DE60204482T2 - Substituierte 6h-dibenzo[c,h]chromene als oestrogene agentien - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft substituierte 6H-Dibenzo[c,h]chromene, welche als estrogene Wirkstoffe brauchbar sind.
  • Die pleiotropen Wirkungen von Estrogenen in Säugetiergeweben sind gut dokumentiert worden und es wird nun anerkannt, dass Estrogene viele Organsysteme beeinflussen [Mendelsohn und Karas, New England Journal of Medicine 340: 1801–1811 (1999), Epperson et al., Psychosomatic Medicine 61: 676-697 (1999), Crandall, Journal of Womens Health & Gender Based Medicine 8: 1155–1166 (1999), Monk und Brodaty, Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 11: 1–10 (2000), Hurn und Macrae, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 20: 631–652 (2000), Carlvin, Maturitas 34: 195–210 (2000), Finking et al., Zeitschrift für Kardiologie 89: 442–453 (2000), Brincat, Maturitas 35: 107–117 (2000), Al-Azzawi, Postgraduate Medical Journal 77: 292–304 (2001)]. Estrogene können auf mehreren Wegen Wirkungen auf Gewebe ausüben und der am Besten gekennzeichnete Wirkungsmechanismus ist ihre Interaktion mit Estrogenrezeptoren, was zu Veränderungen von Gentranskription führt. Estrogenrezeptoren sind Ligand-aktivierte Transkriptionsfaktoren und gehören zur nuklearen Hormonrezeptor-Überfamilie. Weitere Mitglieder dieser Familie schließen die Progesteron-, Androgen-, Glukokortikoid- und Mineralkortikoidrezeptoren ein. Nach Binden von Ligand dimerisieren diese Rezeptoren und können entweder durch direktes Binden an spezifische Sequenzen an DNA (welche als Response-Elemente bekannt sind) oder durch Interagieren mit anderen Transkriptionsfaktoren (wie AP1), welche ihrerseits direkt an spezifische DNA-Sequenzen binden, Gentranskription aktivieren [Moggs und Orphanides, EMBO Reports 2: 775–781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869–36872 (2001), McDonnell, Principles of Molecular Regulation, p. 351–361 (2000)]. Eine Klasse von „co-regulatorischen" Proteinen kann auch mit dem Ligand-gebundenen Rezeptor interagieren und seine transkriptionale Wirksamkeit weiter modulieren [McKenna et al., Endocrine Reviews 20: 321–344 (1999)]. Es ist ebenfalls gezeigt worden, dass Estrogenrezeptoren NFKB-vermittelte Transkription auf sowohl eine Ligand-abhängige, als auch unabhängige Weise unterdrücken können [Quaedackers et al., Endocrinology 142: 1156–1166 (2001), Bhat et al., Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 37: 233–240 (1998), Pelzer et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 286: 1153–7 (2001)].
  • Estrogenrezeptoren können auch durch Phosphorylierung aktiviert werden. Diese Phosphorylierung wird durch Wachstumsfaktoren wie EGF vermittelt und verursacht Veränderungen in Gentranskription in Abwesenheit von Ligand [Moggs und Orphanides, EMBO Reports 2: 775–781 (2001), Hall et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869–36872 (2001)].
  • Ein weniger gut gekennzeichnetes Mittel, durch welches Estrogene Zellen beeinflussen können, ist ein sogenannter Membranrezeptor. Die Existenz solch eines Rezeptors ist umstritten, aber es ist gut dokumentiert worden, dass Estrogene sehr schnelle nicht-genome Antworten von Zellen auslösen können. Die molekulare Einheit, welche zur Transduktion dieser Wirkungen verantwortlich ist, ist noch nicht definitiv isoliert worden, aber es gibt Anzeichen die nahe legen, dass sie zumindest mit den nuklearen Formen der Estrogenrezeptoren verwandt ist [Levin, Journal of Applied Physiology 91: 1860–1867 (2001), Levin, Trends in Endocrinology & Metabolism 10: 374–377 (1999)].
  • Zwei Estrogenrezeptoren sind bis jetzt entdeckt worden. Der erste Estrogenrezeptor wurde vor etwa 15 Jahren kloniert und wird nun als ERα bezeichnet [Green et al., Nature 320: 134–9 (1986)]. Die zweite Form des Estrogenrezeptors wurde vergleichsweise kürzlich gefunden und wird ERβ genannt [Kuiper et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 5925–5930 (1996)]. Frühe Arbeit an ERβ fokussierte auf das Definieren seiner Affinität für eine Vielfalt an Liganden und tatsächlich wurden einige Unterschiede zu ERα gesehen. Die Gewebeverteilung von ERβ ist beim Nager gut aufgezeichnet und stimmt mit ERα nicht überein. Gewebe wie der Maus- und Rattenuterus exprimieren überwiegend ERα, während die Maus- und Rattenlunge überwiegend ERβ exprimieren [Couse et al., Endocrinology 138: 4613–4621 (1997), Kuiper et al., Endocrinology 138: 863–870 (1997)]. Selbst innerhalb des gleichen Organs kann die Verteilung von ERα und ERβ aufgeteilt sein. Zum Beispiel wird ERβ in den Mäuseeierstöcken hochgradig in den Granulosazellen exprimiert und ERα ist auf die Theka- und Stromazellen beschränkt [Sar und Welsch, Endocrinology 140: 963–971 (1999), Fitzpatrick et al., Endocrinology 140: 2581–2591 (1999)]. Jedoch gibt es Beispiele, wo die Rezeptoren co-exprimiert werden, und es gibt Anzeichen aus in vitro Studien, dass ERα und ERβ Heterodimere bilden können [Cowley et al., Journal of Biological Chemistry 272: 19858–19862 (1997)].
  • Eine große Anzahl an Verbindungen ist beschrieben worden, welche die Wirkung von 17β-Estradiol entweder imitieren oder blockieren. Verbindungen mit grob den gleichen biologischen Wirkungen wie 17β-Estradiol, das wirkkräftigste endogene Estrogen, werden als „Estrogenrezeptoragonisten" bezeichnet. Jene, welche seine Wirkungen blockieren, wenn sie in Kombination mit 17β-Estradiol gegeben werden, werden „Estrogenrezeptorantagonisten" genannt. In der Realität gibt es ein Kontinuum zwischen Estrogenrezeptoragonist- und Estrogenrezeptorantagonist-Wirksamkeit und tatsächlich verhalten sich einige Verbindungen wie Estrogenrezeptoragonisten in einigen Geweben und Estrogenrezeptorantagonisten in anderen. Diese Verbindungen mit gemischter Wirksamkeit werden selektive Estrogenrezeptormodulatoren (SERMS) genannt uns sind therapeutisch brauchbare Wirkstoffe (z. B. EVISTA) [Mc-Donnell, Journal of the Society for Gynecologic Investigation 7: S10–S15 (2000), Goldstein et al., Human Reproduction Update 6: 212–224 (2000)]. Der genaue Grund, warum die gleiche Verbindung Zell-spezifische Wirkungen haben kann, ist nicht erläutert worden, aber die Unterschiede bei der Rezeptorkonformation und/oder beim Milieu von co-regulatorischen Proteinen sind vorgeschlagen worden.
  • Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass Estrogenrezeptoren unterschiedliche Konformationen annehmen, wenn sie Liganden binden. Jedoch ist die Konsequenz und Feinheit dieser Veränderungen erst kürzlich aufgedeckt worden. Die dreidimensionalen Strukturen von ERα und ERβ sind durch Co-Kristallisation mit verschiedenen Liganden gelöst worden und zeigen deutlich die Repositionierung von Helix 12 in Gegenwart eines Estrogenrezeptorantagonisten, welcher die Proteinsequenzen sterisch behindert, welche für Rezeptor co-regulatorische Proteininteraktion erforderlich sind [Pike et al., Embo 18: 4608–4618 (1999), Shiau et al., Cell 95: 927–937 (1998)]. Zusätzlich ist die Technik der Phagenanzeige verwendet worden, um Peptide zu identifizieren, die mit Estrogenrezeptoren in der Gegenwart von unterschiedlichen Liganden interagieren [Paige et al., Proceedings of the National Aca demy of Sciences of the United States of America 96: 3999–4004 (1999)]. Zum Beispiel wurde ein Peptid identifiziert, das zwischen ERα, gebunden an den vollen Estrogenrezeptoragonisten 17β-Estradiol und Diethylstilbesterol unterschied. Von einem anderen Peptid wurde gezeigt, dass es zwischen Clomiphen, gebunden an ERα und ERβ unterschied. Diese Daten zeigen an, dass jeder Ligand den Rezeptor potentiell in eine einzigartige und unvorhersehbare Konformation platziert, von der wahrscheinlich ist, dass sie getrennte biologische Wirksamkeiten hat.
  • Wie oben erwähnt beeinflussen Estrogene eine Palette an biologischen Prozessen. Wo Geschlechtsunterschiede beschrieben worden sind (z. B. Krankheitshäufigkeiten, Antworten auf Challenge usw.) ist es zusätzlich möglich, dass die Erklärung den Unterschied von Estrogengraden zwischen männlich und weiblich einbezieht.
  • Sathyamoorthy und Wang, European Journal of Cancer 33: 2384–2389 (1997) berichten von unterschiedlichen Wirkungen der diätischen Phyto-Estrogene Daidzein und Equol auf Krebs MCF-7 Zellen von menschlicher Brust. US-A-5696'127 betrifft unter anderem Isochromenochinolone als Steroidrezeptormodulatoren und Lloyd und Meegan, Idrugs 3: 632–642 (2000) besprechen kürzliche Fortschritte bei Estrogenrezeptorantagonisten.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Diese Erfindung sieht estrogene Verbindung der Formel I mit der Struktur
    Figure 00040001
    vor, worin
    R1 und R2 jeweils unabhängig ausgewählt werden aus Wasserstoff, Hydroxyl, Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2– 7 Kohlenstoffatomen, Alkinyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen oder Halogen; worin die Alkyl- oder Alkenylkomponenten von R1 oder R2 gegebenenfalls substituiert sein können mit Hydroxyl, -CN, Halogen, Trifluoralkyl, Trifluoralkoxy, -NO2 oder Phenyl; und mit der Maßgabe, dass mindestens eines von R1 oder R2 für Hydroxyl steht;
    R3, R4, R5, R6 und R7 jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Halogen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, -CN, Alkenyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Alkinyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, -CHO, Phenyl oder einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring mit 1 bis 4 Heteroatomen, ausgewählt aus O, N oder S darstellen; worin die Alkyl- oder Alkenylkomponenten von R4, R5, R6 oder R7 gegebenenfalls substituiert sein können mit Hydroxyl, -CN, Halogen, Trifluoralkyl, Trifluoralkoxy, -NO2 oder Phenyl; worin die Phenylkomponente von R4 oder R5 gegebenenfalls mono-, di- oder trisubstituiert sein kann mit Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Halogen, Hydroxyl, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, -CN, -NO2, Amino, Alkylamino mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Dialkylamino mit 1–6 Kohlenstoffatomen pro Alkylgruppe, Thio, Alkylthio mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkylsulfinyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkylsulfonyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Alkylcarbonyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen oder Benzoyl;
    oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  • Pharmazeutisch annehmbare Salze können aus organischen und anorganischen Säuren gebildet werden, zum Beispiel Essig-, Propion-, Milch-, Zitronen, Wein-, Bernstein-, Fumar-, Malein-, Malon-, Mandel-, Äpfel, Phthal-, Salz-, Bromwasserstoff-, Phosphor-, Salpeter-, Schwefel-, Methansulfon-, Naphthalinsulfon-, Benzolsulfon-, Toluolsulfon-, Kampfersulfon- und ähnlichen bekannten annehmbaren Säuren, wenn eine Verbindung dieser Erfindung eine basische Komponente enthält. Salze können auch aus organischen und anorganischen Basen gebildet werden, wie Alkalimetallsalze (zum Beispiel Natrium, Lithium oder Kalium), Erdalkalimetallsalze, Ammoniumsalze, Alkylammoniumsalze, welche 1–6 Kohlenstoffatome enthalten, oder Dialkylammoniumsalze, welche 1–6 Kohlenstoffatome in jeder Alkylgruppe enthalten, und Trialkylammoniumsalze, welche 1–6 Kohlenstoffatome in jeder Alkylgruppe enthalten, wenn eine Verbindung dieser Erfindung eine saure Komponente enthält.
  • Die Begriffe Alkyl und Alkenyl als Gruppe oder Teil einer Gruppe (z. B. Alkoxy, Alkylthio, Alkylcarbonyl) schließen sowohl verzweigte, als auch geradkettige Komponenten, z. B. aus 1–6 bzw. 2–7 Kohlenstoffatomen ein. Beispiele schließen Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isopropyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, Vinyl, Allyl, 1-Methylvinyl und ähnliche ein. Wenn Alkyl- oder Alkenylkomponenten substituiert sind, können sie typischerweise mono-, di-, tri- oder persubstituiert sein. Beispiele für einen Halogensubstituenten schließen 1-Bromvinyl, 1-Fluorvinyl, 1,2-Difluorvinyl, 2,2-Difluorvinyl, 1,2,2-Trifiuorvinyl, 1,2-Dibromethan, 1,2-Difluorethan, 1-Fluor-2-bromethan, CF2CF3, CF2CF2CF3 und Ähnliche ein. Der Begriff Halogen schließt Brom, Chlor, Fluor und Iod ein.
  • Bevorzugte 5-6-gliedrige heterocyclische Ringe schließen Furan, Thiophen, Pyrrol, Isopyrrol, Pyrazol, Imidazol, Triazol, Dithiol, Oxathiol, Isoxazol, Oxazol, Thiazol, Isothiazolem, Oxadiazol, Furazan, Oxatriazol, Dioxazol, Oxathiazol, Tetrazol, Pyran, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Triazin, Oxazin, Oxathiazin oder Oxadiazin ein. Es wird mehr bevorzugt, dass der heterocyclische Ring Furan oder Thiophen ist.
  • Wie gemäß dieser Erfindung verwendet bedeutet der Begriff „Vorsehen" bezüglich Vorsehen einer durch diese Erfindung abgedeckten Verbindung oder Substanz entweder direktes Verabreichen solch einer Verbindung oder Substanz oder Verabreichen einer Proarznei, eines Derivats oder Analogs, welches die wirksame Menge der Verbindung oder Substanz innerhalb des Körpers bilden wird.
  • In einigen Ausführungsformen stellen R6 und R7 jeweils unabhängig Wasserstoff oder Halogen dar, zum Beispiel steht R6 für Wasserstoff oder Fluor.
  • R4 und R5 können zum Beispiel unabhängig ausgewählt werden aus Wasserstoff, Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Halogen, Alkenyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, -CN, Furyl und Thienyl. In einigen Ausführungsformen steht R4 nicht für Wasserstoff, z. B. wird R4 beispielsweise ausgewählt aus Cyano, Chlor, Brom, Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Methoxy, Vinyl, Thien-2-yl und Thien-3-yl.
  • Beispiele für R5 sind Wasserstoff und Halogen, z. B. Chlor.
  • Beispiele für R2 und R3 sind jeweils unabhängig Wasserstoff, Halogen, z. B. Chlor oder Hydroxyl.
  • Beispiele für R1 sind Wasserstoff, Hydroxyl und Halogen, z. B. Chlor.
  • In einigen Ausführungsformen steht nur eines von R1 und R2 für Hydroxy.
  • Beispiele für R3 sind Wasserstoff und Halogen wie Chlor, z. B. in der 4-Position.
  • Von den Verbindungen dieser Erfindung wird es bevorzugt, dass R6 und R7 jeweils unabhängig Wasserstoff oder Halogen darstellen; und R4 und R5 jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Halogen, Alkenyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, -CN, Furyl oder Thienyl darstellen. Es wird mehr bevorzugt, dass R1, R2 und R3 jeweils unabhängig Wasserstoff, Halogen oder Hydroxyl darstellen; und es wird noch mehr bevorzugt, dass R4 nicht für Wasserstoff steht.
  • Es werden ebenfalls Verfahren zum Herstellen der Verbindungen dieser Erfindung vorgesehen. Entsprechend sieht diese Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der Formel I vor, welches eines der Folgenden umfasst:
    • a) Dealkylieren einer Verbindung der Formel II:
      Figure 00070001
      worin R für eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht und R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 wie hierin definiert sind, um eine Verbindung der Formel I zu ergeben; oder
    • b) Deacylieren einer Verbindung der Formel III:
      Figure 00080001
      worin R' eine Acylgruppe darstellt, z. B. Alkanoyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen wie Acetyl, R11 für R1 oder eine Acyloxygruppe steht, z. B. Alkanoyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen wie Acetyl, R12 für R2 oder eine Acyloxygruppe steht, z. B. Alkanoyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen wie Acetyl, und R3, R4, R5, R6, R7 wie hierin definiert sind, um eine entsprechende Verbindung der Formel I zu ergeben; oder
    • c) Umsetzen einer 12-Bromverbindung der Formel IV:
      Figure 00080002
      geschützt wie notwendig, worin R1, R2, R3, R5, R6 und R7 wie hierin definiert sind, mit einem passenden reaktiven Derivat der Formel R4-L worin R4 für Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen oder einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring mit 1 bis 4 Heteroatomen steht, ausgewählt aus O, N oder S, und worin L für eine passende Abgangsgruppe steht, z. B. steht L für Boronsäure (wie Butylboronsäure oder 2-Thiophenboronsäure) oder ein Butylzinnderivat (wie Allyltributylzinn) steht; und Entfernen jeglicher Schutzgruppen, um eine entsprechende Verbindung der Formel (I) zu ergeben; oder
    • d) Halogenieren einer Verbindung der Formel I:
      Figure 00090001
      wie in Anspruch 1 definiert, geschützt falls notwendig, und worin mindestens eines von R1, R2, R3, R4 und R5 für Wasserstoff steht, mit einem Halogenierungsmittel, z. B. N-Bromsuccinimid, N-Chlorsuccinimid, gefolgt falls nötig von Entschützung, um eine Verbindung der Formel I zu ergeben, worin mindestens eines von R1, R2, R3 und R4 für Halogen steht; oder
    • e) Nitrilieren (also Einführen von CN) einer Verbindung der Formel I:
      Figure 00090002
      wie hierin definiert, geschützt wie notwendig, und worin R4 für Brom steht, mit einem Nitrilierungsmittel, z. B. Zinkcyanid, gefolgt falls notwendig von Entschützung, um eine Verbindung der Formel I zu ergeben, worin R4 für Cyano steht; oder
    • f) Umwandeln einer basischen Verbindung der Formel I in ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon oder umgekehrt.
  • Die bei der Herstellung der Verbindungen dieser Erfindung verwendeten Reagenzien können entweder im Handel erhalten werden oder können durch Standardverfahren hergestellt werden, welche in der Literatur beschrieben werden. Bei jeder dieser hierin beschriebenen Umsetzungen können reaktive Substituentengruppen oder Stellen geschützt werden, bevor die Umsetzung durchgeführt wird, und die Schutzgruppe danach entfernt werden.
  • In Verfahren a) oben, wo entweder R1 und R2 auch für Alkoxy steht, kann diese Gruppe in der gleichen Umsetzung dealkyliert werden, um eine entsprechende Verbindung der Formel I zu ergeben, worin R1 und/oder R2 für Hydroxy stehen.
  • Die Herstellung von mehreren repräsentativen Beispielen dieser Erfindung gemäß den obigen Verfahren werden in den folgenden Schemata 1–10 beschrieben.
  • Schema 1
    Figure 00110001
  • Schema 2
    Figure 00110002
  • Schema 3
    Figure 00110003
  • Schema 4
    Figure 00120001
  • Schema 5
    Figure 00120002
  • Schema 6
    Figure 00130001
  • Schema 7
    Figure 00130002
  • Schema 8
    Figure 00140001
  • Schema 9
    Figure 00140002
  • Schema 10
    Figure 00150001
  • Pharmakologische Standardtestverfahren sind leicht erhältlich, um das Wirksamkeitsprofil einer gegebenen Testverbindung zu bestimmen. Das Folgende fasst kurz mehrere repräsentative Testverfahren zusammen und kann Daten für repräsentative Verbindungen der Erfindung einschließen. Alle Tests, außer der Radioligand-Bindungstest, können verwendet werden, um Estrogenrezeptor-Agonist- oder Antagonistwirksamkeit von Verbindungen nachzuweisen. Im Allgemeinen wird Estrogenrezeptor-Agonistwirksamkeit durch Vergleichen der Wirksamkeit der Verbindung mit einem Referenz-Estrogen (z. B. 17β-Estradiol, 17α-Ethinyl, 17β-Estradiol, Estron, Diethylstilbesterol usw.) gemessen. Estrogenrezeptor-Antagonistwirksamkeit wird im Allgemeinen durch Co-Behandeln der Testverbindung mit dem Referenz-Estrogen und Vergleichen des Ergebnisses mit demjenigen, welches mit dem Referenz-Estrogen al-lein erhalten wurde, gemessen. Pharmakologische Standardtestverfahren für SERMs werden auch in US-Patenten 4418068 und 5998402 vorgesehen, welche hiermit durch Verweis eingeschlossen werden.
