-
Diese Erfindung betrifft im allgemeinen die
pharmazeutischen Wissenschaften und insbesondere die
kommerzielle Herstellung von Liposomen und anderen
Vesikeln mit einer Lipid-Doppelschicht.
-
Vesikel mit einer Lipid-Doppelschicht sind
geschlossene mikroskopische Vesikel, die im wesentlichen
aus einzelnen Molekülen mit einem polaren (hydrophilen)
und einem nichtpolaren (lipophilen) Teil gebildet werden,
obwohl wahlweise Cholesterole und andere Sterole enthalten
sein können. Die hydrophilen Gruppen können Phosphat,
Glycerylphosphat, Carboxy, Sulfat, Amino, Hydroxy, Cholin
oder andere polare Gruppen sein. Beispiele für nichtpolare
Gruppen sind gesättigte oder ungesättigte
Kohlenwasserstoffe wie Alkyl, Alkenyl oder andere lipide
Gruppen. Liposome sind eine Untergruppe dieser
doppelschichtigen Vesikel und bestehen im wesentlichen aus
phospholipiden Molekülen. Wenn diese Moleküle Wasser
ausgesetzt werden, bilden sie eine Doppelschichtmembran,
wobei in jeder Schicht die lipiden Enden der Moleküle, die
in der Mitte der Membran vereint sind, und die
gegenüberliegenden polaren Enden die Innen- bzw.
Außenfläche der Doppelschichtmembran bilden. Somit weist
jede Seite der Membran eine hydrophile Oberfläche auf,
während das Innere der Membran ein lipophiles Medium
beinhaltet. Diese Membrane können in Gegenwart von
überschüssigem Wasser zunächst in einem System von
konzentrisch geschlossenen Membranen um einen inneren
wässerigen Raum in einer Weise angeordnet werden, die den
Schichten einer Zwiebel nicht unähnlich ist. Jede der
Membrane ist eine ungebrochene doppelschichtige Lage von
lipiden Molekülen. Bei zusätzlicher Energie, wie
Homogenisierung, Beschallung oder Extrusion, können diese
Vesikel mit mehreren Lamellen (MLV) kleine Vesikel mit
einer Lamelle (SUV) bilden. Die technischen Aspekte der
Liposombildung sind in der Wissenschaft gut bekannt, wie
auch die Tatsache, daß Liposome zur Einkapselung
biologisch aktiver Substanzen vorteilhaft sind.
-
Während Liposome deutliche Vorteile bieten,
insbesondere als Träger zur Abgabe von Pharmazeutika, ist
auch bekannt, daß Liposome und ihre Arzneimittelinhalte in
wässeriger Dispersion verhältnismäßig instabil sein
können. Daher haben Fachleute versucht, die
verhältnismäßig kurze Haltbarkeitsdauer von einigen
liposomalen Produkten durch Dehydratisierung der
Dispersion zum Beispiel durch Lyophilisierung
(Gefriertrocknung) der wässerigen Dispersion zu
verlängern, um ein stabiles Pulver zu erhalten, das über
einen langen Zeitraum gelagert werden kann und aus dem mit
einem wässerigen Medium eine Liposomdispersion
rekonstituiert werden kann.
-
Frühe Versuche zur Dehydratisierung von Vesikeln
mit einer Lipid-Doppelschicht, wie Liposomen, waren nicht
erfolgreich, zum Teil aufgrund der Tatsache, daß
Lipid-Doppelschichtmembrane in Gegenwart der wässerigen
Phase am stabilsten sind, die die molekulare Ausrichtung
aufrechterhält. Eine deutliche Verbesserung bringt jedoch
die Verwendung verschiedener Stabilisierungsmittel der
hydrophilen Membran, z.B. Kohlenwasserstoffe wie Sucrose,
welche die einzelnen Lipidpartikel während der Trocknung
stützen sollen. Siehe zum Beispiel Racker (1972) J.
Membrane Biol. 10, 221-235, und U.S. Patent 4.229.360 an
Schneider, et al.
