DE68907458T2

DE68907458T2 - Verbindungen mit Aktivität gegen Gewebemalaria und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Info

Publication number: DE68907458T2
Application number: DE89402593T
Authority: DE
Inventors: Jean-Bernard Falmagne; Philippe Pirson; Andre Trouet
Original assignee: La Region Wallonne
Current assignee: La Region Wallonne
Priority date: 1988-09-23
Filing date: 1989-09-21
Publication date: 1993-12-16
Anticipated expiration: 2009-09-22
Also published as: US5110935A; ATE91283T1; FR2644462B1; EP0362031A1; EP0362031B1; ES2058576T3; DE68907458D1; FR2644462A1; JPH02129170A

Description

Die vorliegende Erfindung gehört in das Gebiet der therapeutischen Behandlung von Human-Malaria. insbesondere der Gewebeformen.
2,5 Milliarden Menschen, die in den endemischen Zonen leben, wo die Malaria grassiert, mahnen das bis heute vergebliche Bemühen an, diese Krankheit zu kontrollieren. 400 Millionen Menschen leben in den Regionen, wo keine prophylaktische Maßnahme angewendet wird. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt ein, daß in jedem Jahr eine Million Kinder von unter fünf Jahren an dieser Krankheit sterben, und das nur auf dem afrikanischen Kontinent.
Es existieren vier Stämme von Plasmodien, die für die Krankheit beim Menschen verantwortlich sind. Sie weisen einen gleichartigen Evolutionszyklus auf, der einen Uberträger, einen weiblichen Moskito der Gattung Anopheles, und einen Wirt, den Menschen, einbezieht. Plasmodium falciparum (malignes Tertiärfieber) ist der furchtbarste dieser Stämme, er ist verantwortlich für tödliche Komplikationen bei Malaria cerebralis und eine der ersten Ursachen für die Kindersterblichkeit in den endemischen Gebieten.
Plasmodium vivax und P. ovale (benignes Tertiärfieber) sind weniger virulent, aber sie produzieren latente Formen in den Hepatozyten, den Hypnozoiten. Diese Formen sind verantwortlich für klassische Rückfälle, die nach ei ner einzigen Infektion über eine lange Zeitdauer (zwei bis fünf Jahre) fortbestehen können. P. malariae ist wenig verbreitet, es ist verantwortlich für chronische Nierenerkrankungen, wie der Nephritis und den tödlichen nephrotischen Syndromen, und kann über mehrere Jahre im Blut fortbestehen.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die Entwicklung von neuen Medikamenten, die bei der Human-Malaria wirksam sind, insbesondere bei ihren Gewebeformen, nämlich neue Aminochinolin-Derivate, besonders neue Derivate von Primaquin, das die folgende Struktur aufweist: Formel I
Bei der vorliegenden Patentanmeldung versteht man unter Aminochinolin ein Derivat des Chinolins, das mindestens eine freie Amin-Funktion aufweist, insbesondere die 8-Aminochinoline, wie sie das Primaquin [6-Methoxy-8-(4-amino-1-methylbutylamino)-chinolin] darstellt, aber auch andere 8-Aminochinoline mit einer primären Amin-Funktion am Ende der Seitenkette, wie Chinocid [6- Methoxy-8-(4-aminopentylamino)-chinolin oder SN 3883 [6-Methoxy-8-(4-aminobutylamino)-chinolin].
Aber es existieren ebenfalls noch andere Derivate von Primaquin, bei denen die Modifizierungen vom Chinolinkern (in Position 2,4,2-4,5,4-5) und von der Seitenkette (4-Amino-1-alkylbutylamino) getragen werden, die von der vorliegenden Erfindung umfaßt werden.
Bei den klassischen Behandlungen der Malaria, im wesentlichen repräsentiert durch die 8-Aminochinoline (Primaquin, Chinocid), sind die Gewebe-Schizonten für die Kausal-Prophylaxe verantwortlich, nämlich die Vorbeugung der Blutinfektion durch Zerstörung der primären Gewebeformen (exo-erythrozytär) bei P. falciparum und die Radikal-Behandlung durch Entfernung der sekundären Gewebeformen bei P. vivax und P. ovale. Das Primaquin, ein 6-Methoxy-8-(4- amino-1-methylbutylamino)-chinolin der Formel I, und vor mehr als 30 Jahren eingeführt, ist klinisch bei den beständigen Gewebeformen von P. vivax und P.ovale beim Menschen wirksam und immer ein Medikament der Wahl.
Dennoch begrenzt die Toxizität des Primaquins seinen Einsatz bei einer kontrollierten klinischen Verwendung. Die ernsthafteste toxische Wirkung ist die Hämolyse, besonders bei Individuen, die ein erythrozytäres genetisches Defizit aufweisen, beispielsweise an Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Die Methämoglobinurie, gastro-intestinale Störungen sowie einige Wirkungen am Zentralnervensystem sind ebenfalls signifikante toxische Wirkungen des Primaquins und anderer 8-Aminochinoline.
Die Anzahl an Antimalariamitteln, die eine radikale kausale oder kurative prophylaktische therapeutische Wirkung besitzen, ist extrem begrenzt. Das Primaquin ist das einzige Medikament für die radikale kurative Behandlung, aber die sekundären toxischen Wirkungen begrenzen dabei scharf die therapeutische Anwendung.
Es ist festzustellen, daß nur die Verbindungen aus der Familie der 8- Aminochinoline geeignet sind, eine umfassende Genesung herbeizuführen.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue Antimalaria-Derivate von Chinolin vorzuschlagen, insbesondere neue Derivate von 8-Aminochinolin, die einen günstigeren therapeutischen Index besitzen.
Anders gesagt ist das Ziel der vorliegenden Erfindung die Reduzierung der den genannten Antimalaria-Chinolinen, wie dem Primaquin, innewohnenden Toxizität und die Erhöhung ihrer Aktivität, insbesondere von Primaquin, bei den hepatitischen Gewebeformen.
Die Patentanmeldung EP-A-28649, die einen Teil des Standes der Technik i.S. des Art. 54(3) EPÜ darstellt, beschreibt aniinoaktive Derivate des Primaquins, insbesondere das L-Glutamyl-Primaquin. die Vorläuferverbindungen von diesem sind.
Der Artikel in Bull. W.H.O., 1981, Vol.59, 449, beschreibt die Leu-PQ-, Ala-Leu-PQ- und Ala-Leu-Ala-Leu-PQ-Derivate.
Der Artikel in J. Med. Chem. 1988, Vol 31, 870, beschreibt die Lys-PQ- Val-Leu-Lys-PQ-, D-Val-Leu-Lys-PQ- und die D-Ala-Leu-Lys-PQ-Derivate.
Man stellt fest, daß das in der europäischen Anmeldung EP 37 388 vorgeschlagene, mit L-Leucin verbundene Primaquin unter Berücksichtigung seiner Bedeutung als Linker oder Brücke in den Rahmen der konjugierten Überträger- Brücken-Drogen fällt. Das L-Leucyl-Primaquin regeneriert nämlich den freien Wirkstoff, der der lysosomalen Umsetzung unterzogen wurde. Jedoch erweist sich der therapeutische Index der Derivate von PQ mit dem angrenzenden, nicht konjugierten L-Leucin als weniger interessant als der der Derivate, die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden.
Zu diesem Zweck hat die vorliegende Erfindung Antimalaria-Derivate von Aminochinolin zum Gegenstand, insbesondere Derivate von Primaquin, deren wesentliches Merkmal es ist, schematisch der Formel
PQ - X
zu entsprechen, in der
