DE69001296T2 - Verfahren zur reinigung von spezifischen oligonukleotiden. - Google Patents
Verfahren zur reinigung von spezifischen oligonukleotiden.Info
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- Saccharide Compounds (AREA)
Description
- Aufgrund des Einsatzes von synthetischen Oligonukleotiden in vielfältigen molekularbiologischen Techniken ist die Nachfrage nach einfachen Methoden zur Synthese und Reinigung von Oligonukleotiden sehr groß. Automatisierte Synthesizer haben sich bei der Herstellung von spezifischen Oligonukleotiden als nützlich erwiesen. Bei der Oligonukleotidsynthese durch einen automatisierten Syntheziser werden Nukleotidmonomere fortschreitend an eine wachsende Oligonukleotidkette angefügt. Während jedes Zyklus scheitert ein gewisser Prozentsatz der Kopplungsreaktionen, d.h. es findet keine Monomeraddition statt.Typischerweise beträgt die Kopplungseffizienz 97-98%. Somit sind 2-3% des Reaktionsgemisches mangelhafte Sequenzen. Dieser Fehler multipliziert sich jedoch bei der Verlängerung der Oligonukleotidkette. In einer 20mer-Synthese stellt z.B. das 20mer- Produkt nur 50-60% des wiedergewonnenen Oligonukleotidprodukts dar. Die übrigen 40-50% bestehen aus mangelhaften Sequenzen.
- Da die chemische Reinheit eines synthetisierten Oligonukleotids kritisch für jede Anwendung ist, wurden viele Techniken eingesetzt, um Ziel- Oligonukleotide voller Länge von unvollständigen, mangelhaften Sequenzen zu reinigen. Dazu gehören Dünnschichtchromatographie, Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) und HPLC mit Hilfe von Ionenaustausch unter Einsatz von normaler und umgekehrter Phasenmodi. Mit diesen oben genannten Reinigungsmethoden können nur bis zu 150 ug (Mikrogramm) synthetische DNA gereinigt werden. Zusätzlich erfordern alle diese Methoden, daß die Reaktionsbedingungen verändert werden müssen, wenn das Phosphatrückgrat von einem bestimmten Oligonukleotid in irgendeiner Weise modifiziert worden ist.
- Eine Methode wäre sehr nützlich, durch die Oligonukleotide mit gewünschter Sequenz in großen Mengen effizient aus einem Sequenzgemisch (Synthesegemisch) isoliert werden können, das mangelhafte Sequenzen so wie auch die gewünschten Sequenzen enthält.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung (Reinigung) von Ziel-Oligonukleotiden voller Länge (d.h. Nukleotidsequenzen, die die gewünschte Anzahl von Nukleotiden enthalten) aus einem Synthesegemisch von Oligonukleotiden, insbesondere aus einem Gemisch, das verkürzte, mangelhafte Sequenzen enthält (d.h. Nukleinsäuresequenzen, die durch automatisierte Synthese entstanden sind, aber kürzer sind als die gewünschte Sequenz). Dieses Verfahren nutzt die Tatsache aus, daß verkürzten, mangelhaften Sequenzen einige Nukleotide am 5'-Ende fehlen, die beim Ziel-Oligonukleotid voller Länge vorhanden sind.
- Betrachten wir beispielsweise ein 20mer voller Länge mit der Nukleinsäuresequenz 5'-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3' und eine mangelhafte Sequenz 5'-AAAATGG-3' derselben Synthesereaktion. Die 7 mehr am 3'-Ende liegenden Nukleotide der mangelhaften Sequenz sind identisch in ihrer Reihenfolge und Zusammensetzung mit denen des korrespondierenden vollständigen 20mers. Weil jedoch die Verlängerung der mangelhaften Sequenz nach der Addition des 7. Nukleotids an die Kette beendet wurde, fehlen ihm die 13 mehr am 5'-Ende liegenden Nukleotide. Um das gewünschte 20mer zu isolieren, müssen das mangelhafte 7mer sowie alle anderen möglichen mangelhaften Sequenzen (z.B. 8mere, 9mere, etc.) abgetrennt werden.
- Im Verfahren der vorliegenden Erfindung ist eine kurze Nukleotidsequenz, die komplementär zum 5'-Ende eines Ziel- Oligonukleotids ist, an einen festen Träger angebracht (gebunden). Das nach einer synthetischen Reaktion entstehende Oligonukleotidgemisch wird mit dem gebundenen Oligonukleotid in einem geeigneten Gefäß unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Hybridisierung von komplementären Nukleotidsequenzen fördern. Die Komplementarität zwischen den mehr am 5'-Ende liegenden Nukleotiden des Ziel- Oligonukleotids und den Monomereinheiten des gebunden Oligonukleotids führt zur Bildung von H-Brückenbindungen, welche dazu dienen, das Ziel-Oligonukleotid im Reaktionsgefäß zurückzuhalten, wogegen verkürzte, mangelhafte Sequenzen mit fehlenden, zum gebundenen Oligonukleotid komplementären 5'-Sequenzen das Reaktionsgefäß durchlaufen. Die Ziel-Oligonukleotide werden anschließend nach bekannten Methoden wiedergewonnen, beispielsweise durch in Kontakt bringen mit einer Elutionslösung und zwar unter Bedingungen, die dazu führen, die intermolekulare Hybridisierung aufzulösen.
