DE10115265A1 - Transplantat zur Behandlung von Wunden - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kit zur Behandlung von Wunden, das Endothelzellen und Keratinozyten enthält. Die Zellen sind in Fribrinkleber oder einer Vorläuferlösung suspendiert. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung des Kits. Die Zellen im Fibrinkleber können auf Wunden aufgebracht werden und führen zur Vaskularisierung und Epithelisierung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Chirurgie, insbesondere die Behandlung von chronischen, hypovaskularisierten Wunden.

Nicht-heilende chronische Wunden stellen ein großes therapeutisches und sozioökonomisches Problem dar. Eine erfolgversprechende, zum Teil noch in der Entwicklung befindliche Therapiemöglichkeit stellt die Transplantation autologer Keratinozyten dar. Diese können in mehrschichtigen Zellagen als sogenanntes "sheet" oder in neuerer Entwicklung als Keratinozytensuspension in Fibrinkleber transplantiert werden.

Dennoch stellen gerade chronische hypovaskularisierte Wunden für die Transplantate ein Problem dar, wegen ungenügender Vaskularisation bleibt eine Heilung dann aus und die Transplantate gehen verloren. Verschiedene in vitro-Modelle wurden entwickelt, um kapillarähnliche Strukturen zu schaffen und Angiogenese nachzubilden. Dabei gelang es mit Endothelzellen aus Rindern kapillarähnliche Strukturen in Gegenwart verschiedener extrazellulärer Matrixkomponenten zu erzeugen. Humane Endothelzellen degenerieren jedoch unter diesen Bedingungen.

Black et al. (1998) FASEB J. 12, 1331-1340 offenbaren ein Verfahren zur in vitro- Rekonstitution eines Hautäquivalents, in dem Keratinozyten, Fibroblasten und Endothelzellen kokultiviert werden. Die Zellen werden dabei auf einem Chitosan-/Kollagen- Biopolymer ausgesät.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein vorteilhaftes Mittel zur Behandlung hypovaskularisierter Wunden zur Verfügung zu stellen.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß es nach Applikation von Keratinozyten und Endothelzellen in einer Fibrinmatrix auf Wunden zu einer verstärkten Bildung von kapillarähnlichen Strukturen sowie zur Ausbildung einer Epidermis kommt.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung eines Kits zur Behandlung von Wunden, das umfaßt, daß man Keratinozyten und Endothelzellen aus einer Vollhautbiopsie isoliert und die Keratinozyten sowie die Endothelzellen in Fibrinkleber oder in einer Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert. Die Reihenfolge der Isolierung von Keratinozyten und Endothelzellen ist beliebig, sie kann auch parallel erfolgen. Ebenfalls beliebig ist die Reihenfolge der Suspension der Keratinozyten und Endothelzellen in Fibrinkleber oder in einer Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird. Sie kann auch gleichzeitig erfolgen.

In einer Ausführungsform werden Endothelzellen und Keratinozyten nicht in demselben Fibrinkleber oder in derselben Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert. In einem ersten Fibrinkleber oder in einer ersten Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, können Endothelzellen suspendiert werden, in einem zweiten Fibrinkleber oder in einer zweiten Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, können Keratinozyten suspendiert werden. Es werden somit zwei Suspensionen bereitgestellt, eine davon enthält im wesentlichen Endothelzellen, die andere im wesentlichen Keratinozyten.

In einer anderen Ausführungsform werden Endothelzellen und Keratinozyten in demselben Fibrinkleber oder in derselben Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert. Es wird also eine Suspension bereitgestellt, in der sowohl Endothelzellen als auch Keratinozyten enthalten sind.

Die Endothelzellen und die Keratinozyten werden aus einer Vollhautbiopsie isoliert, vorzugsweise aus ein und derselben Biopsie. Die Vollhautbiopsie im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt wenigstens einen Teil der Epidermis und einen Teil der Dermis. Üblicherweise hat die Epidermis einen Anteil an der Biopsie von ca. 5-10%, die Dermis einen Anteil von ca. 90-95%. Die Vollhautbiopsie kann auch Subcutis oder subcutanes Fettgewebe enthalten, diese Schichten sind zur Ausführung der Erfindung aber nicht wesentlich, sondern werden vor Isolierung der Endothelzellen und Keratinozyten in der Regel entfernt.

Die Vollhautbiopsie gemäß der vorliegenden Erfindung schließt auch Spalthaut ein. Spalthaut kann gewonnen werden, indem Epidermis und ein Teil der Dermis durch ein hobelartiges Gerät entnommen werden. Aus operationstechnischen und ästhetischen Gründen ist diese Ausführungsform aber nicht bevorzugt. Zudem ist dabei die Zellisolierung erschwert und die Ausbeute an Endothelzellen geringer als bei einer Vollhautbiopsie, die die gesamte Dermis-Schicht umfaßt.

Bei der Vollhautbiopsie kann es sich z. B. um eine Biopsie aus der Leistengegend handeln. Die Größe der Biopsie ist variabel und kann den jeweiligen Gegebenheiten und Erfordernissen angepaßt werden. Die Probe wird üblicherweise zunächst unter sterilen Bedingungen von Bindegewebsresten und Fett befreit. Anschließend kann durch enzymatische Trennung mittels des Enzyms Dispase die Epidermis von der Dermis getrennt werden. Aus der Epidermis können später die Keratinozyten gewonnen werden, aus der Dermis die Endothelzellen.

