DE68904530T3

DE68904530T3 - Biologisch wirksames Lipoprotein und seine Verwendung.

Info

Publication number: DE68904530T3
Application number: DE68904530T
Authority: DE
Inventors: Tore S-191 43 Sollentuna Curstedt; Hans S-172 46 Sundbyberg Joernvall; Bjoern S-183 64 Taeby Loewenadler; Bengt S-113 33 Stockholm Robertsson
Original assignee: Pharmacia and Upjohn AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1988-10-18
Filing date: 1989-10-11
Publication date: 1999-07-08
Anticipated expiration: 2009-10-12
Also published as: EP0368823A3; DE68904530D1; CA2000893A1; ATE84799T1; AU4299689A; JPH02145599A; EP0368823A2; JP2963923B2; AU623180B2; DE68904530T2; CA2000893C; EP0368823B1; EP0368823B2; US5223481A; SE8803713D0; US5455227A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Lipoproteine mit pulmonaler Oberflächenaktivität, d. h. sie eignen als Komponenten pulmonaler oberflächenaktiver Mittel zur Bereitstellung normaler Atmung in Säugetieren, einschließlich Mensch. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Erleichterung der Atmung in Säugetieren, einschließlich Mensch.
Ein pulmonales, oberflächenaktives Mittel, nämlich ein Phospholipid-Proteinkomplex, ist für eine normale Atmung durch Reduzierung der Oberflächenspannung an der Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche der Alveolen notwendig (1). Verschiedene oberflächenaktive, spezifische Proteine wurden entdeckt. Eine Gruppe umfaßt, vergleichsweise große Glycoproteine mit Molekulargewichten, die zwischen 28 und 36 kD in Abhängigkeit des Glycosilierungsgrades (2, 3) variieren. Dieses Protein ist in Wasser löslich und die Primärstruktur der Formen aus Hundlunge und Menschenlunge wurde bestimmt (4-6). In Gegenwart von Calciumionen nimmt dieses Protein offensichtlich an der Bildung von oberflächenaktivem tubulären Myelin aus sekretierten lamellaren Körpern (7) teil und vergrößert die Adsorptionsrate von oberflächenaktiven Phospholipiden (8). Obwohl dieses Protein wahrscheinlich für das endogene oberflächenaktive Mittel funktionell ist, das in den alveolaren, epithelialen Typ II-Zellen synthetisiert wird, scheint es für die physiologische Aktivität von exogenen oberflächenaktiven Präparationen nicht wesentlich zu sein, die für eine Austauschtherapie entworfen wurden (9-11)
Eine zweite Gruppe von oberflächenaktiven, spezifischen Proteinen weist Formen mit niedrigen Molekulargewichten (≤14 kD) (2, 9, 12-20) auf. Diese Proteine sind sehr hydrophob und bestehen aus unterschiedlichen Proteinen, die in Ether/Ethanol löslich (9) oder unlöslich (2, 16, 17) sind.
Beide Proteine benötigen organische Lösungsmittel zum Aufschluß und zur Reinigung und sind aufgrund vielfacher Startpositionen in den N-terminalen Regionen (verkürzte Formen) heterogen. Eine Rekombination von irgendeinem dieser Proteine mit synthetischen Phospholipiden führt zu einer oberflächenaktiven Präparation mit physikalischen und biologischen Eigenschaften, die in vielerlei Hinsicht jenen eines natürlichen pulmonalen, oberflächenaktiven Mittels ähneln.
Die zwei Proteine mit niedrigem Molekulargewicht haben nicht-verwandte Strukturen und Größen; die kleinere Form ist kein Fragment der größeren. Kürzlich wurden cDNA-Segmente der längeren Form des Hundes beschrieben (21). Die vorliegende Erfindung betrifft lipophile Apoproteine niedrigen Molekulargewichts aus einem Säugetier.
Aufgrund intensiver wissenschaftlicher Forschung und Experimentierens und entgegen früherer wissenschaftlicher Theorien wurde jetzt überraschenderweise gefunden, daß pulmonale Oberflächenaktivität mit einem Lipoprotein verbunden ist, worin ein alveolares Polypeptid oder Protein ein oder zwei Fettsäurereste covalent gebunden hat. Der Umstand, daß es sich gezeigt hat, daß ein Lipoprotein die aktive Komponente in Zusammensetzungen mit pulmonaler Aktivität ist, ist ein unerwartetes Ergebnis und die bisher verlauteten wissenschaftlichen Theorien zielten auf die Vorstellung, daß die relevanten alveolaren Proteine in einem Gemisch mit Materialien eines Phospholipid-Typs vorliegen, während bis jetzt niemand erwartet hatte, daß das Protein mit hydrophoben Substanzen, wie Fettsäuren, covalent verbunden ist.
Basierend auf diesen überraschenden Ergebnissen stellt die vorliegende Erfindung so ein neues Mensch- oder Rinder-alveolares Lipoprotein bereit, welches pulmonare Grenzflächenaktivität besitzt, stark hydrophob ist und zur Solubilisierung und Reinigung organische Lösungsmittel benötigt, welches ein Molekulargewicht von weniger als 14 kDa und ein oder zwei Fettsäurereste aufweist, welche(r) kovalent an eine oder beide Cysteinreste des Lipoproteinmoleküls unter Ausbildung von Thioestern gebunden ist (sind), und wobei dieser Rest bzw. diese Reste 16 Kohlenstoffatome aufweisen.
