DE68913730T2 - Vorrichtung und Verfahren zur Optimierung der flüssig-chromatographischen Trennung einer Probe. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein entsprechendes Verfahren zur Optimierung der flüssigchromatographischen Trennung einer Probe in bezug auf einen Optimierungsparameter, beispielsweise die Zusammensetzung der mobilen Phase.
• Bei dem Analyseverfahren der Flüssigkeitschromatographie wird eine zu analysierende Probe zusammen mit einem geeigneten Lösungsmittel (mobile Phase) in eine Trennsäule gespritzt, für gewöhnlich unter sehr hohem Druck. Die verschiedenen Bestandteile der Probe reagieren unterschiedlich mit dem Säulenmaterial und dem Lösungsmittel, und zwar so, daß sich die Bestandteile zu verschiedenen Zeiten aus der Säule herauslösen. Die Substanzen, die aus der Säule heraustreten, werden anschließend von einem Detektor nachgewiesen, beispielsweise von einem photometrischen Detektor. Die Zeit, die zwischen dem Einspritzen einer Probe und dem Nachweis eines bestimmten Bestandteils liegt, wird als Retentionszeit für diesen Bestandteil bezeichnet. Das Ergebnis einer chromatographischen Trennung, das Chromatogramm, wird als Graphik in Form des Nachweissignals über der Zeit angezeigt. Ein Chromatogramm weist für gewöhnlich eine Vielzahl von Spitzen auf, wobei jede Spitze einem bestimmten Bestandteil der zu analysierenden Probe entspricht. Die Fläche der Spitze ist kennzeichnend für den Anteil des in der Probe vorhandenen jeweiligen Bestandteils.
• Um eine zuverlässige qualitative und quantitative Analyse der Probe sicherzustellen, ist es notwendig, daß das Chromatogramm eine gute Gesamtauflösung hat, das heißt, daß die Spitzen der verschiedenen Bestandteile gut voneinander getrennt sind und ihre Breite vergleichsweise schmal ist. Bei Chromatogrammen mit einer schlechten Gesamtauflösung kann es vorkommen, daß benachbarte Spitzen nicht aufgelöst werden, so daß man weder erkennen kann, daß diese Spitzen eigentlich verschiedenen Bestandteilen der Probe entsprechen, noch aussagefähige quantitative Werte ableiten kann. Es ist bekannt, daß die Gesamtauflösung eines Chromatogramms bei einer bestimmten Probe von der Zusammensetzung der mobilen Phase abhängt und daß durch Veränderung dieser Zusammensetzung, beispielsweise indem man mehrere Lösungsmittel in einem bestimmten Verhältnis miteinander mischt, eine Verbesserung dieser Auflösung erreicht werden kann.
• Verschiedene Verfahren wurden bereits vorgeschlagen, um die flüssigchromatographische Trennung einer Probe zu optimieren, wobei große Anstrengungen auf Verfahren verwendet wurden, mit denen sich die Zusammensetzung der mobilen Phase finden läßt, die zu optimalen Trennungen führt.
• Ein Verfahren und eine entsprechende Vorrichtung zur automatischen Optimierung von Trennungen in der Flüssigkeitschromatographie ist aus "Microprocessors and Microsystems", Jahrgang 7, Nr. 1, Januar/Februar 1983, Seiten 19 bis 23, J.C. Berridge "Using a microprocessor in high performance liquid chromatography" bekannt. Bei dieser bekannten Methode kommt ein Simplexoptimierungsverfahren zur Anwendung, bei dem ein mehrdimensionaler sequentieller Suchalgorithmus angewendet wird, um einen versuchsweisen Bestwert für eine flüssigchromatographische Trennung zu ermitteln.
• Ein Verfahren zur rechnergestützten Optimierung in der Gaschromatographie ist aus "Advances in Instrumentation", Jahrgang 41, Teil 1, 1986, Seiten 383 bis 402, R. Annino u.a.: "A computer aided optimization program including stationary phase selection and optimized analysis conditions" bekannt. Bei diesem Verfahren werden bestimmte Parameter, die in der gaschromatographischen Trennung von Interesse sind, auf der Grundlage theoretischer Modelle berechnet. Es ist auch möglich, daß ein Anwender anforderungsspezifische Bedingungen wählt und sich dann das entsprechende Chromatogramm anzeigen läßt.
• Ein Verfahren zur Auswahl der optimalen Zusammensetzung der mobilen Phase in der Flüssigkeitschromatographie ist auf "An Improved Optimization Procedure for the Selection of Mixed Mobile Phases in Reversed Phase Liquid Chromatography" von A.C.J.H. Drouen u.a. bekannt, erschienen in "Chromatographia", Jahrgang 16, auf den Seiten 48 bis 52. Bei diesem bekannten Verfahren handelt es sich um einen iterativen Optimierungsansatz, wobei in einem ersten Schritt einige Chromatogramme einer zu prüfenden Probe bei verschiedenen Zusammensetzungen des Lösungsmittels gemessen werden und auf der Grundlage der gemessenen chromatogramme ein sogenanntes Retentionsmodell berechnet wird, das den chromatographischen Leistungsfaktor in Abhängigkeit der Zusammensetzung des Lösungsmittels für die verschiedenen Bestandteile der Probe beschreibt. Aus dem so erhaltenen Retentionsmodell wird ein Gesamtauflösungswert für jede mögliche Zusammensetzung des Lösungsmittels abgeleitet, wobei der Gesamtauflösungswert ein Maß für die Qualität der chromatographischen Trennung bei den jeweiligen Zusammensetzung des Lösungsmittels ist. Der Adsorptionsanalytiker leitet dann eine neue chromatographische Trennung mit einer Zusammensetzung des Lösungsmittels ein, deren Auflösungswert dem Maximum der optimalen Trennung entspricht oder aber dicht daneben liegt. Die auf diese Weise erhaltenen neuen Versuchsdaten dienen zur Verfeinerung des Retentionsmodells, und eine neue Funktion des Auflösungswertes wird von dem neuen Retentionsmodell abgeleitet. Das Verfahren kann so lange wiederholt werden, bis die optimale mobile Phase gefunden worden ist.
