JP2963923B2 - 生物学的に活性なリポタンパク質およびその使用 - Google Patents
生物学的に活性なリポタンパク質およびその使用Info
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- JP2963923B2 JP2963923B2 JP1268838A JP26883889A JP2963923B2 JP 2963923 B2 JP2963923 B2 JP 2963923B2 JP 1268838 A JP1268838 A JP 1268838A JP 26883889 A JP26883889 A JP 26883889A JP 2963923 B2 JP2963923 B2 JP 2963923B2
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- acid
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/785—Alveolar surfactant peptides; Pulmonary surfactant peptides
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/16—Central respiratory analeptics
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は肺界面活性作用を有するリポタンパク質、す
なわちヒトを含む哺乳動物において正常な呼吸をもたら
す肺界面活性組成物の成分として有用なリポタンパク質
に関する。
なわちヒトを含む哺乳動物において正常な呼吸をもたら
す肺界面活性組成物の成分として有用なリポタンパク質
に関する。
リン脂質−タンパク質複合体からなる肺界面活性物質
は、肺胞の空気−液体界面での表面張力を低下させるこ
とにより、正常な呼吸にとつて不可欠である（１）。界
面活性物質に特異的なタンパク質が数多く見出されてい
る。１つのグループはグリコシル化の度合に応じて28〜
38KDaの分子量を有する比較的大きい糖タンパク質から
成る（2,3）。このタンパク質は水溶性であり、イヌお
よびヒト肺に由来するこの種のタンパク質の一次構造が
決定されている（４−６）。カルシウムイオンの存在下
で、明らかにこのタンパク質は分泌されたラメラ体から
の界面活性管状ミエリンの形成に関係しており（７）、
そして界面活性リン脂質の吸着速度をはやめる（８）。
このタンパク質は肺胞のII型上皮細胞において合成され
た内因性界面活性物質に作用しうるが、代償療法のため
に考案された外因性界面活性製剤の生理活性には必要で
ないように思われる（９−11）。
は、肺胞の空気−液体界面での表面張力を低下させるこ
とにより、正常な呼吸にとつて不可欠である（１）。界
面活性物質に特異的なタンパク質が数多く見出されてい
る。１つのグループはグリコシル化の度合に応じて28〜
38KDaの分子量を有する比較的大きい糖タンパク質から
成る（2,3）。このタンパク質は水溶性であり、イヌお
よびヒト肺に由来するこの種のタンパク質の一次構造が
決定されている（４−６）。カルシウムイオンの存在下
で、明らかにこのタンパク質は分泌されたラメラ体から
の界面活性管状ミエリンの形成に関係しており（７）、
そして界面活性リン脂質の吸着速度をはやめる（８）。
このタンパク質は肺胞のII型上皮細胞において合成され
た内因性界面活性物質に作用しうるが、代償療法のため
に考案された外因性界面活性製剤の生理活性には必要で
ないように思われる（９−11）。
２番目のグループの界面活性物質特異的タンパク質は
低分子量（14KDa）のタンパク質から成る（2,9,12−2
0）。これらのタンパク質は非常に疎水性であり、エー
テル／エタノールに可溶（９）または不溶（2,16,17）
である種々のタンパク質から成る。
低分子量（14KDa）のタンパク質から成る（2,9,12−2
0）。これらのタンパク質は非常に疎水性であり、エー
テル／エタノールに可溶（９）または不溶（2,16,17）
である種々のタンパク質から成る。
両方のタンパク質とも可溶化および精製に有機溶剤を
必要とし、Ｎ末端領域における多数の開始位置により種
々の末端切断形態が存在する。これらのタンパク質のい
ずれかを合成リン脂質と組み合わせると、多くの点で天
然肺界面活性物質と類似した物理的および生物学的性質
を有する界面活性製剤が得られる。
必要とし、Ｎ末端領域における多数の開始位置により種
々の末端切断形態が存在する。これらのタンパク質のい
ずれかを合成リン脂質と組み合わせると、多くの点で天
然肺界面活性物質と類似した物理的および生物学的性質
を有する界面活性製剤が得られる。
２種類の低分子量タンパク質は構造および大きなの点
で関係がなく、小さい方のタンパク質は大きい方のタン
パク質の断片ではない。最近になって、大きい方のタン
パク質のcDNAセグメント（21）がイヌから解明された。
本発明は哺乳動物由来の親水性の低分子量アポタンパク
質に関する。
で関係がなく、小さい方のタンパク質は大きい方のタン
パク質の断片ではない。最近になって、大きい方のタン
パク質のcDNAセグメント（21）がイヌから解明された。
本発明は哺乳動物由来の親水性の低分子量アポタンパク
質に関する。
多方面にわたる科学的研究および実験に基づいて、し
かし以前の科学的理論とは相違して、今や以外にも肺界
面活性作用がリポタンパク質（肺胞のポリペプチドまた
はタンパク質がそれに共有結合された１個または２個の
脂肪酸残基をもつもの）に関係のあることが見出され
た。リポタンパク質が肺界面活性作用を有する組成物の
活性成分であると判明した事実は予期せぬ新しい発見で
あり、これまでに発表された科学的理論はすべて関連し
た肺胞タンパク質がリン脂質型の物質との組み合わせで
存在するという確信に向けられたものであつた。それ故
に、今までだれもこのタンパク質が脂肪酸のような疎水
性物質と共有結合により会合したものであるとは予想し
なかつた。
かし以前の科学的理論とは相違して、今や以外にも肺界
面活性作用がリポタンパク質（肺胞のポリペプチドまた
はタンパク質がそれに共有結合された１個または２個の
脂肪酸残基をもつもの）に関係のあることが見出され
た。リポタンパク質が肺界面活性作用を有する組成物の
活性成分であると判明した事実は予期せぬ新しい発見で
あり、これまでに発表された科学的理論はすべて関連し
た肺胞タンパク質がリン脂質型の物質との組み合わせで
存在するという確信に向けられたものであつた。それ故
