DE3876836T2

DE3876836T2 - Aminochinolinderivate gegen malaria, verfahren zur herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzung.

Info

Publication number: DE3876836T2
Application number: DE8888400683T
Authority: DE
Inventors: Jean-Bernard Falmagne; Philippe Pirson; Jacques Quivy; Andre Trouet
Original assignee: La Region Wallonne
Current assignee: La Region Wallonne
Priority date: 1987-03-24
Filing date: 1988-03-22
Publication date: 1993-05-06
Anticipated expiration: 2008-03-23
Also published as: ATE83771T1; FR2612778A1; ES2052752T3; GR3006982T3; EP0286491B1; DE3876836D1; EP0286491A1; JPS63255265A; FR2612778B1; CA1336528C

Description

Die vorliegende Erfindung gehört in das Gebiet der therapeutischen Behandlung von Human-Malaria, insbesondere der Gewebeformen.
2,5 Milliarden Menschen, die in den endemischen Zonen leben, wo die Malaria grassiert, mahnen das bis heute vergebliche Bemühen an, diese Krankheit zu kontrollieren. 400 Millionen Menschen leben in den Regionen, wo keine prophylaktische Maßnahme angewendet wird. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt ein, daß in jedem Jahr eine Million Kinder von unter fünf Jahren an dieser Krankheit sterben, und das nur auf dem afrikanischen Kontinent.
Es existieren vier Stämme von Plasmodien, die für die Krankheit beim Menschen verantwortlich sind. Sie weisen einen gleichartigen Evolutionszyklus auf, der einen Überträger, einen weiblichen Moskito der Gattung Anopheles, und einen Wirt, den Menschen, einbezieht. Plasmodium falciparum (malignes Tertiärfieber) ist der furchtbarste dieser Stämme, er ist verantwortlich für tödliche Komplikationen bei Malaria cerebralis und eine der ersten Ursachen für die Kindersterblichkeit in den endemischen Gebieten.
Plasmodium vivax und P. ovale (benignes Tertiärfieber) sind weniger virulent, aber sie produzieren latente Formen in den Hepatozyten, den Hypnozoiten. Diese Formen sind verantwortlich für klassische Rückfälle, die nach einer einzigen Infektion über eine lange Zeitdauer (zwei bis fünf Jahre) fortbestehen können. P. malariae ist wenig verbreitet, es ist verantwortlich für chronische Nierenerkrankungen, wie der Nephritis und den tödlichen nephrotischen Syndromen, und kann über mehrere Jahre im Blut fortbestehen.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die Entwicklung von neuen Medikamenten, die bei der Human-Malaria wirksam sind, insbesondere bei ihren Gewebeformen, nämlich neue Aminochinolin-Derivate, besonders neue Derivate von Primaquin, das die folgende Struktur aufweist: Formel I
Bei der vorliegenden Patentanmeldung versteht man unter Aminochinolin ein Derivat des Chinolins, das mindestens eine freie Amin-Funktion aufweist, insbesondere die 8-Aminochinoline, wie sie das Primaquin [6-Methoxy-8-(4- amino-1-methylbutylamino)-chinolin] darstellt, aber auch andere 8-Aminochinoline mit einer primären Amin-Funktion am Ende der Seitenkette, wie Chinocid [6-Methoxy-8-(4-aminopentylamino)-chinolin oder SN 3883 [6-Methoxy-8-(4-aminobutylamino)-chinolin].
Aber es existieren ebenfalls noch andere Derivate von Primaquin, bei denen die Modifizierungen vom Chinolinkern (in Position 2,4,2-4,5,4-5) und von der Seitenkette (4-Amino-1-alkylbutylamino) getragen werden, die von der vorliegenden Erfindung umfaßt werden.
Bei den klassischen Behandlungen der Malaria, im wesentlichen repräsentiert durch die 8-Aminochinoline (Primaquin, Chinocid), sind die Gewebe-Schizonten für die Kausal-Prophylaxe verantwortlich, nämlich die Vorbeugung der Blutinfektion durch Zerstörung der primären Gewebeformen (exo-erythrozytär) bei P. falciparum und die Radikal-Behandlung durch Entfernung der sekundären Gewebeformen bei P. vivax und P. ovale. Das Primaquin, ein 6-Methoxy-8-(4- amino-1-methylbutylamino)-chinolin der Formel I, und vor mehr als 30 Jahren eingeführt, ist klinisch bei den beständigen Gewebeformen von P. vivax und P.ovale beim Menschen wirksam und immer ein Medikament der Wahl.
Dennoch begrenzt die Toxizität des Primaquins seinen Einsatz bei einer kontrollierten klinischen Verwendung. Die ernsthafteste toxische Wirkung ist die Hämolyse, besonders bei Individuen, die ein erythrozytäres genetisches Defizit aufweisen, beispielsweise an Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Die Methämoglobinurie, gastro-intestinale Störungen sowie einige Wirkungen am Zentralnervensystem sind ebenfalls signifikante toxische Wirkungen des Primaquins und anderer 8-Aminochinoline.
Die Anzahl an Antimalariamitteln, die eine radikale kausale oder kurative prophylaktische therapeutische Wirkung besitzen, ist extrem begrenzt. Das Primaquin ist das einzige Medikament für die radikale kurative Behandlung, aber die sekundären toxischen Wirkungen begrenzen dabei scharf die therapeutische Anwendung.
Es ist festzustellen, daß nur die Verbindungen aus der Familie der 8- Aminochinoline geeignet sind, eine umfassende Genesung herbeizuführen.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue Antimalaria-Derivate von Chinolin vorzuschlagen, insbesondere neue Derivate von 8-Aminochinolin, die einen günstigeren therapeutischen Index besitzen.
Anders gesagt ist das Ziel der vorliegenden Erfindung die Reduzierung der den genannten Antimalaria-Chinolinen, wie dem Primaquin, innewohnenden Toxizität und die Erhöhung ihrer Aktivität, insbesondere von Primaquin, bei den hepatitischen Gewebeformen.
Zu diesem Zweck hat die vorliegende Erfindung neue Antimalaria-Derivate von Aminochinolin zum Gegenstand, insbesondere neue Derivate von Primaquin, deren wesentliches Merkmal es ist, schematisch der Formel
PQ - X
zu entsprechen, in der
- PQ ein Antimalaria-8-Aminochinolin darstellt und X ausgewählt wird unter L- Alanin, L-Phenylalanin und L-Glutaminsäure, und
- PQ-X eine kovalente Peptid-Bindung zwischen der freien Amino-Gruppe des PQ und der endständigen Carbonsäure-Gruppe des X ist.
Das Primaquin wirkt wie ein Oxydationsmittel und destabilisiert die Membran der roten Blutkörperchen, die eine Hämolyse hervorrufen, was der Ursprung für seine hauptsächliche Toxizität ist.
Das in Übereinstimmung mit der Erfindung durchgeführte Hinzufügen einer Aminosäure reduziert das Eindringen des Primaquins in die roten Blutkörperchen im Hinblick auf die sterische Hinderung.
Außerdem ist in ganz und gar überraschender Weise die Wirkung dieser neuen Derivate, wie man weiter unten sehen wird, viel mehr ausgeprägt.
Der Artikel in Journal of Medicinal Chemistry 1986, vol 29, S.1765, beschreibt die Herstellung von Cysteinyl-Primaquin. Der Artikel in Bulletin of the W.H.O. 59 (3), 459-488, 1981, beschreibt ein Leucyl-Primaquin-Derivat.
Man stellt fest, daß das in der europäischen Anmeldung EP 37 388 vorgeschlagene, mit L-Leucin verbundene Primaquin unter Berücksichtigung seiner Bedeutung als Linker oder Arm in den Rahmen der konjugierten Überträger-Arm- Drogen fällt. Tatsächlich ist das L-Leucyl-Primaquin in dem Serum stabil und regeneriert den freien Wirkstoff gleichzeitig mit dem Unterziehen unter die liposomale Digestion. Jedoch erweist sich der therapeutische Index der Derivate von PQ mit dem angefügten nicht konjugierten L-Leucin als weniger interessant als die Derivate, die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden, wie nachstehend zu sehen ist.
Bei Primaquin werden besonders bemerkenswerte therapeutische Wirkungen erhalten für L-Lysyl-PQ, L-Phenylalanyl-PQ, L-Alanyl-PQ und L-Glutamyl-PQ.
Eine Reduzierung der erheblichen Toxizität wird für L-Glutamyl-PQ und L- Alanyl-PQ erhalten.
Die zwei kombinierten Wirkungen (Aktivität und Toxizität) ermöglichen eine wesentliche Erhöhung des therapeutischen Indexes im Fall der Derivate L-Glutamyl-PQ (16,1), L-Alanyl-PQ (7,5) und L-Phenylalanyl-PQ (5,3).
In dieser Patentanmeldung versteht man unter Aminoacyl-Derivaten oder Aminosäure-Derivaten von Aminochinolinen das Produkt, das durch die Verbindung einer Aminosäure mit dem genannten Aminochinolin in Übereinstimmung mit der Erfindung erhalten wird.
Die Produkte der Basis PQ sowie die erhaltenen Produkte PQ-X können in Form ihrer Additionssalze mit Säuren vorliegen.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Antimalaria-Aminochinolin-Derivate zum Gegenstand, insbesondere von neuen Primaquin-Derivaten.
Bei dem wesentlichen Merkmal des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung bringt man eine Aminosäure in saurer Form, deren Amin-Funktion geschützt ist, mit dem Aminochinolin oder einem seiner Salze, das eine freie Amin-Funktion trägt, in Anwesenheit eines Kondensationsmittels zur Reaktion.
Die Schutzgruppen für die Amin-Funktion sind klassische Schutzgruppen, aber vorzugsweise verwendet man das tert.-Butyloxycarbonyl.
Die Säure-Funktion der Aminosäure kann auch aktiviert werden, beispielsweise in Form eines Esters mit N-Hydroxysuccinimid.
Das Kondensationsmittel ist im allgemeinen ein Carbodiimid, wie Dicyclohexylcarbodiimid.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens geht man von einem Aminochinolin-Salz aus, beispielsweise vom Diphosphat des Primaquins, und von der Aminosäure, deren Amin-Funktion durch beispielsweise eine tert.-Butyloxycarbonyl-Gruppe geschützt ist, wobei man die folgenden Stufen durchführt:
a) man bringt N-Hydroxysuccinimid oder jede andere die Säure-Funktion der Aminosäure aktivierende Gruppe, mit dem geschützten Derivat der Aminosäure, beispielsweise mit dem N-tert.-Butyloxycarbonyl-Derivat der Aminosäure, zur Reaktion,
b) man bringt das Aminochinolin, wie Primaquin, freigesetzt aus seinem Salz durch beispielsweise eine Ammoniak-Lösung, mit beispielsweise dem N-Hydroxysuccinimid-Ester des geschützten Aminosäure-Derivates zur Reaktion,
c) man reinigt das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt durch Chromatographie auf Silicagel,
d) die Schutzgruppe der erhaltenen Verbindung, wie tert.-Butyloxycarbonyl, wird anschließend in Anwesenheit von Säure, beispielsweise Trifluoressigsäure, abgespalten, um das Derivat PQ-X in Form von Salz, beispielsweise als Trifluoracetat, zu erhalten.
Diese Gruppe kann unter Bedingungen entfernt werden, die die gebildete Peptid-Bindung nicht zerstören.
Gemäß einem anderen Merkmal des Verfahrens wird das in Stufe d) erhaltene Produkt durch Umkehrphasen-Chromatographie gereinigt. Diese Reinigung weist industrielle Bedeutung auf mit der Möglichkeit, in Serien von Kolonnen zu arbeiten.
Genauer gesagt verwendet man beispielsweise als Eluent eine Mischung von Acetonitril in Wasser, die Säure enthält, beispielsweise Trifluoressigsäure.
Gemäß einem weiteren besonderen Merkmal des Verfahrens wird das Gegenanion Trifluoracetat durch Hydrochlorid ausgetauscht.
Mit dem Ziel Oxydationsreaktionen zu inhibieren, sieht ein weiteres besonderes Merkmal der Erfindung vor, daß die wäßrige Lösung, die das Hydrochlorid-Salz des Derivates gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, mit Natriumbisulfit behandelt wird.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen zum Gegenstand, die als Wirkstoff die neuen Derivate gemäß der Erfindung oder ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze enthalten.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden im Licht der folgenden Beispiele hervortreten.