- Das vorliegende Verfahren kann auch dazu benutzt werden, Ziel- Oligonukleotide von jeder Mischung zu trennen, z.B. von einer Mischung, die aus der durch Restriktionsenzyme oder mechanischer Fragmentierung von Nukleinsäuren anfallenden Mischung resultiert.
- Ein nützlicher Vorteil dieser Erfindung gegenüber den gegenwärtig verfügbaren Methoden ist, daß durch Einsatz dieses Verfahrens Mikrogramm- bis Gramm-Mengen von Ziel-Oligonukleotidsequenzen gereinigt werden können. Zusätzlich kann jedes synthetische Oligonukleotid (Desoxy- oder Ribonukleotid), eingeschlossen solche, die natürlich vorkommenden Sequenzen entsprechen und solche mit Modifikationen, beispielsweise am Phosphatrückgrat, mit diesem Verfahren gereinigt werden.
- Ein weiterer Vorteil ist, daß die trägergebundenen Nukleotidsequenzen unter Reinigungsbedingungen stabil sind und somit wiederverwendet werden können. Zusätzlich beträgt die Reinheit des isolierten Oligonukleotids schätzungsweise 98% und im Prinizip gehen keine synthetischen Ziel-Oligonukleotide verloren. Ein letzter Vorteil ist, daß diese Methode nicht den Einsatz von potentiell karzinogenen organischen Lösungsmitteln erfordert.
- Die oben angeführten und weitere Merkmale dieser Erfindung einschließlich verschiedener neuartiger Einzelheiten in Konstruktion und Zusammensetzung von Teilbereichen werden im Folgenden genauer unter bezug auf begleitende Zeichnungen und die Patentansprüche beschrieben. Die spezielle Methode der Oligonukleotidreinigung, die diese Erfindung verkörpert, ist nur erläuternd dargestellt, was aber nicht als eine Einschränkung dieser Erfindung verstanden werden soll. Die Prinzipien und Merkmale dieser Erfindung können in zahlreichen und auch abgewandelten Ausführungen angewendet werden, ohne daß dabei vom Bereich der Erfindung abgewichen wird.
- Figur 1 zeigt die chemischen Grundlagen für vier Methoden zur Verknüpfung von Nukleotidsequenzen an einen festen Träger.
- Figur 2 ist eine schematische Darstellung einer trägergebundenen Hexamersequenz, die mit dem 5'-Ende des Ziel-Oligonukleotids hybridisiert.
- Figur 3 ist eine schematische Darstellung des Reinigungsschemas der vorliegenden Erfindung.
- Figur 4 ist ein Flußdiagramm eines Gerätes, das in dem Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann.
- Figur 5 ist eine Aufzeichnung der Elution von synthetischen Oligonukleotiden nach dem Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung.
- Figur 6 zeigt ein HPLC-Profil eines synthetischen 20mer Rohproduktgemischs.
- Figur 7 zeigt das HPLC-Profil eines synthetischen 20mer Produkts, das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigt wurde.
- Figur 8 zeigt die Schmelztemperaturkurve für vier verschiedene rückgratmodifizierte Oligonukleotide.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Ziel- Oligonukleotiden voller Länge, deren Länge beliebig ist, jedoch im allgemeinen zwischen 5 bis 50 Nukleotiden beträgt, aus einem synthetischen Reaktionsproduktgemisch, das verkürzte oder mangelhafte Sequenzen enthält. Die Oligonukleotidsequenzen können Oligoribonukleotid- oder Oligodesoxyribonukleotidsequenzen sein. Beide Arten werden im Folgenden als Oligonukleotide bezeichnet. Das Verfahren nutzt die Tatsache aus, daß den verkürzten oder mangelhaften Sequenzen einige Nukleotide fehlen, die am 5'-Ende des vollständig synthetisierten Zieloligonukleotids vorhanden sind.
- Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Oligonukleotid, das komplementär zum 5'-Ende des Ziel-Oligonukleotids voller Länge ist (d.h. ein Oligonukleotid mit vorher ausgewählter Größe und Sequenz) in einem Reaktionsgefäß, z.B. einer Säule, oder durch Anwendung irgendeiner von zahlreichen bekannten Techniken (R.T. Pon, Biotechniques 6 (1988): 8 und darin enthaltene Zitate) an ein festes Trägermaterial (z.B. Glassperlen, Polystyrol, Cellulose, Agarose, Sephadex, Sepharose, Papier, etc.) angebracht (z.B. kovalent gebunden ), was mit mehr Einzelheiten in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist.