-
Ungeachtet der Verwendung von Stabilisierungsmittel
der hydrophilen Membran, die ein visuell annehmbares
Liposompulver liefern können, erzielen herkömmliche
Verfahren zur Rekonstitution des dehydratisierten oder
lyophilisierten Pulvers, d.h., die Zugabe einer wässerigen
Phase bei kontrollierter Raumtemperatur (15º bis 30º laut
Definition der U.S. Pharmacopeia), zur Bildung der
endgültigen Liposomdispersion oftmals unvorhersagbare
Ergebnisse. Insbesondere bildet das Pulver oft äußerst
große Liposome oder Lipidglobuli anstatt Liposome
zurückzubilden, die im Vergleich zur anfänglichen
Liposomdispersion eine vergleichbare Größe,
Größenverteilung und Integrität aufweisen. Daher wird ein
verläßliches Verfahren zur Rekonstitution von
dehydratisierten Vesikelpulvern mit einer Lipid-
Doppelschicht und insbesondere von lyophilisierten Pulvern
zu brauchbaren Dispersionen mit vorhersagbaren
Größenverteilungen gewünscht.
-
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur
Rekonstitution von getrockneten Vesikeln mit einer Lipid-
Doppelschicht geschaffen, das die Zugabe einer Menge einer
flüssigen wässerigen Phase mit einer Temperatur von
weniger als etwa 15º zu den getrockneten Partikeln zur
Bildung einer wässerigen partikulären Dispersion umfaßt.
Vorzugsweise sind die doppelschichtigen Vesikel Liposome
und besonders bevorzugt sind die Liposome kleine Vesikel
mit einer Lamelle, die bei einer Temperatur von etwa 2º
bis 8º rekonstituiert werden. Der Begriff "Vesikel mit
Lipid-Doppelschicht", wie hierin verwendet, beschreibt
eine mikroskopische Zelle oder ein Bläschen, das durch
eine oder mehrere Lipid-Doppelschichtmembrane begrenzt
wird und Liposome einschließt. Der Begriff "getrocknetes
Vesikel" oder "getrocknete Liposome" betrifft das Produkt,
das durch Verdampfen von Wasser von einer Dispersion der
entsprechenden Lipidvesikel erhalten wird, und der Begriff
"Rekonstitution" betrifft die Bildung einer Dispersion der
Vesikel oder Liposome in einer flüssigen Phase in einer
Weise, bei der im wesentlichen die Größe und
Größenverteilung der Vesikel kontrolliert wird, um diese
Parameter auf Werten zu halten, die jenen in der
Ausgangsdispersion vor der Dehydratisierung ähnlich sind.
Alle Temperaturen sind hierin in Grad Celsius angegeben.
-
Ohne an eine besondere Theorie gebunden sein zu
wollen, scheint es, daß die übliche Hydratisierung von
getrocknetem Vesikelpulver bei Raumtemperatur (15º bis
30º) die membranstützenden Stabilisierungsmittel vor dem
ausreichenden Einschluß des Wassers zur Stabilisierung der
einzelnen Lipidmoleküle in der anfänglichen
Doppelschichtform auflöst.
-
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung werden
die Parameter der Rekonstitutionstemperatur, Menge und
Form einer oder mehrerer Stabilisierungsmittel der
hydrophilen Membran und andere Faktoren, wie zum Beispiel
Puffer, kontrolliert, so daß eine optimale Rekonstitution
der Vesikel unter zahlreichen Bedingungen gegeben ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
-
Die Figur ist eine Graphik des hierin
beschriebenen, 650 - 750 nm Lichtstreuungsindexes, der für
verschiedene Chargen von dehydratisiertem liposomalen Amphotericin
B-Pulver über der Temperatur der rehydra- tisierenden
wässerigen Phase (Wasser für Injektionszwecke, USP)
aufgetragen ist.
