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1. Bereich
der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur Gewinnung von
Zellen. Insbesondere betrifft eine Ausführungsform dieser Erfindung
eine Vorrichtung und ein Verfahren, die die direkte Dispersion von
Zellen aus Gewebe für
die medizinische oder forschende Verwendung ermöglichen.
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2. Verwandter
Stand der Technik
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Fortschritte
in medizinischer Wissenschaft und medizinischen Therapien haben
den Bedarf für Verfahren
und Geräte
zum Isolieren und Sammeln von lebenden Zellen für die spätere Verwendung bei medizinischen
oder forschenden Verfahren angeregt. Solche Verfahren schließen das
Beimpfen der isolierten Zellen zur Verbesserung der Gewebeverpflanzung,
wie zum Beispiel bei Brandopfern, und den Einsatz von Zellen als
eine spezifische Zelltherapie zur Unterstützung oder Steigerung der Funktionsfähigkeit
der eigenen erkrankten oder verletzten Gewebes oder der Organe,
wie zum Beispiel der Leber, des Empfängers, ein.
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Unter
den zahlreichen Verfahren und Vorrichtungen, die zur Isolierung
von lebenden Zellen offenbart werden, sind diejenigen, die im EP-Patent
Nr. 446 450 B1 offenbart werden. Dieses Patent offenbart eine Vorrichtung
zum Verdauen und Bearbeiten von Gewebe zum Erzielen von Endothelzellprodukten.
Eine Ausführungsform,
die offenbart wird, besteht aus einem System von fünf primären Teilsystemen:
1. Fett-Sammeleinheit (siehe 1); 2. Verdauungseinheit
(siehe 2); 3. Endothelzellen-Isolierungseinheit (siehe 3);
4. Vaskulärer
Kraft-Bearbeitungseinheit (siehe 4);
und 5. Endothelzellen-Verabreichungseinheit (siehe 4).
Es wird eine alternative Ausführungsform
(siehe 14) offenbart, die aus einem
einzelnen Gefäß besteht,
das aus einem Gefäß mit drei
Kammern besteht: einer Verdauungskammer (210), einer Abfallkammer
(212) und einer Isolierungskammer (214). Die Verdauungskammer
(210) wird von der Abfallkammer (212) durch eine
Platte (218) getrennt, die ein normalerweise geschlossenes
Kontrollventil enthält
(220). Ein Belüftungsrohr
(222), das ein Schwimm-Kugelrückschlagventil (224)
enthält,
erstreckt sich von der Abfallkammer (212) in die Isolierungskammer
(214). Die Verdauungskammer (210) steht mittels
einer Serie von Anschlüssen
(228, 229, 230) mit der Außenseite
in Verbindung. Die Verdauungskammer (210) wird von der
Isolierungskammer (214) durch eine Abschirmung (232)
getrennt. Die Isolierungskammer (214) weist zwei Anschlüsse (234 und 236)
auf, wobei jeder davon ein Zweipunktventil (238 und 240)
beinhaltet. Die erste Position erlaubt die Verbindung zwischen der
Mitte der Ampulle (235) und den oberen und unteren Teilen
der Ampulle. Die zweite Position erlaubt die Verbindung zwischen
der Mitte der Ampulle (235) und den außen liegenden Anschlüssen (234 und 236).
Zunächst
sind beide Ampullenventile (238 und 240) in der
ersten Position. Die Vorrichtung wird als Auffangfalle mit einem
Fettabsaugungsvakuum angeordnet, das mit den Anschlüssen verbunden
wird (228 und 230). Nachdem das Fett gesammelt
wurde, wird die Fettabsaugungsanlage entfernt, die Anschlüsse 228 und 230 werden
verschlossen, und eine Waschlösung
(Media 199E, Hanks, Salzlösung, PBS
oder eine andere physiologisch gepufferte Lösung) wird durch den Anschluß (229)
eingeführt.
Das Fett wird in der Waschlösung
durch jedes externe Mittel, wie zum Beispiel Schütteln, gerührt. Die Vorrichtung wird anschließend mit
der Ampullenseite nach oben in eine Zentrifuge plaziert und zentrifugiert,
bis sich das normalerweise geschlossene Kontroll-Ventil öffnet und
die Waschlösung
in die Abfallklammer (212) abläuft. Das Kugelventil (224)
in dem Entlüftungsrohr
(222) öffnet
sich während
dieses Zentrifugationsschritts, was es der Abfallkammer (212)
erlaubt zu lüften,
wobei die Luft durch Waschlösung
ersetzt wird. Verdauungs-Enzymlösung
(Collagenase, Dispase, Trypsin oder andere Gewebe-dissoziierende
Enzyme) wird anschließend
durch den Anschluß (229)
eingeführt,
nochmals gefolgt von maschinellem Rühren. Sobald die Verdauung
abgeschlossen ist, wird die Vorrichtung mit der Ampullenseite nach
oben wieder zentrifugiert. Um die Endothelzellen zu isolieren, die
in die Ampulle (235) getrennt wurden, werden beide Ventile
(238 und 240) in ihre zweiten Positionen gedreht.