Beispiele I bis VII: SYNTHESE DER AMINOACYL-DERIVATE VON PRIMAQUIN

(Pq = Primaquin)

Die Aminoacyl-Derivate von Primaquin werden in zwei Stufen ausgehend von Primaquin-Diphosphat und der Aminosäure erhalten, deren Amin-Funktion durch eine N-tert.-Butyloxycarbonyl-Gruppe (N-tBoc) geschützt ist. Die erste Stufe umfaßt die Reaktion von Primaquin-Base mit dem N-Hydroxysuccinimid-Ester des N-tBoc-Derivates der Aminosäure.
Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt wird dann durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt. Man isoliert mit guten Ausbeuten (± 70 %) das in Form eines mehr oder weniger kristallinen und ausreichend hygroskopischen Feststoffes erhaltene Produkt.
Die Gruppe tBoc wird anschließend in Anwesenheit von Trifluoressigsäure abgespalten. Das Aminoacyl-Derivat des Primaquins wird in Form des Trifluoracetates erhalten (vermutlich ein Ditrifluoracetat).
In dem Fall, wo eine spätere Reinigung erforderlich ist, benutzt man eine Kolonne für Umkehrphasen-Chromatographie und das Produkt wird mit einer Mischung Acetonitril/Wasser eluiert.
Das Aminoacyl-Derivat des Primaquins in Form der freien Base kann durch Neutralisation der wäßrigen Lösung erhalten werden, die das Trifluoracetat von Aminoacyl-Pq enthält, durch NH&sub4;OH bis zu einem pH-Wert ± 8, gefolgt von einer gründlichen Extraktion mit Dichlormethan. Man erhält nach Verdampfen des CH&sub2;Cl&sub2; ein sehr schwer zu handhabendes grünliches Öl, das später durch Chromatographie über eine Silicagel-Kolonne gereinigt werden kann, indem man mit einer Mischung von CH&sub2;Cl&sub2;/EtOH/NH&sub4;OH (120/20/1) eluiert.
Bei der Methode der Reinigung der Aminoacyl-Derivate von Primaquin in Form ihrer Trifluoracetate, die eine Technik der Kolonnen-Umkehrphasen-Chromatographie anwendet, ist die eingesetzte Kolonne eine Kolonne Merck lobar 8. Der Träger ist eine durch C&sub8;-Reste gepfropfte Kieselerde. Zur Vermeidung von Oxydationsprozessen bei den Derivaten auf der Kolonne werden die Lösungsmittel für die Elution sorgfältig entgast. Für den gleichen Zweck kann man andere Typen von gepfropfter Kieselerde als stationäre Phase vorsehen, insbesondere vollständig demineralisierte. Das im wäßrigen sauren Medium gelöste rohe Produkt wird am Kopf der Kolonne adsorbiert. Anschließend führt man eine Entsalzungsstufe (H&sub2;O-H&spplus;) durch, bevor das Produkt unter Verwendung eines Gradienten von CH&sub3;CN in H&sub2;O/H&spplus; eluiert wird. Das Eluat wird fraktioniert. Die Fraktionen, die das Produkt enthalten (gelb-orange gefärbte Fraktionen) werden durch HPLC analysiert. Diese Fraktionen, die das Produkt mit einer Reinheit von höher als 98 % enthalten, werden gesammelt und lyophilisiert. Man erhält ein helles gelb-orangenes Pulver. Das Gegenanion Trifluoracetat wird anschließend durch Hydrochlorid ausgetauscht, indem man zu einer wäßrigen Lösung des Trifluoracetat-Salzes eine Menge von wäßriger HCl gibt, die annähernd zwei Äquivalenten Säure entspricht, berechnet in bezug auf das Gewicht des auszutauschenden Trifluoracetat-Salzes. Die erhaltene Lösung (pH 2,8-3) wird dann unter Lichtausschluß lyophilisiert (2 Lyophilisationen). Das erhaltene Produkt liegt in Form eines sehr hygroskopischen, hellen orangenen Pulvers vor. Sogar bei Aufbewahrung unter inerter Atmosphäre (Argon) zersetzt sich das Produkt hinlänglich schnell im Laufe der Zeit. In Lösung weist es ebenfalls nur eine begrenzte Stabilität auf: physiologisches Milieu oder wäßrige Lösung von 0 ºC und unter Lichtausschluß.
Der Chinolin-Kern ist ein besonders empfindliches Ziel für jede Oxydationsreaktion. Dies erklärt zum Teil die beobachtete Instabilität. Mit dem Ziel diese Oxydationsreaktionen zu inhibieren, wurde die wäßrige Lösung, die das Trifluoracetat-Salz enthält, mit Natriumbisulfit (0,1 %) behandelt.
Der relative Anteil CH&sub3;CN-H&sub2;O/H&spplus; schwankt je nach Beschaffenheit der mit dem Primaquin verbundenen Aminosäure.

