DE60221104T2

DE60221104T2 - Substituierte diarylharnstoffe als stimulatoren der fas-vermittelten apoptose

Info

Publication number: DE60221104T2
Application number: DE60221104T
Authority: DE
Inventors: Louise San Carlos ROBINSON; Hugo O. La Jolla Villar
Original assignee: Telik Inc
Current assignee: Telik Inc
Priority date: 2001-03-07
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2022-03-02
Also published as: EP1366021A2; JP2004528311A; WO2002076930A3; DE60221104D1; ATE366720T1; EP1366021B1; AU2002306618B2; CA2434020A1; WO2002076930A2; ES2286267T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft substituierte Diarylharnstoffe, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten, und ihre Verwendung zur Stimulierung von Fasvermittelter Apoptose.
Beschreibung des verwandten Standes der Technik
Es wird angenommen, dass der Fas-Rezeptor, auch als APO-1 oder CD95 bekannt, ein Schlüsselinitiator des apoptotisch programmierten Zelltods in einer Vielfalt von Zelltypen ist. Die Aktivierung des Fas-Rezeptors durch Fas-Liganden (FasL) oder Agonist-Antikörpern führt zur Aggregierung des Fas-Rezeptors und zur Aktivierung des intrazellulären Tod-induzierenden Signalkomplexes (DISC). Siehe z.B. Kischkel et al., EMBO J. 14:5579–5588 (1995). Die Aktivierung von anderen Molekülen, wie Caspasen, und in einigen Zellen bcl-2 kann auch auftreten. Es ist vorgeschlagen worden, dass die Hauptfunktion des Fas-Signalisierungskomplexes die Aktivierung von Caspase-8-Protease ist. Siehe z.B. Siegel et al., J. Allergy Clin. Immunol. 103:729 (1999). CD4⁺ T-Zellen sind einzigartig in ihrem Vermögen, durch Stimulierung ihrer eigenen Fas-Rezeptoren den Selbstmord zuzulassen. T-Zellen können auch die Apoptose in B-Zellen, Makrophagen und anderen Zelltypen durch FasL triggern. Diese Wechselwirkungen regulieren in negativer Weise das Immunsystem, können aber auch zur Immunopathologie beitragen, wie bei der Fasvermittelten Schädigung von Zielgeweben bei Hepatitis und anderen Organspezifischen Autoimmun-Erkrankungen. Fas spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der menschlichen Immunreaktion und die Einzelheiten seiner klinischen Bedeutung werden aktiv untersucht. Es wird angenommen, dass ein veränderter Fas-Rezeptor oder ein veränderter FasL zu Autoimmun-, Infektions- und malignen Krankheitszuständen beiträgt, einschließlich autoimmunes lymphoproliferatives Syndrom, autoimmune Schilddrüsenerkrankung, Hypereosinophilie, viraler Hepatitis, Dickdarmkarzinoma, Brustkarzinoma, Prostatakrebs, Neuroblastoma, Glioma und anderen Krebsarten und Krankheitszuständen. Siehe z.B. Houghton, J. Curr. Opin. Oncol. 11:475 (1999) und Siegel et al., J. Allergy Clin. Immunol. 103:729 (1999).
Es gibt eine große Reihe von Diarylharnstoffen, die in der Literatur zitiert sind, es gibt aber nur eine begrenzte Zahl an mit Halogenen substituierten Diarylharnstoffen. Es ist von bestimmten Diarylharnstoffen berichtet worden, dass sie als p38-Kinase-Inhibitoren ( WO 99/32463 , WO 99/00357 ), raf-Kinase-Inhibitoren ( WO 99/32436 ) und 5-HT-Rezeptor-Antagonisten ( WO 98/50346 ) brauchbar sind.
Die hier und anderswo in dieser Anmeldung zitierten Dokumente sind hier durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen der Formel:
worin:
X¹ und X² unabhängig ausgewählt sind aus -F, -Cl, -Br und -OSO₂R¹;
Y¹ und Y² unabhängig ausgewählt sind aus -CN, -NO₂, -COR¹, -CONR¹R², -SO₂R¹ und – SO₂NR¹R²; und
jedes R¹ unabhängig ausgewählt ist aus gegebenenfalls substituiertem linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und gegebenenfalls substituiertem Aralkyl,
jedes R² unabhängig ausgewählt ist aus H, gegebenenfalls substituiertem linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und gegebenenfalls substituiertem Aralkyl,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
In einem zweiten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine Verbindung des ersten Aspekts der Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten in Säugern, die durch Verabreichung eines Stimulators der Fas-vermittelten Apoptose behandelbar sind, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung des ersten Aspekts dieser Erfindung oder einer Zusammensetzung des zweiten Aspekts dieser Erfindung an den Säuger. Die Verbindungen des ersten Aspekts der Erfindung stimulieren Fas-vermittelte Apoptose, was zum Zelltod in Zellen führt, die den Fas-Rezeptor enthalten, und sind brauchbar bei der Regulierung des Immunsystems und der Immunantworten, der Zellproliferation und der Malignität. Geeignete Krankheiten für diese Behandlung sind Autoimmunerkrankungen, Infektionserkrankungen und maligne Erkrankungen, einschließlich autoimmunes lymphoproliferatives Syndrom, autoimmuner Schilddrüsenerkrankung, Hypereosinophilie, viraler Hepatitis, Kolonkarzinoma, Mammakarzinoma, Prostatakrebs, Neuroblastoma, Glioma und anderen Krebsarten und Erkrankungen. Dieser Aspekt beinhaltet auch die Verwendung von Verbindungen des ersten Aspekts der Erfindung bei der Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen in Säugern, die durch Verabreichung eines Stimulators der Fas-vermittelten Apoptose behandelbar sind.
In einem vierten Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Stimulierung von Fas-vermittelter Apoptose in einer Zelle, die einen Fas-Rezeptor aufweist, indem die Zelle mit einer Verbindung des ersten Aspekts dieser Erfindung in einer ausreichenden Menge, um die Fas-vermittelte Apoptose zu stimulieren, kontaktiert wird. In vivo kann der Schritt des Kontaktierens der Zelle mit der Verbindung durch Verabreichen einer wirksamen Menge der Verbindung an ein Tier, das die Zelle enthält, bewirkt werden. In vitro kann der Schritt des Kontaktierens der Zelle mit einer Verbindung der Formel durch Verabreichen einer wirksamen Menge der Verbindung an die Zelle oder an eine Lösung, in der die Zelle badet, bewirkt werden.
In einem fünften Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Herstellung der Verbindungen des ersten Aspekts der Erfindung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
(a) Definitionen und allgemeine Parameter
"Alkyl" bedeutet ein einwertiges C₁-C₁₀-Hydrocarbyl, das linear, verzweigt oder cyclisch sein kann und z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Cyclopentyl, Cyclopropylmethyl, Cyclohexyl und Cyclohexylmethyl beinhaltet. C₁-C₆-Alkyle sind bevorzugt.
Ein "substituiertes Alkyl" ist ein Alkyl, das mit bis zu drei Halogenatomen und/oder Substituenten ausgewählt aus -CN, -NO₂, -OR, -SR, -COR, -OC(O)R, -C(O)OR, -NR₂, -SO₂OR, -OSO₂R, -SO₂NR₂, -NRSO₂R, -CONR₂ oder -NRCOR, worin jedes R unabhängig Wasserstoff, gegebenenfalls R'-substituiertes Alkyl, gegebenenfalls R'-substituiertes Aryl, Heteroaryl, gegebenenfalls R'-substituiertes Aralkyl oder Heteroaralkyl ist und jedes R' unabhängig Halogen, -CN, -NO₂, -OH, C_1-3-Alkyl, C_1-3-Alkoxy, -SH oder -NH₂ ist, substituiert ist. Bevorzugte substituierte Alkyle sind mit bis zu 3 Halogenatomen und/oder einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -CN, -NO₂, -OH, C_1-3-Alkoxy, -SH und -NH₂ substituiert und ein besonders bevorzugtes substituiertes Alkyl ist -CF₃.
"Aryl" bedeutet ein aromatisches Hydrocarbyl enthaltend 6 bis 20 Ringkohlenstoffatome, das monocyclisch (Phenyl), kondensiert polycyclisch, bevorzugt kondensiert bicyclisch (z.B. Naphthyl) oder verknüpft polycyclisch, bevorzugt verknüpft bicyclisch (z.B. Biphenylyl) ist. Das Aryl ist bevorzugt C₆-C₁₆ und sogar noch bevorzugter C₆-C₁₄. Ein besonders bevorzugtes Aryl ist Phenyl.
Ein "substituiertes Aryl" ist ein Aryl, das substituiert ist mit bis zu 3 Substituenten ausgewählt aus Halogen, -CN, -NO₂, -OR, gegebenenfalls Halogensubstituiertem C_1-3-Alkyl, gegebenenfalls Halogen-substituiertem C_1-3-Alkoxy, -SR, -COR, -OC(O)R, -C(O)OR, -NR₂, -SO₂OR, -OSO₂R, -SO₂NR₂, -NRSO₂R, -CONR₂ oder -NRCOR, wobei jedes R unabhängig Wasserstoff oder gegebenenfalls R'-substituiertes Alkyl ist und jedes R' unabhängig Halogen, -CN, -NO₂, -OH, C_1-3-Alkyl, C_1-3-Alkoxy, -SH oder -NH₂ ist. Bevorzugte substituierte Aryle sind substituiert mit bis zu drei Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, -CN, -NO₂, -OH, gegebenenfalls Halogen-substituiertem C_1-3-Alkyl, gegebenenfalls Halogen-substituiertem C_1-3-Alkoxy, -SH und -NH₂; und besonders bevorzugte substituierte Aryle sind substituierte Phenyle.
"Aralkyl" bedeutet ein Alkyl, das mit einem Aryl substituiert ist. Bevorzugte Aralkyle sind Benzyl und Phenethyl.
Ein "substituiertes Aralkyl" ist ein Aralkyl, bei dem das Aryl oder das Alkyl oder beide in der vorstehend für substituiertes Aryl und substituiertes Alkyl beschriebenen Weise substituiert sind.
"Halogen" bedeutet F, Cl oder Br.
"Heteroaryl" bedeutet ein monocyclisches oder kondensiertes bicyclisches aromatisches Hydrocarbyl enthaltend 6 bis 20 Ringatome, bei dem 1 bis 3 der Ringkohlenstoffatome durch O, S, N oder NR (worin R H oder C_1-3-Alkyl ist) ersetzt sind. Bevorzugte Heteroaryle sind monocyclisch und enthalten 5 oder 6 Ringatome und beinhalten Furyl, Thienyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Imidazolyl, Pyridinyl, Pyrazinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl usw.
"Pharmazeutisch annehmbare Salze" sind in dem Abschnitt mit dem Titel "Verbindungen" beschrieben.
Eine "therapeutisch wirksame Menge" bedeutet die Menge, die bei Verabreichung an ein Lebewesen zur Behandlung einer Krankheit genügt, um diese Behandlung für die Krankheit zu bewirken.
"Behandeln" oder "Behandlung" einer Krankheit in einem Säuger beinhaltet (1) die Verhinderung des Auftretens der Krankheit bei einem Säuger, der eine Prädisposition für die Erkrankung aufweisen kann, aber noch keine Symptome der Krankheit erfährt oder zeigt, (2) Hemmung der Krankheit, d.h. Anhalten der Entwicklung, (3) Lindern der Symptome der Krankheit, d.h. Reduzieren der Wirkungen der Krankheit und (4) Bewirkung einer Regression der Krankheit.
(b) Verbindungen
In einem ersten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen der Formel:
worin:
X¹ und X² unabhängig ausgewählt sind aus -F, -Cl, -Br und -OSO₂R¹;
Y¹ und Y² unabhängig ausgewählt sind aus -CN, -NO₂, -COR¹, -CONR¹R², -SO₂R¹ und – SO₂NR¹R²; und
jedes R¹ unabhängig ausgewählt ist aus gegebenenfalls substituiertem Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und gegebenenfalls substituiertem Aralkyl,
jedes R² unabhängig ausgewählt ist aus H, gegebenenfalls substituiertem Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und gegebenenfalls substituiertem Aralkyl,
und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon.
Beispiele für bevorzugte Klassen von Verbindungen sind solche, bei denen eines oder mehreres des folgenden wahr ist:

(1) X¹ und X² sind unabhängig -F oder -Cl,
(2) Y¹ und Y² sind unabhängig -CN, -NO₂ oder -COR¹,
(3) X¹ und X² sind gleich, oder
(4) Y¹ und Y² sind gleich.

Beispiele für bevorzugtere Klassen der Verbindung sind solche, worin eines oder mehreres des folgenden wahr ist:

(a) X¹ und X² sind beide -Cl oder beide sind -F, oder
(b) Y¹ und Y² sind beide -NO₂ oder beide sind -CN.

Eine besonders bevorzugte Verbindung ist die Verbindung, bei der X¹ und X² -Cl sind und Y¹ und Y² -NO₂ sind, d.h. die Verbindung 1,3-Bis(4-chlor-3-nitrophenyl)harnstoff.
Synthesen und Beschreibungen dieser Verbindungen sind in den Beispielen ausgeführt.
Bestimmte Verbindungen der Erfindung können ein oder mehrere chirale Zentren enthalten. In diesen Fällen fallen auch alle Stereoisomere in den Umfang der Erfindung. Die Verbindungen der Erfindung beinhalten die individuell isolierten Stereoisomere und auch Mischungen von solchen Stereoisomeren.
Pharmazeutisch annehmbare Salze, Kationen und Anionen der Verbindungen der Erfindung sind auch in der vorliegenden Erfindung enthalten und bei den Verfahren und pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hier beschrieben sind, brauchbar.
Pharmazeutisch annehmbare Salze beinhalten Salze, die gebildet werden können, wenn vorhandene saure Protonen in der Lage sind, mit anorganischen oder organischen Basen zu reagieren. Typischerweise wird die Stammverbindung mit einem Überschuss von einem alkalischen Reagenz, wie Hydroxid, Carbonat oder Alkoxid mit einem geeigneten Kation, behandelt. Kationen wie Na⁺, K⁺, Ca² ⁺, Mg²⁺ und NH₄ ⁺ sind Beispiele von Kationen, die in pharmazeutisch annehmbaren Salzen vorhanden sind. Die Na⁺-Salze sind besonders geeignet. Annehmbare anorganische Basen beinhalten daher Aluminiumhydroxid, Calciumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat und Natriumhydroxid. Salze können auch mit organischen Basen hergestellt werden, wie Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen, substituierten Aminen, einschließlich natürlich vorkommenden substituierten Aminen, und cyclischen Aminen, einschließlich Isopropylamin, Trimethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Tripropylamin, Ethanolamin, 2-Dimethylaminoethanol, Tromethamin, Lysin, Arginin, Histin, Koffein, Procain, Hydrabamin, Cholin, Betain, Ethylendiamin, Glucosamin, N-Alkylglucaminen, Theobromin, Purinen, Piperazin, Piperidin, N-Ethylpiperidin usw.
Wenn eine Verbindung der Erfindung eine basische Gruppe enthält, kann ein Säureadditionssalz hergestellt werden. Säureadditionssalze der Verbindungen werden in herkömmlicher Weise in einem geeigneten Lösungsmittel aus der Stammverbindung und einem Überschuss einer Säure, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure (was die Sulfat- und Bisulfatsalze ergibt), Salpetersäure, Phosphorsäure usw. und organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Apfelsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Salicylsäure, p-Toluolsulfonsäure, Hexansäure, Heptansäure, Cyclopentanpropionsäure, Milchsäure, o-(4-Hydroxybenzoyl)benzoesäure, 1,2-Ethandisulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Chlorbenzolsulfonsäure, 2-Naphthalinsulfonsäure, Kamphersulfonsäure, 4-Methylbicyclo[2.2.2]oct-2-en-1-carbonsäure, Glucoheptonsäure, Gluconsäure, 4,4'-Methylenbis(3-hydroxy-2-naphthoe)säure, 3-Phenylpropionsäure, Trimethylessigsäure, tert.-Butylessigsäure, Laurylschwefelsäure, Glucoronsäure, Glutaminsäure, 3-Hydroxy-2-naphthoesäure, Stearinsäure, Muconsäure usw., hergestellt.
Einige dieser Verbindungen können innere Salze oder Zwitterionen bilden.
(c) Pharmazeutische Zusammensetzungen
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung des ersten Aspekts der Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfassen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung umfassen bevorzugt als Wirkbestandteil eine bevorzugte Verbindung des ersten Aspekts dieser Erfindung. Es werden aber alle pharmazeutischen Zusammensetzungen, die irgendeine der Verbindungen der Erfindung umfassen, berücksichtigt. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung umfassen auch einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können durch irgendeine Route verabreicht werden, einschließlich intravenös, intramuskulär, intraarteriell, intra medulär, intrathekal, intraventrikulär, transmucosal oder transdermal, subkutan, intraperitoneal, intranasal, enteral, sublingual, rektal oder über einen anderen Körperhohlraum, einschließlich Zäpfchen usw., topisch oder sie können oral verabreicht werden, aber nicht darauf beschränkt. Die Verabreichung kann akut sein oder mit Hilfe von Systemen mit gesteuerter Freisetzung, langsamer Freisetzung oder verzögerter Freisetzung erfolgen, einschließlich oral verabreichten, mit der Zeit freigesetzten Kapseln oder anderen Zuführungsmitteln, Depotverabreichung, Dauerkatheter, chronischer Verabreichung über ein transdermales Arzneimittelzufuhrpatch oder ein subdermales Implantat, so dass eine relativ konstante Dosierungskonzentration beibehalten wird. Siehe z.B. US 3710795 .
Formulierungen können wässrig, ölig oder emulgiert sein oder Lösungsmittel enthalten, die für die Verabreichungsweise geeignet sind, und es kann sich gegebenenfalls um Liposomformulierungen, Formulierungen, die zur Verabreichung des Arzneimittels über Mucosalmembranen ausgelegt sind, oder transdermale Formulierungen handeln. Geeignete Formulierungen für jedes dieser und anderer Verfahren zur Verabreichung, die in dieser Anmeldung erörtert werden, können z.B. in Gennaro, Hrsg., "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20. Aufl., 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, gefunden werden.
In Abhängigkeit von dem beabsichtigten Verabreichungsmodus können die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form von festen, halbfesten oder flüssigen Dosierungsformen sein, wie z.B. Tabletten, Zäpfchen, Pillen, Kapseln, Pulver, Flüssigkeiten, Suspensionen, Cremes, Salben, Lotionen oder dgl., bevorzugt in Einheitsdosierungsform, die für eine einzelne Verabreichung einer genauen Dosierung geeignet ist. Zusätzlich zu einer wirksamen Menge der Wirkbestandteile können die Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch annehmbare Exzipienten und Hilfsstoffe enthalten, welche die Verarbeitung der Wirkverbindungen zu Präparaten, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Wie hier verwendet bezieht sich der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbarer Exzipient" auf einen Exzipienten oder eine Mischung von Exzipienten, welche die Wirksamkeit der biologischen Aktivität der Wirkbestandteile nicht beeinträchtigen und für den Wirt, dem es verabreicht wird, nicht toxisch sind.
Überdies können die pharmazeutischen Zusammensetzungen andere pharmazeutische Mittel, Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Puffer usw. beinhalten. Die Verbindungen können daher oral, parenteral, transdermal, rektal, nasal, bukkal, topisch oder über ein implantiertes Reservoir in Dosierungsformulierungen, die übliche ungiftige pharmazeutisch annehmbare Träger, Adjuvantien und Vehikel enthält, verabreicht werden. Der Ausdruck "parenteral", wie hier verwendet, soll subkutane, intravenöse und intramuskuläre Injektion beinhalten.
Bei festen Zusammensetzungen beinhalten übliche ungiftige feste Träger z.B. pharmazeutisch geeignete(s) Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Cellulose, Sucrose, Magnesiumcarbonat usw. Flüssige pharmazeutisch verabreichbare Zusammensetzungen können z.B. durch Lösen, Dispergieren usw. einer Wirkverbindung wie hier beschrieben und gegebenenfalls von pharmazeutischen Adjuvantien in einem Exzipienten, wie z.B. Wasser, Kochsalzlösung, wässriger Dextrose, Glycerin, Ethanol usw., hergestellt werden, um dadurch eine Lösung oder Suspension zu bilden. Falls gewünscht kann die zu verabreichende pharmazeutische Zusammensetzung auch geringe Mengen von ungiftigen Hilfsstoffen enthalten, wie z.B. Benetzungsmittel oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel usw., z.B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminnatriumacetat, Triethanolaminoleat usw.