- Figur 1(a) veranschaulicht die Verknüpfung einer am 3'-Ende derivatisierten Oligonukleotidsequenz mit einem mit COOH-Gruppen versehenen Träger (z.B.: CPG) in Gegenwart von wasserlöslichem Carbodiimid EDC. Die Figuren 1(c) und 1(d) veranschaulichen Methoden zur Synthese von Oligonukleotiden an einem Ribonukleosidträger und die anschließende Verknüpfung der Oligonukleotide an den Träger entweder durch Derivatisierung des 3'-Endes des Oligonukleotids durch Bildung einer Aminogruppe, die mit dem mit Carboxylgruppen versehenen Träger reagieren kann (1(c)) oder durch Reaktion des Dialdehyds am 3'-Ende des Oligonukleotids mit dem mit NH&sub2;-Gruppen versehenen CPG (1(d)).
- Die zum Ziel-Oligonukleotid komplementäre Sequenz kann aber auch direkt am festen Träger synthetisiert werden, wenn die Bindungen unter sauren und basischen Bedingungen stabil sind. Dies ist in Beispiel 3 ausführlich beschrieben.
- Figur 1(b) veranschaulicht die Reaktion zwischen dem mit Carboxylresten versehenen Trägers und Aminohexanol in Gegenwart von EDC zu einem Träger, der nun mit Hydroxylgruppen versehen ist und zum Anknüpfen der Oligonukleotide genutzt werden kann.
- Die Sequenz, die zum 5'-Ende der Ziel-Oligonukleotidsequenz komplementär ist, wird im Folgenden als angebrachtes (gebundenes) Oligonukleotid bezeichnet. Ein Reaktionsgefäß (z.B. eine Säule) wird dann vorbereitet, indem man eine gewisse Menge an Hybridisierungslösung (z.B. einen Puffer) durchlaufen läßt, die ausreicht, um das feste Trägermaterial und das gebundene Oligonukleotid gründlich abzusättigen.
- Die synthetischen Reaktionsprodukte werden aus der Lösung wiedergewonnen und in der Hybridiserungslösung resuspendiert. Dieses resuspendierte Reaktionsgemisch läuft dann durch das Reaktionsgefäß. Ziel-Oligonukleotide voller Länge bilden H-Brücken (d.h. sie hybridisieren) mit den gebundenen Oligonukleotiden und werden so im Reaktionsgefäß zurückgehalten. Verkürzte mangelhafte Sequenzen, die gar keine oder eine nicht ausreichende Zahl an H-Brücken ausbilden können, damit sie unter den Elutionsbedingungen an die gebundenen Oligonukleotide gebunden bleiben, verlassen mit dem Durchfluß das Reaktionsgefäß. Dieses Verfahren ist in Beispiel 4 genauer beschrieben. Figur 2 gibt das mit dem Ziel-Oligonukleotid hybridisierte gebundene Oligonukleotid wieder. Figur 3 veranschaulicht schematisch das Reinigungsschema.
- Es kann eine Klasse von verkürzten, mangelhaften Sequenzen geben, die begrenzt komplementär zu dem gebundenen Oligonukleotid sein kann. Wir betrachten beispielsweise ein gebundenes Hexamer, das zur Isolierung eines Ziel-Oligonukleotids voller Länge benutzt wird, das als 20mer in einem synthetischen Reaktionsgemisch vorhanden ist. Nimmt man für jeden Monomeradditionsschritt eine Kopplungseffizienz von 97- 98% an, so stellen 6-9% des synthetischen Rohproduktgemischs Oligonukleotide dar, deren Verlängerung nach Koppeln des 17., 18. oder 19. Nukleotids abgebrochen ist. Diese drei verkürzten, mangelhaften Sequenzen werden H-Brücken mit dem gebundenen Oligonukleotiden bilden, weil diese mangelhaften Sequenzen 5'-Enden aufweisen, die zumindestens zu einem Teil des gebundenen Oligonukleotids komplementär sind. Die Stärke der Bindung zwischen diesen mangelhaften Sequenzen und dem gebundenen Oligonukleotid wird abhängig vom Ausmaß der Komplementarität (d.h. der Anzahl der Basen, die mit dem gebundenen Oligonukleotid hybridisieren) variieren. Beispielsweise sollte eine synthetische Nukleotidsequenz, deren Verlängerung nach Koppeln des 19. Nukleotids abgebrochen ist, stärker an das gebundene Oligonukleotid binden als eine Nukleotidsequenz, deren Verlängerung nach Koppeln des 18. Nukleotids abgebrochen ist.