- PQ ein Antimalaria-8-Aminochinolin darstellt, insbesondere das Primaquin,
- X eine Aminosäure oder ein Peptid mit 2 bis 4 Aminosäuren bedeutet, wobei die Aminosäure oder die erste Aminosäure des Peptids, die an das PQ angrenzt, ausgewählt wird unter α- oder ß- Asparaginsäure, γ-Glutaminsäure oder Pyroglutaminsäure,
- die Bindung PQ-X eine kovalente Peptid-Bindung zwischen der freien Amino- Gruppe des PQ und einer Carboxylgruppe der Aminosäure oder der ersten Aminosäure von X ist.
In der vorliegenden Erfindung versteht man unter "α-(β-)Asparaginsäure oder γ-Glutaminsäure", daß die angrenzende Aminosäure an PQ in Form von Ester durch ihre Carboxylfunktion Jeweils in α oder γ gebunden ist.
Das Primaquin wirkt wie ein Oxydationsmittel und destabilisiert die Membran der roten Blutkörperchen, die eine Hämolyse hervorrufen, was der Ursprung für seine hauptsächliche Toxizität ist.
Das in Übereinstimmung mit der Erfindung durchgeführte Hinzufügen einer Aminosäure oder eines Peptides reduziert das Eindringen des Primaquins in die roten Blutkörperchen im Hinblick auf die sterische Hinderung.
Außerdem ist in ganz und gar überraschender Weise die Wirkung dieser neuen Derivate viel mehr ausgeprägt. Es wurde ebenfalls eine bemerkenswerte niedrige Toxizität beobachtet.
Wenn die kovalente Bindung zwischen PQ und X in dem Serum stabil ist und den lysosomalen Hydrolasen widersteht, dann ist die günstige Wirkung der Aminosäure oder des Peptides noch größer. Diese zusätzliche Bedingung tritt insbesondere ein, wenn X eine β-Asparaginsäure. γ-Glutaminsäure oder Pyroglutaminsäure ist.
Vorteilhafterweise ist daher gemäß der Erfindung die Aminosäure oder die erste Aminosäure des Peptids γ-Glutaminsäure oder β-Asparaginsäure, durch ihre γ- oder β-Carboxylgruppen gebunden an PQ, oder auch Pyroglutaminsäure oder Asparaginsäure, gebunden durch ihre α-Carboxvlgruppe an PQ.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die an PQ angrenzende Aminosäure aus der Serie D oder L ausgewählt, aber vorzugsweise aus der Serie L.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat die vorliegende Erfindung neue Primaquin-Derivate zum Gegenstand, deren wesentliches Merkmal es ist, schematisch der Formel
PQ - X
zu entsprechen, in der
- PQ ein Antimalaria-8-Aminochinolin darstellt, insbesondere das Primaquin,
- x γ-L-Glutaminsäure, L-Pyroglutaminsäure, α-L- oder β-L-Asparaginsäure bedeutet,
- die Bindung PQ-X eine kovalente Peptid-Bindung zwischen der freien Amino- Gruppe des Primaquins und der Carboxylgruppe von X ist, stabil im Serum und widerstandsfähig gegen die lysosomalen Hydrolasen.
Es handelt sich daher um N-(α-L-Pyroglutamyl)-RQ, N-(γ-L-Glutamyl)-PQ, N-(α-L-Asparaginyl)-PQ und N-(ß-L-Asparaginyl]-PQ.
Die Produkte auf der Basis von PQ sowie die erhaltenen Produkte PQ-X können in Form ihrer Additionssalze mit Säuren vorliegen.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Antimalaria-Aminochinolin-Derivate zu Gegenstand, insbesondere der neuen Derivate von Primaquin.
Beim wesentlichen Merkmal des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung bringt man durch Kondensation eine Aminosäure oder ein Peptid in Form der Säure, deren Aminfunktionen, und gegebenenfalls die Carboxylfunktionen α, γ oder ß, eventuell geschützt sind, mit Aminochinolin oder einem seiner Salze, die eine freie Aminfunktion tragen, in Anwesenheit eines Kondensationsmittels zur Reaktion,
Die Schutzgruppen der Aminfunktionen sind klassische Gruppen, aber vorzugsweise verwendet man tert.-Butyloxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl.
Die Schutzgruppen der Carboxylfunktion sind klassische Gruppen, wie tert.-Butyl oder Benzyl.
Die Säure-Funktion der Aminosäure oder des Peptides kann auch aktiviert werden, beispielsweise in Form eines Esters mit N-Hydroxysuccinimid.
Das Kondensationsmittel ist im allgemeinen ein Carbodiimid, wie Dicyclohexylcarbodiimid.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens geht man von einem Aminochinolin-Salz aus, beispielsweise vom Diphosphat des Primaquins, und von der Aminosäure oder dem Peptid, deren Amin-Funktion und gegebenenfalls die Carboxylfunktionen α, γ oder ß, eventuell durch beispielsweise eine tert.- Butyloxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonyl-Gruppe für die Aminfunktion und tert.-Butyl oder Benzyl für die Carboxylfunktion geschützt sind, wobei man die folgenden Stufen durchführt:
a) man bringt N-Hydroxysuccinimid oder Jede andere, die nicht geschützte Säure-Funktion der Aminosäure oder des Peptides aktivierende Gruppe. mit dem gegebenenfalls geschützten Derivat der Aminosäure oder des Peptides zur Reaktion,
b) man bringt das Aminochinolin, wie Primaquin, freigesetzt aus seinem Salz durch beispielsweise eine Ammoniak-Lösung, mit beispielsweise dem N-Hydroxy- succinimid-Ester des geschützten Aminosäure-Derivates oder Peptides zur Reaktion,
c) man reinigt das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt durch Chromatographie auf Silicagel,
d) die Schutzgruppen werden dann gegebenenfalls in Anwesenheit von Säure, beispielsweise Trifluoressigsäure, abgespalten, um das Derivat PQ-X in Form von Salz, beispielsweise als Trifluoracetat, zu erhalten, oder werden durch Hydrogenolyse abgespalten.
Diese Gruppe kann unter Bedingungen entfernt werden, die die gebildete Peptid-Bindung nicht zerstören.
Gemäß einem weiteren besonderen Merkmal des Verfahrens wird das Gegenanion Trifluoracetat durch Hydrochlorid oder Phosphat ausgetauscht.
Mit dem Ziel Oxydationsreaktionen zu inhibieren, sieht ein weiteres besonderes Merkmal der Erfindung vor, daß die wäßrige Lösung, die das Hydrochlorid-Salz des Derivates gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, mit Natriumbisulfit behandelt wird.
Man kann ein PQ-X-Derivat, worin X die L-Pyroglutaminsäure darstellt, erhalten, indem man einen Ester in y der L-Glutaminsäure in das N-Carboxy- anhydrid umwandelt, wobei die Reaktion in Anwesenheit von Phosgen durchgeführt wird und das N-Carboxyanhydrid-Derivat an PQ durch Reaktion bei einer Temperatur von 0 ºC in THF gekuppelt wird, um das PQ-(L-Pyroglutamyl)-Derivat zu ergeben.
Vorteilhafterweise ist der L-Glutaminsäure-Ester das γ-Methylglutamat oder das γ-Benzylglutamat.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen zum Gegenstand, die als Wirkstoff die neuen Derivate gemäß der Erfindung oder ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze enthalten.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden im Licht der folgenden Beispiele hervortreten, gegeben unter Bezug auf Figur I, die zwei Synthesewege für das Derivat N-α-L-Pyroglutamyl-Primaquin zeigt.