に、今までだれもこのタンパク質が脂肪酸のような疎水
性物質と共有結合により会合したものであるとは予想し
なかつた。
従って、これらの驚くべき発明に基づいて、本発明
は、高度に疎水性でありそして溶解及び精製のために有
機溶媒を必要とし、14kDa未満の分子量を有しそしてチ
オエステルを形成するように、リポタンパク質分子のシ
スティン残基の一方または両方に共有的に結合された１
個または２個の脂肪酸残基を有する、肺界面活性を有す
る肺胞リポタンパク質であって、（１）前記脂肪酸残基
が16個の炭素原子を有するヒトまたウシ肺胞リポタンパ
ク質または（２）前記脂肪酸残基が16個の炭素を除外す
る14〜22個の炭素原子を有する脂肪酸残基から選ばれ、
しかも のアミノ酸配列を含む肺胞リポタンパク質が提供され
る。
は、高度に疎水性でありそして溶解及び精製のために有
機溶媒を必要とし、14kDa未満の分子量を有しそしてチ
オエステルを形成するように、リポタンパク質分子のシ
スティン残基の一方または両方に共有的に結合された１
個または２個の脂肪酸残基を有する、肺界面活性を有す
る肺胞リポタンパク質であって、（１）前記脂肪酸残基
が16個の炭素原子を有するヒトまたウシ肺胞リポタンパ
ク質または（２）前記脂肪酸残基が16個の炭素を除外す
る14〜22個の炭素原子を有する脂肪酸残基から選ばれ、
しかも のアミノ酸配列を含む肺胞リポタンパク質が提供され
る。
関係する脂肪酸は炭素原子数14〜22の慣例的な脂肪
酸、例えば16個または18個の炭素原子を有するもの、か
ら選ばれ、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、
リノール酸およびリノレン酸から選ぶことができる。パ
ルミチン酸残基とステアリン酸残基が好適であり、特に
パルミチン酸残基が好適である。本発明のリポタンパク
質は好ましくはポリペプチド分子当たり２個のパルミチ
ン酸残基を含んでいる。
酸、例えば16個または18個の炭素原子を有するもの、か
ら選ばれ、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、
リノール酸およびリノレン酸から選ぶことができる。パ
ルミチン酸残基とステアリン酸残基が好適であり、特に
パルミチン酸残基が好適である。本発明のリポタンパク
質は好ましくはポリペプチド分子当たり２個のパルミチ
ン酸残基を含んでいる。
新しいリポタンパク質のポリペプチド構成部分は次の
最小アミノ酸配列： を含んでいるが、このアミノ酸配列は異なる哺乳動物種
に由来する全ての既知ポリペプチドに共通する領域（コ
ンセンサス領域）を構成している。
最小アミノ酸配列： を含んでいるが、このアミノ酸配列は異なる哺乳動物種
に由来する全ての既知ポリペプチドに共通する領域（コ
ンセンサス領域）を構成している。
好適なポリペプチドは次のアミノ酸配列： （ここでΧはGlyまたはArgである）から成る、この配列
において、ΧはGlyおよびArgから選ばれ、Glyが好適な
アミノ酸残基である。
において、ΧはGlyおよびArgから選ばれ、Glyが好適な
アミノ酸残基である。
本発明によるリポタンパク質のポリペプチド部分は、
ヒト、ブタまたはウシ由来のものであるが好ましい。こ
の種のポリペプチドの特性決定に関しては、Feb:sLett.
（1988）,Vol.232,No.1,61−64を参照されたい。この報
文の技術内容はすべて参照によりここに引用するものと
する。
ヒト、ブタまたはウシ由来のものであるが好ましい。こ
の種のポリペプチドの特性決定に関しては、Feb:sLett.
（1988）,Vol.232,No.1,61−64を参照されたい。この報
文の技術内容はすべて参照によりここに引用するものと
する。
より詳細には、ポリペプチドは次のアミノ酸配列： から成り、この配列においてもΧはGlyまたはArgであ
り、好ましくは前者である。
り、好ましくは前者である。
本発明のリポタンパク質には上記ポリペプチドのＮ末
端切断形態が含まれる。このような末端切断は好ましく
は１個または２個のアミノ酸残基を含む。
端切断形態が含まれる。このような末端切断は好ましく
は１個または２個のアミノ酸残基を含む。
上記ポリペプチドの脂肪酸残基の結合位置に関して、
それらはポリペプチド分子の５位と６位にあるシステイ
ン残基の一方または両方に共有結合され、この結合はチ
オエステルを形成するようなものである。
それらはポリペプチド分子の５位と６位にあるシステイ
ン残基の一方または両方に共有結合され、この結合はチ
オエステルを形成するようなものである。
本発明はまた、上記タンパク質またはタンパク質組成
物とリン脂質型の物質との組み合わせから成る、哺乳動
物における呼吸を容易にするための薬剤組成物を包含す
る。このような薬剤組成物においてタンパク質は小量成
分であり、組成物に含まれるタンパク質の好適な重量範
囲は組成物の約0.5〜10重量％である。タンパク質は全
体として組成物の約１〜５重量％を占めるのが特に好適
である。リン脂質型の物質の例としては、パルミチン酸
に基づいたリン脂質を挙げることができる。この種のリ
ン脂質マトリツクスのほかに、本発明組成物は他の添加
剤、例えば製剤学的に許容しうる担体または希釈剤、安
定剤、およびその他の通常用いられる製剤学的に許容し
うる添加剤をも含有しうる。
物とリン脂質型の物質との組み合わせから成る、哺乳動
物における呼吸を容易にするための薬剤組成物を包含す
る。このような薬剤組成物においてタンパク質は小量成
分であり、組成物に含まれるタンパク質の好適な重量範
囲は組成物の約0.5〜10重量％である。タンパク質は全
体として組成物の約１〜５重量％を占めるのが特に好適
である。リン脂質型の物質の例としては、パルミチン酸
に基づいたリン脂質を挙げることができる。この種のリ
ン脂質マトリツクスのほかに、本発明組成物は他の添加
剤、例えば製剤学的に許容しうる担体または希釈剤、安
定剤、およびその他の通常用いられる製剤学的に許容し
うる添加剤をも含有しうる。
本発明によるリポタンパク質は肺界面活性作用に有意
に寄与することが分かつた。従つて、本発明のリポタン
パク質および組成物は、肺界面活性物質の成分として特
に有用である。呼吸障害の治療を必要とする患者の気道
に、有効量の本発明リポタンパク質または組成物を投与
することにより、ヒトを含む哺乳動物における呼吸を容
易にすることが出来る。この投与により、患者の肺胞の
空気−液体界面での表面張力を有意に低下させることが
できる。投与は気管または気管支に直接行われるが、普
通のタイプのエーロゾル噴霧剤を用いて口腔を通して行
うこともできる。
に寄与することが分かつた。従つて、本発明のリポタン
