DE69002365T2

DE69002365T2 - Antivirale Zusammensetzung.

Info

Publication number: DE69002365T2
Application number: DE1990602365
Authority: DE
Inventors: Junko Nozaki; Hiroyuki Takase
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-04-06
Filing date: 1990-04-05
Publication date: 1993-11-18
Anticipated expiration: 2010-04-06
Also published as: CA2013843A1; DE69002365D1; EP0391410A1; EP0391410B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des sulfatierten Polysaccharids DS-4152 oder der Derivate davon, worin Natrium im sulfatierten Polysaccharid DS-4152 durch ein von Natrium verschiedenes pharmazeutisches Metall ersetzt ist, zur Herstellung einer antiviralen Zusammensetzung.
Das sulfatierte Polysaccharid DS-4152 ist eine Substanz, die beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung Nr. 246,654, veröffentlicht am 25. November 1987, offenbart ist. Bekanntlich besitzt diese Substanz eine Antitumoraktivität sowie eine die Vaskularisierung inhibierende Aktivität. Eine antivirale Aktivität dieser Substanz war jedoch bisher nicht bekannt.
Andererseits besitzt bekanntlich Dextransulfat, ein sulfatiertes Polysaccharid, antivirale Aktivität (Proc. Nati- Acad. Sci. USA, 85 6132 (1988), Antimicrob. Agents Chemther. 32 1742 (1988)). Aus klinischer Sicht ist jedoch diese Substanz nicht zufriedenstellend insofern, als sie eine ernsthafte nachteilige Wirkung, nämlich einen starken anticoagulierenden Effekt, besitzt.
Die EP-A-240 098 offenbart Zusammensetzungen, welche als aktiven Bestandteil ein natürliches oder synthetisches Oligo- oder Polysaccharid enthalten, das wenigstens eine S- Oxosäuregruppe aufweist, die an das Saccharidkohlenstoffatom über eine Brückengruppe mit niedrigem Molekulargewicht gebunden ist. Es wird berichtet, daß die Zusammensetzungen zur Behandlung von retroviralen Erkrankungen geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des sulfatierten Polysaccharids DS-4152 oder der Derivate davon, worin Natrium von DS-4152 durch ein von Natrium verschiedenes pharmazeutisches Metall ersetzt ist, zur Herstellung eines antiviralen pharmazeutischen Mittels.
DS-4152 ist ein sulfatiertes Polysaccharid, erhältlich aus dem Polysaccharid DF-4639 [vergleiche JP-A-56-67301 (der Ausdruck "JP-A" steht für "ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung")], das aus einer Kultur des Bakterienstamms Arthrobacter sp. AT-25 (hinterlegt bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan als Micrococcus sp. AT-25 unter der Hinterlegungsnummer FERM P- 5255, und hinterlegt gemäß Budapester Vertrag als Arthrobacter sp. AT-25 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1357), indem man pyrogene Substanzen davon abtrennt, die darin enthalten sind und ein Molekulargewicht von nicht weniger als 15 x 10&sup4; aufweisen, wobei man geeignete Fraktionierungstechniken, wie z.B. Gelfiltration, Ultrafiltration, Dialyse und/oder Alkoholfällung anwendet.
Das sulfatierte Polysaccharid DS-4152 besitzt folgende physikalisch-chemische Eigenschaften:
(1) Molekulargewicht (gemäß der Gelfiltrationsmethode):
etwa 29000 ± 3000
(2) Elementaranalyse (Bereiche für 5 Präparationen):
C, 24,42 bis 25,76%; H, 3,34 bis 3,98%; N, 0,51 bis 0,89%; S, 10,6 bis 11,7%; P, 0,77 bis 1,06%.
(3) Zuckergehalt und Proteingehalt:
Zuckergehalt (%): etwa 57 ± 3 (Phenol-Schwefelsäuremethode, mit Galactose als Standard).
Proteingehalt (%): 1 ± 0,5 (Lowry-Folin-Methode, mit Rinderserumalbumin als Standard)
(4) Spezifische Drehung:
[a]25D = etwa -37º ± -1º (0,5% wäßrige Lösung)
(5) Hauptabsorptionsbanden im Infrarotabsorptionsspektrum:
1240, 840 (Schulter), 810 (cm&supmin;¹; KBr)
(6) Löslichkeit:
freilöslich in Wasser; praktisch unlöslich in Ethyläther, Benzol, Chloroform, Methanol, Ethanol und anderen organischen Lösungsmitteln.
(7) Farbreaktionen:
Es sind positive Phenol-Schwefelsäure-, Anthronschwefelsäure-, Biuret- und Lowry-Folin-Reaktionen möglich. Durch Hydrolyse sind positive Elson-Morgan- und Ninhydrin- Reaktionen möglich. Es sind negative Carbazol- und Sakaguchi-Reaktionen möglich.
(8) Grad der Basizität, Neutralität oder Acidität:
Etwa pH 6 bis 8 (3% wäßrige Lösung)
(9) Zuckerbausteine, Sulfatgruppe und Anteil an Phosphor:
Das molare Verhältnis von D-Glucose/D-Galactose/Sulfatgruppe als SO&sub3;Na/P (D-Glukosegehalt wird als 10 gesetzt) beträgt etwa 10:61:73:6.
(10) Aminosäure- und Aminozucker-Bausteine:
Durch Analyse des Hydrolysats in einem Aminosäureanalysator ist Alanin, Glycin, Glutaminsäure, Diaminopimelinsäure, Glucosamin und Muraminsäure nachweisbar.
Das DS-4152-Derivat, worin Natrium von DS-4152 durch ein anderes pharmazeutisches Metall ersetzt ist, kann mit Hilfe üblicher Salzaustauschmethoden, wie z.B. einem Verfahren unter Verwendung einer Ionenaustauschchromatographie, hergestellt werden.
Das obenerwähnte von Natrium verschiedene pharmazeutische Metall umfaßt Alkalimetalle, wie Kalium und Lithium, Erdalkalimetalle, wie Calcium, Magnesium und dergleichen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist wirksam gegenüber RNA-Viren, wie z.B. Retroviren, wie dem AIDS-Virus (human immunodeficiency virus; HIV), wie z.B. HIV-1 oder HIV-2, und dem Human-T-Zellen Leukämievirus (HTLV), z.B. HTLV-I oder HTLV-II, sowie gegenüber DNA-Viren, wie z.B. Viren des Typs Herpesviridae, wie z.B. dem Cytomegalovirus, und dem Typ I oder Typ II Herpes Simplex Virus und dem Typ C, Typ B oder Typ A Hepatitisvirus. Die Verabreichung von DS-4152 oder den Derivaten davon kann erwartungsgemäß besonders wirksam gegenüber HIV und Viren des Typs Herpesviridae sein.
DS-4152 oder die Derivate davon sind Substanzen, die hohe Sicherheit bieten. Deren akute intravaskuläre Toxiztät (LD&sub5;&sub0;) beträgt in Mäusen (slc-ddy-Stamm, männlich, 6 Wochen alt) nicht weniger als 2000 mg/kg.
DS-4152 oder die Derivate davon können zusammen mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern oder Excipienten, wie Lactose, Maisstärke, Talkum und Magnesiumstearat in Dosisformen, wie Lösungen, Pulvern, Granulaten, Tabletten oder injizierbaren Lösungen oder Suppositorien, mit Hilfe herkömmlicher pharmazeutischer Techniken formuliert werden.
DS-4152 oder die Derivate davon können oral, intravenös oder intradermal, vorzugsweise intravenös, verabreicht werden. Im allgemeinen liegt die tägliche Dosis im Bereich von 0,1 bis 10 g pro erwachsenem Menschen bei oraler Verabreichung und im Bereich von 10 bis 500 mg pro erwachsenem Menschen im Fall einer intravenösen Verabreichung.
Bei in vitro Untersuchungen hat sich ergeben, daß DS-4152 die Proliferation von Wirtszellen nicht beeinflußt, jedoch einen selektiven wachstumsinhibierenden Effekt auf HIV und auf Viren des Typs Herpesviridae, insbesondere Typ I oder Typ II Herpes Simplex Viren (HSV-1 oder HSV-2) zeigt, DS-4152 oder die Derivate davon können deshalb als ausgezeichnete antivirale Wirkstoffe bezeichnet werden, die bei der Behandlung von infektiösen Erkrankungen nützlich sind, welche durch verschiedene Virusarten verursacht werden, wie z.B. AIDS, AIDS- related complex, wie disseminierte Histoplasmose, bronchiale und pulmonale Candidiasis, einschließlich pneumocystischer Pneumonie, non-Hodgkinsches Lymphom, Kaposissarcom und Herpesinfektionen. Die Verbindungen sind außerdem wirksam bei der Prävention der Entwicklung viraler Erkrankungen in Trägern entsprechender Viren.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung ohne jedoch deren Schutzbereich zu beschränken.