• Das bekannte Optimierungsverfahren ist nicht in jeder Hinsicht zufriedenstellend: Je nach der Definition des Gesamtauflösungswertes kann das Optimierungsverfahren zu unterschiedlichen Ergebnissen führen, d.h. zu unterschiedlichen Zusammensetzungen des Lösungsmittels, die als optimal betrachtet werden. Außerdem kann es sein, daß die Auflösungswerte bei verschiedenen chromatographischen Trennungen nicht in ausreichendem Maß voneinander abweichen. d.h., die mit verschiedenen Trennungen verbundenen Auflösungswerte sind identisch oder fast gleich, so daß es schwierig ist, vorauszusagen, wo nach optimalen Bedingungen gesucht werden soll. Es wird versucht, diese Schwierigkeiten zu überwinden, indem die Gesamtauflösung so definiert wird, daß sie eine bessere Unterscheidung möglich macht, aber selbst mit einer solchen neu definierten Auflösung lassen sich nicht alle Trennungsprobleme zufriedenstellend lösen. Folglich werden in der Praxis voneinander abweichende Optimierungskriterien zugrundegelegt, was das Optimierungsverfahren kompliziert. Darüber hinaus bietet das bekannte Verfahren lediglich eine begrenzte Flexibilität: Wenn der Adsorptionsanalytiker beispielsweise an einer optimalen Trennung von nur bestimmten Bestandteilen der Probe interessiert ist, ist das bekannte Verfahren, das auf der Bestimmung einer Gesamtauflösung basiert, nur begrenzt anwendbar.
• In bezug auf diesen Stand der Technik ist es eine Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein entsprechendes Verfahren zur Optimierung von flüssigchromatographischen Trennungen vorzusehen, das dem Adsorptionsanalytiker mehr Flexibilität bei der Bestimmung optimaler Bedingungen für ein Trennungsproblem garantiert und dennoch unkompliziert ist, und das eine schnelle Bestimmung solcher optimaler Bedingungen gewährleistet.
• Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe bei einer Vorrichtung durch die in Anspruch 1 genannten Merkmale und bei einem Verfahren durch die in Anspruch 7 genannten Merkmale erfüllt.
• Gemäß einem zugrundeliegenden Prinzip der Erfindung weist ein Flüssigkeitschromatograph zusätzlich Mittel zur Berechnung und Anzeige des Retentionsverhaltens der Probenbestandteile in Abhängigkeit eines Optimierungsparameters auf, beispielsweise in Abhängigkeit der Zusammensetzung der mobilen Phase. Die Berechnungen beruhen sowohl auf einem theoretischen Modell als auch auf tatsächlich durchgeführten chromatographischen Trennungen der Probe. Das angezeigte Retentionsmodell gibt dem Anwender einen ersten Hinweis darauf, bei welchen Werten des Optimierungsparameters optimale Bedingungen erwartet werden könnten. Der Anwender kann dann aus dem angezeigten Retentionsmodell mittels eines Markers, beispielsweise mittels eines beweglichen Cursors, den Optimierungsparameter oder diejenigen Parameter auswählen, die optimale Bedingungen erwarten lassen. Nachdem der Anwender solch eine Auswahl getroffen hat, werden die entsprechenden Chromatogramme berechnet und angezeigt. Der Anwender kann somit direkt die resultierenden Chromatogramme für verschiedene Optimierungsparameter erkennen und auf einem Blick entscheiden, welche Chromatogramme für sein bestimmtem Trennungsproblem am besten geeignet sind. Beispielsweise sieht der Anwender sofort, ob alle Spitzen bei einem bestimmten Optimierungsparameter deutlich voneinander getrennt sind oder ob zwei oder mehrere Spitzen sich decken. Wenn der Anwender nur an einer Trennung von ein paar Bestandteilen der Probe interessiert ist, erlaubt die Erfindung, den Optimierungsparameter auszuwählen, der die beste Auflösung nur für diese interessierenden Spitzen bietet, während die Gesamtauflösung des Chromatogramms aller Bestandteile nicht optimal zu sein braucht. Außerdem kann der Anwender einen Optimierungsparameter auswählen, bei dem die interessierenden Bestandteile auf akzeptable, wenn auch nicht auf bestmögliche Weise getrennt werden, der jedoch eine kurze Analysezeit ermöglicht, eine kürzere als beispielsweise bei der Trennung mit der größten umfassenden Trennung der Spitzen. Gemäß diesem Beispiel kann der Anwender ein Optimum zwischen Trennung der Spitzen und Analysezeit gestalten.
• Einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung entsprechend beginnt das Optimierungsverfahren mit der Aufzeichnung eines Chromatogramms für mindestens zwei Grenzwerte des Optimierungsparameters (z.B. Zusammensetzung der mobilen Phase). Dann wird die Retention für die einzelnen Bestandteile der Probe abgeleitet, wobei die gemessenen Grenzwerte und ein Rechenmodell für die Retention verwendet werden, und die sich daraus ergebende graphische Darstellung der Retention über dem Optimierungsparameter wird angezeigt. Sobald der Anwender neue Parameterbedingungen aus dem angezeigten Retentionsverhalten und den entsprechenden angezeigten Chromatogrammen ausgewählt hat, wird eine eigentliche chromatographische Trennung mit diesen ausgewählten Parameterbedingungen (z.B. eine bestimmte Zusammensetzung des Lösungsmittels) durchgeführt, und die in diesem chromatographischen Durchlauf erhaltenen Versuchsdaten werden zur Verfeinerung des Rechenmodells für die Retention verwendet. Dieses Verfahren kann mehrmals wiederholt werden, bis man zufriedenstellende Chromatogramme erhält. Es ist klar, daß mit dem hier verwendeten Ausdruck "Retentionsverhalten" die Zeitfolge der Elution der Probenbestandteile aus der Trennsäule beschrieben werden soll; einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung entsprechend kann es sich dabei um die Retentionszeit handeln, doch wären auch andere Anzeigearten möglich, beispielsweise eine logarithmische Darstellung der Retentionszeit. Wenn die Retentionszeit auf der Anzeigeeinrichtung angezeigt wird, hat das den Vorteil, daß der Anwender die Analysezeiten für die chromatographischen Trennungen direkt erkennen kann.
• Die Erfindung ermöglicht eine große Flexibilität bei der Auswahl derjenigen chromatographischen Bedingungen, die für optimal bei dem jeweiligen Trennungsproblem erachtet werden, während die Optimierung beim Stand der Technik auf einem einzigen Qualitätsfaktor beruht, wodurch es zu einer ungerechtfertigten Vereinfachung des ganzen Optimierungsproblems kommt, was gegebenenfalls zu nicht zufriedenstellenden Optimierungsergebnissen führt. Im Gegensatz dazu sorgt die Vorrichtung der Erfindung für einen vollständigen Überblick über das gesamte Optimierungsproblem, nämlich über das Retentionsverhalten über den gesamten Bereich des Optimierungsparameters und ermöglicht ferner die Ableitung und Anzeige von Chromatogrammen, die aus dem angezeigten Retentionsverhalten ausgewählt wurden. Auf diese Weise bietet die Erfindung die Möglichkeit des direkten Sichtvergleichs von "Größenordnungen", welche die Qualität der Trennung viel besser beschreiben als die Qualitätsfaktoren beim Stand der Technik, nämlich die Chromatogramme selbst.