  • Bewertung von Bindungsaffinitäten an ERα und ERβ
  • Repräsentative Beispiele der Erfindung wurden bezüglich ihrer Fähigkeit bewertet, mit 17β-Estradiol für sowohl ERα, als auch ERβ in einem herkömmlichen Radioligand-Bindungstest zu konkurrieren. Dieses Testverfahren sieht die Methodik vor, die relativen Bindungsaffinitäten für die ERα oder ERβ Rezeptoren zu bestimmen. Das verwendete Verfahren wird unten kurz beschrieben.
  • Herstellung von Rezeptorextrakten zur Kennzeichnung von Bindungsselektivität. Die Ligandbindungsdomänen, welche bequemerweise hier als die Sequenz unterhalb der DNA-Bindungsdomäne definiert sind, wurden durch PCR erhalten, unter Verwendung von cDNA in voller Länge als Matrizen und Primer, die passende Restriktionsstellen zum Subklonieren enthielten, während der passende Leserahmen zur Expression beibehalten wurde. Diese Matrizen enthielten Aminosäuren M250–V595 von menschlichem ERα [Green et al., Nature 320: 134–9 (1986)] und M214–Q530 von menschlichem ERβ [Ogawa et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 293: 122–6 (1998)]. Menschliches ERβ wurde in pETl5b kloniert (Novagen, Madison WI) als ein Nco1-BamH1 Fragment, welches eine C-terminale Flag-Markierung trägt. Menschliches ERα wurde wie bei menschlichem ERβ kloniert, außer, dass eine N-terminale His-Markierung zugegeben wurde. Die Sequenzen aller verwendeten Konstrukte wurden durch vollständiges Sequenzieren beider Stränge verifiziert.
  • BL21(DE3) Zellen wurden verwendet, um die menschlichen Proteine zu exprimieren. Typischerweise wurde eine 10 ml Kultur über Nacht verwendet, um eine 1 l Kultur aus LB Medium zu inokulieren, welche 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und Inkubation setzte sich bei 25°C für 2 Stunden fort. Zellen wurden durch Zentrifugation (1500 × g) geerntet und die Pellets wurden mit 100 ml von 50 mM Tris-Cl (pH 7,4), 150 mM NaCl gewaschen und darin resuspendiert. Die Zellen wurden durch zweimaliges Passieren durch einen Drückfilter (French Press) bei 12000 psi lysiert. Das Lysat wurde durch Zentrifugation bei 12000 × g für 30 Minuten bei 4°C geklärt und bei –70°C gelagert.
  • Bewertung von Extrakten bezüglich spezifischer [3H]-Estradiolbindung. Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (Gibco, 1 × Endkonzentration), ergänzt durch 1 mM EDTA, wurde als Testpuffer verwendet. Um die Menge an in dem Test zu verwendendem Rezeptor zu optimieren, wurden [3H]-17β-Estradiol (New England Nuclear; Endkonzentration = 2 nM) ± 0,6 μM Diethylstilbestrol und 100 μl verschiedener Verdünnungen des E. coli Lysats zu jeder Mulde einer hochgradig bindenden, maskierten Mikrotiterschale (EG & G Wallac) zugegeben. Das Testendvolumen betrug 120 μl und die Konzentration an DMSO war ≤ 1%. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 5–18 Stunden wurde nicht gebundenes Material abgesaugt und die Schale wurde dreimal mit annähernd 300 μl Testpuffer gewaschen. Nach dem Waschen wurden 135 μl Szintillationscocktail (Optiphase Supermix, EG & G Wallac) zu den Mulden zugegeben und die Schale wurde versiegelt und für mindestens 5 Minuten bewegt, um Szintillant mit rückständigem Waschpuffer zu mischen. Gebundene Radioaktivität wurde durch Flüssigkeitsszintillationszählung (EG & G Wallac Microbeta Plus) bewertet.
  • Nach Bestimmung der Verdünnung von jedem Rezeptorpräparat, das maximale spezifische Bindung vorsah, wurde der Test durch Schätzen des IC50 von nicht markiertem 17β-Estradiol unter Verwendung von verschiedenen Verdünnungen des Rezeptorpräparats weiter optimiert. Eine Arbeitsendverdünnung für jedes Rezeptorpräparat wurde gewählt, für welche der IC50 von nicht markiertem 17β-Estradiol 2–4 nM betrug.
  • Ligandbindungswettbewerb-Testverfahren. Testverbindungen wurden anfänglich in DMSO gelöst und die Endkonzentration von DMSO im Bindungstest betrug ≤ 1%. Acht Verdünnungen von jeder Testverbindung wurden als nicht markierte Wettbewerber für [3H]-17β-Estradiol verwendet. Typischerweise würde ein Satz Verbindungsverdünnungen gleichzeitig an menschlichem ERα und ERβ getestet. Die Ergebnisse wurden als gemessener DPM gegenüber Konzentration an Testverbindung geplottet. Für Dosis-Response Kurvenanpassung wurde ein Vier-Parameter Rechenmodell an die transformierten, gewichteten Daten angepasst und der IC50 wurde als die Konzentration von Verbindung definiert, welche maximale [3H]-Estradiolbindung um 50% verringert.
  • Bindungsaffinitäten für ERα und ERβ (wie durch IC50 gemessen) für repräsentative Beispiele der Erfindung werden in Tabelle (1) gezeigt.
  • Figure 00180001
  • Die in dem oben beschriebenen pharmakologischen Standard testverfahren erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Verbindungen dieser Erfindung beide Subtypen des Estrogenrezeptors binden. Die IC50er sind im Allgemeinen für ERβ niedriger, was darauf hinweist, dass diese Verbindungen vorzugsweise ERβ selektive Liganden sind, aber noch als wirksam an ERα angesehen werden. Verbindungen dieser Erfindung werden eine Bandbreite an Wirksamkeit aufweisen, basierend zumindest teilweise auf ihren Rezeptoraffinitäts-Selektivitätsprofilen. Da die Verbindungen der Erfindung ER-β mit höherer Affinität binden, als ER-α, werden sie beim Behandeln oder Hemmen von Krankheiten brauchbar sein, die über ER-β moduliert werden können. Da jeder Rezeptorligandkomplex einzigartig ist und so seine Interaktion mit verschiedenen co-regulatorischen Proteinen einzigartig ist, werden Verbindungen dieser Erfindung zusätzlich unterschiedliche und unvorhersehbare Wirksamkeiten je nach zellulärem Kontext zeigen. Zum Beispiel ist es bei einigen Zelltypen für eine Verbindung möglich, sich wie ein Estrogenrezeptoragonist zu verhalten, während in anderen Geweben wie ein Estrogenrezeptorantagonist. Verbindungen mit solcher Wirksamkeit sind manchmal als SERMs (Selective Estrogen Receptor Modulators) bezeichnet worden. Anders als viele Estrogene verursachen viele der SERMs jedoch keine Erhöhungen des Uterus-Nassgewichts. Diese Verbindungen sind anti-estrogen im Uterus und können die trophischen Wirkungen von Estrogenrezeptoragonisten in uterinärem Gewebe vollständiq antagonisieren. Diese Verbindungen wirken jedoch als Estrogenrezeptoragonisten in den Knochen, kardiovaskulären und zentralen Nervensystemen. Aufgrund dieser Gewebe-selektiven Eigenart dieser Verbindungen sind sie brauchbar beim Behandeln oder Hemmen von Krankheitszuständen oder Syndromen in einem Säuger, welche durch einen Estrogenmangel (in bestimmten Geweben wie Knochen oder kardiovaskulär) oder einen Überschuss an Estrogen (im Uterus oder Brustdrüsen) verursacht werden, oder damit in Verbindung stehen. Zusätzlich haben Verbindungen dieser Erfindung ebenfalls das Potential, sich wie Estrogenrezeptoragonisten an einem Rezeptortyp zu verhalten, während sie sich am anderen wie Estrogenrezeptorantagonisten verhalten. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass Verbindungen die Wirkung von 17β-Estradiol über ERβ antagonisieren, während sie Estrogenrezeptor-Agonistwirksamkeit bei ERα aufweisen [Sun et al., Endocrinology 140: 800–804 (1999)]. Solche ERSAA (Estro gen Receptor Selective Agonist Antagonist) Wirksamkeit sieht pharmakologisch getrennte estrogene Wirksamkeit innerhalb dieser Serie von Verbindungen vor.
  • Regulierung von Metallothionein II mRNA
  • Estrogene, welche durch ERβ, aber nicht ERα wirken, können Metallothionein II mRNA Gehalte in Saos-2 Zellen hochregulieren, wie durch Harris [Endocrinology 142: 645–652 (2001)] beschrieben. Ergebnisse dieses Testverfahrens können mit Ergebnissen aus den unten beschriebenen Testverfahren (ERE-Reporter Testverfahren) kombiniert werden, um ein Selektivitätsprofil für Verbindungen dieser Erfindung zu erzeugen (siehe auch WO-00/37681).
  • Bewertung von Testverbindung unter Verwendung eines ERE-Reporter Testverfahrens in MCF-7 Brustkrebszellen
  • Vorratslösungen aus Testverbindungen (üblicherweise 0,1 M) werden in DMSO hergestellt und dann 10- bis 100-fach mit DMSO verdünnt, um Arbeitslösungen von 1 oder 10 mM herzustellen. Die DMSO-Vorräte werden bei entweder 4°C (0,1 M) oder –20°C (< 0,1 M) gelagert. MCF-7 Zellen werden zweimal die Woche mit Wachstumsmedium [D-MEM/F-12 Medium, welches 10% (Vol./Vol.) Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum, 1% (Vol./Vol.) Penicillin-Streptomycin und 2 mM glutaMax-1 enthielt] passiert. Die Zellen werden in belüfteten Kolben bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO2/95% befeuchteter Luft gehalten. Ein Tag vor der Behandlung werden die Zellen mit Wachstumsmedium bei 25000 Zellen/Mulde in 96-Mulden-Schalen plattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert.
  • Die Zellen werden für 2 Std. bei 37°C mit 50 μl/Mulde einer 1 : 10 Verdünnung aus Adenovirus 5-ERE-tk-Luciferase in experimentellem Medium [Phenol Rot freies D-MEM/F-12 Medium, welches 10% (Vol./Vol.) Hitze-inaktiviertes, mit Aktivkohle gestripptes, fötales Rinderserum, 1% (Vol./Vol.) Penicillin-Streptomycin, 2 mM glutaMax-1, 1 mM Natriumpyruvat enthielt] infiziert. Die Mulden werden dann einmal mit 150 μl experimentellem Medium gewaschen. Zum Schluss werden die Zellen für 24 Std. bei 37°C in Replikaten von 8 Mulden/Behandlung mit 150 μl/Mulde Vehikel (≤ 0,1% Vol./ Vol. DMSO) oder Verbindung behandelt, die ≥ 1000-fach in experimentellem Medium verdünnt ist.
  • Anfängliches Screening von Testverbindungen wird bei einer einzelnen Dosis von 1 μM durchgeführt, die allein (Estrogenrezeptoragonist-Modus) oder in Kombination mit 0,1 nM 17β-Estradiol (EC80; Estrogenrezeptorantagonist-Modus) getestet wird. Jede 96-Mulden-Schale schließt auch eine Vehikelkontrollgruppe (0,1% Vol./Vol. DMSO) und eine Estrogenrezeptoragonist-Kontrollgruppe (entweder 0,1 oder 1 nM 17β-Estradiol) ein. Dosis-Response Versuche werden in entweder den Estrogenrezeptoragonist- und/oder Estrogenrezeptorantagonist-Modi an wirksamen Verbindungen in log-Erhöhungen von 10–14 bis 10–5 M durchgeführt. Aus diesen Dosis-Response-Kurven werden EC50, bzw. IC50 Werte erzeugt. Die letzte Mulde in jeder Behandlungsgruppe enthält 5 μl von 3 × 10–5 M ICI-182,780 (10–6 M Endkonzentration) als Estrogenrezeptorantagonistkontrolle.
  • Nach der Behandlung werden die Zellen auf einem Schüttler für 15 Min. mit 25 μl/Mulde von 1X Zellkultur-Lysisreagens (Promega-Corporation) lysiert. Die Zelllysate (20 μl) werden auf eine 96-Mulden Luminometerschale übertragen und Luciferase-Wirksamkeit wird in einem MicroLumat LB 96 P Luminometer (EG & G Berthold) unter Verwendung von 100 μl/Mulde Luciferasesubstrat (Promega Corporation) gemessen. Vor der Injektion von Substrat wird eine 1 Sekunde Hintergrundmessung für jede Mulde durchgeführt. Nach der Injektion von Substrat wird die Luciferasewirksamkeit für 10 Sekunden nach einer Verzögerung von 1 Sekunde gemessen. Die Daten werden vom Luminometer auf einen Macintosh Personal Computer übertragen und unter Verwendung der JMP-Software (SAS Institute) analysiert; dieses Programm subtrahiert die Hintergrundablesung von der Luciferasemessung für jede Mulde und bestimmt dann den Mittelwert und die Standardabweichung für jede Behandlung.
  • Die Luciferasedaten werden durch Logarithmen transformiert und der Huber M-Schätzer wird verwendet, um die abseits gelegenen transformierten Beobachtungen nach unten zu gewichten. Die JMP-Software wird verwendet, um die transformierten und gewichteten Daten für Einweg ANOVA (Dunnett's Test) zu analysieren. Die Verbindungsbehandlungen werden mit den Vehikelkontrollergebnissen im Estrogenrezeptoragonist-Modus oder den positiven Estrogenrezeptoragonist-Kontrollergebnissen (0,1 nM 17β-Estradiol) im Estrogenrezeptorantagonist-Modus verglichen. Für den anfänglichen Einzeldosisversuch wird von den Ergebnissen als Pro zentsatz relativ zur 17β-Estradiolkontrolle berichtet, falls sich die Verbindungsbehandlungsergebnisse signifikant von der passenden Kontrolle unterscheiden (p < 0,05) (also ((Verbindung – Vehikelkontrolle)/(17β-Estradiolkontrolle – Vehikelkontrolle)) × 100). Die JMP-Software wird auch verwendet, um die EC50 und/oder IC50 Werte von den nicht-linearen Dosis-Response-Kurven zu bestimmen.
  • Bewertung uterotrophischer Wirksamkeit
  • Uterotrophische Wirksamkeit einer Testverbindung kann gemäß den folgenden pharmakologischen Standardtestverfahren gemessen werden.
  • Verfahren 1: sexuell unreife (18 Tage alte) Sprague-Dawley Ratten werden von Taconic erhalten und erhielten uneingeschränkten Zugang zu einer Casein-basierten Diät (Purina Mills 5K96C) und Wasser. An Tag 19, 20 und 21 werden die Ratten subkutan mit 17α-Ethinyl-17β-estradiol (0,06 μg/Ratte/Tag), Testverbindung oder Vehikel (50% DMSO/50% Dulbecco's PBS) dosiert. Um Estrogenrezeptorantagonist zu bewerten werden Verbindungen mit 17α-Ethinyl-17β-estradiol (0,06 μg/Ratte/Tag) zusammen verabreicht. Es gibt sechs Ratten/Gruppe und sie werden annähernd 24 Stunden nach der letzten Injektion durch CO2-Erstickung und Pneumothorax eingeschläfert. Die Uteri werden entfernt und nach Stutzen von verbundenem Fett und Ausdrücken der inneren Flüssigkeit gewogen. Eine Gewebeprobe kann zur Analyse von Genexpression (z. B. Komplement-Faktor 3 mRNA) auch schnellgefroren werden.
  • Verfahren 2: sexuell unreife (18 Tage alte) 129 SvE Mäuse wurden von Taconic erhalten und erhielten uneingeschränkten Zugang zu einer Casein-basierten Diät (Purina Mills 5K96C) und Wasser. An Tag 22, 23, 24 und 25 wurden die Mäuse subkutan mit Verbindung oder Vehikel (Maisöl) dosiert. Es gab sechs Mäuse/Gruppe und sie wurden annähernd 6 Stunden nach der letzten Injektion durch CO2-Erstickung und Pneumothorax eingeschläfert. Die Unteri wurden entfernt und nach Stutzen von verbundenem Fett und Ausdrücken der inneren Flüssigkeit gewogen. Die folgenden Ergebnisse (Tabelle (2)) wurden für repräsentative Verbindungen der Erfindung erhalten.
  • Figure 00230001
  • Bewertung von Osteoporose- und Lipidmodulation (Kardioschutz)
  • Weibliche Sprague-Dawley Ratten, ovariektomiert oder scheinoperiert, werden 1 Tag nach der Operation von Taconic Farms erhalten (Gewichtsbereich 240–275 g). Sie werden mit 3 oder 4 Ratten/Käfig in einem Raum mit einem 12/12 (hell/dunkel) Zeitplan untergebracht und mit Nahrungsmittel (Purina 5K96C Rattenfutter) und Wasser ad libitum versorgt. Die Behandlung für alle Studien beginnt einen Tag nach der Ankunft und die Ratten werden 7 Tage pro Woche wie angezeigt für 6 Wochen dosiert. Eine Gruppe von scheinoperierten Ratten mit passendem Alter, welche keinerlei Behandlung erhalten, dient als intakte, Estrogen übersättigte Kontrollgruppe für jede Studie.
  • Alle Testverbindungen werden in einem Vehikel aus 50% DMSO (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/1 × Dulbecco's Phosphat-Kochsalzlösung (GibcoBRL, Grand Island, NY) bei definierten Konzentrationen hergestellt, so dass das Behandlungsvolumen 0,1 ml/100 g Körpergewicht beträgt. 17β-Estradiol wird in Maisöl (20 μg/ml) gelöst und subkutan 0,1 ml/Ratte abgegeben. Alle Dosierungen werden in dreiwöchigen Intervallen gemäß den Gruppe-gemittelten Körpergewichtsmessungen angepasst und subkutan verabreicht.
  • Fünf Wochen nach dem Behandlungsbeginn und eine Woche vor Beendigung der Studie wird jede Ratte bezüglich Knochenmineraldichte (BMD) bewertet. Die gesamte und trabekuläre Dichte der proximalen Tibia werden bei anästhetisierten Ratten unter Verwendung eines XCT-960M (pQCT; Stratec Medizintechnik, Pforzheim, Deutschland) bewertet. Die Messungen werden wie folgt durchgeführt: fünfzehn Minuten vor dem Scannen wird jede Ratte mit einer intraperitonealen Injektion aus 95 mg/kg Ketamin, 8,5 mg/kg Xylazin und 1,5 mg/kg Acepromazin anästhetisiert.
  • Das rechte hintere Glied wird durch eine Polycarbonatröhre mit einem Durchmesser von 25 mm passiert und an einen Acrylrahmen mit dem Sprunggelenk in einem 90° Winkel und dem Kniegelenk bei 180° fixiert. Die Polycarbonatröhre wird an einer gleitenden Plattform angebracht, die sie senkrecht zur Öffnung des pQCT hält. Die Plattform wird angepasst, so dass das Distalende des Oberschenkelknochens und das proximale Ende der Tibia im Scanfeld liegt. Ein zweidimensionales Übersichtsbild wird für eine Länge von 10 mm und eine Linienauflösung von 0,2 mm laufen gelassen. Nachdem das Übersichtsbild auf dem Monitor gezeigt wird, wird das proximale Ende der Tibia lokalisiert. Der pQCT-Scan wird 3,4 mm distal von diesem Punkt begonnen. Der pQCT-Scan ist 1 mm dick, hat eine Voxel (dreidimensionale Pixel) Größe von 0,140 mm und besteht aus 145 Projektionen durch die Scheibe.