Genaue Beschreibung
-
Wie oben erwähnt, sind Verfahren zur Bildung der
anfänglichen Liposomdispersion in der Wissenschaft gut
bekannt und nicht Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Gleichermaßen sind bestimmte Verfahren zur
Dehydratisierung der anfänglichen Liposomdispersion bekannt,
einschließlich der Verwendung von Stabilisierungsmitteln
für die hydrophile Membran, auf die oben verwiesen wurde.
Daher wird hierin nur eine allgemeine Beschreibung der
Liposomherstellung und -trocknung mit besonderem
Schwerpunkt auf die Erfindung gegeben, d.h., die
Rehydratisierung von getrockneten Doppelschicht-Partikeln
wie Liposomen in einer Weise, die die Größe,
Größenverteilung und Integrität der Partikel in der
Ausgangsdispersion kontrolliert. Liposome, die in der
Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel MLV,
multivesikulare Liposome (MVL), große Vesikel mit einer
Lamelle (LUV) und SUV; und im allgemeinen jedes
mikroskopische Partikel mit einer Lipid-
Doppelschichtmembran. In den folgenden Beispielen ist die
Rekonstitution von getrockneten SUV mit einer
Partikelgröße von weniger als 200 nm dargestellt.
-
Techniken zur Dehydratisierung von Zellen und
Vesikeln mit einer Lipid-Doppelschicht im allgemeinen und
Liposomen im besonderen sind gut bekannt. Die
Gefriertrocknung von Liposomen und anderen Vesikeln zur Bildung
eines gefriergetrockneten Pulvers (eines Lyophilisats)
kann nach dem Verfahren durchgeführt werden, das in U.S.
Patent 4.229.360, U.S. Patent 4.857.319, und der
gleichzeitig anhängigen U.S. Anmeldung, Seriennr. 253.680,
eingereicht am 5. Oktober 1988, beschrieben ist. Liposome
können durch Sprühtrocknung oder andere Verfahren der
Blitzverdampfung, wie in der veröffentlichten Anmeldung
WO 88/06441 beschrieben, durchgeführt werden, und es
können auch andere Dehydratisierungsverfahren verwendet
werden.
-
In bezug auf die Lyophilisierung wird im
allgemeinen die anfängliche Liposomdispersion, die
vorzugsweise ein Stabilisierungsmittel der hydrophilen
Membran enthält, zunächst auf eine vorbestimmte
Temperatur, z.B. 30º bis 50º, gefroren und nach
Verfestigung der flüssigen Mischung wird sie einem
verminderten Druck (z.B. 0,1 Torr) ausgesetzt, der die
Sublimation des Eises bewirkt. Die Temperatur und der
verminderte Druck werden dann zur Entfernung der
Restfeuchtigkeit aus dem Produkt beibehalten, wie in der
Wissenschaft bekannt, und dann wird das so erhaltene
lyophilisierte Produkt verschlossen und zur Verwendung
gelagert.
-
Erfindungsgemäß wird das so erhaltene Vesikelpulver
durch Zugabe einer flüssigen wässerigen Phase unter
Temperaturbedingungen von weniger als Raumtemperatur,
d.h., weniger als etwa 15º, zu dem getrockneten
Liposompulver rekonstituiert. Vorzugsweise wird eine
wässerige Phase bei einer Temperatur von weniger als 10º
zugegeben, und besonders bevorzugt weist die flüssige
wässerige Phase eine Temperatur von etwa 2º bis etwa 8º
auf. Die flüssige wässerige Phase kann jede einer Reihe
von Lösungen enthalten, deren Zusammensetzung durch die
besondere Liposomdispersion und ihre beabsichtigte
Verwendung bedingt ist. Zum Beispiel kann steriles Wasser
für Injektionszwecke (WFI) verwendet werden wie auch 5%
Dextrose (D5W), phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder
andere Lösungen. Die flüssige wässerige Phase kann
ausreichend lange in einem Gefrierschrank aufbewahrt
werden, um die gewünschte Temperatur der Flüssigkeit zu
erzielen, oder bei liposomalen Zubereitungsformen, die
gegenüber Rehydratisierungs- bedingungen besonders
empfindlich sind, wird die wässerige Phase in eine sterile
Spritze gezogen, die in einen Gefrierschrank gegeben wird,
bis die erforderliche Temperatur erreicht ist. Im
klinischen Bereich kann nach der Infusion der kalten
wässerigen Phase in das Vesikelpulver und der
anschließenden Rehydratisierung der Vesikel die Temperatur
zur weiteren Verarbeitung oder Injektion nach Wunsch
erhöht werden, ohne die Größenverteilung der Vesikel zu
beeinträchtigen.
