeben. Nach Belassen des erhaltenen Gemisches bei 37ºC für 2 Minuten wurden 100 ul Humanserumplasma zugegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde für 4 Minuten belassen. Nach Zugabe von 200 ul einer 0,0125 M-Lösung Calciumchlorid wurde die Gerinnung unter Verwendung eines "COAGTEC TE- 600" (Warenzeichen; Produkt der Erma Inc., Tokio) gemessen.
In der nachstehenden Tabelle sind die Meßergebnisse in Form der prozentualen Verlängerung der Gerinnungszeit aufgeführt, in der Annahme, daß die Gerinnungszeit 100% ist, wenn das Polypeptid nicht zugegeben wurde.
Menge an zugegebenem Polypeptid (ug/ml) 0 50 100 150
prozentuale Verlängerung der Gerinnungszeit (n=2) % 100 107 120 141
Menge an zugegebenem Polypeptid (ug/ml) 200 300 500
%-Verlängerung der Gerinnungszeit (n=2) (%) 184 396 608

Beispiel 9:

Vergleich der gerinnungshemmenden Aktivitäten zwischen dem Polypeptid und PCI.
Die gerinnungshemmenden Aktivitäten des Polypeptids wurden mit jenen von PCI, abgeleitet von menschlicher Plazenta, verglichen. 100-ul-Portionen von jeder Probe, jede Portion mit unterschiedlichen Konzentrationen, wurden jeweils mit 100 ul eines 0,5 mg/ml PT-Reagenz vermischt ("Lyoplastin", Warenzeichen; Produkt der Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.). Drei Minuten später wurden 200 ul des Standardplasmas, die zweifach mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt wurden, zur Messung der Gerinnungszeit zugegeben.
Wie in Tabelle 1 dargestellt, zeigten das Polypeptid und PCI, abgeleitet von menschlicher Plazenta, im wesentlichen die gleichen gerinnungszeitverlängernden Wirkungen (PT). Tabelle 1 gerinnungshemmende Aktivitäten von Polypeptid und PCI, abgeleitet von menschlicher Plazenta: Zugegebene Probe Reaktionsgemisch Gerinnungszeit Polypeptid PCI, abgeleitet von menschlicher Plazenta

Beispiel 7:

Zubereitung einer Dosierungsform:

Polypeptid 1 mg
Albumin 5 mg
Mannit 25 mg
Natriumchlorid 1,95 mg
Natriumphosphat 3,85 mg
Die vorstehenden Inhaltsstoffe werden in 2 ml destilliertem Wasser zur Injektion gelöst. Die so zubereitete Lösung wurde in ein sterilisiertes Fläschchen gefüllt und wurde vorsorglich bei -30ºC bis -40ºC für 2 Stunden eingefroren. Es wurde anschließend erstem Trocknen bei -30ºC bis +20ºC und 0,05 bis 0,1 Torr für 35 Stunden unterzogen und dann zweitem Trocknen bei 30ºC und 0,01 bis 0,05 Torr für 5 Stunden unterzogen, wodurch ein Fläschchen zur Injektion erhalten wurde.

Claims

1. DNA-Fragment mit nachstehender Nukleotidsequenz:

oder ein DNA-Fragment mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu der vorstehend erwähnten Nukleotidsequenz ist.

2. Rekombinantes Plasmid, umfassend:

ein DNA-Fragment mit der nachstehenden Nukleotidsequenz:

oder ein DNA-Fragment mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu der vorstehend erwähnten Nukleotidsequenz ist; und eine replizierende Vektor-DNA.

3. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 2, wobei das rekombinante Plasmid die Bereiche (1)-(6) in der Reihenfolge stromabwärts zur Transkriptionsrichtung umfaßt:

(1) einen Promotor;

(2) eine Ribosombindungsstelle;

(3) ein Startcodon;

(4) eine DNA mit nachstehender Nukleotidsequenz:

oder ein DNA-Fragment mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu der vorstehend erwähnten Nukleotidsequenz ist:

(5) ein Stoppcodon; und

(6) einen Transkriptionsterminator.

4. Transformante, enthaltend ein rekombinantes Plasmid, welches ein DNA-Fragment mit der nachstehenden Nukleotidsequenz umfaßt:

5. Transformante nach Anspruch 4, wobei die Transformante das rekombinante Plasmid nach Anspruch 3 enthält.

6. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit gerinnungshemmender Wirkung, umfassend:

(1) Züchten einer Transformante, die ein rekombinantes Plasmid enthält, umfassend ein DNA-Fragment mit der nachstehenden Nukleotidsequenz:

oder ein DNA-Fragment mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu der vor stehend erwähnten Nukleotidsequenz ist; und eine replizierende Vektor-DNA; und

(2) Gewinnen des hergestellten Polypeptids aus der erhaltenen Kultur.