パク質および組成物は、肺界面活性物質の成分として特
に有用である。呼吸障害の治療を必要とする患者の気道
に、有効量の本発明リポタンパク質または組成物を投与
することにより、ヒトを含む哺乳動物における呼吸を容
易にすることが出来る。この投与により、患者の肺胞の
空気−液体界面での表面張力を有意に低下させることが
できる。投与は気管または気管支に直接行われるが、普
通のタイプのエーロゾル噴霧剤を用いて口腔を通して行
うこともできる。
以下の非限定的実施例により、本発明をさらに詳しく
説明することにする。この例示は添付図面を参照しなが
ら行われる。
説明することにする。この例示は添付図面を参照しなが
ら行われる。
本発明によるリポタンパク質は高度に疎水性であつ
て、可溶化および精製に有機溶剤を必要とする。
て、可溶化および精製に有機溶剤を必要とする。
例１ ヒト低分子量界面活性タンパク質の単離 気管支肺胞洗浄 ヒトにおける気管支肺胞洗浄（Bronchoalveolar lava
ge;BAL）は局所麻酔下に柔軟性の気管支鏡を用いて行つ
た。気管支鏡を中葉気管支に押し込み、37℃の滅菌生理
食塩液を50mlのアリコートに分けて注入した。注入した
合計容量は200〜300mlの間で変化した。それぞれの注入
後に流動液を吸引し、氷上に保持したシリコーン処理済
みのびんの中に集めた。洗浄完了後すぐにこのびんを実
験室へ移した。
ge;BAL）は局所麻酔下に柔軟性の気管支鏡を用いて行つ
た。気管支鏡を中葉気管支に押し込み、37℃の滅菌生理
食塩液を50mlのアリコートに分けて注入した。注入した
合計容量は200〜300mlの間で変化した。それぞれの注入
後に流動液を吸引し、氷上に保持したシリコーン処理済
みのびんの中に集めた。洗浄完了後すぐにこのびんを実
験室へ移した。
回収したBAL流動液はダクロン（Dacron）ネツトの２
重層を通して過し、容量を測定した。それを４℃、40
0gで５分間遠心し、上清を分析に使用するまで−20℃で
貯蔵した。
重層を通して過し、容量を測定した。それを４℃、40
0gで５分間遠心し、上清を分析に使用するまで−20℃で
貯蔵した。
羊水 帝王切開および腟分娩により月満ちた妊娠から得られ
たヒト羊水はネツトを通して過し、その容量を測定
し、分析に使用するまで−20℃で貯蔵した。
たヒト羊水はネツトを通して過し、その容量を測定
し、分析に使用するまで−20℃で貯蔵した。
気管支肺胞および羊水からの疎水性タンパク質の分離 羊水またはBAL流動液300mlにメタノール400mlを加
え、この溶液を振とうおよび超音波処理により混合し
た。クロロホルム800mlを加え、この混合物を振とうし
た。過後、下相を蒸発乾固させ、そして疎水性タンパ
ク質をも含むリン脂質画分をリピデツクス（Lipidex）
−5000による逆相クロマトグラフイにかけ、塩化エチレ
ン／メタノール1:4（v/v）混合溶媒系で溶出することに
より単離した。
え、この溶液を振とうおよび超音波処理により混合し
た。クロロホルム800mlを加え、この混合物を振とうし
た。過後、下相を蒸発乾固させ、そして疎水性タンパ
ク質をも含むリン脂質画分をリピデツクス（Lipidex）
−5000による逆相クロマトグラフイにかけ、塩化エチレ
ン／メタノール1:4（v/v）混合溶媒系で溶出することに
より単離した。
例２ 界面活性リポタンパク質の分析 アミノ酸粗製の決定のために、タンパク質はジチオエ
リトリトール（約30nmol/nmolペプチド;37℃;2時間）で
還元し、8M尿素、0.4Mトリス/HCX1、2mM EDTA中の中和
ヨード（14C）酢酸（120nmol/nmolペプチド;37℃;2時
間）の添加によりカルボイシメチル化した。過剰の試薬
類はセフアデツクス（Sephadex）LH−60（40×1.1cm）
による排除クロマトグラフイーにかけ、５％0.1M HClを
含むクロロホルム／メタノール1:1（v/v）の混合溶媒で
溶出して除いた。アミノ酸組成の分析のために、サンプ
ルは排気した管の中で0.5％フエノールを含む6M HClに
より、110℃で24時間、さらにそれぞれ150℃で72時間お
よび120時間加水分解した。ヒト界面活性リポタンパク
質の全アミノ酸組成を表１に示す。遊離したアミノ酸は
ベツクマン（Beckmn）120M装置を使つて分析した。
リトリトール（約30nmol/nmolペプチド;37℃;2時間）で
還元し、8M尿素、0.4Mトリス/HCX1、2mM EDTA中の中和
ヨード（14C）酢酸（120nmol/nmolペプチド;37℃;2時
間）の添加によりカルボイシメチル化した。過剰の試薬
類はセフアデツクス（Sephadex）LH−60（40×1.1cm）
による排除クロマトグラフイーにかけ、５％0.1M HClを
含むクロロホルム／メタノール1:1（v/v）の混合溶媒で
溶出して除いた。アミノ酸組成の分析のために、サンプ
ルは排気した管の中で0.5％フエノールを含む6M HClに
より、110℃で24時間、さらにそれぞれ150℃で72時間お
よび120時間加水分解した。ヒト界面活性リポタンパク
質の全アミノ酸組成を表１に示す。遊離したアミノ酸は
ベツクマン（Beckmn）120M装置を使つて分析した。
見掛け分子量はSDS/ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（8M尿素を含む10％ゲルを使用）により決定した（2
2）。分子量マーカーはBDH Chemicals Ltd（英国）から
購入し、臭化シアンで切断したウマ心臓ミオグロブリン
から成つていた。リンはBartlett（23）に従つて分析し
た。
（8M尿素を含む10％ゲルを使用）により決定した（2
2）。分子量マーカーはBDH Chemicals Ltd（英国）から
購入し、臭化シアンで切断したウマ心臓ミオグロブリン
から成つていた。リンはBartlett（23）に従つて分析し
た。
配列分析用の調製物はクロロホルム／メタノール1:2
の混合溶媒中に加えた。
の混合溶媒中に加えた。
構造分析 リポタンパク質画分は窒素下に37℃で２時間ジチオト
レイトール（30nmol/nmolポリペプチド）により処理し
て還元した。その後、還元サンプルは中和ヨード
（14C）酢酸（120nmol/nmolポリペプチド;37℃;2時間）
で処理して14C−カルボキシメチル化し、そしてセフア
デツクスLH−60での排除クロマトグラフイーにより精製
した。
レイトール（30nmol/nmolポリペプチド）により処理し
て還元した。その後、還元サンプルは中和ヨード
（14C）酢酸（120nmol/nmolポリペプチド;37℃;2時間）