Beispiel I: Synthese von N-1-L-Alanyl,N-4-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4- pentandiamin

Zu 1 g (5,9 mMol) N-tBoc-Alanin, gelöst in 10 ml Diglym (Diethylenglykoldimethylether) und auf einer Temperatur von 0 ºC gehalten, gibt man 0,61 g (5,3 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 1,09 g (5,3 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 4 Stunden Reaktion gibt man 1,37 g (5,3 mMol) Primaquin-Base hinzu. Diese wird aus Primaquin-Diphosphat durch Einwirkung einer 25 %igen Ammoniak-Lösung freigesetzt. Nach 17 Stunden wird der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Lösungsmittel unter Vakuum ausgetrieben. Das erhaltene braune Öl wird in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das Produkt wird über Silicagel gereinigt, indem man als Eluent eine Mischung Dichlormethan/Methanol verwendet. Die gereinigten Fraktionen werden gesammelt, und das eingedampfte Eluat führt zu 1,5 g (66 %) eines mehr oder weniger kristallinen, hinlänglich hygroskopischen Produktes.
NMR: (CDCl&sub3; - TMS):
1.2-1.7 (m, 19H); 3.3 (m, 2H); 3.64 (m, 1H); 3.9 (s, 3H); 4.07 (m, 1H); 5 (m, 1H); 6 (m, 1H); 6.2 (m, 1H); 5.26 (d, 1H); 6.33 (D, 1H); 7.3 (dd, 1H); 7.9 (DD, 1H); 8.5 (dd, 1H).
Die vorstehend erhaltene Verbindung wird in 15 ml einer Mischung 1:1 von Dichlormethan und Trifluoressigsäure gelöst. Die Mischung wird dann 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösungsmittel werden unter Vakuum verdampft und der Rückstand in Wasser aufgenommen und mehrmals mit Diisopropylether gewaschen.
Wenn erforderlich, wird das Produkt durch Umkehrphasen-Chromatographie (Merck lobar 8) gereinigt, indem man als Eluent eine Mischung von 25 % Acetonitril in Wasser verwendet, die 1 % Trifluoressigsäure enthält.
Die gereinigten Fraktionen (HPLC) werden gesammelt und das Acetonitril unter Vakuum ausgetrieben. Nach zwei Zyklen Lyophilisation erhält man 1,6 g (80 %) eines hygroskopischen hell-orangenen Pulvers.
NMR: (D&sub2;O-Ref. extern):
1.65-1.50 (m, 6H); 1.88 (m, 4H); 3.45 (m, 2H); 5 (m, 1H); 4.17 (m, 4H); 7.08 (s, 1H); 7.13 (d, 1H); 7.93 (dd, 1H); 8.65 (d, 1H); 8.88 (d, 1H).

Beispiel II: Synthese von N-1-D-Alanyl,N-4-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4- pentandiamin

Man arbeitet in der gleichen Weise wie zuvor in Beispiel I beschrieben und isoliert die Titelverbindung ausgehend von Primaquin und N-tBoc-D-Alanin sowie nach Abspaltung der Schutzgruppe von der Amin-Funktion mit Hilfe von Trifluoressigsäure (52 %).
NMR: (CD&sub3;OH-Ref. extern):
1.40 (d, 3H); 1.54 (dd, 3H); 1.80 (m, 4H); 3.80 (m, 1H); 3.94 (q, 1H); 4 (s, 3H); 6.6 (s, 2H); 7.35 (dd, 1H); 8.37 (m, 1H); 8.68 (dd, 1H).

Beispiel III: Synthese von N-1-L-Leucyl,N-4-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4- pentandiamin

Man arbeitet in der gleichen Weise wie zuvor in Beispiel I beschrieben und isoliert die Titelverbindung ausgehend von Primaquin und N-tBoc-L-Leucin sowie nach Abspaltung der Schutzgruppe von der Amin-Funktion mit Hilfe von Trifluoressigsäure (70 %).
NMR: (H&sub2;O-Ref. extern):
0.71-0.81 (m, 6H); 1.28 (d, 3H); 1.4-1.7 (m, 7H); 3-3.2 (m, 1H); 3.26-3.5 (m, 1H); 3.6-4 (m, 5H); 6.8-6.9 (m, 2H); 7.65-7.72 (m, 1H); 8.52 (d, 1H); 8.63 (d, 1H).

Beispiel IV: Synthese von N-1-D-Leucyl,N-4-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4- pentandiamin

Man arbeitet in der gleichen Weise wie zuvor in Beispiel I beschrieben und isoliert die Titelverbindung ausgehend von Primaquin und N-tBoc-D-Leucin sowie nach Abspaltung der Schutzgruppe von der Amin-Funktion mit Hilfe von Trifluoressigsäure (78 %).
NMR: (CD&sub3;OD-Ref. extern):
1.05 (m, 6H); 1.4 (d, 3H); 1.77 (m, 6H); 3.36 (m, 2H); 3.7 (m, 2H); 4 (s, 3H); 6.66 (s, 2H); 7.67 (dd, 1H); 8.46 (ddd, 1H); 8.72 (dd, 1H).

Beispiel V: Synthese von N-1-L-Phenylalanyl,N-4-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4- pentandiamin

Man arbeitet in der gleichen Weise wie zuvor in Beispiel I beschrieben und isoliert die Titelverbindung ausgehend von Primaquin und N-tBoc-L-Phenylalanin sowie nach Abspaltung der Schutzgruppe von der Amin-funktion mit Hilfe von Trifluoressigsäure (79 %).
NMR: (CD&sub3;OD-Ref. extern):
1.35 (dd, 3H); 1.62 (m, 4H); 3.16 (m, 2H); 3.40 (m, 2H); 3.71 (m, 1H); 3.92 (d, 3H); 4.03 (dt, 1H); 6.38 (m, 1H); 6.53 (m, 1H); 7.32 (m, 5H); 7.46 (dd, 1H); 8.13 (m, 1H); 8.59 (dd, 1H).

Beispiel VI: Synthese von N-1-L-Lysyl,N-4-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4- pentandiamin

Man arbeitet in der gleichen Weise wie zuvor in Beispiel I beschrieben und isoliert die Titelverbindung ausgehend von Primaquin und N-tBoc-L-Lysin sowie nach Abspaltung der Schutzgruppe von der Amin-Funktion mit Hilfe von Trifluoressigsäure.

Beispiel VII: Synthese von N-1-L-Glutamyl,N-4-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4- pentandiamin

Man arbeitet in der gleichen Weise wie zuvor in Beispiel I beschrieben und isoliert die Titelverbindung ausgehend von Primaquin und N-tBoc-Glutaminsäure sowie nach Abspaltung der Schutzgruppe von der Amin-Funktion mit Hilfe von Trifluoressigsäure.