Beispiel 1: SYNTHESE DER L-PYROGLUTAMYL- ODER L-γ-GLUTAMYL-DERIVATE VON PRIMAQUIN

1. Synthese von N-α-L-Pyroglutamyl-Primaquin (pGLU-PQ)

Das Pyroglutaminsäure-Derivat von Primaquin (PQ) wird durch Kondensation von PQ auf zwei Wegen A und B erhalten, entweder mit Pyroglutaminsäure (Weg A) oder mit einem aktivierten Ester von Pyroglutaminsäure (Weg B). Diese zwei Synthesewege sind schematisch in Figur 1 dargestellt. Diese Verbindung wird in Form der Base (MG: 370,43), in Form eines Monohydrochlorid-Salzes (MG: 406,89) und in Form eines Monophosphat-Salzes (MG: 468,44) erhalten.

1.1. Synthese nach Weg A

Das Pyroglutaminsäurederivat von PQ wird in zwei Stufen ausgehend von Primaquin-Diphosphat und der Pyroglutaminsäuresäure erhalten.

a) Primaquin-Base

Das PQ in seiner freien Form wird ausgehend von PQ-Diphosphat erhalten, indem man die wäßrige Lösung, die das PQ-Salz enthält, mit 25%igem NH&sub4;OH bis zu einem pH-Wert von 8 neutralisiert und anschließend kräftig die PQ-Base mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert.

b) Aktivierung der Pyroglutaminsäure

Der N-Hydroxysuccinimidester der L-Pyroglutaminsäure wird durch Reaktion von Pyroglutaminsäure, gelöst in Dimethylformamid oder DMF (1 g in 5 ml), mit einem Äquivalent N-Hydroxysuccinimid (891 mg) und einem Äquivalent Dicyclohexylcarbodiimid (1,6 g) erhalten. Die Mischung wird 16 Stunden lang bei einer Temperatur von 4 ºC gerührt.

c) L-Pyroglutamyl-Primaquin

Die Primaquin-Base wird in einem Minimum von CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und bei 4 ºC zu dem aktivierten Ester gegeben. Die Reaktionsmischung wird 16 Stunden lang bei einer Temperatur von 4 ºC gerührt. Der Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und die Lösungsmittel verdampft.
Das rohe Reaktionsprodukt wird dann in CH&sub2;Cl&sub2; aufgenommen, dreimal mit einer 5%igen NaHCO&sub3;-Lösung und dreimal mit einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen. Die Dichlormethan-Phase wird über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und bis zur Trockne eingedampft. Das Produkt wird mit einer Mischung von Dichlormethan/Methanol (95/5) eluiert. Die reinen Fraktionen werden zusammengefaßt und die Lösungsmittel verdampft. Es werden 1,6 g L-Pyroglutamyl-Primaquin isoliert (Ausbeute: 47,5 %).

1.2. Synthese nach Weg B

a) Primaquin-Base

Das PQ in seiner freien Form wird ausgehend von PQ-Diphosphat erhalten, indem man die wäßrige Lösung, die das PQ-Salz enthält (9,1 g in 100 ml), mit dem Äquivalent 1M NaOH (20 ml) neutralisiert. Die PQ-Base wird dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 x 100 ml) extrahiert. Die organischen Phasen werden zusammengefaßt und mit Hilfe von Toluol oder Tetrahydrofuran (THF) getrocknet. b) Derivatisierung zum N-Carboxyanhydrid (NCA) Toluol -Tetrahydrofuran
Die Derivatisierung der Aminosäure zum N-Carboxyanhydrid (NCA) wird durch Reaktion der Aminosäure mit Phosgen durchgeführt. Genauer gesagt werden 10 g γ-Methylglutamat in 20 ml trockenem THF suspendiert (Rückfluß unter Natrium in Anwesenheit von Benzophenon).
Andererseits wird eine Lösung von Phosgen in THF hergestellt, ausgehend von gasförmigem Phosgen, das bei niedriger Temperatur kondensiert wurde. und von THF.
Die Phosgenlösung (40 ml - 2,75 M) wird dann über eine Kapillare und mit einem Überdruck von Stickstoff zu der Suspension der Aminosäure in THF gegeben.
Die Apparatur wird dann mit einem Kohlensäureeis-Kühler ausgestattet, der seinerseits mit zwei in Serie angeordneten Vakuumfallen verbunden ist, gefolgt von einem in eine konzentrierte NaOH-Lösung eintauchenden Rohr (Binden des überschüssigen Phosgens). Die Reaktionsmischung wird dann auf Rückflußtemperatur gebracht und diese Temperatur bis zur vollständigen Auflösung der Aminosäure aufrecht erhalten, was 2 Stunden und 30 Minuten dauert. Danach werden die Lösungsmittel unter Vakuum und Ausschluß von atmosphärischer Feuchtigkeit bis zur Trockne verdampft. Das N-Carboxyanhydrid wird in Form eines weißen Pulvers erhalten. Das NCA wird gegebenenfalls durch Auflösung in trockenem, warmem Ethylacetat und Zugabe eines gleichen Volumens an trockenem Petrolether sowie Abkühlung kristallisiert.

c) Kopplungs-Reaktion

Das in trockenem Tetrahydrofuran THF gelöste NCA-Derivat wird langsam (3 Stunden) durch Perfusion in eine Lösung von Primaquin-Base in trockenem THF bei einer Temperatur von 0 ºC eingebracht. Aus der Reaktionsmischung entweicht CO&sub2;, was ein Anzeichen für die Öffnung des NCA-Ringes ist. Das CO&sub2; wird durch die Bildung von BaCO&sub3; bestimmt, beim Einleiten der entweichenden Gase in eine Lösung von Bariumhydroxid.
Nach der Reaktion wird das Lösungsmittel bis zur Trockne verdampft und das rohe Reaktionsprodukt mittels Chromatographie auf SiO&sub2; (CH&sub2;Cl&sub2; - MeOH) gereinigt.

1.3. Bildung der Salze

1º Hydrochlorid-Salz

Das pGLU-PQ wird in Wasser in Anwesenheit von zwei Äquivalenten Salzsäure gelöst und lyophilisiert. Diese Operation wird ein zweites Mal wiederholt. 2º Phosphat-Salz
Das pGLU-PO wird in Isopropanol gelöst und zu einem Äquivalent Phosphorsäure, gelöst in Isopropanol (1,5 %. Gew./Vol.), gegeben. Unter diesen Bedingungen fällt das Salz nicht aus. Das Lösungsmittel wird verdampft und das Salz in Wasser aufgenommen sowie lyophilisiert.

1.4. Physikalische und chemische Eigenschaften

1.4.1. L-Pyroglutamyl-PQ

Reinheit durch TLC
System: CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (10/1, Vol.)
Platten: Si-60
Rf: 0,26
Reinheit durch TLC: ein einziger Fleck
Reinheit durch HPLC
Kolonne: gepfropfte Kieselerde C&sub8; (Waters)
Eluent: Mischung von Ammoniumformiat 0,1 M pH 3,85/Acetonitril (70/30, Vol.)
Detektor: UV bei 363 nm
Durchsatz: 2 ml/min
tR: 4,8 min
Reinheit durch HPLC: üblicherweise > 99 % an Oberfläche; Lösung 1 mg/ml in Ammoniumformiat-Puffer 0,1 M pH 3,85
Schmelzpunkt: N.D.
Rotationsvermögen: N.D.
Stabilität: das pGLU-PQ ist:
instabil bei tº Umgebung und an der Luft
stabil bei tº Umgebung unter inerter Atmosphäre (Argon)
Magnetische Kernresonanz:
NMR ¹H: (CDCl&sub3; - TMS)
NMR ¹³C: (CDCl&sub3; - die zentrale Linie des CDCl&sub3;, die als Referenz 77.00 ppm dient).
179.198 (c-5 pGLU); 172.233 (c-1 pGLU); 159.152 (c-6 PQ); 144.640 (c-8 PQ); 144.106 (c-2 PO); 135.022 (c-8a PO); 134.696 (c-4 PO); 129.704 (c-4a PQ); 121.709 (c-3 PO); 96.647 (c-7 PO); 91.507 (c-5 PQ); 56.985 (c-2 pGLU); 54.978 (6-OCH3 PO); 47.589 (c-1' PO); 39.248 (c-4' PQ); 33.539 (c-2' PQ); 29.147 (c-4 pGLU); 25.523 (c-3 pGLU); 20.246 (c-5' PQ). Infrarot: breit; Masse:

2. Synthese von N-γ-L-Glutamyl-Primaquin (qGLU-PO)

Das γ-Glutaminsäure-Derivat des Primaquins wird nach dem unten beschriebenen Syntheseweg in Form eines Hydrochlorid-Salzes (M.G. 388,45 + 72,92 = 461.38) und eines Monophosphat-Salzes (M.G. 468,44) erhalten.