で処理して14C−カルボキシメチル化し、そしてセフア
デツクスLH−60での排除クロマトグラフイーにより精製
した。
14C−カルボキシメチル化タンパク質の配列分析用サ
ンプルはクロロホルム／メタノールに可溶化した後取り
出した。ペプシン切断用サンプルは100％ギ酸に溶か
し、５％ギ酸へ希釈し、その後酵素（酵素対基質比1:3
0;37℃;2時間）で処理した。ペプシンで切断したペプチ
ドはウルトロパツク（Ultropac）Ｃ−18カラムでの高性
能液体クロマトグラフイーにかけ、線状勾配のアセトニ
トリルを含む0.1％トリフルオロ酢酸で溶出して分離し
た。CNBr処理用サンプルは100％ギ酸に溶かし、70％へ
希釈し、その後CNBr（0.1g/ml）を用いて室温で24時間
処理した。CNBr断片は５％0.1M HClを含むクロロホルム
／メタノール1:1（v/v）の混合溶媒を用いセフアデツク
スLH−60により分離した（24）。
ンプルはクロロホルム／メタノールに可溶化した後取り
出した。ペプシン切断用サンプルは100％ギ酸に溶か
し、５％ギ酸へ希釈し、その後酵素（酵素対基質比1:3
0;37℃;2時間）で処理した。ペプシンで切断したペプチ
ドはウルトロパツク（Ultropac）Ｃ−18カラムでの高性
能液体クロマトグラフイーにかけ、線状勾配のアセトニ
トリルを含む0.1％トリフルオロ酢酸で溶出して分離し
た。CNBr処理用サンプルは100％ギ酸に溶かし、70％へ
希釈し、その後CNBr（0.1g/ml）を用いて室温で24時間
処理した。CNBr断片は５％0.1M HClを含むクロロホルム
／メタノール1:1（v/v）の混合溶媒を用いセフアデツク
スLH−60により分離した（24）。
気相シークエンサー分析はアプライド・バイオシステ
ムズ（Applied Biosystems）470 A装置での分解、およ
びヒユーレツド・パツカード（Helett Packard）1090装
置を使用する逆相高性能液体クロマトグラフイーでのフ
エニルチオヒダントイン検出により行つた（25）。ベツ
クマン890 C装置による液相シークエンサー分析用のサ
ンプルはグリシン予防循環ポリブレン（Polybrene）に
加え（26）、そして同じ高性能液体クロマトグラフイー
装置により分析した。全組成物は減圧下に100℃で24時
間6 M HCl/0.5％フエノールにより加水分解して得られ
た。ヒドラジン分解は排気した管の中で無水ヒドラジン
を用いて100℃で６時間実施した（27）。アミノ酸はニ
ンヒドリンに基づいたベツクマン121 Mアミノ酸アナラ
イザー、またはフエニルチオカルパミルに基づいた高性
能液体クロマトグラフイー装置を用いて定量化した（2
8）。界面活性タンパク質のＮ末端切断を表２に示す。
ムズ（Applied Biosystems）470 A装置での分解、およ
びヒユーレツド・パツカード（Helett Packard）1090装
置を使用する逆相高性能液体クロマトグラフイーでのフ
エニルチオヒダントイン検出により行つた（25）。ベツ
クマン890 C装置による液相シークエンサー分析用のサ
ンプルはグリシン予防循環ポリブレン（Polybrene）に
加え（26）、そして同じ高性能液体クロマトグラフイー
装置により分析した。全組成物は減圧下に100℃で24時
間6 M HCl/0.5％フエノールにより加水分解して得られ
た。ヒドラジン分解は排気した管の中で無水ヒドラジン
を用いて100℃で６時間実施した（27）。アミノ酸はニ
ンヒドリンに基づいたベツクマン121 Mアミノ酸アナラ
イザー、またはフエニルチオカルパミルに基づいた高性
能液体クロマトグラフイー装置を用いて定量化した（2
8）。界面活性タンパク質のＮ末端切断を表２に示す。
界面活性リポタンパク質の分子量は18000ボルトの加
速電圧を用いて“飛行時間（time of flight）”質量分
光分析器（スエーデン国ウプサラ、Bioion）により測定
した。ウシインシユリンを内部標準として使用した。
速電圧を用いて“飛行時間（time of flight）”質量分
光分析器（スエーデン国ウプサラ、Bioion）により測定
した。ウシインシユリンを内部標準として使用した。
リボタンパク質はジチオエリトリトール（約30mol/mo
lペプチド;37℃;2時間）で還元し、質量分析器により分
析した。非還元および還元物質は35個のアミノ酸の重量
から予測されるものより約480質量単位大きい、類似し
た分子量を示した（第１図参照）。天然の界面活性リポ
タンパク質は、プロテオリピドを形成すべく、ペプチド
配列に共用結合で連結された脂肪酸から成るという仮説
を目的する目的で、非還元リポタンパク質をクロロホル
ム／メタノール1:2（v/v）の混合溶媒に溶かし、2Mトリ
メチルアミン水溶液を加えて最終濃度を200 mMとした。
lペプチド;37℃;2時間）で還元し、質量分析器により分
析した。非還元および還元物質は35個のアミノ酸の重量
から予測されるものより約480質量単位大きい、類似し
た分子量を示した（第１図参照）。天然の界面活性リポ
タンパク質は、プロテオリピドを形成すべく、ペプチド
配列に共用結合で連結された脂肪酸から成るという仮説
を目的する目的で、非還元リポタンパク質をクロロホル
ム／メタノール1:2（v/v）の混合溶媒に溶かし、2Mトリ
メチルアミン水溶液を加えて最終濃度を200 mMとした。
この混合物37℃で４時間インキユベートした。脂肪酸
を遊離させ、セフアデツクスLH−60による排除クロマト
グラフイーにかけ、５％0.1 M HClを含むクロロホルム
／メアノール1:1（v/v）の混合溶媒で溶出して脂肪酸を
ポリペプチドから分離した。脂肪酸（主にパルミチン
酸）が回収された。
を遊離させ、セフアデツクスLH−60による排除クロマト
グラフイーにかけ、５％0.1 M HClを含むクロロホルム
／メアノール1:1（v/v）の混合溶媒で溶出して脂肪酸を
ポリペプチドから分離した。脂肪酸（主にパルミチン
酸）が回収された。
得られたペプチド画分を“飛行時間”質量分光分析器
で分析すると（第２図参照）、その分子量はトリメチル
アミン処理の際に約478質量単位だけ減少することが明
らかになつた。
で分析すると（第２図参照）、その分子量はトリメチル
アミン処理の際に約478質量単位だけ減少することが明
らかになつた。
この分子量の減少は、恐らくCys 5およびCys 6のスル
フヒドリル基にエステル化されていた、２個のパルミチ
ン酸残基の欠損に一致する。
フヒドリル基にエステル化されていた、２個のパルミチ
ン酸残基の欠損に一致する。
界面活性ペプチドから２個のパルミチン酸残基を遊離