  • Nachdem der pQCT-Scan vollständig ist, wird das Bild auf dem Monitor gezeigt. Ein Bereich von Interesse einschließlich der Tibia aber ausschließlich der Fibula wird umrissen. Das weiche Gewebe wird unter Verwendung eines iterativen Algorithmus mathematisch entfernt. Die Dichte des verbleibenden Knochens (Gesamtdichte) wird in mg/cm3 angegeben. Die äußeren 55% des Knochens werden in einer kozentrischen Spirale mathematisch abgeschält. Die Dichte des verbleibenden Knochens (trabekuläre Dichte) wird in mg/cm3 angegeben.
  • Eine Woche nach der BMD-Bewertung werden die Ratten durch CO2-Erstickung und Pneumothorax eingeschläfert und Blut wird zur Cholesterinbestimmung gesammelt. Die Uteri werden ebenfalls entfernt und nach Stutzen von verbundenem Fett und Ausdrücken der luminalen Flüssigkeit gewogen. Gesamtcholesterin wird unter Verwendung eines Boehringer-Mannheim Hitachi 911 klinischen Analysators unter Verwendung des Cholesterin/HP-Kits bestimmt. Die Statistiken wurden unter Verwendung einer 1-Weg-Varianzanalyse mit Dunnet's Test verglichen.
  • Bewertung von Antioxidanswirksamkeit
  • Schweineaorten werden von einem Schlachthof erhalten, gewa schen, in gekühltem PBS transportiert und endotheliale Aortazellen werden geerntet. Um die Zellen zu ernten, werden die interkostalen Gefäße der Aorta abgebunden und ein Ende der Aorta wird geklammert. Frische, sterile, filtrierte 0,2% Collagenase (Sigma Typ I) wird in das Gefäß platziert und das andere Ende des Gefäßes dann geklammert, um ein geschlossenes System zu ergeben. Die Aorta wird bei 37°C für 15–20 Minuten inkubiert, wonach die Collagenaselösung gesammelt und für 5 Minuten bei 2000 × g zentrifugiert wird. Jedes Pellet wird in 7 ml endothelialem Zellkulturmedium suspendiert, welches aus Phenol-Rot freiem DMEM/ Ham's F12 Medium besteht, ergänzt durch Aktivkohle gestripptes FBS (5%), NuSerum (5%), L-Glutamin (4 mM), Penicillin-Streptomycin (1000 U/ml, 100 μg/ml) und Gentamycin (75 μg/ml), gesät in 100 mm Petrischale und inkubiert bei 37°C in 5% CO2. Nach 20 Minuten werden die Zellen mit PBS gespült und frisches Medium wird zugegeben, dies wurde wieder nach 24 Stunden wiederholt. Die Zellen sind nach annähernd 1 Woche konfluent. Die endothelialen Zellen werden routinemäßig zweimal die Woche gefüttert und, wenn konfluent, trypsiniert und bei einem 1 : 7 Verhältnis gesät. Zellvermittelte Oxidation von 12,5 μg/ml LDL darf sich in Gegenwart der zu bewertenden Verbindung (5 μM) für 4 Stunden bei 37°C fortsetzen. Die Ergebnisse werden als die prozentuale Hemmung des oxidativen Prozesses ausgedrückt, wie durch das TBARS (Thiobarbitursäure reaktive Substanzen) Verfahren zur Analyse von freien Aldehyden gemessen [Yagi, Biochemical Medicine 15: 212–6 (1976)].
  • Progesteron-Rezeptor mRNA Regulation pharmakologisches Standardtestverfahren
  • Dieses Testverfahren kann verwendet werden, um die estrogene oder antiestrogene Wirksamkeit von Verbindungen dieser Erfindung zu bewerten [Shughrue et al., Endocrinology 138: 5476–5484 (1997)]. Daten für repräsentative Verbindungen der Erfindung werden in Tabelle (3) gezeigt.
  • Figure 00260001
  • Hitzewallung bei Ratten Testverfahren
  • Die Wirkung von Testverbindungen auf Hitzewallungen kann in einem pharmakologischen Standardtestverfahren bewertet werden, welches die Fähigkeit einer Testverbindung misst, die Erhöhung der Schwanzhauttemperatur abzustumpfen, welche auftritt, wenn Morphium süchtigen Ratten die Droge unter Verwendung von Naloxon akut entzogen wird [Merchenthaler et al., Maturitas 30: 307–16 (1998)]. Es kann auch verwendet werden, um Estrogenrezeptor-Antagonistwirksamkeit durch Co-Dosierung von Testverbindung mit dem Referenz-Estrogen nachzuweisen.
  • Bewertung von vasomotorischer Funktion in isolierten Aortaringen von Ratten
  • Sprague-Dawley Ratten (240–260 Gramm) werden in 4 Gruppen aufgeteilt:
    • 1. Normal, nicht ovariektomiert (intakt)
    • 2. Ovariektomiert (Ovex) Vehikel behandelt
    • 3. Ovariektomiert 17β-Estradiol behandelt (1 mg/kg/Tag)
    • 4. Ovariektomierte Tiere, behandelt mit Testverbindung (ver schiedene Dosen)
  • Die Tiere werden annähernd 3 Wochen vor der Behandlung ovariektomiert. Jedes Tier erhält entweder 17-β-Estradiolsulfat (1 mg/kg/Tag) oder Testverbindung, suspendiert in destilliertem, entionisierten Wasser mit 1% Tween-80 durch eine Magensonde. Mit Vehikel behandelte Tiere erhielten ein angemessenes Volumen des Vehikels, welches in den mit Arznei behandelten Gruppen verwendet wurde.
  • Die Tiere werden durch CO2-Inhalation und Ausbluten eingeschläfert. Thorax-Aorten werden schnell entfernt und in 37°C physiologische Lösung mit der folgenden Zusammensetzung (mM) platziert: NaCl (54,7), KCl (5,0), NaHCO3 (25,0), MgCl2 2H2O (2,5), D-Glucose (11,8) und CaCl2 (0,2), begast mit CO2-O2, 95%/5 für einen End-pH von 7,4. Die Adventitia wird von der äußeren Oberfläche entfernt und das Gefäß wird in 2–3 mm breite Ringe geschnitten. Die Ringe werden in einem 10 ml Gewebebad suspendiert, wobei ein Ende am Grund des Bades befestigt wird und das andere an einen Kraftaufnehmer. Eine Ruhespannung von 1 Gramm wird auf die Ringe angewendet. Die Ringe werden für 1 Stunde äquilibriert, Signale werden gewonnen und analysiert.
  • Nach der Äquilibrierung werden die Ringe steigenden Konzentrationen von Phenylephrin (10–8 bis 10–4 M) ausgesetzt und die Spannung wird aufgezeichnet. Die Bäder werden dann 3 Mal mit frischem Puffer gespült. Nach dem Auswaschen werden 200 mM L-NAME zum Gewebebad zugegeben und für 30 Minuten äquilibriert. Die Phenylephrinkonzentration-Response-Kurve wird dann wiederholt.
  • Bewertung von kardio-protektiver Wirksamkeit
  • C57/B1J (apo E KO) Mäuse mit Apolipoprotein E Mangel werden von Taconic Farms erhalten. Alle Tierverfahren werden unter strenger Einhaltung von IACUC Richtlinien durchgeführt. Ovariektomierte weibliche apo E KO Mäuse, 4–7 Wochen alt, werden in Schuhkarton-Käfigen untergebracht und hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Tiere wurden willkürlich nach Gewicht in Gruppen (n = 12–15 Mäuse pro Gruppe) aufgeteilt. Den Tieren werden Testverbindungen oder Estrogen (17β-Estradiolsulfat bei 1 mg/kg/Tag) in der Diät unter Verwendung eines Genaudosierungsprotokolls dosiert, wo die Menge an konsumierter Diät wöchentlich gemessen und die Dosis entsprechend angepasst wird, basierend auf dem Tiergewicht. Die verwendete Diät ist eine Western-Style Diät (57U5), die durch Purina hergestellt wird, und enthält 0,50% Cholesterin, 20% Schmalz und 25 IU/KG Vitamin E. Die Tiere werden unter Verwendung dieses Paradigma für einen Zeitraum von 12 Wochen dosiert/gefüttert. Kontrolltiere werden mit der Western-Style Diät gefüttert und erhalten keine Verbindung. Am Ende des Untersuchungszeitraums werden die Tiere eingeschläfert und Plasmaproben werden erhalten. Die Herzen werden in situ durchschwemmt, zuerst mit Kochsalzlösung, dann mit neutral gepufferter 10% Formalinlösung.
  • Für die Bestimmung von Plasmalipiden und Lipoproteinen werden Gesamtcholesterin und Triglyceride unter Verwendung von enzymatischen Verfahren mit im Handel erhältlichen Kits von Boehringer Mannheim bzw. Wako Biochemicals bestimmt und unter Verwendung des Boehringer Mannheim Hitachii 911 Analysators analysiert. Abtrennung und Quantifizierung von Plasmalipoproteinen wurde unter Verwendung einer FPLC Größenfraktionierung durchgeführt. Kurz: 50–100 ml Serum werden filtriert und in Superose 12 und Superose 6 Säulen, verbunden in Serie, injiziert und bei einer konstanten Fließgeschwindigkeit mit 1 mM Natrium EDTA und 0,15 M NaCl eluiert. Bereiche von jeder Kurve, welche VLDL, LDL und HDL repräsentieren, werden unter Verwendung von Waters MillenniumTM Software integriert, und jede Lipoproteinfraktion wird durch Multiplizieren des Gesamtcholesterinwertes mit dem relativen Prozentbereich jedes betreffenden Chromatogramm-Peaks quantifiziert.
  • Für die Quantifizierung von Aorta-Atherosklerose werden die Aorten vorsichtig isoliert und in Formalin-Fixativ für 48–72 Stunden vor der Handhabung platziert. Atherosklerotische Läsionen werden unter Verwendung von Oil Red O Färbung identifiziert. Die Gefäße werden kurz entfleckt und dann unter Verwendung eines Nikon SMU800 Mikroskops, ausgestattet mit einem Sony 3CCD Videokamerasystem zusammen mit IMAQ Configuration Utility (National Instrument) als Bildgewinnungssoftware abgebildet. Die Läsionen werden en face entlang des Aortabogens unter Verwendung eines maßgeschneiderten Utility-Software-Pakets (Coleman Technologies) quantifiziert. Automatisierte Läsionsbewertung wird an den Gefäßen unter Verwendung der Grenzfunktion des Programms durchgeführt, speziell an der Region, welche innerhalb des Aortabogens vom proximalen Rand des brachio-cephalischen Rumpfs zum distalen Rand der linken Arterie unter dem Schlüsselbein enthalten ist. Aorta-atherosklerotische Daten werden als prozentuale Läsion-Einbeziehung streng innerhalb dieses definierten Luminalbereichs ausgedrückt.
  • Bewertung von Kognitionsverstärkung
  • Ovariektomierte Ratten (n = 50) werden an ein 8-armiges Radial-Labyrinth für 10-minütige Zeiträume an jedem von 5 aufeinander folgenden Tagen gewöhnt. Den Tieren wurde vor der Gewöhnung und dem Testen Wasser vorenthalten. Eine 100 μl Aliquote Wasser, platziert am Ende jedes Arms, dient als Verstärkung. Aneignung einer Win-Shift Aufgabe im Radial-Labyrinth wird erreicht, indem es dem Tier erlaubt wird, Zugang zu einem Arm mit Köder zu haben. Nach dem Trinken verlässt das Tier den Arm und tritt wieder in das zentrale Abteil ein, wo es nun Zugang zum vorher besuchten Arm oder zu einem neuen Arm hat. Eine richtige Antwort wird aufgezeichnet, wenn das Tier sich entscheidet, einen neuen Arm zu betreten. Jedem Tier werden 5 Versuche pro Tag für 3 Tage gegeben. Nach dem letzten Aneignungsversuch werden die Tiere einer der folgenden 4 Gruppen zugeteilt:
    • 1. Negative Kontrollen: injiziert mit 10% DMSO/Sesamöl Vehikel einmal täglich für 6 Tage (1 ml/kg, SC)
    • 2. Positive Kontrollen: injiziert mit 17β-Estradiolbenzoat für 2 Tage und getestet 4 Tage nach der zweiten Injektion (17β-Estradiolbenzoat bei 10 μg/0,1 ml pro Ratte)
    • 3. Estradiol: 17β-Estradiol wird täglich für 6 Tage injiziert (20 μg/kg, SC)
    • 4. Testverbindung: injiziert täglich für 6 Tage (Dosen variieren).
  • Alle Injektionen werden nach dem Testen am letzten Aneignungstag beginnen. Die letzte Injektion für Gruppen 1, 3 und 4 wird 2 Stunden vor Testen bezüglich Arbeitsgedächtnis stattfinden.
  • Der Test fürs Arbeitsgedächtnis ist eine verzögerte Nichtübereinstimmung mit Musterreiz (non-matching-to-sample DNMS) Aufgabe mit Nutzung von Verzögerungen von 15, 30 oder 60 Sekunden. Diese Aufgabe ist eine Variation der Aneignungsaufgabe, bei welcher die Ratte in die zentrale Arena platziert wird und einen Arm wie vorher betreten darf. Ein zweiter Arm wird geöffnet, sobald die Ratte den halben Weg den ersten Arm herunter durchquert hat, und wieder muss die Ratte diesen Arm wählen. Wenn sie den halben Weg diesen zweiten Arm herunter durchquert hat, werden beide Türen geschlossen und die Verzögerung wird eingesetzt. Sobald die Verzögerung abgelaufen ist, werden beide der ursprüng lichen zwei Türen und eine dritte neue Tür gleichzeitig geöffnet. Eine richtige Antwort wird aufgezeichnet, wenn das Tier den halben Weg den dritten, neuen Arm herunter wandert. Eine unrichtige Antwort wird aufgezeichnet, wenn das Tier den halben Weg entweder den ersten oder zweiten Arm herunter wandert. Jedes Tier wird 5 Versuche bei jedem der drei verzögerten Intervalle für insgesamt 15 Versuche pro Subjekt erhalten.
  • Bewertung von Wirkung auf Pleuritis
  • Die Fähigkeit, die Symptome von experimentell herbeigeführter Pleuritis bei Ratten zu verringern, kann gemäß dem Verfahren von Cuzzocrea [Endocrinology 141: 1455–63 (2000)] bewertet werden.
  • Bewertung von Schutz vor Glutamat-induzierter Cytotoxizität (Neuroprotektion)
  • Die neuroprotektive Wirksamkeit von Verbindungen dieser Erfindung kann in einem pharmakologischen Standardtestverfahren in vitro unter Verwendung von Glutamat-Challenge bewertet werden [Zaulyanov et al., Cellular & Molecular Neurobiology 19: 705–18 (1999); Prokai et al., Journal of Medicinal Chemistry 44: 110–4 (2001)].
  • Bewertung im Brust-Endknospen Testverfahren
  • Estrogene sind für volle Duktusverlängerung und Verzweigung der Brustgänge und nachfolgender Entwicklung von lobulo-alveolaren Endknospen unter dem Einfluss von Progesteron erforderlich. In diesem Testverfahren wurde die mammotrophische Wirksamkeit von ausgewählten Verbindungen der Erfindung gemäß dem folgenden pharmakologischen Standardtestverfahren bewertet. Achtundzwanzig Tage alte Sprague-Dawley Ratten (Taconic Farms, Germantown, NY) wurden ovariektomiert und ruhten für neun Tage. Die Tiere wurden unter einem 12-stündigen hell/dunkel Zyklus untergebracht und ihnen wurde Casein-basierte Purina Laboratory Rodent Diet 5K96 (Purina, Richmond, IN) gefüttert und ihnen wurde freier Zugang zu Wasser erlaubt. Die Ratten wurden dann subkutan für sechs Tage mit Vehikel (50% DMSO (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/50% 1 × Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (GibcoBRL, Grand Island, NY), 17β-Estradiol (0,1 mg/kg) oder Testverbindung (20 mg/kg) dosiert. Für die letzten drei Tage wurden die Ratten ebenfalls subkutan mit Progesteron (30 mg/kg) dosiert. Am siebten Tag wurden die Ratten eingeschläfert und ein Brustfettkissen wurde herausgeschnitten. Dieses Fettkissen wurde bezüglich Casein-Kinase II mRNA als Marker für Endknospenproliferation analysiert. Casein-Kinase II mRNA wurde durch Echtzeit RT-PCR analysiert. Kurz: RNA wurde Trizol (GibcoBRL, Grand Island, NY) folgend gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Proben wurden mit DNAse I unter Verwendung von DNA-freiem Kit (Ambion) behandelt und Casein-Kinase II mRNA Grade wurden durch Echtzeit RT-PCR unter Verwendung des Taqman Gold Verfahrens (PE Applied Biosystems) gemessen. Insgesamt 50 ng RNA wurden unter Verwendung von Casein-Kinase II spezifischem Primer-Paar (5' Primer, CACACGGATGGCGCATACT; 3' Primer, CTCGGGATGCACCATGAAG) und maßgefertigter Sonde (TAMRA-CGGCACTGGTTTCCCTCACATGCT-FAM) dreifach analysiert. Casein-Kinase II mRNA Grade wurden zu 18s ribosomaler RNA normalisiert, enthalten innerhalb jeder Probenumsetzung, unter Verwendung von durch PE Applied Biosystems gelieferten Primern und Sonden. Die folgenden Ergebnisse wurden für ein Beispiel der Erfindung erhalten (Tabelle (4)).
  • Figure 00310001
  • Bewertung im HLA Ratten pharmakologischen Standardtestverfahren für entzündliche Darmerkrankung
  • Repräsentative Verbindungen der Erfindung wurden im HLA Ratten pharmakologischen Standardtestverfahren bewertet, welches entzündliche Darmerkrankung bei Menschen nachahmt. Das Folgende beschreibt kurz das verwendete Verfahren und die erhaltenen Ergebnisse. Männliche HLA-B27 Ratten wurden von Taconic erhalten und erhielten unbeschränkten Zugang zu Nahrung (PMI Lab Diet 5001) und Wasser. Die Ratten wurden einmal täglich (oral) mit entweder Vehikel (2% Tween-80/0,5% Methylcellulose) oder Beispiel 1d (10 mg/kg) für 26 Tage dosiert. Die Stuhlqualität wurde täglich überwacht und gemäß der folgenden Skala bewertet: Diarrhöe = 3, weicher Stuhl = 2, normaler Stuhl = 1. Tabelle (5) zeigt, dass sich die Stuhlqualität nach Dosieren mit Beispiel 1d verbesserte. Am Ende der Studie wurde Serum gesammelt und bei –70°C gelagert. Ein Dickdarmabschnitt wurde zur histologischen Analyse präpariert und ein zusätzliches Segment wurde bezüglich Myeloperoxidasewirksamkeit analysiert.
    Figure 00330001
    • ND
    nicht bestimmt
    3
    Diarrhöe,
    2
    weicher Stuhl,
    1
    normaler Stuhl
  • Histologische Analyse: Dickdarmgewebe wurde in 10% neutral gepuffertes Formalin eingetaucht. Jede Dickdarmprobe wurde zur Bewertung in vier Proben geteilt. Die Formalin-fixierten Gewebe wurden in einem Tissue Tek Vakuum-Infiltrationsprozessor (Miles, Inc; West Haven, Connecticut) für Paraffineinbettung verarbeitet. Die Proben wurden bei 5 μm aufgeteilt und dann mit Hematoxylin und Eosin (H & E) für histologische Blindbewertungen unter Verwendung einer Skala, modifiziert nach Boughton-Smith, gefärbt. Nachdem die Bewertungen vollständig waren, wurden die Proben zuordenbar gemacht und die Daten wurden tabellarisiert und durch ANOVA lineare Modellbildung mit multiplen Mittelwertvergleichen analysiert. Abschnitte von Dickdarmgewebe wurden bezüglich mehrerer Krankheitsindikatoren bewertet und erhielten relative Bewertungen. Wie in Tabelle (6) gezeigt, ist Beispiel 1d wirksam beim Verringern mehrerer Messungen von Gewebeverletzung.
  • Figure 00340001
  • Bewertung in zwei Arthritismodellen
  • Lewis Rattentest für Adjuvans-induzierte Arthritis. Sechzig weibliche, 12 Wochen alte Lewis Ratten werden gemäß Standardeinrichtung-Arbeitsverfahren untergebracht. Sie erhalten eine Standarddiät an Nahrung und Wasser ad libitum. Jedes Tier wird durch eine Käfigkarte identifiziert, welche die Projektgruppe und Tiernummer anzeigt. Jede Rattennummer wird durch abriebfesten Tintenmarker auf den Schwanz markiert. Mindestens 10–21 Tage vor der Studie werden sie anästhetisiert und durch aseptische, chir urgische Verfahren ovariektomiert.