Isolierung von Zellen im Sinne dieser Erfindung bedeutet die Anreicherung der Zellen, so daß der zu isolierende Zelltyp in einer Zusammensetzung einen Anteil an der Gesamtzahl der Zellen von wenigstens 50%, bevorzugt wenigstens 60%, bevorzugter wenigstens 70%, noch bevorzugter wenigstens 80%, am bevorzugtesten wenigstens 90% hat. Dieser Prozentsatz wird auch als Reinheit der Zellen bezeichnet. Die angegebenen Werte gelten für Endothelzellen und Keratinozyten. Dem Fachmann ist klar, daß der therapeutische Effekt geringer ist, wenn weniger spezifische Zellen (Endothelzellen bzw. Keratinozyten) vorhanden sind.

Die von der Epidermis befreite Dermis kann weiterhin mit Trypsin behandelt werden, um Zellen herauszulösen. Das gewonnene Zellgemisch kann anschließend in Zellkulturschalen oder Zellkulturflaschen ausgebracht werden und in Gegenwart von geeigneten Medien kultiviert werden. Nach ein bis zwei Tagen werden in der Regel adhärente Zellen sichtbar, bei denen es sich vor allem um Fibroblasten, Endothelzellen aber auch Keratinozyten handelt. Nach weiteren sieben bis zehn Tagen erreicht die primäre Zellkultur üblicherweise ein subkonfluentes Stadium. Nun können die Endothelzellen isoliert werden. Die weitere Isolierung der Endothelzellen kann auf verschiedene Weisen erfolgen, eine Möglichkeit ist die Isolierung der Zellen über einen spezifischen Antikörper, beispielsweise einen Antikörper, der gegen menschliches CD31 gerichtet ist. Dabei kann zunächst der Anti-CD31-Antikörper (Primärantikörper) mit dem Zellgemisch inkubiert werden, anschließend werden magnetische Kügelchen zugegeben, die mit einem Sekundärantikörper, der den Primärantikörper erkennt, gekoppelt sind. Durch Anlegen eines Magnetfelds können dann die Zielzellen isoliert werden. Die so isolierten Zellen können dann für wenigstens 24 h weiter kultiviert werden, vorzugsweise für wenigstens drei Tage, bevorzugter für wenigstens fünf Tage, am bevorzugtesten für sieben bis zehn Tage. Dabei wird üblicherweise eine Subkonfluenz von 60 bis 70% erreicht. Nach der ersten Isolierung der Endothelzellen aus der Dermis läßt sich eine Reinheit der Endothelzellen von ca. 60% erreichen. Durch den weiteren Isolierungsschritt über spezifische Antikörper, z. B. Anti-CD31, läßt sich eine Reinheit von ca. 90% erzielen. Die verbleibenden Restzellen sind meist Fibroblasten, die für die weitere Verwendung nicht schädlich sind. Im Gegenteil können diese sogar noch helfen, ein dreidimensionales bindegewebiges Stützgerüst aufzubauen.

Die Epidermis, die man nach der Trennung von der Dermis erhält, kann dann auch mit Trypsin behandelt werden, um die desmosomalen Verbindungen der Zellen zu spalten. Die Zellen können dann durch Verfahren wie Filtration und/oder Zentrifugation gewonnen werden und werden dann in geeigneten Kultivierungsmedien inkubiert. Üblicherweise werden die Zellen dann bei etwa 70 bis 80% Konfluenz das erste Mal passagiert. Die Zellen können weiterkultiviert werden, so kann man über mehrere Passagen verfahren. Die Keratinozyten können für wenigstens 24 h, vorzugsweise für wenigstens drei Tage, bevorzugter für wenigstens fünf Tage, am bevorzugtesten für wenigstens sieben Tage weiter kultiviert werden. Nach Isolierung der Keratinozyten läßt sich eine ca. 90% reine Kultur erreichen, da die anderen Zellen in Serum-freiem Keratinozytenmedium absterben. Die Reinheit kann durch wiederholtes Passagieren in Serum-freiem Keratinozytenmedium erhöht werden.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Endothelzellen und/oder Keratinozyten um autologe Zellen, das heißt die Biopsie stammt von dem Patienten, dessen Wunde später behandelt werden soll. Die Verwendung von allogenen Zellen ist aber ebenfalls denkbar.

Bei den Endothelzellen handelt es sich bevorzugt um mikrovaskuläre Endothelzellen. Mikrovaskuläre Endothelzellen sind Zellen aus kleinsten Kapillaren wie zum Beispiel aus der Haut, aber auch anderen Geweben. Sie entsprechen damit am ehesten den Anforderungen, die für ein kapillarähnliches Konstrukt benötigt werden. Die molekularen Marker (CD31, CD34, CD105, Faktor VIII), die zur Identifikation benutzt werden können, sind identisch mit denen, die bei anderen Endothelzellen auch benutzt werden.

In einer besonderen Ausführungsform werden die Endothelzellen nach ihrer Isolierung transfiziert. Vorzugsweise wird dabei DNA transfiziert, die für Proteine kodiert, die die Angiogenese stimulieren. Es kommt dabei zu einer autokrinen/parakrinen Stimulation. Beispiele für solche Proteine sind VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF (basic Fibroblast Growth Factor alpha und beta), Angiopoetin, EGF (Epidermal Growth Factor). Geeignete Expressionsvektoren sind in der Literatur (1. Isner JM, Baumgartner I, Rah G, Schainfeld R, Blair R, Manor O, Razvi S. Symes JF. Treatment of thrombangütis obliterans (Buerger's disease) by intramuscular gene transfer of vascular endothelial growth factor: Preliminary clinical results. J Vasc Surg. 28 (6): 964-973, discussion 973-­ 975, 1998; 2. Isner JM, Pieczek A, Schainfeld R, Blair R, Haley L, Asahara T, Rosenfiled K, Razvi S. Walsh K, Symes JF. Clinical evidence of angiogenesis following arterial gene transfer of phVEGF-165 in patient with ischemic limb. Lancet 348: 370-374, 1996) beschrieben oder werden individuell hergestellt.