2.1. Synthese

Das Glutaminsäure-Derivat von Primaquin wird in zwei Stufen ausgehend vom PQ-Diphosphat und der L-Glutaminsäure erhalten, deren Aminfunktion geschützt ist, entweder durch eine tert.-Butyloxycarbonyl-Gruppe (N-α-t-BOC) oder durch eine Benzyloxycarbonyl-Gruppe (N-α-CBZ). Die α-Carboxylfunktion ist entweder durch eine tert.-Butylgruppe oder durch eine Benzylgruppe geschützt.

a) Primaquin-Base

b) Aktivierung der geschützten Aminosäure

Der N-Hydroxysuccinimidester der geschützten L-Glutaminsäure wird durch Reaktion von 5,9 mM N-α-t-BOC-L-GLU-α-t-butyl (1,8 g), oder N-α-CBZ-L-Glu-α- o-benzyl, mit 5,9 mM N-OH-Succinimid (D,68g) und 5,9 mM Dicyclohexylcarbodiimid (1,21 g), gelöst bei 0 ºC in Ethylacetat, erhalten.

c) N-α-t-BOC-α-t-butyl-L-Glutamyl-PQ

Nach 16 Stunden Reaktionszeit bei 0 ºC zwischen geschützter Glutaminsäure und NHS gibt man 5,9 mMol (1,53 g) PQ-Base hinzu. Nach 17 Stunden wird der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Lösungsmittel unter Vakuum ausgetrieben.
Das erhaltene braune Öl wird dann in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Dann wird das Produkt über Kieselgel gereinigt, indem man mit einer Mischung von Dichlormethan/Methanol eluiert. Die reinen Fraktionen werden zusammengefaßt und das verdampfte Eluent führt zu einem mehr oder weniger kristallinen Produkt.
Ausbeute: 65 %.

d) Abspaltung der Schutzgruppen

1º Abspaltung mit Trifluoressigsäure und Bildung des Hydrochlorid-Salzes

Die zuvor erhaltene Verbindung wird in 45 ml einer 1:1 Mischung von Dichlormethan und Trifluoressigsäure gelöst und die Mischung 4 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gelöst. Die Lösungsmittel werden unter Vakuum verdampft, der Rückstand in Wasser aufgenommen und mehrmals mit einer Mischung Ethylacetat/Ether (50/50, Vol.) gewaschen.
Die wäßrigen Phasen werden zusammengefaßt und lyophilisiert. Das gelborangene Pulver wird in Wasser aufgenommen und man setzt 2 Äquivalente O,5N- Salzsäure hinzu. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird dann lyophilisiert. Dieser Zyklus wird zweimal wiederholt. Das Hydrochlorid-Salz wird isoliert und unter Argon aufbewahrt.

2º Abspaltung durch Hydrogenolyse und Bildung des Phosphat-Salzes

Das vorstehend erhaltene N-α-CBZ-α-o-benzyl-L-Glutamyl-Primaquin wird in Ethylacetat (100 ml pro 0,01 Mol) gelöst. Dann werden der Lösung 150 ml absolutes Ethanol zugesetzt. Anschließend wird der Kolben von 1 Liter mit Argon gespült. Nachdem der Kolben evakuiert wurde, trägt man den Wasserstoff ein. Der Zyklus evakuieren und Wasserstoff einführen wird zweimal wiederholt. Der Wasserstoffdruck wird dann auf 1,38 bar (20 psi) gebracht. Nach 2 und 4 Stunden Reaktionszeit wird der Kolben unter Vakuum gesetzt und anschließend bis zu einem Druck von 1,38 bar (20 psi) mit Wasserstoff gefüllt. Nach 6 oder 7 Stunden Reaktion wird der Wasserstoff unter Vakuum ausgetrieben und die Lösungsmittel werden verdampft. Abschließend wird das γ-Glutamyl-Primaquin 16 Stunden lang unter Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 100 %.

Bildung des Phosphat-Salzes

Das γ-Glutamyl -Primaquin (0,01 Mol) wird in 60 ml Ethanol und 10 ml Ethylacetat gelöst. Diese Mischung wird zu einer Phosphorsäure-Lösung gegeben (Merck 573; Qualität zur Analyse: 85 % in Isopropanol).
Das Volumen wird auf 250 ml gebracht und der Niederschlag 1 Stunde lang gerührt. Dann wird der Niederschlag unter Argon über eine Membran Millipore FH abfiltriert. Das Produkt wird zweimal mit Isopropanol gespült, in einen Kolben umgefüllt und etwa 20 Stunden lang unter Vakuum getrocknet. Auf diese Weise werden 4,4 g L-γ-Glutamyl-Primaquin-Phosphat isoliert (90 %).

2.2. Physikalische und chemische Eigenschaften

2.2.1. L-γ-Glutamyl-Primaquin

Reinheit durch TLC
System: CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (18/2, Vol.)
Platten: Si-60
Rf: 0,15
Reinheit durch TLC: ein einziger Fleck
Reinheit durch HPLC
Kolonne: gepfropfte Kieselerde C&sub8;
Eluent: Mischung von Ammoniumformiat 0,1 M pH 3,85/Acetonitril (70/30, Vol.)
Detektor: UV bei 363 nm
Durchsatz: 2 ml/min
tR: 2,2 min
Reinheit durch HPLC: üblicherweise > 99 %
Schmelzpunkt: N.D.
Rotationsvermögen: N.D.
Stabilität: das gGLU-PQ ist:
instabil bei tº Umgebung und an der Luft
stabil bei tº Umgebung unter inerter Atmosphäre (Argon)
Magnetische Kernresonanz:
NMR ¹H: (CDCl&sub3; - TMS) N.D.
NMR ¹³C: (CDCl&sub3; - die zentrale Linie des CDCl&sub3;, die als Referenz 77.00 ppm dient).
Infrarot:
Masse:

2.2.2. L-γ-Glutamyl-Primaquin-Hydrochlorid

Reinheit durch HPLC: üblicherweise > 99 %
Identische Bedingungen wie in 4.2.2.1.

2.2.3. L-γ-Glutamyl-Primaquin-Phosphat

Beispiel 2: EXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNGEN IN VITRO

1. Stabilität in Anwesenheit von Serum

1.1. Protokoll

Der Einfluß des Serums auf die Stabilität von Primaquin (PQ) und seinen Derivaten wurde bestimmt, indem man es bei 37 ºC in einer Konzentration von 100 ug/µl in 95 % Kälberfötus-Serum (SFV, Flow Laboratories) inkubiert, oder in Human-Serum und Phosphatsalz-Puffer (PBS 0,15 M, pH 7,2) als Kontrolle. Alle Lösungen werden durch Filtration über ein Filter Millipore (Millex GV) von 0.20 µm Porosität sterilisiert.
Im Laufe der Zeit wurden Proben von 1 ml entnommen und danach serische Proteine durch Fällung mit Acetonitril entfernt. Zu diesem Zweck gibt man zu jeder Probe ein identisches Volumen von Acetonitril. Nach kräftigem Mischen mit dem Vortex-Rührer werden die Proben 1 Stunde unter Lichtausschluß bei 4 ºC belassen und anschließend 5 Minuten lang bei 12.000 g zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile werden gesammelt und danach durch HPLC (Aliquot von 20 bis 50 µl) unter Standardbedingungen analysiert.

1.2. Ergebnisse

Die Ergebnisse der Stabilität von Primaquin und seiner zwei Derivate in Anwesenheit von Kälberfötus-Serum sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in Prozent der Ausgangs-Konzentration (Zeit 0) nach der Extraktion.
In Anwesenheit von Serum ist das Primaquin instabil, es zersetzt sich nach und nach, um nach 24 Stunden 7 % zu erreichen. Unter den angewendeten experimentellen Bedingungen beobachtet man einen zweiten Peak Y in HPLC (tr: 4,2 min) nach 2 Stunden Inkubation. der jedoch 10 % nicht überschreitet. Tabelle 1: Stabilität von Primaquin und seinen Aminosäure-Derivaten in Anwesenheit von Kälberfötus-Serum Verbindungena INKUBATIONSZEIT (STUNDEN)b Primaquin a: Die Verbindungen werden bei 37 ºC in Anwesenheit von Kälberfötus-Serum (Ende 95 %) inkubiert und anschließend durch Spektrophotometrie nach HPLC analysiert. Die Ausgangsreinheit der Verbindungen, bestimmt durch HPLC, beträgt jeweils 99,5 %, 98,6 % und 99,5 %.b: Die Ergebnisse stellen die relative Konzentration an Primaquin (PQ) und an Derivat (PQ-X) in Abhängigkeit von der Inkubationszeit dar, ausgedrückt im Prozentsatz der Ausgangskonzentration (Zeit 0) nach der Extraktion (mittlere +/- Standardabweichung; n = 4, PQ; n = 2, gGLU-PQ und n = 4, pGLU-PQ).
Das gGLU-PQ ist mindestens innerhalb von 3 Stunden stabil, anschließend wird eine schrittweise Verringerung der relativen Konzentration nach 6 Stunden Inkubation beobachtet, ohne signifikante Erhöhung der Konzentration an PQ. Das pGLU erleidet keine Modifizierung im Verlauf seiner Inkubation im Serum. Die zwei Derivate regenerieren kein Primaquin in Anwesenheit von Serum nach 24 Stunden oder nach 48 Stunden Inkubation.
Ähnliche Resultate werden bei einer Inkubation der Verbindungen in Anwesenheit von Human-Serum erhalten. In einer Pufferlösung (PBS) sind die Verbindungen stabil, ohne signifikante spektrale Modifizierung nach 24 Stunden.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die kovalente Bindung zwischen der Aminosäure und Primaquin stabil ist und widerstandsfähig gegen serische Enzyme.