Ein alveolares Lipoprotein einer anderen Ausführungsform mit diesen Eigenschaften weist ein Molekulargewicht von weniger als 14 kDa und einen oder zwei Fettsäurereste auf, welche(r) kovalent an eine oder beide Cysteinreste des Lipoproteinmoleküls unter Ausbildung von Thioestern gebunden ist (sind), wobei die Fettsäurereste aus Resten von Fettsäuren mit 14 bis 22 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, wobei Säuren mit 16 Kohlenstoffatomen ausgeschlossen sind. Diese Säuren sind bevorzugt aus Stearin-, Olein-, Linol- und Linolensäure ausgewählt. Es ist ferner bevorzugt, daß diese Säuren gesättigt sind.
Die Säure besteht geeigneterweise aus Stearinsäure, und das Lipoprotein enthält vorzugsweise zwei Fettsäurereste.
Das einen Teil des neuen Lipoproteins ausmachende Polypeptid umfaßt vorzugsweise die minimale Aminosäuresequenz:
Ile-Pro-Cys-Cys-Pro-Val.
Diese Aminosäuresequenz trägt die Konsensusregion für alle bekannten, von verschiedenen Säugetierarten abstammenden Polypeptide.
Ein bevorzugtes Polypeptid umfaßt die Aminosäuresequenz:
wo X Gly oder Arg ist.
In dieser Sequenz wird X aus Gly und Arg ausgewählt, wobei Gly ein bevorzugter Aminosäurerest ist.
Vorzugsweise stammt der Polypeptidteil des erfindungsgemäßen Lipoproteins vom Menschen, Schwein oder Rind. Hinsichtlich der Charakterisierung solcher Polypeptide wird auf Febs Lett., Bd. 232 (1988), Nr. 1, 61-64 verwiesen. Die vollständige Offenbarung dieser Literaturstelle ist hiermit aufgenommen.
Im spezielleren Fall umfaßt das Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz:
In dieser Sequenz ist X erneut Gly oder Arg, wobei ersteres bevorzugt ist.
Das erfindungsgemäße Lipoprotein umfaßt, wie vorstehend angegeben, Polypeptide in ihren N-terminalen verkürzten Formen. Eine solche Verkürzung umfaßt vorzugsweise ein oder zwei Aminosäurereste.
Hinsichtlich der Bindungspositionen der Fettsäurereste der vorstehend definierten Polypeptide sind die Fettsäurereste covalent an ein oder zwei der Cysteinreste in den Positionen 5 und 6 des Moleküls gebunden, wobei durch eine solche 7 Bindung Thioester ausgebildet werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die in Kombination ein Protein oder eine Proteinzusammensetzung, wie vorstehend angegeben, und ein Material eines Phospholipid-Typs umfassen. In einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung ist das Protein die kleinere Komponente und ein bevorzugter Gewichtsbereich der Gehalte der Proteinzusammensetzung ist etwa 0,5 bis etwa 10 Gew.-% davon. Es ist insbesondere bevorzugt, daß das Protein etwa 1 bis etwa 5 Gew.-% der Zusammensetzung im Ganzen ausmacht. Als Beispiel eines Phospholipidmaterials können auf Palmitinsäure basierende Phospholipide genannt werden. Zusätzlich zu einer solchen Phospholipid-Matrix kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung auch weitere Zusatzstoffe enthalten, wie pharmazeutisch verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel, Stabilisierungsmittel und weitere, üblicherweise verwendete pharmazeutisch verträgliche Zusatzstoffe.
Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Lipoproteine eine bedeutsame pulmonale Oberflächenaktivität aufweisen. Deshalb eignen sich die erfindungsgemäßen Lipoproteine und Zusammensetzungen insbesondere als Komponenten pulmonaler oberflächenaktiver Mittel. Des weiteren umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Erleichterung der Atmung in Säugetieren, einschließlich Mensch, wobei bei einem solchen Verfahren eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Lipoproteins oder einer Zusammensetzung dem Atmungstrakt eines Patienten verabreicht wird, der eine Behandlung für respiratorische Störungen benötigt. Durch eine solche Verabreichung ist es möglich, die Oberflächenspannung an der Luft- Flüssigkeitsgrenzfläche der Alveolen des Patienten bedeutsam zu reduzieren. Die Verabreichung kann direkt in die Trachea oder die Bronchien erfolgen, sie kann jedoch auch über die Mundhöhle unter Verwendung eines Aerosolsprays üblichen Typs durchgeführt werden.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung durch nicht-limitierende Beispiele erläutert. Die Erläuterung erfolgt hinsichtlich der beigefügten Zeichnungen, worin
Fig. 1 das Massenspektrogramm von menschlichem, oberflächenaktiven Lipoprotein zeigt,
Fig. 2 das entsprechende Massenspektrogramm nach Behandlung mit Trimethylamin zeigt,
Fig. 3 das entsprechende Massenspektrogramm nach Behandlung mit Trimethylamin gefolgt von Iodacetat zeigt,
Fig. 4 das Massenspektrogramm nach Behandlung mit Kaliumhydroxid zeigt,
Fig. 5 Diagramme der Oberflächenaktivität von künstlichen, oberflächenaktiven Präparationen zeigt, indem die Wirbel- Blasentechnik verwendet wird.
Die erfindungsgemäßen Lipoproteine sind stark hydrophob und benötigen organische Lösungsmittel zur Lösung und Reinigung.