Auch die Keratinozyten können zur parakrinen Stimulation der Endothelzellen transfiziert werden. Die bevorzugte DNA entspricht der zur Transfektion von Endothelzellen. Dem Fachmann sind entsprechende Konstrukte und Verfahren an sich bekannt. Da somit alle Zellen der Ko-Kultur transfiziert werden können, kann das Verfahren, das eine optimale Expression gewährleistet, ausgewählt werden.

Als Transfektionsverfahren kommen gängige Methoden zur Transfektion eukaryontischer Zellen in Frage. Beispiele sind die Calciumphosphat-vermittelte Transfektion, Lipofektion, Elektroporation und andere. Es kann sich um transiente oder stabile Transfektion handeln, transiente Transfektion ist aber bevorzugt.

Der Fibrinkleber, der auf die Wunde aufgebracht werden soll, wird aus einer Thrombin­ haltigen Lösung und einer Fibrinogen-haltigen Lösung hergestellt. Die Fibrinogen-haltige Lösung und die Thrombin-haltige Lösung sind im Sinne dieser Anmeldung Zusammensetzungen, die zur Herstellung eines Fibrinklebers verwendet werden. Ein Beispiel für einen handelsüblichen Fibrinkleber ist das Produkt TISSUCOL® Duo S erhältlich von der Firma Baxter. Dabei werden zwei Lösungen bereitgestellt. Eine Lösung enthält als Komponenten Humanplasmafraktion mit Fibrinogen, Blutgerinnungsfaktor XIII, Plasmafibronectin und bovines Aprotinin. Die andere Lösung enthält Thrombin und Calciumchlorid. Die Thrombin-haltige Lösung und die Fibrinogen-haltige Lösung können nun gemischt werden, und in die entstehende Fibrinktebersuspension können die Endothelzellen und/oder Keratinozyten suspendiert werden. Eine andere Möglichkeit ist, die Zellen in einer Zusammensetzung zu suspendieren, die zur Herstellung des Fibrinklebers verwendet wird. Die Zellen können somit in der Fibrinogen-haltigen Lösung oder in der Thrombin-haltigen Lösung suspendiert werden, was bevorzugt ist. Am bevorzugtesten werden die Zellen in der Thrombin-haltigen Lösung suspendiert. Diese Zellsuspension kann dann mit der Fibrinogen-haltigen Lösung gemischt werden, wodurch der Fibrinkleber entsteht, der auf die Wunde appliziert werden kann.

Zur Herstellung einer Endothelzellen-Fibrinkleber-Suspension können die Endothelzellkulturen im subkonfluenten Stadium abtrypsinisiert und gezählt werden. Nach Zentrifugation kann das Endothelzellpellet unter sterilen Bedingungen in der Thrombinlösung aufgenommen werden. Die Zellkonzentration wird dabei vorzugsweise so gewählt, daß sie ungefähr 6 × 10⁵ bis 6 × 10⁷ Endothelzellen/ml Endvolumen Fibrinkleber beträgt. Bevorzugt ist eine Zellkonzentration von ungefähr 6 × 10⁶ Endothelzellen/ml Endvolumen Fibrinkleber.

Die Herstellung einer Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension erfolgt analog zur Herstellung der Endothelzellen-Fibrinkleber-Suspension. Die Herstellung einer Fibrinklebersuspension, die Endothelzellen und Keratinozyten enthält, erfolgt ebenfalls analog. Dabei werden Endothelzellen und Keratinozyten vorzugsweise im Verhältnis 1 : 1 verwendet. Auch hier sind die bevorzugten Zellkonzentrationen ungefähr 6 × 10⁵ bis 6 × 10⁷ Zellen/ml Fibrinkleber, am bevorzugtesten ungefähr 6 × 10⁶ Zellen/ml Fibrinkleber, wobei sich hierbei ca. 3 × 10⁶ Endothelzellen/ml und ca. 3 × 10⁶ Keratinozyten/ml im Kleber befinden.

Die Zellen können sowohl als Endothelzellen-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension als auch als Einzelsuspension appliziert werden. Bei ersterem Verfahren organisieren sich die Keratinozyten an der Oberfläche und bilden ein Epithel aus, beim zweiten Verfahren wird zunächst die Endothelzellsuspension aufgetragen. Nach Aushärten des Fibringemischs kann dann in einem zweiten Schritt die Keratinozytensuspension aufgetragen werden. Das Aushärten des Fibringemisches dauert in der Regel weniger als eine Minute. Das Auftragen der Keratinozytensuspension im zweiten Schritt kann also fast unmittelbar danach erfolgen oder aber auch erst nach einigen Tagen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Kit erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren. Das Kit enthält Endothelzellen und Keratinozyten. Die Endothelzellen sind in Fibrinkleber oder in einer Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert. Auch die Keratinozyten sind in Fibrinkleber oder in einer Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert. Die Endothelzellen und Keratinozyten können dabei in getrennten Suspensionen vorliegen oder aber in einer einzigen Suspension. Die bevorzugten Ausführungsformen der Zellen wurden bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erläutert. Die Zellsuspensionen können in einer Spritzvorrichtung bereitgestellt werden, die vorteilhaft zur Applikation des Fibrinklebers ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Fibrinogen, Thrombin, Endothelzellen und Keratinozyten zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Wunden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Wunden, bei dem in Fibrinkleber suspendierte Endothelzellen und in Fibrinkleber suspendierte Keratinozyten auf die Wunde aufgetragen werden. In einer Ausführungsform wird eine Suspension auf die Wunde aufgetragen, in der Endothelzellen und Keratinozyten enthalten sind. In einer anderen Ausführungsform wird zunächst eine erste Suspension auf die Wunde aufgetragen, in der Endothelzellen enthalten sind, anschließend wird eine zweite Suspension aufgetragen, in der Keratinozyten enthalten sind.