  • Freund's Adjuvant-Complete (Sigma Immuno Chemicals, St. Louis, MO) wird verwendet, um Arthritis herbeizuführen, wobei jeder ml 1 mg Mycobacterium tuberculosis, durch Hitze abgetötet und getrocknet, 0,85 ml Mineralöl und 0,15 ml Mannid-monooleat Losnummer 084H8800 enthielt.
  • Das Folgende sind Beispiele für zwei Testverfahren. Hemmungstestverfahren: Dreißig Ratten wird intradermal 0,1 ml Freund's Adjuvant-Complete am Schwanzansatz injiziert. Die Tiere werden willkürlich vier Gruppen zugeordnet, wobei jede Gruppe sechs Ratten enthält. Jeden Tag erhalten die Gruppen Vehikel (50% DMSO (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/1 × Dulbecco's Phosphat-Kochsalzlösung (GibcoBRL, Grand Island, NY)) oder Testverbindung (10 mg/kg, subkutan verabreicht). Alle Ratten beginnen die Behandlung an Tag 1. Die Daten für eine repräsentative Verbindung der Erfindung werden in Tabelle (7) gezeigt.
  • Behandlungstestverfahren: Dreißig Ratten wird intradermal 0,1 ml Freund's Adjuvant-Complete am Schwanzansatz injiziert. Die Tiere werden willkürlich vier Gruppen zugeordnet, wobei jede Gruppe sechs Ratten enthält. Jeden Tag erhalten die Gruppen Vehikel (50% DMSO (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/1x Dulbecco's Phosphat-Kochsalzlösung (GibcoBRL, Grand Island, NY)) oder Testverbindung (10 mg/kg, subkutan verabreicht). Alle Ratten beginnen die Behandlung an Tag 8 nach Adjuvans-Injektion. Die Daten für eine repräsentative Verbindung der Erfindung werden in Tabellen (8), (9) und (10) gezeigt.
  • Statistische Analysen wurden unter Verwendung von Abacus Concepts Super ANOVA (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) durchgeführt. Alle Parameter von Interesse wurden Varianzanalyse mit Duncan's neuem Mehrfachbereich post hoc Test zwischen Gruppen unterworfen. Daten werden durchwegs als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt und Unterschiede wurden als signifikant angesehen, falls p < 0,05.
  • Der Schweregrad der Arthritis wird täglich bezüglich der folgenden Krankheitsanzeichen überwacht: Hinterpfoten-Erythem, Hinterpfotenschwellung, Weichheit der Gelenke und Bewegungen und Haltung. Eine ganzzahlige Skala von 0 bis 3 wird verwendet, um den Grad an Erythem (0 = normale Pfote, 1 = leichtes Erythem, 2 = mäßiges Erythem, 3 = schweres Erythem) und Schwellung (0 = normale Pfote, 1 = leichte Schwellung, 2 = mäßige Schwellung, 3 = schwere Schwellung der Hinterpfote) zu quantifizieren. Der maximale Wert pro Tag ist 12.
  • Am Ende der Studie werden die Ratten mit CO2 eingeschläfert, die hinteren Glieder bei einer Obduktion entfernt und in 10% gepuffertem Formalin fixiert, und die Fußwurzelgelenke entkalkt und in Paraffin eingebettet. Histologische Abschnitte werden mit Hematoxylin und Eosin oder Saffranin O – Fast Green Farbe gefärbt.
  • Objektträger werden kodiert, so dass der Untersucher bezüglich der Behandlungsgruppen blind ist. Synoviales Gewebe aus Fußwurzelgelenken wird bewertet, basierend auf synovialer Hyperplasie, entzündlicher Zellinfiltration und Pannus-Bildung [Poole und Coombs, International Archives of Allergy & Applied Immunology 54: 97–113 (1977)], wie unten skizziert.
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Zusätzlich wird artikulärer Knorpel und Knochen unter Verwendung von Mankin's histologischem Bewertungssystem [Mankin et al., Journal of Bone & Joint Surgery – American Volume 53: 523–37 (1971)] wie unten gezeigt bewertet.
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Bewertung im HLA-B27 Rattenmodell für Arthritis. Repräsentative Verbindungen der Erfindung wurden im HLA-B27 Ratten pharmakologischen Standardtestverfahren bewertet, welches Arthritis bei Menschen nachahmt. Das Folgende beschreibt kurz das verwendete Verfahren und die erhaltenen Ergebnisse. Männliche HLA-B27 Ratten (8–10 Wochen alt) wurden von Taconic erhalten und erhielten unbeschränkten Zugang zu Nahrung (PMI Lab Diet 5001) und Wasser. Die Ratten wurden einmal täglich mit entweder Vehikel (2% Tween-80/0,5% Methylcellulose) oder Testverbindung (10 mg/kg) für 26 Tage dosiert. Gelenkwerte und Histologie werden wie oben für das Lewis-Ratten Modell für Adjuvans-induzierte Arthritis beschrieben bewertet. Daten für eine repräsentative Verbindung der Erfindung werden in Tabelle (11) gezeigt.
  • Figure 00420001
  • Bewertung in in vivo Modellen von Karzinogenese
  • Die Fähigkeit von Verbindungen dieser Erfindung, verschiedene bösartige Tumore oder hyperproliferative Störungen zu be handeln und zu hemmen, kann in pharmakologischen Standardtestverfahren bewertet werden, die in der Literatur leicht verfügbar sind, und schließen die beiden folgenden Verfahren ein.
  • Brustkrebs. Athymische nu/nu (nackte) Mäuse werden ovariektomiert von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) erhalten. Ein Tag vor der Tumorzellen-Injektion werden den Tieren Depot-Pellets implantiert, welche 0,36–1,7 mg 17β-Estradiol (60 oder 90 Tage Abgabe, Innovative Research of America, Sarasota, FL) oder ein Placebo enthalten. Das Pellet wird subkutan in den intraskapularen Bereich unter Verwendung eines 10-Gauge Präzisionstrochars eingeführt. Nachfolgend werden den Mäusen subkutan in das Brustgewebe entweder 1 × 107 MCF-7 Zellen oder 1 × 107 BG-1 Zellen injiziert. Die Zellen werden mit einem gleichen Volumen Matrigel gemischt, einem Grundmembran-Matrixpräparat, um Tumorbegründung zu verstärken. Testverbindungen können entweder durch Dosieren einen Tag nach der Tumorzellen-Implantation (Hemmungstherapie) bewertet werden, oder nachdem Tumore eine bestimmte Größe erreicht haben (Behandlungstherapie). Die Verbindungen werden entweder intraperitoneal oder oral in einem Vehikel aus 1% Tween-80 in Kochsalzlösung jeden Tag verabreicht. Die Tumorgröße wird alle drei oder sieben Tage bewertet.
  • Dickdarmkrebs. Die Fähigkeit, Dickdarmkrebs zu behandeln oder zu hemmen, kann im Testverfahren von Smirnoff [Oncology Research 11: 255–64 (1999)] bewertet werden.
  • Bewertung von Neuroprotektion in zwei in vivo Testverfahren
  • Vorübergehende globale Ischämie bei der Mongolischen Wüstenspringmaus. Die Wirkung von Testverbindungen beim Verhindern oder Behandeln von Hinverletzung als Antwort auf Sauerstoffmangel/Reperfusion kann unter Verwendung des folgenden Testverfahrens gemessen werden.
  • Weibliche Mongolische Wüstenspringmäuse (60–80 g; Charles River Laboratories, Kingston, NY) werden in der Wyeth-Ayerst Tierpflegeeinrichtung (AAALAC zertifiziert) mit einer 12 Stunden hell, 12 Stunden dunkel Photoperiode und freiem Zugang zu Leitungswasser und einer Estrogen-armen Casein-Diät (Purina; Richmond, IN) untergebracht. Nach Akklimatisierung (3–5 Tage) werden die Wüstenspringmäuse mit Isofluran (2–3% Gemisch mit O2) anästhetisiert, ovariektomiert (Tag 0). Beginnend am nächsten Morgen (Tag 1) werden die Wüstenspringmäuse subkutan jeden Tag mit entweder Vehikel (10% ETOH/Maisöl), 17β-Estradiol (1 mg/kg sc) oder einer experimentellen Verbindung behandelt. An Tag 6 werden Wüstenspringmäuse (n = 9–5/Gruppe) mit Isofluran anästhetisiert, die gewöhnlichen Halsschlagadern werden durch einen Mittellinien-Nackeneinschnitt sichtbar gemacht und beide Arterien gleichzeitig für 5 Minuten mit nicht-traumatischen Mikro-Aneurysma-Clips verschlossen. Nach der Okklusion werden die Clips entfernt, um cerebrale Reperfusion zu erlauben, und der Nackeneinschnitt wird mit Wundclips geschlossen. Alle Tiere fasten über Nacht vor der globalen Ischämie-Chirurgie, ein Schritt, der beständige ischämische Verletzung erleichtert. An Tag 12 werden die Wüstenspringmäuse einer tödlichen Dosis CO2 ausgesetzt und die Gehirne werden auf Trockeneis gefroren und bei –80°C gelagert. Die für diese Studien verwendeten Tierprotokolle werden durchgesehen und durch das Radnor/Collegeville Animal Care and Use Committee (RACUC/CACUC) bei Wyeth-Ayerst Research gebilligt.
  • Der Grad an neuronaler Protektion wird durch in situ Hybridisierungsanalyse von Neurogranin mRNA bewertet. Kurz: 20 μm koronale kryostatische Abschnitte werden auf mit Gelatine überzogenen Objektträgern gesammelt, getrocknet und bei –80°C gelagert. Zur Verarbeitungszeit werden die getrockneten Objektträger-Schachteln auf Raumtemperatur erwärmt, die Objektträger werden in 4% Paraformaldehyd post-fixiert, mit Essigsäureanhydrid behandelt und dann mit Chloroform und Ethanol delipidiert und dehydriert. Verarbeitete Abschnitt-haltende Objektträger werden dann mit 200 μl (6 × 106 DPM/Objektträger) einer Antisense- oder Sense- (Kontrolle) Ribosonde für Neurogranin (35S-UTP markiertes NG-241; Basen 99–340) in einem 50% Formamid-Hybridisierungsgemisch hybridisiert und über Nacht bei 55°C in einer befeuchteten Objektträger-Kammer ohne Eindeckung inkubiert. Am nächsten Morgen werden die Objektträger in Ständern gesammelt, in 2 × SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat; pH 7,0)/10 mM DTT eingetaucht, mit RNase A (20 μg/ml) behandelt und bei 67°C in 0,1 × SSC gewaschen (2 × 30 Min.), um unspezifische Markierung zu entfernen. Nach Dehydratation werden die Objektträger BioMax (BMR-1; Kodak) Röntgenfilm über Nacht gegenüber gestellt.
  • Der Grad an Neurogranin-Hybridisierungssignal wird verwendet, um den Grad an neuronalem Verlust in der CA1 Region nach Verletzung zu bewerten und die Wirksamkeit von 17β-Estradiol und Versuchsverbindungen zu bewerten. Neurogranin mRNA wird für diese Studien ausgewählt, weil es in den Hippokampus-Neuronen einschließlich CA1 hochgradig exprimiert wird, aber in Glia und anderen in dieser Hirnregion vorhandenen Zelltypen abwesend ist. Daher repräsentiert Messung der Menge an vorhandenem Neurogranin mRNA überlebende Neuronen. Messungen der relativen optischen Dichte von Neurogranin-Hybridisierungssignal werden von Film-Autoradiogrammen mit einem Computer-basierten Bildanalysesystem (C-Imaging Inc., Pittsburgh, PA) erhalten. Die Ergebnisse von 6 Abschnitten (40 μm auseinander) pro Tier werden gemittelt und statistisch bewertet. Numerische Werte werden als der Mittelwert ± SEM angegeben. Einweg-Varianzanalyse wird verwendet, um auf Unterschiede im Gehalt von Neurogranin mRNA zu testen und alle Aussagen von Nicht-Differenz in den Ergebnissen implizieren, dass p > 0,05.
  • Mittelzerebrale Arterienokklusion bei Mäusen. Neuroprotektion kann gemäß den durch Dubal [siehe Dubal et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98: 1952–1957 (2001), Dubal et al., Journal of Neuroscience 19: 6385–6393 (1999)] beschriebenen Testverfahren bewertet werden.
  • Ovulation hemmende pharmakologische Standardtestverfahren
  • Das Testverfahren wird verwendet, um zu bestimmen, ob Testverbindungen die Zeitsteuerung von Ovulation hemmen oder verändern können. Es kann auch verwendet werden, um die Anzahl an ovulierten Oozyten zu bestimmen [Lundeen et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 78: 137–143 (2001)].
  • Basierend auf den in den pharmakologischen Standardtestverfahren erhaltenen Ergebnissen sind die Verbindungen dieser Erfindung Estrogenrezeptormodulatoren, welche bei der Behandlung oder Hemmung von Bedingungen, Störungen oder Krankheitszuständen brauchbar sind, die zumindest teilweise durch einen Estrogenmangel oder Überschuss vermittelt werden, oder welche durch die Verwendung eines estrogenen Wirkstoffs behandelt oder gehemmt werden können. Die Verbindungen dieser Erfindung sind besonders brauchbar beim Behandeln eines peri-menopausalen, menopausalen oder post-menopausalen Patienten, bei welchem die Grade an erzeugten endogenen Estrogenen stark vermindert sind. Menopause wird im Allgemeinen definiert als die letzte natürliche menstruelle Periode und wird durch die Einstellung von Eierstockfunktionen gekennzeichnet, was zu erheblicher Minderung von zirkulierendem Estrogen im Blutstrom führt. Wie hierin verwendet schließt Menopause Zustände von verringerter Estrogenproduktion ein, die chirurgisch, chemisch oder durch einen Krankheitszustand verursacht sein mögen, welcher zu vorzeitiger Verringerung oder Einstellung von Eierstockfunktion führt.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung sind auch beim Hemmen oder Behandeln von anderen Wirkungen von Estrogenmangel brauchbar, einschließlich Hitzewallungen, vaginaler oder Vulva-Atrophie, atrophischer Vaginitis, vaginaler Trockenheit, Pruritus, Dyspareunie, Dysurie, häufigem Urinieren, Harninkontinenz, Entzündungen des Harnwegs. Weitere Verwendungen beim Fortpflanzungsgebiet schließen die Behandlung oder Hemmung von dysfunktionaler Uterusblutung ein. Die Verbindungen sind ebenfalls beim Behandeln oder Hemmen von Endometriose brauchbar.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung sind ebenfalls im Gehirn wirksam und sind daher zum Hemmen oder Behandeln von Alzheimer-Erkrankung, kognitiver Verminderung, verringerter Libido, seniler Demenz, neurodegenerativen Störungen, Depression, Angststörung, Insomnie, Schizophrenie und Unfruchtbarkeit brauchbar. Die Verbindungen dieser Erfindung sind auch beim Behandeln oder Hemmen von gutartigem oder bösartigem abnormen Gewebewachstum brauchbar, einschließlich Glomerulosklerose, Prostata-Hypertrophie, Leiomyomen des Uterus, Brustkrebs, Sklerodermie, Fibromatose, endometrialem Krebs, polyzystischem Ovarsyndrom, endometrialen Polypen, gutartiger Brusterkrankung, Adenomyose, Eierstockkrebs, Melanom, Prostatakrebs, Dickdarmkrebs, CNS-Krebsen wie Gliom oder Astioblastomie.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung sind kardio-protektiv und sind Antioxidantien und sind brauchbar beim Verringern von Cholesterin, Triglyceriden, Lp(a) oder LDL-Graden; Hemmen oder Behandeln von Hypercholesterinämie, Hyperlipidämie, kardiovaskulärer Erkrankung, Atherosklerose, peripher-vaskulärer Erkrankung, Restenose und Vasospasmen; und Hemmen vaskulärer Wandschädigung von zellulären Vorkommnissen, welche zu immun-vermittelter vaskulärer Schädigung führen. Die Verbindungen dieser Erfindung sind auch brauchbar beim Behandeln von Störungen in Verbindung mit Entzündungs- oder Autoimmunerkrankungen, einschließlich entzündlicher Darmerkrankung (Crohn-Krankheit, ulcerativer Kolitis, unbestimmter Kolitis), Arthritis (Rheumatoidarthritis, Spondyloarthropathien, Osteoarthritis), Pleurisie, Ischämie/Reperfusionsverletzung (z. B. Schlaganfall, Transplantatabstoßung, Myokardinfarkt usw.), Asthma, Riesenzellenarteritis, Prostatitis, interstitielle Zystitis, Uveitis, Psoriasis, Multiple Sklerose, systemischem Lupus erythematodes und Sepsis.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung sind ebenfalls brauchbar beim Behandeln oder Hemmen von Okularen Störungen einschließlich Katarakten, Uveitis und Makuladegeneration und beim Behandeln von Hautzuständen wie Alterung, Alopezie und Akne.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung sind ebenfalls brauchbar beim Behandeln oder Hemmen von metabolischen Störungen wie Diabetes Typ-II, des Lipid-Metabolismus, Appetits (z. B. Anorexia nervosa und Bulimie).
  • Verbindungen dieser Erfindung sind ebenfalls brauchbar beim Behandeln oder Hemmen von Blutungsstörungen wie angeborener hämorrhagischer Teleangiektasie, dysfunktionaler Uterusblutung und beim Bekämpfen von hämorrhagischem Schock.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung sind brauchbar bei Krankheitszuständen, wo Amenorrhöe vorteilhaft ist, wie Leukämie, endometrialer Ablation, chronischer renaler oder hepatischer Erkrankung oder Koagulationserkrankungen oder Störungen.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können als Empfängnisverhütungsmittel verwendet werden, insbesondere wenn sie mit einem Progestin kombiniert werden.
  • Wenn sie zur Behandlung oder Hemmung eines bestimmten Krankheitszustandes oder Störung verabreicht wird, versteht es sich, dass die wirksame Dosierung je nach besonderer, genutzter Verbindung, dem Verabreichungsweg, dem Zustand und der Schwere des behandelten Zustands, als auch verschiedenen physikalischen Faktoren, bezogen auf das behandelte Individium variieren kann. Wirksame Verabreichung der Verbindungen dieser Erfindung kann bei einer oralen Dosis von etwa 0,1 mg/Tag bis etwa 1000 mg/Tag gegeben werden. Vorzugsweise wird die Verabreichung von etwa 10 mg/Tag bis etwa 600 mg/Tag betragen, bevorzugter von etwa 50 mg/Tag bis etwa 600 mg/Tag, in einer einzelnen Dosis oder in zwei oder mehr getrennten Dosen. Von den geplanten täglichen Dosierungen wird erwartet, dass sie mit dem Verabreichungsweg variieren.
  • Solche Dosen können auf jede Weise verabreicht werden, welche brauchbar ist, die wirksamen Verbindungen hierin in den Blutstrom des Empfängers zu dirigieren, einschließlich oral, durch Implantate, parenteral (einschließlich intravenösen, intraperitonealen, intraartikulären und subkutanen Injektionen), rektal, intranasal, topisch, okular (durch Augentropfen), vaginal und transdermal.
