DE69000746T2

DE69000746T2 - Praeparat zur behandlung von systemischem lupus erythomatosus.

Info

Publication number: DE69000746T2
Application number: DE9090104128T
Authority: DE
Inventors: Takayuki Ishii; Hirofumi Kai; Kenji Komatsu; Takeshi Miyata; Sadanori Ogasawara; Kazuo Takahama
Original assignee: KANTO ISHI PHARMA CO Ltd; Mect Corp
Current assignee: KANTO ISHI PHARMA CO Ltd; Mect Corp
Priority date: 1989-03-08
Filing date: 1990-03-02
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 2010-03-03
Also published as: DK0386657T3; IL93649A; EP0386657A1; AU622989B2; IL93649A0; NZ232782A; DE69000746D1; KR900013968A; AU5116790A; JPH02235816A; EP0386657B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Präparation (Zubereitung) zur Behandlung von systemischem Lupus erythematosus. Insbesondere betrifft sie eine Zubereitung, die als Wirkstoff N-Acetylneuraminsäure enthält.
In vivo verbindet sich Sialinsäure mit Heteropolysacchariden auf verschiedenste Arten und hat als wichtiger Bestandteil der Heteropolysaccharide biologische Funktionen.
Wenn man die biologischen Funktionen der Sialinsäure im Immun- System betrachtet, so sind auf diesem Gebiet bisher zahlreiche Untersuchungen durchgeführt worden, und es ist berichtet worden, daß Sialinsäure eine spezifische antigene Eigenschaft aufweist, daß sie ein wesentlicher Bestandteil für Rezeptormoleküle ist oder daß sie einen Anti-Erkennungseffekt zeigt, der die Immun-Erkennungsstellen maskiert.
In den letzten Jahren ist berichtet worden, daß N-Acetylneuraminsäure, die einer der typischen Vertreter der Sialinsäuren ist, antivirale oder Anti-Entzündungswirkung hat [(1) Robert L. Hirsch et al., The Journal of Immunology, Bd. 127, No. 5 (1981), Seiten 1740 - 1743; (2) P. Gorog et al., Agents and Actions, Bd. 8, No. 5,(1978), Seiten 543 - 545; (3) Hiromi Itoh et al., Pharmacology and Therapy, Bd. 13, No. 7 (1985), Seiten 479-494, et al].
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bezüglich der pharmakologischen Wirkung von Sialinsäure Untersuchungen über einen langen Zeitraum angestellt und haben gefunden, daß N- Acetylneuraminsäure, die ein typischer Vertreter der Sialinsäuren ist, eine inhibierende Wirkung auf die Arthus-Reaktion ausübt.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zubereitung für die Behandlung von systemischem Lupus erythematosus bereitzustellen, die N-Acetylneuraminsäure oder deren Salz, dargestellt durch die folgende Formel, als aktiven Bestandteil enthält:
in der, wenn n=1 ist, Z Wasserstoff, Lithium, Kalium, Natrium, Ammonium oder ein organisches Ammonium darstellt; und wenn n=2 ist, Z Calcium, Barium oder Magnesium darstellt.
Die Arthus-Reaktion ist eine Entzündungsreaktion, die insbesondere auf der Haut als Ödem und Blutung beobachtet werden kann. Ihre typische Erkrankung ist systemischer Lupus erythematosus (SLE). Andere Erkrankungen der Arthus-Reaktion sind Serumkrankheit, die komplexe Glomerulonephritis, etc.
Die wesentlichen Reaktionsabläufe bei der Arthus-Reaktion sind (1) Sedimentation des Immunkomplexes an der Gefäßwand und dem umgebenden Gewebe, (2) Aktivierung des Komplement-Systems über den klassischen Weg (teilweise auch über den alternativen Weg), (3) Aggregation der polymorphkernigen Leukocyten an einem Reaktionsort, (4) Immunadhäsion von polymorphkernigen Leukocyten an Materialien und Zellen, die mit C3b beschichtet sind, (5) Verstärkung der Phagocytose von polymorphkernigen Leukocyten, (6) Freisetzen lysosomaler Enzyme aus den polymorphkernigen Leukocyten, und (7) Störung von Zellen (Erythrocyten etc.) und Gewebe.
N-Acetylneuraminsäure und ihre Salze zeigen in vivo in Abhängigkeit von der zu verwendenden Menge inhibitorische Wirkung auf Blutungen infolge der Arthus-Reaktion.
N-Acetylneuraminate können beispielsweise erhalten werden, wenn N-Acetylneuraminsäure mit Hydroxiden oder Carbonaten von Alkali- oder Erdalkalimetallen neutralisiert und das Salz von den Reaktanden abgetrennt wird (Japanische Patentanmeldung 61- 51898).
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Wirkungen von N- Acetylneuraminat auf die passive Arthus-Reaktion und zeigt die Durchmesser der Blutungen, die 2 Stunden nach der Antigen- Stimulation gemessen wurden, und
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Wirkungen von N- Acetylneuraminat auf die passive Arthus-Reaktion und zeigt die Durchmesser der Blutungen, die 24 Stunden nach der Antigen- Stimulation gemessen wurden.