- Die im Reaktionsgefäß zurückgehaltenen Oligonukleotide werden in einem Elutionsschritt freigesetzt, der genauer in Beispiel 5 und 6 beschrieben ist. Beispielsweise reduziert der Durchlauf eines Salzgradienten (z.B. 200mM bis 1mM NaCl) durch das Reaktionsgefäß oder ein Temperaturgradient (z.B. 5ºC bis 40ºC) das H- Brückenbindungspotential der Nukleinsäuren. Da das H-Brückenbindungspotential der fast vollständig synthetisierten, mangelhaften Sequenzen niedriger ist als das des Ziel-Oligonukleotids voller Länge, werden die mangelhaften Sequenzen eher das Reaktionsgefäß verlassen als das Ziel-Oligonukleotid. Figur 3 gibt schematisch das Reinigungsschema der vorliegenden Erfindung wieder.
- Figur 4 veranschaulicht ein Gerät, das im vorliegenden Reinigungsverfahren benutzt werden kann. Das Rohgemisch wird in den Lösungsmittelbehälter gegossen und in die Säule gepumpt. Sobald die Ziel-Oligonukleotide in der Säule sind, hybridisieren sie mit den gebundenen Oligonukleotiden in der Säule. Bei Elution durch einen Salzgradienten wird Salzpuffer in den Lösungsmittelbehälter gegeben. Bei Elution durch einen Temperaturgradienten wird die Temperatur in der Säule angehoben, indem die Temperatur des Wassers in der Wasserummantelung erhöht wird. Zum Nachweis des Elutionsprodukts, nämlich der Ziel-Oligonukleotide, können die UV-Meßeinheit und das Aufzeichnungsgerät hilfreich sein.
- Figur 5 ist eine typische Aufzeichnung der Reinigung von synthetischen Oligonukleotiden mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung. Der erste Peak (1) enthält die kurzen Sequenzen, die nicht hybridisieren und deshalb direkt nach der ersten Zugabe von Puffer von der Säule kommen. Nach dem Auswaschen aller nicht hybridisierten Sequenzen werden die hybridisierten Sequenzen durch einen Temperatur- oder Salzgradienten eluiert. Die Peaks (2), (3) und (4) sind n-3, n-2 und n-1 Peaks (d.h. fast vollständig synthetisierte, aber mangelhafte Sequenzen). Peak (5) ist das Ziel-Oligonukleotid. Z.B. sind, wenn Peak (5) ein 20mer repräsentiert, Peak (2), (3) und (4) 17mere, bzw. 18mere und 19mere.
- Figur 6 ist das Ionenaustausch-HPLC Profil eines rohen 20mers (d.h., es enthält Ziel- und mangelhafte Oligonukleotide), und Figur 7 ist das Ionenaustausch-HPLC Profil eines nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigten 20mers. Ein Beispiel für die HPLC-Bedingungen ist in Beispiel 7 beschrieben. Wie aus Figur 7 ersichtlich, eluieren die nichthybridisierten, mangelhaften Sequenzen frühzeitig und die fast vollständig synthetisierten Sequenzen eluieren nach Anwendung eines Gradienten (z.B. eines Salz- oder Temperaturgradienten), wogegen in Figur 6 eine Reihe mangelhafter Sequenzen überall auftreten. Das Verfahren der Erfindung ist somit eindeutig geeignet zur Reinigung von Ziel- Oligonukleotiden von mangelhaften Sequenzen.
- Ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung ist, daß sie auch zur Reinigung von modifizierten Oligonukleotiden geeignet ist (d.h. Polymere aus Nukleotidmonomeren mit anderen 3'-5'Internukleotid-Bindungen (z.B. Phosphorothioate, Methylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphotriester). Beispielsweise kann man die H-Phosphonat-Methode zur Synthese von DNA benutzen, das H-Phosphonat-Zwischenprodukt oxidieren, um eine oder mehrere Modifikationen des Phosphatrückgrats zu erhalten und dann das Verfahren der vorliegenden Erfindung benutzen, um eine große Menge von modifizierten Oligonukleotiden zu reinigen.
- Figur 9 zeigt Schmelztemperaturkurven für drei verschiedene Phosphatrückgrat-modifizierte Oligonukleotide (Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphomorpholidat und Phosphorobutylamidat) und für ein nicht modifiziertes Oligonukleotid. Die Sequenzen sind 20mere, die mit einem komplementären 20mer in 100mM NaCl (pH7,4) hybridisiert worden sind. Wie durch die Kurven gezeigt wird, hybridisiert jedes Oligonukleotid mit seiner komplementären Sequenz, und die Schmelztemperatur, d.h. die Temperatur, bei der sich die hybridisierten Sequenzen wieder trennen, lag im Bereich von 44ºC-55ºC. Hybridisieren diese Sequenzen mit 5meren oder 6meren, beträgt die Schmelztemperatur nur 15ºC-25ºC, wobei die Hybridisierung weiterhin basenspezifisch erfolgt.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die in keiner Weise begrenzend sein sollen, weiter veranschaulicht.