Zur oralen Verabreichung nimmt die Zusammensetzung im allgemeinen die Form einer Tablette oder Kapsel ein oder sie kann eine wässrige oder nicht wässrige Lösung, Suspension oder ein wässriger oder nicht wässriger Sirup sein. Tabletten und Kapseln sind bevorzugte orale Verabreichungsformen. Tabletten und Kapseln zur oralen Verwendung beinhalten im allgemeinen einen oder mehrere üblicherweise eingesetzte Träger, wie Lactose und Maisstärke. Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, werden auch typischerweise zugesetzt. Wenn flüssige Suspensionen verwendet werden, kann der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermitteln kombiniert werden. Falls gewünscht können Geschmacks-, Farb- und/oder Süßstoffe ebenfalls zugegeben werden. Andere optionale Komponenten zur Aufnahme in eine orale Formulierung beinhalten hier Konservierungsmittel, Suspendiermittel, Verdickungsmittel usw., sind aber nicht darauf beschränkt.
Die parenterale Verabreichung, falls verwendet, ist allgemein durch Injektion gekennzeichnet. injizierbare Formulierungen können in üblichen Formen hergestellt werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Form, die zur Solubilisierung oder Suspension in Flüssigkeit vor Injektion geeignet sind, oder als Emulsion. Bevorzugt werden sterile injizierbare Suspensionen gemäß den in der Technik bekannten Techniken unter Verwendung geeigneter Träger, Dispergier- oder Benetzungsmittel und Suspendiermittel formuliert. Die sterile injizierbare Formulierung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder eine Suspension in einem ungiftigen parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein. Zu den annehmbaren Vehikeln und Lösungsmitteln, die eingesetzt werden können, gehören Wasser, Ringer-Lösung und isotone Natriumchlorid-Lösung. Außerdem werden sterile nicht flüssige Öle, Fettsäureester oder Polyole gewöhnlich als Lösungsmittel oder Suspendiermedien verwendet.
Die Verbindungen der Erfindung können durch die Haut unter Verwendung herkömmlicher transdermaler Arzneimittelzufuhrsysteme, d.h. transdermaler "Patches" zugeführt werden, worin das Mittel typischerweise in einer Laminatstruktur enthalten ist, die als Arzneimittelzufuhrvorrichtung dient und an der Haut zu befestigen ist. In einer solchen Struktur ist die Arzneimittelzusammensetzung typischerweise in einer Schicht oder einem "Reservoir", die der unteren Rückseitenschicht unterlegt ist, enthalten. Die Laminatvorrichtung kann ein einzelnes Reservoir enthalten oder sie kann mehrere Reservoirs enthalten. In einer Ausführungsform umfasst das Reservoir eine Polymermatrix von einem pharmazeutisch annehmbaren Kontaktklebstoff, das zur Befestigung des Systems an die Haut während der Arzneimittelzufuhr dient. Beispiele für geeignete Hautkontaktklebstoffe beinhalten Polyethylene, Polysiloxane, Polyisobutylene, Polyacrylate, Polyurethane usw., sind aber nicht darauf beschränkt. Alternativ sind das das Arzneimittel enthaltende Reservoir und der Hautkontaktklebstoff als gesonderte und unterschiedliche Schichten vorhanden, wobei der Klebstoff unter dem Reservoir liegt, welches in diesem Fall entweder eine wie vorstehend beschriebene Polymermatrix oder eine Flüssigkeit oder ein Hydrogelreservoir oder irgendeine andere Form sein kann.
Alternativ können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung in Form von Zäpfchen zur rektalen Verabreichung verabreicht werden. Diese können durch Mischen des Mittels mit einem geeigneten nicht reizenden Exzipienten, der bei Raumtemperatur fest ist, aber bei Rektaltemperatur flüssig ist, und daher im Rektum zur Freisetzung des Arzneimittels schmilzt, hergestellt werden. Solche Materialien beinhalten Kakaobutter, Bienenwachs und Polyethylenglycole.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können auch durch Nasalaerosol oder Inhalation verabreicht werden. Solche Zusammensetzungen werden gemäß den Techniken hergestellt, die auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierung gut bekannt sind und sie können als Lösungen in Kochsalzlösung, unter Einsatz von Benzylalkohol oder anderen geeigneten Konservierungsmitteln, Absorptionsförderungsmitteln zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit, Treibmitteln, wie Fluorkohlenstoffen oder Stickstoff, und/oder anderen herkömmlichen Solubilisier- oder Dispergiermitteln hergestellt werden.
Bevorzugte Formulierungen für die topische Arzneimittelzufuhr sind Salben und Cremes. Salben sind halbfeste Präparate, die typischerweise auf Petrolat oder einem anderen Petroleumderivat basieren. Cremes, die den ausgewählten Wirkstoff enthalten, sind wie in der Technik bekannt viskose flüssige oder halbfeste Emulsionen, entweder Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl. Creme-Grundlagen sind mit Wasser abwaschbar und enthalten eine Ölphase, einen Emulgator und eine wässrige Phase. Die Ölphase, manchmal auch als "innere" Phase bezeichnet, umfasst im allgemeinen Petrolat und einen Fettalkohol, wie Cetyl- oder Stearylalkohol; die wässrige Phase übertrifft gewöhnlich, aber nicht notwendigerweise die Ölphase im Volumen und enthält im allgemeinen ein Feuchthaltemittel. Der Emulgator in einer Creme-Formulierung ist im allgemeinen ein nicht-ionisches, anionisches, kationisches oder amphoteres Tensid. Die spezielle Salben- oder Creme-Grundlage, die zu verwenden ist, ist eine, die eine optimale Arzneimittelzufuhr liefert, wie dem Fachmann verständlich ist. Wie bei anderen Trägern oder Vehikeln sollte eine Salbengrundlage inert, stabil, nicht reizend und nicht sensibilisierend sein.
Formulierungen für die bukkale Verabreichung beinhalten Tabletten, Pastillen, Gele usw. Alternativ kann eine bukkale Verabreichung unter Verwendung eines transmucosalen Zufuhrsystems erfolgen, wie es den Fachleuten bekannt ist.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können als Lösungen, als gefriergetrocknete Pulver für die parenterale Verabreichung formuliert werden. Pulver können durch Zugabe eines geeigneten Verdünnungsmittels oder eines anderen pharmazeutisch annehmbaren Trägers vor dem Gebrauch wiederhergestellt werden. Die flüssige Formulierung ist im allgemeinen eine gepufferte, isotone, wässrige Lösung. Beispiele für geeignete Verdünnungsmittel sind normale isotone Kochsalzlösung, 5% Dextrose in Wasser oder gepufferte Natrium- oder Ammoniumacetatlösung. Diese Formulierungen sind besonders für die parenterale Verabreichung geeignet, können aber auch für die orale Verabreichung verwendet werden. Es kann zweckmäßig sein, Exzipienten, wie Polyvinylpyrolidinon, Gelatine, Hydroxycellulose, Akaziengummi, Polyethylenglycol, Mannit, Natriumchlorid oder Natriumcitrat, zuzusetzen. Alternativ können diese Verbindungen verkapselt, tablettiert oder in einer Emulsion oder einem Sirup zur oralen Verabreichung zubereitet werden. Pharmazeutisch annehmbare feste oder flüssige Exzipienten können zugegeben werden, um die Zusammensetzung zu verbessern oder zu stabilisieren oder um die Herstellung der Zusammensetzung zu erleichtern. Flüssige Exzipienten beinhalten Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Glycerin, Kochsalzlösung, Alkohol und Wasser. Feste Exzipienten beinhalten Stärke, Lactose, Calciumsulfatdihydrat, Kaolin, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talkum, Pektin, Akaziengummi, Agar oder Gelatine. Der Exzipient kann auch ein Material zur verzögerten Freisetzung, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder mit einem Wachs enthalten. Die Menge des festen Exzipienten variiert, liegt aber bevorzugt zwischen etwa 20 mg bis etwa 1 g pro Dosierungseinheit. Die pharmazeutischen Zubereitungen werden gemäß den üblichen Techniken der Pharmazie, einschließlich Vermahlen, Mischen, Granulieren und Komprimieren, falls notwendig, für Tablettenformen; oder Vermahlen, Mischen und Füllen für Hartgelatinekapselformen hergestellt. Wenn ein flüssiger Exzipient verwendet wird, liegt die Zubereitung in Form von Sirup, Elixier, Emulsion oder wässriger oder nicht wässriger Suspension vor. Eine derartige flüssige Formulierung kann direkt oral verabreicht werden oder in eine Weichgelatinekapsel gefüllt werden.