  • Orale Formulierungen, welche die wirksamen Verbindungen dieser Erfindung enthalten, können jede herkömmlich verwendete orale Form umfassen, einschließlich Tabletten, Kapseln, bukkale Formen, Pastillen, Bonbons und orale Flüssigkeiten, Suspensionen und Lösungen. Kapseln können Gemische der wirksamen Verbindung (en) mit inerten Füllstoffen und/oder Verdünnungsmitteln enthalten, wie die pharmazeutisch annehmbaren Stärken (z. B. Mais-, Kartoffel- oder Tapiokastärke), Zucker, künstliche Süßstoffe, pulverisierte Zellulosen wie kristalline und mikrokristalline Zellulosen, Mehle, Gelatinen, Gummis usw. Brauchbare Tablettenformulierungen können durch herkömmliche Kompression, Nassgranulierungs- und Trockengranulierungsverfahren hergestellt werden und können pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel, Bindemittel, Schmiermittel, Aufschlussmittel, Oberflächenmodifizierende Wirkstoffe (einschließlich Surfaktanten), Suspensions- oder Stabilisierungsmittel, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talk, Natriumlaurylsulfat, mikrokristalline Cellulose, Carboxymethylcellulosecalcium, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Algininsäure, Akaziengummi, Xanthangummi, Natriumcitrat, komplexe Silicate, Calciumcarbonat, Glycin, Dextrin, Sucrose, Sorbitol, Dicalciumphosphat, Calciumsulfat, Lactose, Kaolin, Mannitol, Natriumchlorid, Talk, trockene Stärken und pulverisierten Zucker. Bevorzugte Oberflächenmodifizierende Wirkstoffe schließen nicht-ionische und anionische Oberflächenmodifizierende Wirkstoffe ein. Repräsentative Beispiele für Oberflächen-modifizierende Wirkstoffe schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Poloxamer 188, Benzalkoniumchlorid, Calciumstearat, Cetostearyl-Alkohol, Cetomacrogol emulgierendes Wachs, Sorbitanester, Colloidol-Silicondioxid, Phosphate, Natri umdodecylsulfat, Magnesiumaluminiumsilicat und Triethanolamin. Orale Formulierungen hierin können Standard-Verzögerungs- oder Depotformulierungen nutzen, um die Absorption der wirksamen Verbindungen) zu verändern. Die orale Formulierung kann auch aus Verabreichen des wirksamen Inhaltsstoffs in Wasser oder einem Fruchtsaft bestehen, welcher passende Aufschlussmittel oder Emulgatoren wie notwendig enthalten kann.
  • In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Verbindungen direkt in die Luftwege in Form eines Aerosols zu verabreichen.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Lösungen oder Suspensionen dieser wirksamen Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch annehmbares Salz können in Wasser hergestellt werden, geeignet gemischt mit einem Surfaktanten wie Hydroxy-propylcellulose. Dispersionen können auch in Glycerol, flüssigen Polyethylenglycolen und Gemischen daraus in Ölen hergestellt werden. Unter gewöhnlichen Bedingungen der Lagerung und Verwendung enthalten diese Präparate ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu hemmen.
  • Die pharmazeutischen Formen, welche zur injizierbaren Verwendung geeignet sind, schließen sterile wässerige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur extemporierten Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein. In allen Fällen muss die Form steril sein und muss zu dem Ausmaß flüssig sein, dass leichte Spritzbarkeit besteht. Sie muss unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und muss vor der verunreinigenden Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Fungi bewahrt werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, welches zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol), geeignete Gemische daraus und Pflanzenöle enthält.
  • Zum Zwecke dieser Offenbarung verstehen sich transdermale Verabreichungen so, dass sie alle Verabreichungen auf der Oberfläche des Körpers und der Innenverkleidung von Körperdurchlässen einschließen, einschließlich epithelialem und mukosalem Gewebe. Solche Verabreichungen können unter Verwendung der vorliegenden Verbindungen oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon in Lotionen, Cremes, Schäumen, Pflastern, Suspensionen, Lösungen und Zäpfchen (rektal und vaginal) durchgeführt werden.
  • Transdermale Verabreichung kann durch die Verwendung eines transdermalen Pflasters erreicht werden, welches die wirksame Verbindung und einen Träger enthält, der gegenüber der wirksamen Verbindung inert, nicht toxisch gegenüber der Haut ist und die Abgabe des Wirkstoffs zur systemischen Absorption in den Blutstrom durch die Haut erlaubt. Der Träger kann jede Anzahl an Formen annehmen, wie Cremes und Salben, Pasten, Gels und Okklusionsmittel. Die Cremes und Salben können viskose Flüssigkeit oder halbfeste Emulsionen entweder vom Typ Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl sein. Pasten, bestehend aus absorptiven Pulvern, dispergiert in Petroleum oder hydrophilem Petroleum, welches die wirksame Verbindung enthält, können auch geeignet sein. Eine Vielfalt an Okklusionsmitteln kann verwendet werden, um den wirksamen Inhaltsstoff in den Blutstrom freizusetzen, wie eine halbdurchlässige Membran, welche ein Reservoir bedeckt, welches den Wirkstoff mit oder ohne einen Träger enthält, oder eine Matrix, welche den Wirkstoff enthält. Weitere Okklusionsmittel sind in der Literatur bekannt.
  • Zäpfchenformulierungen können aus traditionellen Materialien hergestellt werden, einschließlich Kakaobutter, mit oder ohne der Zugabe von Wachsen, um den Schmelzpunkt des Zäpfchens zu verändern, und Glycerin. Wasserlösliche Zäpfchenbasen wie Polyethylenglycole mit unterschiedlichen molekularen Gewichten können ebenfalls verwendet werden.
  • Die Herstellung von repräsentativen Beispielen dieser Erfindung wird unten beschrieben.
  • Zwischenverbindung 2
  • 6-Methoxy-1-naphthol
  • Ein Gemisch aus 6-Methoxy-1-tetralon (20,84 g, 118,3 mmol), 10% Pd/C (10,1 g), und p-Cymen (500 ml) wurde bei Rückfluss für 60 Stunden erhitzt. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur gekühlt und durch Celite filtriert. Der Feststoff wurde mit Ethylacetat bis UV-klar gewaschen und die vereinigte organische Lösung wurde mit 1 N Natriumhydroxid (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten wässerigen Schichten wurden mit 6 N HCl sauer gemacht und mit Ethylacetat (3 × 300 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung an einer Silica-Säule (25% Ethylacetat-Hexane) ergab 17,02 g (83%) der Titelverbindung als einen hellbraunen Feststoff. Eine analytische Probe wurde durch Reinigung an einer zweiten Silica-Säule (40–60% Dichlormethan-Hexane) hergestellt, um einen weißen Feststoff zu ergeben: Fp. 73–75°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 3,85 (3H, s), 6,70–6,74 (1H, m), 7,06 (1H, dd, J = 2,34 Hz, J = 9,15 Hz), 7,20–7,21 (3H, m), 8,02 (1H, d, J = 9,12 Hz), 10,01 (1H, s); MS (ESI) m/z 174 (M – H)–.
    Anal. für C11H10O2
    Berechnet: C, 75,84; H, 5,79;
    Gefunden: C, 75,56; H, 5,39.
  • Zwischenverbindung 5
  • 1-[(2-Brom-5-methoxybenzyl)oxy]-6-methoxynaphthalin
  • Zu einer Lösung aus 6-Methoxynaphthol (12,9 g, 74,1 mmol), 5-Methoxy-2-brom-benzylalkohol (17,7 g, 81,6 mmol) und Triphenylphosphin (31,1 g, 119 mmol) in THF (400 ml) wurde langsam eine Lösung aus DEAD (20,6 g, 119 mmol) in THF (50 ml) zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht gerührt, an Silica konzentriert und durch Silica-Säule (10% Ethylacetat-Hexane) gereinigt, um 16,38 g (59%) der Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu ergeben: Fp. 83–84°C; 1H NMR (CDCl3): δ 3,78 (3H, s), 3,92 (3H, s), 5,25 (2H, s), 6,75–6,77 (2H, m), 7,12 (1H, d, J = 2,44 Hz), 7,15 (1H, dd, J = 2,44 Hz, J = 9,28 Hz), 7,24 (1H, d, J = 2,93 Hz), 7,32–7,36 (2H, m), 7,48 (1H, d, J = 8,79 Hz), 8,27 (1H, d, J = 9,23 Hz); MS (ESI) m/z 373/375 ([M + H]+);
    Anal. für C19H17BrO3:
    Berechnet: C, 61,14; H, 4,59;
    Gefunden: C, 60,97; H, 4,49.
  • Zwischenverbindung 6
  • 1-[(2-Brom-5-methoxybenzyl)oxy]naphthalin
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 1-Naphthol (5,7 g, 39,6 mmol) mit 5-Methoxy-2-brombenzylalkohol wie für Zwischenverbindung 5 beschrieben hergestellt, um 5,94 g (44%) eines weißen Feststoffs zu ergeben: Fp. 74–75°C; 1H NMR (CDCl3): δ 3,78 (3H, s), 5,28 (2H, s), 6,77 (1H, dd, J = 2,93 Hz, J = 8,79 Hz), 6,88 (1H, d, J = 7,69 Hz), 7,27 (1H, d, J = 3,30 Hz), 7,36–7,39 (1H, m), 7,47–7,53 (4H, m), 7,81–7,83 (1H, m), 8,37–8,39 (1H, m); MS (ESI) m/z 343/345 ([M + H]+);
    Anal. für C18H15BrO2:
    Berechnet: C, 62,99; H, 4,41;
    Gefunden: C, 63,19; H, 4,30.
  • Zwischenverbindung 8
  • 4-Brom-2-fluor-5-methylphenol
  • Zu einer Lösung aus 2-Fluor-5-methylphenol (20,27 g, 160,7 mmol) in Acetonitril (500 ml) bei 0°C wurde NBS (30,0 g, 168,7 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde für 1 Stunde bei 0°C gerührt. Die sich ergebende Lösung wurde vom Lösungsmittel gestrippt und durch eine kurze Silica-Säule mit Dichlormethan filtriert, um 29,6 g (90%) eines öligen orangen Feststoffs zu ergeben. Eine analytische Probe wurde durch Silica-Säulenreinigung (5% Ethylacetat – Hexane) hergestellt, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu ergeben: Fp. 44–46°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 2,22 (3H, s), 6,93 (1H, d, J = 9,28 Hz), 7,40 (1H, d, J = 10,74 Hz), 10,05 (1H, s); MS (ESI) m/z 203/205 ([M – H]–);
    Anal. für C7H6BrFO:
    Berechnet: C, 41,01; H, 2,95;
    Gefunden: C, 40,69; H, 2,80.
  • Zwischenverbindung 9
  • 1-Brom-5-fluor-4-methoxy-2-methylbenzol
  • Zu einem Gemisch aus 4-Brom-2-fluor-5-methylphenol (29,6 g, 144,2 mmol) und Kaliumcarbonat (30,0 g, 218 mmol) in Aceton (500 ml) wurde Iodmethan (69,0 g, 486 mmol) zugegeben. Die sich ergebende Suspension wurde bei Rückfluss für 4 Stunden gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde auf RT gekühlt, in HCl (250 ml einer 1 N Lösung) gegossen und mit Ethylacetat (3 × 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung an einer Silica-Säule (5% Ethylacetat – Hexane) ergab 29,50 g (93%) der Titelverbindung als klares, farbloses Öl: 1H NMR (CDCl3): δ 2,33 (3H, s), 3,85 (3H, s), 6,82 (1H, d, J = 8,79 Hz), 7,23 (1H, d J = 10,25 Hz); MS m/z;
    Anal. für C8H8BrFO·0,3 H2O:
    Berechnet: C, 92,81; H, 3,86;
    Gefunden: C, 42,38; H, 3,44.
  • Zwischenverbindung 11
  • 1-[(2-Brom-4-fluor-5-methoxybenzyl)oxy]-6-methoxynaphthalin
  • Ein Gemisch aus 1-Brom-5-fluor-4-methoxy-2-methylbenzol (29,50 g, 134,7 mmol), NBS (25,18 g, 141,4 mmol) und Benzoylperoxid (8,14 g, 33,7 mmol) in Tetrachlorkohlenstoff (500 ml) wurde bei Rückfluss für 1 Stunde gerührt. Die Umsetzung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und mit Dichlormethan durch Silica filtriert. Abdampfen des Lösungsmittels ergab die Benzylbromid-Zwischenverbindung. Der hellgelbe Feststoff wurde mit 6-Methoxy-1-naphthol (23,4 g, 134,7 mmol) und Kaliumcarbonat (37,2 g, 269 mmol) in Aceton (500 ml) vereinigt und bei Rückfluss für 12 Stunden gerührt. Das gekühlte Umsetzungsgemisch wurde durch Silica mit Aceton filtriert, von Lösungsmittel gestrippt und durch Silica-Säulenchromatographie (10%–30% Ethylacetat – Hexane) gereinigt, gefolgt von Pulverisierung mit Ethylacetat, um 20,3 g (39%) der Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben: Fp. 138–142°C; 1H NMR (CDCl3): δ 3,85 (3H, s), 3,92 (3H, s), 5,22 (2H, s), 7,75 (1H, dd, J = 2,07 Hz, J = 6,50 Hz), 7,12–7,17 (2H, m), 7,25–7,38 (4H, m), 8,22 (1H, d, J = 8,80 Hz); MS (ESI) m/z 391/393 ([M + H]+);
    Anal. für C19H16BrFO3:
    Berechnet: C, 58,33; H, 4,12;
    Gefunden: C, 58,15; H, 3,98.
  • Zwischenverbindung 12
  • 2,8-Dimethoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen
  • Verfahren A
  • Ein Gemisch aus 1-[(2-Brom-5-methoxybenzyl)oxy]-6-methoxynaphthalin (13,03 g, 34,93 mmol), Natriumacetat (10,3 g, 105 mmol) und Dichlorbis(triphenylphosphin)-palladium(II) (3,68 g, 5,25 mmol) in DMA (600 ml) wurde für 12 Stunden bei 120°C gerührt. Das gekühlte Umsetzungsgemisch wurde in 1500 ml Wasser gegossen. Das rohe feste Produkt wurde durch Filtration gesammelt und durch Silica-Chromatographie (5%–10% Ethylacetat – Hexane) gereinigt, um 5,76 g (56%) der Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben: Fp. 175–178°C; 1H NMR (CDCl3): δ 3,85 (3H, s), 3,92 (3H, s), 5,25 (2H, s), 6,75 (1H, d, J = 2,20 Hz), 6,93 (1H, dd, J = 2,56 Hz, J = 8,92 Hz), 7,10 (1H, d, J = 2,56 Hz), 7,13 (1H, dd, J = 2,56 Hz, J = 9,15 Hz), 7,41 (1H, d, J = 8,79 Hz), 7,63 (1H, d, J = 8,42 Hz), 7,74 (1H, d, J = 8,79 Hz), 8,14 (1H, d, J = 9,15 Hz); MS (ESI) m/z 293 ([M + H]+);
    Anal. für C19H16O3:
    Berechnet: C, 78,06; H, 5,52;
    Gefunden: C, 78,01; H, 5,41.
  • Zwischenverbindung 13
  • 8-Methoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 1-[(2-Brom-5-methoxybenzyl)-oxy]naphthalin (3,05 g, 8,89 mmol) gemäß Verfahren A hergestellt, um 0,94 g (40%) eines weißen Feststoffs zu ergeben: Fp. 128–130°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 3,82 (3H, s), 5,31 (2H, s), 6,96–7,02 (2H, m), 7,47–7,53 (2H, m), 7,60 (1H, d, J = 8,55 Hz), 7,82 (1H, d, J = 8,48 Hz), 7,86–7,91 (1H, m), 7,94 (1H, d, J = 8,65 Hz), 8,12–8,15 (1H, m); MS (ESI) m/z 263 ([M + H] +);
    Anal. für C18H14O2:
    Berechnet: C, 82,42; H, 5,38;
    Gefunden: C, 81,98; H, 5,07.
  • Zwischenverbindung 14
  • 9-Fluor-2,8-dimethoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 1-[(2-Brom-4-fluor-5-methoxybenzyl)oxy]-6-methoxynaphthalin (10,3 g, 26,3 mmol) gemäß Verfahren A hergestellt, um 4,51 g (55%) eines weißen Feststoffs zu ergeben: Fp. 201–206°C; 1H NMR (CDCl3): δ 3,93 (3H, s), 3,94 (3H, s), 5,23 (2H, s), 6,84 (1H, d, J = 8,24 Hz), 7,11–7,13 (2H, m), 7,40–7,443 (2H, m), 7,64 (1H, d, J = 8,60 Hz), 8,11–8,13 (1H, m); MS (ESI) m/z 311 ([M + H]+);
    Anal. für C19H15FO3:
    Berechnet: C, 73,54; H, 4,87;
    Gefunden: C, 73,84; H, 4,60.
  • Beispiel 1a
  • 6H-Dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Verfahren D
  • Zu Pyridinium HCl (11 g) bei 190°C wurde 2,8-Dimethoxy-H-dibenzo[c,h]-chromen (2,48 g, 8,49 mmol) zugegeben. Die sich ergebende Lösung wurde bei 190°C für 3 Stunden gerührt. Die Umsetzung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und in Wasser (400 ml) aufgenommen. Das feste Produkt wurde durch Filtration gesammelt und an einer Silica-Säule gereinigt, um 2,09 g (93%) eines hellgelben Feststoffs zu ergeben. Dieses Material wurde durch präparative Umkehrphasen HPLC weiter gereinigt, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben: Fp. 248–252°C (d); 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,19 (2H, s), 6,70 (1H, d, J = 2,44 Hz), 6,80 (1H, dd, J = 2,44 Hz, J = 8,30 Hz), 7,04 (1H, dd, J = 2,44 Hz, J = 8,79 Hz), 7,08 (1H, d, J = 2,44 Hz), 7,34 (1H, d, J = 8,79 Hz), 7,62 (1H, d, J = 8,30 Hz), 7,76 (1H, d, J = 8,79 Hz), 7,96 (1H, d, J = 9,28 Hz), 9,63 (1H, s), 9,78 (1H, s); MS (ESI) m/z 265 ([M + H]+); MS (ESI) m/z 263 ([M – H]–);
    Anal. für C17H12O3·0,1 H2O:
    Berechnet: C, 76,74; H, 4,62;
    Gefunden: C, 76,57; H, 4,25.
  • Beispiel 1b
  • 9-Fluor-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 9-Fluor-2,8-dimethoxy-H-dibenzo[c,h]chromen (1,29 g, 4,16 mmol) mit Pyridinium HCl (30 g) gemäß Verfahren D hergestellt, um 1,01 g (86%) eines gelbbraunen Feststoffs zu ergeben. Dieses Material wurde durch präparative Umkehrphasen HPLC weiter gereinigt, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben: Fp. 230–231°C (zerf.): 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,19 (2H, s), 6,89 (1H, d, J = 8,73 Hz), 7,04–7,10 (2H, m), 7,35 (1H, d, J = 8,65 Hz), 7,64 (1H, d, J = 12,48 Hz), 7,77 (1H, d, J = 8,75 Hz), 7,97 (1H, d, J = 8,90 Hz), 9,89 Hz (1H, bs), 10,01 (1H, bs); MS (ESI) m/z 283 ([M + H] +); MS (ESI) m/z 281 ([M – H]–);
    Anal. für C17H11FO3·0,75 H2O:
    Berechnet: C, 69,03; H, 4,26;
    Gefunden: C, 69,34; H, 3,70.
  • Beispiel 1c
  • 6H-Dibenzo[c,h]chromen-8-ol
  • Verfahren D
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 8-Methoxy-H-dibenzo[c,h]-chromen (0,73 g, 2,79 mmol) mit Pyridinium HCl (10 g) gemäß Verfahren D hergestellt, um 0,63 g (91%) eines weißen Feststoffs zu ergeben: Fp. 192–194°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,25 (2H, s), 6,73 (1H, bs), 6,83 (1H, dd, J = 2,38 Hz, J = 8,40 Hz), 7,45–7,52 (2H, m), 7,58 (1H, d, J = 8,58 Hz), 7,70 (1H, d, J = 8,34 Hz), 7,84–7,93 (2H, m), 8,10–8,12 (1H, m), 9,73 (1H, s); MS (ESI) m/z 247 ([M – H]–);
    Anal. für C17H12O2:
    Berechnet: C, 82,24; H, 4,87;
    Gefunden: C, 81,85; H, 4,86.
  • Zwischenverbindung 15
  • 12-Brom-2,8-dimethoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen
  • Verfahren B
  • Zu einem Gemisch aus 2,8-Dimethoxy-H-dibenzo[c,h]chromen (1,97 g, 6,75 mmol) in Acetonitril (70 ml) bei °C wurde NBS (1,44 g, 8,10 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 0°C für 15 Minuten gerührt, in 300 ml Wasser gegossen und mit Ethylacetat (3 × 150 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung durch Silica-Chromatographie ergab einen weißen Feststoff, welcher aus 50 ml Isopropanol umkristallisiert wurde, um 1,77 g (71%) der Titelverbindung als einen weißen, kristallinen Feststoff zu ergeben; Fp. 96–98°C; 1H NMR (CDCl3): δ 3,86 (3H, s), 3,98 (3H, s), 5,24 (2H, s), 6,74 (1H, d, J = 2,444 Hz), 6,93 (1H, dd, J = 2,68 Hz, J = 8,54 Hz), 7,15 (1H, dd, J = 2,44 Hz, J = 9,28 Hz), 7,43 (1H, d, J = 2,41 Hz), 7,59 (1H, d, J = 8,79 Hz), 8,04 (1H, s), 8,16 (1H, d, J = 9,28 Hz); MS m/z;
    Anal. für C19H15BrO3;
    Berechnet: C, 61,47; H, 4,07;
    Gefunden: C, 61,66; H, 3,89.