BEISPIEL 1

Isolierung eines menschlichen oberflächenaktiven Proteins niedrigen Molekulargewichts

Bronchoalveolare Waschung

Eine bronchoalveolare Waschung (BAL) bei Menschen wurde mit einem beweglichen Bronchoskop unter örtlicher Betäubung durchgeführt. Das Bronchoskop wurde in einem Bronchus-Mittellappen eingekeilt und sterile Kochsalzlösung wurde bei 37ºC in Aliquoten von 50 ml eingeträufelt. Das gesamte, eingeträufelte Volumen variierte zwischen 200 und 300 ml. Die Flüssigkeit wurde vorsichtig nach jedem Einträufeln ab gesaugt und in einer siliconisierten Flasche auf Eis gesammelt. Unmittelbar nach Beendigung der Waschung wurde die Flasche in das Labor gebracht.
Die erhaltene BAL-Flüssigkeit wurde durch eine doppelte Schicht von Dacron-Netzen filtriert und das Volumen gemessen. Die Flüssigkeit wurde bei 400 g 5 min bei 4ºC zentrifugiert, und der Überstand wurde bei -20ºC gelagert, bis er weiter analysiert wurde.

Amnion-Flüssigkeit

Menschliche Amnion-Flüssigkeit, die von Schwangeren durch Kaiserschnitt und Vaginalentbindungen erhalten worden war, wurde durch ein Netz filtriert und das Volumen gemessen und das Material bei -20ºC gelagert, bis es weiter analysiert wurde.

Isolierung hydrophober Proteine von bronchoalveolaren und Amnion-Flüssigkeiten.

300 ml Amnion- oder BAL-Flüssigkeit wurden 400 ml Methanol zugegeben, und die Lösung wurde durch Schütteln gemischt und mit Ultraschall behandelt. 800 ml Chloroform wurden zugegeben, und das Gemisch wurde geschüttelt. Nach Filtration wurde die untere Phase zur Trockene eingedampft und die Phospholipidfraktion, die auch die hydrophoben Proteine enthielt, wurde durch Umkehrphasen-Chromatographie an Lipidex-5000 in einem System von Ethylenchlorid/Methanol 1 : 4 (v/v) isoliert.

BEISPIEL 2

Analyse von oberflächenaktiven Lipoproteinen

Zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzungen wurden die Proteine mit Dithioerythritol (etwa 30 nmol/nmol Peptid; 37ºC, 2 h) reduziert und durch Zugabe von neutralisiertem Iod-(¹&sup4;C)acetat (120 nmol/nmol Peptid; 37ºC, 2 h) in 8 M Harnstoff, 0,4 M Tris/HCl, 2mM EDTA carboxymethyliert. Überschüssige Reaktionsmittel wurden durch Ausschlußchromatographie an Sephadex LH-60 (40 · 1,1 cm) in Chloroform/Methanol 1 : 1 (v/v) entfernt, was 5% 0,1 M HCl enthielt. Zur Analyse der Aminsäurezusammensetzung wurden Proben in evakuierten Röhrchen 24 h bei 110ºC bzw. 72 und 120 h bei 150ºC mit 6 M HCl hydrolysiert, das 0,5% Phenol enthielt. Eine Gesamt-Aminosäurezusammensetzung von menschlichem oberflächenaktiven Lipoprotein ist in Tabelle 1 gezeigt. Freigesetzte Aminosäuren wurden mit einem Beckman 120 M-Instrument analysiert.
Das ersichtliche Molekulargewicht wurde durch eine SDS/Polyacrylamid-Gelelektrophorese (unter Verwendung eines 10% Gels mit 8 M Harnstoff) (22) bestimmt. Molekulargewichtsmarker wurden von BDH Chemicals Ltd. (England) erworben und bestanden aus Pferdeherzen-Myoglobin, gespalten mit Cyanogenbromid. Phosphor wurde nach Bartlett (23) analysiert.
Präparationen für eine Sequenzanalyse wurden in Chloroform/Methanol 1 : 2 eingesetzt.