Beispiel 1

Anti-HIV-Aktivität

Materialien

(1) HIV-1, Stamm LAV1 verwendet man als Virus und CEM/C113- Zellen verwendet man als Wirtszellen.
(2) RPMI-1640-Medium (hergestellt von Gibco), supplementiert mit 10% inaktiviertem fetalem Kälberserum verwendet man als Kulturmedium.

Methode

Die 3 Tage vorkultivierten Wirtszellen werden mit HIV bei einer MOI (Muliplizität der Infektion) von 0,01 bis 0,05 stimuliert. Nach einer 90-minütigen Absorptionsperiode suspendiert man die Zellen im Kulturmedium in einer Konzentration von 5 x 10&sup5; Zellen /ml. 0,5 ml der Suspension, 0,4 ml Kulturmedium und 0,1 ml einer jeden Testsubstanzlösung gibt man in jede der Vertiefungen einer Multiplatte mit 24 Vertiefungen. Die Inkubation erfolgt bei 5% CO&sub2;-95% Luft.
Kontrollvertiefungen enthalten 0,1 ml physiologische Kochsalzlösung anstelle der Testsubstanzlösung.
Man bestimmt die Zellzahl in bestimmten Zeitintervallen und bestimmt die prozentuale Zell-Vermehrungsfähigkeit mit Hilfe der Trypanblau-Exclusionstechnik. Zur gleichen Zeit bestimmt man den Prozentsatz HIV-Antigen-positiver Zellen (IFA- positive Rate) mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz- Antikörper(IFA)-Technik. Die erhaltenen Ergebnisse sind in folgender Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 Meßgröße Tage nach Infektion DS-4152 (ug/ml) Infizierte Zellen Nicht infizierte Zellen Zellzahl (Log.Zellen/ml) Zellvermehrungsfähigkeit (%) IFA Positiv Rate (%)
Wie sich aus den in Tabelle 1 gezeigten Daten ergibt, werden in dosisabhängiger Weise die Vermehrungsfähigkeit der Zellen erhöht und der Anteil IFA-positiver Zellen verringert. Die anti-HIV Akitivität von DS-4152 wird somit bestätigt. Sogar dann, wenn nicht-infizierte Zellen mit DS-4152 in einer Konzentration von 100 ug/ml behandelt werden, kann keinerlei Anzeichen von Cytotoxizität beobachtet werden.