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Methode zur Behandlung chronischer hypovaskularisierter Wunden zur Verfügung, bei der durch die Transplantation verschiedener Zelltypen den vielfachen Anforderungen der Pathophysiologie in der Wundbehandlung Rechnung getragen wird. In tierexperimentellen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, daß die Keratinozyten in der Lage sind, eine Epidermis zu rekonstituieren.

Das Verfahren stellt ein einfaches, schnell verfügbares und leicht anwendbares System dar, mit dem jede Art von großflächiger Wunde und speziell chronische hypovaskularisierte Wunden mit minimalem Zeitaufwand und möglichst kleinem operativen Eingriff therapiert werden können. Durch die Bereitstellung von mehreren Zelltypen in Kokultur kann gleichzeitig mehreren Problemstellungen nachgegangen werden. Durch die Endothelzellen, die in der Fibrinmatrix ein kapillarähnliches Netz formen, kann die Vaskularisation einer Wunde gesteigert werden. Die Keratinozyten führen dann zur Epithelisierung und zum Verschluß der Wunde. Dadurch, daß die Endothelzellen auch aus der Vollhautbiopsie gewonnen werden können, wird nur ein Eingriff, bei dem die Biopsie entnommen wird, notwendig.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1 Isolierung einer Mischkultur aus humaner Dermis Materialien

25 cm²

Kulturflaschen (Costar, Bodenheim, Deutschland, Cat. No. 430639)
Dispase II (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland, Cat. No. 165 859)
Trypsin/EDTA (

1

x) (PAA Laboratories GmbH, Linz, Austria, Cat. No. L 11-660)
Endothelial Cell Basal Medium MV (Promocell, Heidelberg, Deutschland, Cat. No. C- 22220)
Endothelial Cell Growth Medium MV (Promocell, Heidelberg, Deutschland, Cat. No. C- 22020)
Penicillin-Streptomycin (Life Technologies, Paisley, Schottland, Cat. No. 15140-114)
Fungizone (Life Technologies, Paisley, Schottland, Cat. No. 15290-026)
Supplement Mix (Promocell, Heidelberg, Deutschland, Cat. No. C-39225)
FCS (GibcoßRL, Karlsruhe, Deutschland, Cat. No. 10108-165)

Nach Zugabe des Supplement Mix (Promocell, Cat. No. C-39225) hatte das Endothelial Cell Growth Medium (ECGM) folgende Zusammensetzung:

ECGS/H	0.4%
FCS	5%
EGF	10 ng/ml
Hydrocortison	1 µg/ml
Amphotericin B	50 ng/ml
Gentamicin	50 µg/ml

Zusätzlich wurde noch 1% Penicillin/Streptomycin und 1% Fungizone hinzugefügt. Dieses Medium wurde hauptsächlich zur Kultivierung und Passagieren der HMVEC verwendet und für jedes Versuchsvorhaben speziell angesetzt und modifiziert. Dem Basalmedium wurde 5% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin sowie 1% Fungizone hinzugefügt. Dieses Medium wurde vor allem bei den unten beschriebenen Transfektionsversuchen verwendet.

Protokoll

Zunächst wurde die Probe an der sterilen Werkbank ("laminar air flow") in einer mit PBS gefüllten Petrischale sorgfältig von Bindegewebsresten und Fett befreit, so daß die Reteleistenstruktur der Dermis punktförmig sichtbar wurde, um die enzymatische Trennung der Epidermis von der Dermis zu erleichtern. Dann wurde das Hautstück für wenige Sekunden mit 70%igem Alkohol und abschließend in sterilem PBS gespült. Die so präparierte Haut wurde sodann in eine Petrischale überführt, in welcher sich 0,5%ige Dispase befand und entweder für 3-4 Stunden bei einer Temperatur von 37°C oder für 15- 18 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Inkubation konnte als abgeschlossen betrachtet werden, als sich die Epidermis leicht von der Dermis lösen ließ. Die Wirkung der Dispase beruht auf einer Zerstörung des Kollagen Typ IV in der Basalmembran, läßt aber die Desmosomen intakt.

Die von der Epidermis befreite Dermis wurde zunächst in 4 cm × 4 cm große Stücke geschnitten und in eine andere Petrischale überführt, in welcher sich ca. 25 ml Trypsin/EDTA (0,5 g Trypsin/l, 0,2 g EDTA/l in 1 × PBS) befanden und für 30 Minuten auf einen Schüttler bei 37°C Raumtemperatur gestellt. Nach dieser Zeit wurde die enzymatische Reaktion gestoppt, indem man die Dermisstücke in eine andere Petrischale überführte, in welcher sich ECBM (+5% FCS) befand.