Beispiel 1

Wirkungen von N-Acetylneuraminat auf die passive Arthus-Reaktion

(1) Tiere für das Experiment

Männliche Hartley Meerschweinchen mit einem Gewicht von 300 bis 400 g wurden verwendet.

(2) Herstellung von Antiserum (heterozelluläres Affinitäts-Antiserum vom Kaninchen)

Anti-OA (Kaninchen) wurde nach herkömmlichen Verfahren gewonnen. Das heißt, unter Verwendung von Kaninchen des Neuseeland-Stammes mit einem Gewicht von 2 bis 2,2 kg wurde 1 ml einer Emulsion, die 20 mg OA und Freunds komplettes Adjuvans (erhältlich von Difco Lab.) enthielt, subkutan in das Hinterteil injiziert. Aktive Sensitivierung wurde alle zwei Wochen insgesamt viermal bewirkt.
Zwei Wochen nach dem Tag der letzten Sensitivierung wurde Blut aus der Arteria carotis entnommen und nach Abtrennung des Antiserums wurde es bis zum Gebrauch im Experiment bei -20ºC verwahrt.

(3) Experimentelles

Die passive Arthus-Reaktion wurde nach der Methode von Katayama et al. [S. Katayama et al., Arzneim.-Forsch., Bd. 31, Seite 1196 (1981)] ausgelöst. Um jedoch eine ausreichende Reaktion zu bewirken, wurden verschiedene Konzentrationen der OA-Lösung zugesetzt. Das heißt, die Sensitivierung wurde durch intravenöse Injektion von 1 ml der Antiserum-Stammlösung ausgelöst, und 30 Minuten danach wurde die Reaktion durch intradermale Injektion von jeweils 0,05 ml der OA-Lösungen, die alle 0,025 mg bzw. 0,05 mg OA enthielten, in je einen Teil eines abdominalen Bereichs und in insgesamt zwei Bereiche des Meerschweinchens, dem am Tag zuvor das Fell abrasiert worden war, verursacht. Zu diesem Zeitpunkt wurde gleichzeitig auf dieselbe Weise eine physiologische Kochsalz-Lösung als Kontrolle intradermal injiziert. 2 und 24 Stunden nach der Antigen-Stimulation wurde der Durchmesser der Blutung an jedem stimulierten Bereich gemessen. Das Quadrat des Durchmessers diente als Index für das Mab der Reaktion. Der Wert wurde, um die Ergebnisse der durchgeführten Experimente zu erhalten, an Hand der Kontrolle kalibriert. 1, 5 oder 20 mg/kg Natrium-N-Acetylneuraminat oder physiologische Kochsalz-Lösung (1 mg/kg) als Kontrolle wurden 30 Minuten vor der Antigen-Stimulation oder unmittelbar nach der Sensitivierung intravenös injiziert.

(4) Statistische Behandlung

Mehr als 6 Experimente wurden durchgeführt, und die dabei gewonnenen experimentellen Ergebnisse wurden als Durchschnitt +/- Standardabweichung angegeben. Auch ein Student t-Test wurde als signifikanter Test durchgeführt, und p < 0,05 wurde als statistisch bedeutend gemacht.
Die experimentellen Daten sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt.

(5) Ergebnisse

Wie den Fig. 1 und 2 eindeutig entnommen werden kann, kann die Blutung der Haut in Abhängigkeit von der verwendeten Menge durch Verabreichung von Natrium-N-Acetylneuraminat gemildert werden, wobei diese Milderung bei 20 mg/kg bemerkenswert ist. Dieser inhibitorische Effekt hält auch noch 24 Stunden nach der Antigen-Stimulation an.

Beispiel 2

Test auf akute Toxizität

Tests auf akute Toxizität von Natrium-N-Acetylneuraminat bei Mäusen, Ratten und Meerschweinchen in Folge oraler Verabreichung, subkutaner, intraperitonealer, intravenöser Injektion oder Inhalation wurden wie unten gezeigt durchgeführt.

