DE69024060T2

DE69024060T2 - Osteogenesis-stimulierende mittel.

Info

Publication number: DE69024060T2
Application number: DE69024060T
Authority: DE
Inventors: Masayoshi Shizuoka-Shi Shizuoka 420 Yamaguchi
Original assignee: Hamari Chemicals Ltd; Zeria Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hamari Chemicals Ltd; Zeria Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-10-02
Filing date: 1990-09-28
Publication date: 1996-08-01
Anticipated expiration: 2010-09-29
Also published as: CA2067374A1; KR920703050A; WO1991004737A1; ATE131047T1; JPH03120257A; KR0147855B1; EP0495106A1; EP0495106B1; EP0495106A4; US5294634A; JP2811331B2; CA2067374C; DE69024060D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft einen Osteogenese-Promotor (osteogenen Aktivator), der als aktiven Bestandteil ein Zinksalz oder einen Zinkkomplex von L-Carnosin umfaßt.

STAND DER TECHNIK

Mit zunehmendem Alter nimmt die Knochenmasse ab. Auch bei der jüngeren Generation kann Calcium in Knochen congenital oder idiopathisch anormal in das Blut absorbiert werden, so daß das Calcium in den Knochen verringert wird und demgemäß die Knochenmasse erniedrigt wird, was einen mangelnden Knochenmetabolismus und eine mangelnde Osteogenese verursacht.
Ein gestörter Knochenmetabolismus und eine gestörte Osteogenese haben Frakturen, Osteomalazie, Osteoporose und/oder Schmerzen im unteren Rücken zur Folge. In den letzten Jahren nehmen die betagten Menschen in der Welt rasch zu, und dementsprechend steigt die Osteogenese imperf ecta an. Ähnliche Krankheiten nehmen bei der jüngeren Generation aufgrund von Calciummangel zu, der von unausgewogenen Eßgewohnheiten herrührt.
Experimentelle Marker für die Osteogenese und die Kalzifikation schließen Messungen oder Bestimmungen des Calciumgehalts, der Aktivität der alkalischen Phosphatase und des DNA-Gehalts in Knochen ein. Es wird gesagt, daß die Bildung und der Metabolismus von Knochen aktiver sind, wenn diese Gehalte oder Konzentrationen im Knochen ansteigen.
Die Arzneistoffe Calcitonin und aktives vitamin D&sub3; sind bisher allgemein in der medizinischen Therapie von Krankheiten verwendet worden, die von einer mangelnden Osteogenese verursacht werden. Daneben sind Hormon-Arzneistoffe und Calciumpräparate ebenfalls verwendet worden.
Obwohl Calcitonin auf die Schmerzen bei Osteoporose eine ausgezeichnete Wirkung aufweist, zeigt es keinerlei Wirkungen, wenn es oral verabreicht wird, da es sich um ein Peptid handelt. Seine alleinige Verwendung in Form einer Injektion ist jedoch durch die Probleme der unbequemen Verabreichung und des Schmerzes bei seiner Verabreichung begleitet. Andererseits sind die aktiven Vitamin D&sub3;-Arzneimittel in ihren Wirkungen, wie knochenbildender Wirkung und schmerzlindernder Wirkung, unzureichend und beinhalten derartige Probleme wie das Herbeiführen einer Hyperkalziämie.
Weiter ist in vivo [Metabolism 35, 1044-1047 (1986); und Biochem. Pharmacol., 35, 773-777 (1986)] und in vitro [Biochem. Pharmacol., 36, 4007-4012 (1987) und a.a.O., 37, 4075-4080 (1988)] gezeigt worden, daß Zink eine wichtige Rolle als Aktivator für die Stimulierung und Kalzifikation bei der Osteogenese spielt. Weiter ist gezeigt worden, daß Zink die Knochenprotein-Synthese stimuliert [Biochem. Pharmacol., 37, 4075-4080 (1988)].