Beispiel VIII: Synthese von N-1-L-Alanyl-L-Leucyl,N-4-(6-methoxy-8-chinolinyl)-1,4-pentandiamin

Zu 686 mg (3 mMol) N-t-Boc-Leucin, gelöst in 7 ml Dimethylformamid und auf einer Temperatur von 0 ºC gehalten, gibt man 346 mg (3 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 6,3 mg (3 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid. Anschließend wird die Reaktion 24 Stunden lang bei 4 ºC gehalten.
Andererseits stellt man eine Lösung von 1,5 g (2,7 mMol) des Trifluoracetat-Salzes von L-Alanyl-Primaquin in 7 ml Dichlormethan her, zu der man 593 ul (5,4 mMol) N-Methylmorpholin gibt.
Nach 24 Stunden Reaktion bei 20 ºC verdampft man die Lösungsmittel. Das auf diese Weise erhaltene braune Öl wird in Ethylacetat gelöst. Danach wird die organische Phase fünfmal mit Wasser gewaschen. Die wäßrigen Phasen werden vereinigt und einmal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden gesammelt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das erhaltene braune Öl wird in einer minimalen Menge Ethylacetat gelöst und über eine Silicagel-Kolonne gereinigt, indem man mit 400 ml einer Mischung Ethylacetat/Hexan (50/50) und anschließend mit 400 ml reinem Ethylacetat eluiert. Die gereinigten Fraktionen werden gesammelt und bis zur Trockne eingedampft. Man erhält auf diese Weise 1 g N-t-Boc-L-Leu-L-Ala-Primaquin.
Dieses Produkt wird direkt bei der Reaktion zur Abspaltung der Schutzgruppe eingesetzt, und zwar in Mischung mit 5 ml Dichlormethan und 5 ml Trifluoressigsäure innerhalb von 30 Minuten bei Umgebungstemperatur.
Die Lösungsmittel werden unter Vakuum verdampft und der Rückstand in Wasser aufgenommen und mit einer Mischung Diethylether/Diisopropylether/Hexan (1/1/1) extrahiert. Anschließend wird die wäßrige Phase lyophilisiert. Nach zwei Lyophilisationen erhält man 1,2 g (66 %) Dipeptid.

Beispiele IX bis XIII: THERAPEUTISCHE BEISPIELE

Das Modell der Nagetier-Malaria, Plasmodium berghei-Anopheles stephensi- Maus, entwickelt von MOST, H., HERMAN, R. & SCHOENFELD, C. (1967) Am.J.Trop. Med.Hyg. 16, 572-575, ermöglicht die Bestimmung der kausalen prophylaktischen Aktivität (Gewebe-Schizonten) der neuen therapeutischen Verbindungen. Die angewendete Verfahrensweise ist abgeleitet von der durch MOST, H. & MONTUORI, W.A. (1975) Am.J.Trop.Med.Hyg. 24, 179-182, beschriebenen. Es handelt sich um das System P. berghei berghei (ANKA)- Anopheles stephensi-Maus Swiss OF1. Der Stamm ANKA von P. b. berghei wird zyklisch erhalten durch Anopheles stephensi. Der Maus-Stamm Swiss OF1 ist besonders empfindlich gegenüber P. b. berghei, der immer eine tödliche Infektion hervorruft.

Beispiel IX: Isolierung der Stechmücken-Sporozoiten und Versuchs-Infektion

Weibliche Stechmücken (80 bis 100 Individuen pro Präparation) werden von ihren Beinen, Flügeln und Hinterleibern befreit und anschließend bei 4 ºC mit Hilfe eines Glas-Stößels in einem Medium M 199 (GIBCO), das 10 % Kälberfötus- Serum enthält, homogenisiert. Die Suspension der Sporozoiten wird dann von den Stechmücken-Fragmenten durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen (2 Minuten bei 50 g und 5 Minuten bei 200 g) gereinigt und der gesammelte aufschwimmende Anteil bei 4 ºC konserviert. Nach Auszählen in einer Petroff- Hausser-Kammer wird die Anzahl von Parasiten durch Verdünnen mit dem gleichen kalten Milieu auf eine Dichte von 2 10&sup5; Sporozoiten/ml eingestellt. Diese ganze Prozedur wird immer in einer Zeit von maximal 35 Minuten durchgeführt und ermöglicht es, die Lebensfähigkeit und die Infektiösität der Sporozoiten aufrechtzuerhalten.
Ein Volumen von 0,5 ml der Suspension, die 10&sup5; Sporozoiten enthält, wird intravenös weiblichen Mäusen Swiss OF1 mit einem Gewicht von 18 bis 22 g injiziert, die für die therapeutischen Untersuchungen verwendet werden.

Beispiel X: Chemotherapeutische Behandlungen

Gruppen von 20 bis 25 der wie oben beschrieben infizierten Mäuse werden mit einer einzigen intravenösen Injektion von Primaquin-Diphosphat (Pq) oder den monoacylierten und den Aminosäure-Derivaten des Primaquins in Form der Dihydrochloride (X-Pq) drei Stunden nach der Inokulation der Sporozoiten behandelt. das injizierte Volumen wird in Abhängigkeit vom Gewicht der Mäuse eingestellt, und zwar in einem Verhältnis von 0,5 ml pro 25 g Gewicht. Die Verbindungen werden in einem Phosphat-Salz-Puffer (PBS) pH 7,0 verdünnt und der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Die infizierten, aber nicht behandelten Mäuse (5 pro Gruppe) erhalten nur den Puffer und dienen zur Kontrolle der Infektiösität der Sporozoiten.