Die Dermisstücke wurden dann einzeln mit einem Skalpell in einer weiteren Petrischale ausgekratzt. Nach ca. 3 Stückchen wurde die sich in der Petrischale befindende Flüssigkeit/Suspension mit 5 ml ECGM aufgenommen und steril in ein 50 ml-Falcon-Tube filtriert. Nachdem so mit allen Dermisstücken verfahren wurde, wurde die so gewonnene Lösung in dem Röhrchen für 10 Minuten bei 1200 U/min und 4°C zentrifugiert. Das so gewonnene Zellpellet wurde nach Verwerfen des Überstandes in 10 ml ECGM resuspendiert. Eine 50 µl-Probe wurde der Suspension entnommen und nach Anfärbung mit Trypanblau im Verhältnis 1 : 1 in der Neubauer Zählkammer ausgezählt. Die Zellen wurden dann in einer Dichte von ca. 5 × 10⁵ Zellen pro 4 ml Medium pro Zellkulturflasche, die zuvor mit 1,5%iger Gelatine beschichtet wurden, ausgesät und im Brutschrank bei 37°C und 5%iger CO₂-Begasung inkubiert. Der Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage.

Das Ausplattieren der Zellsuspension, die aus der Dermis gewonnen wurde, resultierte in einer Mischkultur aus adhärenten Zellen, die nach 1-2 Tagen erkennbar wurden. Es handelt sich hierbei v. a. um Fibroblasten, Endothelzellen, aber auch Keratinozyten. Wenn diese primäre Zellkultur nach 7-10 Tagen subkonfluent war, wurde die weitere Isolation der humanen mikrovaskulären Endothelzellen durchgeführt.

Beispiel 2 Isolation einer Kultur von humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC) aus der in Beispiel 1 gewonnen Mischkultur Materialien

Dynabeads M-450 Goat anti-Mouse IgG (Dynal, Hamburg; Deutschland, Cat. No. 110.05)
CD31 anti-human (Dianova, Hamburg, Deutschland, Cat. No. CBL

468

)
Dynal MPC® E (Dynal, Hamburg, Deutschland, Cat. No. 120.04)

Prinzip

Das Prinzip besteht in einer positiven, indirekten Isolation der Zellen. Dynabeads® M-450 Goat anti-Mouse IgG binden an bestimmte zelluläre Oberflächenantigene durch einen primären Mausantikörper. Zuerst werden die Zellen mit einem spezifischen Maus-IgG anti­ human Primärantikörper inkubiert und danach mit dem Dynabead-Antikörper, welcher an die Erstantikörper bindet.

Die zu isolierende Zellart ist nun spezifisch an die Dynabeads gebunden. Diese kann nun einfach und spezifisch von der heterogenen Suspension entfernt werden, indem man die Test-Tubes, die die Zielzellen mit den gebundenen magnetischen Beads enthalten, in den Dynal MPC-® E stellt. Dabei handelt es sich um einen Magneten, der insgesamt 6 Tubes vom Eppendorff-Typ (8-10 mm Durchmesser, 1.0-1.5 ml Volumen, Typ Standard-Mikro) fassen kann. Die an die magnetischen Dynabeads gekoppelten Zellen werden durch das magnetische Feld an die Wand der Tubes gezogen und am Platz gehalten. Nun wird die Flüssigkeit abgesaugt, in der sich alle nicht an die Dynabeads gekoppelten Zellen befinden und somit von der gewünschten Zellart getrennt.

Protokoll

Nach 7-10 Tagen, wenn eine Subkonfluenz von 60-70% erreicht war, wurden die Zellen mit Trypsin/EDTA abtrypsiniert und für 10 Minuten bei 1200 U/min und 4°C abzentrifugiert. Das so gewonnene Zellpellet wurde in 1 ml 4°C kaltem ECGM-MV resuspendiert und anschließend die Zellzahl mittels der Neubauer Zählkammer ausgezählt.

Wichtig ist nun, daß alle folgenden Schritte kalt, d. h. bei 4°C durchgeführt werden müssen bzw. daß die Zellsuspension so schnell wie möglich wieder ins Kalte kommt. Nach der Abtrypsinierung folgt nun - die für die indirekte Technik typische - Inkubation der heterogenen Zellsuspension mit dem IgG Maus-anti-human-Erstantikörper, CD31 (PECAM-1, platelet endothelial cell adhesion molecule-1), in einer Konzentration von 1 µg pro 10⁶ Zellen für 30 Minuten bei 2-8°C, wobei leichtes Mischen gewährleistet sein sollte, so daß sich die Zellen nicht absedimentieren. Die niedrige Temperatur soll die Interaktion mit phagozytierenden Zellen minimieren.

Nach diesen 30 Minuten schließt sich nun die Waschung der Zellen an, um nicht gebundenen überschüssigen Antikörper zu entfernen. Dazu wird in einem ersten Schritt das sich im Kulturgefäß befindliche Volumen erhöht und die Suspension für 10 Minuten bei 1200 U/min und 4°C abzentrifugiert. Diese Waschung der vorbehandelten Zellen wird mindestens 2 mal durchgeführt. Die Zellen sind nun mit dem spezifischen primären Antikörper bedeckt.

Parallel hierzu fängt man mit der Vorbereitung der Dynabeads M-450 Goat anti-Mouse IgG an. Diese müssen vor Gebrauch zuerst gewaschen werden, da sie in einer für die Zellen toxischen Flüssigkeit aufbewahrt werden. Zunächst resuspendiert man die Dynabeads sorgfältig zu einer homogenen Lösung, bevor man die benötigte Menge entnimmt und sie in Eppendorff-Tubes (1,5 ml) transferiert. Anschließend fügt man 1 ml ECBM hinzu und mischt gut. Die Tubes werden dann für 2 Minuten in den Dynal MPC gestellt, um danach - während die Tubes noch im Magneten stehen - die Flüssigkeit abzuziehen. Dann werden die Tubes aus dem Magneten genommen und die Waschung wird wiederholt.