Strukturanalyse

Die Lipoprotein-Fraktionen wurden durch zweistündige Behandlung mit Dithiothreitol (30 nmol/nmol Polypeptide) bei 37ºC unter Stickstoff reduziert. Die reduzierten Proben wurden dann durch Behandlung mit neutralisiertem Iod(¹&sup4;C)- Essigsäure (120 nmol/nmol Polypeptid, 37ºC, 2 h) ¹&sup4;C-carboxymethyliert und durch Ausschlußchromatographie an Sephadex LH-60 gereinigt.
Proben zur Sequenzanalyse des 14C-carboxymethylierten Proteins wurden nach Lösung in Chloroform/Methanol abgenommen. Proben zur Spaltung mit Pepsin wurden in 100% Ameisensäure gelöst, auf 5% Ameisensäure verdünnt und dann dem Enzym (1 : 30 im Verhältnis von Enzym zu Substrat, 37ºC, 2 h) unterzogen. Die Pepsin-Peptide wurden durch HPLC an einer Ultropac C-18-Säule in 0,1% Trifluoressigsäure mit einem linearen Gradienten von Acetonitril getrennt. Proben zur Behandlung mit CNBr wurden in 100% Ameisensäure gelöst, auf 70% verdünnt und dann mit CNBr (0,1 g/ml) 24 h bei Raumtemperatur behandelt. CNBr-Fragmente wurden an Sephadex LH-60 in Chloroform/Methanol 1 : 1 (v/v) getrennt, das 5% 0,1 M HCl (24) enthielt.
Eine Gasphasen-Sequenzanalyse wurde durch Abbau in einem Applied Biosystems 470 A-Instrument und einem Phenylthiohydantoin-Nachweis durch Umkehrphasen-HPLC durchgeführt, indem ein Hewlett Packard 1090-Instrument (25) verwendet wurde. Proben für eine Flüssigphasen-Sequenzanalyse in einem Beckman 890C-Instrument wurden einem Glycin-vorzyklisierten Polybren (26) verabreicht und durch ein ähnliches HPLC-System analysiert. Gesamtzusammensetzungen wurden durch Hydrolyse mit 6 M HCl/0,5% Phenol bei 100ºC für 24 Stunden unter Vakuum erhalten. Eine Hydrazinolyse wurde mit wasserfreiem Hydrazin 6 h bei 100ºC in evakuierten Röhrchen (27) durchgeführt. Aminosäuren wurden mit einem auf Ninhydrin-basierenden Beckman 121M-Aminosäureanalysator oder mit einem auf Phenylthiocarbamyl-basierenden HPLC-System (28) quantifiziert. Eine N-terminale Verkürzung der oberflächenaktiven Proteine ist in Tabelle 2 gezeigt.
Das Molekulargewicht des oberflächenaktiven Lipoproteins wurde durch "Flugzeit"-Massenspektroskopie (Bioion, Uppsala, Schweden) durchgeführt, indem eine Beschleunigungs spannung von 18000 Volt verwendet wurde. Rinder-Insulin wurde als innerer Referenzstandard verwendet.
Das Lipoprotein wurde mit Dithioerythritol (etwa 30 mol/mol Peptid, 37ºC, 2 h) reduziert und durch Massenspektrometrie analysiert. Das nicht-reduzierte und reduzierte Material hatte ähnliches Molekulargewicht, etwa 480 Masseneinheiten größer als von dem Gewicht der 35 Aminosäuren (Fig. 1) zu erwarten war. Zur Untersuchung der Hypothese, daß natives, oberflächenaktives Lipoprotein Fettsäuren umfaßt, die covalent an die Peptidsequenz zur Ausbildung eines Proteolipids gebunden sind, wurde das nicht-reduzierte Lipoprotein in Chloroform/Methanol 1 : 2 (v/v) gelöst und aq. 2 M Trimethylamin bis zu einer Endkonzentration von 200 mM zugegeben.
Das Gemisch wurde 4 h bei 37ºC inkubiert. Fettsäuren wurden freigesetzt und von dem Polypeptid durch Ausschlußchromatographie an Sephadex LH-60 in Chloroform/Methanol 1 : 1 (v/v) abgetrennt, das 5% 0,1 M HCl enthielt. Fettsäuren, hauptsächlich Palmitinsäure, wurden erhalten.
Wurde die erhaltene Peptidfraktion durch "Flugzeit"-Massenspektrometrie (Fig. 2) analysiert, wurde es deutlich, daß das Molekulargewicht um etwa 478 Masseneinheiten nach Trimethylamin-Behandlung abgenommen hatte.
Diese Reduktion im Molekulargewicht entspricht dem Verlust von zwei Palmitinsäureresten, die wahrscheinlich an die Sulfhydrylreste von Cys 5 und Cys 6 über Esterbrücken gebunden sind.
Zum Nachweis, daß die Trimethylamin-Behandlung, die zur Freisetzung von Palmitinsäureresten von dem oberflächenaktiven Peptid führte, auch freie Thiolreste erzeugte, wurde das nachstehende Experiment durchgeführt:
Getrennte Proben des nativen, oberflächenaktiven Lipoproteins wurden mit Trimethylamin behandelt und jegliche freigesetzte Thiolreste dann carboxymethyliert, indem sie mit Dithioerythritol zur Verhinderung einer Reoxidation und anschließend mit Iodacetat behandelt wurden.
Eine massenspektroskopische Analyse (Fig. 3) zeigt eine Zunahme von etwa 120 Masseneinheiten im Vergleich zu der Trimethylamin-behandelten Peptidfraktion. Eine Zunahme im Molekulargewicht von 120 stimmt gut mit der Carboxymethylierung der Thiolreste von Cys 5 und Cys 6 überein.
Für einen weiteren Nachweis des Vorliegens von zwei veresterten Palmitinsäureresten wurde das native Lipoprotein mit 0,01 M KOH in Methanol/Wasser 98 : 2 (v/v) 30 min bei 37ºC behandelt. Das Peptid wurde aus der unpolaren Phase (29) erhalten.
Eine Analyse dieses Peptidmaterials durch "Flugzeit"-Massenspektroskopie (Fig. 4) zeigt erneut eine Verminderung des Molekulargewichts von etwa 480 Masseneinheiten, verglichen zu dem nativen, oberflächenaktiven Peptid, was den Verlust von 2 covalent-konjugierten Palmitinsäureresten nach alkalischer Hydrolyse zeigt.
In Fig. 1 können zwei kleinere Peaks unterschieden werden. Einer an der Position -240 hinsichtlich des Hauptpeaks stellt vermutlich einen kleinen Teil des Peptidmaterials dar, das mit Palmitinsäure an nur einem der Cysteinreste verestert ist.
Diese Daten zusammengenommen zeigen klar, daß mindestens einer, jedoch vorzugsweise zwei Palmitinsäurereste covalent mit dem Peptid durch Veresterung der Thiolreste von Cys 5 und Cys 6 konjugiert sind.