• Einer Ausführungsform der Erfindung entsprechend umfaßt die Anzeige des Retentionsverhaltens nicht nur die Anzeige der sich ändernden Retention in Abhängigkeit des Optimierungsparameters, sondern umfaßt ferner die Anzeige einer berechneten Bandbreite für die einzelnen Probenbestandteile, die der jeweiligen Breite der Spitzen in den Chromatogrammen entspricht. Somit läßt sich bereits dem angezeigten Retentionsverhalten entnehmen, wo sich Probenbestandteile überlappen.
• In einer weiteren Ausführungsform kann eine berechnete Trennungsqualitätskurve gleichzeitig mit dem Retentionsverhalten und den Chromatogrammen angezeigt werden, womit ein zusätzliches Hilfsmittel zur Auswahl optimaler Bedingungen bereitgestellt ist. Es wäre ebenfalls möglich, mehrere Trennungsqualitätskurven anzuzeigen.
• Im folgenden wird eine Ausführungsform der Erfindung mit Bezug auf die Zeichnungen erläutert.
• Figur 1 zeigt schematisch eine Vorrichtung gemäß der Erfindung zur Optimierung flüssigchromatographischer Trennungen.
• Figur 2 veranschaulicht eine typische Anzeige von berechneten Retentionsdaten und Chromatogrammen, die während des Optimierungsverfahrens angezeigt werden.
• In Figur 1 ist eine Vorrichtung gemäß der Erfindung zur Durchführung flüssigchromatographischer Trennungen und zur Optimierung solcher Trennungen gezeigt. Die Vorrichtung umfaßt ein System 1 für die Zufuhr von Lösungsmitteln, an das mehrere Lösungsmittelbehälter A, B, C, D angeschlossen sind. Bei den Lösungsmitteln kann es sich um jedwede Art von in der Flussigkeitschromatographie verwendeten Lösungsmitteln handeln, beispielsweise Wasser, Methanol, Acetonitril, Tetrahydrofuran. Das System für die Zufuhr von Lösungsmittel stellt vorher festgelegte Mischungen der Lösungsmittel A, B, C, D entsprechend den Steuersignalen von einer Steuereinheit 8 bereit und gibt an seinem Auslaß einen Hochdruckstrahl dieser Mischungen ab. Es ist klar, daß die Erfindung nicht auf vier Lösungsmittel beschränkt ist, sondern daß eine beliebige Anzahl von Lösungsmittelbehältern an das System für die Zufuhr von Lösungsmittel angeschlossen werden kann.
• Ein Mittel zur Probeneinführung 2 kann so betrieben werden, daß sie vorher festgelegte Mengen der Probe in den Lösungsmittelstrahl vom Lösungsmittel-Zufuhrsystem 1 spritzt. Die Probe wird dann unter hohem Druck in die Trennsäule 3 überführt, in der die verschiedenen Bestandteile voneinander getrennt werden und sich zu verschiedenen Zeiten aus der Säule 3 herauslösen. Ein Detektor 4, der mit dem Auslaß der Säule 3 verbunden ist, liefert Ausgangssignale, die einen Hinweis auf die Bestandteile der Probe geben. Bei dem Detektor kann es sich um jedwede Art von in der Flüssigkeitschromatographie verwendeten Detektoren handeln, wie beispielsweise einen photometrischen Detektor, Fluoreszenzdetektor, Leitfähigkeitsdetektor, elektrochemischen Detektor oder eine andere Art von Detektor, der zum Nachweis der interessierenden Bestandteile geeignet ist.
• Das Ausgangssignal des Detektors 4 wird an eine Datenverarbeitungseinrichtung 5 übertragen, in der ein Chromatogramm von den Nachweissignalen abgeleitet wird. Das Chromatogramm, d.h. eine graphische Darstellung des Detektor-Ausgangssignals über der Retentionszeit, kann auf einer Anzeigeeinrichtung 6, wie beispielsweise einem Kathodenstrahlröhren-Bildschirm, angezeigt werden. Die Datenverarbeitungseinrichtung 5 ist nicht nur in der Lage, von den Ausgangssignalen des Detektors ein Chromatogramm abzuleiten, sondern sie ist auch in der Lage, ein Chromatogramm auf der Grundlage bestimmter Eingangsparameter auf eine Weise zu berechnen, die nachstehend genauer erläutert wird. Solche berechneten Chromatogramme können ebenfalls auf der Anzeigeeinrichtung 6 angezeigt werden. Ferner können berechnete Kurven, die das Retentionsverhalten bei verschiedenen Bestandteilen der Probe in Abhängigkeit der Zusammensetzung des Lösungsmittels zeigen, als auch Kurven, welche die chromatographische Auflösung in Abhängigkeit der Zusammensetzung des Lösungsmittels darstellen, angezeigt werden. Um diese Aufgaben durchzuführen, kann ein Graphikterminal verwendet werden, das verschiedene Farben darstellt, um die verschiedenen Kurven besser voneinander unterscheiden zu können.
• Ein Eingabemittel 7, das mit der Steuereinheit 8 verbunden ist, die wiederum an die Anzeigeeinrichtung 6 angeschlossen ist, ermöglicht dem Anwender, mit dem Chromatographie-System zu kommunizieren, d.h. Befehle einzugeben, die vom System ausgeführt werden sollen, oder Informationen vom System anzufordern, die dann auf der Anzeigeeinrichtung 6 angezeigt werden. Bei dem Eingabemittel 7 kann es sich beispielsweise um eine Tastatur handeln, mit welcher der Anwender Befehle eingeben und einen oder mehrere Cursor auf der Anzeigeeinrichtung 6 steuern kann. Es ist klar, daß anstelle oder zusätzlich zu einer Tastatur ein beliebiges anderes Eingabegerät verwendet werden kann, wie beispielsweise eine Computer-Maus, eine Rollkugel oder ein Kontaktbildschirm, bei dem der Anwender zur Eingabe bestimmter Befehle an die Steuereinheit 8 auf bestimmte Bereiche auf dem Bildschirm zeigt.
• Im folgenden ist ein typisches Optimierungsverfahren mit Bezug auf Figur 2 beschrieben. Figur 2 ist eine graphische Darstellung, die während des Optimierungsverfahrens auf der Anzeigeeinrichtung 6 erscheint. Die graphische Darstellung umfaßt drei Hauptblöcke, 20, 21, 22, in denen unterschiedliche Argen von Informationen angezeigt werden, die der Adsorptionsanalytiker für den Optimierungsprozeß verwendet.