Das Zell„Pellet" kann anschließend durch
Anbringen einer Druckleitung an einen der Ampullenanschlüsse (234 oder 236)
ausgeschwemmt werden.
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US-Patent
Nr. 5,409,833 offenbart ebenfalls eine einzelne Vorrichtung zur
Verwendung zum Erhalten, Reinigen, Verdauen und Isolieren bestimmter identifizierbarer
Zellen aus Geweben, wobei die Vorrichtung ein Gehäuse umfaßt, das
eine Verfahrenskammer definiert, die einen unteren konischen Teil und
einen Siebkorb einschließt,
der einen konischen Teil einschließt, der den unteren Teil des
Siebkorbes definiert. Der Siebkorb und sein konischer Teil wird innerhalb
der Verfahrenskammer positioniert, wo der untere konische Teil des
Korbes einen Spalt definiert, der den Siebkorb von dem Gehäuse trennt,
wobei die Größe des Spalts
im wesentlichen quer über
den Siebkorb und seinem konischen Teil gleichmäßig ist. Bei der Verwendung
benötigt
die Vorrichtung einige Waschschritte, einen Zell-Verdauungsschritt,
was die Verwendung von Ventilen beinhaltet, um nach Zentrifugation
eine Zell-„Pellet" von Mikrogefäßzellen
herzustellen. Dieses Pellet muß durch
Einführen
einer sterilen gepufferten Flüssigkeit
durch einen Anschluß entfernt
werden, der dem „Pellet" vorgeschaltet ist, der
das „Pellet" durch einen zweiten
Anschluß zwingt,
der aus der Vorrichtung herausführt.
Die Anschlüsse
setzen voraus, durch Ventile geöffnet
und geschlossen werden zu können.
Aufgrund der Feinheiten der Vorrichtung wird erwartet, daß die Wiederverwendung
der Vorrichtung in einem anschließenden Verfahren gründliches
Sterilisieren erfordert, das aufgrund der Feinheiten der Durchgänge und
Ventile in der Vorrichtung erschwert sein könnte.
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Während die
voranstehenden Patente Ausführungsformen
von Zelltrennungsvorrichtungen als einzelne Geräte offenbaren, erscheint es,
daß der Ablauf
für den
Anwender mühsam
ist, der sofort mit all den Funktionen der Anschlüsse und
Ventile für
die Vielzahl der Verbindungen vertraut sein muß. Zusätzlich scheint die Wiederverwendung
dieser Vorrichtungen aufgrund der Komplexität der Vorrichtungsdurchgänge gründliche
Sterilisation und Reinigungsprozesse zur Gewährleistung einer sterilen Wiederverwendung
der Vorrichtungen zu erfordern.
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Die
vorliegende Erfindung stellt durch das Bereitstellen einer sterilen
Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung von Zellen aus Gewebe in
einem einfachen und schnellen Verfahren, wie im folgenden beschrieben,
einen Fortschritt gegenüber
dem Stand der Technik zur Verfügung.
Die Vorrichtung erfordert außerdem
keinerlei Ventile, was die Reinigung und Sterilisierung zur Wiederverwendung
einfacher macht, da die Feinheiten der Durchgänge der vorangehend offenbarten
Vorrichtungen hier nicht vorliegen. Alternativ ist die Vorrichtung
der vorliegenden Erfindung ideal zur Einwegverwendung geeignet und schließt damit
die Bedenken bezüglich
Reinigung und Sterilisierung gebrauchter Vorrichtungen aus.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
die hauptsächlichen
nicht zusammengebauten Bestandteile einer Ausführungsform der Vorrichtung
der Erfindung.
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2 zeigt
eine Ausführungsform,
wobei die Vorrichtung der Erfindung zusammengebaut ist und einen
Trennungsschritt erwartet.
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3 zeigt
verdaute, isolierte Zellen, die getrennt wurden und auf einem Zellfilter
gehalten werden.
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4a zeigt
den Auseinanderbau der Vorrichtung nach Zentrifugation und 4b zeigt
die Zellisolierungseinheit mit abgetrennten Zellen.
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5 zeigt
eine Ausführungsform
der Erfindung, wobei die Trennvorrichtung vor dem Waschen der isolierten
Zellen in ein Sammelgefäß zusammengebaut
ist.