Beispiel 2

HIV-Reverse Transcriptase-inhibierender Effekt

Materialien

(1) Reverse Transcriptase von HIV:
CEM-Zellen inokuliert man mit HIV gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Die Inkubation erfolgt über einen Zeitraum von 7 Tagen und man trennt die Viruspartikel vom Kulturüberstand durch Dichtegradienten-Zentrifugation ab. Die gereinigten Viruspartikel gibt man zu einer wäßrigen Triton X-100-Lösung (Endkonzentration 0,1%) hinzu und verwendet das resultierende Gemisch als HIV-Reverse Transcriptasepräparation nach 10-minütiger Inkubation bei 37ºC.
(2) Sämtliche für das enzymatische Reaktionssystem verwendete Substanzen werden von Pharmacia bezogen, mit Ausnahme von Isotopen-markiertem Tymidintriphosphat (im folgenden bezeichnet TTP; hergestellt vom Amersham). Andere Reagenzien werden von Sigma bezogen.

Methode

Die HIV-Reverse Transcriptase-Lösung (10 ug Protein), hergestellt wie oben unter Materialien (1) beschrieben, sowie 1, 0,5 oder 0,25 ug des aktiven Bestandteils (DS-4152) gibt man zu dem im folgenden angegebenen Reaktionssystem in einem Reaktionsgefäß hinzu (Gesamtmenge 50 ug/Gefäß) und inkubiert das Gefäß 60 Minuten bei 37ºC. Die resultierenden, durch die Aktivität der Reversen Transcriptase bedingten Reaktionsprodukte quantifiziert man durch Bestimmung der Isotopen- Aufnahme in einem Flüssigscintillationszähler. Als Kontrolle verwendet man Wasser anstelle des aktiven Bestandteils.

Reaktionssystem

50 mM Tris-HCl (pH 8,0)
5 mM Magnesiumchlorid
1 mM Dithiothreitol
20 mM Kaliumchlorid
10 ug/ml Poly(A)-oligo(dT) [(γA)n(dT) 12-18]
10 nM Deoxythimidintriphosphat
1,85 10&sup4;S&supmin;¹(0,5 uCi)³H-TTP
0,1% Triton X-100
15% Glycerin Tabelle 2 Counts (DPM) Inhibition (%) (Kontrolle)

Ergebnisse

Aus den in Tabelle 2 angegebenen Daten ergibt sich, daß der aktive Bestandteil die Reverse Transcriptase-Aktivität von HIV in dosisabhängiger Weise inhibiert.

Beispiel 3

Wirkungen auf die Wirtszelloberflächen-HIV-Rezeptoren

Materialien

(1) CEM/C113-Zellen verwendet man als Wirtszellen.
(2) RPMI-1640-Medium (Gibco), supplementiert mit 10% inaktiviertem fetalem Kälberserum, verwendet man als Kulturmedium.
(3) Einen monoclonalen Antikörper gegen das OKT4A-Antigen verwendet man so, wie von Orthomune bezogen.

Methode

Den aktiven Bestandteil (DS-4152) gibt man zu 1 ml der Wirtszellen-Suspension (2,5 x 10&sup5; Zellen/ml) in einer Konzentration von 500 ug/ml hinzu und kultiviert 48 Stunden in 5% CO&sub2;-95% Luft. Zu einem Kontrollansatz gibt man das gleiche Volumen physiologischer Kochsalzlösung hinzu und führt die Kultivierung unter den gleichen Bedingungen durch. Die Zellen färbt man dann mit FITC-konjugiertem Anti-OKT4A-Antikörper an und bestimmt die Intensität der Fluoreszenz mit Hilfe eines Showa Denko Model CS-20-Zellsorters. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben. Tabelle 3 Gruppe Kanalzahl Peak Kanalzahl Kontrolle
Wie in Tabelle 3 gezeigt, ergeben die nicht mit DS-4152 behandelten Zellen (Kontrolle) nach Behandlung mit FITC- konjugiertem Anti-OKT4A-Antikörper eine Verteilung mit einem Maximum mit hoher Fluoreszenzintensität im Kanal Nr. 74.
Dagegen zeigen die vorher mit DS-4152 behandelten Zellen bei Behandlung mit dem obengenannten Antikörper eine Verteilung mit einem Maximum geringer Fluoreszenzintensität im Kanal Nr. 43. Es wird daher angenommen, daß DS-4152 das OKT4A-Antigen der kultivierten Zellen abdeckt und dadurch die Absorption von HIV-1 an das Antigen inhibiert.