• In Block 20 ist ein abgeleitetes Retentionsmodell für die bestimmte Trennung aufgezeigt, d.h. eine graphische Darstellung der Retention über der Zusammensetzung des Lösungsmittels für die verschiedenen Bestandteile der Probe. Das gezeigte Beispiel bezieht sich auf die Trennung einer Probe aus neun antiepileptisch wirkenden Arzneipräparaten. Die neun schraffierten Bänder, die mit den Buchstaben a bis i gekennzeichnet sind, entsprechen diesen neun Bestandteilen der Probe. Bei der waagerechten Achse der graphischen Darstellung handelt es sich um die Retentionszeit, die beispielsweise in Minuten ausgedrückt wird, und bei der senkrechten Achse handelt es sich um die Zusammensetzung des Lösungsmittels. In dem gezeigten Beispiel variiert die Zusammensetzung des Lösungsmittels zwischen einem ersten Grenzwert von 60 % Wasser und 40 % Methanol (oberes Ende der senkrechten Skala) und einem zweiten Grenzwert von 80 % Wasser und 20 % Tetrahydrofuran (unteres Ende der vertikalen Skala). Die zwischen diesen beiden Grenzwerten liegenden Werte stellen die möglichen Mischverhältnisse zwischen diesen beiden Grenzwerten dar. Dies kann auf die Weise veranschaulicht werden, daß man zwei Lösungsmittelbehälter in Betracht zieht, wobei der eine ein Gemisch aus 60 % Wasser und 40 % Methanol und der andere ein Gemisch aus 30 % Wasser und 20 % Tetrahydrofuran enthält, und man aus dem Inhalt dieser beiden Behälter die möglichen Gemische erzeugt, um die Werte auf der senkrechten Skala von Block 20 zu erhalten.
• Beispielsweise entsprechen die waagerechten Zeilen 30, 31 und 32 den drei Zusammensetzung des Lösungsmittels:
• i) 65,4 % Wasser (H&sub2;O); 5,4 % Tetrahydrofuran (THF); 29,3 % Methanol (MeOH)
• ii) 66,3 % H&sub2;O; 6,3 % THF; 27,4 % MeOH
• iii) 67,5 % H&sub2;O; 7,5 % THF; 24,9 % MeOH
• Die Zusammensetzung des Lösungsmittels zwischen den beiden Grenzwerten läßt sich durch einen Parameter X, der innerhalb eines bestimmten Intervalls variiert, mathematisch beschreiben. Der Parameter X wird, wie nachstehend erläutert, im Optimierungsprozeß verwendet.
• Bei dem in Block 20 gezeigten Retentionsmodell werden nicht nur die Retentionszeiten für die Bestandteile a bis i der Probe in Abhängigkeit der Zusammensetzung des Lösungsmittels angezeigt, sondern auch die Bandbreiten w für die Bestandteile in Abhängigkeit der Zusammensetzung des Lösungsmittels. Somit entspricht ein Querschnitt entlang einer waagerechten Zeile im Retentionsmodell von Block 20, wie beispielsweise der Zeile 30, 31 oder 32, einem Chromatogramm, d.h. einer Darstellung der chromatographischen Spitzen in Abhängigkeit der Retentionszeit. In Block 21 werden die drei Chromatogramme angezeigt, die sich aus dem waagerechten Querschnitt entlang der jeweiligen Zeilen 30, 31 und 32 ergeben. Die Position der einzelnen Zeilen kann über das Eingabemittel 7 vom Anwender gewählt werden. Vorzugsweise können die Zeilen als Antwort auf die Benutzersteuerung zwischen den Grenzwerten wie ein Cursor bewegt werden, beispielsweise über entsprechende Tasten auf einer Tastatur oder mittels einer Computer-Maus, und zwar so, daß die momentane Position der Cursor- Zeile auf dem Bildschirm 6 jeweils angezeigt wird.
• Das Chromatogramm, das der momentanen Position der Cursor-Zeile entspricht, wird in Block 21 angezeigt. Im vorliegenden Beispiel werden die Chromatogramme, die den Cursor-Zeilen 30, 31, 32 entsprechen, im oberen, mittleren beziehungsweise unterer Drittel des Blocks 21 angezeigt. Die Daten, die den angezeigten Chromatogrammen entsprechen, werden von der Datenverarbeiturgseinrichtung 5 von den Daten abgeleitet, die das in Block 20 angezeigte Retentionsmodell darstellen. Die angezeigten Chromatogramme weisen entsprechend den Bestandteilen der Probe Spitzen auf, die mit den Buchstaben a bis i gekennzeichnet sind, wie in dem Retentionsmodell in Block 20 gezeigt ist. Der Adsorptionsanalytiker kann somit unmittelbar die Chromatogramme erkennen, die sich bei einer bestimmten Zusammensetzung des Lösungsmittels für das angezeigte Retentionsmodell ergeben würden, so daß er schnell entscheiden kann, welche Zusammensetzung des Lösungsmittels für sein Trennungsproblem die geeignetste wäre.
• In Block 22 ist ein Trennungsqualitätsfaktor für die Chromatogramme in Abhängigkeit der Zusammensetzung des Lösungsmittels gezeigt. Der Trennungsqualitätsfaktor ist ein Maß dafür, wie gut die einzelnen Bestandteile der Probe voneinander getrennt sind, oder mit anderen Worten ein Maß für die Gesamtauflösung des Chromatogramms. Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten für die Definition des Trennungsqualitätsfaktors: In Block 22 sind zwei Arten von Qualitätsfaktoren gezeigt. Die in der linken Hälfte von Block 22 gezeigte Kurve stellt die Auflösung des Spitzenpaares in einem Chromatogramm dar, das am schlechtesten getrennt ist, wobei die Auflösung in diesem Zusammenhang als Quotient der Differenz zwischen den Retentionszeiten dieser Spitzen und der Summe der jeweiligen Breite der chromatographischen Spitzen definiert ist. Die senkrechte Achse in der Anzeige von Block 22 entspricht der Zusammensetzung des Lösungsmittels und ist identisch mit der senkrechten Achse in der Anzeige von Block 20. Die waagerechte Achse zeigt die Größenordnung des Qualitätsfaktors an.
• In der rechten Hälfte von Block 22 wird eine zweite Kurve des Trennungsqualitätsfaktors angezeigt, wobei der Qualititsfaktor anders als in der linken Hälfte definiert ist. In diesem Beispiel ist der Qualitätsfaktor proportional zum Produkt aller Auflösungen benachbarter Spitzen im Chromatogramm, gemäß Gleichung (2) des oben genannten Artikels von A.C.J.H. Drouen u.a. mit dem Titel "An Improved Optimization Procedure for the Selection of Mixed Mobile Phases in Reversed Phase Liquid Chromatography", erschienen in "Chromatographia", Jahrgang 16 Seiten 48 bis 52.
• Wie in der linken Hälfte von Block 22 entspricht die senkrechte Achse der Zusammensetzung des Lösungsmittels, und die waagerechte Achse (die in der Mitte des Blocks anfängt) zeigt die Größenordnung des Qualitätsfaktors an. Die waagerechten Cursor- Zeilen 30, 31 und 32, die bereits in Verbindung mit Block 20 beschrieben wurden, erstrecken sich über den Block 20 hinaus in den Block 22, um dem Anwender das Ablesen des Trennungsqualitätsfaktors für eine beliebige, mit Hilfe der Zeilen-Cursor 30, 31 oder 32 gewählte Zusammensetzung des Lösungsmittels zu erleichtern.