Die pharmazeutische Formulierung kann zusätzlich einen oder mehrere pharmazeutische Wirkstoffe neben einer Verbindung der Erfindung enthalten. Diese zusätzlichen Wirkstoffe sind typischerweise zur Verhinderung oder Behandlung von Autoimmun-, Infektions- oder malignen Krankheitszuständen oder zur Verbesserung der Behandlung dieser Störungen durch Verbindungen der Erfindung geeignet.
Einige spezielle Beispiel für geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen werden nachstehend in den Beispielen beschrieben.
Typischerweise wird eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einem Behälter mit einem Etikett oder Instruktionen oder beidem verpackt, welche die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, Infektionskrankheiten, malignen Erkrankungen, wie autoimmunem lymphoproliferativem Syndrom, autoimmuner Schilddrüsenerkrankung, Hypereosinophilie, viraler Hepatitis, Dickdarmkarzinomen, Brustkarzinomen, Prostatakrebs, Neuroblastomen, Gliomen oder anderem Krebs oder einer anderen Erkrankung.
(c) Verwendungen der Verbindungen der Erfindung
Die Verbindungen der Erfindung sind zur Stimulierung von Fas-vermittelter Apoptose wirksam, wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt. Die Stimulierung von Fasvermittelter Apoptose eignet sich z.B. bei der Behandlung und Handhabung von Patienten mit Autoimmun-, Infektions- oder malignen Erkrankungen. Insbesondere beinhalten Beispiele für die Verwendungen der Verbindungen die Behandlung von dem autoimmunen lymphoproliferativen Syndrom, der autoimmunen Schilddrüsenerkrankung, von Hypereosinophilie, viraler Hepatitis, Dickdarmkarzinomen, Brustkarzinomen, Prostatakrebs, Neuroblastomen, Gliomen und anderen Krebsarten und Erkrankungen.
Daher können die Verbindungen der Erfindung zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung in einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Erfindung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung davon an den Säuger verwendet werden. Gegebenenfalls kann dies ferner die Behandlung des Säugers mit einer üblichen Therapieform für eine Autoimmunerkrankung, wie der Verabreichung eines üblichen Immunsupressors, umfassen. Alternativ können die Verbindungen der Erfindung dem Säuger in Verbindung mit einem entzündungshemmenden Mittel oder einer anderen herkömmlichen Behandlung für die Symptome dieser Autoimmunerkrankung, z.B. wenn die Erkrankung rheumatoide Arthritis ist, verabreicht werden. Die Gesamtmenge der Kombination von Arzneimitteln, die dem Säuger verabreicht werden, muss eine therapeutisch wirksame Menge sein, obwohl die Menge von jedem der einzelnen Arzneimittel selbst suboptimal für die therapeutischen Zwecke sein kann.
Die Verbindungen der Erfindung können auch zur Behandlung von Infektionen in einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Erfindung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung davon, an den Säuger verwendet werden. Dies kann gegebenenfalls ferner die Behandlung des Säugers mit einer üblichen Form der Infektionstherapie umfassen. Zum Beispiel können auch ein antivirales, antibakterielles oder fungizides Mittel dem Säuger verabreicht werden. Die Gesamtmenge der Kombination von Arzneimitteln, die dem Säuger verabreicht werden, müssen eine therapeutisch wirksame Menge sein, obwohl die einzelnen Mengen von jedem der einzelnen Arzneimittel selbst suboptimal für therapeutische Zwecke sein können.
Die Verbindungen der Erfindung können auch zur Behandlung von Malignität in einem Säuger, bevorzugt einem Menschen, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Erfindung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung davon an den Säuger verwendet werden. Wiederum kann wie bei den anderen Behandlungsverfahren dieses Verfahren ferner die Behandlung des Säugers mit einer herkömmlichen Therapieform für Malignität umfassen, wie die Verabreichung eines chemotherapeutischen Antikrebsmittels an den Säuger. Die Gesamtmenge der Kombination von Arzneimitteln, die dem Säuger verabreicht werden, muss eine therapeutisch wirksame Menge sein, obwohl die einzelnen Mengen von jedem der einzelnen Arzneimittel selbst supoptimal für therapeutische Zwecke sein kann.
Die Verbindungen der Erfindung oder die pharmazeutischen Zusammensetzungen davon werden daher zur Stimulierung der Fas-vermittelten Aproptose in Säugern, die eine solche Behandlung benötigen, verwendet, indem eine therapeutisch wirksame Menge der ausgewählten Verbindung, bevorzugt dispergiert in einem pharmazeutischen Träger, verabreicht wird. Therapeutisch wirksame Mengen von Verbindungen der Erfindung liegen im Bereich von 0,01 bis 1.000 mg/kg, bevorzugt 0,01 bis 100 mg/kg und bevorzugter 1 bis 30 mg/kg, und geeignete Dosen werden vom Fachmann in Abhängigkeit von der Verabreichungsroute, dem Alter und dem Zustand des Patienten ohne weiteres ermittelt. Die Dosierungseinheiten können bis zu 1 bis 10 Mal täglich für akute oder chronische Erkrankung verabreicht werden. Es werden keine nicht annehmbaren toxikologischen Wirkungen erwartet, wenn Verbindungen der Erfindung gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht werden.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird die Fas-vermittelte Apoptose durch Kontaktieren einer Zelle mit einem Fas-Rezeptor mit einer Verbindung der Erfindung in einer ausreichenden Menge, um die Fas-vermittelte Apoptose zu stimulieren, stimuliert. In einem solchen Fall wird die Kontaktierung in vivo durch Verabreichung der Verbindung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung davon an einen die Zelle enthaltenden Säuger bewirkt; und in vitro durch Zugabe der Verbindung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung davon in einen Behälter, in dem die Zelle vorhanden ist, oder in eine Lösung, in der die Zelle badet.
Es hat sich erwiesen, dass die Verbindungen der Erfindung Fas-vermittelte Apoptose stimulieren und bei der Behandlung von autoimmunen, infektiösen und malignen Zuständen geeignet sein können. In ähnlicher Weise können andere Verbindungen, welche die gleichen Wirkungen bei Fas-vermittelter Apoptose zeigen, für die Behandlung von autoimmunen, infektiösen und malignen Zuständen geeignet sein. Die in dieser Anmeldung offenbarten Verbindungen können als Modelle zur Auffindung anderer neuer Mittel verwendet werden, die eine Stimulierung der Fasvermittelten Apoptose bewirken. Die Schritte in einem Verfahren, bei dem diese Verbindungen eingesetzt werden können, um neue therapeutische Mittel zu entdecken, können wie folgt erreicht werden: Die Verbindungen können zur Validierung, Optimierung und Standardisierung von Assays eingesetzt werden, die zur Entdeckung von anderen Verbindungen, die Fas-vermittelte Apoptose stimulieren und die Fas-vermittelte Apoptose durch Wirkung am Fas-Rezeptor stimulieren, eingesetzt werden. Diese Verbindungen können als Bezugspunkte eingesetzt werden, um andere Mittel zu entdecken, die verbesserte Aktivität in Assays zeigen, bei denen:

1. der Fas-Rezeptor aktiviert/stimuliert wird;
2. der Fas-Rezeptor blockiert wird;
3. die Fas-vermittelte Apoptose stimuliert wird;
4. die Fas-vermittelte Regulierung der Zellproliferation beeinflusst wird;
5. die Fas-vermittelte Regulierung der Immunantwort beeinflusst wird; und/oder
6. die Fas-vermittelte Regulierung der Infektion beeinflusst wird.

Ein Verfahren zur Entdeckung von Mitteln, die eine verbesserte Aktivität in Assays zeigen, die den Fas-Rezeptor aktivieren/stimulieren, den Fas-Rezeptor blockieren, die Fas-vermittelte Apoptose stimulieren oder bei denen die Fasvermittelte Regulierung der Zellproliferation, die Immunantwort und/oder Infektion beeinflusst wird, umfasst die Schritte der Erzielung der Ergebnisse von einem Assay für die Fas-vermittelte Apoptose in Anwesenheit einer Mehrzahl von Konzentrationen von einer Verbindung der Erfindung, der Erzielung der Ergebnisse des Assays in Anwesenheit einer Mehrzahl von Konzentrationen einer Testverbindung, des Vergleichs der Ergebnisse der Assays und der Identifizierung als Mittel, das eine verbesserte Aktivität in Assays zeigt, welche die Wechselwirkung mit dem Fas-Rezeptor messen oder nachweisen, bei denen die Fas-vermittelte Apoptose stimuliert wird oder bei denen die Fas-vermittelte Regulierung der Zellproliferation, der Immunantwort und/oder von Infektion beeinflusst wird, bei einer Testverbindung, von der die in dem Assay erhaltenen Ergebnisse im Vergleich zu den mit der Verbindung der Erfindung erhaltenen Ergebnisse verbessert sind.
Algorithmen können verwendet werden, um Strukturen oder chemische Eigenschafen von Verbindungen, wie beispielhafte Verbindungen oder andere Testverbindungen, zu vergleichen. Algorithmen können auch verwendet werden, um Strukturen oder chemische Eigenschaften in Bibliotheken von Testverbindungen zu vergleichen. Auf diese Weise können, wenn von beispielhaften Verbindungen oder Testverbindungen bekannt ist, dass sie bestimmte Strukturen, Eigenschaften oder Aktivitäten von Interesse aufweisen, Verbindungen eingesetzt werden, um andere Verbindungen oder Mittel zu entdecken, die auch solche Strukturen, Eigenschaften oder Aktivitäten haben. Zum Beispiel kann eine Aktivität von Interesse eine gewünschte Aktivität in einem Bioassay sein. Derartige Algorithmen sind bekannt; zum Beispiel beschreiben US 5567317 und US 5587293 Verfahren zur Bestimmung der Reaktivitäten von Verbindungskandidaten mit Zielgruppen oder -rezeptoren. Es kann eine Formel, die die Reaktivität mit dem Zielrezeptor vorhersagt, aus einem Referenzsatz von Rezeptoren oder einem Verzeichnis von Verbindungen erhalten werden, die sich bezüglich bestimmter Eigenschaften systematisch unterscheiden. Auf diese Weise zu prüfende Verbindungen können bezüglich der Referenzrezeptoren technisch bewertet werden, die Formel kann eingesetzt werden und die erwartete Reaktivität mit dem tatsächlichen Zielrezeptor kann vorhergesagt werden. Das Verfahren aus US 5587293 benötigt kein physisches Vorhandensein des Rezeptors.
Die Verwendung solcher Algorithmen, die Strukturen oder chemische Eigenschaften vergleichen und/oder Strukturen oder chemische Eigenschaften innerhalb von Bibliotheken von Testverbindungen abgleichen, ist effektiv für die Entdeckung von Mitteln, die Aktivität in Bioassays zeigen. Solche Bioassays beinhalten Bioassays, um die Wechselwirkung mit dem Fas-Rezeptor, die Blockade des Fas-Rezeptors, die Fas-vermittelte Apoptose, die Aktivierung der Fas-vermittelten Apoptose, die Stimulierung der Fas-vermittelten Apoptose und Wirkungen auf die Fas-vermittelte Regulierung von Zellproliferation, die Fas-vermittelte Regulierung der Immunreaktion und die Fas-vermittelte Regulierung der Infektion nachzuweisen und zu messen.
Bei Kombination mit Algorithmen, die Strukturen oder chemische Eigenschaften vergleichen und/oder Strukturen oder chemische Eigenschaften innerhalb von Bibliotheken von Testverbindungen abgleichen, können diese Verbindungen außerdem eingesetzt werden, um Mittel zu entdecken, die Aktivität in Bioassays zeigen, bei denen:

Ein Verfahren zur Feststellung von Mitteln, die Aktivität in Bioassays zeigen, bei denen der Fas-Rezeptor aktiviert/stimuliert wird, bei denen der Fas-Rezeptor blockiert wird, bei denen die Fas-vermittelte Apoptose stimuliert wird oder bei denen die Fas-vermittelte Regulierung der Zellproliferation, der Immunreaktion und/oder der Infektion beeinflusst wird, umfasst das Anwenden eines Algorithmus zum Vergleich der chemischen Strukturen oder chemischen Eigenschaften innerhalb einer Bibliothek von Testverbindungen mit der chemischen Struktur oder den chemischen Eigenschaften einer Verbindung der Erfindung und die Identifizierung als ein Mittel, das Aktivität in Bioassays zeigt, bei denen der Fas-Rezeptor aktiviert/stimuliert wird, bei denen der Fas-Rezeptor blockiert wird, bei denen die Fas-vermittelte Apoptose stimuliert wird oder bei denen die Fas-vermittelte Regulierung der Zellproliferation, der Immunantwort und/oder der Infektion beeinflusst wird, wobei durch den Algorithmus festgestellt wird, dass eine Verbindung eine chemische Struktur oder chemische Eigenschaften aufweist, die denen der Verbindung der Erfindung ähnlich sind.
Algorithmen können auch zum Vergleich von Strukturen oder zum Abgleich von Strukturen zum Zweck der Modellierung von molekularen Wechselwirkungen verwendet werden. Solche Algorithmen sind bekannt; zum Beispiel können die Verfahren von US 5567317 und US 5587293 eingesetzt werden, um zum Zweck der Modellierung von molekularen Wechselwirkungen Strukturen zu vergleichen und/oder Strukturen abzugleichen.
Die Verwendung solcher Algorithmen ist effektiv, um Mittel zu ermitteln, die Aktivität in Bioassays zeigen, wie Bioassays, um Wechselwirkung mit dem Fas Rezeptor, die Blockade des Fas-Rezeptors, die Fas-vermittelte Apoptose, die Aktivierung von Fas-vermittelter Apoptose, die Stimulierung von Fas-vermittelter Apoptose und Wirkungen auf die Fas-vermittelte Regulierung von Zellproliferation, Fas-vermittelter Regulierung der Immunantwort und Fas-vermittelter Regulierung von Infektion nachzuweisen und zu messen.
Bei Kombinationen mit Algorithmen, die zur Modellierung von molekularen Wechselwirkungen Strukturen vergleichen und/oder Strukturen abgleichen, können diese Verbindungen ferner eingesetzt werden, um Mittel zu entdecken, die Aktivität in Bioassays zeigen, bei denen:

Ein Verfahren zur Entdeckung von Mitteln, die Aktivität in Bioassays zeigen, bei denen der Fas-Rezeptor aktiviert/stimuliert wird, bei denen der Fas-Rezeptor blockiert wird, bei denen die Fas-vermittelte Apoptose stimuliert wird oder bei denen die Fas-vermittelte Regulierung der Zellproliferation, der Immunantwort und/oder der Infektion beeinflusst wird, umfasst das Anwenden eines Algorithmus zum Vergleichen und/oder Abgleichen der chemischen Strukturen innerhalb einer Bibliothek von Testverbindungen mit der chemischen Struktur einer Verbindung der Erfindung zur Modellierung von molekularen Wechselwirkungen und das Identifizieren als ein Mittel, das den Fas-Rezeptor aktiviert/stimuliert, das den Fas-Rezeptor blockiert, das die Fas-vermittelte Apoptose stimuliert und das die Fas-vermittelte Regulierung der Zellproliferation, der Immunantwort und/oder von Infektion beeinflusst, wobei durch den Algorithmus bestimmt wird, dass eine Testverbindung eine chemische Struktur aufweist, die vergleichbar mit der Verbindung der Erfindung ist oder zu ihr passt.
Außerdem beinhalten die Verfahren der Erfindung ein Verfahren zur Validierung, Optimierung oder Standardisierung eines Bioassays. Dieses Verfahren umfasst

(a) das zur Verfügung stellen einer Verbindung der Erfindung für einen Bioassay; und
(b) das Validieren, Optimieren oder Standardisieren des Bioassays durch die Aktivität der Verbindung im Bioassay.

BEISPIELE
Die folgenden Beispiele veranschaulichen diese Erfindung und sollen in keiner Weise den Umfang der Erfindung begrenzen.
Die Verbindungen der Erfindung werden hergestellt durch übliche Verfahren der organischen Chemie und viele Verfahren zur Synthese von substituierten Harnstoffen sind in der Technik wohlbekannt. Siehe z.B. Larock "Comprehensive Organic Transformations", Wiley-VCH, New York NY. In einigen Fällen können Schutzgruppen eingeführt und später entfernt werden. Geeignete Schutzgruppen für Amino-, Hydroxyl- und Carboxylgruppen sind in Green et al., "Protective Groups in Organic Synthesis", 2. Aufl., 1991, John Wiley and Sons, New York NY beschrieben. Die Verbindungen dieser Erfindung können wie in den folgenden Beispielen gezeigt oder durch Modifizierung der veranschaulichten Beispiele durch den Fachmann bekannte Mittel hergestellt werden.
Eine typische Synthese, die sowohl für symmetrische als auch unsymmetrische Diarylharnstoffe zweckmäßig ist, ist in nachstehendem Reaktionsschema 1 gezeigt. Die Reaktion von einem Isocyanat 2 (zweckmäßigerweise hergestellt durch Reaktion eines ersten Amins 1 und Phospgen in einer basischen Lösung) mit einem zweiten Amin 3 in einer basischen Lösung liefert Harnstoff 4. In diesem Schema können X¹ und X² jeweils gleich oder unterschiedlich sein und in ähnlicher Weise können Y¹ und Y² jeweils gleich oder verschieden sein. Reaktionssschema 1
BEISPIEL 1. 1-(4-Chlor-3-cyanophenyl)-3-(4-chlor-3-nitrophenyl)harnstoff
Eine Lösung von 3-Nitro-4-chloranilin (2 g) in 50 ml Benzol und 5 ml Triethylamin wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung von 20% Gew./Gew. Phosgen in Toluol (6 g) und 10 ml Benzol bei 5°C zugegeben. Nach Vervollständigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur aufgewärmt und der Rührvorgang wurde 3 h fortgesetzt, um das Isocyanat zu bilden; dann wurden 2,1 g 3-Cyano-4-chloranilin in 10 ml Benzol tropfenweise zu der Isocyanatlösung gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 65°C gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 100 ml Diethylether wurden zugegeben, um das Produkt und Aminsalze auszufällen. Die Aufschlämmung wurde unter Verwendung eines Sinterfilters filtriert und mit Diethylether gewaschen. Die Feststoffe wurden erneut mit Wasser aufgeschlämmt und mit Wasser, 10% Salzsäure (zweimal) und destilliertem Wasser (dreimal) gewaschen. Das Produkt wurde an Luft getrocknet, um 2,9 g (72%) von 1-(4-Chlor-3-cyanophenyl)-3-(4-chlor-3-nitrophenyl)harnstoff zu ergeben.
Wie in Reaktionschema 2 gezeigt können symmetrische Harnstoffe zweckmäßigerweise hergestellt werden durch Behandlung eines Isocyanats 5 (welches natürlich aus einem Amin wie vorstehend beschrieben hergestellt worden ist) mit Wasser zur Hydrolyse von einem Teil des Isocyanats zurück zum Amin, woraufhin die anschließende Kondensation des Amins mit dem verbleibenden Isocyanat den geeigneten symmetrischen Harnstoff 6 ergibt. Reaktionsschema 2
BEISPIEL 2. 1,3-Bis(4-chlor-3-nitrophenyl)harnstoff
Eine Lösung von 3-Nitro-4-chloranilin (2 g) in 50 ml Benzol, 5 ml Pyridin und 100 mg 4-Dimethylaminopyridin wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung von 20% Gew./Gew. Phosgen in Toluol (6 g) und 10 ml Benzol bei 5°C zugegeben. Nach Vervollständigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur erwärmt und der Rührvorgang wurde 3 h fortgesetzt. Diese Lösung wurde dann zu einer gerührten Mischung von 200 ml Diethylether, 0,5 ml Pyridin und 100 mg Wasser zugegeben und über Nacht gerührt. Zusätzliche 10 ml Wasser wurden zugegeben und der Rührvorgang wurde eine weitere Stunde fortgesetzt. Der sich ergebende Niederschlag wurde mit einem Sinterfilter filtriert und mit Diethylether gewaschen. Die Feststoffe wurden erneut mit Wasser aufgeschlämmt und mit Wasser, 10% Salzsäure (zweimal) und destilliertem Wasser (bis das Waschwasser einen neutralen pH aufwies) gewaschen. Das Produkt wurde dann luftgetrocknet, um 0,97 g (47%) 1,3-Bis(4-chlor-3-nitrophenyl)harnstoff zu ergeben.

Die nachstehende Tabelle zeigt anschauliche Beispiele von Verbindungen der Erfindung.