Die nun gewaschenen Dynabeads M-450 Goat anti-Mouse IgG werden nun zu den mit Antikörper markierten Zellen gegeben, und zwar in einer Konzentration von 2 µl pro 10⁶ Zellen. Vom Hersteller wird zwar eine Konzentration von 1-2 × 10⁷ Dynabeads pro ml Probe empfohlen, doch hat sich oben genannte Konzentration als effektiver erwiesen. Optimalerweise sollten mindestens 4 Dynabeads pro Zielzelle veranschlagt werden. Dieses Gemisch wird nun für 20 Minuten bei bidirektionaler Rotation inkubiert, was zu einer maximalen Bindungseffizienz führen soll.

Nach dieser Zeit werden die Eppendorff-Tubes für 2 Minuten in den Magneten gestellt und danach, während die Tubes sich noch im Magnetständer befinden, wird der Überstand abgezogen. Dieser Vorgang sollte mindestens 4-5 mal mit ECGM wiederholt werden.

Danach wurden die so isolierten Zellen in mit Gelatine beschichteten 25 cm² Kulturflaschen ausgesät und bei 37°C und 5% CO₂-Begasung inkubiert. Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage.

Beispiel 3 Isolierung von humanen Keratinozyten Materialien

Keratinozytenmedium SF (Gibco, Eggenstein, Deutschland)
NCS (Gibco, Eggenstein, Deutschland)
75 cm²

KULTURFLASCHEN (COSTAR, Bodenheim, Deutschland, Cat. No. 3376)

Protokoll

Die Epidermis, die man nach der Trennung von der Dermis erhält, wurde wie folgt weiterverarbeitet:
Zunächst wurde sie mit einer Schere in kleine Stücke geschnitten und dann portionsweise in sterile Röhrchen gegeben, in denen sich je 5 ml Trypsin/EDTA befindet. Dieser Schritt dient der Spaltung der desmosomalen Verbindungen der Zellen.

Dies inkubiert man nun für 30 Minuten in einem 37°C warmen Schüttelbad, zusätzlich werden die Röhrchen alle 5 Minuten maschinell geschüttelt. Um die Enzymaktivität abzustoppen, wurden zu jedem Röhrchen 7 ml 10%iges NCS gegeben. Nach Filtration durch einen sterilen Zellfilter wurde die Lösung für 10 Minuten bei 1200 U/min und 4°C abzentrifugiert. Das so gewonnene Zellpellet wurde vorsichtig in serumfreiem Keratinozytenmedium, dem EGF (5 ng/ml, Gibco, Eggenstein), Rinderhypophysenextrakt (50 µg/ml, Gibco, Eggenstein) und Gentamycin einer Konzentration von 1 mg/ml zugesetzt wurden, resuspendiert. Nach Bestimmung der Zellzahl mittels der Neubauer-Zählkammer werden die Zellen in einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen/13 ml Medium pro 75 cm² Zellkulturflasche ausgesät und im Brutschrank bei 37°C und 5%iger CO²-Begasung inkubiert. Das Medium wurde alle 2-3 Tage gewechselt.

Bei ca. 70-80%iger Konfluenz wurden die Zellen das erste Mal passagiert. Hierzu wurden je 2 ml Trypsin in die Flaschen gegeben und diese für 5-10 Minuten in den Brutschrank gestellt. Die Zellen wurden durch Klopfen vom Flaschenboden gelöst. Die Trypsinierung wurde durch Zugabe von 5 ml 10%igen NCS abgestoppt, die Zellen dann abzentrifugiert, in Medium resuspendiert und in einer Dichte von 1 × 10⁶ pro 75 cm² Kulturflasche erneut ausgesät. So kann man über mehrere Passagen verfahren.

Beispiel 4 Kultivierung von HMVEC Material

Trypan Blue (Sigma, Deisenhofen, Deutschland, Cat. No. T-8154)

Protokoll

Wenn die Kultur eine Konfluenz von 70-90% erreicht hatte, wurde eine Passagierung durchgeführt. Hierzu wurde zunächst das Medium aus den Kulturflaschen abgesaugt und dann die Kultur einmal mit PBS gespült. Sodann wurde der Kultur 2 ml auf 37°C erwärmtes Trypsin hinzugefügt. Sobald sich die Zellen abzurunden begannen, wurde das Trypsin wieder abgesaugt. Sofort danach sorgte man durch intermittierendes Abklopfen, sogenanntes "shake-off", dafür, daß die Zellen sich vom mit Gelatine beschichteten Flaschenboden abzulösen begannen. Dann gab man ECGM MV hinzu und spülte die Zellen ab, überführte diese Suspension in 50 ml Falcon-Tubes und zentrifugierte sie für 10 Minuten bei 1200 U/min und 4°C ab. Das so gewonnene Pellet wurde in 5 ml ECGM MV gründlich resuspendiert und in der Neubauer-Zählkammer gezählt. Hierzu wurden 50 µl der Zellsuspension mit 50 µl Trypanblau sehr gut gemischt.

Anschließend wurden die Zellen in mit Gelatine beschichteten Kulturflaschen ausgesät, und zwar mit einer Zelldichte von 3.000-5.000 Zellen pro cm² und im Brutschrank gelagert.