• Wie aus Block 22 hervorgeht, weichen die Kurven des Trennungsqualitätsfaktors in der linken und rechten Hälfte voneinander ab, insbesondere befinden sich die Maximalwerte der Kurven an verschiedenen Stellen, d.h. bei verschiedenen Zusammensetzungen des Lösungsmittels. Der Anwender kann wählen, welche Trennungsqualitätskurve zur Auswahl der von ihm für optimal erachteten Zusammensetzung des Lösungsmittels er in Betracht ziehen möchte. Ebenfalls in Block 22 gezeigt ist ein schraffiertes Band 40, das zur Trennungsqualitätskurve in der linken Hälfte gehört und dazu dient, einen Bereich für eine bestimmte Mindesttrennungsqualität zu definieren. Die Trennungsqualitätswerte am Schnittpunkt der waagerechten Zeilen-Cursor 30, 31, 32 und der Trennungsqualitätskurven können am Bildschirm angezeigt werden.
• Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Anzeige gemäß Figur 2 dem Anwender in Block 22 das berechnete Retentionsmodell, d.h. die Abhängigkeit der Retentionszeit von der Zusammensetzung des Lösungsmittels, zeigt und es ihm erlaubt, bestimmte Zusammensetzungen des Lösungsmittels zu markieren, für die das resultierende Chromatogramm dann berechnet und in Block 21 angezeigt wird. Die Blöcke 20 und 21 sind aufeinander abgestimmt, so daß der Anwender die Spitzen der angezeigten Chromatogramme den im Retentionsmodell gezeigten Bändern problemlos zuordnen kann. Ebenfalls angezeigt werden eine oder mehrere Trennungsqualitätskurven, die auf das Retentionsmodell von Block 20 abgestimmt sind, und zwar so, daß der Anwender direkt Informationen über einen Trennungsqualitätswert für eine ausgewählte Zusammensetzung des Lösungsmittels erhält. Die Bänder im Retentionsmodell und die zugehörigen Spitzen in den Chromatogrammen haben jeweils dieselbe Farbe, so daß die Identifikation der verschiedenen Bestandteile in der Anzeige des Retentionsmodells und in der Anzeige der Chromatogramme vereinfacht wird. Anstelle von verschiedenen Farben für die verschiedenen Probenbestandteile ist es auch möglich, unterschiedliche Schraffuren zu verwenden.
• Vorstehend wurden die graphischen Darstellungen erklärt, die während des Optimierungsprozesses auf der Anzeigeeinrichtung 6 erscheinen. Im folgenden wird erklärt, wie man die angezeigten Daten erhält und insbesondere, wie das in Block 20 angezeigte Retentionsmodell abgeleitet wird.
• In einem ersten Schritt des Optimierungsverfahrens werden die Grenz- oder Anfangsbedingungen festgelegt. Wenn es sich bei dem Optimierungsparameter um die Zusammensetzung des Lösungsmittels handelt, wie dies in der Ausführungsform gemäß Figur 2 der Fall ist, werden zwei Lösungsmittel-Zusammensetzungen mit Grenzwertcharakter festgelegt, zwischen denen der Optimierungsparameter X variieren kann. Im vorliegenden Beispiel sind diese Grenzbedingungen wie folgt: 60 % H&sub2;O / 40 % MeOH und 80 % H&sub2;O / 20 % THF. Die Grenzbedingungen können auf unterschiedliche Weise festgelegt werden: Eine Möglichkeit, entsprechend der Ausführungsform von Figur 2, besteht darin, zwei Zusammensetzungen dem Lösungsmittels mit Grenzwertcharakter auszuwählen, und zwar so, daß die Analysezeiten für die interessierende Probe, d.h. die Retentionszeiten der letzten Probenbestandteile, die jeweils aus der Trennsäule eluieren, weitgehend gleich sind.
• Nachdem die Grenzbedingungen festgelegt und die bei diesen Bedingungen resultierenden Chromatogramme aufgezeichnet wurden, wird das erste Retentionsmodell von der Datenverarbeitungseinrichtung 5 berechnet und anschließend von der Anzeigeeinrichtung 6 in Block 20 angezeigt. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Berechnung des Retentionsmodells wie folgt durchgeführt:
• Zunächst wird als theoretisches Modell angenommen, daß der natürliche Logarithmus des chromatographischen Leistungsfaktors ki für den Probenbestandteil i linear mit dem Optimierungsparameter X (z.B. der Zusammensetzung des Lösungsmittels) abweicht, d.h. es gilt die Gleichung:
• ln (ki) = a X + b (1),
• wobei a und b Konstante sind. Dieses Modell hat sich als eine adäquate Beschreibung des tatsächlichen Retentionsverhaltens herausgestellt, und dennoch ist es mathematisch einfach. Für den Leistungsfaktor ki und die Retentionszeit tri des i-ten Probenbestandteils gilt das bekannte Verhältnis:
• tri = (1 + ki) to (2),
• wobei to die sogenannte nicht in Anspruch genommene Zeit oder Leerzeit der Säule ist. Auf der Grundlage dieses theoretischen Modells wird eine lineare Interpolation zwischen den experimentell festgelegten Grenzbedingungen durchgeführt. Das heißt, daß in einer graphischen Darstellung in Form von ln k übel X die Grenzbedingungen durch eine gerade Linie miteinander verbunden sind, um die Werte zwischen den Grenzwerten zu erhalten. Die Retentionszeiten für die einzelnen Probenbestandteile werden aus den so interpolierten Leistungsfaktoren unter Anwendung der Gleichung (2) berechnet.
• Die auf die soeben beschriebene Weise erhaltenen Daten charakterisieren die Änderung der Retentionszeiten für die einzelnen Probenbestandteile in Abhängigkeit der Zusammensetzung des Lösungsmittels und entsprechen den Mittellinien der in Block 20 angezeigten schraffierten Bänder. Die Breiten w der in Block 20 gezeigten Bänder werden, diesem besonderen Beispiel entsprechend, durch das Verhältnis w = 4 i bestimmt, wobei i die Standardabweichung einer Gaußschen Spitze ist und durch die Formel
• i= tri/ [N] (3)
• ausgedrückt wird, wobei tri die Retentionszeit des i-ten Probenbestandteils ist und N die Plattenanzahl der Trennsäule, die vom Anwender in die Datenverarbeitungseinrichtung eingegeben werden kann. Bei den in Block 21 angezeigten chromatographischen Spitzen a bis h handelt es sich um Gaußsche Spitzen mit einer Standardabweichung i, das heißt, daß die volle Breite dieser Spitzen bei einem Anteil von 0,607 ihrer Gesamthöhe gleich 2 i ist. Es ist klar, daß die Erfindung nicht auf Gaußsche Spitzen beschränkt ist, sondern daß auch andere Formen von Spitzen möglich sind und daß die Breite der Spitzen anders definiert werden kann.