  • Zwischenverbindung 16
  • 12-Brom-9-fluor-2,8-dimethoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 9-Fluor-2,8-dimethoxy-H-dibenzo[c,h]chromen (1,47 g, 4,74 mmol) mit NBS (1,01 g, 5,69 mmol) gemäß Verfahren B hergestellt, um 1,14 g (62%) eines gelbbraunen Feststoffs zu ergeben: Fp. 139–143°C; 1H NMR (CDCl3): δ 3,98 (3H, s), 3,98 (3H, s), 5,22 (2H, s), 6,78 (1H, d, J = 8,24 Hz), 7,16 (1H, dd, J = 2,56 Hz, J = 9,15 Hz), 7,37 (1H, d, J = 12,08 Hz), 7,43 (1H, d, J = 2,56 Hz), 7,92 (1H, s), 8,14 (1H, dd, J = 0,37 Hz, J = 9,15 Hz); MS (ESI) m/z 387/389 ([M + H]+);
    Anal. für C19H14BrFO3:
    Berechnet: C, 58,63; H, 3,63;
    Gefunden: C, 58,82; H, 3,58.
  • Zwischenverbindung 17
  • 2,8-Dimethoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-12-carbonitril
  • Verfahren C
  • Ein Gemisch aus 12-Brom-2,8-dimethoxy-H-dibenzo[c,h]chromen (8,33 g, 22,45 mmol), Zinkcyanid (3,15 g, 26,9 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (1,30 g, 1,12 mmol) in DMF (100 ml) wurde bei 120°C über Nacht gerührt. Das gekühlte Umsetzungsgemisch wurde in Ammoniumchloridlösung (600 ml einer 1 N Lösung) gegossen und mit Ethylacetat (4 × 300 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Ammoniumchloridlösung gewaschen, durch einen Silica-Pfropfen filtriert, von Lösungsmittel gestrippt und an einer Silica-Säule (40%–60% Dichlormethan – Hexane) gereinigt, um einen gelben Feststoff zu ergeben. Dieser Feststoff wurde mit Ethylacetat pulverisiert, um 5,43 g (76%) der Titelverbindung als einen gelben Feststoff zu ergeben: Fp. 161–165°C; 1H NMR (CDCl3): δ 3,86 (3H, s), 3,98 (3H, s), 5,32 (2H, s), 6,73 (1H, d, J = 2,56 Hz), 6,96 (1H, dd, J = 2,56 Hz, J = 8,42 Hz), 7,19 (1H, dd, J = 2,56 Hz, J = 9,15 Hz), 7,37 (1H, d, J = 2,20 Hz), 7,60 (1H, d, J = 8,42 Hz), 8,16 (1H, s), 8,18 (1H, d, J = 9,52 Hz); MS (ESI) m/z 317 ([M + H]+);
    Anal. für C20H15NO3:
    Berechnet: C, 75,70; H, 4,76; N, 4,41;
    Gefunden: C, 75,53; H, 4,48; N, 4,32.
  • Zwischenverbindung 18
  • 9-Fluor-2,8-dimethoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-12-carbonitril
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 9-Fluor-2,8-dimethoxy-H-dibenzo[c,h]chromen (0,99 g, 2,55 mmol) mit Zinkcya nid (0,45 g, 3,8 mmol) gemäß Verfahren C hergestellt, um 0,55 g (64%) eines weißen Feststoffs zu ergeben: Fp. > 220°C; 1H NMR (CDCl3): δ 3,92 (3H, s), 3,97 (3H, s), 5,29 (2H, s), 6,77 (1H, d, J = 8,05 Hz), 7,19 (1H, dd, J = 2,47 Hz, J = 9,24 Hz), 7,36–7,39 (2H, m), 8,04 (1H, s), 8, 17 (1H, d, J = 9, 15 Hz); MS m/z;
    Anal. für C20H14FNO3·0,1 H2O;
    Berechnet: C, 71,25; H, 4,25; N, 4,16;
    Gefunden: C, 70,87; H, 3,91; N, 4,31.
  • Beispiel 1d
  • 2,8-Dihydroxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-12-carbonitril
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 2,8-Dimethoxy-H-dibenzo[c,h]-chromen-12-carbonitril (5,43 g, 17,1 mmol) mit Pyridinium HCl (50 g) gemäß Verfahren D hergestellt, um 3,43 g (69%) eines gelben Feststoffs zu ergeben: Fp. > 250°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,34 (2H, s), 6,71 (1H, d, J = 2,36 Hz), 6,82 (1H, dd, J = 2,48 Hz, J = 8,41 Hz), 7,19 (1H, dd, J = 2,32 Hz, J = 9,11 Hz), 7,30 (1H, d, J = 2,26 Hz), 7,78 (1H, d, J = 8,56 Hz), 8,11 (1H, d, J = 9,14 Hz), 8,50 (1H, s), 9,81 (1H, s), 10,46 (1H, bs); MS (ESI) m/z 288 ([M – H]–);
    Anal. für C18H11NO3·0,25 H2O:
    Berechnet: C, 73,59; H, 3,95; N, 4,77;
    Gefunden: C, 73,69; H, 3,84; N, 4,53.
  • Beispiel 1e
  • 9-Fluor-2,8-dihydroxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-12-carbonitril
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 9-Fluor-2,8-dimethoxy-H-dibenzo[c,h]-chromen-12-carbonitril (0,40 g, 1,19 mmol) mit Pyridinium HCl (15 g) gemäß Verfahren D hergestellt, um 0,32 g (88%) eines weißen Feststoffs zu ergeben: Fp. > 250°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,29 (2H, s), 6,86 (1H, d, J = 8,69 Hz), 7,16 (1H, dd, J = 2,32 Hz, J = 9,15 Hz), 7,28 (1H, d, J = 2,32 Hz), 7,80 (1H, d, J = 12,40 Hz), 8,08 (1H, d, J = 9,04 Hz), 8,49 (1H, s), 10,16 (1H, s), 10,4 (1H, s); MS (ESI) m/z 306 ([M – H]–);
    Anal. für C18H10FNO3·0,3 H2O:
    Berechnet: C, 69,14; H, 3,42; N, 4,48;
    Gefunden: C, 68,91; H, 3,10; N, 4,30.
  • Beispiel 1f
  • 1-Chlor-2,8-dihydroxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-12-carbonitril
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 2,8-Dihydroxy-H-dibenzo[c,h]-chromen-12-carbonitril (0,20 g, 0,70 mmol) mit NCS (0,11 g, 0,83 mmol) in THF (10 ml) bei Raumtemperatur über Nacht gemäß Verfahren B hergestellt, um 0,10 g (45%) eines gelben Feststoffs zu ergeben: Fp. > 250°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,34 (2H, s), 6,72 (1H, d, J = 2,35 Hz), 6,83 (1H, dd, J = 2,43 Hz, J = 8,44 Hz), 7,37 (1H, d, J = 9,22 Hz), 7,84 (1H, d, J = 8,57 Hz), 8,14 (1H, d, J = 9,20 Hz), 8,53 (1H, s), 9,87 (1H, bs), 1,12 (1H, bs); MS (ESI) m/z 322/324 ([M – H]–);
    Anal. für C18H10ClNO3·0,75 H2O:
    Berechnet: C, 64,11; H, 3,44; N, 4,33;
    Gefunden: C, 64,45; H, 3,05; N, 4,03.
  • Beispiel 1g
  • 1-Chlor-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von H-Dibenzo[c,h] chromen-2,8-diol (0,218 g, 0,83 mmol) mit NCS (0,13 g, 0,99 mmol) in THF (10 ml) gemäß Verfahren B hergestellt, um 0,17 g (67%) der Titelverbindung zusammen mit 0,025 g (10%) des 12-Chlor-H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol-isomers zu ergeben. Diese Isomere wurden durch präparative HPLC getrennt; Fp. 216–218; 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,24 (2H, s), 6,72 (1H, d, J = 2,29 Hz), 6,82 (1H, dd, J = 2,40 Hz, J = 8,39 Hz), 7,25 (1H, d, J = 9,11 Hz), 7,67 (2H, d, J = 8,69 Hz), 7,94–7,99 (2H, m), 9,72 (1H, bs), 10,50 (1H, bs); MS (ESI) m/z 297/299 ([M – H]–);
    Anal. für C17H11ClO3·0,25 H2O:
    Berechnet: C, 67,34; H, 3,82;
    Gefunden: C, 67,25; H, 3,89.
  • Zwischenverbindung 19
  • 2-(Acetyloxy)-6H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat
  • Verfahren E
  • Ein Gemisch aus H-Dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol (1,82 g, 6,49 mmol), Pyridin (25 ml) und Essigsäureanhydrid (25 ml) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und in Wasser (300 ml) gegossen. Das weiße, feste Produkt wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum bei 105°C getrocknet, um 2,11 g (88%) der Titelverbindung als weißen Feststoff zu erhal ten: Fp. 172–173°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 2,31 (3H, s), 2,34 (3H, s), 5,36 (2H, s), 7,17 (1H, d, J = 2,44 Hz), 7,21 (1H, dd, J = 2,43 Hz, J = 8,29 Hz), 7,21 (1H, dd, J = 2,44 Hz, J = 9,28 Hz), 7,63 (1H, d, J = 8,30 Hz), 7,68 (1H, d, J = 2,44 Hz), 7,94 (1H, d, J = 8,30 Hz) 8,04 (1H, d, J = 8,79 Hz), 8,18 (1H, d, J = 9,28 Hz); MS (ESI) m/z 349 [(M + H]+);
    Anal. für C21H16O5
    Berechnet: C, 72,41; H, 4,63;
    Gefunden: C, 72,20; H, 4,67.
  • Zwischenverbindung 20
  • 2-(Acetyloxy)-9-fluor-6H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 9-Fluor-H-dibenzo[c,h]-chromen-2,8-diol (0,84 g, 2,98 mmol) mit Pyridin (10 ml) in Essigsäureanhydrid (10 ml) gemäß Verfahren E hergestellt, um 0,93 g (86%) eines weißen Feststoffs zu ergeben: Fp. 206–212° C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 2,30 (3H, s), 2,33 (3H, s), 5,30 (2H, s), 7,28–7,32 (2H, m), 7,59 (1H, d, J = 8,61 Hz), 7,64 (1H, d, J = 2,38 Hz), 7,92 (1H, d, J = 11,54 Hz), 8,01 (1H, d, J = 8,79 Hz), 8,15 (1H, d, J = 9,16 Hz); MS (ESI) m/z 367 ([M + H]+);
    Anal. für C21H15FO5:
    Berechnet: C, 68,85; H, 4,13;
    Gefunden: C, 68,41; H, 4,06.
  • Zwischenverbindung 21
  • 2-(Acetyloxy)-12-brom-6H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 2-(Acetyloxy)-H-dibenzo[c,h]-chromen-8-yl-acetat (1,63 g, 4,68 mmol) mit NBS (1,00 g, 5,62 mmol) in Acetonitril (100 ml) bei Raumtemperatur über Nacht gemäß Verfahren B hergestellt, um 2,00 g (quantitative Ausbeute) eines weißen Feststoffs zu ergeben: Fp. 192–194°C; 1H NMR (CDCl3): δ 2,33 (3H, s), 2,38 (3H, s), 5,28 (2H, s), 6,99 (1H, d, J = 2,20 Hz), 7,14 (1H, dd, J = 2,34 Hz, J = 8,42 Hz), 7,29 (1H, dd, J = 2,26 Hz, J = 9,11 Hz), 7,69 (1H, d, J = 8,47 Hz), 7,86 (1H, d, J = 2,17 Hz), 8,09 (1H, s), 8,28 (1H, d, J = 9,05 Hz); MS m/z;
    Anal. für C21H15BrO5:
    Berechnet: C, 59,04; H, 3,54;
    Gefunden: C, 58,95; H, 3,43.
  • Zwischenverbindung 22
  • 2-(Acetyloxy)-12-chlor-6H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 2-(Acetyloxy)-H-dibenzo[c,h]-chromen-8-yl-acetat (0,26 g, 0,75 mmol) mit NCS (0,12 g, 0,90 mmol) in Acetonitril (10 ml) bei Rückfluss für 3 Stunden gemäß Verfahren B hergestellt, um 0,24 g (84%) eines weißen Feststoffs zu ergeben; Fp. 183–184°C; 1H NMR (CDCl3): δ 2,33 (3H, s), 2,38 (3H, s), 5,28 (2H, s), 6,99 (1H, d, J = 2,27 Hz), 7,14 (1H, dd, J = 2,34 Hz; J = 8,42 Hz), 7,30 (1H, dd, J = 2,27 Hz, J = 9,07 Hz), 7,68 (1H, d, J = 8,49 Hz), 7,88–7,89 (2H, m), 8,29 (1H, d, J = 9,06 Hz); MS m/z;
    Anal. für C21H15ClO5·0,1 H2O:
    Berechnet: C, 65,58; H, 3,98;
    Gefunden: C, 65,37; H, 3,55.
  • Zwischenverbindung 23
  • 2-(Acetyloxy)-12-brom-9-fluor-6H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 2-(Acetyloxy)-9-fluor-H-dibenzo[c,h]-chromen-8-yl-acetat (0,47 g, 1,28 mmol) mit NBS (0,27 g, 1,54 mmol) in Acetonitril (25 ml) bei Raumtemperatur über Nacht gemäß Verfahren B hergestellt, um 0,57 g (quantitative Ausbeute) eines weißen Feststoffs zu ergeben. Eine analytische Probe wurde durch Pulverisieren mit Ethylacetat erhalten, um die Titelverbindung als weißen Feststoff vorzusehen: Fp. 190–193°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 2,36 (3H, s), 2,37 (3H, s), 5,34 (2H, s), 7,34 (1H, d, J = 7,69 Hz), 7,46 (1H, dd, J = 2,23 Hz; J = 9,05 Hz), 7,81 (1H, d, J = 2,18 Hz), 8,09 (1H, d, J = 11,65 Hz), 8,28 (1H, d, J = 9,08 Hz), 8,47 (1H, s); MS m/z (ESI) 462/464 ([M + NH4]+);
    Anal. für C21H14BrFO5:
    Berechnet: C, 56,65; H, 3,17;
    Gefunden: C, 56,59; H, 3,16.
  • Zwischenverbindung 24
  • 2-(Acetyloxy)-12-chlor-9-fluor-6H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 2-(Acetyloxy)-9-fluor-H-dibenzo[c,h]-chromen-8-yl-acetat (0,47 g, 0,1,28 mmol) mit NCS (0,21 g, 1,54 mmol) in Acetonitril (15 ml) bei Rückfluss für 4 Stunden gemäß Verfahren B hergestellt, um 0,55 g (quantitative Ausbeute) eines gelben Feststoffs zu ergeben. Eine analytische Probe wurde durch Pulverisieren mit Ethylacetat erhalten, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben: Fp. 194-198°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 2,36 (3H, s), 2,37 (3H, s), 5,37 (2H, s), 7,34 (1H, d, J = 7,66 Hz), 7,48 (1H, dd, J = 2,16 Hz; J = 9,06 Hz), 7,85 (1H, d, J = 2,07), 8,08 (1H, d, J = 11,61 Hz), 8,28 (1H, d, J = 9,10 Hz), 8,32 (1H, s); MS m/z (ESI) 399/401 ([M – H]–);
    Anal. für C21H14ClFO5:
    Berechnet: C, 62,93; H, 3,52;
    Gefunden: C, 62,53; H, 3,53.
  • Beispiel 1h
  • 12-Brom-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Verfahren F
  • Eine Lösung aus 2-(Acetyloxy)-12-brom-H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat (1,40 g, 3,28 mmol) in Natriummethoxid (40 ml von 1 N in Methanol) wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Die Lösung wurde in 100 ml 1 NHCl gegossen und mit Ethylacetat (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Natriumbicarbonatlösung gewaschen, mit Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung durch Silica-Chromatographie (40% Ethylacetat–Hexane) ergab 0,91 g (81%) der Titelverbindung als weißen Feststoff: Fp. 178–180 (zerf.), verfärbt sich über 160°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,23 (2H, s), 6,71 (1H, d, J = 2,32 Hz), 6,80 (1H, dd, J = 2,43 Hz, J = 8,39 Hz), 7,12 (1H, dd, J = 2,32 Hz, J = 9,03 Hz), 7,34 (1H, d, J = 2,28 Hz), 7,58 (1H, d, J = 8,53 Hz), 8,04 (1H, d, J = 9,07 Hz), 8,14 (1H, s), 9,73 (1H, bs), 10,20 (1H, bs); MS (ESI) m/z 341/343 ([M – H]–);
    Anal. für C17H11BrO3:
    Berechnet: C, 59,50; H, 3,23;
    Gefunden: C, 59,33; H, 3,26.
  • Beispiel 1i
  • 12-Chlor-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 2-(Acetyloxy)- 12-chlor-H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat (0,18 g, 0,47 mmol) mit Natriummethoxidlösung (75 ml von 1 N in Methanol) gemäß Verfahren F hergestellt, um 0,13 g (93%) eines gelbbraunen Feststoffs zu ergeben. Dieses Material wurde durch präparative Umkehrphasen HPLC weiter gereinigt, um die Titelverbindung als einen hellrosa Feststoff zu ergeben: Fp. 212–216°C (d); 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,23 (2H, s), 6,71 (1H, d, J = 2,33 Hz), 6,80 (1H, dd, J = 2,44 Hz, J = 8,39 Hz), 7,14 (1H, dd, J = 2,34 Hz, J = 9,09 Hz), 7,35 (1H, d, J = 2,31 Hz), 7,68 (1H, d, J = 8,54 Hz), 7,98 (1H, s), 8,05 (1H, d, J = 9,07 Hz), 9,74 (1H, bs), 10,19 (1H, bs); MS (ESI) m/z 299/301 ([M + H]+); MS (ESI) m/z 297/299 ([M – H]–);
    Anal. für C17H11ClO3·0,1 H2O:
    Berechnet: C, 67,94; H, 3,76;
    Gefunden: C, 67,77; H, 3,67.
  • Beispiel 1j
  • 12-Brom-9-fluor-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 2-(Acetyloxy)-12-brom-9-fluor-H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat (0,48 g, 1,08 mmol) mit Natriummethoxidlösung (40 ml von 1 N in Methanol) gemäß Verfahren F hergestellt. Reinigung durch präparative Umkehrphasen HPLC ergab 0,20 g (53%) der Titelverbindung als weißen Feststoff: Fp. 194–197°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,22 (2H, s), 6,89 (1H, d, J = 8,68 Hz), 7,13 (1H, dd, J = 2,31 Hz, J = 9,05 Hz), 7,35 (1H, d, J = 2,27 Hz), 7,75 (1H, d, J = 12,46 Hz), 8,04 (1H, d, J = 9,06 Hz), 8,19 (1H, s), 10,21 (2H, bs); MS (ESI) m/z 359/361 ([M – H]–);
    Anal. für C17H10BrFO3·0,75 H2O:
    Berechnet: C, 54,50; H, 3,09;
    Gefunden: C, 54,85; H, 2,89.
  • Beispiel 1k
  • 12-Chlor-9-fluor-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 2-(Acetyloxy)-12-chlor-9-fluor-H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat (0,49 g, 1,10 mmol) mit Natriummethoxidlösung (40 ml von 1 N in Methanol) gemäß Verfahren F hergestellt, um 0,30 g (86%) eines gelbbraunen Feststoffs zu ergeben. Dieses Material wurde durch präparative Um kehrphasen HPLC weiter gereinigt, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu ergeben: Fp. 215–220°C (zerf.); 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,22 (2H, s), 6,89 (1H, d, J = 8,68 Hz), 7,15 (1H, dd, J = 2,22 Hz, J = 9,05 Hz), 7,35 (1H, d, J = 2,13 Hz), 7,74 (1H, d, J = 12,42 Hz), 8,03–8,06 (2H, m), 10,21 (2H, bs); MS (ESI) m/z 315/317 ([M – H]–);
    Anal. für C17H10ClFO3·0,25 H2O:
    Berechnet: C, 63,57; H, 3,29;
    Gefunden: C, 63,22; H, 3,27.