- 3'-Aminooligonukleotidderivate werden mittels eines speziellen Linkers zusammengefügt, wie es in Figur 1(a) dargestellt ist. Nach diesem Zusammenfügen und dem Abspalten der Schutzgruppen wurde das Aminooligonukleotid mit dem CPG-Carboxylderivat in Gegenwart von Triethylamin, wasserfreiem Pyridin, Dimethylaminopyridin als Katalysator und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (EDC, manchmal auch als 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid bezeichnet (Chu, B.C.F., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82 (1985): 963-967; Ho, M.W.Y., Duncan, R.E. & Gilham, B.T., Biochem. 20 (1981): 64-67)) verknüpft. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Minuten sonifiziert und anschließend 24h lang gerührt. Der feste Träger wurde dann mit Pyridin, daraufhin mit Acetonitril und zuletzt mit Ether gewaschen und getrocknet.
- Die Synthese der benötigten Sequenz wurde an einem Ribonukleosidträger ausgeführt. Nach dem Zusammenfügen und Abspalten der Schutzgruppen gemäß Beispiel 1, wurde das 2',3'cis-Diol mit Natriummetaperjodat zum Dialdehyd oxidiert, der wiederum mit 1,6- Diaminohexan umgesetzt und mit Natriumcyanoborhydrid reduziert wurde. Die Aminogruppe wurde dann mit der Carboxylgruppe des Trägers in Gegenwart von EDC zur Reaktion gebracht wie von Agrawal, S., Nucl. Acid. Res. 14-15 (1986): 6227-6245 beschrieben und in Figur 1 (c) dargestellt. Der Dialdehyd kann aber auch direkt mit dem NH&sub2;- Derivat des CPG umgesetzt werden, wie in Figur 1(d) beschrieben.
- Der mit Carboxylgruppen derivatisierte Träger wurde in Gegenwart von EDC mit Aminohexanol gemäß Beispiel 1 umgesetzt. Nach dieser Reaktion wurde der Träger gewaschen und getrocknet. Der jetzt mit Hydroxylgruppen derivatisierte Träger, der in der Figur 1(b) dargestellt ist, wurde anschließend zum Aufbau der Oligonukleotidsequenzen eingesetzt. Nach diesem Aufbau wurden die Schutzgruppen vom Träger abgespalten. Da alle Bindungen zwischen dem Oligonukleotid und dem Träger resistent sind gegen saure und basische Hydrolyse, bleibt das Oligonukleotid gebunden.
- Nach allen Schritten zur Abspaltung von Schutzgruppen (z.B. mit Ammoniak zur Abspaltung von Schutzgruppen für Basen) wird das Rohprodukt des synthetischen Oligonukleotids in Wasser aufgenommen. Eine 400mM NaCl-Lösung wurden dann zum wässerigen Rohprodukt bis zu einer Endkonzentration von 200mM NaCl gegeben. Mit dieser Lösung wurde die Säule entweder manuell oder durch Injektion beladen. Die Gesamtmenge an auf die Säule gegebenen Roholigonukleotid ist je nach der Menge der Verunreinigungen, der Größe der Säule und der Menge des an die feste Oberfläche gebundenen Oligonukleotids unterschiedlich zu wählen. Beträgt die Beladung z.B. 12 umol/g, so können 12 umol des 20mers gereinigt werden. 1 Gramm CPG hat ein Säulenvolumen von etwa 2ml, so daß 20 umol an Roholigonukleotid (welches etwa 12 uM an reinem Oligonukleotid enthält und etwa 72mg entspricht) in 3ml Salzpuffer gelöst werden können. Das Roholigonukleotid wurde 15 Minuten lang über die Säule gegeben mit einer Durchflußrate von 0,2ml/min. Während des Durchflusses wurde die Temperatur der Säule abhängig vom Phosphatrückgrat auf 5ºC bis 10ºC abgesenkt. Nach 15 Minuten wurde der Träger auf 5ºC abgekühlt.
- Nach dem Abkühlen auf 5ºC wurde der Träger mit 200mM Salzpufferlösung gewaschen. Die Elution wurde durch eine UV-Meßeinheit aufgezeichnet. Nach Waschungen mit einem Gradienten, der von 200mM bis 1mM NaCl reichte, wurde der letzte Peak, der mit der UV- Meßeinheit nachgewiesen wurde, aufgefangen.
- Der Träger wurde bei 5ºC mit einer 200mM Salzpufferlösung gewaschen. Die Elution wurde durch eine UV-Meßeinheit aufgezeichnet. Die Temperatur wurde dann langsam linear erhöht auf 40ºC. Der letzte Peak, der durch die UV-Meßeinheit nachgewiesen wurde, wurde aufgefangen.