BEISPIEL 3

Rekombination von isolierten Lipoprotein-Fraktionen mit synthetischen Phospholipiden

1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC),
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC),
und
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG)
wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben und ohne weitere Reinigung verwendet. Die Phospholipide wurden in Chloroform/Methanol 2 : 1 (v/v), gemischt in den Verhältnissen von DPPC : POPC : DPPG von 55 : 35 : 10 (w/w/w), gelöst und als oberflächenaktive Präparation "Phospholipide" verwendet.
Diesem Gemisch wurde ein oberflächenaktives, in Chloroform/Methanol 1 : 2 (v/v) gelöstes Lipoprotein zugegeben, wodurch ein Lipoprotein zu Phospholipid-Verhältnis von 1 : 50 erhalten wurde. Die Lösungsmittel wurden zur Trockene eingedampft und die unterschiedlichen oberflächenaktiven Präparationen (Phospholipide, Phospholipide + Lipoprotein- Fraktion) in Kochsalzlösung suspendiert, wodurch eine Phospholipid-Konzentration von 10 oder 80 mg/ml erhalten wurde.

BEISPIEL 4

Bestimmung von in vitro Oberflächen-Eigenschaften

Die Oberflächen-Eigenschaften des künstlichen, auf dem Lipoprotein-basierenden oberflächenaktiven Mittels wurden mit einem Wirbelblasen-Instrument (Surfactometer International, Toronto, Canada) (30) analysiert. Die oberflächenaktiven Präparationen wurden bei einer Phospholipid-Konzentration von 10 mg/ml suspendiert und der Druckgradient gegenüber der Blasenwand wurde bei 37ºC während einer 50% zyklischen Oberflächenkompression bei einer Rate von 40/min aufgezeichnet. Eine Oberflächenspannung wurde bei maximaler und minimaler Blasengröße während des 5. Zyklus und nach 1- und 5minütiger Wirbelung beurteilt.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 5 gezeigt. Die Kurven darin zeigen Druckgradienten gegenüber der Blasenwand; max und min weisen auf maximale (Radius 0,55 mm) und minimale (Radius 0,40 mm) Blasengröße während der Wirbelung bei einer Rate von 40/min hin. Ein Druckgradient nahe Null bei minimaler Blasengröße entspricht einer Oberflächenspannung nahe Null.