2. Hydrolyse in Anwesenheit von lysosomalen Enzymen

2.1. Protokoll

Die Verbindungen werden mit einer Endkonzentration von 15 µg/ml in einem Acetatpuffer 50 mM, pH 4,5 in Anwesenheit von Cystein 5 mM und einer Fraktion von lysosomalen Enzymen (0,15 mg Protein/ml), die ausgehend von Rattenleber gereinigt wurde, bei einer Temperatur von 37 ºC inkubiert. Die gereinigte lysosomale Fraktion wurde nach der von Trouet [Meth. Enzymol., 31 (1974), 323-334] beschriebenen Methode hergestellt.
Im Verlauf der Zeit wurden entsprechende Proben von der Inkubation entnommen. Die enzymatische Reaktion wird beendet, indem man 10 µl 10 M HCl pro ml Probe hinzusetzt. Dann wird ein Volumen von 20 µl entnommen und direkt mittels HPLC unter Standardbedingungen analysiert.

2.2. Ergebnisse

Die Einwirkung von lysosomalen Hydrolasen bei pH 4,5 auf PQ und seine Derivate ist in der nachfolgenden Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Lysosomale Hydrolyse von Primaquin und seinen Aminosäure- Derivaten Verbindungena INKUBATIONSZEIT (STUNDEN)b Primaquin
a: Die Verbindungen werden bei pH 4,5 in Anwesenheit von lysosomalen Enzy- men (0,15 mg Protein/ml) und 5 mM Cystein inkubiert und anschließend durch Spektrophotometrie nach HPLC analysiert. Die Ausgangsreinheit der Verbindungen, bestimmt durch HPLC, beträgt jeweils 99,5 %, 99,7 % und 98,8 %.
b: Die Ergebnisse stellen die relative Konzentration an Primaquin (PQ) und an Derivat (PQ-X) in Abhängigkeit von der Inkubationszeit dar, ausgedrückt im Prozentsatz der Ausgangskonzentration (Zeit O) nach der Extraktion.
In Anwesenheit von lysosomalen Enzymen regenerieren die zwei Derivate von Primaquin kein Eltern-Primaquin nach 24 oder 48 Stunden Inkubation.
Die kovalente Bindung zwischen der Aminosäure und der Seitenkette des PQ ist widerstandsfähig gegen die lysosomale Hydrolyse. Man beobachtet jedoch eine schrittweise Verringerung der relativen Konzentration an PQ, die nach 24 Stunden 68 % erreicht, ohne Auftreten eines neuen Peak in HPLC. Das gleiche Phänomen wird auch im Fall von pGLU-PQ beobachtet, das nach nur 6 Stunden Inkubation auftritt.

3. Permeabilität der Human-Erythrozyten für Primaquin und Derivate

3.1. Protokoll

Frisches Human-Blut (A+) über CPDA wird zweimal in einem RPMI-Milieu, das 20 mM Glucose enthält, bei pH 7,4 gewaschen und danach in dem gleichen Milieu wieder bei 37 ºC suspendiert, um eine Suspension von 20 % roten Blutkörperchen (2 10&sup9; Erythrozyten pro ml) zu erhalten. Zu 1 ml dieser Suspension gibt man 1 ml einer Lösung von PQ oder der Derivate mit einer Konzentration von 0,250 mM in dem gleichen Milieu von 37 ºC.
Nach verschiedenen Inkubationszeiten bei 37 ºC werden 0,5 ml Probe entnommen und danach in ein Eppendorf-Rohr überführt, das 0,4 ml Silikonöl enthält (Merck, Dichte 1,06 g/ml).
Nach Zentrifugieren während 30 Sekunden bei 12000 g wird der aufschwimmende Anteil sowie das Silikonöl entfernt, während die Zellen des Rückstandes unter Zugabe von 0.5 ml Wasser gelöst werden. Die an dem zellularen Lysat assoziierte Chinolinverbindung wird dann durch Fällung der zellularen Proteine mit Acetonitril (0,5 ml) extrahiert und anschließend mittels HPLC unter Standardbedingungen analysiert.
Die intrazellulare Konzentration an dem Chinolinderivat wird erhalten, indem man von der Gesamtkonzentration in dem zellularen Lysat die Konzentration der Verbindung, die sich in dem extrazellularen Milieu befindet, subtrahiert. Das verunreinigende extrazellulare Volumen wird mit Hilfe von tritiertem Inulin bewertet.

3.2. Ergebnisse

Das PQ wird schnell von den Erythrozyten aufgefangen (Tabelle 3). Nach 5 Minuten Inkubation finden sich von dem in dem extrazelluaren Milieu vorhandenen PQ 18 % in den roten Blutkörperchen wieder und diese Konzentration hält sich mindestens eine Stunde lang.
Das gGLU-PQ wird nicht in den Erythrozyten akkumuliert. Das pGLU-PQ akkumuliert sich langsamer als das PQ. Der maximale Gehalt wird nach 60 Minuten erreicht und die Konzentration ist gleich der von PQ. Tabelle 3: Permeabilität der roten Human-Blutkörperchen für Primaquin und seine Aminosäure-Derivate Verbindungena KONZENTRATIONb (% Ausgangskonzentration) 5 min 10 min 60 min Primaquin
a: Die Verbindungen werden bis zu einer Endkonzentration von 100 µg/ml in Anwesenheit von roten Human-Blutkörperchen mit der Dichte von 10&sup9; Erythrozyten/ml inkubiert.
b: Die Resultate stellen die Konzentration der an die Erythrozyten assoziierten Verbindungen dar, ausgedrückt im Prozentsatz der Ausgangskonzentration (mittlere +/- Standardabweichung, n = 4 Proben).
c: Unter den angewendeten Analysebedingungen nicht nachweisbare Verbindung (Nachweisschwelle: 50 ng)

4. Hämolytische Wirkung und Produktion von Methämoglobulin

Zwei der bedeutenden toxischen Wirkungen von PQ wurden an den zwei Derivaten bewertet: die hämolytische Wirkung und die Umwandlung von Hämoglobulin in Methämoglobulin. Die Bilanz an Glutathion (reduzierte und oxydierte Form), die in den Mechanismus der Zellabwehr gegen Oxydationsmittel eingreift, wurde ebenfalls untersucht.

4.1. Protokoll:

Blut A+ wird zweimal in einem Phosphatsalz-Puffer 0,15 M bei pH 7,4, der 20 mM Glucose (GPBS) enthält, gewaschen und danach wieder zu 50 % in dem gleichen Puffer suspendiert. Zu dieser Suspension gibt man ein gleiches Volumen der Verbindung in Lösung von GPBS mit unterschiedlichen Konzentrationen (Test) oder GPBS (Kontrolle). Der End-Hämatokrit der Suspension beträgt 25 %. Nach 60 Minuten Inkubation bei 37 ºC bestimmt man die Konzentration an Hämoglobin und Methämoglobin an der Gesamtsuspension sowie die Konzentration an Hämoglobin, das nach dem Zentrifugieren (extrazellulares Hämoglobin) in dem aufschwimmenden Anteil vorliegt, und zwar nach den Methoden mit Cyanmethämoglobin und mit Benzidin (Fairbanks V.F., 1976, in "Fundamentals of Clinical Chemistry, M.W. Tietz Editors, Saunders"). Der Gehalt an reduziertem (GSM) und an oxdiertem (GSSG) Glutathion wird an der Suspension der roten Blutkörperchen nach der fluorimetrischen Methode von Hissin P.J. und Hilf R. (1976, Anal. Biochem. , 74, 214-226) bewertet.