- Die HPLC wurde mit Hilfe eines Water's 600E System controller, eines Lambda max 481LC Spektrophotometers, eines Water's 745 Data Moduls und einer Whatman Partisphere SAX Säule durchgeführt. Die eingesetzten Puffer waren: (A) 1mM KH&sub2;PO&sub4; (pH6.3)/60% HCONH&sub2; und (B) 300mM KH&sub2;PO&sub4; (pH6,3)/60% HCONH&sub2;. Der Gradientenlauf war 0% B für 2 Minuten, anschließend 0-80% B in A und B über 30 Minuten. Die Durchflußrate war 2ml/min und der Detektor wurde auf eine Absorption von 280nm eingestellt.
- Im Folgenden wird die Synthese von Oligonukleosidmethylphosphonat beschrieben, das eine funktionelle Alkylaminogruppe entweder am 5'- oder 3'-Terminus trägt, welche mit N-Hydroxysuccinimidestern des Biotins, N-Caproylamido-biotin und mit Rhodaminisothiocyanat umgsetzt worden ist.
- Ein Pentadecamer Oligonukleosidmethylphosphonat, AAGCTTC- CGGTCTCC, das zum 5'-Ende des menschlichen U2 small nuclear RNA "maxi Transkripts" komplementär ist, wurde aus Nukleosid-methylphosphoamiditen mit Hilfe eines automatisierten DNA-Synthesizers ( Biosearch 8700) synthetisiert; vgl Agrawal,S. & Goodchild,J., Tet. Lett. 28 (1987): 3539-3542. Zur Funktionalisierung des 5'-Terminus des trägergebundenen Oligonukleosidmethylphosphonats (I) wurde die letzte Kopplungsreaktion mit 2-(9-Fluorenylmethoxy-carbonyl)aminohexanol-(N,N-diisopropylmethyl)-phosphoroamidit (II) durchgeführt.
- Die Verbindung (II) wurde durch Reaktion von 2-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-aminohexanol mit Methylchloro-N,N-diisopropylaminophosphin in Dichlormethan, das N,N-Diisopropylethylamin enthält, bei Raumtemperatur während 20 Minuten hergestellt; vgl. Agrawal, S. et al., Nucleic Acid Research 14(15) (1986): 6227- 6245; Agrawal,S. & Goodchild,J., Tet. Lett.28 (1987): 3539-3542. Die wässerige Aufbereitung und die Prezipitation aus Ethylacetat mittels Pentan bei -40ºC ergab ein Öl mit 90%iger Ausbeute. Das Produkt war nach Dünnschichtchromatographie (tlc), ¹H- und ³¹P-NMR beurteilt rein. Zur Funktionalisierung des 3'-Terminus wurde der Aufbau der gewünschten Sequenz von 3'nach 5'an N-Fluorenylmethoxycarbonyl- O¹-dimethoxytrityl-3-amino-1,2-propandiol-(O²)-langkettigem Alkylamin- CPG-Träger (Clontech Laboratories, Inc.) ausgeführt.
- Nach dem Aufbau der funktionalisierten Sequenz wurden die Schutzgruppen bei Raumtemperatur in wässeriger Ammoniaklösung für 2h und anschließender Behandlung mit Ethylendiamin-Ethanol (1:1) für 6h abgespalten; vgl. Agrawal,S. & Goodchild,J., Tet. Lett. 28 (1987): 3539-3542; Miller,P.S. et al., Biochemistry 25 (1986): 5092-5097. Das rohe Amino-15mer (III) wurde analysiert und durch reverse phase HPLC gereinigt; das Amino-15mer eluierte später als das korrespondierende 15mer ohne terminale Aminogruppe. Das gereinigte Amino-15mer wurde dann mit N-Hydroxysuccinimid-biotin und N- Hydroxysuccinimid-N-caproylamido-biotin unter denselben Bedingungen wie vorher beschrieben umgesetzt; vgl. Agrawal, S. et al., Nuleic Acid Research 14(15) (1986): 6227-6245. Die analytische reverse phase HPLC des Reaktionsgemisches zeigte ein neues Produkt, nämlich ein Biotin-15mer Addukt und ein Caproylamido-biotin-15mer Addukt in quantitativer Ausbeute. Die Produkte wurden durch HPLC gereinigt und mittels Gelfiltration entsalzt.
- Sowohl das Biotin-15mer als auch das Caproylamido-biotin-15mer wurde erfolgreich dazu eingesetzt, maxi U2 RNA:Ribonukleoprotein (RNP) Komplexe aus Kernextrakten von menschlichen Zellkulturen durch Affinitätschromatographie des Oligomer:U2RNA-Hybrids an Streptavidin Agarose zu isolieren. Im Gegensatz dazu führt der Gebrauch an biotinyliertem Phosphodiester des 15mers in demselben Typ von Experiment nicht zur Gewinnung von maxi U2 RNA:RNP Komplexen, da die DNA-RNA Duplex durch endogene RNase H Aktivität im Kernextrakt geschnitten wird. Die hier beschriebene Methode kann zur automatisierten Synthese eingesetzt werden, welche nach dem routinemäßigen Abspalten der Schutzgruppen funktionalisiertes Oligonukleosidmethylphosphonat ergibt.