• Jetzt sind alle für den Block 20 benötigten Daten berechnet, so daß sie angezeigt werden können. Dann wird der Trennungsqualitätsfaktor (oder die Trennungsqualitätsfaktoren) berechnet und in Block 22 angezeigt. Der Anwender hat nun einen Überblick über das Retentionsmodell im gesamten Bereich der Zusammensetzungen des Lösungsmittels und bekommt eine Vorstellung davon, wo optimale Bedingungen zu erwarten sind. Die Anzeige des Qualitätsfaktors stellt für den Anwender ein zusätzliches Hilfsmittel dar, um zu entscheiden, mit welchen Zusammensetzungen des Lösungsmittels er die besten Ergebnisse erzielen könnte. Wenn dem Anwender die waagerechten Cursor 30, 31, 32 bei bestimmten Zusammensetzungen des Lösungsmittels (senkrechte Achse von Block 20) positioniert hat, werden die resultierenden Chromatogramme von der Datenverarbeitungseinrichtung 5 berechnet und in Block 21 angezeigt. Die Verwendung mehrerer Cursor 30, 31, 32 hat den Vorteil, daß mehrere Chromatogramme direkt verglichen werden können. Für die Berechnung und die Anzeige von Chromatogrammen bedarf es nur einen Augenblicks, sie erfolgt fast gleichzeitig mit der Positionierung des Cursors bei einer bestimmten Zusammensetzung des Lösungsmittels, so daß der Anwender alle möglichen Chromatogramme schnell abfragen kann.
• Aus der linken Hälfte von Block 22 geht hervor, daß die Qualitätskurve über der Cursorzeile 30 ein deutliches Maximum aufweist und dann gegen das obere Ende von Block 22 steil abfällt. Folglich würde sich die Qualität der Trennung bei Optimierungsparametern in diesem Bereich drastisch ändern. Es geht auch hervor, daß die Änderung des Qualitätswerts unter der Cursor-Zeile 30 vergleichsweise gleichmäßig ist, so daß es ratsam ist, einen Parameterwert aus diesem Bereich zu wählen. Die Erfindung hat somit auch den Vorteil, daß dem Anwender eine Art "Robustheitsinformationen" zur Verfügung gestellt werden, d.h. Informationen über den Änderungsgrad (Gradienten) der Qualität in Abhängigkeit des Optimierungsparameters.
• Nachdem der Anwender festgestellt hat, welches der Chromatogramme für seine Analyseaufgabe am besten geeignet ist, wählt er dieses Chromatogramm aus, indem er einen entsprechenden Befehl über das Eingabemittel 7 eingibt. Dann leitet die Steuereinheit 8 eine chromatographische Trennung der Probe mit einer Zusammensetzung des Lösungsmittels ein, die dem gewählten Chromatogramm entspricht. Wenn der Anwender beispielsweise auf der Grundlage von Figur 2 beschlossen hat, daß das Chromatogramm im mittleren Drittel von Block 21 (entsprechend der Position des Cursors 31 in Block 20) das beste ist, drückt er eine bestimmte Taste, um dieses Chromatogramm auszuwählen und um einen chromatographischen Durchlauf mit dieser Zusammensetzung des Lösungsmittels zu starten. Dieser chromatographische Durchlauf ergibt neue Versuchsdaten, die in der Datenverarbeitungseinrichtung gespeichert und zur Berechnung eines verfeinerten Retentionsmodells verwendet werden.
• Das neue Retentionsmodell wird entsprechend demselben Prinzip, wie es vorstehend in Verbindung mit dem ersten Retentionsmodell erklärt wurde abgeleitet, nämlich durch eine lineare Interpolation des natürlichen Logarithmus des Retentionsfaktors ki in Abhängigkeit der Zusammensetzung des Lösungsmittels X (siehe Gleichung (1)). Somit werden die experimentell festgelegten Punkte in einer graphischen Darstellung in Form von ln (ki) in Abhängigkeit von X durch gerade Linien stückweise miteinander verbunden. Die jeweilige Breite der Bänder des neuen Retentionsmodells wird gemäß Gleichung (3) berechnet. Das neue Retentionsmodell wird in Block 20 angezeigt, wo es das erste Retentionsmodell ersetzt. Auch die Trennungsqualitätsfaktoren werden berechnet und in Block 22 angezeigt. Der Anwender kann die Cursor 30, 31, 32 an jedweder gewünschten Stelle entlang der senkrechten Achse von Block 20 positionieren und damit veranlassen, daß das entsprechende Chromatogramm berechnet und in Block 21 angezeigt wird. Der Anwender betrachtet und vergleicht die angezeigten Chromatogramme und wählt das Chromatogramm aus, das ihm optimal erscheint.
• Dann wird eine neue chromatographische Trennung der Probe mit der Zusammensetzung des Lösungsmittels durchgeführt, die dem ausgewählten Chromatogramm entspricht. Die neuen Versuchsdaten werden zur erneuten Verfeinerung des Retentionsmodells verwendet. Wieder wählt der Anwender ein optimales Chromatogramm aus, und der Prozeß beginnt von neuem. Die oben beschriebenen Schritte werden mehrmals wiederholt, bis sich das Retentionsmodell nicht mehr wesentlich ändert, d.h. bis das "wahre" Retentionsmodell für die Probe gefunden worden ist. Normalerweise lassen sich gute Ergebnisse nach drei bis fünf Durchläufen erzielen. Somit steht ein iterativer, interaktiver Optimierungsprozeß zur Verfügung der schnell und dennoch sehr flexibel ist, da er es dem Anwender ermöglicht, die für seinen Fall optimalen Bedingungen selbst zu beurteilen.
• Anstelle einer Gaußschen Form können die berechneten chromatographischen Spitzen auch ein anderes Profil aufweisen das sogar asymmetrisch sein kann. Es ist auch klar, daß die jeweilige Breite der in Block 20 angezeigten Bänder nicht auf die Breite von 4 entsprechend der Gleichung (3) begrenzt ist. Die Breite der Bänder kann beispielsweise gleich der Breite der entsprechenden chromatographischen Spitzen bei der Hälfte ihres Maximalwertes sein. Außerdem ist es möglich, verschiedene Änderungen an dem bestimmten, in Figur 2 gezeigten Anzeigemodus vorzunehmen, wenn nur die Retention für die Probenbestandteile in Abhängigkeit eines Optimierungsparameters angezeigt wird und die Chromatogramme, die wählbaren Parametern entsprechen, angezeigt werden können.