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6 zeigt
den Zentrifugationsschritt, wobei die isolierten Zellen in ein Sammelgefäß hineingewaschen
werden.
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7 zeigt
das Sammelrohr, das isolierte Zellen enthält, die zur Verwendung bereit
sind.
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8a zeigt
das Anwenden oder Aussäen der
Zellen auf eine Matrix, und 8b zeigt
die Applikation der besäten
Matrix auf eine Wunde.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Eine
Ausführungsform
dieser Erfindung ist auf eine Vorrichtung zur Trennung von Zellen
aus Gewebe gerichtet, umfaßend
ein Gehäuse,
das eine Zellisolierungseinheit definiert, die ein erstes Ende und
ein zweites Ende aufweist, wobei das erste Ende zur abwechselnden
Aufnahme einer Gewebeverdauungskammer und einer dispergierten Zellen-Kammer angepaßt ist,
und das zweite Ende zur abwechselnden Aufnahme einer Abfallkammer
und einer Serumkammer angepaßt
ist, und das zweite Ende weiterhin einen Filter enthält, der
zum Filtern von Zellen aus einer Dispersion geeignet ist.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Zellen,
umfassend die Schritte von:
- a) Bereitstellen
einer Zellisolierungseinheit, die ein erstes und ein zweites offenes
Ende aufweist;
- b) Bereitstellen einer Quelle von Gewebe zur Gewinnung von Zellen
aus dem Gewebe, das durch ein gewebeverdauendes Material in der
Gewebeverdauungskammer verdaut wird;
- c) Bereitstellen einer Abfallkammer;
- d) Bereitstellen einer Quelle von Serum in einer Serumkammer;
- e) Bereitstellen einer Zelldispersionskammer;
- f) Verbinden der Gewebeverdauungskammer an das erste Ende der
Zellisolierungseinheit und der Abfallkammer an das zweite Ende der
Zellisolierungseinheit;
- g) Anwenden einer Kraft, die das Durchwandern der Zellen aus
der Gewebeverdauungskammer in die Zellisolierungseinheit bewirkt,
wodurch die Zellen am zweiten Ende der Einheit eingefangen werden
und anderen Bestandteilen erlaubt wird, die Zellisolierungseinheiten
zu durchströmen
und in die Abfallkammer zu wandern;
- h) Trennen der Gewebeverdauungskammer und der Abfallkammer von
der Zellisolierungseinheit;
- i) Verbinden der zweiten Zelldispersionskammer an das erste
Ende der Zellisolierungseinheit und die Serumkammer an das zweite
Ende der Isolierungseinheit; und
- j) Anwenden einer Kraft, die das Wandern der Bestandteile aus
der Serumkammer durch die Zellisolierungseinheit bewirkt, wodurch
die Zellen aus der Zellisolierungseinheit in die Dispersionszellkammer
gewaschen werden.
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Alternative
Ausführungsformen
dieser Erfindung schließen
eine Vorrichtung zum Trennen von Zellen aus Gewebe ein, das bereits
verdaut wurde oder das bereits dispergiert wurde und es ist wünschenswert,
die Zellen aus einer Dispersion oder einer Dispersion von verschiedenen
Zelltypen und -größen abzutrennen.
In so einer Ausführungsform umfaßt die Vorrichtung
ein Gehäuse,
das eine Zellisolierungseinheit definiert, die ein erstes Ende und ein
zweites Ende aufweist, wobei das erste Ende zur abwechselnden Aufnahme
einer ersten dispergierten Zellenkammer und einer zweiten dispergierten
Zellenkammer angepaßt
ist und das zweite Ende zur abwechselnden Aufnahme einer Abfallkammer
und einer Serumkammer angepaßt
ist, und das zweite Ende weiterhin einen Filter enthält, der
zum Filtern von Zellen aus einer Dispersion geeignet ist.