Beispiel XI: Verwendete Parameter für die Bewertung der Wirksamkeit von Primaquin

Die Untersuchungs-Mäuse werden über eine Zeitdauer von 50 Tagen gehalten. Die Entwicklung der Parasitämie wird durch tägliche Überprüfung des Blut-Ausstriches verfolgt, gefärbt 60 Minuten lang mit Giemsa (5 %) in einem Sörensen-Puffer pH 7,2, ausgehend vom 5. Tag und bis zum 15. Tag. Auf diese Weise kann die Anzahl infizierter Tiere bestimmt werden. Diese Resultate ermöglichen es, das Überleben über einen langen Zeitraum festzustellen (LTS, Anzahl der überlebenden, nicht parasitären Mäuse zur Anzahl der infizierten und behandelten Mäuse).
Die kausale prophylaktische Aktivität (CPD&sub5;&sub0;) wird durch Analyse der Logits der Reaktion (ausgedrückt in % LTS) in Abhängigkeit von der Dosis (mg Pq/kg) erhalten.
Die eventuelle Restwirkung der Medikamente auf die ersten erythrozytären Formen (erythrozytärer schizontozider Effekt) wird nach der Methode von GREGORY, K.G. & PETERS, W. (1970) Ann.Trop.Med.Parasitol. 64, 15-24 bestimmt, basierend auf dem Test der 2 % von Warhurst.

Beispiel XII: Untersuchung der Toxizität der Verbindungen

Die akute Toxizität in Abhängigkeit von der verabreichten Einheitsdosis wird an Mäusen mit einem Gewicht von 18 bis 22 g bestimmt. Es wird eine Reihe von Verdünnungen von jeder Verbindung an Gruppen von 10 Mäusen auf intravenösem Weg injiziert.
Die letale Dosis für 50 % der nicht infizierten Mäuse (LD&sub5;&sub0;) wird durch lineare Regression der Logits des Prozentsatzes überlebender Tiere in Abhängigkeit vom Logarithmus der injizierten Dosis (in mg Pq-Diphosphat-Äquivalent/kg) bestimmt [Logit Weighted Transformation; BERKSON, J. (1953), J.Am. Stat.Assoc. 48, 565-599].

Beispiel XIII: Therapeutische und toxikologische Aktivität von Primaquin und seinen Aminosäure-Derivaten in vivo