Jedoch ist eine pharmazeutische Verwendung von Zink nicht erreicht worden, obwohl vorgeschlagen worden ist, daß es eine Osteogenese-beschleunigende Wirkung aufweist. Zink selbst beinhaltet ein Problem in Bezug auf Absorption, Metabolismus und Toxizität. Deshalb bestand ein Bedarf für die Entwicklung einer Substanz, die eine ausgezeichnete knochenbildende Eigenschaft besitzt.
Andererseits handelt es sich bei einem L-Carnosin-Zinksalz um ein Zinksalz von L-Carnosin, das von ß-Alanin und L-Histidin abstammt. Es ist bekannt, daß das Salz eine heilende Wirkung bei peptischen Ulcera (Japanische Patentanmeldungsoffenlegungsschrift Nr. 33270/1984) und eine vorbeugende und heilende Wirkung bei Hepatopathie (Japanische Patentanmeldungsoffenlegungsschrift Nr.14728/1988) aufweist. Es wurde vorgeschlagen, daß die Hemmung von freien Radikalreaktionen (Anti-aktiver Sauerstoff-Wirkung) am Mechanismus der Anti- Ulcus-Wirkung beteiligt ist [Jounal of Japanese Digestive Disease Society, 85, Extra Edition, 644 (1987)]. Es war jedoch nicht bekannt, daß das Zinksalz oder der Zinkkomplex von L- Carnosin eine Osteogenese-beschleunigende Wirkung besitzt.
In Anbetracht der vorstehenden Umstände haben die gegenwärtigen Erfinder eine umfangreiche Untersuchung durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß das Zinksalz oder der Zinkkomplex von L-Carnosin eine ausgezeichnete Osteogenese-beschleunigende Wirkung aufweist, und daß ein Osteogense-beschleunigendes Mittel, das diese Verbindung als aktiven Bestandteil umfaßt, eine äußerst geringe Toxizität und äußerst geringe Nebenwirkungen aufweist und bei der Behandlung von Brüchen, Osteomalazie und dergleichen nützlich ist, welche durch eine Störung des Knochenmetabolismus oder der Osteogenese verursacht werden, was zur Fertigstellung der vorliegenden Erfindung führte.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf einen neuen Typ von Osteogenese-Promotor, der als aktiven Bestandteil ein Zinksalz oder einen Zinkkomplex von L-Carnosin umfaßt und der von den herkömmlichen Arzneistoffen Calcitonin und aktives Vitamin D&sub3; sehr verschieden ist.
Das Zinksalz oder der Zinkkomplex von L-Carnosin kann in zwei Typen vorliegen, in amorpher und kristalliner Form. Es gibt keinen Unterschied im Hinblick aufihre Osteogenesebeschleunigende Wirkungen. Im übrigen kann die Bestimmung, welche der Formen, die amorphe oder die kristalline, das Zinksalz oder der Zinkkomplex von L-Carnosin aufweist, beispielsweise durch Beobachtungen durch ein Elektronenmikroskop, mittels Infrarotabsorptions spektrum und durch das Röntgenbeugungsmuster vorgenommen werden.
Das Zinksalz oder der Zinkkomplex von L-Carnosin wird beispielsweise durch Umsetzung eines Zinksalzes und einer Alkalimetallverbindung mit L-Carnosin in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel hergestellt.