Verbindung Nr.	X¹	X²	Y¹	Y²
1	Cl	Cl	NO₂	NO₂
2	F	F	NO₂	NO₂
3	Br	Br	NO₂	NO₂
4	Cl	Cl	CN	CN
5	F	F	CN	CN
6	Br	Br	CN	CN
7	Cl	Cl	SO₂CF₃	SO₂CF₃
8	F	F	SO₂CF₃	SO₂CF₃
9	Br	Br	SO₂CF₃	SO₂CF₃
10	Cl	Cl	SO₂CH₃	SO₂CH₃
11	F	F	SO₂CH₃	SO₂CH₃
12	Cl	Cl	SO₂Ph	SO₂Ph
13	F	F	SO₂Ph	SO₂Ph
14	F	Cl	CN	CN
15	F	Cl	NO₂	NO₂
16	Br	Cl	NO₂	NO₂
17	F	Cl	SO₂CH₃	SO₂CH₃
18	F	F	COCH₃	COCH₃
19	Cl	Cl	COCH₃	COCH₃
20	F	F	CONHCH₃	CONHCH₃
21	Cl	F	CON(CH₃)₂	CON(CH₃)₂
22	Cl	Cl	CON(CH₃)₂	COCH₃
23	Br	Cl	NO₂	CN
24	F	F	NO₂	CN
25	F	Cl	NO₂	CN
26	Cl	F	NO₂	CN
27	Cl	Cl	COCH₃	CN
28	Cl	Cl	COCH₃	NO₂
29	F	Cl	COCH₃	NO₂
30	Cl	Cl	SO₂CF₃	NO₂
31	Cl	F	SO₂CF₃	SO₂CH₃

Verbindung Nr.	X¹	X²	Y¹	Y²
32	Cl	F	SO₂CF₃	NO₂
33	Cl	F	SO₂CF₃	CN
34	F	F	SO₂CH₃	NO₂
35	Cl	Cl	SO₂CH₃	NO₂
36	F	Cl	SO₂CH₃	NO₂
37	Cl	Cl	COPh	NO₂
38	F	Cl	SO₂Ph	NO₂
39	F	F	SO₂Ph	NO₂
40	Cl	Cl	SO₂Ph	NO₂
41	F	Cl	SO₂Ph	CN
42	F	F	SO₂Ph	NO₂
43	F	Cl	SO₂Ph	SO₂Ph
44	Cl	F	CON(CH₃)₂	NO₂
45	F	F	CON(CH₃)₂	NO₂
46	Cl	Cl	CON(CH₃)₂	NO₂
47	Cl	Br	CON(CH₃)₂	NO₂
48	OSO₂CF₃	OSO₂CF₃	NO₂	NO₂
49	OSO₂CH₃	Cl	NO₂	NO₂
50	OSO₂CF₃	F	NO₂	NO₂

BEISPIEL 3. Fas-vermittelte Apoptose
Assays für Fas-abhängige Apoptose sind in der Technik bekannt. Siehe z.B. Ruiz-Ruiz et al., Cell Death Diff. 6:271 (1999); und Muller et al., J. Exp. Therap. 188:2033 (1998).
Apoptose wird durch Nachweis des für den apoptotischen Zelltod charakteristischen DNA-Fragmentierungsmusters identifiziert. In diesem Beispiel wird die Apoptose durch FACS^®-Analyse gemessen, die in einem FACScan^®-Durchfluss-Zytometer (Becton Dickinson) unter Verwendung von CellQuest-Software durchgeführt. Die Quantifizierung der DNA-Fragmentierung erfolgt durch FACS^®-Analyse von Propidiumiodid-verschmutzten Kernen, wie in Nicolletti et al., J. Immunol. Methods 139:271–279 (1991) beschrieben. Im Kulturmedium schwebende Hepatozyten werden durch Zentrifugieren bei 200 g gesammelt. Haftende Hepatozyten werden durch Inkubierung mit 1% Trypsin für 1 min gesammelt. Die Zellen wurden in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, in hypotonem Lysispuffer (0,1% Natriumcitrat, 0,1% Triton X und 50 ng/ml Propidiumiodid) (Sigma) suspendiert und bei 4°C 6 h inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Durchfluss-Zytometrie auf den DNA-Gehalt analysiert.
Frühe apoptotische Änderungen werden mit Annexin V-Fluos (Boehringer Mannheim) identifiziert, das sich an Phosphatidylserinmoleküle (PS) bindet, die an apoptotischen Zellmembranen, aber nicht an normalen Zellmembranen freigelegt sind (PS ist normalerweise auf dem inneren Blatt der Zellmembran-Doppelschicht begrenzt). Propidiumiodid wird verwendet, um nekrotische Zellen von den positiv Annexin V-verschmutzten Zellclustern zu unterscheiden. Die Zellen werden typsiniert, mit PBS gewaschen, bei 200 g für 5 min zentrifugiert und erneut in 100 μl HEPES-Puffer (10 ml HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 5 mM CaCl₂) und 20 μl Propidiumiodid suspendiert. Die Zellen werden 10 bis 15 min inkubiert und an einem Durchfluss-Zytometer unter Verwendung von CellQuest-Software analysiert. Die Anregungswellenlänge bei 488 nm und ein Sperrfilter bei 560 nm werden zum Nachweis von Propidiumiodid verwendet.
Verbindung 3 zeigt die Stimulierung von Fas-abhängiger Apoptose bei 10 μM.
BEISPIEL 4. Stimulierung von Fas-vermittelter Apoptose
Anti-Human-Fas-Antikörper h-HFE7A humanisierter Antikörper wurde von Sankyo Co., Ltd. erhalten. Dieser Antikörper führt Apoptose herbei, wenn er in vitro mit sekundärem Antikörper vernetzt wird.
Proben von humanem Synovium wurden von Patienten mit rheumatoider Arthritis bei einem chirurgischen Ersatz des vollständigen Knies oder bei einer Synoviektomie erhalten. Synoviales Gewebe wurde in kleine Stücke zerhackt und mit Kollagenase verdaut und in Ham F12-Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum (F10F) ergänzt war, in einer angefeuchteten 5% CO₂-Atmosphäre bei 37°C kultiviert. Anhaftende Zellen wurden als Synoviozyten angesehen und in F10F kultiviert.
Die Zellentwicklungsfähigkeit wurde mit dem in Cancer Res. 48:4827 (1988) beschriebenen XTT-Verfahren bestimmt. 96 flache Muldenplatten wurden mit Anti-Human IgG vorbeschichtet. h-HFE7A (1.000 ng/ml) und/oder 10 μM einer Verbindung der Erfindung wurden zugegeben und 2 h inkubiert. Synoviozyten wurden geimpft (10.000/Mulde) und 16 h inkubiert. Mulden für den Hintergrund erhielten nur Kulturmedium. XTT (2,3-Bis[2-methoxy-4-nitrosulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilid), Endkonzentration 200 μg/ml, und Phenazinmethosulfat, Endkonzentration 5 μM, wurden zu jeder Mulde gegeben und es wurde weitere 4 h inkubiert. Die Extinktion bei 450 nm wurde gemessen und die Zellentwicklungsfähigkeit wurde folgendermaßen bestimmt:
Die Verstärkung der Fas-vermittelten Apoptose durch Verbindungen der Erfindung wurde durch den Stimulationsindex (SI) bestimmt:
Ein SI über 2,0 wurde als positiv angesehen.
Verbindung 3 war in diesem Assay bei 10 μM positiv.
BEISPIEL 5. Expression des Fas-Rezeptors
Die Expression des Fas-Rezeptors wird durch das Verfahren von Muller et al., J. Exp. Med. 188:2033–2045 (1998) gemessen. Ein FACScan^®-Durchfluss-Zytometer (Becton Dickinson) unter Verwendung von CellQuest-Software wird zur Bestimmung der prozentualen Verstärkung der Fas-Rezeptor-Expression verwendet. Der Antikörper Anti-APO-1 (IgG3), der für den Fas-Rezeptor spezifisch ist, wird als gereinigter biotinylierter Antikörper verwendet. Quantum Red Streptavidin (Sigma) wird als sekundäres Reagenz für die indirekte Immunofluoreszenz verwendet. Hepatomazellen werden in 50 μl Kulturmedium mit biotinyliertem Anti-APO-1 inkubiert. Nach 30-minütiger Inkubierung werden die Zellen zweimal gewaschen, 30 min mit Quantum Red Streptavidin inkubiert, wiederum zweimal gewaschen und überprüft. Bei Datensammlung wird eine Eingrenzung an intakten Zellen durch Vorwärts/Seiten-Streuungsanalyse eingestellt und es werden 10⁴ lebensfähige Zellen analysiert. Die prozentuale Verstärkung der Fas-Rezeptor-Expression wird als Differenz zwischen % Fas-Rezeptor, der in behandelten Zellen nachgewiesen wird, und % Fas-Rezeptor, der in Kontrollzellen nachgewiesen wird, gemäß der folgenden Formel berechnet: Verstärkte Fas-Rezeptor-Expression (%) = (% Fas-Rezeptor in behandelten Zellen – % Quantum Red in behandelten Zellen) – (% Fas-Rezeptor in Kontrollzellen – % Quantum Red in Kontrollzellen)
Es wurde festgestellt, dass Verbindungen der Erfindung die Fas-Rezeptor-Expression verstärken.
BEISPIEL 6. Herstellung orale pharmazeutische Zusammensetzung – feste Dosierungsformulierung
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur oralen Verabreichung wird durch Vereinen der folgenden Bestandteile hergestellt:

% Gew./Gew.