Die mit Hilfe der Sporozoiten von P. berghei infizierten Tiere werden drei Stunden danach mit einer einzigen Injektion der Verbindungen auf intravenösem Weg behandelt. Dieser Test ermöglicht es, die kausale prophylaktische Aktivität der Verbindungen oder die Dosis zu definieren, die eine Genesung von 50 % der infizierten Tiere (CPD&sub5;&sub0;) ermöglicht. Die Dosis wird immer in mg Pq-Diphosphat pro kg ausgedrückt.
Die Resultate der Toxizität von Primaquin und seinen Aminosäure- und Dipeptid-Derivaten sind in der Tabelle 1 dargestellt. Die Resultate der kausalen prophylaktischen Aktivität (+ 3 Stunden) von Primaquin und den verschiedenen Derivaten sind in den Tabellen 3 bis 8 aufgeführt und in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Für Primaquin (Tabelle 3) beträgt die minimal wirksame Dosis (EM) 10,4 mg Pq/kg. Die kausale prophylaktische Aktivität (CPD&sub5;&sub0;) von Pq liegt bei 18,7 mg Pq/kg. Wegen der Toxizität des Pq von 25 mg/kg an ist es nicht möglich, eine heilende Behandlung zu erreichen. Die bei 25 mg/kg erhaltene therapeutische Aktivität beträgt 75 %. Die auf die Toxizität von Pq bezogenen Resultate sind ebenfalls in Tabelle 1 aufgeführt. Die maximal tolerierte Dosis (MTD) beträgt 25,7 mg Pq/kg und die letale Dosis (LD&sub5;&sub0;) 31 mg Pq/kg. Der therapeutische Index von Pq, dargestellt durch das Verhältnis von LD&sub5;&sub0; zu CPD&sub5;&sub0;, beträgt 1,7.
Das erste Derivat, L-Leucyl-Pq (Tabelle 2), zeigt sich etwas mehr aktiv als Pq. Die minimale wirksame Dosis und die CPD&sub5;&sub0; betragen jeweils 7,6 mg Pq/kg und 16,2 mg Pq/kg. Bei der Dosierung von 30 mg Pq/kg wird eine vollständig heilende Behandlung (100 %) erreicht. Der Index Pq beträgt nur 1,2. Tabelle 1: Toxizität und Aktivität von Primaquin und seinen Aminosäure- Derivaten Chinolin-Derivatea
a: Die Derivate werden auf intravenösem Weg drei Stunden nach der Inokulation der Sporozoiten verabreicht. Die Konzentrationen sind immer in mg Pq-Diphosphat/kg ausgedrückt.
b: Die maximal tolerierte Dosis wird wie die höchste Dosis definiert, die einen Gewichtsverlust von unterhalb oder gleich 5 % des Ausgangsgewichts während einer Periode von fünf auf die intravenöse Injektion folgenden Tagen hervorruft.
c: Letale Dosis, die 50 % der Mäuse mit einer einzigen intravenösen Injektion tötet.
d: Kausale prophylaktische Dosis, die es ermöglicht, 50 % der injizierten Mäuse zu heilen.
e: Therapeutischer Index, definiert durch das Verhältnis LD&sub5;&sub0;/CPD&sub5;&sub0;. Tabelle 2: Kausale prophylaktische Aktivität von Primaquin-Diphosphat und seinen Derivaten Verbindunga Index Pqd Primaquin
a: Die Verbindungen werden intravenös drei Stunden nach der Inokulation der Sporozoiten von P. berghei verabreicht. Die Dosis ist in mg Pq-Diphosphat-Äquivalent/kg ausgedrückt.
b: Kausale prophylaktische Dosis, die 50 % der infizierten Tiere heilt.
c: Minimal wirksame Dosis (MED) und vollständig heilende Dosis (DE&sub1;&sub0;&sub0;).
d: Der Index Pq wird definiert durch das Verhältnis: CPD&sub5;&sub0; von Pq/CPD&sub5;&sub0; der Verbindung.
e: Der therapeutische Index ist das Verhältnis zwischen LD&sub5;&sub0; und CPD&sub5;&sub0;. Tabelle 3: Kausale prophylaktische Aktivität von Primaquin-Diphosphat Dosis (mg/kg)a Kontrollen
a: Das Pq wird intravenös drei Stunden nach der Inokulation der Sporozoiten von P. berghei verabreicht. Die Dosis ist in mg Pq-Diphosphat/kg ausgedrückt.
b: Langzeit-Überleben am Tag 50 bei der Anzahl infizierter und behandelter Mäuse.
c: Kausale prophylaktische Dosis, die 50 % der Tiere heilt.
d: Der therapeutische Index ist das Verhältnis zwischen LD&sub5;&sub0; und CPD&sub5;&sub0;.
e: Toxizität bei der Injektion.
Das L-Alanyl-Pq (Tabelle 4) besitzt eine deutlich höhere therapeutische Aktivität als das Pq und seine Leu-Pq-Derivate. Die minimale wirksame Dosis liegt bei 4 mg Pq/kg, während die CPD&sub5;&sub0; 6,3 mg Pq/kg beträgt. Die Dosis von 9,9 mg Pq/kg wirkt vollständig heilend. Der Index Pq beträgt 3,0 und der therapeutische Index von L-Alanyl-Pq ist 7,5.
Dieses Derivat ist ebenfalls weniger toxisch als Primaquin (Tabelle 1). Daher erhält man für L-Alanin besonders interessante Resultate, vor allem eine Anti-Malaria-Aktivität von fast viermal höher als die von Primaquin- Base.
Das D-Alanin ist ebenfalls deshalb interessant, weil man mit ihm eine sehr geringe Toxizität erhält. Die Bindung mit dem Produkt D ist nämlich wenig reversibel. Daher dringen die Metaboliten in einer weniger großen Menge in die roten Blutkörperchen ein. Tabelle 4: Kausale prophylaktische Aktivität von L-Alanyl-Primaquin Chinolin-Derivatea Dosis (mg/kg) Index Pqd Kontrollen
a: Die zwei Derivate von Primaquin werden auf intravenösem Weg drei Stunden nach der Inokulation der Sporozoiten verabreicht. Die Konzentrationen sind ebenfalls in Pq-Diphosphat-Äquivalent/kg ausgedrückt.
b: Langzeit-Überleben am Tag 50 bei der Anzahl infizierter und behandelter Mäuse.
c: Kausale prophylaktische Dosis, die 50 % der infizierten Tiere heilt.
d: Der Index Pq ist das Verhältnis zwischen der CPD&sub5;&sub0; von Pq und der CPD&sub5;&sub0; des Derivates.
Die kausale prophylaktische Aktivität von L-Phenylalanyl-Pq ist in Tabelle 5 dargestellt. Die CPD&sub5;&sub0; dieses Derivates beträgt 6,1 mg Pq/kg, das ergibt einen Index Pq von 3,1. Die minimale wirksame Dosis ist 1,8 mg Pq/kg. Dieses Derivat wirkt in einer Dosierung von 21,3 mg Pq/kg vollständig heilend. Die Toxizität dieser Verbindung liegt in der Nähe von der von Pq. Der therapeutische Index ist 5,3.