Das kristalline Zinksalz oder der kristalline Zinkkomplex von L-Carnosin wird erhalten, indem man ein Zinksalz und eine Alkalimetallverbindung in Verhältnissen von 0,1-1,2 Mol bzw. 1,6-2,4 Mol pro Mol L-Carnosin verwendet und sie miteinander in einem wasserfreien oder wasserhaltigen polaren organischen Lösungsmittel entweder bei Raumtemperatur oder unter Erwärmen umsetzt (Japanische Patentanmeldungsoffenlegungsschrift Nr. 42471/1989). Als Beispiele für das polare organische Lösungsmittel können Alkohole, wie Methanol, Ethanol und Propanol, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, N,N- Dimethylformaldehyd, Tetrahydrofuran, Aceton und dergleichen erwähnt werden. Diese können mit einem Wassergehalt bis zu ungefähr 50% verwendet werden. Als Zinksalz können sowohl Salze anorganischer Säuren als auch Salze organischer Säuren verwendet werden. Als Beispiele für die erstgenannten Zinksalze können Zinkhalogenide, Zinksulfat, Zinknitrat, Zinkperchlorat usw. erwähnt werden. Als Beispiele für die letztgenannten Zinksalze können Zinksalze von Carbonsäuren, wie Zinkacetat, Zinkacetylacetonat usw., erwähnt werden. Es können jedoch jegliche Zinksalze verwendet werden, solange sie die Reaktion eingehen. Als Alkalimetallverbindungen können Lithiumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid, Kahumalkoholat, Natriumalkoholat usw. verwendet werden.
Andererseits kann das amorphe Zinksalz oder der amorphe Zinkkomplex von L-Carnosin mit dem gleichen Verfahren, wie oben beschrieben, hergestellt werden, außer daß Wasser anstelle des wasserfreien oder wasserhaltigen polaren organischen Lösungsmittels verwendet wird.
Das so erhaltene Zinksalz oder der so erhaltene Zinkkomplex von L-Carnosin kann mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen versetzt werden, um dieses als Präparat zur oralen oder parenteralen Verabreichung zu verwenden. Die orale Verabreichung wird jedoch besonders bevorzugt. Mit Bezug auf Präparate zur oralen Verabreichung kann die obige Verbindung auf geeignete Weise mit geeigneten Zusätzen vereinigt werden, beispielsweise mit Hilfsstoffen wie Lactose, Mannit, Maisstärke und kristalliner Cellulose; Bindemitteln, wie Cellulosederivaten, Gummiarabicum und Gelatine; Auflösungsmitteln, wie Calciumcarboxymethylcellulose; Gleitmitteln, wie Talkum und Magnesiumstearat, oder dergleichen, um dessen Tabletten, Pulver, Granula und Kapseln zu bilden. Zusätzlich können diese festen Präparate unter Verwendung einer Beschichtungsbase, wie Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Hydroxypropylmethylcelluloseacetatsuccinat, Celluloseacetatphthalat oder Methacrylat-Copolymer in enterische Präparate überführt werden. Weiter können die festen Präparate durch Auflösen derselben in einem Fettsäuretriglycerid mittlerer Kette, Safloröl, Sojabohnenöl, Polyethylenglykol 400 oder dergleichen zu weichen Kapseln geformt werden. Bezüglich Präparaten für die parenterale Verabreichung kann die Verbindung beispielsweise mit Wasser, Ethanol, Glycerin, üblicherweise verwendeten Tensiden und dergleichen vereinigt werden, um deren Injektionen zu bilden. Alternativ kann sie durch Verwendung eines Grundmaterials für Suppositorien zu Suppositorien geformt werden.
Ihre Dosis variiert abhängig vom Alter, Gewicht und Zustand des zu behandelnden Patienten, der therapeutischen Wirkung, dem Dosierungsverfahren und dem Dosierungszeitraum. Im Fall der oralen Verabreichung wird das Präparat 1 bis 3 mal täglich in einem Bereich von 1 - 2000 mg/Tag, vorzugsweise 10 - 200 mg/Tag, verabreicht.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend spezieller durch Bezugsbeispiel, Testbeispiele und Beispiele beschrieben. Jedoch sollen diese Beispiele die Erfindung nicht beschränken.