BEISPIEL 5

Wirkung der Entfernung der Fettsäurereste auf in vitro oberflächenaktive Eigenschaften

Natives oder Trimethylamin-behandeltes Lipoprotein wurde mit proteinfreien Phospholipiden gemischt, die von einem Lungen-oberflächenaktiven Mittel durch Chromatographie an Sephadex LH-60 erhalten wurden. Diese künstlichen, oberflächenaktiven Präparationen, die 0-4% Lipoprotein enthalten, oder die durch die Behandlung erhaltene Protein-Fraktion wurden in Kochsalzlösung bei einer Phospholipid-Konzentration von 10 mg/ml suspendiert und mit einem Wirbelblasen- Instrument analysiert. Der Druckgradient gegenüber der Blasenwand wurde bei 37ºC während einer 50% zyklischen Oberflächenkompression bei einer Rate von 40/min aufgezeichnet. Eine Oberflächenspannung bei maximaler und minimaler Bla sengröße wurde während des 5., 40. und 200. Wirbelzyklus bestimmt. Die Oberflächenadsorptionsrate wurde dann bestimmt, indem die Wirbelung bei maximaler Blasengröße angehalten und das Zeitintervall aufgezeichnet wurden, bis die statistische Oberflächenspannung auf ein Level von 30 mN/m abgefallen war.
Die Oberflächenpräparation, die 2% des nativen Lipoproteins enthielt, hatte eine rasche Adsorption (< 2 s) und eine minimale Oberflächenspannung nahe 0 mN/m. Das entsprechende Gemisch mit Trimethylamin-behandeltem Lipoprotein hatte eine niedrige Adsorption (> 120 s) und eine hohe minimale Oberflächenspannung (etwa 20 mN/m). Somit sind covalent an das Polypeptid gebundene Acylreste für die physiologische Aktivität des oberflächenaktiven Mittels wesentlich. BEISPIEL 6 Herstellung von synthetischen Peptiden Die Peptide
Leu-Ile-Val-Val-COOH
wurden gemäß der schrittweisen Festphasen-Technik in einem Applied Biosystems Model 430A Peptid Synthesizer synthetisiert. Ein Phenylacetamidomethyl (PAM)-Harz wurde als fester Träger verwendet und die folgenden tert.-Butyloxycarbonyl (t-Boc)-aminosäurederivate wurden eingesetzt: L-Arg- Tosyl, L-Cys-4-Methyl-Benzyl, L-Lys-Cl-Benzyloxycarbonyl, L-Asn, L-Pro, L-Ala, L-Val, L-Met, L-Ile, L-Leu und Gly.
Ein Standardprogramm, das die Vorbildung von symmetrischen Anhydriden umfaßt, wurde für die Synthese verwendet. Die erhaltenen Peptide wurden aus dem Harz herausgeschnitten und durch das Fluorwasserstoff (HF)-Verfahren entschützt und nachfolgend durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die Identität und Reinheit des Endprodukts wurde durch Aminosäurehydrolyse (31) (vgl. Kent, S. B. H., Ann. Rev. Biochem. 57 (1980), 957-989) beurteilt.

BEISPIEL 7

Herstellung eines Thioester-Lipopeptids

Die Konjugation von umdestilliertem Palmitoyl-Chlorid (Fluka) und dem Hexapeptid H&sub2;N-Ile-Pro-Cys-Cys-Pro-Val-COOH wurde wie folgt durchgeführt:
- 3 mg (4,8 umol) Hexapeptid wurden in 500 ul Chloroform/ Methanol 1 : 2 (v/v) gelöst.
- 25 ul 0,5 M DTE (12,5 umol) wurden der Lösung zugegeben, das Gemisch wurde mit N&sub2; gespült und 160 Minuten bei 37ºC inkubiert.
- 20 ul 3,3 M Palmitoyl-Chlorid (66 umol) wurden zugegeben, das Gemisch wurde mit N&sub2; gespült und 250 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Das acylierte Peptid wurde durch TLC isoliert und sein Molekulargewicht bestimmt.
In einem Test nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren verhält sich das Lipopeptid ähnlich wie das native Lipoprotein.

BEISPIEL 8

Bestimmung von in vitro Oberflächen-Eigenschaften von künstlichen, oberflächenaktiven Mitteln, die aus synthetischen Phospholipiden und einem synthetisierten SP-C-Polypeptid (ohne Thioester-gebundene Palmitinsäure) bestehen.