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Ein
alternatives Verfahren gemäß dieser
Erfindung umfasst ein Verfahren zur Isolierung von Zellen, umfassend
die Schritte von:
- a) Bereitstellen einer Zellisolierungseinheit,
die ein erstes und zweites offenes Ende aufweist;
- b) Bereitstellen einer ersten Dispersion von Zellen, die in
einer ersten Zelldispersionskammer getrennt werden sollen;
- c) Bereitstellen einer Abfallkammer;
- d) Bereitstellen einer Quelle von Serum in einer Serumkammer;
- e) Bereitstellen einer zweiten Zelldispersionskammer;
- f) Verbinden der ersten Zelldispersionskammer an das erste Ende
der Zellisolierungseinheit und der Abfallkammer an das zweite Ende
der Zellisolierungseinheit;
- g) Anwenden einer Kraft, die das Durchwandern der Zellen aus
der ersten Zelldispersionskammer in die Zellisolierungseinheit bewirkt,
wodurch die Zellen am zweiten Ende der Einheit gefangen werden und
es anderen Bestandteilen ermöglicht wird,
dann die Zellisolierungseinheit zu durchströmen und in die Abfallkammer
zu wandern;
- h) Trennen der ersten Zelldispersionskammer und der Abfallkammer
von der Zellisolierungseinheit;
- i) Verbinden der zweiten Zelldispersionskammer an das erste
Ende der Zellisolierungseinheit und der Serumkammer an das zweite
Ende der Zellisolierungseinheit; und
- j) Anwenden einer Kraft, die das Wandern der Bestandteile aus
der Serumkammer durch die Zellisolierungseinheit bewirkt, wodurch
die Zellen aus der Zellisolierungseinheit in die zweite Zelldispersionskammer
gewaschen werden.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung umfaßt
einen Kit, umfassend ein Gehäuse,
das eine Zellisolierungseinheit definiert, die ein erstes Ende und
ein zweites Ende aufweist, wobei das erste Ende zur abwechselnden
Aufnahme einer ersten Dispersionszellkammer und einer zweiten Dispersionszellkammer
angepaßt
ist und das zweite Ende zur abwechselnden Aufnahme einer Abfallkammer
und einer Serumkammer angepaßt
ist, und das zweite Ende weiterhin einen Filter enthält, der
zum Filtern von Zellen aus einer Dispersion geeignet ist, mit Gebrauchsanweisungen,
umfassend die Schritte von:
- a) Bereitstellen
einer ersten Zelldispersion, die in einer ersten Zelldispersionskammer
getrennt wird;
- b) Verbinden der ersten Zelldispersionskammer an das erste Ende
der Zellisolierungseinheit und der Abfallkammer an das zweite Ende
der Zellisolierungseinheit;
- c) Anwenden einer Kraft, die das Durchwandern der Zellen aus
der ersten Zelldispersionskammer in die Zellisolierungseinheit bewirkt,
wodurch die Zellen am zweiten En de der Einheit eingefangen werden
und es den anderen Bestandteilen erlaubt wird, die Zellisolierungseinheit
zu durchströmen und
in die Abfallkammer zu wandern;
- d) Trennen der ersten Zelldispersionskammer und der Abfallkammer
von der Zellisolierungseinheit;
- e) Verbinden der zweiten Zelldispersionskammer an das erste
Ende der Zellisolierungseinheit und der Serumkammer, die ein Serum
enthält,
an das zweite Ende der Zellisolierungseinheit; und
- f) Anwenden einer Kraft, die das Wandern der Bestandteile aus
der Serumkammer durch die Zellisolierungseinheit bewirkt, wodurch
die Zellen aus der Zellisolierungseinheit in die zweite Zelldispersionskammer
gewaschen werden.
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Es
sollte beachtet werden, daß die
Kit-Gebrauchsanweisung alternative Vorschriften enthalten würde, wie
die Zellisolierung ausgeführt
wird, begonnen mit der Verdauung einer Gewebsprobe wie für die oben
beschriebene erste Verfahrensausführungsform.
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Vorteile
dieser Erfindung schließen
ein einfaches und schnelles Verfahren zur Isolierung von Zellen
aus Gewebe ein. In einer so kurzen Zeit wie 45 Minuten können Gewebeproben
einem Wirt entnommen, in Zellbestandsteile verdaut, die verdauten
Zellen abgetrennt und als Beimpfungszellen für die gewünschte Anwendung verwendet
werden. Die Vorrichtung ist Idealerweise für den Einweggebrauch geeignet,
wodurch der Bedarf zur Reinigung und Sterilisierung nach Gebrauch
ausgeschlossen wird. Allerdings, falls eine Wiederverwendung gewünscht wird, kann
die Vorrichtung im Vergleich zu anderen bekannten Vorrichtungen
leicht gereinigt und sterilisiert werden, da die erfinderische Vorrichtung
keine Ventile benötigt,
was im Moment ein Problem für
die Reinigung und Sterilisierung vor einer Wiederverwendung darstellt.
Andere Vorteile dieser Erfindung schließen die mögliche Anwendung der Vorrichtung mit
minimaler Anweisung, Kosten und zusätzlicher Ausrüstung ein.
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Genaue Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung
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Die
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung und die Vorteile davon werden am besten
im Bezug auf die folgenden Beschreibungen und Zeichnungen verstanden,
wobei die gleichen Bezugszeichen für die gleichen und entsprechenden
Teile der Zeichnungen verwendet werden.