Beispiel 5 Herstellung einer Endothelzellen-Fibrinkleber-Suspension Material

TISSUCOL® Duo S (Packungsgröße

1

, Immuno, Fa. Baxter, Wien, Österreich)
TISSUCOL® Duo S 1 ml Immuno ist ein biologischer Zweikomponentenkleber bestehend aus zwei tiefgefrorenen Lösungen in Fertigspritzen. In der einen Fertigspritze befindet sich die 1 ml Kleberproteinlösung, die als Komponenten Humanplasmaproteinfraktion mit Fibrinogen, Blutgerinnungsfaktor XIII, Plasmafibronectin und bovines Aprotinin enthält. In der anderen Fertigspritze befindet sich 1 ml Thrombinlösung, die humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat enthält. Des weiteren ist der Packung auch das Applikationssystem Duploject® beigefügt, mit dem die beiden Spritzen parallel entleert werden können, was eine homogene Durchmischung und damit eine gleichmäßigere und durchgehende Verfestigung des Fibrinklebers ermöglicht.

Protokoll

Für die Herstellung der Endothelzellen-Fibrinkleber-Suspension wurden die Endothelzellkulturen, die nach Passage 3 eine 70-80%ige Konfluenz aufwiesen, wie bei der Durchführung einer Passage abtrypsiniert, abzentrifugiert, resuspendiert und ausgezählt. Durch erneutes Abzentrifugieren einer definierten Menge Medium mitsamt Zellen bekam man so ein Pellet, in welchem die Zellzahl bekannt war. Dieses konnte nun in der gewünschten Konzentration in einem handelsüblichen Fibrinkleber (TISSUCOL® Duo S. Packungsgröße 1, Immuno, Fa. Baxter, Wien, Österreich) resuspendiert werden.

Zur Resuspension des Zellpellets war die Thrombinlösung aufgrund ihrer geringeren Viskosität besser geeignet. Hierzu resuspendierte man das definierte Endothelzellpellet (hier: 12 × 10⁶ Zellen) unter sterilen Bedingungen in der Spritze mit der Thrombinlösung. Die Zellkonzentration betrug somit ca. 6 × 10⁶ Endothelzellen/ml Endvolumen Fibrinkleber. Das Applikationssystem wurde dann fertig montiert und bis zur weiteren Verarbeitung bei 4°C gelagert.

Es wurde je 300 µl (enthielten ca. 1 × 10⁶ Zellen) des Gemischs in das Insert einer 24-Well Platte gespritzt, und nach Verfestigung des Klebers gab man 2 ml ECGM MV dazu. Probenentnahmen erfolgten an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 14, wobei jede Probe doppelt angelegt war. Die Proben wurden schockgefroren und anschließend immunhistochemisch aufgearbeitet.

Es wurden HE-Färbungen sowie Immunhistochemien für CD31 (Endothelzellmarker) und CD105 (Endothelzellproliferationsmärker) durchgeführt. Es fanden sich vitale Zellen in der Fibrinklebermatrix über den gesamten Untersuchungszeitraum. Beginnend mit Tag 3 war eine zunehmende Bildung kapillarähnlicher Strukturen im Sinne eines dreidimensionalen Netzes in der Fibrinmatrix zu beobachten. Ein großer Anteil der Zellen war dabei auch CD105 positiv (proliferierende Endothelzellen).

Einige Proben der in der Thrombinkonzentration enthaltenen Zellen wurden bei 4°C gelagert und nach 2, 4, und 24 Stunden auf ihre Vitalität hin überprüft. Dies geschah mittels Anfärben mit Trypanblau. Da bei intakter Zellmembran die Endothelzellen den Farbstoff nicht aufnahmen, konnte man so auf einfache Weise die vitalen Zellen von den abgestorbenen Zellen unterscheiden.

Die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und der Endothelzellen- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension erfolgte analog. Im letzteren Fall wurden Endothelzellen und Keratinozyten im Verhältnis 1 : 1 verwendet. Auch hierbei entsprach die finale Zellkonzentration wieder 6 × 10⁶ Zellen pro ml Fibrinkleber, wobei sich hierbei 3 × 10⁶ Endothelzellen und 3 × 10⁶ Keratinozyten im Kleber befanden.

Wichtig hierbei ist zu erwähnen, daß die Zellen sowohl als Endothelzellen-Keratinozyten- Fibrinkleber-Suspension als auch Einzelzell-Suspension appliziert werden können. Bei ersterem Verfahren organisieren sich die Keratinozyten an der Oberfläche und bilden ein Epithel aus, beim zweiten Vorgehen wird zunächst die Endothelzellsuspension aufgetragen. Nach Aushärten des Fibringemisches (< 1 min) kann dann in einem zweiten Schritt die Keratinozytensuspension aufgetragen werden.

Beispiel 6 Herstellung einer Suspension aus transfizierten Endothelzellen, Keratinozyten und Fibrinkleber (Transfektion mit dem angiogenen Wachstumsfaktor hVEGF-165)

Zunächst wurden die Zellen, wie bereits oben beschrieben, vorbereitet.

Parallel hierzu wurde die Transfektionsmischung vorbereitet. Hierzu wurden 1 µg DNA mit dem DNA-kondensierenden Puffer, Buffer EC, zu einem Endvolumen von 150 µl verdünnt. Da das pCMX-hVEGF-165-Plasmid in einer Konzentration von 2 µg/µl vorliegt, wurden 0,5 µl DNA mit 149,5 µl Puffer EC verdünnt. Dann wurden 8 µl Enhancer hinzugegeben und vermischt. Es folgte eine 2-5minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Nach Zugabe von 25 µl Effectene^TM zu der DNA-Enhancer Lösung inkubierte man für weitere 5-10 Minuten. Nach dieser Zeit gab man die Thrombinlösung aus dem TISSUCOL Duo S Fibrinkleber hinzu und vermischte alles sehr gut, so daß eine gleichmäßige Verteilung der Transfektionsmischung im Thrombin gewährleistet war. Das definierte Zellpellet, bestehend aus 3 × 10⁶ Endothelzellen und 3 × 10⁶ Keratinozyten, wurde anschließend ebenfalls in der Thrombinlösung resuspendiert und zwar so, daß eine homogene Verteilung der Zellen gewährleistet war.