Das SP-C-Polypeptid wurde nach der schrittweisen Festphasen-Technik in einem Applied Biosystems Model 430A Peptid Synthesizer synthetisiert. Ein Phenylacetamidomethyl-Harz wurde als fester Träger verwendet und das Polypeptid aus dem Harz herausgeschnitten und durch das Fluorwasser-Verfahren entschützt. Das Polypeptid wurde aus dem Harz mit Chloroform/Methanol 1 : 1 (v/v) in Gegenwart von und ohne 5% 0,1 M HCl extrahiert, wodurch etwa 30% der Probe erhalten wurden. Das Material wurde in einer kleinen Menge konzentrierter Ameisensäure gelöst, mit Chloroform/Methanol 1 : 1 (v/v) verdünnt und durch Sephadex LH-60-Chromatographie in 5% Ameisensäure-enthaltendem Chloroform/Methanol 1 : 1 (v/v) gereinigt. Die Identität und Reinheit des Endprodukts wurden durch Aminosäure-Hydrolyse, Sequenzabbau und Flugzeit- Massenspektrometrie beurteilt.
Verschiedene Mengen des gereinigten, synthetisierten Polypeptids SP-C wurden mit dem in Beispiel 3 verwendeten synthetischen Phospholipid-Gemisch rekombiniert. Die Phospholipide wurden in Chloroform/Methanol 2 : 1 (v/v), gemischt in den Verhältnissen von DPPC : POPC : DPPG von 55 : 35 : 10 (w/w/w), gelöst und als oberflächenaktive Präparation "Phospholipide" verwendet.
Verschiedene Mengen von synthetischem, in Ameisensäure gelöstem SP-C-Polypeptid wurden verschiedenen Röhrchen zugegeben und die Säure zur Trockene eingedampft. Nach Zugabe der Phospholipide wurden die organischen Lösungsmittel zur Trockene eingedampft und die verschiedenen oberflächenaktiven Präparationen in Kochsalzlösung bei einer Phospholipid- Konzentration von 10 mg/ml suspendiert. Die künstlichen, oberflächenaktiven Präparationen, die 0-20% synthetisches SP-C-Polypeptid enthielten, wurden mit einem Wirbelblasen- Instrument analysiert. Der Druckgradient gegenüber der Blasenwand wurde bei 37ºC während einer 50% zyklischen Oberflächenkompression bei einer Rate 40/min aufgezeichnet. Eine Oberflächenspannung bei maximaler und minimaler Blasengröße wurde während des 5., 40. und 200. Wirbelzyklus bestimmt. Die Oberflächenadsorptionsrate wurde dann durch Anhalten der Wirbelung bei maximaler Blasengröße und durch Aufzeichnung des Zeitintervalls bestimmt, bis eine statistische Oberflächenspannung auf ein Level von 30 mN/m gefallen war. Alle Präparationen hatten eine sehr langsame Adsorption (> 120 s) und eine hohe minimale (> 20 mN/m) und maximale (> 44 mN/m) Oberflächenspannung (Tabelle 3). Die Ergebnisse zeigen, daß das SP-C-Polypeptid (ohne Palmitoylreste) keine Wirkung auf die Oberflächenaktivität hat. Die langsamen Adsorptions- und hohen Oberflächenspannungswerte schließen die Verwendung dieser Präparationen für die Behandlung von Kleinkindern aus.

BEISPIEL 9

Bestimmung von in vitro Oberflächen-Eigenschaften von künstlichen, oberflächenaktiven Mitteln, die aus synthetischen Phospholipiden und nativem oder Trimethylamin-behandeltem (= deacyliertem) SP-C bestehen.

Das Molekulargewicht von nativem und Trimethylamin-behandeltem SP-C wurde durch Flugzeit-Massenspektrometrie bestimmt. Das Massenspektrum zeigte, daß natives SP-C hauptsächlich zwei Palmitoylreste und kleine Mengen von Molekülen mit einem Palmitoylrest enthielt. Das Trimethylamin-be handelte SP-C wurde an Sephadex LH-60 in 5% 0,1 M HCl-enthaltendem Chloroform/Methanol 1 : 1 (v/v) gereinigt und durch Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Dieses, Trimethylamin-behandelte SP-C war vollständig deacyliert. Verschiedene Mengen von nativem oder deacyliertem SP-C wurden mit dem in Beispiel 3 verwendeten synthetischen Phosholipid-Gemisch rekombiniert. Die Phospholipide wurden in Chloroform/Methanol 2 : 1 (v/v), gemischt in den Verhältnissen von DPPC : POPC : DPPG von 55 : 35 : 10 (w/w/w), gelöst und als oberflächenaktive Präparation "Phospholipide" verwendet.
Diesem Phospholipid-Gemisch wurden verschiedene Mengen von nativem oder deaclyiertem SP-C, gelöst in Chloroform/Methanol 1 : 2 (v/v) zugegeben. Die organischen Lösungs- 5 mittel wurden zur Trockene eingedampft und die verschiedenen oberflächenaktiven Präparationen in Kochsalzlösung bei einer Phospholipid-Konzentration von 10 mg/ml suspendiert. Diese künstlichen, oberflächenaktiven Präparationen, die 0-4% natives oder deacyliertes SP-C enthielten, wurden mit einem Wirbelblasen-Instrument analysiert. Der Druckgradient gegenüber der Blasenwand wurde bei 37ºC während einer 50% zyklischen Oberflächenkompression bei einer Rate von 40/min aufgezeichnet. Eine Oberflächenspannung bei maximaler und minimaler Blasengröße wurde während des 5., 40. und 200. Wirbelzyklus bestimmt. Die Oberflächenadsorptionsrate wurde dann bestimmt, indem die Wirbelung bei maximaler Blasengröße angehalten und das Zeitintervall aufgezeichnet wurden, bis eine statistische Oberflächenspannung auf ein Level von 30 mN/m gefallen war. Die Ergebnisse zeigen, daß Präparationen mit nativem SP-C die in vitro Oberflächenaktivität vergrößert hatten. Somit ergab eine Konzentration von 2% nativem SP-C in der Präparation eine ziemlich rasche Adsorption (16 s), eine minimale Oberflächenspannung nahe 0 mN/m und eine maximale Oberflächenspannung von etwa 30 mN/m (Tabelle 4). Diese Ergebnisse sind ähnlich der in vitro Oberflächenaktivität von natürlichen Schweine-oberflächenaktiven Präparationen (Adsorption < 1 s, minimale und maximale Oberflächenspannung während des 200. Zyklus von < 3 mN/m bzw. 30 mN/m), die erfolgreich zur Behandlung von Kleinkindern verwendet wurden. Die Adsorptionszeit ist etwas länger als jene, die mit einem natürlichen oberflächenaktiven Mittel erhalten wurde, was an dem komplexeren und ungesättigten Phospholipid-Gemisch in dem natürlichen oberflächenaktiven Mittel liegt. Eine Zugabe von deacyliertem SP-C zu dem Phospholipid-Gemisch verbesserte die Oberflächen-Eigenschaften nicht. Alle Präparationen hatten eine sehr langsame Adsorption (> 120 s) und hohe minimale (≥18 mN/m) und maximale (≥50 mN/m) Oberflächenspannung (Tabelle 5). Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß die oberflächenaktiven Präparationen, die deacyliertes SP-C enthalten, zur Behandlung von Kleinkindern wirksamer sein würden.