Verbindung der Erfindung 10%

Magnesiumstearat 0,5%

Stärke 2,0%

Hydroxypropylmethylcellulose 1,0%

mikrokristalline Cellulose 86,5%
Die Mischung wird in einer Presse komprimiert, um Tabletten zu bilden. Alternativ wird die Mischung stattdessen in Hartgelatinekapseln gefüllt.
Tabletten können durch Aufbringen einer Suspension von Filmbildner (z.B. Hydroxypropylmethylcellulose), Pigment (z.B. Titandioxid) und Weichmacher (z.B. Diethylphthalat) und Trocknen des Films durch Verdampfung des Lösungsmittels beschichtet werden. Dieser Überzug weist typischerweise zwischen 2% und 6% der Tabletten, bezogen auf das Gewicht, auf, z.B. 3 Gew.-%.
Tabletten, die Verbindungen der Erfindung umfassen, die durch die Verfahren dieses Beispiels hergestellt werden, eignen sich zur oralen Verabreichung und sind bei der Verbesserung der Fas-vermittelten Apoptose und zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, Infektionskrankheiten und Malignität wirksam.
BEISPIEL 7. Herstellung einer oralen pharmazeutischen Zusammensetzung – Weichgel
Eine pharmazeutische Zusammensetzung einer Verbindung der Erfindung, die zur oralen Verabreichung geeignet ist, wird durch Vereinen der folgenden Bestandteile hergestellt:

% Gew./Gew.

Verbindung der Erfindung 20%

Polyethylenglycol 80%
Die Verbindung wird in einem flüssigen Träger dispergiert oder gelöst und gegebenenfalls wird ein Verdickungsmittel zugegeben. Die Formulierung wird dann in eine Weichgelatinekapsel eingehüllt.
Weichgelatinekapseln, die Verbindungen der Erfindung umfassen, die durch die Verfahren dieses Beispiels hergestellt werden, eignen sich zur oralen Verabreichung und sind wirksam bei der Verstärkung der Fas-vermittelten Apoptose und zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, Infektionskrankheiten und Malignität.
BEISPIEL 8. Pharmazeutische Zusammensetzung für parenterale Verabreichung
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung umfassen typischerweise den pharmazeutischen Wirkstoff und physiologische Kochsalzlösung, wie mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung oder eine andere Wasserlösung mit einem pH und einem Salzgehalt, der zur Aufnahme in ein Lebewesen geeignet ist. Eine pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale Verabreichung wird durch Kombinieren einer Verbindung der Erfindung und mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung von Dulbecco (D8662, Sigma Chemical Co., St. Louis MO) wie im folgenden beschrieben hergestellt:

% Gew./Gew.

Verbindung der Erfindung 1,0%

Kochsalzlösung 99,0%
Die Lösung wird sterilisiert und in sterilen Behältern verschlossen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen der Erfindung umfassen, die durch die Verfahren dieses Beispiels hergestellt werden, eignen sich zur parenteralen Verabreichung und sind bei der Verstärkung der Fas-vermittelten Apoptose und zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, Infektionskrankheiten und Malignität wirksam.

Claims

Verbindung der Formel:
worin: X¹ und X² unabhängig ausgewählt sind aus -F, -Cl, -Br und -OSO₂R¹; Y¹ und Y² unabhängig ausgewählt sind aus -CN, -NO₂, -COR¹, -CONR¹R², -SO₂R¹ und – SO₂NR¹R²; und jedes R¹ unabhängig ausgewählt ist aus gegebenenfalls substituiertem linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und gegebenenfalls substituiertem Aralkyl, jedes R² unabhängig ausgewählt ist aus H, gegebenenfalls substituiertem linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und gegebenenfalls substituiertem Aralkyl, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, worin X¹ und X² gleich sind.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Y¹ und Y² gleich sind.
Verbindung nach Anspruch 1, worin X¹ und X² unabhängig ausgewählt sind aus -F und -Cl.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Y¹ und Y² unabhängig ausgewählt sind aus -CN, -NO₂ und -COR¹.
Verbindung nach Anspruch 1, die 1,3-Bis(4-chlor-3-nitrophenyl)harnstoff ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die mindestens eine Funktion ausgewählt aus der Gruppe der Stimulierung des Fas-Rezeptors und der Stimulierung der Fas-vermittelten Apoptose aufweist, wobei das Verfahren das Zuführen einer Verbindung nach Anspruch 1 zu einem Assay der Fas-Bindung oder der Fas-vermittelten Apoptose und Vermerken eines ersten Ergebnisses, das Zuführen einer Testverbindung zum Assay und Vermerken eines zweiten Ergebnisses und das Vergleichen des ersten und zweiten Ergebnisses umfasst, wodurch eine Testverbindung, die ähnliche oder bessere Ergebnisse als das erste Ergebnis ergibt, als eine Verbindung mit der gewünschten Funktion identifiziert wird.
Verfahren zur Identifizierung einer Zielverbindung, die die Funktion einer Verbindung nach Anspruch 1 in einem Assay nachbildet, wobei das Verfahren das Zuführen einer Verbindung nach Anspruch 1 zum Assay und Vermerken eines ersten Ergebnisses, das Zuführen einer Testverbindung zum Assay und Vermerken eines zweiten Ergebnisses und das Vergleichen des ersten und zweiten Ergebnisses umfasst, wodurch eine Testverbindung, die ähnliche oder bessere Ergebnisse als das erste Ergebnis ergibt, als eine Zielverbindung identifiziert wird, die die Funktion einer Verbindung nach Anspruch 1 nachbildet.
Verfahren zur Validierung, Optimierung oder Standardisierung eines Bioassays, wobei das Verfahren das Aussetzen einer Verbindung nach Anspruch 1 dem Bioassay; und das Validieren, Optimieren oder Standardisieren des Bioassays durch die Aktivität der Verbindung im Bioassay umfasst.
Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels, das sich zur Behandlung einer Krankheit eignet, die durch Verabreichung eines Stimulators der Fas-vermittelten Apoptose behandelbar ist.
Verwendung nach Anspruch 11, worin die Krankheit ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunkrankheiten, Infektionskrankheiten und maligne Krankheiten.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:
worin: X¹ und X² unabhängig ausgewählt sind aus -F, -Cl, -Br und -OSO₂R¹; Y¹ und Y² unabhängig ausgewählt sind aus -CN, -NO₂, -COR¹, -CONR¹R², -SO₂R¹ und – SO₂NR¹R²; und jedes R¹ unabhängig ausgewählt ist aus gegebenenfalls substituiertem linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und gegebenenfalls substituiertem Aralkyl, jedes R² unabhängig ausgewählt ist aus H, gegebenenfalls substituiertem linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und gegebenenfalls substituiertem Aralkyl, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, wobei das Verfahren umfasst: a) Umsetzen einer Verbindung der Formel:
worin X¹ und Y¹ wie vorstehend definiert sind, mit einer Verbindung der Formel:
worin X² und Y² wie vorstehend definiert sind, oder b) Umsetzen einer Verbindung der Formel:
worin X -F, -Cl, -Br oder -OSO₂R¹ ist; Y -CN, -NO₂, -COR¹, -CONR¹R², -SO₂R¹ und – SO₂NR¹R² ist; und jedes R¹ unabhängig ausgewählt ist aus gegebenenfalls substituiertem linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und gegebenenfalls substituiertem Aralkyl; jedes R² unabhängig ausgewählt ist aus H, gegebenenfalls substituiertem linearem, verzweigtem oder cyclischem Alkyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und gegebenenfalls substituiertem Aralkyl, in Anwesenheit von Wasser, um eine Verbindung der Formel (I) zu ergeben, worin X¹ und X² gleich sind und X sind und Y¹ und Y² gleich sind und Y sind; oder c) Umwandeln einer Verbindung der Formel (I) in ein entsprechendes Baseadditions- oder Säureadditionssalz; oder d) Umwandeln eines Salzes einer Verbindung der Formel (I) zu einer freien Verbindung; oder e) Umwandeln eines Salzes einer Verbindung der Formel (I) zu einem pharmazeutisch annehmbaren Salz; oder f) Racematspaltung einer Mischung von Stereoisomeren einer Verbindung der Formel (I) in einzelne Stereoisomere.
Verfahren zur Stimulierung der Fas-vermittelten Apoptose in einer Zelle mit einem Fas-Rezeptor, das das Kontaktieren der Zelle mit einer Verbindung nach Anspruch 1 in einer ausreichenden Menge zur Stimulierung des Fas-Rezeptors umfasst.