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1 ist
eine allgemeine Darstellung der Grundkomponenten einer Ausführungsform
der Vorrichtung 100 dieser Erfindung.
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Die
Vorrichtung 100 umfaßt
die Zellisolierungseinheit 200, die Gewebeverdauungskammer 300,
die ein gewebeverdauendes Material 320 enthält, die
Abfallsammelkammer 400, die Serumkammer 500, die
ein Serum 510 enthält
und die dispergierte Zellenkammer 600.
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Die
Zellisolierungseinheit 200 umfaßt ein erstes Ende 201 und
ein zweites Ende 202. Das erste Ende 201 enthält gegebenenfalls
eine entfernbare Gaze oder Filter 210, der Öffnungen
umfaßt,
die ausreichend groß sind,
damit es den verdauten Zellen in dem Größenbereich von ungefähr 0,1 bis
1000 μm ermöglicht wird,
hindurch zu passieren, während
das größere, unverdaute
Gewebe daran gehindert wird, durch den Filter 210 zu passieren.
Das zweite Ende 202 umfaßt einen Filter 220,
der Öffnungen
einer Größe aufweist,
die verhindern, daß die
verdauten Zellen passieren. Typischerweise sind die Öffnungen des
Filters 220 in einem Größenbereich
von ungefähr 0,1
bis 1000 μm,
vorzugsweise von 0,4 bis 10 μm.
Die Filter 210 und 220 können aus jedem geeigneten biologisch
verträglichen
Material hergestellt werden, einschließlich Seide, Musselin, rostfreiem
Stahl, Glasfasern, Zelluloseacetat, Polyethylenterephthalat, Glas,
Nylon und Nitrozellulose. Ein bevorzugtes Material für den Filter 210 ist
Nylon und für
den Filter 220 Nitrozellulose. Es ist auch vorgesehen,
daß die Filter 210 und 220 eine
Reihe von Filtern umfassen können,
die stufenweise sich verengende Öffnungen aufweisen,
die durch Verhindern einer Blockierung der feineren Passagefiltern
durch größere Zellen oder
unverdautem Gewebe bei dem Filtrieren helfen. In dieser Ausführungsform
des Zellkollektors 200 ist auch der wahlweise Kanal 230 dargestellt.
Der Kanal 230 ist ein Durchgang mit einem im Vergleich
zum ersten Ende 201 und zweiten Ende 202 verengten Durchmesser.
Der Zweck des Kanals 230 ist es, bei der Trennung der verdauten
Zellen zu helfen, die verklumpen können, bevor solche Agglomerate
den Filter 220 erreichen. Der Kanal 230 ist auch
so dargestellt, das er eine Übergangszone 232 zwischen
dem ersten Ende 201 und Kanal 230 und eine Übergangszone 232 zwischen
Kanal 230 und dem zweiten Ende 202 aufweist. Für die meisten
Anwendungen ist es vorgesehen, daß der Durchmesser des Kanals 230 von
ungefähr
0,1 mm bis 2 mm reicht und die Durchmesser der Enden 201 und 202 von
1 cm bis 10 cm reicht. Es sollte außerdem darauf hingewiesen werden,
daß, obwohl 1 nur
einen Ka nal 230 darstellt, es vorgesehen ist, daß andere
Ausführungsformen
dieser Erfindung eine Vielzahl von Kanälen umfassen können.
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In 1 werden,
die Gewebeverdauungskammer 300, die Abfallsammelkammer 400,
die Serumkammer 500 und die dispergierte Zellenkammer 600 alle
als Gefäße dargestellt,
die ein geschlossenes Ende und ein offenes Ende aufweisen. Das offene
Ende 301 der Verdauungskammer 300, das offene
Ende 401 der Abfallkammer 400, das offene Ende 501 der
Serumkammer 500 und das offene Ende 601 der dispergierten
Zellenkammer 600 sind alle passend mit der Zellisolierungseinheit 200 verbindbar. Alternativ
und nicht gezeigt, können
die Kammern 300, 400, 500 und 600 jeweils
Spritzen-ähnliche
Vorrichtungen umfassen, wobei jede ein Kolbenende und ein offenes
Ende umfasst. Die offenen Enden der Kammern können passend mit den offenen
Enden 201 und 202 der Zellisolierungseinheit 200 verbunden
werden. In dieser Ausführungsform
würden
die Spritzenähnlichen
Kammern es erlauben, eine Druckkraft auf die Inhalte der Kammern
auszuüben, damit
die verdaute Gewebslösung
gezwungen wird, gefiltert zu werden und damit die verdauten Zellen auf
den Filter 220 gesammelt werden. In ähnlicher Weise würden die
gesammelten Zellen dispergiert werden, indem eine Spritzen-ähnliche
Serumkammer 500 angebracht wird, die die Zellen zwingt
von dem Filter 220 in entgegengesetzter Richtung als gesammelt,
abgewaschen zu werden.