Beispiel 4

Anti-HSV Aktivität

Materialien

1) Den KOS-Stamm des Typ I Herpes Simplex Virus (HSV-1) verwendet man als Virus und Vero-Zellen verwendet man als Wirtszellen.
2) MEM-Medium (hergestellt von Eiken Kagaku), supplementiert mit 1,5% inaktiviertem fetalem Kälberserum, verwendet man als Kulturmedium.

Methode

Eine Wirtszell-Suspension verteilt man in den Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen und inkubiert einen Tag bei 37ºC in 5% CO&sub2;-95% Luft. Den aktiven Bestandteil (DS-4152) gibt man in Lösung zu den jeweiligen Vertiefungen hinzu und impft unmittelbar daran anschließend mit dem Virus an. Die Kultivierung erfolgt über einen Zeitraum von 72 Stunden unter den obenerwähnten Bedingungen.
Parallel dazu wird ein System ohne virale Infektion zur Bewertung der Cytotoxizität verwendet. Die übrigen Bedingungen entsprechen den Obenerwähnten. Die Zellen werden fixiert und gefärbt und anschließend bestimmt man die Extinktion. Diejenige Konzentration, die zu einer 50%igen Inhibierung des Cytopathischen Effekts (CPIE&sub5;&sub0;) führt, bestimmt man als Index für die Anti-HSV-1-Aktivität und die 50% lethale Konzentration (CLE&sub5;&sub0;) bestimmt man als Index für die Cytotoxizität. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4
Wie sich aus Tabelle 4 ergibt, wurde gefunden, daß DS-4152 auf die Wirtszellen nicht cytotoxisch wirkt, jedoch die Proliferation von HSV-1 selektiv inhibiert.

Beispiel 5

In vitro antikoagulierende Aktivität

Materialien

(1) Dextransulfat-Natrium (hergestellt von Seikagaku Kogyo; mittleres Molekulargewicht 10.700) verwendet man als positive Kontrolle.
(2) Clotek (hergestellt von Sanko Junyaku) verwendet man zur Bestimmung der Gerinnungs- oder Koagulationszeit (PCT).

Methode

0,1 ml der Testsubstanz in Kochsalzlösung bei verschiedenen Konzentrationen gibt man jeweils zu 0,1 ml Portionen citriertem Rattenserum. Jedes Gemisch erwärmt man 3 Minuten aus 37ºC und gibt 0,1 ml 0,025 M wäßriges Calciumchlorid zu dem Gemisch hinzu, um die Koagulation zu starten. Die Gerinnungszeit trägt man gegen die Konzentration auf Millimeterpapier auf und bestimmt graphisch die antikoagulierende Aktivität, die definiert ist, als die Konzentration (CT&sub2;), bei der die Gerinnungszeit doppelt so groß ist wie bei der Kontrollgruppe ohne Testsubstanz. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 wiedergegeben. Tabelle 5 Test Substanz Dextransulfat-Natrium
Aus Tabelle 5 ergibt sich, daß DS-4152 eine geringere antikoagulierende Aktitivität als Dextransulfat-Natrium aufweist.

Claims

1. Verwendung des sulfatisierten Polysaccharids DS-4152 oder der Derivate davon, bei denen das Natrium des DS-4152 durch ein anderes pharmazeutisches Metall als Natrium ersetzt ist, zur Herstellung eines antiviralen pharmazeutischen Mittels.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Mittel wirksam ist gegen ein Human-Retrovirus, ein Human-Immunodefizienz-Virus, ein Herpes viridae-Virus und/oder ein Herpes simplex-Virus vom Typ 1.