Nach Transfektion der Endothelzellen und Expression des VEGF-Proteins kam es zu einer signifikanten Proliferationssteigerung der Endothelzellen sowohl in zwei- als auch in dreidimensionaler Kultur. In dreidimensionaler Matrix war eine verstärkte Bildung kapillarähnlicher Strukturen nachweisbar.

Beispiel 7 Tierexperimentelle Untersuchungen

Zur Untersuchung des in vivo-Verhaltens der in Suspension befindlichen Endothelzellen und Keratinozyten wurden Versuche an Nacktmäusen durchgeführt. Bei den immuntoleranten Mäusen ist eine Abstoßungsreaktion der implantierten humanen Zellen ausgeschlossen.

Sowohl Einzelzellsuspensionen wie auch Mischkultursuspensionen wurden getestet. Folgendes Modell wurde angewandt:
Auf dem Rücken der Nacktmäuse wurde eine subcutane Tasche geschaffen, in die die Fibrinklebersuspensionen injiziert wurden. Danach erfolgte der Wundverschluß. Nach 4, 7, 14 und 21 Tagen wurden Proben des behandelten Areals entnommen und histologisch untersucht.

Die in Fibrinkleber suspendierten implantierten Zellen überlebten nach Implantation. Bei der Endothelzellsuspension war eine Formierung kapillarähnlicher Strukturen nachweisbar (sogenannte "tube like structures"). In den Grenzzonen zum Subcutangewebe war ein Einsprossen von Kapillaren aus der Umgebung zu erkennen. Diese schienen Verbindungen zu den kapillarähnlichen Strukturen zu entwickeln.

Die Keratinozytensuspensionen wurden zudem in einem weiteren Wundmodell getestet. Dazu wurde auf dem Rücken von Nacktmäusen eine Exzisionswunde angelegt. Diese Wunde wurde mit der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension abgedeckt. In den entnommenen Proben konnte nachgewiesen werden, daß sich ein komplettes Epithel ausgebildet hatte.

Somit organisiert sich jeder Zelltyp nach Applikation im Fibrinkleber. Die Keratinozyten bilden eine epitheliale Schicht, während die Endothelzellen kapillarähnliche Strukturen ausbilden.

Claims (21)

1. Verfahren zur Herstellung eines Kits zur Behandlung von Wunden, das folgende Schritte umfaßt:

• a) Isolierung von Keratinozyten aus einer Vollhautbiopsie;
• b) Isolierung von Endothelzellen aus einer Vollhautbiopsie;
• c) Suspendieren der Keratinozyten in Fibrinkleber oder in einer Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird; und
• d) Suspendieren der Endothelzellen in Fibrinkleber oder in einer Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird,

wobei die Schritte a) und b) in beliebiger Reihenfolge oder gleichzeitig durchgeführt werden können, und die Schritte c) und d) in beliebiger Reihenfolge oder gleichzeitig durchgeführt werden können.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten in einem ersten Fibrinkleber oder in einer ersten Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert werden und die Endothelzellen in einem zweiten Fibrinkleber oder in einer zweiten Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten und die Endothelzellen in demselben Fibrinkleber oder in derselben Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten nach Schritt a) und vor Schritt c) für wenigstens 24 Stunden in vitro kultiviert werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Endothelzellen nach Schritt b) und vor Schritt d) für wenigstens 24 Stunden in vitro kultiviert werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten und/oder Endothelzellen autologe Zellen sind.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Endothelzellen mikrovaskuläre Endothelzellen sind.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Endothelzellen und die Keratinozyten aus derselben Vollhautbiopsie isoliert werden.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsuspensionen nach Schritt c) und d) in eine Spritzvorrichtung gegeben werden.

10. Kit erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.

11. Kit zur Behandlung von Wunden, das Keratinozyten, die in Fibrinkleber oder in einer Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert sind, und Endothelzellen, die in Fibrinkleber oder in einer Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert sind, enthält.

12. Kit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten in einem ersten Fibrinkleber oder in einer ersten Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert sind, und die Endothelzellen in einem zweiten Fibrinkleber oder in einer zweiten Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert sind.

13. Kit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten und die Endothelzellen in demselben Fibrinkleber oder in derselben Zusammensetzung, die zur Herstellung von Fibrinkleber verwendet wird, suspendiert sind.

14. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten und die Endothelzellen aus derselben Vollhautbiopsie stammen.

15. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten und/oder Endothelzellen autologe Zellen sind.

16. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Endothelzellen mikrovaskuläre Endothelzellen sind.

17. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsuspensionen in einer Spritzvorrichtung enthalten sind.

18. Verwendung von Fibrinogen, Thrombin, Endothelzellen und Keratinozyten zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Wunden.

19. Verfahren zur Behandlung von Wunden, dadurch gekennzeichnet, daß in Fibrinkleber suspendierte Endothelzellen und in Fibrinkleber suspendierte Keratinozyten auf die Wunde aufgetragen werden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine Suspension auf die Wunde aufgetragen wird, in der Endothelzellen und Keratinozyten enthalten sind.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Fibrinklebersuspension auf die Wunde aufgetragen wird, in der Endothelzellen enthalten sind, und anschließend eine zweite Fibrinklebersuspension auf die Wunde aufgetragen wird, in der Keratinozyten enthalten sind.