  • Beispiel 1l
  • 12-Methoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Ein Gemisch aus 2-(Acetyloxy)-12-methoxy-H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat (2,06 g, 6,00 mmol), CuBr (0,86 g, 6,00 mmol), Natriummethoxid (15 ml von 25% in Methanol) und DMF (30 ml) wurde bei Rückfluss für 3 Stunden erhitzt. Die Umsetzung wurde auf Raumtemperatur gekühlt, in HCl-Lösung (200 ml von 2 N) gegossen und mit Ethylacetat (3 × 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung durch Silica-Säulenchromatographie (40% Ethylacetat–Hexane) ergab 1,11 g (63%) der Titelverbindung als gelbbraunen Feststoff: Fp. 224°C (d); 1H NMR (DMSO-d6) δ 3,98 (3H, s), 5,12 (2H, s), 6,70 (1H, d, J = 2,47 Hz), 6,81 (1H, dd, J = 2,47 Hz, J = 8,24 Hz), 7,05 (1H, dd, J = 2,47 Hz, J = 9,06 Hz), 7,18 (1H, s), 7,35 (1H, d, J = 2,47 Hz), 7,68 (1H, d, J = 8,51 Hz), 7,92 (1H, d, J = 9,06 Hz), 9,63 (1H, s), 9,80 (1H, s); MS (ESI) m/z 293 ([M – H]–; MS (ESI) m/z 295 ([M + H]+);
    Anal. für C18H14O4·0,3 H2O:
    Berechnet: C, 72,14; H, 4,90;
    Gefunden: C, 71,88; H, 4,74.
  • Zwischenverbindung 25
  • 2-(Acetyloxy)-12-methoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 12-Methoxy-H-dibenzo[c,h]-chromen-2,8-diol (1,11 g, 3,78 mmol) mit Pyridin und Essigsäureanhydrid gemäß Verfahren E hergestellt, um 1,11 g (78%) eines hellgelben Feststoffs zu ergeben: Fp. 126–134°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 2,31 (3H, s), 2,33 (3H, s), 4,05 (3H, s), 5,28 (2H, s), 7,16 (1H, d, J = 2,32 Hz), 7,22 (1H, dd, J = 2,94 Hz, J = 8,34 Hz), 7,35 (1H, dd, J = 2,32 Hz; J = 9,04 Hz), 7,42 (1H, s), 7,80 (1H, m), 8,01 (1H, d, J = 8,58 Hz), 8,14 (1H, dd, J = 0,35 Hz, J = 9,04 Hz);
    Anal. für C22H18O8·0,25 H2O:
    Berechnet: C, 69,01; H, 4,87;
    Gefunden: C, 69,08; H, 4,88.
  • Beispiel 1m
  • 11-Chlor-12-methoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 2-(Acetyloxy)-12-methoxy-H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat (0,41 g, 1,08 mmol) mit NCS (0,17 g, 1,30 mmol) in Acetonitril (10 ml) gemäß Verfahren B hergestellt, gefolgt von Deacylierung gemäß Verfahren F, um 0,050 g (14%) eines rosa Feststoffs zu ergeben: Fp. verfärbt > 230°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 3,87 (3H, s), 5,06 (2H, s), 6,80 (1H, d, J = 2,35 Hz), 6,84 (1H, dd, J = 2,55 Hz, J = 8,63 Hz), 7,11 (1H, dd, J = 2,34 Hz, J = 9,06 Hz), 7,23 (1H, d, J = 2,30 Hz), 8,01 (1H, d, J = 9,05 Hz), 8,11 (1H, d, J = 8,60 Hz), 9,81 (1H, bs), 10,14 (1H, bs); MS (ESI) m/z 329/331 ([M + H]+); MS (ESI) m/z 327/329 ([M – H]–);
    Anal. für C18H13ClO4·0,25 H2O:
    Berechnet: C, 64,87; H, 4,08;
    Gefunden: C, 64,90; H, 4,09.
  • Beispiel 1n
  • 12-Methyl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2-8-diol
  • Ein Gemisch aus 12-Brom-H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol (3,05 g, 8,89 mmol), Tetramethylzinn (2,39 g, 13,3 mmol) und Dichlorbis(tri-O-tolylphosphin)palladium(II) (0,70 g, 0,9 mmol) in DMF (100 ml) wurde bei 80°C unter Stickstoff für 16 Stunden gerührt. Die Umsetzung wurde auf Raumtemperatur gekühlt, in Wasser (250 ml) gegossen und mit Ethylacetat (3 × 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Ammoniumchloridlösung (50 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung durch Silica-Säulenchromatographie (40% Ethylacetat – Hexane) ergab 2,28 g (92%) eines hellbraunen Feststoffs. Eine Probe wurde durch präparative Umkehrphasenchromatographie HPLC weiter gereinigt, um die Titelverbindung als einen von weiß abweichenden Feststoff zu ergeben: Fp. 220–224°C (d); 1H NMR (Aceton-d6): δ 2,56 (3H, s), 5,20 (2H, s), 6,78 (1H, d, J = 2,74 Hz), 6,89 (1H, dd, J = 2,74 Hz, J = 8,24 Hz), 7,12 (1H, dd, J = 2,47 Hz, J = 9,06 Hz), 7,25 (1H, d, J = 2,20 Hz), 7,64–7,66 (2H, m), 8,09 (1H, d, J = 8,79 Hz), 8,46 (1H, s), 8,60 (1H, s); MS (ESI) m/z 279 ([M + H]+); MS (ESI) m/z 277 ([M – H]–);
    Anal. für C18H14O3·0,30 H2O:
    Berechnet: C, 76,20; H, 5,19;
    Gefunden: C, 75,90; H, 4,75.
  • Beispiel 1o
  • 12-Vinyl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Zu einem Gemisch aus 12-Brom-H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol (0,63 g, 1,84 mmol) und Dichlorbis(tri-o-tolylphosphin)palladium (II) (0,07 g, 0,09 mmol) in Diethoxyethan (10 ml) wurde Tributylvinylzinn (0,87 g, 2,76 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde für 12 Stunden bei 110°C gerührt. Die Umsetzung wurde auf Raumtemperatur gekühlt, in Ammoniumchloridlösung (100 ml von 1 N) gegossen und mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Ammoniumchloridlösung (100 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung durch Silica-Säulenchromatographie (30% Ethylacetat–Hexane) ergab 0,40 g (75%) der Titelverbindung als hellgelben Feststoff: Fp. > 220°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,20 (2H, s), 5,40 (1H, dd, J = 1,65 Hz, J = 10,99 Hz), 5,87 (1H, dd, J = 1,65 Hz, J = 17,58 Hz), 6,71 (1H, d, J = 2,75 Hz), 6,81 (1H, dd, J = 2,47 Hz, J = 8,51 Hz), 7,08 (1H, dd, J = 2,47 Hz, J = 9,06 Hz), 7,26–7,31 (2H, m), 7,72 (1H, d, J = 8,79 Hz), 7,94 (1H, s), 8,01 (1H, d, J = 9,34 Hz), 9,63 (1H, s), 9,85 (1H, s); MS (ESI) m/z 291 ([M + H]+); MS (ESI) m/z 289 ([M – H]–);
    Anal. für C19H14O3·0,25 H2O:
    Berechnet: C, 77,41; H, 4,96;
    Gefunden: C, 77,34; H, 4,77.
  • Beispiel 1p
  • 12-Ethyl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Zu einer Lösung aus 12-Vinyl-H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol (0,19 g, 0,66 mmol) in Ethylacetat (30 ml) wurde Palladium-auf- Aktivkohle (0,23 g) zugegeben. Der Kolben wurde mit einem Ballon, gefüllt mit Wasserstoff versehen und die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Die Umsetzung wurde durch Celite filtriert und durch Silica-Säulenchromatographie (40% Ethylacetat – Hexane) gereinigt, um 0,11 g (58%) eines hellbraunen Feststoffs zu ergeben, welcher durch präparative Umkehrphasen HPLC weiter gereinigt wurde, um die Titelverbindung als hellvioletten Feststoff zu ergeben: Fp. 184–192; 1H NMR (DMSO-d6): δ 1,31 (3H, t, J = 7,48 Hz), 2,89–2,95 (2H, m), 5,16 (2H, s), 6,69 (1H, d, J = 2,55 Hz), 6,80 (1H, dd, J = 2,49 Hz, J = 8,40 Hz), 7,04 (1H, dd, J = 2,32 Hz, J = 9,04 Hz), 7,20 (1H, d, J = 2,21 Hz), 7,61–7,63 (2H, m), 8,00 (1H, d, J = 9,04 Hz), 9,58 (1H, s), 9,74 (1H, s); MS (ESI) m/z 291 ([M – H]–);
    Anal. für C19H16O3·0,10 H2O;
    Berechnet: C, 77,59; H, 5,55;
    Gefunden: C, 77,37; H, 5,58.
  • Beispiel 1q
  • 12-Thien-3-yl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Verfahren G
  • Ein Gemisch aus 12-Brom-H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol (0,51 g, 1,49 mmol), 3-Thiophen-boronsäure (0,38 g, 3 mmol), Tetrakis (triphenylphosphin)palladium (0,17 g, 0,15 mmol), Natriumcarbonatlösung (1,5 ml von 2 N), Wasser (1 ml) und DME (5 ml) wurde über Nacht bei 85°C gerührt. Die Umsetzung wurde auf Raumtemperatur gekühlt, in Wasser (100 ml) gegossen und in Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung an Silica (40% Ethylacetat – Hexane) ergab 0,43 g (84%) eines gelbbraunen Feststoffs. Dieses Material wurde durch präparative Umkehrphasen HPLC weiter gereinigt, um die Titelverbindung als gelbbraunen Feststoff zu ergeben: Fp. 179–182°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,23 (2H, s), 6,72 (1H, d, J = 2,38 Hz), 6,78 (1H, dd, J = 2,38 Hz, J = 8,33 Hz), 7,06 (1H, dd, J = 2,38 Hz, J = 8,92 Hz), 7,21 (1H, d, J = 2,38 Hz), 7,63–7,67 (2H, m), 7,72–7,73 (2H, m), 8,05 (1H, d, J = 8,93 Hz), 9,63 (1H, s), 9,75 (1H, s); MS (ESI) m/z 345 (([M – H]–);
    Anal. für C21H14O3S·0,25 C2H3N·0,50 H2O:
    Berechnet: C, 70,62; H, 4,34; N, 0,96;
    Gefunden: C, 70,34; H, 4,41; N, 1,39:
  • Zwischenverbindung 26
  • 12-Thien-2-yl-2,8-dimethoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen
  • Ein Gemisch aus 12-Brom-2,8-dimethoxy-H-dibenzo[c,h]chromen (0,53 g, 1,43 mmol), 2-Thiophen-boronsäure (0,2 g, 1,57 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0,08 g, 0,07 mmol), Natriumcarbonatlösung (2 ml von 2 N), Wasser (1 ml) und DME (20 ml) wurde über Nacht bei 85°C gemäß Verfahren G umgesetzt, um 0,48 g (90%) eines gelbbraunen Feststoffs zu ergeben: Fp. 110–112°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 3,80 (3H, s), 3,81 (3H, s), 5,33 (2H, s), 6,95–6,99 (2H, m), 7,22–7,27 (2H, m), 7,39–7,40 (1H, m), 7,48 (1H, d, J = 2,49 Hz), 7,70 (1H, dd, J = 0,98, 5,37 Hz), 7,76 (1H, d, J = 8,3 Hz), 7,92 (1H, s), 8,16 (1H, d, J = 9,28 Hz); MS (ESI) m/z 345 ([M – H]–);
    Anal. für C23H18O3S:
    Berechnet: C, 73,77; H, 4,85;
    Gefunden: C, 74,43; H, 4,78.
  • Beispiel 1r
  • 12-Thien-2-yl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von Zwischenverbindung 26 und Pyridinium HCl (2,85 g) gemäß Verfahren D hergestellt, um 0,3 g (88%) eines leicht grünlich-gelben Feststoffs zu ergeben: Fp. 191–193°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 5,25 (2H, s), 6,72 (1H, d, J = 2,75 Hz), 6,80 (1H, dd, J = 2,75, 8,24 Hz), 7,90 (1H, dd, J = 2,20, 9,06 Hz), 7,24–7,29 (2H, m), 7,37 (1H, d, J = 2,20 Hz), 7,65–7,68 (2H, m), 7,79 (1H, s), 8,07 1H, d, J = 8,79 Hz), 9,66 (1H, bs), 9,85 (1H, bs); HRMS berechnet für C23H18O3S + H (M + 1) 375,10495 beobachtet 375,10497.
    Anal. für C21H14O3S·0,65 H2O:
    Berechnet: C, 70,43; H, 4,30;
    Gefunden: C, 70,02; H, 3,85.
  • Beispiel 1s
  • 12-Butyl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 12-Brom-H-dibenzo[c,h]-chromen-2,8-diol (1,07 g, 3,12 mmol) mit Butyl-boron säure (0,46 g, 4,55 mmol) gemäß Verfahren G hergestellt, um 0,12 g (12%) eines hellgelben Feststoffs zu ergeben, welcher durch präparative Umkehrphasen HPLC weiter gereinigt wurde, um einen hellvioletten Feststoff zu ergeben: Fp. 118–121°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 0,96 (3H, t, J = 7,30 Hz), 1,38–1,47 (2H, m), 1,62–1,69 (2H, m), 2,90 (2H, t, J = 7,59 Hz), 5,16 (2H, s), 6,69 (1H, d, J = 2,09 Hz), 6,80 (1H, dd, J = 2,38 Hz, J = 8,39 Hz), 7,04 (1H, dd, J = 2,20 Hz, J = 9,04 Hz), 7,20 (1H, d, J = 2,09 Hz), 7,60–7,62 (2H, m), 7,99 (1H, d, J = 9,04 Hz), 9,58 (1H, s), 9,73 (1H, s); MS (ESI) m/z 321 ([M + H]+); MS (ESI) m/z 319 ([M – H]–);
    Anal. für C21H20O3·0,10 H2O;
    Berechnet: C, 78,29; H, 6,32;
    Gefunden: C, 78,13; H, 6,30.
  • Zwischenverbindung 27
  • 8-Dimethoxy-12-propenyl-6H-dibenzo[c,h]chromen
  • Ein Gemisch aus 12-Brom-2,8-dimethoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen (1,4 g, 3,78 mmol), Allyltributylzinn (1,76 ml, 5,68 mmol) und Dichlorbis(triphenylphosphin)palladium(II) (133 mg, 0,19 mmol) in m-Xylol (38 ml) wurde bei 130°C mit Rühren für 1 Std. erhitzt. TLC und LC-MS zeigten an, dass die Umsetzung nicht vollständig war. Das Gemisch wurde durch Celite filtriert und frischer Dichlorbis(triphenylphosphin)palladium(II) (133 mg, 0,19 mmol) Katalysator wurde in die Umsetzung gegeben und das Gemisch wurde bei 130°C für 2 Std. erhitzt. TLC und LC-MS zeigten an, dass die Umsetzung immer noch nicht vollständig war. Daher wurden Filtration und Zugabe von frischem Katalysator zwei Mal wiederholt. Das Gemisch wurde durch Celite filtriert, von Lösungsmittel gestrippt und durch Silica-Chromatographie (20%–40% Dichlormethan – Hexan) gereinigt, um 0,84 g (67%) der Titelverbindung als einen gelblichen Feststoff zu ergeben: 1H NMR (DMSO-d6): δ 2,02 (3H, dd, J = 6,57 Hz, J = 1,73 Hz), 3,86 (3H, s), 3,96 (3H, s), 5,24 (2H, s), 6,17–6,18 (1H, m), 6,75 (1H, d, J = 2,52 Hz), 6,94 (1H, dd, J = 8,57 Hz; J = 2,61 Hz), 7,01 (1H, J = 15,43 Hz, J = 1,54 Hz), 7,14 (1H, dd, J = 9,14 Hz, J = 2,52 Hz), 7,31 (1H, d, J = 2,44 Hz), 7,69 (1H, d, J = 8,57 Hz), 7,81 (1H, s), 8,17 (1H, d, J = 9,16 Hz); MS (ESI) m/z 333 (M + H)+.
  • Zwischenverbindung 28
  • 2,8-Dimethoxy-12-propyl-6H-dibenzo[c,h]chromen
  • Ein Gemisch aus 2,8-Dimethoxy-12-propenyl-6H-dibenzo[c,h]chromen (460 mg, 1,38 mmol) und Palladium (92 mg, 10% auf Aktivkohle) in 36 ml Ethylacetat wurde unter einem Wasserstoffballon bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde durch Celite filtriert und konzentriert, um 430 mg (94%) der Titelverbindung als einen hellbraunen Feststoff zu ergeben. Die analytische Probe wurde durch weitere Reinigung mit präparativer Umkehrphasen HPLC erhalten: Fp. 88–90°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 1,01 (3H, t, J = 7, 31 Hz), 1,68–1,80 (2H, m), 2, 98 (2H, t, J = 7,29 Hz), 3,81 (3H, s), 3,91 (3H, s), 5,25 (2H, s), 6,93 (1H, d, J = 2,53 Hz), 6,98 (1H, dd, J = 8,46 Hz, J = 2,04 Hz), 7,17 (1H, dd, J = 9,20 Hz, J = 2,38 Hz), 7,28 (1H, d, J = 2,36 Hz), 7,72 (1H, s), 7,77 (1H, d, 8,57 Hz), 8,08 (1H, d, J = 9,14 Hz); MS (ESI) m/z 335 (M + H)+.
    Anal. für C22H22O3:
    Berechnet: C, 79.02; H, 6,63;
    Gefunden: C, 78,48; H, 6,75.
  • Beispiel 1t
  • 12-Propyl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol
  • Zu einem Gemisch aus 2,8-Dimethoxy-12-propyl-6H-dibenzo[c,h]chromen (220 mg, 0,658 mmol) in CH2Cl2 (33 ml) bei 0°C wurde langsam Borontribromid (3,95 ml von 1 N Lösung in CH2Cl2 3,95 mmol) zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde bei 0°C für 3 Std. gerührt. 4 ml Wasser wurden mit Rühren in einem Eiswasserbad in das Gemisch injiziert. CH2Cl2 in dem Gemisch wurde unter verringertem Druck entfernt. Das sich ergebende Gemisch wurde mit Ethylacetat (×3) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und von Lösungsmittel gestrippt, um 120 mg (60%) der Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben. Die analytische Probe wurde durch Reinigung mit Silica-Säulenchromatographie (20%–30% Ethylacetat – Hexan) und dann Umkristallisation mit Ethylacetat – Hexan gereinigt: Fp. 86–95°C; 1H NMR (DMSO-d6): δ 1,00 (3H, t, J = 7,24 Hz), 1,63–1,76 (2H, m), 2,87 (2H, t, J = 7,22 Hz), 5,16 (2H, s), 6,69 (1H, d, J = 2,28 Hz), 6,79 (1H, dd, J = 8,39 Hz, J = 2,28 Hz), 7,03 (1H, dd, J = 9,02 Hz, J = 2,18 Hz), 7,20 (1H, d, J = 2,10 Hz), 7,60 (1H, s), 7,62 (1H, d, J = 7,85 Hz), 7,99 (1H, d, J = 9,01 Hz), 9,61 (1H, s), 7,76 (1H, s); MS (ESI) m/z 305 (M – H)–, 307 (M + H)+; HRMS berechnet für C20H18O3 306, 1256; gefunden (ESI), 305, 11827.
    Anal. für C20H18O3:
    Berechnet: C, 78,41; H, 5,92;
    Gefunden: C, 72,79; H, 6,62.
  • Zwischenverbindung 30
  • 5-Methoxy-1-naphthol
  • In einem 2000 ml Kolben wurde ein Gemisch aus 5-Methoxy-1-tetralon (30,0 g, 170,2 mmol) und 10% Pd/C (40 g) in 1000 ml p-Cymen auf Rückfluss gebracht und durch LC-MS überwacht, bis kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden war (etwa 24 Std.). Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt und durch einen Silicagel/Celite Pfropfen passiert und unter Vakuum zu 26,6 g (90%) eines von weiß abweichenden Feststoffs konzentriert: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3,90 (3H, s), 6,83 (1H, appd, J = 7, 5 Hz), 6,89 (1H, appd, J = 7,7 Hz), 7,24 (1H, appt), 7,30 (1H, appt), 7,54 (1H, appt, J = 8,5 Hz), 7,65 (1H, d, J = 8,5 Hz), 9,98 (1H, s).