-
In dem folgenden Beispiel wird ein getrocknetes
Liposompulver, das aus einer Ausgangsdispersion von SUV
hergestellt wurde, die das Antimykotikum Amphotericin B
enthält, durch das erfindungsgemäße Verfahren
rekonstituiert. Die Ausgangsdispersion der Liposome wurde nach
der Beschreibung in der Patentveröffentlichung EPA
0317120 hergestellt. Im allgemeinen wurde zunächst ein
löslicher Komplex zwischen Amphotericin B und
Distearoylphosphatidylglycerol in einer Lösung von
Chloroform und Methanol, angesäuert auf einen pH von etwa
1,0 bis 3,0, gebildet. Dieser Amphotericin
B/Phospholipid-Komplex wurde dann mit Phophatidylcholin
und Cholesterol vermischt und getrocknet, um ein
Lipidpulver zu erhalten. Die Liposomzubereitung wurde
durch Hydratisierung dieses Lipidkomplexpulvers mit einem
wässerigen Puffer mit einem pH von etwa 5,5 oder weniger
und mit Sucrose als Membran-Stabilisierungsmittel nach den
Angaben von U.S. Patent 4.857.319, und durch Anwendung
einer Scherkraft wie Beschallung oder Homogenisierung zur
Bildung der SUV durchgeführt. In diesem Beispiel wurden
Liposome bei Verwendung der in U.S. Patent 4.753.788
beschriebenen Homogenisierungsvorrichtung gebildet. Auf
die Offenbarung beider Patente, die in diesem Absatz
erwähnt sind, wir hierin Bezug genommen. Die anfängliche
Liposomdispersion enthielt vor der Dehydratisierung
Amphotericin B-haltige Liposome mit einer Lamelle und
einem mittleren Durchmesser von weniger als 200 nm und
einer geringen Größenverteilung der Partikel, gemessen
durch die Wellenlängenabhängigkeit der Lichtstreuung in
einem nichtabsorbierenden Bereich des sichtbaren Spektrums
(650-750 nm), von etwa 4,0.
-
Acht Chargen der anfänglichen Amphotericin
B-Liposomzubereitungen wurden dann in einzelne Ampullen
gefüllt und lyophilisiert. Nach der Lyophilisierung wurden
das Liposompulver in allen Ampullen mit Stickstoff gespült
und hermetisch verschlossen.
-
Die Größenverteilung der Partikel in den
rekonstituierten Liposomdispersionen, wie in Tabelle I und
der Figur angeführt, wurde durch Messung der
Wellenlängenabhängigkeit der Lichtstreuung in einem
nichtabsorbierenden Bereich des sichtbaren Spektrums (650-750 nm)
bewertet, eine Technik, die in Long, et al., J. Colloid
Interface Sci. 42, 545 (1973) beschrieben ist, eine
Offenbarung, auf die hierin Bezug genommen wird. Die
negative Neigung einer Darstellung von log (Absorbanz)
gegenüber log (Wellenlänge) für dieses Spektralfenster
wird als Streuungsindex (n) bezeichnet. Für Dispersionen
von Partikeln, die im Verhältnis zu der Wellenlänge des
Streulichts klein sind, beträgt der Index etwa 4,0. Die
Gegenwart von Aggregaten oder großen Partikeln wird durch
eine Verringerung des Streuungsindexes auf Werte
angezeigt, die unter Eins liegen können. Während die
Freisetzbarkeit von pharmazeutischen Zubereitungen auf der
Toxizitätstestung und einer Reihe anderer Tests beruht,
korreliert ein Indexwert von etwa 3,0 oder mehr nach dem
modifizierten Long et al. Verfahren mit einer äußerst
guten Akzeptanz vom Standpunkt der Partikelgröße für die
parenterale Verwendung der Amphotericin
B-Liposomzubereitungen. Ein Indexwert von etwa 2,5 oder mehr
korreliert mit guter Akzeptanz vom Standpunkt der
Partikelgröße für solche Zubereitungen. Für die
Zubereitungen dieses Beispiels betrug der Streuungsindex
vor der Lyophilisierung etwa 3,9 bis 4,1.