4.2. Ergebnisse

Die Tabelle 4 zeigt die Hämolyse, das heißt, die Konzentration an extrazellularem Hämoglobin nach 60 Minuten Inkubation der Erythrozyten in Anwesenheit von PQ und seinen Derivaten.
Das PQ besitzt eine hämolytische Wirkung, die von der Konzentration abhängig ist, 4,7 % der roten Blutkörperchen werden nach einer Stunde in Anwesenheit von 10 mM PQ lysiert. Die hämolytische Wirkung ist ebenfalls Funktion der Inkubationszeit (Ergebnis nicht gezeigt). Die Derivate besitzen eine hämolytische Aktivität, die mit der von PQ vergleichbar ist und bei der Konzentration von 5 mM eine Hämolyse vom zweifachen Wert der Kontrollen aufweist.
Was die Produktion von Methämoglobin betrifft, so hängt sie ebenfalls von der Konzentration des Aminochinolin-Derivates ab. Im Fall von PQ werden 11,5 % Hämoglobin zu Methämoglobin oxydiert, wenn sich die Erythrozyten eine Stunde lang in Anwesenheit von 10 mM PQ befinden (Tabelle 4).
In Anwesenheit der gleichen Menge an Derivat ist die Oxydation von Hämoglobin bei gGLU-PQ die gleiche wie bei PQ und bei pGLU-PQ 1,5-mal geringer. Tabelle 4: Einwirkung von Primaquin und seinen Aminosäure-Derivaten auf rote Human-Blutkörperchen Verbindungena KONZENTRATIONb (mM) HÄMOLYSEb (%) METHÄMOGLOBINb (%) Primaquin
a: Die Verbindungen werden mit unterschiedlichen Konzentrationen eine Stunde lang bei 37 ºC in Anwesenheit von roten Human-Blutkörperchen (Hämatokrit 25%) inkubiert. Kontrolle ohne Verbindungen zur Zeit 0 (T 0) und nach einer Stunde Inkubation (T 1).
b: Die Resultate zeigen die Konzentration an extrazellularem Hämoglobin (Hämolyse) und an Methämoglobin (oxydiertes Hämoglobin), ausgedrückt im Prozentsatz der Konzentration am jeweiligen Gesamthämoglobin in jeder Probe (mittlere +/- Standardabweichung; n = 3 für PQ und n = 3 für gGLU- PQ und für pGLU-PQ).

Beispiel 3: EXPERIMENTELLE TOXIZITÄT BEIM TIER

Die akute Toxizität in Abhängigkeit von der verabreichten Einheitsdosis wurde an weiblichen Mäusen Swiss OF1 mit einem Gewicht von 22 bis 25 g bestimmt. Es wurde eine Serie von Verdünnungen von jeder Verbindung auf intravenösem Weg an Gruppen von 10 Mäusen injiziert (0,1 ml pro 10 g Gewicht).
Die letale Dosis für 50 % der Mäuse (LD&sub5;&sub0;) wurde durch lineare Regression der Logits des Prozentsatzes überlebender Tiere bestimmt, in Abhängigkeit vom Logarithmus der injizierten Dosis (in mg PQ-Diphosphat-Äquivalent pro kg) (Logit Weighted Transformation, Berkson J., 1953; J.Am.Stat.Assoc. 48, 565-599).
Die in Tabelle 6 aufgenommenen Resultate zeigen, daß die maximal tolerierte Dosis (MTD), definiert wie die höchste Dosis, die einen Gewichtsverlust von unterhalb oder gleich 5 % des Ausgangsgewichtes hervorruft, während einer auf die Injektion i.v. folgenden Periode von 5 Tagen bei 24 mg/kg für PQ, bei 117 mg/kg für gGLU-PQ und bei 126 mg/kg für pGLU-PQ liegt.
Die Dosis, die 50 % der Tiere (LD50) nach der Einheits-Injektion i.v. tötet, liegt bei 31 mg/kg für PQ und jeweils bei 169 mg/kg und 159 mg/kg für die Derivate gGLU-PQ und pGLU-PQ. Tabelle 6: Akute Toxizität, verglichen zwischen Primaquin und seinen Derivaten an der Maus nach Einheits-Verabreichung i.v. Produkta Primaquin a: Die Produkte wurden auf intravenösem Weg verabreicht, an Gruppen von 10 weiblichen Mäusen Swiss OF&sub1; von 22 bis 25 g, im Verhältnis von 5 Dosen pro Produkt. b: Maximal tolerierte Dosis (MTD), definiert wie die höchste Dosis, die einen Gewichtsverlust von unterhalb oder gleich 5 % des Ausgangsgewichtes hervorruft, während einer auf die Injektion i.v folgenden Periode von 5 Tagen. c: Letale Dosis für 50 % der Mäuse nach der Einheits-Verabreichung i.v.

Beispiel 4: ANTIMALARIA-AKTIVITÄT BEIM TIER

1. Protokoll

Das Primaquin und seine Derivate wurden am Modell der Malaria beim Nagetier untersucht, unter Anwendung der Infektion an der Maus durch Plasmodium berghei, wobei die Sporozo ten von infizierten Stechmücken Anopheles stephensi stammen. Dieses Modell , entwickelt von MOST, H., HERMAN, R. & SCHOENFELD, C. (1967) Am.J.Trop. Med.Hyg. 16, 572-575, ermöglicht die Bestimmung der kausalen prophylaktischen Aktivität (Gewebe-Schizonten) der neuen therapeutischen Verbindungen.
Die angewendete Verfahrensweise ist abgeleitet von der durch MOST, H. & MONTUORI, W.A. (1975) Am.J.Trop.Med.Hyg. 24, 179-182, beschriebenen. Es handelt sich um das System P. berghei berghei (ANKA)- Anopheles stephensi-Maus Swiss OF&sub1;. Der Stamm ANKA von P. b. berghei wird zyklisch erhalten durch Anopheles stephensi. Der Maus-Stamm Swiss OF&sub1; ist besonders empfindlich gegenüber P. b. berghei, der immer eine tödliche Infektion hervorruft.

1.1. Isolierung der Sporozoiten der Stechmücken und Versuchs-Infektion

Weibliche Stechmücken (80 bis 100 Individuen pro Präparation) werden von ihren Beinen, Flügeln und Hinterleibern befreit und anschließend bei 4 ºC mit Hilfe eines Glas-Stößels in einem Medium MEM (GIBCO), das 10 % Kälberfötus- Serum enthält, homogenisiert. Die Suspension der Sporozo ten wird dann von den Stechmücken-Fragmenten durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen (2 Minuten bei 50 g und 5 Minuten bei 200 g) gereinigt und der gesammelte aufschwimmende Anteil bei 4 ºC konserviert. Nach Auszählen in einer Petroff- Hausser-Kammer wird die Anzahl von Parasiten durch Verdünnen mit dem gleichen kalten Milieu auf eine Dichte von 2 10&sup5; Sporozoiten/ml eingestellt.
Die eventuelle Restwirkung der Medikamente auf die ersten erythrozytären Formen (erythrozytäre schizontozide Wirkung) wird nach der Methode von Gregory K.G. & Peters W. (Ann.Trop.Med.Parasitol. , 1970, 64, 15-24) bestimmt, basierend auf dem Test der 2 % von Warhurst.
Die kausale prophylaktische Aktivität der Verbindungen ist die Dosis, die es ermöglicht, 50 % der infizierten Tiere (CPD&sub5;&sub0;) zu heilen, und sie wird durch Analyse der Logits der Reaktion (ausgedrückt in % LTS) in Abhängigkeit von der Dosis (mg PQ/kg) erhalten.
Diese ganze Prozedur wird immer in einer Zeit von maximal 35 Minuten durchgeführt und ermöglicht es, die Lebensfähigkeit und die Infektiösität der Sporozo ten aufrechtzuerhalten.
Ein Volumen von 0,5 ml der Suspension, die 10&sup5; Sporozo ten enthält, wird intravenös weiblichen Mäusen Swiss OF&sub1; mit einem Gewicht von 20 bis 25 g injiziert, die für die therapeutischen Untersuchungen verwendet werden.