(1) Zu testende Tiere

ICR Maus 6 Wochen alt
SD Ratte 6 Wochen alt
Hartley Meerschweinchen 6 Wochen alt

(2) Konzentration der Chemikalien

20% (w/v) gelöst in dest. Wasser

(3) Anzahl der Tiere pro Level

Zehn

(4) Beobachtete Zeiträume

14 Tage

(5) Berechnungsmethode für LD&sub5;&sub0;

Probit-Verfahren
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Test auf akute Toxizität von Natrium-N-Acetylneuraminat LD&sub5;&sub0; (mg/kg) Verabreichungsweg Art des Tieres Geschlecht Inhalation Maus Ratte Meerschw. p.o.: oral i.p.: intraperitoneal s.c.: subkutan i.v.: intravenös
Die Inhalation wird dadurch bewirkt, daß das zu testende Pulver eine Stunde exponiert wird.

Beispiel 3

Einfacher Test auf akute Toxizität

Ein einfacher Test auf akute Toxizität des zu testenden Mittels nach intravenöser Injektion an Mäuse wurde wie unten dargestellt bewirkt.

1. Experimentelles Material und Methoden

(1) Zu testende Mittel

Es wurden das Lithiumsalz, das Kaliumsalz, das Bariumsalz und das Magnesiumsalz der N-Acetylneuraminsäure (alle erhältlich von MECT Corporation) verwendet.

(2) Tiere für die Experimente

ddy männliche Mäuse
Gewicht zu Beginn der Testreihe: 17,7 bis 21,1 g
Anzahl der Tiere pro Level: 3

(3) Raumtemperatur:

23 +/- 1ºC, Feuchtigkeit: 55 +/- 7%

(4) Verabreichungsweg:

intravenös

(5) Verabreichungsverfahren und verabreichte Mengen

Die oben genannten zu testenden Mittel wurden in physiologischer Kochsalz-Lösung gelöst und derart zubereitet, daß eine Menge von 0,2 ml pro 20 g Körpergewicht der Maus per Injektion in eine Schwanzvene verabreicht wurde. Die verabreichten Mengen waren die folgenden drei Level: 500, 1000 und 2000 mg/kg.

(6) Beobachtung des Allgemeinzustands und der Todes-Bedingung

Beobachtungen des Allgemeinzustands und Eintreten oder Ausbleiben des Todes wurden im folgenden Zeitraum durchgeführt: beginnend sofort nach der Verabreichung bis 7 Tage danach.

2. Ergebnisse

(1) Sterblichkeitsrate

Die Sterblichkeitsrate ist in Tabelle 2 gezeigt.
Bei Verwendung des Kaliumsalzes, des Bariumsalzes und des Magnesiumsalzes der N-Acetylneuraminsäure in den Dosen von 1000 und 2000 mg/kg starben 3 von 3 Tieren. Bei der Dosis von 500 mg/kg starben 3 von 3 Tieren, denen das Bariumsalz der N-Acetylneuraminsäure verabreicht worden war. Ansonsten kam es bei keiner anderen Konzentration irgendeines Salzes zu Todesfällen.

(2) Allgemeine Bedingung

Die Tiere, die starben, litten zuvor unter klonischer Konvulsion und Urin-Inkontinenz, und nahezu alle Tiere starben sofort nach der Verabreichung oder innerhalb einer Minute. In den viralen Proben konnte in einer kleinen Probe eine Inhibition der Ultramotivität beobachtet werden, die jedoch innerhalb einer Stunde wieder hergestellt war. Tabelle 2 Anzahl der gestorbenen Tiere in Abhängigkeit von der Zeit Mittel verabreichte Menge mg/kg Stunden Tage Sterblichkeitsrate Lithium N-Acetylneuraminat Kalium N-Acetylneuraminat Barium N-Acetylneuraminat Magnesium N-Acetylneuraminat

Claims

1. Verwendung einer Präparation, die eine wirksame Menge einer Verbindung enthält, welche durch die Formel gegeben ist:

in der, wenn n = 1 ist, Z Wasserstoff, Lithium, Kalium, Natriuin, Ammonium oder ein organisches Ammonium darstellt; und wenn n = 2 ist, Z Kalzium, Barium oder Magnesium als aktiven Bestandteil und pharmakologisch unbedenklichen Träger darstellt, für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Schmetterlingsflechte (Lupus Erythematosus).

2. Verwendung der Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation eine pulverförmige Präparation ist, die im Gebrauch aufgelöst ist.

3. Verwendung der Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichent, daß die Präparation eine gefriergetrocknete Präparation ist.

4. Verwendung der Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichent, daß die Präparation eine wasserlösliche Präparation ist.

5. Verwendung der Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation wenigstens ein Reagens enthält,ausgewählt aus Stabilisatoren, Puffern, isotonischen Mitteln, Excipienten, pH-Regulatoren und Konservierungsmitteln als Träger.