- Die vorliegende Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von Oligonukleotiden in Mikrogramm- bis Gramm-Mengen. Das Verfahren eignet sich zur Bereitstellung von gereinigten Oligonukleotiden und ist somit wertvoll für die folgenden grundlegenden und angewandten molekularbiologischen Techniken, bei denen synthetische Oligonukleotide eingesetzt werden. Beim Gen-screening werden synthetische Oligonukleotide, die eine komplementäre Nukleotidsequenz zu einem gesuchten Gen oder einer mRNA haben, mit einer nachweisbaren Gruppe markiert, um dieses Gen oder die mRNA in einer cDNA- oder genomischen DNA Bank nachzuweisen.
- Synthetische Oligonukleotide werden auch häufig als Primer für reverse Transkriptase beim Verfahren zur Synthese von DNA an einer einzelsträngigen RNA-Matrize eingesetzt. Zusätzlich können synthetische Oligonukleotide zur Schaffung von spezifischen Mutationen in einem cDNA-Abschnitt benutzt werden, der dann wieder in den Organismus eingeführt werden kann, um Veränderungen in diesem Organismus aufgrund der Mutation zu beobachten. Diese Technik ist ein bemerkenswerter Fortschritt im Vergleich zum klassischen Ansatz, bei dem in vivo Mutationen zufällig über das Genom verteilt geschaffen werden und dann die Mutanten isoliert werden, die einen bestimmten Phänotyp zeigen.
- Schließlich sind synthetische Oligonukleotide (modifizierte oder nicht modifizierte) geeignet als antivirale Agenzien. Es wird z.B. ein Antisense- Oligonukleotid mit den bekannten Techniken synthetisiert, welches komplementär zu einem Bereich eines viralen mRNA-Moleküls ist. Dieses Antisense-Oligonukleotid wird dann in die Zelle eingeführt und hybridisiert mit der komplementären Region der mRNA des Virus in der Zelle, so daß eine Doppelstrangregion entsteht. Diese Doppelstrangregion der viralen mRNA kann nicht translatiert werden. Zu diesem Zweck wird eine große Menge von synthetischen Oligonukleotiden benötigt (z.B. Gramm-Mengen). Somit ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung, mit dem große Mengen von Oligonukleotiden gereinigt werden können, besonders wichtig für diese Anwendung.
- Zusätzlich erfordert das Verfahren der vorliegenden Erfindung, anders als gegenwärtig verfügbare Methoden zur DNA-Reinigung, keine Reaktionsbedingungen, die für modifizierte Oligonukleotide verändert werden müssen. Modifizierte synthetische Oligonukleotide sind vielseitig einsetzbar. Phosphorothioat-DNA-Analoge, die Schwefel in der internukleosidischen Bindung tragen, werden gegenwärtig als nukleaseresistente Antisense-Oligonukleotide benutzt, entweder um die Translation zu blockieren oder die virale DNA-Synthese zu inhibieren; vgl. Marcus-Sekura, C.J. et al., Nucl. Acid Res 15 (1987): 5749- 5763; Agrawal, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988): 7079-7083. In der Vergangenheit wurden Phosphorothioate beim Studium der Stereochemie von Restriktionsendonukleasen (Matsukura, M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:? (1987); Stec, W.J. et al., J. Amer. Chem. Soc. 106 (Jahr?): Seite ?; Connolly, B.A. et al., Biochem. 23 (1984): 3443-3453), der strukturellen Dynamik von DNA (Koziolkiewicz, M. et al., Phosphorus and Sulfur 27 (1986): 81-92), der Erkennung von DNA durch Proteine ( z.B. durch monoklonale, anti-native DNA Antikörper, LaPlanche, C.A. et al., Nucl. Acid. Res. 14 (1986): 9081-9093), und zur Aufklärung von bestimmten Enzymmechanismen einschließlich von Protein-Nukleinsäureinteraktionen eingesetzt (Porter, B. & Eckstein F., J. Biol. Chem. 259 (1984): 14243).
- Methylphosphonatanaloge von DNA sind stärker hydrophob und es wurde gezeigt, daß sie ohne weiteres Zellmembranen passieren und die Proteinsynthese inhibieren, vermutlich indem sie die mRNA Translation beeinträchtigen; vgl. Blake, K., et al., Biochem 24 (1985): 6139; Smith, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986): 2787; Agrawal, S. et al., Tet. Lett., 28 (1987): 3539-3542; Sarin, P.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988): 7448-7451. Phosphoramidatanaloge von Dinukleotiden sind bekannt dafür, daß sie an komplementäre Polynukleotide binden und sie wurden zur Verknüpfung von verschiedenen Liganden mit DNA eingesetzt; vgl. Letsinger, R. et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986): 3487; Agrawal, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988): 7079-7083.