Bezugsbeispiel:

< Herstellung eines kristallinen Zinkkomplexes von L-Carnosin>

In 100 ml Methanol wurden 3,5 g Natriumhydroxid gelöst, wozu 9,96 g L-Carnosin gegeben wurden, so daß eine gleichförmige Lösung gebildet wurde. Eine Lösung mit 9,67 g Zinkacetatdihydrat, das in 145 ml Methanol gelöst war, wurde über 30 Minuten tropfenweise unter Rühren zu der zuerst erwähnten Lösung gegeben. Als Folge trat allmählich ein weißer Niederschlag auf. Nach Beendigung des Zutropfens wurde die Mischung zwei Stunden gerührt und dann über Nacht stehengelassen. Danach wurde die Mischung filtriert, und der resultierende Filterkuchen wurde mit 140 ml Wasser gewaschen und 5 Stunden bei 80ºC an Luft getrocknet, wodurch man 12,4 g weißes Pulver in Form von Kristallen erhielt.
IR (KBR) cm&supmin;¹ : 3292, 1626, 1563, 1389, 1262, 1230, 1117, 1060, 1030, 999, 982, 883, 787
Elementaranalyse (bestimmt als C&sub9;H&sub1;&sub2;N&sub4;O&sub3;Zn): Berechnet (%) Gefunden (%) Röntgenbeugungsmuster: Gitterabstand (d; Angström) Relative Intensität (%; I/I&sub0;)

Testbeispiel 1:

< Osteogenese-stimulierende Wirkung>

Die Osteogenese-stimulierende Wirkung des Zinkkomplexes von L- Carnosin wurde durch den Calciumgehalt, den Zinkgehalt, die alkalische Phosphatase-Aktivität und den DNA-Gehalt in der femoralen Diaphyse von verwendeten jungen Ratten bestätigt. Zinksulfat wurde als Vergleichsverbindung verwendet.

(Materialien und Verfahren)

Junge Wistar-Ratten wurden unter Verwendung von fünf Ratten pro Gruppe verwendet. Unter Verwendung einer Lösung, die durch Lösen des L-Carnosin-Zinkkomplexes in 1 N Salzsäure und Einstellen des pH auf 7 mit 1 N Natriumhydroxid erhalten wurde, und einer Lösung mit in destilliertem Wasser gelöstem Zinksulfat wurde das zu testende Mittel bzw. die Vergleichsverbindung jeweiligen Gruppen oral verabreicht. Einer Kontrollgruppe wurde lediglich. Lösungsmittel oral verabreicht.
Das zu testende Mittel wurde 3 Tage einmal täglich in einer Menge verabreicht, die 5,5 mg/kg Körpergewicht bezüglich Zink entsprach. Nach Verstreichen eines 24-stündigen Zeitraums nach der letzten Dosis wurden die Ratten geopfert, und unter leichter Etheranästhesie wurden jeder Ratte die femoralen Bereiche entnommen. Weiche Gewebe und Knochenmark wurde vom femoralen Bereich entfernt. Die Diaphyse und Epiphyse (einschließlich methaphysealer Gewebe) wurden voneinander abgetrennt, so daß Fragmente der femoralen Diaphyse gebildet wurden.

(Messung des Calciumgehalts im Knochen)

Das femorale Diaphyse-Gewebe wurde 24 Stunden bei 640ºC verascht, um die resultierende Asche zu wiegen. Danach wurde die Asche in 6 N Salzsäure gelöst, um deren Calciumgehalt mittels Atomabsorptionsspektroskopie zu messen. Der Calciumgehalt im Knochen wurde als mg pro g Knochenasche ausgedrückt.

(Bestimmung der alkalischen Phosphatase-Aktivität)

Das femorale Diaphyse-Gewebe wurde in 3 ml eiskalte 6,5 mM Barbital-Pufferlösung (pH: 7,4) eingetaucht und dann in Stücke geschnitten, um es mit einem Potter-Blvehjem-Homogenisator, der mit einem Teflon-Pistill ausgestattet war, einheitlich zu mahlen. Das so gemahlene Gewebe wurde 60 Sekunden lang mit einer Ultraschall-Auflösungsvorrichtung aufgelöst. Das so aufgelöste Gewebe wurde 5 Minuten bei 600 x g zentrifugiert. Die so erhaltene Überstandsflüssigkeit wurde zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität verwendet. Die alkalische Phosphatase-Aktivität wurde gemäß dem Wallter-Schutt-Verfahren bestimmt [Bergmeyer HU (Herausgeber), Methods of enzymatic analysis, Vol. 1 - 2, Academic Press, New York, Seiten 856 -860 (1965)]. Die enzymatische Aktivität wurde als Mikromol p- Nitrophenol ausgedrückt, das pro Minute bei 1 mg Protein isoliert wurde. Die Proteinkonzentration wurde gemäß dem Verfahren von Lowry et al. [J. Biol. Chem., 193, 265 - 273 (1951)] gemessen.