させたトリメチルアミン処理が遊離チオール基を生成さ
せたことを確かめる目的で、次の実験を行つた： 天然界面活性リポタンパク質の別々のサンプルをトリ
メチルアミンで処理し、その後遊離チオール基をジチオ
エリトリトールで処理して再酸化を防ぎ、続いてヨード
酢酸で処理してカルボキシメチル化した。
させたトリメチルアミン処理が遊離チオール基を生成さ
せたことを確かめる目的で、次の実験を行つた： 天然界面活性リポタンパク質の別々のサンプルをトリ
メチルアミンで処理し、その後遊離チオール基をジチオ
エリトリトールで処理して再酸化を防ぎ、続いてヨード
酢酸で処理してカルボキシメチル化した。
質量分光分析（第３図参照）はトリメチルアミン処理
したペプチド画分と比べて約120質量単位の増加を示
す。120の分子量の増加はCys 5とCys 6のチオール基の
カルボキシメチル化とよく一致する。
したペプチド画分と比べて約120質量単位の増加を示
す。120の分子量の増加はCys 5とCys 6のチオール基の
カルボキシメチル化とよく一致する。
２個のエステル化されたパルミチン酸残基の存在をさ
らに証明するために、天然リポタンパク質はメタノール
／水98:2（v/v）の混合溶媒中0.01 M KOHにより＋37℃
で30分間処理した。ペプチドを非極性相から回収した
（29）。
らに証明するために、天然リポタンパク質はメタノール
／水98:2（v/v）の混合溶媒中0.01 M KOHにより＋37℃
で30分間処理した。ペプチドを非極性相から回収した
（29）。
このペプチドの“飛行時間”質量分光分析により測定
（第４図参照）はこの場合も天然界面活性ペプチドと比
較して約480質量単位の分子量の減少を示し、アルカリ
加水分解後の２個の共有結合パルミチン酸残基の欠損を
立証した。
（第４図参照）はこの場合も天然界面活性ペプチドと比
較して約480質量単位の分子量の減少を示し、アルカリ
加水分解後の２個の共有結合パルミチン酸残基の欠損を
立証した。
第１図では、２つの比較的小さいピークをはつきりと
識別することができる。主ピークに対して−240の位置
にあるものは、恐らく２個のシステイン残基のうちの１
個のみがパルミチン酸によりエステル化された、小割合
のペプチドを表すであろう。
識別することができる。主ピークに対して−240の位置
にあるものは、恐らく２個のシステイン残基のうちの１
個のみがパルミチン酸によりエステル化された、小割合
のペプチドを表すであろう。
これらのデータを総合すると、少なくとも１個優先的
には２個のパルミチン酸残基がCys 5およびCys 6のチオ
ール基へのエステル化によりペプチドへ共有結合されて
いることが明らかである。
には２個のパルミチン酸残基がCys 5およびCys 6のチオ
ール基へのエステル化によりペプチドへ共有結合されて
いることが明らかである。
例３ 単離したリポタンパク質画分と合成リン脂質との組み合
わせ 1,2−ジパルミトイル−Sn−グリセロ−３−ホスホコ
リン（DPPC）、１−パルミトイル−２−オレオイル−Sn
−グリセロ−３−ホスホコリン（POPC）および1,2−ジ
パルミトイル−Sn−グリセロ−３−ホスオグリセロール
（DPPG）はSigma Chemical社（ミズーリ州セントルイ
ス）から購入し、これ以上精製せずに使用した。これら
のリン脂質はクロロホルム／メタノール2:1（v/v）の混
合溶媒に溶解し、DPPC:POPC:DPPG:55:35:10（w/w/w）の
比率で混合し、界面活性調製物“リン脂質”として用い
た。
わせ 1,2−ジパルミトイル−Sn−グリセロ−３−ホスホコ
リン（DPPC）、１−パルミトイル−２−オレオイル−Sn
−グリセロ−３−ホスホコリン（POPC）および1,2−ジ
パルミトイル−Sn−グリセロ−３−ホスオグリセロール
（DPPG）はSigma Chemical社（ミズーリ州セントルイ
ス）から購入し、これ以上精製せずに使用した。これら
のリン脂質はクロロホルム／メタノール2:1（v/v）の混
合溶媒に溶解し、DPPC:POPC:DPPG:55:35:10（w/w/w）の
比率で混合し、界面活性調製物“リン脂質”として用い
た。
この混合物に、クロロホルム／メタノール1:2（v/v）
に溶かした界面活性リポタンパク質を加え、リポタンパ
ク質対リン脂質の比を1:50とした。溶媒を蒸発乾固さ
せ、それぞれの界面活性調製物（リン脂質、リン脂質＋
リポタンパク質画分）を食塩水に懸濁して10または80mg
/mlのリン脂質濃度を得た。
に溶かした界面活性リポタンパク質を加え、リポタンパ
ク質対リン脂質の比を1:50とした。溶媒を蒸発乾固さ
せ、それぞれの界面活性調製物（リン脂質、リン脂質＋
リポタンパク質画分）を食塩水に懸濁して10または80mg
/mlのリン脂質濃度を得た。
例４ in vitro表面特性の決定 リポタンパク質をベースとした人工界面活性物質の表
面特性は脈動バブル装置（カナダ国トロント、Surfacto
meter Internationl）を用いて分析した（30）。界面活
性調製物を10mg/mlのリン脂質濃度で懸濁し、バブル壁
を横切る圧力勾配を40/分の速度での50％周期的表面圧
縮において37℃で記録した。表面張力は５回目のサイク
ルと、１分および５分の脈動後において最大および最小
バブル寸法で評価した。
面特性は脈動バブル装置（カナダ国トロント、Surfacto
meter Internationl）を用いて分析した（30）。界面活
性調製物を10mg/mlのリン脂質濃度で懸濁し、バブル壁
を横切る圧力勾配を40/分の速度での50％周期的表面圧
縮において37℃で記録した。表面張力は５回目のサイク
ルと、１分および５分の脈動後において最大および最小
バブル寸法で評価した。
これらの実験結果を第５図に示す。ここに示されるト
レースはバブル壁を横切る圧力勾配を表し、maxおよびm
inは40/分の速度での脈動における最大（半径0.55m）お
よび最小（半径0.40mm）バブル寸法を示す。最小バブル
寸法でゼロに近い圧力勾配はほぼゼロの表面張力に相当
する。
レースはバブル壁を横切る圧力勾配を表し、maxおよびm
inは40/分の速度での脈動における最大（半径0.55m）お
よび最小（半径0.40mm）バブル寸法を示す。最小バブル
寸法でゼロに近い圧力勾配はほぼゼロの表面張力に相当
する。
例５ in vitro表面活性特性に対する脂肪酸の除去の影響 天然またはトリメチルアミン処理済みのリポタンパク
質を、タンパク質不含リン脂質（セフアデツクスLH−60
でのクロマトグラフイーにより肺界面活性物質から得ら
れたもの）と混合した。０〜４％のリポタンパク質また