  • Zwischenverbindung 31
  • 1-[(2-Brom-5-methoxybenzyl)oxy]-5-methoxynaphthalin
  • Zu einem Gemisch aus 5-Methoxy-1-naphthol (26,0 g, 149 mmol), Triphenylphosphin (43,3 g, 165 mmol), (2-Brom-5-methoxy-phenyl)-methanol (36,0 g, 166 mmol) und THF (500 ml) wurde DEAD (28,7 g in 50 ml THF, 165 mmol) tropfenweise zugegeben. Die Umsetzung wurde dann über Nacht gerührt, konzentriert, in einer minimalen Menge an Ether gelöst und bei etwa –30°C gekühlt, um einen weißen Niederschlag (PPh3O und reduziertes DEAD) zu bilden, welcher abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde konzentriert und in einer minimalen Menge an Dichlormethan gelöst und auf –30°C gekühlt. Der Niederschlag wurde an einem Silica-Pfropfen abfiltriert und das Filtrat wurde auf 28,7 g (51,5) eines weißen Feststoffs konzentriert: Fp. 120–121°C; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 3,77 (3H, s), 3,96 (3H,s), 5,26 (2H, s), 6,94 (1H, dd, J = 8,8 Hz, 3,1 Hz), 7,01 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,11 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,28 (1H, d, J = 3,1 Hz), 7,42 (2H, m), 7,61 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,75 (2H, appd); MS m/z 373/275 (Br Muster) (M + H+).
    Anal. für C19H17BrO3;
    Berechnet: C, 61,14; H, 4,59;
    Gefunden: C, 60,86; H, 4,42.
  • Zwischenverbindung 32
  • 1,8-Dimethoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen
  • Zu einem 2000 ml Rückgewinnungskolben wurden 1-[(2-Brom-5-methoxybenzyl)oxy]-5-methoxynaphthalin (3,0 g, 8,03 mmol), Kaliumacetat (2, 4 g, anh., 29, 10 mmol), PdCl2(PPh3)2 (1,12 g, 1,60 mmol) und N,N-Dimethylacetamid (500 ml 99%) zugegeben. Der Kolben wurde mit Stickstoff gespült, für 12 Std. auf 130°C erhitzt und unter hohem Vakuum konzentriert. Die dunklen Feststoffe wurden dann in Ether/CH2Cl2 (1/1 300 ml) gelöst und durch einen Silica-Gel/Celite Pfropfen passiert. Eindampfen unter reduziertem Druck ergab 2,32 g (99%) Produkt als einen gelbbraun gefärbten Feststoff. Fp. 166–167°C; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 3,82 (3H, s), 3,97 (3H, s), 5,30 (2H, s), 6,98 (3H, m), 7,42 (1H, t, J = 8,1 Hz), 7,69 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,81 (2H, appd, J = 8,6 Hz), 7,91 (1H, d, J = 8,9 Hz); MS m/z 293 (M + H+).
    Anal. für C19H16O3;
    Berechnet: C, 78,06; H, 5,52;
    Gefunden: C, 77,67; H, 5,28.
  • Beispiel 1u
  • 6H-Dibenzo[c,h]chromen-1,8-diol
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 1,8-Dimethoxy-6H-dibenzo[c,h]-chromen (1,0 g, 3,42 mmol) mit Pyridin-hydrochlorid (5,0 g, 43,3 mmol) gemäß Verfahren D hergestellt, um 0,93 g (99%) weißen Schaum zu ergeben. Fp. 213–214°C; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 5,21 (2H, s), 6,72 (1H, d, J = 1,9 Hz), 6,82 (2H, m), 7,27 (1H, t, J = 7,9 Hz), 7,54 (1H, d, J = 8,3 Hz), 7,68 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,78 (2H, brs), 9,72 (1H, s), 10,09 (1H, s); MS m/z 263 (M – H+);
    Anal. für C17H12O3;
    Berechnet: C, 77,26; H, 4,58;
    Gefunden: C, 76,62; H, 4,42.
  • Zwischenverbindung 33
  • 1-(Acetyloxy)-6H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 6H-Dibenzo[c,h] chromen-1,8-diol (1,5 g, 5,68 mmol), Essigsäureanhydrid (25 ml) und Pyridin (25 ml) gemäß Verfahren E hergestellt, um 1,88 g (95%) Produkt als einen weißen Feststoff zu erzeugen. Fp. 142–143°C; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 2,31 (3H, s), 2,47 (3H, s), 5,38 (2H, s), 7,18 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,22 (1H, dd, J = 8,4 Hz, 2,3 Hz), 7,33 (1H, d, J = 7,1 Hz), 7,55 (1H, t, J = 8,0 Hz), 7,60 (1H, d, J = 8,9 Hz), 7,95 (1H, d, J = 8,4 Hz), 8,06 (2H, appt); MS m/z 349 (M + H+);
    Anal. für C21H16O5;
    Berechnet: C, 72,41; H, 4,63;
    Gefunden: C, 72,06; H, 4,72.
  • Beispiel 1v
  • 12-Chlor-6H-dibenzo[c,h]chromen-1,8-diol
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 1-(Acetyloxy)-6H-dibenzo[c,h]-chromen-8-yl-acetat (360 mg, 1,03 mmol) mit NCS (210 mg, 1,57 mmol) und wasserfreiem DMF (20 ml) gemäß Verfahren B für 2,0 Std. bei Raumtemperatur, gefolgt von Erhitzen auf 100°C für 1 Std. hergestellt. Die Umsetzung wurde unter verringertem Druck konzentriert und die Feststoffe wurden in MeOH (30 ml) gelöst. NH3 wurde für 0,5 Std. eingeperlt, während Acetat-Entfernung durch LC-MS überwacht wurde. Die Umsetzung wurde zu einem dunklen Schlamm konzentriert, in EtOAc gelöst und durch einen Silica-Pfropfen passiert, um 200 mg (65%) Schaum herzustellen, Eine analytische Probe wurde durch Silica-Chromatographie (1 : 1 EtOAc : Hexane) hergestellt. Fp. ~185°C zerf.; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5,23 (2H, s), 6,72 (1H, d, J = 2,3 Hz), 6,81 (1H, dd, J = 8,6 Hz, 2,6 Hz), 6,92 (1H, dd, J = 7,5 Hz, 1,0 Hz), 7,33 (1H, appt), 7,62 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 1,0 Hz), 7,69 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,79 (1H, s), 9,78 (1H, s), 10,11 (1H, s); MS m/z 297/399 (Cl Muster) (M – H+).
    Anal. für C17H11ClO3;
    Berechnet: C, 68,35; H, 3,71;
    Gefunden: C, 67,85; H, 3,61.
  • Beispiel 1w
  • 12-Brom-6H-dibenzo[c,h]chromen-1,8-diol
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 1-(Acetyloxy)-6H-dibenzo[c,h]chromen-8-yl-acetat (510 mg, 1,46 mmol), NBS (315 mg, 1,77 mmol) und wasserfreiem DMF (30 ml) bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden gemäß Verfahren B hergestellt. Die Umsetzung wurde unter verringertem Druck konzentriert, in MeOH (30 ml) gelöst und NH3 wurde für 1,5 Std. eingeperlt, während Acetat-Entfernung durch LC-MS überwacht wurde. Die Umsetzung wurde zu einem dunklen Schlamm konzentriert und durch Silica-Chromatographie (1 : 1 EtOAc : Hexane) gereinigt, um 340 mg (68%) Produkt als gelbbraunen Feststoff zu ergeben. Fp.: zerfällt über 130°C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 5,23 (2H, s), 6,72 (1H, d, J = 1,9 Hz), 6,81 (1H, dd, J = 8,2 Hz, 2,5 Hz), 6,92 (1H, dd, J = 7,7 Hz, 1,1 Hz), 7,33 (1H, t, J = 8,0 Hz), 7,64 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 1, Hz), 7,68 (1H, d, J = 8,5 Hz), 8,01 (1H, s), 9,78 (1H, s), 10,15 (1H, s); MS m/z 341/343 (Br Muster) (M – H+).
    Anal. für C17H11BrO3:
    Berechnet: C, 59,50; H, 3,23;
    Gefunden: C, 59,23; H, 3,34.
  • Beispiel 1x
  • 1,8-Dihydroxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-12-carbonitril
  • In einen 10 ml Kolben wurden Bromid (165 mg, 0,48 mmol), Pd (PPh3) (28 mg, 0,024 mmol), Zinkcyanid (68 mg, 0,58 mmol) und DMF (5 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde für 12 Std. auf 120°C erhitzt, wonach keine Umsetzung stattfand. Kupfercyanid (43 mg, 0,48 mmol) wurde dann zugegeben und die Umsetzung war in 1 Std. durch LC-MS vollständig. Nachdem die Umsetzung kühlte, wurde sie mit EtOAc verdünnt, durch einen Silica-Pfropfen passiert, konzentriert und durch präparative Umkehrphasen HPLC (Wasser/CH3CN 0,1% TFA) gereinigt und unter reduziertem Druck zu einem weißen Feststoff konzentriert. Die Feststoffe wurden in einer Trockenpistole (100°C über Nacht) getrocknet, um 30 mg Produkt (21%) als weißen Feststoff zu ergeben; Fp. zerf. über 260°C; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 2,06 (2H, m), 2,60 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,99 (2H, t, J = 5,9 Hz), 6,87 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,57 (4H, m), 7,86 (1H, d, J = 8,7 Hz), 9,74 (1H, s); MS m/z 237 (M – H+).
    Anal. für C16H14O2;
    Berechnet: C, 80,65; H, 5,92;
    Gefunden: C, 79,04; H, 5,60.
  • Beispiel 1y und Beispiel 1z
  • 2-Chlor-6H-dibenzo[c,h]chromen-1,8-diol (Bsp. 1y) und 4-Chlor-6H-dibenzo[c,h]chromen-1,8-diol (Bsp. 1z)
  • Die Titelverbindung wurde durch Umsetzen von 6H-Dibenzo[c,h] chromen-1,8-diol (150 mg, 0,57 mmol), NCS (84 mg, 0,63 mmol) und THF (8 ml) für 3 Std. bei RT und für 5 Std. bei 60°C gemäß Verfahren B hergestellt. Die Umsetzung wurde durch präparative HPLC gereinigt, um 35 mg 2-Chlor Verbindung und 10 mg 4-Chlor Verbindung (27% insgesamt) zu ergeben.
  • 2-Chlor Verbindung: Fp. 181–182°C zerf.; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 5,24 (2H, s), 6,72 (1H, d, J = 2,3 Hz), 6,83 (1H, dd, J = 8,4 Hz, 2,4 Hz), 7,40 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,61 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,71 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,64 (1H, d, J = 8,9), 7,91 (1H, d, J = 9,0 Hz), 9,77 (1H, s), 10,01 (1H, s); HRMS Genau: 297,03239 (M – H+), gefunden: 297,03240 (0,02 ppm);
    Anal. für C17H11ClO3:
    Berechnet: C, 68,35; H, 3,71;
    Gefunden: C, 67,66; H, 3,68.
  • 4-Chlor Verbindung: Fp; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 5,14 (2H, s), 6,73 (1H, d, J = 2,4 Hz), 6,77 (1H, d, J = 8,2 Hz), 6,84 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,5 Hz), 7,31 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,70 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,87 (2H, appq), 9,78 (1H, s), 9,77 (1H, s), 10,90 (1H, s); HRMS Genau: 297,03239 (M – H+), gefunden: 297,03236 (–0,11 ppm);
    Anal. für C17H11ClO3:
    Berechnet: C, 68,35; H, 3,71;
    Gefunden: C, 66,12; H, 3,57.

Claims (31)

  1. Verbindung der Formel I mit der Struktur
    Figure 00760001
    worin R1 und R2 jeweils unabhängig ausgewählt werden aus Wasserstoff, Hydroxyl, Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Alkinyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen oder Halogen; worin die Alkyl- oder Alkenylkomponenten von R1 oder R2 gegebenenfalls substituiert sein können mit Hydroxyl, -CN, Halogen, Trifluoralkyl, Trifluoralkoxy, -NO2 oder Phenyl; und mit der Maßgabe, dass mindestens eines von R1 oder R2 für Hydroxyl steht; R3, R4, R5, R6 und R7 jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Halogen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, -CN, Alkenyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Alkinyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, -CHO, Phenyl oder einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring mit 1 bis 4 Heteroatomen, ausgewählt aus O, N oder S darstellen; worin die Alkyl- oder Alkenylkomponenten von R4, R5, R6 oder R7 gegebenenfalls substituiert sein können mit Hydroxyl, -CN, Halogen, Trifluoralkyl, Trifluoralkoxy, -NO2 oder Phenyl; worin die Phenylkomponente von R4 oder R5 gegebenenfalls mono-, di- oder trisubstituiert sein kann mit einem Substituenten, gleich oder unterschiedlich, ausgewählt aus Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Halogen, Hydroxyl, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, -CN, -NO2, Amino, Alkylamino mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Dialkylamino mit 1–6 Kohlenstoffatomen pro Alkylgruppe, Thio, Alkylthio mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkylsulfinyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkylsul fonyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Alkylcarbonyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen oder Benzoyl; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  2. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R6 und R7 jeweils unabhängig Wasserstoff oder Halogen darstellen.
  3. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin R6 für Wasserstoff oder Fluor steht.
  4. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin R4 und R5 jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Halogen, Alkenyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen, -CN, Furyl oder Thienyl darstellen.
  5. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin R4 nicht für Wasserstoff steht.
  6. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin R4 ausgewählt wird aus Cyano, Chlor, Brom, Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Methoxy, Vinyl, Thien-2-yl und Thien-3-yl.
  7. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R5 für Wasserstoff oder Halogen steht.
  8. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin R2 und R3 jeweils unabhängig Wasserstoff, Halogen oder Hydroxyl darstellen.
  9. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin R2 für Hydroxyl oder Halogen steht.
  10. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin R2 für Hydroxy steht.
  11. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, worin R3 für Wasserstoff oder Halogen steht.
  12. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, worin R1 für Wasserstoff, Hydroxyl oder Halogen steht.
  13. Verbindung gemäß Anspruch 1, welche eine der Folgenden ist: a) 6H-Dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; b) 9-Fluor-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; c) 2,8-Dihydroxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-12-carbonitril; d) 9-Fluor-2,8-dihydroxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-12-carbonitril; e) 1-Chlor-2,8-dihydroxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-12-carbonitril; f) 1-Chlor-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; g) 12-Brom-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; h) 12-Chlor-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; i) 12-Brom-9-fluor-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; j) 12-Chlor-9-fluor-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; k) 12-Methoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; l) 11-Chlor-12-methoxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; m) 12-Methyl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; n) 12-Vinyl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; o) 12-Ethyl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; p) 12-Thien-3-yl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; q) 12-Thien-2-yl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; r) 12-Butyl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; s) 12-Propyl-6H-dibenzo[c,h]chromen-2,8-diol; t) 6H-Dibenzo[c,h]chromen-1,8-diol; u) 12-Chlor-6H-dibenzo[c,h]chromen-1,8-diol; v) 12-Brom-6H-dibenzo[c,h]chromen-1,8-diol; w) 1,8-Dihydroxy-6H-dibenzo[c,h]chromen-12-carbonitril; x) 2-Chlor-6H-dibenzo[c,h]chromen-1,8-diol; y) 4-Chlor-6H-dibenzo[c,h]chromen-1,8-diol; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  14. Verbindung, welche 6H-Dibenzo[c,h]chromen-8-ol ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  15. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Hemmen von Prostatitis oder interstitieller Zystitis in einem Säuger.
  16. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Hemmen von entzündlicher Darmerkrankung, Crohn-Krankheit, Proctitis ulcerosa oder Kolitis in einem Säuger.
  17. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Hemmen von Prostata-Hypertrophie, Leiomyomen des Uterus, Brustkrebs, Endometriumkrebs, polyzystischem Ovarsyndrom, endometrialen Polypen, gutartiger Brusterkrankung, Adenomyose, Eierstockkrebs, Melanom, Prostatakrebs, Dickdarmkrebs, Gliom oder Astioblastomie in einem Säuger.
  18. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Verringern von Cholesterin, Triglyceriden, Lp(a) oder LDL-Graden; Hemmen oder Behandeln von Hypercholesterinämie; Hyperlipidämie; kardiovaskulärer Erkrankung; Atherosklerose; Bluthochdruck; periphervaskulärer Erkrankung; Restenose oder Vasospasmen; oder Hemmen vaskulärer Wandschädigung von zellulären Vorkommnissen, welche zu immun-vermittelter vaskulärer Schädigung führen, in einem Säuger.
  19. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Vorsehen von Kognitionsverstärkung oder Neuroprotektion oder zum Behandeln oder Hemmen von seniler Demenz, Alzheimer-Erkrankung, kognitiver Verminderung, Schlaganfall, Angststörung oder neurodegenerativen Störungen in einem Säuger.
  20. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Hemmen von Erkrankungszuständen, herbeigeführt durch freie Radikale, in einem Säuger.
  21. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Hemmen von vaginaler oder Vulva-Atrophie; atrophischer Vaginitis; vaginaler Trockenheit; Pruritus; Dyspareunie; Dysurie; häufigem Urinieren; Harninkontinenz und Entzündungen des Harnwegs in einem Säuger.
  22. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Hemmen von vasomotorischen Symptomen in einem Säuger.
  23. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen von Empfängnis in einem Säuger.
  24. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Hemmen von Arthritis in einem Säuger.
  25. Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei die Arthritis Rheumatoidarthritis, Osteoarthritis oder Spondyloarthropathien ist.
  26. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Hemmen von Gelenkschwellung oder Erosion; oder Behandeln oder Verhindern von Gelenkschädigung sekundär zu arthroskopischen oder chirurgischen Verfahren in einem Säuger.
  27. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Hemmen von Psoriasis oder Dermatitis in einem Säuger.
  28. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Hemmen von Ischämie, Reperfusionsverletzung, Asthma, Pleurisie, multipler Sklerose, systemischem Lupus erythematodes, Uveitis, Sepsis, hämorrhagischem Schock, Makuladegeneration oder Diabetes Typ II in einem Säuger.
  29. Verwendung einer Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Hemmen von Endometriose in einem Säuger.
  30. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutischen Träger umfasst.
  31. Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, welches eines der Folgenden umfasst: a) Dealkylieren einer Verbindung der Formel II:
    Figure 00810001
    worin R für eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht und R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 wie in Anspruch 1 definiert sind, um eine Verbindung der Formel I zu ergeben; oder b) Deacylieren einer Verbindung der Formel III:
    Figure 00810002
    worin R' eine Acylgruppe darstellt, z. B. Alkanoyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen wie Acetyl, R11 für R1 oder eine Acyloxygruppe steht, z. B. Alkanoyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen wie Acetyl, R12 für R2 oder eine Acyloxygruppe steht, z. B. Alkanoyl mit 2–7 Kohlenstoffatomen wie Acetyl, und R3, R4, R5, R6, R7 wie in Anspruch 1 definiert sind, um eine Verbindung der Formel I zu ergeben; oder c) Umsetzen einer 12-Bromverbindung der Formel IV:
    Figure 00820001
    geschützt wie notwendig, worin R1, R2, R3, R5, R6 und R7 wie in Anspruch 1 definiert sind, mit einem reaktiven Derivat der Formel R4-L z. B., worin L für eine Boronsäure oder ein Butylzinnderivat steht und R4 für Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen oder einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring mit 1 bis 4 Heteroatomen steht, ausgewählt aus O, N oder S; und Entfernen jeglicher Schutzgruppen, um eine entsprechende Verbindung der Formel (I) zu ergeben; oder d) Halogenieren einer Verbindung der Formel I:
    Figure 00820002
    wie in Anspruch 1 definiert, geschützt falls notwendig, und wo rin mindestens eines von R1, R2, R3, R4 und R5 für Wasserstoff steht, mit einem Halogenierungsmittel, gefolgt falls nötig von Entschützung, um eine Verbindung der Formel I zu ergeben, worin mindestens eines von R1, R2, R3 und R4 für Halogen steht; oder d) Nitrilieren einer Verbindung der Formel I:
    Figure 00830001
    wie in Anspruch 1 definiert, geschützt wie notwendig, und worin R4 für Brom steht, mit einem Nitrilierungsmittel, z. B. Zinkcyanid, gefolgt falls notwendig von Entschützung, um eine Verbindung der Formel I zu ergeben, worin R4 für Cyano steht; oder e) Umwandeln einer basischen Verbindung der Formel I in ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon oder umgekehrt.
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