- Alle obengenannten grundlegenden und angewandten molekularbiologischen Methoden, bei denen synthetische Oligonukleotide verwendet werden, profitieren vom erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem synthetische Oligonukleotide in Gramm-Mengen gereinigt werden können und die Reaktionsbedingungen für modifizierte Oligonukleotide nicht verändert werden müssen.
Claims (12)
1. Verfahren zur Trennung von Ziel-Oligonukleotiden voller Länge aus einem
Oligonucleotidsynthesegemisch, umfassend das Zusammenbringen des Gemisches mit
einem kurzen Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die zum 5'-Ende des Ziel-
Oligonukleotids voller Länge komplementär und an einen festen Träger angebracht ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ziel-Oligonukleotide voller Länge und das
gebundene Oligonukleotid Oligodesoxynukleotide sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Länge des angebrachten Oligonukleotids 5-10
Basen beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ziel-Oligonukleotide voller Länge modifizierte
Oligonukleotide sind und die Modifikation sich in dem Anteil der Ziel-Oligonukleotide
voller Länge befindet, der nicht den zum angebrachten Oligonukleotid komplementären
Bereich darstellt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die modifizierten Oligonukleotide aus der folgenden
Gruppe ausgewählt werden:
a. Oligonukleotidmethylphosphonat
b. Oligonukleotidphosphorothioat
c. Oligonukleotidphosphoramidat
d. Äquivalente dazu, wobei die Äquivalente Nukleotidsequenzen sind, welche dem
Ziel-Oligonukleotid voller Länge in ihrer Sequenz am 5'-Ende ausreichend ähnlich sind,
so daß sie mit dem angebrachten Oligonukleotid hybridisieren können.
6. Verfahren zur Trennung von Ziel-Oligonukleotiden voller Länge aus einem
Oligonukleotidsynthesegemisch, das folgende Schritte umfaßt:
a. das Anbringen von kurzen Oligonukleotiden, deren Nukleotidsequenzen komplementär
zum 5'-Ende der Ziel-Oligonukleotide voller Länge sind, an einen festen Träger, so daß
angebrachte Oligonukleotide entstehen;
b. das in Kontact bringen von angebrachten Oligonukleotiden mit dem
Oligonukleotidsynthesegemisch unter Bedingungen, die für die Hybridisierung von
komplementären Nukleinsäuresequenzen geeignet sind und zur Hybridisierung von
angebrachten Oligonukleotiden mit Ziel-Oligonukleotiden voller Länge sowie mit
mangelhaften Oligonukleotiden nahezu voller Länge führen;
c. das Unterwerfen der Hybridisierungsprodukte aus (b) einem Gradienten, der geeignet ist,
die Hybridisierung von angebrachten Oligonukleotiden mit mangelhaften
Oligonukleotiden nahezu voller Länge aufzulösen, jedoch nicht die Hybridisierung von
angebrachten Oligonukleotiden mit Ziel-Oligonukleotiden voller Länge;
d. die Wiedergewinnung der Ziel-Oligonukleotide voller Länge durch Unterwerfen der
angebrachten Oligonukleotid - Ziel-Oligonukleotidprodukte, die in (c) gebildet wurden,
unter Bedingungen, die zur Aufhebung der Hybridisierung geeignet sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Ziel-Oligonukleotide voller Länge und die
angebrachten Oligonukleotide Oligodesoxynukleotide sind.
8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Länge der angebrachten Oligonukleotide 5-10
Basen beträgt.
9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die vollständig synthetisierten Ziel-Oligonukleotide
voller Länge modifizierte Oligonukleotide sind und die Modifikation sich in dem Anteil
der Ziel-Oligonukleotide voller Länge befindet, der nicht den zum angebrachten
Oligonukleotid komplementären Bereich darstellt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die modifizierten Oligonukleotide aus der folgenden
Gruppe ausgewählt werden:
a. Oligonukleotidmethylphosphonat
b. Oligonukleotidphosphorothioat
c. Oligonukleotidphosphoramidat
d. Oligoribonukleotide und deren Phosphatrückgratanaloge
e. Äqivalente dazu, wobei die Äquivalente Nukleotidsequenzen sind, welche den Ziel-
Oligonukleotiden voller Länge in ihrer Sequenz am 5'-Ende ausreichend ähnlich sind, so
daß sie mit dem angebrachten Oligonukleotid hybridisieren können.
11. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Gradient in Schritt (c) ein Salzgradient ist.
12. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Gradient in Schritt (c) ein Temperaturgradient
ist.
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