は上記処理により得られたタンパン質画分を含むこれら
の人工界面活性調製物は10mg/mlのリン脂質濃度で食塩
水に懸濁し、脈動バブル装置を使つて分析した。バブル
壁を横切る圧力勾配は、40/分の速度での50％周期的表
面圧縮において37℃で記録した。最大および最小バブル
寸評での表面張力は５回目、40回目および200回目の脈
動サイクルにおいて測定した。その後、表面吸着速度は
最大バブル寸法で脈動を停止させ、静止表面張力が30mN
/mのレベルに降下するまでの時間間隔を記録することに
より測定した。
質を、タンパク質不含リン脂質（セフアデツクスLH−60
でのクロマトグラフイーにより肺界面活性物質から得ら
れたもの）と混合した。０〜４％のリポタンパク質また
は上記処理により得られたタンパン質画分を含むこれら
の人工界面活性調製物は10mg/mlのリン脂質濃度で食塩
水に懸濁し、脈動バブル装置を使つて分析した。バブル
壁を横切る圧力勾配は、40/分の速度での50％周期的表
面圧縮において37℃で記録した。最大および最小バブル
寸評での表面張力は５回目、40回目および200回目の脈
動サイクルにおいて測定した。その後、表面吸着速度は
最大バブル寸法で脈動を停止させ、静止表面張力が30mN
/mのレベルに降下するまでの時間間隔を記録することに
より測定した。
２％の天然リポタンパク質を含む界面活性調製物は速
やかな吸着（＜２秒）および0mN/mに近い最小表面張力
を有していた。トリメチルアミン処理したリポタンパク
質を含む対応混合物を遅い吸着（＞120秒）および高い
最小表面張力（約20mN/m）を有していた。従つて、ポリ
ペプチドに共有結合されたアシル残基は界面活性物質の
生理活性にとつて不可欠である。
やかな吸着（＜２秒）および0mN/mに近い最小表面張力
を有していた。トリメチルアミン処理したリポタンパク
質を含む対応混合物を遅い吸着（＞120秒）および高い
最小表面張力（約20mN/m）を有していた。従つて、ポリ
ペプチドに共有結合されたアシル残基は界面活性物質の
生理活性にとつて不可欠である。
例６ 合成ペプチドの製造 次のペプチド： はアプライド・バイオシステムズ430 A型ペプチド合成
機を用いて段階的固相法により合成した。支持体として
フエニルアセトアミドメチル（PMA）樹脂を使用し、次
のｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Boc）アミノ酸誘
導体を用いた:L−Arg−トシル、Ｌ−Cys−４−メチル−
ベンジル、Ｌ−Lys−Cl−ベンジルオキシカルボニル、
−Ｌ−Asn,L−Pro,L−Ala,L−Val,L−Met,L−Ile,L−Le
uおよびGly。この合成のために、対称酸無水物の予備形
成を含む標準プログラムを使用した。生成したペプチド
はフツ化水素（HF）法により樹脂から切り離し、脱保護
した。その後逆相高性能液体クロマトグラフイー（HPL
C）で精製した。最終産物の同一性および純度はアミノ
酸加水分解により評価した（31）。
機を用いて段階的固相法により合成した。支持体として
フエニルアセトアミドメチル（PMA）樹脂を使用し、次
のｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Boc）アミノ酸誘
導体を用いた:L−Arg−トシル、Ｌ−Cys−４−メチル−
ベンジル、Ｌ−Lys−Cl−ベンジルオキシカルボニル、
−Ｌ−Asn,L−Pro,L−Ala,L−Val,L−Met,L−Ile,L−Le
uおよびGly。この合成のために、対称酸無水物の予備形
成を含む標準プログラムを使用した。生成したペプチド
はフツ化水素（HF）法により樹脂から切り離し、脱保護
した。その後逆相高性能液体クロマトグラフイー（HPL
C）で精製した。最終産物の同一性および純度はアミノ
酸加水分解により評価した（31）。
Kent,S.B.H.（1980）Ann.Rev.Biochem.57,957−999. 例７ チオエステルリポペプチドの製造 再蒸留した塩化パルミトイル（Fluka）とヘキサペプ
チドH2N−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro−Val−COOHとの結
合は次のように行つた： −ヘキサペプチド3mg（4.8μmmol）をクロロホルム／メ
タノール1:2（v/v）の混合溶媒500μに溶解した。
チドH2N−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro−Val−COOHとの結
合は次のように行つた： −ヘキサペプチド3mg（4.8μmmol）をクロロホルム／メ
タノール1:2（v/v）の混合溶媒500μに溶解した。
−この溶液に0.5 M DTE 25μ（12.5μmol）を加え
た。この混合物にN2を流し、37℃で160分間インキユベ
ートした。
た。この混合物にN2を流し、37℃で160分間インキユベ
ートした。
−3.3M塩化パルミトイル20μ（66μmol）を加え、こ
の混合物にN2を流して37℃で250分間インキユベートし
た。
の混合物にN2を流して37℃で250分間インキユベートし
た。
アシル化ペプチドはTLCで分離し、その分子量を確認
した。
した。
例４に記載の方法に従つて試験した場合、このリポペ
プチドは天然リポタンパク質と同様の挙動を示した。
プチドは天然リポタンパク質と同様の挙動を示した。
例８ 合成リン脂質および合成SP−Ｃポリペプチド（チオエス
テル結合されたパルミチン酸を含まない）から成る人工
界面活性物質のin vitro表面特性の測定 SP−Ｃポリペプチドはアプライド・バイオシステムズ
430 A型ペプチド合成機を用いて段階的固相法により合
成した。支持体としてフエニルアセトアミドメチル樹脂
を使用し、ポリペプチドはフツ化水素法により樹脂から
切り離し且つ脱保護した。ポリペプチドは５％0.1 M HC
lを含むまたは含まないクロロホルム／メタノール1:1
（v/v）の混合溶媒で樹脂から抽出し、約30％のサンプ
ルを得た。この物質を少量の濃ギ酸に溶かし、クロロホ
ルム／メタノール1:1（v/v）で希釈し、セフアデツクス
LH−60クロマトグラフイーにかけ、５％ギ酸を含むクロ
ロホルム／メタノール1:1（v/v）で溶出して精製した。
最終産物の同一性および純度をアミノ酸加水分解、シー
クエンサー分解および“飛行時間”良質分析により評価
した。
テル結合されたパルミチン酸を含まない）から成る人工
界面活性物質のin vitro表面特性の測定 SP−Ｃポリペプチドはアプライド・バイオシステムズ