Literaturzitate

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A: Amnionflüssigkeit
B: Bronchoalveolare Waschung

Tabelle 3

Oberflächen-Eigenschaften (Mittelwerte) von synthetischen Phospholipiden (10 mg/ml), die mit verschiedenen Mengen von synthetischem SP-C-Polypeptid rekombiniert wurden.
Die Aufzeichnungen wurden mit einer Wirbelblase bei 37ºC, 50% Oberflächenkompression und einer Rate von 40/min erhalten. Fünf Experimente wurden für jede Präparation durchgeführt.

Tabelle 4

Oberflächen-Eigenschaften (Mittelwerte) von synthetischen Phospholipiden (10 mg/ml), die mit verschiedenen Mengen von nativem SP-C rekombiniert wurden.
Die Aufzeichnungen wurden mit einer Wirbelblase bei 37ºC, einer 50% Oberflächenkompression und einer Rate von 40/min erhalten. Fünf Experimente wurden für jede Präparation durchgeführt.

Tabelle 5

Oberflächen-Eigenschaften (Mittelwerte) von synthetischen Phospholipiden (10 mg/ml), die mit verschiedenen Mengen von deacyliertem SP-C rekombiniert wurden.
Die Aufzeichnungen wurden mit einer Wirbelblase bei 37ºC, einer 50% Oberflächenkompression und einer Rate von 40/min erhalten. Fünf Experimente wurden für jede Präparation durchgeführt.

Claims

1. Alveolares Human- oder Rinder-Lipoprotein mit pulmonaler Grenzflächenaktivität, welches stark hydrophob ist und organische Lösungsmittel zur Solubilisierung und Reinigung benötigt, welches ein Molekulargewicht von weniger als 14 kD aufweist und welches einen oder zwei Fettsäurereste aufweist, welche kovalent unter Bildung von Thioestern an einen oder an beide Cysteinreste des Lipoproteinmoleküls gebunden sind, wobei diese Reste 16 Kohlenstoffatome aufweisen.

2. Alveolares Lipoprotein mit pulmonaler Grenzflächenaktivität, welches stark hydrophob ist und organische Lösungsmittel zur Solubilisierung und Reinigung benötigt, welches ein Molekulargewicht von weniger als 14 kD aufweist und welches einen oder zwei Fettsäurereste aufweist, welche kovalent unter Bildung von Thioestern an einen oder an beide Cysteinreste des Lipoproteinmoleküls gebunden sind, wobei diese Fettsäurereste aus Fettsäureresten mit 14 bis 22 C-Atomen ausgewählt sind und Säuren mit 16 Kohlenstoffatomen ausgeschlossen sind.

3. Lipoprotein nach Anspruch 2, wobei die Säuren aus Stearin-, Öl-, Linol- und Linolensäuren ausgewählt sind.

4. Lipoprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Säuren gesättigt sind.

5. Lipoprotein nach Anspruch 2, wobei die Säure Stearinsäure ist.

6. Lipoprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches zwei Fettsäurereste enthält.

7. Lipoprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Aminosäuresequenz

Ile-Pro-Cys-Cys-Pro-Val.

8. Lipoprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Aminosäuresequenz

wobei X Gly oder Arg ist.

9. Lipoprotein nach Anspruch 8, umfassend die Aminosäuresequenz

wobei X Gly oder Arg ist.

10. Lipoprotein nach Anspruch 8 oder 9 mit verkürzter N-terminaler Form.

11. Lipoprotein nach Anspruch 10, wobei die Verkürzung 1 oder 2 Aminosäurereste umfaßt.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend in Kombination ein Lipoprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche und ein Material vom Phospholipidtyp.