Claims (7)

1. Eine Vorrichtung zur Optimierung der flüssigchromatographischen Trennung einer Probe in bezug auf einen Optimierungsparameter X (beispielsweise die Zusammensetzung der mobilen Phase), die folgendes umfaßt:

- Mittel (1, 2, 3, 4) zur Durchführung einer flüssigchromatographischen Trennung einer Probe, die eine Vielzahl von Probenbestandteilen enthalten,

- Datenverarbeitungsmittel (5) zur Ableitung des Retentionsverhaltens von Probenbestandteilen (a bis i) in Abhängigkeit des Optimierungsparameters X und zur Ableitung der Chromatogramme, die einstellbaren Werten (30, 31, 32) des Optimierungsparameters X entsprechen,

- Anzeigemittel (6) zur Anzeige des abgeleiteten Retentionsverhaltens (20) in Abhängigkeit des Optimierungsparameters X und zur Anzeige von abgeleiteten Chromatogrammen (21), die ausgewählten Werten (30, 31, 32) des Optimierungsparameters X entsprechen, wobei diese Anzeige gleichzeitig mit der Anzeige des abgeleiteten Retentionsverhaltens (20) erfolgt, und

- Steuerungsmittel (8) zur Einleitung einer flüssigchromatographischen Trennung der Probe bei einem bestimmten Wert des Optimierungsparameters X,