Das L-Lysyl-Pq ist ebenfalls deutlich aktiver als das Pq mit einer CPD&sub5;&sub0; von 3,9 mg Pq/kg und einem Index Pq von 4,8 (Tabelle 6). Die minimale wirksame Dosis beträgt 1,7 mg Pq/kg. Dennoch zeigt sich diese Verbindung in stärkerer Dosis toxisch. Bei der minimalen toxischen Dosis von 8,2 mg Pq/kg wirkt die Verbindung vollständig heilend. Der therapeutische Index liegt höher als der von Pq (2,6).
Die Addition von L-Glutaminsäure oder L-Glutamin ermöglicht ebenfalls eine Steigerung der Wirksamkeit von Primaquin (Tabelle 7). Die CPD&sub5;&sub0; liegen jeweils bei 8,5 mg Pq/kg und bei 10 mg Pq/kg und der Index Pq beträgt 2,2 und 1,9. Das L-Glutamyl-Pq-Derivat erscheint als das am wenigsten toxische. Die MTD beträgt 124 mg Pq/kg (fünfmal größer als die MTD von Pq) und die LD&sub5;&sub0; ist 136 mg Pq/kg (viermal größer als die LD&sub5;&sub0; von Pq).
Die drei letzten Aminosäure-Derivate von Primaquin, das Succinyl-L- Alanyl-Pq, das Succinyl-L-Phenylalanyl-Pq und das Glutarryl-Pq sind deutlich weniger wirksam als das Pq. Tabelle 5: Kausale prophylaktische Aktivität von L-Phenylalanyl-Primaquin Chinolin-Derivatea Dosis (mg/kg) Index Pqd Kontrollen
a: Das Derivat von Primaquin wird auf intravenösem Weg drei Stunden nach der Inokulation der Sporozoiten verabreicht. Die Konzentrationen sind ebenfalls in Pq-Diphosphat-Äquivalent/kg ausgedrückt.
b: Langzeit-Überleben am Tag 50 bei der Anzahl infizierter und behandelter Mäuse.
c: Kausale prophylaktische Dosis, die 50 % der infizierten Tiere heilt.
d: Der Index Pq ist das Verhältnis zwischen der CPD&sub5;&sub0; von Pq und der CPD&sub5;&sub0; des Derivates. Tabelle 6: Kausale prophylaktische Aktivität von L-Lysyl-Primaquin Chinolin-Derivatea Dosis (mg/kg) Index Pqd Kontrollen
a: Das Derivat von Primaquin wird auf intravenösem Weg drei Stunden nach der Inokulation der Sporozoiten verabreicht. Die Konzentrationen sind ebenfalls in Pq-Diphosphat-Äquivalent/kg ausgedrückt.
b: Langzeit-Überleben am Tag 50 bei der Anzahl infizierter und behandelter Mäuse.
c: Kausale prophylaktische Dosis, die 50 % der infizierten Tiere heilt.
d: Der Index Pq ist das Verhältnis zwischen der CPD&sub5;&sub0; von Pq und der CPD&sub5;&sub0; des Derivates. Tabelle 7: Kausale prophylaktische Aktivität von L-Glutamyl-Primaquin und L-Glutaminyl-Primaquin Chinolin-Derivatea Dosis (mg/kg) Index Pqd Kontrollen
a: Die zwei Derivate von Primaquin werden auf intravenösem Weg drei Stunden nach der Inokulation der Sporozoiten verabreicht. Die Konzentrationen sind ebenfalls in Pq-Diphosphat-Äquivalent/kg ausgedrückt.
b: Langzeit-Überleben am Tag 50 bei der Anzahl infizierter und behandelter Mäuse.
c: Kausale prophylaktische Dosis, die 50 % der infizierten Tiere heilt.
d: Der Index Pq ist das Verhältnis zwischen der CPD&sub5;&sub0; von Pq und der CPD&sub5;&sub0; des Derivates. Tabelle 8: Kausale prophylaktische Aktivität von L-Leucyl-L-Alanyl-Primaquin Chinolin-Derivatea Dosis (mg/kg) Index Pqd Kontrollen
a: Das Derivat von Primaquin wird auf intravenösem Weg drei Stunden nach der Inokulation der Sporozoiten verabreicht. Die Konzentrationen sind ebenfalls in Pq-Diphosphat-Äquivalent/kg ausgedrückt.
b: Langzeit-Überleben am Tag 50 bei der Anzahl behandelter Mäuse.
c: Kausale prophylaktische Dosis, die 50 % der infizierten Tiere heilt.
d: Der Index Pq ist das Verhältnis zwischen der CPD&sub5;&sub0; von Pq und der CPD&sub5;&sub0; des Derivates.
Es wurde ebenfalls die eventuelle Restwirkung von allen diesen Verbindungen auf die Blutformen untersucht. Keine der Verbindungen zeigt eine Inhibitor-Wirkung der ersten Blutformen (hepatische Merozoiten) bei einer Konzentration, die der CPD&sub5;&sub0; und der DE&sub1;&sub0;&sub0; entspricht. Von da an tritt der therapeutische Effekt der Zerstörung der hepatischen (exo-erythrozytären) Formen in Erscheinung, der eine naturgemäße kausale prophylaktische Aktivität aufweist.
Es geht deutlich aus den für das Malaria-Modell erhaltenen Resultaten hervor, daß die Hinzufügung einer Aminosäure an der Seitenkette von Primaquin über eine dazwischenliegende Peptid-Bindung ermöglicht, einerseits die therapeutische Aktivität von Primaquin zu erhöhen und andererseits dessen akute Toxizität merklich zu reduzieren.
Auf der Basis des Index Pq wurden die besten therapeutischen Aktivitäten für L-Lysyl-Pq (4,8), L-Phenylalanyl-Pq (3,1), L-Alanyl-Pq (3,0) und L-Glutamyl-Pq (2,2) erhalten. Die anderen Derivate von Primaquin weisen eine therapeutische Aktivität etwa in der Größenordnung von Primaquin auf.
Auf der Basis der akuten Toxizität von Primaquin und seinen Derivaten ist die höchste Reduzierung der Toxizität bei L-Glutamyl-Pq, L-Alanyl-Pq und L-Leucyl-L-Alanyl-Pq zu verzeichnen. Was das L-Lysyl-Pq anbetrifft, so erweist es sich deutlich toxischer als Primaquin (3x).
Die zwei kombinierten Wirkungen (Aktivität und Toxizität) ermöglichen eine beachtliche Steigerung des therapeutischen Index, insbesondere im Fall der Derivate L-Glutamyl-Pq (16,1), L-Alanyl-Pq (7,5) und L-Phenylalanyl-Pq (5,3).
Das Hinzufügen einer zweiten Aminosäure zum Primaquin führt ebenfalls zu einer Steigerung des therapeutischen Index, insbesondere beim Derivat L-Leucyl-L-Alanyl-Pq (3,7).