430 A型ペプチド合成機を用いて段階的固相法により合
成した。支持体としてフエニルアセトアミドメチル樹脂
を使用し、ポリペプチドはフツ化水素法により樹脂から
切り離し且つ脱保護した。ポリペプチドは５％0.1 M HC
lを含むまたは含まないクロロホルム／メタノール1:1
（v/v）の混合溶媒で樹脂から抽出し、約30％のサンプ
ルを得た。この物質を少量の濃ギ酸に溶かし、クロロホ
ルム／メタノール1:1（v/v）で希釈し、セフアデツクス
LH−60クロマトグラフイーにかけ、５％ギ酸を含むクロ
ロホルム／メタノール1:1（v/v）で溶出して精製した。
最終産物の同一性および純度をアミノ酸加水分解、シー
クエンサー分解および“飛行時間”良質分析により評価
した。
いろいろな量の精製した合成ポリペプチドSP−Ｃは例
３で用いた合成リン脂質混合物と組み合させた。リン脂
質はクロロホルム／メタノール2:1（v/v）の混合溶媒に
溶かし、DPPC:POPC:DPPG 55:35:10（w/w/w）の比率で混
合し、そして界面活性調製物“リン脂質”として使用し
た。
３で用いた合成リン脂質混合物と組み合させた。リン脂
質はクロロホルム／メタノール2:1（v/v）の混合溶媒に
溶かし、DPPC:POPC:DPPG 55:35:10（w/w/w）の比率で混
合し、そして界面活性調製物“リン脂質”として使用し
た。
ギ酸に溶解した合成SP−Ｃポリペプチドの異なる量は
別々の管に加え、その後酸を蒸発乾固させた。リン脂質
の添加後、有機溶媒を蒸発乾固させた。それぞれの界面
活性調製物は10mg/mlのリン脂質濃度で食塩水に懸濁し
た。０〜20％の合成SP−Ｃポリペプチドを含むこれらの
人工界面活性調製物は脈動バブル装置を用いて試験し
た。バブル壁を横切る圧力勾配は40/分の速度での50％
周期的表面圧縮において37℃で記録した。最大および最
小バブル寸法での表面張力は５回目、40回目および200
回目の脈動サイクルにおいて測定した。その後、界面吸
着速度は最大バブル寸法で脈動を止め、静止表面張力が
30mN/mのレベルに降下するまでの間隔を記録することに
より測定した。これらの調製物はすべて非常に遅い吸着
（＞120秒）および高い最小（＞20mN/m）および最大
（＞44mN/m）表面張力を有していた（表３参照）。これ
らの結果は、SP−Ｃポリペプチド（パルミトイル残基を
含まない）が表面活性に対して何ら影響を及ぼさなかつ
たことを示している。遅い吸着および高い表面張力の値
は新生児を治療する際のこれらの調製物の使用を妨げる
であろう。
別々の管に加え、その後酸を蒸発乾固させた。リン脂質
の添加後、有機溶媒を蒸発乾固させた。それぞれの界面
活性調製物は10mg/mlのリン脂質濃度で食塩水に懸濁し
た。０〜20％の合成SP−Ｃポリペプチドを含むこれらの
人工界面活性調製物は脈動バブル装置を用いて試験し
た。バブル壁を横切る圧力勾配は40/分の速度での50％
周期的表面圧縮において37℃で記録した。最大および最
小バブル寸法での表面張力は５回目、40回目および200
回目の脈動サイクルにおいて測定した。その後、界面吸
着速度は最大バブル寸法で脈動を止め、静止表面張力が
30mN/mのレベルに降下するまでの間隔を記録することに
より測定した。これらの調製物はすべて非常に遅い吸着
（＞120秒）および高い最小（＞20mN/m）および最大
（＞44mN/m）表面張力を有していた（表３参照）。これ
らの結果は、SP−Ｃポリペプチド（パルミトイル残基を
含まない）が表面活性に対して何ら影響を及ぼさなかつ
たことを示している。遅い吸着および高い表面張力の値
は新生児を治療する際のこれらの調製物の使用を妨げる
であろう。
例９ 合成リン脂質および天然またはトリメチルアミン処理
（二脱アシル化）SP−Ｃから成る人工界面活性物質のin
vitro表面特性の測定 天然およびトリメチルアミン処理SP−Ｃの分子量は
“飛行時間”質量分析により測定した。質量スペクトル
は天然SP−Ｃが主として２個のパルミトイル残基を含
み、１個のパルミトイル残基をもつ分子が少量含まれる
ことを示した。トリメチルアミン処理SP−Ｃはセフアデ
ツクスLH−60クロマトグラフイーにかけ、５％0.1 M HC
lを含むクロロホルム／メタノール1:1（v/v）の混合溶
媒で溶出して精製し、“飛行時間”質量分析により測定
した。このトリメチルアミン処理SP−Ｃは完全に脱アシ
ル化されていた。異なる量の天然または脱アシル化SP−
Ｃを例３で用いた合成リン脂質混合物と組み合わせた。
リン脂質はクロロホルム／メタノール2:1（v/v）に溶解
し、DPPC:POPC:DPPG 55:35:10（w/w/w）の比率で混合
し、そして界面活性調製物“リン脂質”として使用し
た。
（二脱アシル化）SP−Ｃから成る人工界面活性物質のin
vitro表面特性の測定 天然およびトリメチルアミン処理SP−Ｃの分子量は
“飛行時間”質量分析により測定した。質量スペクトル
は天然SP−Ｃが主として２個のパルミトイル残基を含
み、１個のパルミトイル残基をもつ分子が少量含まれる
ことを示した。トリメチルアミン処理SP−Ｃはセフアデ
ツクスLH−60クロマトグラフイーにかけ、５％0.1 M HC
lを含むクロロホルム／メタノール1:1（v/v）の混合溶
媒で溶出して精製し、“飛行時間”質量分析により測定
した。このトリメチルアミン処理SP−Ｃは完全に脱アシ
ル化されていた。異なる量の天然または脱アシル化SP−
Ｃを例３で用いた合成リン脂質混合物と組み合わせた。
リン脂質はクロロホルム／メタノール2:1（v/v）に溶解
し、DPPC:POPC:DPPG 55:35:10（w/w/w）の比率で混合
し、そして界面活性調製物“リン脂質”として使用し
た。
これらのリン脂質混合物に、クロロホルム／メタノー
ル1:2（v/v）に溶解した天然または脱アシル化SP−Ｃを
いろいろな量で加えた。有機溶媒を蒸発乾固させ、それ
ぞれの界面活性調製物は10mg/mlのリン脂質濃度で食塩
水で懸濁した。０〜４％の天然または脱アシル化SP−Ｃ
を含むこれらの人工界面活性調製物は脈動バブル装置を
用いて試験した。バブル壁を横切る圧力勾配は、40/分
の速度での50％周期的表面圧縮において37℃で記録し
た。最大および最小バブル寸法での表面張力は５回目、
40回目、および200回目の脈動サイクルにおいて測定し
た。その後、最大バブル寸法で脈動を止め、静止表面張
力が30mN/mのレベルに降下するまでの時間間隔を記録す
ることにより表面吸着速度を測定した。これらの結果
は、天然SP−Ｃ含有調製物がin vitro表面活性を増強し
たことを示している。こうして、調製物中の２％の濃度