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Der
Zellkollektor 200, die Gewebeverdauungskammer 300,
die Abfallkammer 400, die Serumkammer 500 und
die dispergierte Zellenkammer 600 können aus jedem biologisch verträglichen
Material hergestellt werden. Geeignete Materialien schließen Polypropylen,
Polyethylen, Polysulfon, Teflon FEP, Teflon PFA, Polystyrol, Polycarbonat,
Styrol, Acrylnitril, Acryl, Glas und ähnliches ein.
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Die
Bedienung der Vorrichtung der Erfindung kann unter Bezug auf die 2 bis 10 verstanden werden.
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2 stellt
die Vorrichtung 100 dar, die vor der Anwendung einer Kraft,
zusammengesetzt wurde (zum Beispiel zentrifugal oder Druck, wie
zum Beispiel durch eine Spritzenähnliche
Kammer, wie oben beschrieben) um so zu bewirken, daß die verdauten Zellen,
die in der Verdauungskammer 300 enthalten sind, von der
Verdauungslösung
oder anderem, falls vorhanden, unverdautem Gewebe, getrennt werden. In
Bezug auf 2 wird unverdautes Gewebe 310 gezeigt,
das in einem akzeptablen Gewebeverdauungsmaterial 320 enthalten
ist, das das Gewebe 310 in isolierte Zellen verdaut (nicht
gezeigt). Die Verdauungskammer 300 ist mit dem Zellkollektor 200 an
einem Ende lösbar
verbunden. Die Abfallkammer 400 ist mit dem Zellkollektor 200 an
dem Ende verbunden, das gegenüber
der Verdauungskammer 300 liegt.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
wird das eigene Gewebe des Wirts 310 verwendet. Das Gewebe 310 kann
mittels herkömmlicher
Mittel dem Wirt entnommen werden. Wenn das Gewebe Haut ist, ist es
ein bevorzugter Weg, das Gewebe mittels eines ultradünnen Keratoms
zu entfernen, das die welligen Abschnitte der epidermalen/dermalen
Zwischenschicht einfängt.
So eine Technik erlaubt es, eine Hautdicke in der Nähe von 0,2
mm zu entfernen. Diese ultradünnen
Gewebsschnitte unterstützen
die schnelle Verdauung des Gewebes um isolierte Zellen herzustellen
und unterstützen
die schnelle Heilung des Teils des Wirts, wo Gewebe entfernt wurde.
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Akzeptable
Gewebeverdauungsmaterialien 320 können jede geeignete Lösung umfassen,
die das Gewebe in isolierte Zellen verdauen wird. Geeignete Materialien
schließen
Enzyme oder ähnliche Reagenzien,
wie zum Beispiel Proteasen, Lipasen oder Hydrolasen mit Ester-hydrolysierenden
Eigenschaften ein. Solche Enzyme schließen, ohne Begrenzung, Dispase,
Neuramidase (Sialidase), Pankreatin-Proteinase K, Bromelain, Pronase
E, Zellulase, Dextranase, Elastase, Plasminstreptokinase, Trypsin,
Chymotrypsin, Papain, Chymopapain, Kollagenase, Subtilisin, Chlostridopeptidase
A, Ficin, Carboxypeptidase A, Pektinase, Pektinesterase, eine Oxidoreduktase,
eine Oxidase und Mischungen davon ein. Andere geeignete Enzyme schließen neutrale
Proteasen, Glycosidasen, Endopeptidasen, Pankreatin, Metalloproteinasen,
Serinproteasen und Mischungen davon ein. Für einen Fachmann ist es ersichtlich,
daß Mischungen
der vorangehenden Materialien verwendet werden können, um eine optimale Zusammensetzung
zur Verdauung des Gewebes zu erzielen. Bevorzugte Enzyme sind Kollagenase
und Trypsin, falls das Gewebe, das verdaut werden soll, epidermale
Haut ist. Zusätzliche
Mittel zur Erhöhung der
Zellausbau- und -reinheit, sind zum Beispiel chelatierende Mittel,
wie zum Beispiel Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Enzyme zur
Nukleinsäureverdauung
Desoxyribonuklease (DNase).