wobei die Datenverarbeitungsmittel (5) dazu dienen, ein neues Retentionsverhalten der Probenbestandteile abzuleiten und die Retentionsdaten, die bei der zuvor durchgeführten flüssigchromatographischen Trennung gemessen wurden, als Einstellwerte für das neue Retentionsverhalten verwendet werden.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, die Markierungsmittel (30, 31, 32) aufweist, die auf der Anzeigeeinrichtung (6) angezeigt werden und bewegt werden können, um bestimmte Werte des Optimierungsparameters X aus der Anzeige des Retentionsverhaltens (20) auszuwählen, und zwar als Antwort auf Befehle, die über die Eingabemittel (7) eingegeben wurden, wobei durch die Positionierung der Markierungsmittel (30, 31, 32) auf einem bestimmten Wert des Optimierungsparameters das entsprechende Chromatogramm von den Datenverarbeitungsmitteln (5) abgeleitet und von den Anzeigemitteln (6) angezeigt wird.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Datenverarbeitungsmittel (5) dazu dienen, von dem Retentionsverhalten, entsprechend einem oder mehreren vorgegebenen Verhältnissen, Trennungsqualitätsfaktoren für die angezeigten Werte des Optimierungsparameters X abzuleiten, und wobei die Anzeigemittel (6) dazu dienen, gleichzeitig mit der Anzeige des Retentionsverhaltens (20) eine graphische Darstellung (22) des(r) Trennungsqualitätsfaktors(en) anzuzeigen.

4. Vorrichtung gemäß jedem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Anzeige des Retentionsverhaltens eine graphische Darstellung der Retentionszeit tri der Probenbestandteile über dem Optimierungsparameter X umfaßt.

5. Vorrichtung gemäß jedem der vorstehenden Ansprüche, wobei die abgeleiteten Breiten (w) der chromatographischen Spitzen (21: a bis i) eine Funktion der Retentionszeit tri sind.

6. Vorrichtung gemäß jedem der vorstehenden Ansprüche, wobei zur Ableitung des Retentionsverhaltens das folgende Verhältnis zur Anwendung kommt: ln (ki) = a X + b, wobei ki der chromatographische Leistungsfaktor, X der Optimierungsparameter, a und b Konstanten sind, und wobei man abgeleitete Retentionsdaten durch Interpolation zwischer Retentionsmeßdaten erhält.

7. Ein Verfahren zur Optimierung der flüssigchromatographischen Trennung einer Probe in bezug auf einen Optimierungsparameter X (beispielsweise die Zusammensetzung der mobilen Phase), das folgende Schritte umfaßt:

a) Ableitung des Retentionsverhaltens von Probenbestandteilen (a bis i) in Abhängigkeit des Optimierungsparameters X,

b) Anzeige des abgeleiteten Retentionsverhaltens (20) auf einem Anzeigemittel (6) in Abhängigkeit des Optimierungsparameters X,

c) Ableitung und Anzeige von Chromatogrammen (21) auf den Anzeigemitteln (6), und zwar gleichzeitig mit dem abgeleiteten Retentionsverhalten, die ausgewählten, auf den Anzeigemitteln (6) angezeigten Werten (30, 31, 32) des Optimierungsparameters X entsprechen,

d) Durchführung einer flüssigchromatographischen Trennung der Probe, wobei der Parameter X aus den angezeigten Werten (30, 31, 32) ausgewählt wurde, um Retentions- Versuchsdaten zu erhalten, und

e) Verwendung der in Schritt d) erhaltenen Retentions- Versuchsdaten zur Ableitung eines neuen Retentionsverhaltens und

f) nochmalige Durchführung der Schritte b) bis d) unter Verwendung des neuen Retentionsverhaltens.