の天然SP−Ｃはやや速やかな吸着（16秒）、0mN/mに近
い最小表面張力および約30mN/mの最大表面張力を与えた
（表４参照）。これらの結果は、新生児の治療に上首尾
で用いられる天然ブタ界面活性製剤のin vitro表面活性
（吸着＜１秒、200回目のサイクルにおける最小および
最大表面張力それぞれ＜3mN/mおよび30mN/m）と類似し
ている。吸着時間は天然界面活性物質中のより複雑な不
飽和リン脂質混合物のために、天然界面活性物質から得
られた吸着時間よりもやや長い。リン脂質混合物への脱
アシル化SP−Ｃの添加は表面特性を改善しなかつた。こ
れらの調製物はすべて非常に遅い吸着（＞120秒）と高
い最小（18mN/m）および最大（50mN/m）表面張力を
有していた（表５参照）。これらの結果は、脱アシル化
SP−Ｃを含む界面活性調製物が新生児の治療に効果的で
ないことを示している。
ル1:2（v/v）に溶解した天然または脱アシル化SP−Ｃを
いろいろな量で加えた。有機溶媒を蒸発乾固させ、それ
ぞれの界面活性調製物は10mg/mlのリン脂質濃度で食塩
水で懸濁した。０〜４％の天然または脱アシル化SP−Ｃ
を含むこれらの人工界面活性調製物は脈動バブル装置を
用いて試験した。バブル壁を横切る圧力勾配は、40/分
の速度での50％周期的表面圧縮において37℃で記録し
た。最大および最小バブル寸法での表面張力は５回目、
40回目、および200回目の脈動サイクルにおいて測定し
た。その後、最大バブル寸法で脈動を止め、静止表面張
力が30mN/mのレベルに降下するまでの時間間隔を記録す
ることにより表面吸着速度を測定した。これらの結果
は、天然SP−Ｃ含有調製物がin vitro表面活性を増強し
たことを示している。こうして、調製物中の２％の濃度
の天然SP−Ｃはやや速やかな吸着（16秒）、0mN/mに近
い最小表面張力および約30mN/mの最大表面張力を与えた
（表４参照）。これらの結果は、新生児の治療に上首尾
で用いられる天然ブタ界面活性製剤のin vitro表面活性
（吸着＜１秒、200回目のサイクルにおける最小および
最大表面張力それぞれ＜3mN/mおよび30mN/m）と類似し
ている。吸着時間は天然界面活性物質中のより複雑な不
飽和リン脂質混合物のために、天然界面活性物質から得
られた吸着時間よりもやや長い。リン脂質混合物への脱
アシル化SP−Ｃの添加は表面特性を改善しなかつた。こ
れらの調製物はすべて非常に遅い吸着（＞120秒）と高
い最小（18mN/m）および最大（50mN/m）表面張力を
有していた（表５参照）。これらの結果は、脱アシル化
SP−Ｃを含む界面活性調製物が新生児の治療に効果的で
ないことを示している。
文献 1. Goerke,J.（1974）Biochim.Biophys.Acta374,241−
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3.
第１図はヒト界面活性リポタンパク質の質量スペクトル
を示し； 第２図はトリメチルアミン処理後の対応する質量スペク
トルを示し； 第３図はトリメチルアミンで処理し、次にヨード酢酸で
処理した後の対応する質量スペクトルを示し； 第４図は水酸化カリウム処理後の対応する質量スペクト
ルを示し；そして 第５図は脈動バブル法による人工界面活性調製物の表面
活性に関する図表を示す。
を示し； 第２図はトリメチルアミン処理後の対応する質量スペク
トルを示し； 第３図はトリメチルアミンで処理し、次にヨード酢酸で
処理した後の対応する質量スペクトルを示し； 第４図は水酸化カリウム処理後の対応する質量スペクト
ルを示し；そして 第５図は脈動バブル法による人工界面活性調製物の表面
活性に関する図表を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブイエルン・レーベンアドラー スウエーデン国，テーバイ，エス‐183 64，カールショームスベーゲン ３ エフ (72)発明者 ベント・ロバートソン スウエーデン国，ストックホルム，エ ス‐113 33，カデットガータン １ (56)参考文献 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５月 （1988），232（１），Ｐ．61−64 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】高度に疎水性でありそして溶解及び精製の
ために有機溶媒を必要とし、14kDa未満の分子量を有し
そしてチオエステルを形成するように、リポタンパク質
分子のシスティン残基の一方または両方に共有的に結合
された１個または２個の脂肪酸残基を有し、前記残基が
16個の炭素原子を有し、しかも のアミノ酸配列を含み、肺界面活性を有するヒトまたは
ウシ肺胞リポタンパク質。 - 【請求項２】高度に疎水性でありそして溶解及び精製の
ために有機溶媒を必要とし、14kDa未満の分子量を有し
そしてチオエステルを形成するように、リポタンパク質
分子のシスティン残基の一方または両方に共有的に結合
された１個または２個の脂肪酸残基を有し、前記脂肪酸
残基が16個の炭素原子を有する酸を除外する14〜22個の
炭素原子を有する脂肪酸の残基から選ばれ、しかも のアミノ酸配列を含み、肺界面活性を有する肺胞リポタ
ンパク質。 - 【請求項３】前記脂肪酸残基がパルミチン酸残基であ
る、請求項１に記載のリポタンパク質。 - 【請求項４】前記酸がステアリン酸、オレイン酸、リノ
ール酸、およびリノレン酸から選ばれる、請求項２記載
のリポタンパク質。 - 【請求項５】前記酸が飽和されている、請求項１〜４の
いずれか１項記載のリポタンパク質。 - 【請求項６】前記酸がステアリン酸である、請求項４記
載のリポタンパク質。 - 【請求項７】２個の脂肪酸残基を含有する、請求項１〜
６のいずれか１項記載のリポタンパク質。 - 【請求項８】アミノ酸配列： （但しΧはGlyまたはArgである）を含む請求項１〜７の
いずれか１記載のリポタンパク質。 - 【請求項９】アミノ酸配列： （但しΧはGlyまたはArgである）を含む請求項８記載の
リポタンパク質。 - 【請求項１０】Ｎ−末端切断形態を有する、請求項８ま
たは９に記載のリポタンパク質。 - 【請求項１１】切断が１個または２個のアミノ酸残基を
含む、請求項10に記載のリポタンパク質。 - 【請求項１２】請求項１〜11のいずれか１項記載のリポ
タンパク質とリン脂質型の材料とを組み合わせて含む、
哺乳動物における呼吸を容易にするための医薬組成物。
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