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Eine
typische Zeitspanne zur Verdauung einer 0,2 mm Probe einer Epidermishaut
als Gewebe, unter Verwendung von Proteasen wie zum Beispiel Kollagenasen
und Trypsin, würde
bei 37°C
ungefähr 30
Minuten dauern. Natürlich
ist es für
den Fachmann ersichtlich, daß die
Verdauungszeit aufgrund solcher Variablen wie Gewebetyp und -dicke
und Art und Konzentration der enzymatischen Lösung, die verwendet wird, variieren
kann. Zusätzlich
kann die Anreicherung bestimmter Zelltypen einiger Gewebe durch
Enzyme die verwendet werden und durch Variieren der Verdauungszeit
erreicht werden.
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Sobald
das Gewebe 310 zur Bildung einer geeigneten Anzahl von
isolierten Zellen ausreichend verdaut wurde, werden die isolierten
Zellen von der enzymatischen Lösung 320 durch
die Anwendung einer Kraft abgetrennt. 3 stellt
die Anwendung einer Zentrifugalkraft, wie durch den Pfeil 250 gezeigt, und
die Folgen der Anwendung der Kraft dar. Im Vergleich zu 2 zeigt 3,
daß das
Gewebe-verdauende Material 320 und die isolierten Zellen 330 die
Verdauungskammer 300 verlassen haben. Die isolierten Zellen 330 akkumulieren
auf dem Filter 220. Das verbrauchte Gewebe-verdauende Material 340 akkumuliert
in der Abfallkammer 400. Obwohl nicht gezeigt, würde der
Filter 210 jegliches unverdautes Gewebe 310 ansammeln,
das zu groß war, um
die Öffnungen
des optimalen Filters 210 zu passieren.
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Während die
obige Ausführungsform
und die nachfolgende Beschreibung nur die Zentrifugalkraft diskutiert,
um die Trennung der Zellen zu erreichen, sollte es für den Fachmann
ersichtlich sein, daß andere
Arten von Kräften
durch diese Erfindung eingeschlossen werden können, einschließlich, jedoch nicht
begrenzt auf, Gravitationskraft, Vakuum, elektromagnetische- und
Zentripetalkraft.
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Die 4a und 4b stellen
den Abbau der Vorrichtung 100 nach der Anwendung einer
Kraft zur Trennung der isolierten Zellen 330 von der verbrauchten
enzymatischen Lösung 340 dar.
In Bezug auf 4a stellen die Pfeile 260 die
Richtung dar, in der die Zellverdauungskammer 300 und Abfallkammer 400 von
der Zellisolierungseinheit entfernt werden. 4b zeigt
die komplett abgebaute Vorrichtung 100 mit der Zellisolierungseinheit 200,
die die isolierten Zellen 330 auf den Filter 220 behält. Obwohl
der Filter 210 immer noch dargestellt wird, wird der Filter 210 vorzugsweise
vor dem Beginn des nächsten
Schritts, wie unten beschrieben, entfernt.
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5 stellt
die Vorrichtung 100 dar, die zur Annahme der Serumkammer 500 und
der dispergierten Zellenkammer 600 aufgebaut wird. Die
isolierten Zellen 330 verbleiben auf dem Filter 220.
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Die
Serumkammer 500 enthält
jedes geeignete Serum 510, das zur Dispergierung der isolierten Zellen 330 fähig ist.
Geeignete Seren schließen
balancierte Salzlösungen,
isotonische Lösungen,
Zellkulturmedien, gepufferte Salzlösungen, Gesamtblut, Plasma
und Mischungen davon ein. Ein bevorzugtes Serum ist die isotonisch
gepufferte Lösung
PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung).
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Zusätzlich kann
das Serum weitere Bestandteile, wie zum Beispiel Nährstoffe,
Wachstumsfaktoren, chemotaktische Faktoren, Cytokine, Autokoide, Prostanoide,
Glukokortikoide, Morphogene, nukleare Hormone, Rezeptoragonisten
und Mischungen davon enthalten.
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6 stellt
die Anwendung einer Zentrifugalkraft auf die Vorrichtung, wie in 5 durch
den Pfeil 250 gezeigt und die Folgen der Anwendung der
Kraft dar. Im Vergleich zu 5 zeigt 6,
daß das
Serum 510 und die isolierten Zellen 330 jeweils
die Serumkammer 500 und die Zellisolierungseinheit 200 verlassen
haben. Die isolierten Zellen 330 werden in dem Serum 510 in
der Dispersionskammer 600 dispergiert, wie in 7 gezeigt.
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Die 8a und 8b stellen
eine geeignete Verwendung der dispergierten, isolierten Zellen dar.
In Bezug auf 8a werden die isolierten Zellen 330 gezeigt,
die in ein extrazelluläres
Gerüst
oder Matrix 700 über
Kapillareinwirkung, wie durch den Pfeil 270 gezeigt, eindringen,
nachdem der Inhalt der Dispersionskammer 600 auf die Matrix 700 aufgetragen
wurde.