-
Die Liposomzubereitungen in den Ampullen wurden
durch Infusion von WFI bei bestimmten Temperaturen
rekonstituiert. In Spalte 1 von Tabelle I wurde das Gefäß,
das WFI bei 4º enthielt, dem Gefrierschrank entnommen und
eine Teilmenge von WFI in eine Spitze gezogen. Die Spritze
wurde dann in den Gefrierschrank gebracht, um das WFI,
nachdem es Raumtemperatur ausgesetzt worden war und vor
der Injektion in die Ampulle, auf 4º zu bringen. Die
Spalte 2 wurde auf 6º für 4º WFI geschätzt, das dem
Gefrierschrank entnommen und ohne Temperaturausgleich in
die Ampullen injiziert wurde. Spalte 3 und 4 beziehen sich
auf die Lagertemperatur, von der angenommen wurde, daß sie
sich nicht signifikant verändert. Alle anderen
Rehydratisierungen wurden durch Entfernen eines Gefäßes,
das WFI mit der bestimmten Temperatur enthielt, aus einer
Umgebung mit kontrollierter Temperatur und Hydratisierung
des Liposompulvers ohne Temperaturausgleich des WFI in der
Spritze durchgeführt. In der Klinik wären alle Ampullen
bei 4º gelagert. Alle Ampullen in dem Beispiel wurden vor
Injektion der wässerigen Phase bei Raumtemperatur
gelagert. Nach der Infusion des kalten Wassers wurde jede
der Ampullen ein bis zwei Minuten heftig geschüttelt und
dann zehn Minuten vor der Bewertung der Größenverteilung
der Partikel, wie in dem vorangehenden Absatz beschrieben,
auf 65º erwärmt.
-
Die Ergebnisse zeigen, daß die Rehydratisierung
unter Raumtemperatur (d.h., weniger als 15º) vom
Standpunkt der Partikelgröße bei allen getesteten Chargen
der Amphotericin B-Liposomzubereitungen eine gute
Akzeptanz zur parenteralen Verwendung ergibt. Die
Rehydratisierung bei Temperaturen von 4º, 6º oder 10º
ergab für alle Chargen eine äußerst gute Akzeptanz. Im
Gegensatz dazu waren bei 20º vier Chargen nicht annehmbar,
eine war gut und nur drei besonders gut und bei
Raumtemperatur, in einer typischen Hospital- oder
Klinikumgebung, d.h. etwa 26º, waren fünf Chargen
unannehmbar.
-
Die Erfindung schafft somit eine beständige und
verläßliche Rekonstitution von dehydratisierten
liposomalen Zubereitungen durch Verwendung einer kalten
wässerigen Phase als Hydratisierungsmittel. Besonders
vorteilhafte Ergebnisse werden in der Rekonstitution von
lyophilisierten liposomalen Zubereitungen erhalten, bei
welchen die geringe Temperatur die Schwankung aufgrund
anderer Faktoren in der Rekonstitution von ähnlichen
Chargen des Liposomprodukts bei Raumtemperatur beseitigt.
TABELLE I
WFI Temperatur (Grad Celsius)
CHARGE