Chemotherapeutische Behandlungen

Gruppen von 20 bis 25 der wie oben beschrieben infizierten Mäuse werden mit einer einzigen intravenösen Injektion von Primaquin-Diphosphat (PQ) oder seinen zwei Derivaten in Form der Hydrochloride drei Stunden nach der Inokulation der Sporozo ten behandelt. Das injizierte Volumen wird in Abhängigkeit vom Gewicht der Mäuse eingestellt, und zwar in einem Verhältnis von 0,25 ml pro 25 g Gewicht. Die Verbindungen werden in einem Phosphatsalz-Puffer (PBS) pH 7,0 verdünnt und der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Die infizierten, aber nicht behandelten Mäuse (5 pro Gruppe) erhalten nur den Puffer und dienen zur Kontrolle der Infektiösität der Sporozoiten.

1.3. Verwendete Parameter für die Bewertung der Wirksamkeit von Primaquin und seiner Derivate

Die Untersuchungs-Mäuse werden über eine Zeitdauer von 50 Tagen gehalten. Die Entwicklung der Parasitämie wird durch tägliche Überprüfung des Blut-Ausstriches verfolgt, gefärbt 60 Minuten lang mit Giemsa (5 %) in einem Sörensen-Puffer pH 7,2, ausgehend vom 5. Tag und bis zum 15. Tag. Auf diese Weise kann die Anzahl infizierter Tiere bestimmt werden. Diese Resultate ermöglichen es, das Überleben über einen langen Zeitraum festzustellen (LTS, Anzahl der überlebenden, nicht parasitären Mäuse zur Anzahl der infizierten und behandelten Mäuse).

2. Therapeutische Aktivität beim Tier

Die mit Hilfe der Sporozo ten von P. berghei infizierten Tiere werden drei Stunden danach mit einer einzigen Injektion der Verbindungen auf intravenösem Weg behandelt. Dieser Test ermöglicht es, die kausale prophylaktische Aktivität der Verbindungen zu definieren, das ist die Dosis, die eine Genesung von 50 % der infizierten Tiere (CPD&sub5;&sub0;) ermöglicht. Die Dosis wird immer in mg PQ-Diphosphat pro kg ausgedrückt.
Die Resultate der kausalen prophylaktischen Aktivität (+ drei Stunden) von Primaquin und seinen zwei Aminosäure-Derivaten sind in der Tabelle 7 dargestellt. Sie zeigen eindeutig, daß die zwei Derivate wirksamer als PQ sind. Die Dosis, die eine Heilung von 50 % der Tiere hervorruft (CPD&sub5;&sub0;), liegt bei gGLU-PQ 2,2-mal und bei pGLU-PQ 1,9-mal niedriger als bei PQ.
Die minimale wirksame Dosis der zwei Derivate liegt ebenfalls weniger hoch als die von PO. Während die Dosis zur völligen Heilung bei PQ wegen seiner Toxizität (DE100 von PQ geschätzt bei 54 mg/kg) nicht mit einer einzigen Injektion erreicht werden kann, ist dies bei gGLU-PQ und bei pGLU-PQ mit 24 mg/kg bzw. 22 mg/kg möglich. Tabelle 7: Kausale prophylaktische Aktivität von Primaquin und seinen Aminosäure-Derivaten bei mit Plasmodium berghei infizierten Mäusen OF&sub1; Verbindunga PQ-INDEXd Primaquin
a: Die Derivate werden auf intravenösem Weg drei Stunden nach der Inokulation der Sporozo ten verabreicht. Die Konzentrationen sind immer in mg PQ-Diphosphat-Äquivalent/kg ausgedrückt.
b: Kausale prophylaktische Dosis, die 50 % der infizierten und behandelten Mäuse heilt.
c: Minimale wirksame Dosis (MED) und vollständig heilende Dosis (DE&sub1;&sub0;&sub0;), berechnet durch lineare Regression (Weighted Logit Transformation).
d: Index PQ (Verhältnis CPD&sub5;&sub0; von PQ/CPD&sub5;&sub0; der Verbindung).

3. Therapeutischer Index

Der therapeutische Index wird definiert als das Verhältnis zwischen der Toxizität, ausgedrückt durch die LD&sub5;&sub0;, und der therapeutischen Aktivität, ausgedrückt durch die CPD&sub5;&sub0;, bei der Maus.
Der therapeutische Index von PQ beträgt 1,7 (Tabelle 8), während er höher als 15 und 19 bei pGLU-PQ und gGLU-PQ liegt.
Die experimentellen Daten der Aktivität im Modell der Malaria bei der Maus und die Daten der Toxizität zeigen, daß das gGLU-PQ einen therapeutischen Index besitzt. der mindestens elfmal höher liegt als der von PQ, das Derivat ist mindestens fünfmal weniger toxisch und mindestens zweimal mehr aktiv als PQ in diesem experimentellen Modell der Malaria.
Das Gleiche trifft für das Derivat pGLU-PQ zu. Es besitzt einen therapeutischen Index, der neunmal höher liegt als der von PQ, wobei das Derivat mindestens fünfmal weniger toxisch und mindestens 1,9-mal aktiver als PQ ist. Tabelle 8: Therapeutischer Index von Primaquin und seinen Aminosäure- Derivaten Produktea Primaquin a: Die Produkte werden auf intravenösem Weg inokuliert und die Konzentrationen sind ausgedrückt in Äquivalenten PQ-Diphosphat. b: Der therapeutische Index (TI) ist das Verhältnis zwischen der LD&sub5;&sub0; und der CPD&sub5;&sub0;.

Beispiel 5: L-ASPARTYL-PRIMAQUIN-DERIVAT

1. Synthese

Die Asparaginsäure-Derivate von Primaquin werden durch Kondensation von Primaquin an einen aktiven Ester der Asparaginsäure erhalten, nach dem gleichen Syntheseweg, wie er für die Glutaminsäure-Derivate des Primaquins beschrieben ist.
Das L-Asparaginsäure-Derivat von Primaquin (ASP-PQ) wird nach der gleichen Methode synthetisiert, wie sie für das γ-Glutaminsäure-Derivat von Primaquin angewendet wurde, jedoch unter Schützen der β-Carboxylfunktion anstelle der α-Carboxylfunktion. Das L-β-Asparaginsäure-Derivat von Primaquin
(βASP-PQ) wird nach der Methode erhalten, wie sie bei gGLU-PQ angewendet wurde.
Die Verbindungen werden in Form der Base (MG: 374,43) und eines Dihydrochloridsalzes (MG: 447,35) erhalten.

2. Experimentelle Toxizität beim Tier

Die akute Toxizität in Abhängigkeit von der verabreichten Einheitsdosis wird unter den gleichen Bedingungen und gemäß dem Protokoll von Beispiel 3 bestimmt.
Die in Tabelle 9 zusammengefaßten Resultate zeigen, daß die maximal tolerierte Dosis (MTD), definiert wie die höchste Dosis, die einen Gewichtsverlust von unterhalb oder gleich 5 % des Ausgangsgewichtes hervorruft, während einer auf die Injektion i.v. folgenden Periode von 5 Tagen, bei 24 mg/kg für PQ, bei 107 mg/kg für ASP-PQ und bei 109 mg/kg für βASP-PQ liegt.
Die Dosis, die 50 % der Tiere nach der Einheits-Injektion i.v. tötet (LD&sub5;&sub0;), liegt bei 31 mg/kg für PQ und bei 165 mg/kg bzw. bei 164 mg/kg für die Derivate ASP-PQ und BASP-PQ. Tabelle 9: Akute Toxizität, verglichen zwischen Primaquin und seinen Derivaten bei der Maus nach Einheitsverabreichung i.v. Produkta Primaquin a: Die Produkte werden auf intravenösem Weg verabreicht, an Gruppen von 10 weiblichen Mäusen Swiss OF&sub1; von 22 bis 25 g, im Verhältnis von 5 Dosen pro Produkt. b: Maximal tolerierte Dosis (MTD), definiert wie die höchste Dosis, die einen Gewichtsverlust von unterhalb oder gleich 5 % des Ausgangsgewichtes hervorruft, während einer auf die Injektion i.v. folgenden Periode von 5 Tagen. c: Letale Dosis für 50 % der Mäuse nach Einheitsverabreichung i.v.