(Messung des Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Gehalts)

Ein kleines Fragment der femoralen Diaphyse wurde einer Homogenisierung für Knochengewebe unterzogen, anschließend schüttelte man es zusammen mit 4,0 ml 0,1 N Natriumhydroxid- Lösung, die mit Eis gekühlt war. Nachdem das so behandelte Homogenisat einer Alkali-Extraktion unterzogen worden war, wurde der Extrakt 5 Minuten bei 10000 x g zentrifugiert. Der so erhaltene Flüssigkeitsüberstand wurde zur Messung gemäß dem Ceriotti-Verfahren vewendet [J. Biol. Chem., 214, 39-77 (1955)]. Der DNA-Gehalt wurde als Gesamt-DNA-Gehalt (mg) pro Gramm nasses Knochengewebe ausgedrückt.

(Messung des Zinkgehalts)

Ein Fragment der femoralen Diaphyse wurde mit Salpetersäure verdaut, [Biochem. Pharmacol., 36, 4007-4012 (1986)], um den Zinkgehalt mittels Atomabsorptionsspektroskopie zu messen. Der Zinkgehalt wurde als Mikrogramm Zink pro Gramm nasser Knochen ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Die Daten sind als Durchschnittswert ± Standardabweichung gezeigt. Der signifikante Unterschied wurde unter Verwendung des Student-t-Tests bestimmt. Wenn der P-Wert eines Ergebnisses nicht größer als 0,05 war, wurde das Ergebnis statistisch als signifikant unterschiedlich angesehen. Tabelle 1 Calcium-Gehalt(mg/g Knochenasche) Alkalishe Phosphatse(µMol/min/mg Protein) DNA (mg/g nassen Knochen) Zink (µg/g nassen Knochen)
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, steigert Zinksulfat den Zinkgehalt, den Calciumgehalt und die alkalische Phosphatase- Aktivität in der femoralen Diaphyse. Jedoch wurde keine signifikante Veränderung im DNA-Gehalt erzeugt. Andererseits steigert der L-Carnosin-Zinkkomplex den DNA-Gehalt zusätzlich zum Zinkgehalt, Calciumgehalt und zu der alkalischen Phosphatase-Aktivität. Wie oben beschrieben, wurde bestätigt, daß, wenn L-Carnosin-Zinkkomplex und Zinksulfat gesondert in den gleichen Mengen bezüglich Zink (5,5 mg/kg Körpergewicht) verabreicht wurden, der L-Carnosin-Zinkkomplex eine stärkere Osteogenese-stimulierende Wirkung ausübte als Zinksulfat.

Testbeispiel 2:

Unter Verwendung von männlichen und weiblichen Wister-Ratten mit 150 bis 200 g Gewicht, 10 Ratten pro Gruppe, wurde der kristalline Zinkkomplex von L-Carnosin jeder Ratte mit einer Dosis von 10 g/kg Körpergewicht oral verabreicht. Als über 7 Tage Beobachtungen vorgenommen wurden, traten in beiden Rattengruppen keine Todesfälle auf. Andererseits war bekannt, daß der LD&sub5;&sub0;-Wert für die orale Verabreichung von Zinksulfat 1374 mg/kg beträgt [Safety Evaluation (II) for Chemical Substances, The Chemical Daily Co., Ltd., (1983)], und Zinksulfat wird von Nebenwirkungen wie Erbrechen, Übelkeit und Diarrhoe begleitet. Demgemäß wurde bestätigt, daß der L Carnosin-Zinkkomplex eine höhere Sicherheit als Zinksulfat aufweist. Beispiel 1: Kristalliner L-Carnosin-Zinkkomplex Laktose Maisstärke Kristalline Cellulose
Die obigen Bestandteile wurden gleichförmig gemischt und mit 200 ml einer 7,5%-igen wäßrigen Lösung von Hydroxypropylcellulose versetzt. Die resultierende Mischung wurde mittels einer Extrusionsgranulationsvorrichtung unter Verwendung eines Siebs mit 0,5 mm Querschnitt zu Granula geformt. Die so geformten Granula wurden sofort mittels eines "Marumerizers" rundgemacht und dann getrocknet, wodurch ein Granulat-Präparat bereitgestellt wurde. Beispiel 2: Kristalliner L-Carnosin-Zinkkomplex Laktose Maisstärke Kristalline Cellulose Calciumcarboxymethylcellulose Magnesiumstearat
Die Bestandteile der obigen Zusammensetzung wurden gleichförmig gemischt, um mittels einer Einzelformungs- Tablettiermaschine, die mit einem Pistill mit 7,5 mm Durchmesser ausgestattet war, Tabletten zu bilden, von denen jede ein Gewicht von 200 mg aufwies.
Die so gebildeten Tabletten wurden mit einer Beschichtungslösung sprühbeschichtet, welche die folgende Zusammensetzung aufwies, um ein Beschichtungsgewicht von 10 mg zu ergeben, wodurch ein enterisches fumbeschichtetes Tabletten-Präparat bereitgestellt wurde. Zusammensetzung der Beschichtungs lösung: Hydroxypropylmethylcellulosephthalat Glycerinfettsäureester Methylenchlorid Gebleichtes Bienenwachs Isopropanol

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT

Die Osteogenese-Promotoren gemäß der vorliegenden Erfindung, die als aktiven Bestandteil das Zinksalz oder den Zinkkomplex von L-Carnosin umfassen, sind in ihrer Wirkung, den Calciumgehalt, den Zinkgehalt, den DNA-Gehalt und die alkalische Phosphatase-Aktivität in Knochen zu erhöhen, ausgezeichnet und weisen äußerst geringe Toxizität und Nebenwirkungen auf. Diese Mittel sind deshalb als Arzneimittel für die Behandlung von Brüchen, Osteomalazie, Osteoporose und Schmerzen im unteren Rücken nützlich, welche durch eine Störung des Knochenmetabolismus oder der Osteogenese verursacht werden. Die vorliegende Erfindung weist auch das Merkmal auf, daß diese Mittel diese Wirkungen durch orale Verabreichung besitzen.

Claims

1. Osteogenese-Promotor, der als wirksamen Bestandteil ein Zinksalz oder einen Zinkkomplex von L-Carnosin umfaßt.

2. Osteogenese-Promotor nach Anspruch 1, in dem der Promotor weiter ein pharmazeutisch annehmbares Adjuvans umfaßt.

3. Osteogenese-Promotor nach Anspruch 2, in dem der Promotor weiter mindestens ein Mitglied umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hilfsstoffen, Bindemitteln, Tensiden und Gleitmitteln besteht.

4. Osteogenese-Promotor nach Anspruch 2, in dem der Promotor weiter einen Beschichtungs-Grundstoff umfaßt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Hydroxypropylmethylcelluloseacetatsuccinat, Celluloseacetatphthalat und Methacrylat- Copolymer besteht.

5. Osteogenese-Promotor nach Anspruch 2, in dem der Promotor weiter ein Lösungsmittel umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Fettsäuretriglycerid mit mittlerer Kettenlänge, Safloröl, Sojabohnenöl, Polyethylenglykol 400, Wasser, Ethanol und Glycerin besteht.

6. Osteogenese-Promotor nach Anspruch 3, in dem der Promotor eine Tablette, ein Pulver, ein Granulat oder eine Kapsel, die bzw. das zur oralen Verabreichung geeignet ist, eine Lösung, die für die parenterale Injektion geeignet ist, oder ein Suppositonum ist.

7. Osteogenese-Promotor nach Anspruch 1, in dem der Promotor 1 bis 2000 mg wirksamen Bestandteil enthält.

8. Osteogenese-Promotor nach Anspruch 7, in dem der Promotor 10 bis 200 mg wirksamen Bestandteil enthält.