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Geeignete
Matrices 700 schließen
sowohl biologische als auch synthetische extrazelluläre Matrices
ein. Beispiele von geeigneten biologischen extrazellulären Matrices
schließen
Kollagen, Fibrin, azelluläres
Gewebe, Koralle, Alginat, Fibronectin, Hyaluronsäure und ähnliches ein. Synthetische
extrazelluläre
Matrices schließen
Dextranpolymere, Polyvinylchloride, Polyglycolsäuren, Polylaktidsäuren, Polylactidglycolsäuren, Silizium,
Ethylenvinylacetat, Poly-2-hydroxyethylmethacrylat, Polytetrafluorethylen („PTFE"), Po ly(ethylenglycol),
Poly(butylenterephthalat), Keramiken und Mischungen davon ein. Nachdem
es den isolierten Zellen 330 für eine ausreichende Zeit erlaubt
wurde, die Matrix 700 zu beimpfen, wird die beimpfte Matrix
anschließend
auf eine Vielzahl von Wegen verwendet.
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8b stellt
eine solche Anwendung einer geimpften Matrix 700 dar, wie
sie auf einer Wunde 800 angewendet wird.
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Die
Vorrichtung und das Verfahren dieser Erfindung kann zur sterilen
Isolierung von Zellen aus einer Vielzahl von Geweben verwendet werden,
einschließlich,
aber nicht begrenzt darauf, Haut, Fettgewebe, Muskel, Knorpel, Leber,
Pankreas, Karotidkörper,
Omentum und Knochen. Die Zellen können ihren ursprünglichen
Phänotyp
behalten oder Stamm/Vorläuferzellen
sein, die in verschiedene Phänotypen differenzieren
können.
Die isolierten Zellen können auf
Gewebe durch eine Vielzahl von Verfahren, die zur Isolierung von
Zellen zur Analyse oder Kultivierung in vitro verwendet werden,
appliziert werden. Die isolierten Zellen können direkt ins Gewebe injiziert
werden, auf ein Gerüst
aus verschiedenen Zusammensetzungen (Protein/Polysaccharid/Glycosaminglycan/Keramik),
ein Gelvehikel oder Materialien die als Träger dienen, appliziert werden.
Die Zellen können
durch Gentechnik manipuliert werden oder direkt zur Behandlung von
Krankheiten verwendet werden, die das ursprüngliche Organ oder andere allogenische
oder autologe Gewebe betreffen. Spezifische Anwendungen sind Regeneration
oder Reparatur von Haut, Organen, Knorpel, Knochen, Skelett und
Herzmuskel oder Fettgewebe.
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Beispiel
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Eine
Epidermisprobe wird bei 37°C
in der Gewebeverdauungskammer inkubiert, die eine Proteaselösung aus
Kollagenase und Trypsin verwendet, um Zellmatrix und Zellanheftung
der Gewebeprobe zu lösen.
Die Gewebeverdauungskammer mit dem inkubierten Gewebe wird an dem
ersten Ende der Zellisolierungseinheit, mit einem Netz über der Öffnung der
Röhre angebracht,
um dem Eintritt von jeglichem unverdauten Gewebe in die Zellisolierungseinheit
vorzubeugen. Eine Abfallkammer wird an das zweite Ende der Zellisolierungseinheit
mit einem Filter zum Sammeln der isolierten Zellen angebracht. Die
zusammengebaute Vorrichtung wird zur Entfernung der Proteaselösung von
den Zellen zentrifugiert, und die Zellen werden auf dem Filter aufgefangen.
Die Gewebeverdauungskammer und die Abfallkammer werden entfernt
und eine Serumkammer, die eine isotonisch gepufferte Lösung an
PBS enthält,
wird an dem zweiten Ende der Zellisolierungseinheit angebracht,
das neben dem Filter angeordnet ist. Die dispergierte Zellenkammer
wird an das erste Ende der Zellisolierungseinheit angebracht. Die
Einheit wird zum Waschen der Zellen von dem Filter wieder zentrifugiert,
wobei das Serum in der Serumkammer verbleibt und in die Zelldispersionskammer
eintritt. Die Zellen in dem Serum können anschließend für das Beimpfen
einer medizinischen Vorrichtung verwendet, kultiviert oder kryogenisch
konserviert werden.
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Es
sollte verstanden werden, daß die
vorangehende Offenbarung und die Beschreibung der vorliegenden Erfindung
illustrativ und beispielhaft sind und eine Vielzahl von Änderungen
in Größe, Form und
Materialen, als auch in der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
gemacht werden können.