3. Therapeutische Aktivität beim Tier

Die mit Hilfe der Sporozo ten von P. berghei infizierten Tiere werden drei Stunden danach mit einer einzigen Injektion der Verbindungen auf intravenösem Weg behandelt. Dieser Test ermöglicht es, die kausale prophylaktische Aktivität der Verbindungen oder die Dosis zu definieren, die eine Genesung von 50 % der infizierten Tiere (CPD&sub5;&sub0;) ermöglicht. Die Dosis wird immer in mg PQ-Diphosphat pro kg ausgedrückt.
Die Resultate der kausalen prophylaktischen Aktivität (+ 3 Stunden) von Primaquin und seinen Aminosäure-Derivaten sind in der Tabelle 10 aufgeführt. Sie zeigen eindeutig, daß die Derivate aktiver als PQ sind. Die bei 50 % der Tiere eine Heilung hervorrufende Dosis (CPD&sub5;&sub0;) liegt 1,6-mal niedriger für ASP-PQ und für βASP-PQ als bei PQ.
Die minimal wirksame Dosis der zwei Derivate ist ebenfalls weniger hoch als bei PQ. Während die Dosis zur völligen Heilung bei PQ wegen seiner Toxizität (DE100 von PO geschätzt bei 54 mg/kg) nicht mit einer einzigen Injektion erreicht werden kann, ist dies bei ASP-PQ und bei βASP-PQ mit 31 mg/kg möglich. Tabelle 10: Kausale prophylaktische Aktivität von Primaquin und seinen Aminosäure-Derivaten bei mit Plasmodium berghei infizierten Mäusen OF&sub1; Verbindunga PQ-INDEXd Primaquin a: Die Verbindungen werden auf intravenösem Weg drei Stunden nach der Inokulation der Sporozo ten verabreicht. Die Konzentrationen sind in mg PQ-Diphosphat-Äquivalent/kg ausgedrückt. b: Kausale prophylaktische Dosis, die 50 % der infizierten und behandelten Tiere heilt. c: Minimale wirksame Dosis (MED) und vollständig heilende Dosis (DE&sub1;&sub0;&sub0;), berechnet durch lineare Regression (Weighted Logit Transformation). d: Index PQ (Verhältnis CPD&sub5;&sub0; von PQ/CPD&sub5;&sub0; der Verbindung).

4. Therapeutischer Index

Der therapeutische Index wird definiert als das Verhältnis zwischen der Toxizität, ausgedrückt durch die LD&sub5;&sub0;, und der therapeutischen Aktivität, ausgedrückt durch die CPD&sub5;&sub0;, bei der Maus.
Der therapeutische Index von PQ beträgt 1,7 (Tabelle 11), während er höher als 14 bei ASP-PQ und βASP-PQ liegt.
Die experimentellen Daten der Aktivität im Modell der Malaria bei der Maus und die Daten der Toxizität zeigen, daß das ASP-PQ einen therapeutischen Index besitzt. der mindestens achtmal höher liegt als der von PQ, das Derivat ist mindestens fünfmal weniger toxisch und mindestens 1,6-mal mehr aktiv als PQ in diesem experimentellen Modell der Malaria.
Das Gleiche trifft fuhr das Derivat βASP-PQ zu. Es besitzt einen therapeutischen Index, der achtmal höher liegt als der von PQ, wobei das Derivat mindestens fünfmal weniger toxisch und mindestens 1,6-mal aktiver als PQ ist. Tabelle 11: Therapeutischer Index von Primaquin und seinen Aminosäure- Derivaten Produktea Primaquin a: Die Produkte werden auf intravenösem Weg inokuliert und die Konzentrationen sind ausgedrückt in Äquivalenten PQ-Diphosphat. b: Der therapeutische Index (TI) ist das Verhältnis zwischen der LD&sub5;&sub0; und der CPD&sub5;&sub0;.

Claims

1. Chinolinderivate, die eine freie Aminfunktion aufweisen und Antimalaria-Eigenschaften besitzen oder ihre Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, daß sie schematisch dargestellt werden durch die Formel

PQ - X

worin bedeuten:

PQ ein Antimalaria-8-Aminochinolin und

X eine Aminosäure oder ein Peptid mit 2 bis 4 Aminosäuren, wobei die Aminosäure oder die erste Aminosäure des Peptids ausgewählt wird aus γ-Glutaminsäure, β- Asparaginsäure, die über ihre γ- oder β-Carboxylgruppe an ein PQ gebunden sind, oder Pyroglutaminsäure und Asparaginsäure, die über ihre α- Carboxyl-Gruppe an PQ gebunden sind;

die Bindung PQ-X eine kovalente Peptid-Bindung zwischen der freien Amingruppe von PQ und einer Carboxylgruppe der Aminosäure oder der terminalen Aminosäure von X.

2. Derivate nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem PQ um das Primaquin handelt.

3. Verfahren zur Herstellung der Derivate nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine freie Carboxylfunktion von X, dessen Aminfunktionen und dessen α, γ - oder β-Carboxyl-Funktion, falls vorhanden, gegebenenfalls geschützt sind, mit der freien Aminfunktion von PQ oder einem seiner Salze in Gegenwart eines Kondensationsmittels kondensiert zur Bildung der Peptidbindung PQ-X.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe der Aminfunktionen eine tert-Butyloxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonyl-Gruppe ist und daß die Schutzgruppe der Carboxylfunktionen, falls vorhanden, eine tert-Butyl- oder Benzylgruppe ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die freie Säurefunktion der Aminosäure oder des Peptids in Form eines Esters mit N-Hydroxy- succinimid aktiviert ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem Diphosphatsalz von Primaquin und der Aininosäure (X) ausgeht, deren Aminfunktion und deren α, γ - oder β-Carboxylfunktion, falls vorhanden, gegebenenfalls geschützt sind durch eine tert-Butyloxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe für die Aminfunktion und eine tert-Butyl oder Benzylgruppe für die Carboxylfunktion, und daß man die folgenden Stufen durchführt:

a) man läßt das N-Hydroxysuccinimid mit dem gegebenenfalls geschützten Derivat von X reagieren,

b) man läßt das aus seinem Salz durch eine Ammoniak-Lösung freigesetzte PQ mit dem N-Hydroxysuccinimid-Ester des gegebenenfalls geschützten Derivats von X reagieren,

c) man reinigt das so erhaltene Rohprodukt durch Chromatographie an Silicagel,

d) man spaltet anschließend in Gegenwart einer Säure, insbesondere der Trifluoressigsäure, die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen ab unter Bildung des Derivats PQ in Form seines Salzes, insbesondere des Trifluoroacetats, oder die Verbindung kann durch Hydrogenolyse von den Schutzgruppen befreit werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gegenanion Trifluoroacetat ausgetauscht wird gegen Hydrochlorid oder Phosphat.

8. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrochloridsalz mit Natriumbisulfit behandelt wird,

9 Verfahren zur Herstellung eines Derivats PQ-X nach Anspruch 1 oder 2, in dem X die L-Pyroglutaminsäure darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man einen γ-Ester der L-Glutaminsäure in N-Carboxyanhydrid überführt, wobei die Reaktion in Gegenwart von Phosgen durchgeführt wird, daß man das genannte N-Carboxyanhydrid-Derivat durch Umsetzung bei 0ºC in THF an PQ kuppelt unter Bildung des Derivats L- Pyroglutamyl-PQ.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Ester der L-Glutaminsäure um das γ-Methylglutamat oder das γ-Benzylglutamat handelt.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktives Prinzip (Wirkstoff) die Derivate nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze enthält.