Claims

1. Chinolin-Derivate mit Anti-Malaria-Eigenschaften, oder ihre Additionssalze mit Säuren, dadurch gekennzeichnet, daß sie schematisch der allgemeinen Formel

PQ - X

entsprechen, in der

- PQ ein Antimalaria-8-Aminochinolin darstellt und X ausgewählt wird unter L- Alanin, L-Phenylalanin und L-Glutaminsäure,

wobei die Bindung PQ-X eine kovalente Peptid-Bindung zwischen der freien Amino- Gruppe des PQ und der endständigen Carbonsäure-Gruppe des X ist.

2. Derivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß PQ Primaquin ist.

3. Verfahren zur Herstellung der Derivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man X, dessen Amin-Funktion geschützt ist, mit PQ oder einem seiner Salze, das die freie Amin-funktion trägt, in Anwesenheit eines Kondensationsmittels, durch Kondensation zur Reaktion bringt, um die Peptid-Bindung PQ-X zu bilden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe der Amin-funktion eine tert.-Butyloxycarbonyl-Gruppe ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure- Funktion in Form des Esters mit N-Hydroxysuccinimid aktiviert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man vom Primaquin-Diphosphat und der Aminosäure (X) ausgeht, deren Amin-Funktion durch eine tert.- Butyloxycarbonyl-Gruppe geschützt ist, und man die folgenden Stufen durchführt:

a) Reaktion des N-Hydroxysuccinimids mit dem N-tert.-Butyloxycarbonyl-Derivat von X,

b) Reaktion des ausgehend von seinem Salz durch eine Ammoniak-Lösung freigesetzten PQ mit dem N-Hydroxysuccinimid-Ester des geschützten Derivates X,

c) Reinigung des auf diese Weise erhaltenen rohen Produktes durch Chromatographie auf Silicagel,

d) anschließende Abspaltung der Schutzgruppe tert.-Butyloxycarbonyl von der erhaltenen Verbindung in Anwesenheit von Trifluoressigsäure, um das Derivat PQ-X in Form seines Trifluoracetates zu erhalten.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das nach der Stufe d) erhaltene Produkt durch Umkehrphasen-Chromatographie gereinigt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Eluent eine Mischung von Acetonitril in Wasser verwendet, die Trifluoressigsäure enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gegenanion Trifluoracetat durch Hydrochlorid ausgetauscht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrochlorid-Salz mit Natriumbisulfit behandelt wird.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als Wirkstoff die neuen Derivate nach Anspruch 1 oder ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze.