DE602004011358T2

DE602004011358T2 - (4-hydroxyphenyl)-1h-indol-3-carbaldehydoxim-derivative als östrogenagentien

Info

Publication number: DE602004011358T2
Application number: DE602004011358T
Authority: DE
Inventors: Richard Eric King of Prussia Mewshaw; Stephen Marc Mohnton BOWEN; Eric Steven Lafayette Hill MANAS
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2003-08-12
Filing date: 2004-08-10
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2024-08-11
Also published as: DK1653947T3; DE602004011358D1; EP1653947A1; US7250440B2; ATE383856T1; ES2298823T3; CA2535341A1; WO2005018636A1; EP1653947B1; BRPI0413523A; US20050059723A1; US20070249703A1; MXPA06001592A; AU2004266603A1; JP2007502277A; PL1653947T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft (Hydroxyphenyl)-1H-indol-3-carbaldehydoxim-Derivate, deren Verwendungen als östrogene Mittel und Verfahren zu deren Herstellung.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die pleiotropen Wirkungen von Östrogenen in Säugergeweben sind gut dokumentiert worden und man ist sich nun bewusst, dass Östrogene sich auf viele Organsysteme auswirken [Mendelsohn und Karas, New England Journal of Medicine 340: 1801–1811 (1999), Epperson et al., Psychosomatic Medicine 61: 676–697 (1999), Crandall, Journal of Womens Health & Gender based Medicine 8: 1155 – 1166 (1999), Monk und Brodaty, Dementis & Geriatric Cognitive Disorders 11: 1–10 (2000), Hurn und Macrae, Journal of Cerebral Blond Flow & Metabolism 20: 631–652 (2000), Calvin, Maturitas 34: 195–210 (2000), Finking et al., Zeitschrift für Kardiologie 89: 442–453 (2000), Brincat, Maturitas 35: 107–117 (2000), Al-Azzawi, Postgraduate Medical Journal 77: 292–304 (2001)]. Östrogene können auf Gewebe auf mehrerlei Weise Wirkungen ausüben. Der am besten charakterisierte Wirkmechanismus ist wahrscheinlich ihre Interaktion mit Östrogenrezeptoren, die zu Veränderungen der Gentranskription führt. Östrogenrezeptoren sind ligandenaktivierte Transkriptionsfaktoren und gehören zu der Superfamilie nuklearer Hormonrezeptoren. Zu anderen Mitgliedern dieser Familie zählen die Progesteron-, Androgen-, Glukokortikoid- und Mineralokortikoidrezeptoren. Beim Binden von Ligand dimerisieren diese Rezeptoren und können die Gentranskription entweder durch direktes Binden an spezifische Sequenzen an DNA (als Response-Elemente bekannt) oder durch Interagieren mit anderen Transkriptionsfaktoren (wie AP1), die wiederum direkt an spezifische DNA-Sequenzen binden, aktivieren [Moggs und Orphanides, EMBO Reports 2: 775–781 (2001), Hall et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869–36872 (2001), McDonnell, Principles of Molecular Regulation, S. 351–361 (2000)]. Eine Klasse von „Koregulator"-Proteinen kann ebenfalls mit dem ligandengebundenen Rezeptor interagieren und dessen Transkriptionsaktivität weiter modulieren [McKenna et al., Endocrine Reviews 20: 321–344 (1999)]. Es wurde außerdem gezeigt, dass Östrogenrezeptoren die NFκB-vermittelte Transkription auf sowohl ligandenabhängige als auch ligandenunabhängige Weise supprimieren können [Quaedackers et al., Endocrinology 142: 1156–1166 (2001), Bhat et al., Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 67: 233–240 (1998), Pelzer et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 286: 1153–1157 (2001)].
Östrogenrezeptoren können auch durch Phosphorylierung aktiviert werden. Diese Phosphorylierung wird von Wachstumsfaktoren, wie EGF, vermittelt und bewirkt in Abwesenheit von Ligand Veränderungen der Gentranskription [Moggs und Orphanides, EMBO Reports 2: 775–781 (2001), Hall et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869–36872 (2001)].
Ein weniger gut charakterisiertes Mittel, durch das Östrogene sich auf Zellen auswirken können, ist mittels eines so genannten Membranrezeptors. Die Existenz eines solchen Rezeptors ist umstritten, es wurde jedoch gut dokumentiert, dass Östrogene sehr schnelle, nicht genomische Reaktionen von Zellen auslösen können. Die Moleküleinheit, die für das Transduzieren dieser Effekte verantwortlich zeichnet, wurde nicht definitiv isoliert, es gibt jedoch Hinweise, die nahe legen, dass sie am wenigsten mit den nuklearen Formen der Östrogenrezeptoren verwandt ist [Levin, Journal of Applied Physiology 91: 1860–1867 (2001), Levin, Trends in Endocrinology & Metabolism 10: 374–377 (1999)].
Bis heute wurden zwei Östrogenrezeptoren entdeckt. Der erste Östrogenrezeptor wurde vor etwa 15 Jahren kloniert und wird nun als ERα bezeichnet [Green et al., Nature 320: 134–139 (1986)]. Der zweite wurde vor verhältnismäßig kurzer Zeit gefunden und wird ERβ genannt [Kuiper et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 5925–5930 (1996)]. Frühe Arbeiten an ERβ konzentrierten sich auf das Definieren seiner Affinität für eine Vielfalt von Liganden und es wurden in der Tat einige Unterschiede zu ERα erkannt. Diese Gewebeverteilung von ERβ wurde in dem Nagetier gut kartiert und stimmt nicht mit ERα überein. Gewebe, wie der Maus- und Rattenuterus, exprimieren vorwiegend ERα, wohingegen die Maus- und Rattenlunge vorwiegend ERβ exprimiert [Couse et al., Endocrinology 138: 4613–4621 (1997), Kuiper et al., Endocrinology 138: 863–870 (1997)]. Selbst in demselben Organ kann die Verteilung von ERα und ERβ kompartimentiert sein. Zum Beispiel wird ERβ in dem Mausovarium in den Granulosazellen stark exprimiert und ERα ist auf die Theka- und Stromazellen beschränkt [Sar und Welsch, Endocrinology 140: 963–971 (1999), Fitzpatrick et al., Endocrinology 140: 2581–2591 (1999)]. Es gibt jedoch Beispiele, in denen die Rezeptoren koexprimiert werden, und es gibt Hinweise aus In-vitro-Studien, dass ERα und ERβ Heterodimere bilden können [Cowley et al., Journal of Biological Chemistry 272: 19858–19862 (1997)].
Das potenteste endogene Östrogen ist 17β-Östradiol. Eine große Anzahl von Verbindungen wurde beschrieben, die entweder die Aktivität von 17β-Östradiol nachahmen oder blockieren. Verbindungen mit ungefähr gleichen biologischen Wirkungen wie 17β-Östradiol werden als „Östrogenrezeptoragonisten" bezeichnet. In der Tat gibt es eine kontinuierliche Größe zwischen der Aktivität von Östrogenrezeptoragonist und von Östrogen rezeptorantagonist und einige Verbindungen verhalten sich in einigen Geweben als Östrogenrezeptoragonisten, in anderen jedoch als Östrogenrezeptorantagonisten. Diese Verbindungen mit gemischter Aktivität werden selektive Östrogenrezeptormodulatoren (SERMS) genannt und sind therapeutisch verwendbare Mittel (z. B. EVISTA) [McDonnell, Journal of the Society for Gynecologic Investigation 7: S10–S15 (2000), Goldstein et al., Human Reproduction Update 6: 212–224 (2000)]. Der präzise Grund, warum dieselbe Verbindung zellspezifische Wirkungen aufweisen kann, wurde nicht aufgeklärt, Unterschiede der Rezeptorkonformation und/oder des Milieus von Koregulatorproteinen wurden jedoch nahe gelegt.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass Östrogenrezeptoren verschiedene Konformationen annehmen, wenn sie Liganden binden. Die Folge und Feinheit dieser Veränderungen wurde jedoch erst vor kurzem offenbart. Die dreidimensionalen Strukturen von ERα und ERβ wurden mittels Kokristallisation mit verschiedenen Liganden aufgelöst und zeigen deutlich die Neupositionierung von Helix 12 in Gegenwart eines Östrogenrezeptorantagonisten, die die Proteinsequenzen, die für die Rezeptor/Koregulatorprotein-Interaktion erforderlich sind, sterisch hindert [Pike et al., Embo 18: 4608–4618 (1999), Shiau et al., Cell 95: 927–937 (1998)]. Darüber hinaus wurde die Technik der Phagenanzeige zum Identifizieren von Peptiden verwendet, die in Gegenwart verschiedener Liganden mit Östrogenrezeptoren interagieren [Paige et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 3999–4004 (1999)]. Zum Beispiel wurde ein Peptid identifiziert, das zwischen ERα unterschied, das an die vollständigen Östrogenrezeptoragonisten 17β-Östradiol und Diethylstilbesterol gebunden war. Von einem anderen Peptid wurde gezeigt, dass es zwischen Clomiphen unterschied, das an ERα und ERβ gebunden war. Diese Daten weisen darauf hin, dass jeder Ligand potentiell den Rezeptor in einer einzigartigen und unvorhersehbaren Konformation anordnet, von der wahrscheinlich ist, dass sie eindeutige biologische Aktivitäten aufweist.
Wie oben erwähnt, wirken sich Östrogene auf eine Palette biologischer Vorgänge aus. Darüber hinaus ist es möglich, wenn Geschlechtsunterschiede (z. B. Erkrankungshäufigkeiten, Reaktionen auf Belastungsinfektionen usw.) beschrieben wurden, dass die Erläuterung den Unterschied der Östrogenspiegel zwischen männlichen und weiblichen Geschöpfen einschließt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft (Hydroxyphenyl)-1H-indol-3-carbaldehydoxim-Derivate. In bestimmten Gesichtspunkten betrifft die Erfindung Verbindungen der Formel I:
in der:
R₁ Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Halogen, CN oder gegebenenfalls substituiertes Alkoxy ist;
R₂ Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl ist;
oder R₁ und R₂ zusammen einen 5- bis 7-gliedrigen Ring bilden können und
R₃ und R₄ unabhängig jeweils H, OH, Halogen, CN, gegebenenfalls substituiertes Phenyl, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Alkoxy sind; oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung 1 und einen pharmazeutischen Trägerstoff umfasst.
In anderen Ausführungsformen zielt die Erfindung auf die Verwendung derartiger Verbindungen bei der Behandlung oder Prävention von Erkrankungen, wie entzündlichen Darmerkrankungen, ab.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Verbindung stellt östrogene Verbindungen der Formel I bereit, die zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, wie entzündlichen Darmerkrankungen (einschließlich Morbus Crohn und Kolitis), von Nutzen sind.
in der R₁ Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Halogen, CN oder gegebenenfalls substituiertes Alkoxy ist; R₂ Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl ist oder R₁ und R₂ zusammen einen 5- bis 7-gliedrigen Ring bilden können und R₃ und R₄ unabhängig jeweils H, OH, Halogen, CN, gegebenenfalls substituiertes Phenyl, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Alkoxy sind; oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
In bestimmten Ausführungsformen von Verbindung 1 ist R₁ Alkyl, vorzugsweise Niederalkyl, z. B. Methyl. In anderen Ausführungsformen ist R₂ Wasserstoff oder Alkyl, vorzugsweise Niederalkyl, z. B. Methyl. Weitere Ausführungsformen umfassen Zusammensetzungen, in denen R₁ und R₂ zusammen einen 6- gliedrigen Ring bilden. In einigen Ausführungsformen ist R₃ H, Halogen oder CN. R₄ ist in einigen Ausführungsformen Wasserstoff. In einigen anderen Ausführungsformen ist R₄ Fluor. In einigen Ausführungsformen ist R₄ ortho-Fluor.
Pharmazeutisch unbedenkliche Salze können aus organischen und anorganischen Säuren, beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Citronensäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Mandelsäure, Apfelsäure, Phthalsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Methansulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Camphersulfonsäure und ähnliche bekannte unbedenkliche Säuren, gebildet werden, wenn eine Verbindung dieser Erfindung einen basischen Teil enthält. Salze können auch aus organischen oder anorganischen Basen gebildet werden, wie Alkalimetallsalze (beispielsweise Natrium, Lithium oder Kalium), Erdalkalimetallsalze, Ammoniumsalze, Alkylammoniumsalze, die 1–6 Kohlenstoffatome enthalten, oder Dialkylammoniumsalze, die 1–6 Kohlenstoffatome in jeder Alkylgruppe enthalten, und Trialkylammoniumsalze, die 1–6 Kohlenstoffatome in jeder Alkylgruppe enthalten, wenn eine Verbindung dieser Erfindung einen sauren Teil enthält.
Der Ausdruck „Alkyl", wie hierin verwendet, ob für sich oder als Teil einer anderen Gruppe verwendet, bezieht sich auf eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Kohlenwasserstoffkette und beinhaltet, ist jedoch nicht darauf beschränkt, gerade und verzweigte Ketten, die von 1 bis 12 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben. Zum Beispiel werden Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl und tert.-Butyl von dem Ausdruck „Alkyl" umfasst. Insbesondere in der Definition von „Alkyl" enthalten sind jene aliphatischen Kohlenwasserstoffketten, die gegebenenfalls substituiert sind. Der Ausdruck „Niederalkyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, in einigen Ausführungsformen 1 bis 3 Kohlenstoffatome.
Der Ausdruck „Alkoxy", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Gruppe R-O-, wobei R eine Alkylgruppe, vorzugsweise mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
Die Kohlenstoffanzahl, wie in den Definitionen hierin verwendet, bezieht sich auf Kohlenstoffhauptkette und Kohlenstoffverzweigung, beinhaltet jedoch nicht Kohlenstoffatome der Substituenten, wie Alkoxysubstitutionen und dergleichen.
Der Ausdruck „Phenyl", wie hierin verwendet, ob für sich oder als Teil einer anderen Gruppe verwendet, bezieht sich auf eine substituierte oder unsubstituierte Phenylgruppe.
Ein gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Alkenyl und Phenyl kann mit einem oder mehreren Substituenten substituiert werden. Geeignete optionale Substituenten können unabhängig aus Nitro, Cyano, -N(R₁₁)(R₁₂), Halogen, Hydroxy, Carboxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Aryloxy, Heteroaryloxy, Alkylalkoxy, Alkoxycarbonyl, Alkoxyalkoxy, Perfluoralkyl, Perfluoralkoxy, Arylalkyl, Alkylaryl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Alkylthio, -S(O₂)-N(R₁₁)(R₁₂), -C(=O)-N(R₁₁)(R₁₂), (R₁₁)(R₁₂)N-Alkyl, (R₁₁)(R₁₂)N-Alkoxyalkyl, (R₁₁)(R₁₂)N-Alkylaryloxyalkyl, -S(O)_s-Aryl (wobei s = 0–2) oder S(O)_s-Heteroaryl (wobei s = 0–2) ausgewählt sein. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung zählen zu bevorzugten Substituenten für Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl oder Phenyl Nitro, Cyano, -N(R₁₁)(R₁₂), Halogen, Hydroxyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Alkoxyalkyl und Alkoxycarbonyl. In bestimmten Ausführungsformen zählen zu bevorzugten Substituenten für Aryl und Heteroaryl -N(R₁₁)(R₁₂), Alkyl, Halogen, Perfluoralkyl, Perfluoralkoxy, Arylalkyl und Alkylaryl. R₁₁ und R₁₂ sind jeweils unabhängig aus Wasserstoff und Alkyl ausgewählt.
Der Ausdruck „Alkenyl", wie hierin verwendet, ob für sich oder als Teil einer anderen Gruppe verwendet, bezieht sich auf eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Kohlenwasserstoffkette und beinhaltet, ist jedoch nicht darauf beschränkt, gerade und verzweigte Ketten, die 2 bis 8 Kohlenstoffatome aufweisen und mindestens eine Doppelbindung enthalten. Vorzugsweise weist der Alkenylteil 1 oder 2 Doppelbindungen auf. Solche Alkenylteile können in der E-Konformation oder der Z-Konformation existieren und die Verbindungen dieser Erfindung beinhalten beide Konformationen. Insbesondere in der Definition von „Alkenyl" enthalten sind jene aliphatischen Kohlenwasserstoffketten, die gegebenenfalls substituiert sind. Heteroatome, wie O, S oder N-R, die an einem Alkenyl angelagert sind, sollten nicht an einem Kohlenstoffatom, das an eine Doppelbindung gebunden ist, angelagert sein.
Wenn hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck Alkinyl auf eine aliphatische, gerade oder verzweigte, Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, die 1 bis 3 Dreifachbindungen enthalten kann. Wenn hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck Cycloalkyl auf einen monocarbocyclischen Ring mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, z. B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl. Wenn hierin verwendet, für sich oder als Teil einer Gruppe, bezieht sich der Ausdruck Aryl auf einen aromatischen 5- bis 13-gliedrigen mono- oder bicarbocyclischen Ring, wie Phenyl oder Naphthyl. Vorzugsweise sind Gruppen, die Arylteile enthalten, monocyclisch mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen im Ring. Wenn hierin verwendet, für sich oder als Teil einer Gruppe, bezieht sich der Ausdruck Heteroaryl auf einen aromatischen 5- bis 13-gliedrigen, Kohlenstoff enthaltenden mono- oder bicyclischen Ring mit ein bis fünf Heteroatomen, die unabhängig Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel sein können. Vorzugsweise sind Gruppen, die Heteroarylteile enthalten, monocyclisch mit 5 bis 7 Gliedern im Ring, wobei ein oder zwei der Ringglieder unabhängig aus Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt sind. Zu geeigneten Arylgruppen zählen Furanyl, Thienyl, Pyridinyl, Indolyl und Chinolyl.
Zu Beispielen für halogensubstituierte Alkyle und Alkenyle zählen 1-Bromvinyl, 1-Fluorvinyl, 1,2-Difluorvinyl, 2,2-Difluorvinyl, 1,2,2-Trifluorvinyl, 1,2-Dibromethan, 1,2-Difluorethan, 1-Fluor-2-bromethan, CF₂CF₃, CF₂CF₂CF₃ und dergleichen.
Der Ausdruck Halogen beinhaltet Brom, Chlor, Fluor und Iod, vorzugsweise Brom, Chlor und Fluor.
Wie gemäß dieser Erfindung verwendet, steht der Ausdruck „Bereitstellen" im Hinblick auf das Bereitstellen einer Verbindung oder Substanz, die von dieser Erfindung umfasst wird, für entweder direktes Verabreichen einer solchen Verbindung oder Substanz oder Verabreichen eines Derivats oder Analogons, das die wirksame Menge der Verbindung oder Substanz in dem Körper bilden wird.
Die bei der Herstellung der Verbindungen dieser Erfindung verwendeten Reagenzien können entweder vom Handel bezogen werden oder können mittels in der Literatur beschriebener Standardmethoden hergestellt werden.
Die Herstellung mehrerer repräsentativer Beispiele dieser Erfindung wird in den folgenden Schemata 1–3 beschrieben.
Schema 1
Schema 2
Schema 3
Die Verbindungen dieser Erfindung sind Östrogenrezeptormodulatoren, die zur Behandlung oder Inhibition von Leiden, Erkrankungen oder Krankheitszuständen, die zumindest zum Teil von einem Östrogenmangel oder -überschuss vermittelt werden oder die mittels Verwendung eines östrogenen Mittels behandelt oder inhibiert werden können, von Nutzen sind. Die Verbindungen dieser Erfindung sind insbesondere zum Behandeln eines perimenopausalen, menopausalen oder postmenopausalen Patienten von Nutzen, bei dem die produzierten Spiegel endogener Östrogene beträchtlich verringert sind. Die Menopause ist im Allgemeinen als die letzte natürliche Menstruationsperiode definiert und ist von der Einstellung der Ovarfunktion gekennzeichnet, was zu einer beträchtlichen Verringerung von zirkulierendem Östrogen im Blutstrom führt. Wie hierin verwendet, beinhaltet Menopause auch Zustände verminderter Östrogenproduktion, die chirurgisch, chemisch oder von einem Krankheitszustand, der zu einer vorzeitigen Minderung oder Einstellung der Ovarfunktion führt, verursacht sein kann.
Dementsprechend sind die Verbindungen dieser Erfindung zum Behandeln oder Inhibieren von Osteoporose und zur Inhibition von Knochendemineralisation, die aus einem Ungleichgewicht in der Bildung von neuen Knochengeweben und der Resorption älterer Gewebe in einer Einzelperson resultieren kann, was zu einem Nettoverlust von Knochen führt, von Nutzen. Eine solche Knochenabnutzung resultiert in einem Bereich von Einzelpersonen, insbesondere in postmenopausalen Frauen, Frauen, die einer beidseitigen Eierstockentfernung unterzogen wurden, jenen, die erweiterte Kortikosteroidtherapien erhalten oder erhalten haben, jenen, die eine Gonadendysgenesie erfahren, und jenen, die an dem Cushing-Syndrom leiden. Spezielle Bedürfnisse am Ersatz von Knochen, einschließlich Zahnknochen und Knochen der Mundhöhle, können ebenfalls unter Verwendung dieser Verbindungen in Einzelpersonen mit Knochenbrüchen, defekten Knochenstrukturen und jenen, die mit Knochen zusammenhängenden chirurgischen Eingriffen und/oder der Implantation einer Prothese unterzogen werden, erfüllt werden. Neben den oben beschriebenen Problemen können diese Verbindungen zur Behandlung oder Inhibition von Osteoarthrose, Hypokalziämie, Hyperkalziämie, Paget-Krebs, Osteomalazie, Osteohalisterese, Kahler-Krankheit oder anderen Krebsformen mit schädlichen Auswirkungen auf Knochengewebe verwendet werden.
Die Verbindungen dieser Erfindung sind außerdem zum Behandeln oder Inhibieren von gutartigem oder bösartigem abnormem Gewebewachstum, einschließlich Prostatavergrößerung, Uterusleiomyomen, Brustkrebs, Endometriose, Stein-Leventhal-Syndrom, Endometriumpolypen, gutartiger Brusterkrankung, Adenomyosis interna, Eierstockkrebs, Melanom, Prostatakrebs, Krebserkrankungen des Kolons, Krebserkrankungen des ZNS, wie Gliom oder Astroblastom, von Nutzen.
Die Verbindungen dieser Erfindung sind kardioprotektiv und sie sind zum Senken von Cholesterin-, Triglycerid-, Lp(a)- oder LDL-Spiegeln; Inhibieren oder Behandeln von Hypercholesterinämie; Hyperlipämie; Herz-Kreislauf-Erkrankung; Atherosklerose; peripherer Verschlusskrankheit; Restenose und Vasospasmus und Inhibieren von Gefäßwandschädigung aufgrund von zellulären Ereignissen, die zu immunvermittelter Gefäßwandschädigung führen, von Nutzen. Diese Herz und Kreislauf schützenden Eigenschaften sind von großer Bedeutung, wenn postmenopausale Patienten mit Östrogenen behandelt werden, um Osteoporose zu inhibieren, und im männlichen Geschöpf, wenn Östrogentherapie indiziert ist.
Die Verbindungen dieser Erfindung sind außerdem Antioxidantien und sind somit zum Behandeln oder Inhibieren von radikalinduzierten Krankheitszuständen von Nutzen. Spezifische Situationen, in denen Antioxidanstherapie als berechtigt indiziert ist, sind bei Krebserkrankungen, Störungen des Zentralnervensystems, Alzheimer-Krankheit, Knochenerkrankung, Alterung, Entzündungserkrankungen, peripherer Verschlusskrankheit, rheumatoider Arthritis, Autoimmunkrankheiten, Atemnot, Emphysem, Prävention von Reperfusionsverletzung, Virushepatitis, chronischer aktiver Hepatitis, Tuberkulose, Psoriasis, systemischem Lupus erythematodes, Atemnotsyndrom des Erwachsenen, Trauma des Zentralnervensystems und Schlaganfall.
Die Verbindungen dieser Erfindung sind außerdem zum Bereitstellen von Kognitionsverbesserung und zum Behandeln oder Inhibieren von senilen Demenzen, Alzheimer-Krankheit, kognitiver Verschlechterung, neurodegenerativen Erkrankungen, Bereitstellen von Neuroprotektion oder Kognitionsverbesserung von Nutzen.
Die Verbindungen dieser Erfindung sind außerdem zum Behandeln oder Inhibieren von entzündlicher Darmerkrankung, ulzerativer Proktitis, Morbus Crohn und Kolitis; mit der Menopause zusammenhängenden Zuständen, wie vasomotorischen Symptomen, einschließlich Hitzewallungen, Vaginal- oder Vulvaatrophie, atrophischer Vaginitis, vaginaler Trockenheit, Pruritus, Dyspareunie, Dysurie, häufiger Blasenentleerung, Harninkontinenz, Harnwegsinfektionen, vasomotorischer Symptome, einschließlich Hitzewallungen, Myalgie, Arthralgie, Insomnie, Reizbarkeit und dergleichen; androgenetischer Alopezie; Hautatrophie; Akne; Typ-II-Diabetes; dysfunktioneller Uterusblutung und Infertilität von Nutzen.
Die Verbindungen dieser Erfindung sind in Krankheitszuständen von Nutzen, in denen Amenorrhoe vorteilhaft ist, wie Leukämie, Endometriumablationen, chronische Nieren- oder Lebererkrankung oder Blutgerinnungserkrankungen oder -störungen.
Die Verbindungen dieser Erfindung können als Verhütungsmittel verwendet werden, insbesondere wenn sie mit einem Progestin kombiniert werden.
Bei Verabreichung zur Behandlung oder Inhibition eines bestimmten Krankheitszustands oder einer bestimmten Störung versteht sich, dass die wirksame Dosierung in Abhängigkeit von der bestimmten verwendeten Verbindung, dem Verabreichungsmodus, dem Zustand und Schwere dieses, dem behandelten Zustand sowie den verschiedenen physischen Faktoren, die die behandelte Einzelperson betreffen, variieren kann. Eine wirksame Verabreichung der Verbindungen dieser Erfindung kann in einer oralen Dosis von etwa 0,1 mg/Tag bis etwa 1000 mg/Tag gegeben werden. Vorzugsweise wird die Verabreichung von etwa 10 mg/Tag bis etwa 600 mg/Tag, mehr bevorzugt von etwa 50 mg/Tag bis etwa 600 mg/Tag, in einer einzigen Dosis oder in zwei oder mehr fraktionierten Dosen, ausmachen. Von den geplanten täglichen Dosierungen wird erwartet, dass sie mit dem Verabreichungsweg variieren.
Derartige Dosen können auf eine beliebige Art und Weise verabreicht werden, die beim Leiten der Wirkverbindungen hierin zu dem Blutstrom des Empfängers von Nutzen sind, einschließlich oral, mittels Implantaten, parenteral (einschließlich intravenöser, intraperitonealer und subkutaner Injektionen), rektal, intranasal, vaginal und transdermal.
Orale Formulierungen, die die Wirkverbindungen dieser Erfindung enthalten, können beliebige herkömmlich verwendete orale Formen umfassen, einschließlich Tabletten, Kapseln, bukkale Formen, Pastillen, Lutschtabletten und orale Flüssigkeiten, Suspensionen oder Lösungen. Kapseln können Gemischen der Wirkverbindung bzw. Wirkverbindungen mit inerten Füllstoffen und/oder Streckungsmitteln enthalten, wie den pharmazeutisch unbedenklichen Stärken (z. B. Mais-, Kartoffel oder Tapiokastärke), Zuckern, künstlichen Süßstoffen, Cellulosepulvern, wie kristalline und mikrokristalline Cellulosen, Mehlen, Gelatinen, Gummen usw. Nützliche Tablettenformulierungen können mittels herkömmlicher Verdichtungs-, Nassgranulier- und Trockengranulierverfahren hergestellt und pharmazeutisch unbedenkliche Streckmittel, Bindemittel, Gleitmittel, Sprengmittel, Oberflächenmodifizierungsmittel (einschließlich oberflächenaktiven Stoffen), Suspensions- oder Stabilisierungsmittel eingesetzt werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talkum, Natriumlaurylsulfat, mikrokristalliner Cellulose, Calcium- Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Alginsäure, Gummi arabicum, Xanthan, Natriumcitrat, komplexer Silikate, Calciumcarbonat, Glycin, Dextrin, Saccharose, Sorbit, Dicalciumphosphat, Calciumsulfat, Laktose, Kaolin, Mannit, Natriumchlorid, Talkum, Trockenstärken und Puderzucker. Zu bevorzugten Oberflächenmodifizierungsmitteln zählen nichtionische und anionische Oberflächenmodifizierungsmittel. Repräsentative Beispiele von Oberflächenmodifizierungsmitteln beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Poloxamer 188, Benzalkoniumchlorid, Calciumstearat, Cetostearylalkohol, Cetomacrogol-Emulsionswachs, Sorbitanester, kolloidales Siliciumdioxid, Phosphate, Natriumdodecylsulfat, Magnesiumaluminiumsilikat und Triethanolamin. Orale Formulierungen hierin können Standardverzögerungs- oder -retardformulierungen einsetzen, um die Absorption der Wirkverbindung bzw. Wirkverbindungen zu modifizieren. Die orale Formulierung kann auch aus dem Verabreichen des Wirkstoffs in Wasser oder einem Fruchtsaft, das bzw. der nach Bedarf adäquate Lösungsverbesserer oder Emulgatoren enthält, bestehen.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Verbindungen in der Form eines Aerosols direkt in die Atemwege zu verabreichen.
Die Verbindungen dieser Erfindung können auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Lösungen oder Suspensionen dieser Wirkverbindungen als eine freie Base oder ein pharmakologisch unbedenkliches Salz können in Wasser hergestellt werden, in geeigneter Weise mit einem oberflächenaktiven Stoff, wie Hydroxypropylcellulose, gemischt. Dispersionen können ebenfalls in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen und Gemischen davon in Ölen hergestellt werden. Unter gewöhnlichen Lager- und Gebrauchsbedingungen enthalten diese Präparate ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Zu den zur injizierbaren Verwendung geeigneten pharmazeutischen Formen zählen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur improvisierten Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muss die Form steril sein und muss zu dem Ausmaß flüssig sein, dass eine leichte Injizierbarkeit vorliegt. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und muss vor der kontaminierenden Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze, geschützt werden. Der Trägerstoff kann ein Lösemittel oder ein Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol), geeignete Gemischen davon und Pflanzenöle beinhaltet.
Zum Zwecke dieser Offenbarung versteht man unter transdermalen Verabreichungen, dass diese alle Verabreichungen über die Oberfläche des Körpers und die inneren Deckschichten von Körperpassagen, einschließlich Epithel- und Schleimhautgeweben, beinhalten. Solche Verabreichungen können unter Verwendung der vorliegenden Verbindungen oder pharmazeutisch unbedenklicher Salze davon in Lotionen, Cremes, Schäumen, Pflastern, Suspensionen, Lösungen und Suppositorien (rektal und vaginal) durchgeführt werden.
Eine transdermale Verabreichung kann durch Verwendung eines transdermalen Pflasters, das die Wirkverbindung und einen Trägerstoff, der gegenüber der Wirkverbindung inert ist, für die Haut nicht toxisch ist und die Abgabe des Wirkstoffs zur systemischen Absorption in den Blutstrom über die Haut ermöglicht, enthält, erzielt werden. Der Trägerstoff kann eine beliebige Anzahl von Formen annehmen, wie Cremes und Salben, Pasten, Gele und Okklusionsvorrichtungen. Die Cremes und Salben können viskose flüssige oder halbfeste Emulsionen entweder der Öl-Wasser- oder Wasser-Öl-Art sein. Pasten, die sich aus Absorptionspulvern zusammensetzen, die in Mineralöl oder hydrophilem Mineralöl dispergiert sind, das den Wirkstoff enthält, können ebenfalls geeignet sein. Eine Vielfalt von Okklusionsvorrichtungen kann verwendet werden, um den Wirkstoff in den Blutstrom freizusetzen, wie eine semipermeable Membran, die einen Behälter abdeckt, der den Wirkstoff mit oder ohne einen Trägerstoff enthält, oder eine Matrix, die den Wirkstoff enthält. Andere Okklusionsvorrichtungen sind in der Literatur bekannt.
Suppositorienformulierungen können aus traditionellen Materialien, einschließlich Kakaobutter, mit oder ohne Zugabe von Wachsen, um den Schmelzpunkt des Suppositoriums zu modifizieren, und Glycerin, hergestellt werden. Wasserlösliche Suppositoriengrundlagen, wie Polyethylenglykole mit unterschiedlichen Molekulargewichten, können ebenfalls verwendet werden.
Beispiel 1a
1-(4-Benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol
Einem Gemisch von 2-Methylindol (3,28 g, 25 mmol), 4-Benzyloxyiodbenzol (7,76 g, 25 mmol), Kaliumcarbonat (2,65 g, 25 mmol) und N-Methylpyrrolidinon (250 ml) wurde Kupfer(I)-bromid (0,5 g, 3,5 mmol) zugegeben. Die gerührte Lösung wurde auf 180°C erhitzt und 18 h bei dieser Temperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, auf Eis gegossen und mit Essigsäureethylester extrahiert. Nach Waschen der organischen Schicht mit Wasser und Kochsalzlösung und Trocknen über wasserfreiem MgSO₄ wurde das Lösemittel abgezogen, um eine dunkle Flüssigkeit zu erhalten. Reinigung mittels Kieselgelchromatographie (2% Essigsäureethylester/Hexane) ergab die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (30%): Fp. 95–96°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,24 (3H, s), 5,19 (2H, s), 6,38 (1H, s), 6,93-7,04 (3H, m), 7,20 (2H, d, J = 1,9 Hz), 7,23 (2H, d, J = 3,1 Hz), 7,32-7,53 (8H, m); MS m/z (M+H)⁺ 314.
Anal. auf C₂₂H₁₉NO·0,1 H₂O:
Berechnet: C: 83,83; H: 6,14; N: 4,44.
Gefunden: C: 83,84; H: 6,18; N: 4,29.
Beispiel 1b
5-Fluor-1-(4-benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol
5-Fluor-2-methylindol (5,0 g, 33,5 mmol) und 4-Benzyloxyiodbenzol (10,40 g, 33,5 mmol) wurden gemäß dem in Beispiel 1a oben angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen weißen Feststoff (23%) zu erhalten: Fp. 94–95°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,23 (3H, s), 5,19 (2H, s), 6,39 (1H, s), 6,84-6,94 (2H, m), 7,19-7,29 (3H, m), 7,34-7,44 (5H, m), 7,51 (2H, d, J = 7,1 Hz); MS m/z (M+H)⁺ 332.
Anal. auf C₂₂H₁₈NOF:
Berechnet: C: 79,74; H: 5,47; N: 4,23.
Gefunden: C: 79,54; H: 5,54; N: 4,21.
Beispiel 1c
5-Chlor-1-(4-methoxymethyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol
5-Chlor-2-methylindol (4,14 g, 25 mmol) und 4-Methoxymethyloxyiodbenzol (6,20 g, 25 mmol) wurden gemäß dem in Beispiel 1a oben angewendeten Verfahren umgesetzt, um eine farblose Flüssigkeit (19%) zu erhalten: ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,25 (3H, s), 3,44 (2H, s), 5,28 (2H, s), 6,40 (1H, s), 6,96 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,02 (1H, dd, J = 2,0 Hz, J = 8,8 Hz), 7,22 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,36 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,55 (1H, d, J = 2,0 Hz); MS m/z (M+H)⁺ 302/304 (1 Cl).
Anal. auf C₁₇H₁₆ClNO₂:
Berechnet: C: 67,66; H: 5,34; N: 4,64.
Gefunden: C: 67,49; H: 5,17; N: 4,51.
Beispiel 1d
5-Brom-1-(4-methoxymethyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol
5-Brom-2-methylindol (5,59 g, 23,8 mmol) und 4-Methoxymethyloxyiodbenzol (7,47 g, 23,8 mmol) wurden gemäß dem in Beispiel 1a oben angewendeten Verfahren umgesetzt, um eine farblose Flüssigkeit (8,4%) zu erhalten: ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,23 (3H, s), 3,43 (2H, s), 5,26 (2H, s), 6,39 (1H, s), 6,94 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,01 (1H, dd, J = 2,2 Hz, J = 8,6 Hz), 7,20 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,34 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,53 (1H, d, J = 2,2 Hz); MS m/z (M+H)⁺ 346/348 (1 Br).
Anal. auf C₁₇H₁₆BrNO₂:
Berechnet: C: 58,98; H: 4,66; N: 4,05.
Gefunden: C: 58,72; H: 4,53; N: 4,17.
Beispiel 1e
(4E)-9-(4-Benzyloxyphenyl)-1,2,3,9-tetrahydro-4H-carbazol
Carbazol (8,70 g, 39,7 mmol) und 4-Benzyloxyiodbenzol (12,33 g, 39,7 mmol) wurden gemäß dem in Beispiel 1a oben angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen gelbbraunen Feststoff (20%) zu erhalten: Fp. 128–129°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 1,86 (4H, br s), 2,55 (2H, br s), 2,72 (2H, br s), 5,16 (2H, s), 7,00-7,03 (2H, m), 7,05-7,08 (1H, m), 7,13-7,16 (2H, m), 7,27-7,30 (2H, m), 7,33-7,36 (1H, m), 7,40-7,43 (2H, m), 7,49 (2H, d, J = 7,2 Hz); MS m/z (M+H)⁺ 354.
Anal. auf C₂₅H₂₃NO:
Berechnet: C: 84,95; H: 6,56; N: 3,96.
Gefunden: C: 84,74; H: 6,76; N: 3,91.
Beispiel 1f
1-(4-Benzyloxy-3-fluorphenyl)-2-methyl-1H-indol
Einem Gemisch von 2-Methylindol (6,23 g, 47,5 mmol), 4-Benzyloxy-3-fluorbrombenzol (14,066 g, 50 mmol), Kaliumcarbonat (5,83 g, 55 mmol) und N-Methylpyrrolidinon (500 ml) wurde Kupfer(I)-bromid (1,0 g, 7 mmol) zugegeben. Die gerührte Lösung wurde auf 180°C erhitzt und 18 h bei dieser Temperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, auf Eis gegossen und mit Essigsäureethylester extrahiert. Nach Waschen der organischen Schicht mit Wasser und Kochsalzlösung und Trocknen über wasserfreiem MgSO₄ wurde das Lösemittel abgezogen, um eine dunkle Flüssigkeit zu erhalten, die mittels Kieselgelchromatographie (2% Essigsäureethylester/Hexane) gereinigt wurde, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (3,45 g, Ausbeute 22%) bereitzustellen: Fp. 70–71°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,26 (3H, s), 5,28 (2H, s), 6,39 (1H, s), 6,99-7,05 (3H, m), 7,21-7,24 (2H, m), 7,36-7,54 (7H, m); MS m/z (M+H)⁺ 332.
Anal. auf C₂₂H₁₈NOF·0,1 H₂O:
Berechnet: C: 79,31; H: 5,51; N: 4,20.
Gefunden: C: 79,29; H: 5,39; N: 4,16.
Beispiel 2a
1-(4-Benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd
Phosphoroxychlorid (3 ml) wurde wasserfreiem Dimethylformamid (6 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Ein Gemisch von 1-(4-Benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol (0,94 g, 3 mmol) in Dimethylformamid (10 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 18 h auf 80°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Eis gegossen und mittels Zugabe von 2 N NaOH auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Das Gemisch wurde mit Essigsäureethylester (2 × 100 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Abdampfung stellte das Produkt als einen dunklen Feststoff bereit. Reinigung mittels Kieselgelchromatographie (10% EtOAc/Hexane) stellte einen weißen Feststoff (63%) bereit: Fp. 150–152°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,54 (3H, s), 5,22 (2H, s), 6,99 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,17-7,42 (4H, m), 7,45-7,54 (7H, m), 8,17 (1H, d, J = 7,5 Hz), 10,19 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 342.
Anal. auf C₂₃H₁₉NO₂:
Berechnet: C: 80,92; H: 5,61; N: 4,10.
Gefunden: C: 80,76; H: 5,70; N: 3,93.
Beispiel 2b
5-Fluor-1-(4-benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd
Phosphoroxychlorid (5 ml) wurde wasserfreiem Dimethylformamid (10 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 15 min bei Raumtemperatur rühren gelassen, wonach eine Lösung von 5-Fluor-1-(4-benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol (1,63 g, 4,9 mmol) in Dimethylformamid (10 ml) zugegeben wurde, und es wurde gemäß dem in Beispiel 2a angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen gelbbraunen Feststoff (85%) zu erhalten: Fp. 219–220°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,53 (3H, s), 5,22 (2H, s), 6,99-7,06 (2H, m), 7,27 (2H, d, J = 8,9 Hz), 7,37-7,53 (7H, m), 7,86 (1H, dd, J = 2,5 Hz, J = 9,5 Hz); MS m/z (M+H)⁺ 360.
Anal. auf C₂₃H₁₈FNO₂·0,5 H₂O:
Berechnet: C: 74,99; H: 5,20; N: 3,80.
Gefunden: C: 74,91; H: 4,96; N: 3,59.
Beispiel 2c
5-Chlor-1-(4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd
Phosphoroxychlorid (5 ml) wurde wasserfreiem Dimethylformamid (10 ml) zugegeben und es wurde 15 min bei Raumtemperatur gerührt, wonach eine Lösung von 5-Chlor-1-(4-methoxymethyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol (1,22 g, 3,5 mmol) in Dimethylformamid (10 ml) zugegeben wurde. Die Lösung wurde gemäß dem in Beispiel 2a angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen gelbbraunen Feststoff (85%) zu erhalten: Fp. > 240°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,52 (3H, s), 6,97-7,02 (3H, m), 7,22 (1H, dd, J = 2,3 Hz, J = 8,7 Hz), 7,30 (2 H, d, J = 8,6 Hz), 8,40 (1H, d, J = 2,1 Hz), 10,02 (1H, s), 10,16 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 286/288 (1 Cl).
Anal. auf C₁₆H₁₂ClNO₂·0,3 H₂O:
Berechnet: C: 66,01; H: 4,36; N: 4,81.
Gefunden: C: 65,85; H: 4,10; N: 4,74.
Beispiel 2d
5-Brom-1-(4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd
Phosphoroxychlorid (2,5 ml) wurde wasserfreiem Dimethylformamid (5 ml) zugegeben und es wurde 15 min bei Raumtemperatur gerührt, wonach eine Lösung von 5-Brom-1-(4-methoxymethyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol (0,65 g, 1,9 mmol) in Dimethylformamid (10 ml) zugegeben wurde. Die Lösung wurde gemäß dem in Beispiel 2a angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen gelbbraunen Feststoff (51%) zu erhalten: Fp. > 250°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,50 (3H, s), 6,95-7,02 (3H, m), 7,21 (1H, dd, J = 2,4 Hz, J = 8,8 Hz), 7,28 (2H, d, J = 8,7 Hz), 8,38 (1H, d, J = 2,2 Hz), 9,98 (1H, s), 10,14 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 318/320 (1 Br).
Anal. auf C₁₆H₁₂BrNO₂·0,2 H₂O:
Berechnet: C: 55,99; H: 3,88; N: 4,35.
Gefunden: C: 55,69; H: 3,95; N: 4,15.
Beispiel 2e
(4E)-9-(4-Benzyloxyphenyl)-1,2,3,9-tetrahydro-4H-carbazol-4-on
Einer gerührten Lösung von (4E)-9-(4-Benzyloxyphenyl)-1,2,3,9-tetrahydro-4H-carbazol (1,55 g, 4,4 mmol), Tetrahydrofuran (30 ml) und Wasser (20 ml) wurde DDQ (1 g, 4,4 mmol) zugegeben. Das Rühren wurde für 30 min fortgesetzt, wonach das Rohprodukt filtriert und mit Wasser gewaschen wurde. Das Produkt wurde mittels Kieselgelchromatographie (25% EtOAc/Hexane) gereinigt, um einen weißen Feststoff (57%) zu erhalten: Fp. 219–220°C; ¹H-NMR (CDCl₃): δ 2,18-2,25 (2H, m), 2,62 (2H, t, J = 5,9 Hz), 2,79 (2H, t, J = 6,1 Hz), 5,16 (2H, s), 7,11-7,51 (12H, m), 8,30 (1H, d, J = 7,9 Hz); MS m/z (M+H)⁺ 368.
Anal. auf C₂₅H₂₁NO₂·0,5 H₂O:
Berechnet: C: 79,76; H: 5,86; N: 3,72.
Gefunden: C: 79,86; H: 5,75; N: 3,53.
Beispiel 2f
1-(4-Benzyloxyphenyl)-H-indol-3-carbaldehyd
1H-Indol-3-carbaldehyd (3,63 g, 25 mmol) und 4-Benzyloxyiodbenzol (7,76 g, 25 mmol) wurden gemäß dem in Beispiel 1a angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen gelben Feststoff (12%) zu erhalten: Fp. 62–64°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 5,22 (2H, s), 7,26 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,32-7,52 (7H, m), 7,61 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,19-8,22 (1H, m), 8,54 (1H, s), 10,02 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 328.
Anal. auf C₂₂H₁₇NO₂·0,1 H₂O:
Berechnet: C: 80,27; H: 5,27; N: 4,25.
Gefunden: C: 80,15; H: 5,05; N: 3,97.
Beispiel 2g
1-(4-Benzyloxy-3-fluorphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd
Phosphoroxychlorid (3 ml) wurde wasserfreiem Dimethylformamid (6 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Ein Gemisch von 1-(4-Benzyloxy-3-fluorphenyl)-2-methyl-1H-indol (1,03 g, 3,1 mmol) in Dimethylformamid (10 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde auf 80°C erhitzt und 18 h bei dieser Temperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde auf Eis gegossen und mittels Zugabe von 2 N NaOH auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Das Gemisch wurde mit Essigsäureethylester (2 × 100 ml) extrahiert, die organische Schicht wurde mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet, um das Produkt als einen dunklen Feststoff bereitzustellen. Reinigung mittels Kieselgelchromatographie (25% EtOAc/Hexane) stellte einen weißen Feststoff (0,84 g, 76%) bereit: Fp. 166–168°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,55 (3H, s), 5,30 (2H, s), 7,04 (1H, d, J = 6,9 Hz), 7,19-7,28 (2H, m), 7,23-7,52 (7H, m), 7,44 (2H, dd, J = 6,0 Hz, J = 1,4 Hz), 7,59 (1H, dd, J = 11,7 Hz, J = 2,5), 8,17 (1H, dd, J = 7,0 Hz, J = 1,0), 10,20 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 360.
Anal. auf C₂₃H₁₈FNO₂ (0,1 H₂O):
Berechnet: C: 76,48; H: 5,08; N: 3,88.
Gefunden: C: 76,39; H: 4,81; N: 3,69.
Beispiel 3a
1-(4-Benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim
Eine Lösung von 1-(4-Benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd (0,64 g, 1,9 mmol), Hydroxylamin-hydrochlorid (0,25 g, 3,6 mmol), Methanol (25 ml) und Pyridin (1 ml) wurde 30 min zum Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde abgekühlt, das Methanol mittels Abdampfung entfernt. Das Produkt wurde in Essigsäureethylester (2 × 50 ml) extrahiert und die organische Schicht wurde mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Lösemittel wurde abgedampft und das Produkt wurde mittels Kieselgelchromatographie (25% Essigsäureethylester/Hexane) gereinigt, um einen weißen Feststoff (53%) bereitzustellen: Fp. 171–173°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,31 (3H, s), 5,20 (2H, s), 6,94-7,01 (1H, m), 7,10-7,14 (2H, m), 7,23 (2H, d, J = 8,9 Hz), 7,37-7,47 (5H, m), 7,52 (2H, d, J = 7,4 Hz), 8,01-8,03 (1H, m), 8,41 (1H, s), 10,66 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 357.
Anal. auf C₂₃H₂ON₂O₂·0,5 H₂O:
Berechnet: C: 75,60; H: 5,79; N: 7,67.
Gefunden: C: 75,12; H: 5,53; N: 7,34.
Beispiel 3b
5-Fluor-1-(4-benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim
Ein Gemisch von 5-Fluor-1-(4-benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd (0,97 g, 2,7 mmol), Hydroxylamin-hydrochlorid (0,25 g, 3,6 mmol), Methanol (25 ml) und Pyridin (1 ml) wurde gemäß dem in Beispiel 3a angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen weißen Feststoff (88%) zu erhalten: Fp. 183–185°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,30 (3H, s), 5,20 (2H, s), 6,94-6,97 (2H, m), 7,23 (2H, d, J = 8,9 Hz), 7,37-7,46 (5H, m), 7,52 (2H, d, J = 6,8 Hz), 7,71 (1H, d, J = 10,1 Hz), 8,41 (1H, s), 10,72 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 375.
Anal. auf C₂₃H₁₉FN₂O₂:
Berechnet: C: 73,78; H: 5,11; N: 7,48.
Gefunden: C: 73,55; H: 5,03; N: 7,35.
Beispiel 3e
(4E)-9-(4-Benzyloxyphenyl)-1,2,3,9-tetrahydro-4H-carbazol-4-onoxim
Ein Gemisch von (4E)-9-(4-Benzyloxyphenyl)-1,2,3,9-tetrahydro-4H-carbazol-4-on (1,00 g, 2,7 mmol), Hydroxylamin-hydrochlorid (0,56 g, 8,1 mmol), Methanol (25 ml) und Pyridin (1 ml) wurde gemäß dem in Beispiel 3a angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen weißen Feststoff (51%) zu erhalten: Fp. 241–243°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 1,83-1,92 (2H, m), 2,65 (2H, t, J = 5,9 Hz), 2,72 (2H, t, J = 6,0 Hz), 5,20 (2H, s), 7,09-7,14 (3H, m), 7,22 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,36-7,46 (5H, m), 7,51 (2H, d, J = 6,9 Hz), 8,00-8,02 (1H, m), 10,46 (1H, s); MS m/z (M+H)^– 379.
Anal. auf C₂₅H₂₄N₂O₂:
Berechnet: C: 78,51; H: 5,80; N: 7,32.
Gefunden: C: 78,24; H: 5,52; N: 7,26.
Beispiel 3f
1-(4-Benzyloxyphenyl)-H-indol-3-carbaldehydoxim
Ein Gemisch von 1-(4-Benzyloxyphenyl)-H-indol-3-carbaldehyd (0,50 g, 1,5 mmol), Hydroxylamin-hydrochlorid (0,25 g, 3,6 mmol), Methanol (25 ml) und Pyridin (1 ml) wurde gemäß dem in. Beispiel 3a angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen gelben Feststoff (61%) zu erhalten: Fp. 152–154°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 5,20 (2H, s), 7,19-7,53 (12H, m), 7,86 (1H, s), 8,10 (1H, d, J = 7,5 Hz), 10,75 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 383.
Anal. auf C₂₂H₁₈N₂O₂:
Berechnet: C: 77,17; H: 5,30; N: 8,18.
Gefunden: C: 77,49; H: 5,44; N: 7,85.
Beispiel 3g
1-(4-Benzyloxy-3-fluorphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim
Einer gerührten Lösung von 1-(4-Benzyloxy-3-fluorphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd (0,81 g, 2,3 mmol), Hydroxylamin-hydrochlorid (0,25 g, 3,6 mmol) und Methanol (25 ml) wurde Pyridin (1 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zum Rückfluss erhitzt und 30 min bei der Rückflusstemperatur gehalten. Das Gemisch wurde abgekühlt, das Methanol mittels Abdampfung entfernt und der Rückstand wurde in Essigsäureethylester/Wasser aufgenommen. Das Produkt wurde in Essigsäureethylester (2 × 50 ml) extrahiert, der Essigsäureethylester wurde mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und es wurde über MgSO₄ getrocknet. Das Lösemittel wurde abgedampft und das Rohprodukt wurde mittels Kieselgelchromatographie (25% Essigsäureethylester/Hexane) gereinigt, um einen weißen Feststoff (0,7 g, 83%) bereitzustellen: Fp. 167–168°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,32 (3H, s), 5,29 (2H, s), 6,99-7,01 (1H, m), 7,10-7,17 (2H, m), 7,25-7,28 (1H, m), 7,37-7,42 (1H, m), 7,43-7,49 (3H, m), 7,49-7,54 (2H, m), 8,01-8,04 (1H, m), 8,41 (1H, s), 10,67 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 375.
Anal. auf C₂₃H₁₉FN₂O₂:
Berechnet: C: 73,78; H: 5,11; N: 7,48.
Gefunden: C: 73,53; H: 5,06; N: 7,32.
Beispiel 4
1-(4-Hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim
Einer gerührten Lösung von Dichlormethan (20 ml), Pd(OAc)₂ (50 mg, 0,2 mmol) und Triethylsilan (2 ml) wurde Triethylamin (1 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Dem Gemisch wurde 1-(4-Benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim (0,36 g, 1 mmol) in Dichlormethan (10 ml) zugegeben und es wurde 90 min gerührt. Essigsäureethylester (25 ml) und Ammoniumchlorid (25 ml einer 10%-igen Lösung) wurden zugegeben und das Produkt wurde in Essigsäureethylester (2 × 25 ml) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden mit Wasser (3 × 25 ml) und Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösemittels wurde eine Flüssigkeit erhalten, die in wasserfreiem Tetrahydrofuran (10 ml) gelöst wurde. Diesem Gemisch wurde Tetrabutylammoniumfluorid (3 ml) zugegeben. Nach 30 min Rühren wurde das Gemisch mit Essigsäureethylester und Wasser extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Abdampfen des Lösemittels ergab den rohen Feststoff, der mittels Kieselgelchromatographie (25% Essigsäureethylester/Hexane) gereinigt wurde, um einen hellgelben Feststoff (83%) zu ergeben: Fp. 171–173°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,29 (3H, s), 6,95 (4H, d, J = 7,7 Hz), 7,09-7,13 (2H, m), 7,22 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,37-7,42 (1H, m), 7,98-8,01 (1H, m), 8,40 (1H, s), 9,89 (1H, s), 10,63 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 267.
Anal. auf C₁₆H₁₄N₂O₂:
Berechnet: C: 72,17; H: 5,30; N: 10,52.
Gefunden: C: 71,78; H: 5,23; N: 10,37.
Beispiel 5
5-Fluor-1-(4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim
5-Fluor-1-(4-benzyloxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim (0,49 g, 1,3 mmol) wurde gemäß dem in Beispiel 4 angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen weißen Feststoff (67%) zu erhalten: Fp. 162–163°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,29 (3H, s), 6,94-6,97 (4H, m), 7,23 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,70 (2H, d, J = 10,1 Hz), 8,39 (1H, s), 9,92 (1H, s), 10,70 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 285.
Anal. auf C₁₆H₁₄N₂O₂:
Berechnet: C: 67,60; H: 4,61; N: 9,85.
Gefunden: C: 67,44; H: 4,67; N: 9,79.
Beispiel 6
5-Chlor-1-(4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim
Ein Gemisch von 5-Chlor-1-(4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd (0,63 g, 2,2 mmol), Hydroxylamin-hydrochlorid (0,30 g, 4,3 mmol), Methanol (25 ml) und Pyridin (1 ml) wurde gemäß dem in Beispiel 4 angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen weißen Feststoff (68%) zu erhalten: Fp. 212–213°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,29 (3H, s), 6,96 (3H, d, J = 8,7 Hz), 7,12 (1H, dd, J = 2,2, J = 8,7 Hz), 7,24 (2H, d, J = 8,7 Hz), 8,03 (1H, d, J = 2,1 Hz), 8,40 (1H, s), 9,93 (1H, s), 10,75 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 301/303 (1 Cl).
Anal. auf C₁₆H₁₃ClN₂O₂:
Berechnet: C: 63,90; H: 4,36; N: 9,31.
Gefunden: C: 63,63; H: 4,12; N: 9,17.
Beispiel 7
5-Brom-1-(4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim
Ein Gemisch von 5-Brom-1-(4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd (0,16 g, 0,5 mmol), Hydroxylamin-hydrochlorid (0,10 g, 1,4 mmol), Methanol (10 ml) und Pyridin (0,2 ml) wurde gemäß dem in Beispiel 4 angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen weißen Feststoff (66%) zu erhalten: Fp. 209–211°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,29 (3H, s), 6,92-6,97 (3H, m), 7,20-7,25 (3H, m), 8,19 (1H, d, J = 1,9 Hz), 8,39 (1H, s), 9,94 (1H, br s), 10,76 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 345/347 (1 Br).
Anal. auf C₁₆H₁₃BrN₂O₂·0,5 H₂O:
Berechnet: C: 54,26; H: 3,98; N: 7,91.
Gefunden: C: 54,26; H: 3,68; N: 7,65.
Beispiel 8
(4E)-9-(4-Hydroxyphenyl)-1,2,3,9-tetrahydro-4H-carbazol-4-onoxim
(4E)-9-(4-Benzyloxyphenyl)-1,2,3,9-tetrahydro-4H-carbazol-4-onoxim (0,23 g, 0,6 mmol) wurde gemäß dem in Beispiel 4 angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen gelbbraunen Feststoff (40%) zu erhalten: Fp. 227–229°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 1,87-1,91 (2H, m), 2,63 (2H, t, J = 5,9 Hz), 2,71 (2H, t, J = 6,1 Hz), 6,95 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,09-7,13 (3H, m), 7,26 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,98-8,00 (1H, m), 9,85 (1H, s), 10,43 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 293.
Anal. auf C₁₈H₁₆N₂O₂:
Berechnet: C: 73,95; H: 5,52; N: 9,58.
Gefunden: C: 73,61; H: 5,39; N: 9,42.
Beispiel 9
1-(4-Hydroxyphenyl)-1H-indol-3-carbaldehydoxim
1-(4-Benzyloxyphenyl)-H-indol-3-carbaldehydoxim (0,31 g, 0,9 mmol) wurde gemäß dem in Beispiel 4 angewendeten Verfahren umgesetzt, um einen gelben Feststoff (18%) zu erhalten: Fp. 95–97°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 6,94-6,98 (2H, m), 7,19-7,29 (2H, m), 7,36-7,45 (4H, m), 8,31 (1H, s), 9,80-9,83 (1H, m), 10,72 (1H, s), 11,44 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 253.
Anal. auf C₁₅H₁₂N₂O₂:
Berechnet: C: 71,42; H: 4,79; N: 11,10.
Gefunden: C: 71,85; H: 5,36; N: 9,70.
Beispiel 10
1-(3-Fluor-4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim
Einer gerührten Lösung von Dichlormethan (10 ml), Pd(OAc)₂ (50 mg, 0,2 mmol) und Triethylsilan (3 ml) wurde Triethylamin (1,5 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 15 min bei Umgebungstemperatur gerührt. Dem Gemisch wurde 1-(4-Benzyloxy-3-fluorphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim (0,52 g, 1,4 mmol) in Dichlormethan (15 ml) zugegeben und das Rühren wurde für 4 h fortgesetzt. Essigsäureethylester (25 ml) und Ammoniumchlorid (25 ml einer 10%-igen Lösung) wurden zugegeben und das Produkt wurde in Essigsäureethylester (2 × 25 ml) extrahiert. Die vereinten organischen Stoffe wurden mit Wasser (3 × 25 ml) und Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösemittels wurde eine Flüssigkeit erhalten, die in wasserfreiem Tetrahydrofuran (10 ml) gelöst wurde. Diesem gerührten Gemisch wurde Tetrabutylammoniumfluorid (3 ml) zugegeben. Nach 30 min Rühren wurde das Gemisch in Essigsäureethylester/Wasser aufgenommen und die Schichten wurden getrennt. Der organische Teil wurde mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Abdampfen des Lösemittels wurde der rohe Feststoff mittels Kieselgelchromatographie (25% Essigsäureethylester/Hexane) gereinigt, um einen hellgelben Feststoff (0,22 g, 56%) zu ergeben: Fp. 182–184°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,31 (3H, s), 6,98-7,01 (1H, m), 7,07-7,17 (4H, m), 7,35 (1H, dd, J = 11,7 Hz, J = 2,4 Hz), 7,99-8,03 (1H, m), 8,40 (1H, s), 10,35 (1H, br s), 10,64 (1H, s); MS m/z (M+H)⁺ 285.
Anal. auf C₁₆H₁₃FN₂O₂ (0,3 H₂O):
Berechnet: C: 66,34; H: 4,57; N: 9,30.
Gefunden: C: 66,38; H: 4,61; N: 9,85.
Beispiel 11
Selektivität für ERα- oder ERβ-Rezeptoren
Repräsentative Beispiele der Erfindung wurden auf ihre Fähigkeit bewertet, mit 17β-Östradiol um sowohl ERα als auch ERβ zu konkurrieren. Dieses Testverfahren stellt die Methodik zum Bestimmen bereit, ob eine bestimmte Verbindung an den Östrogenrezeptor bindet (und somit „östrogen" ist) und ob Selektivität für ERα oder ERβ vorliegt. Die Werte sind in der Tabelle unten gezeigt und sind als IC₅₀-Werte dargestellt. 17β-Östradiol ist als eine Standardreferenz zum Vergleich einbezogen. Das angewendete Verfahren ist im Folgenden kurz beschrieben. Ein rohes Lysat von E. coli, das die Östrogenrezeptor-Ligandenbindungsdomänen (D, E & F) von menschlichem ERα oder ERβ exprimiert, wurde hergestellt. Beide Rezeptoren und Verbindungen wurden in 1X Dulbeccos PBS (DPBS), das mit 1 mM EDTA supplementiert war, verdünnt. Unter Verwendung einer maskierten Mikrotiterplatte mit hoher Bindung wurden 100 μl Rezeptor (1 μg/Well) mit 2 nM [³H]-17β-Östradiol und verschiedenen Konzentrationen der Verbindung vereint. Nach 5 bis 15 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Platten mit DPBS/1 mM EDTA gewaschen und gebundene Radioaktivität wurde mittels Flüssigkeitsszintillationsmessung ermittelt. Der IC₅₀ ist als die Konzentration der Verbindung definiert, die die Gesamtbindung von 17β-Östradiol um 50% verringert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle unten beschrieben. Tabelle 1. 1-(4'-Hydroxyphenyl)-1H-indol-3-carbaldehydoxim-Derivate

Bsp. R1 R2 R3 R4 ERβ (nM) ERα (nM)

4 Me H H H 12 270

5 Me H F H 6,2 91

6 Me H Cl H 29 145

7 Me H Br H 93,5 235

8 -CH₂CH₂CH₂- H H 10 153

9 H H H H 202 1905

10 Me H H F 8 298
Die in dem pharmakologischen Standardtestverfahren erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Verbindungen dieser Erfindung östrogene Verbindungen sind, einige mit einer starken bevorzugten Affinität für den ERβ-Rezeptor. Die Verbindungen dieser Erfindung reichen von mit einer hohen bevorzugten Affinität für ERβ gegenüber ERα bis zu einer nahezu gleichen Affinität für beide Rezeptoren. Somit werden Verbindungen dieser Erfindung einen Aktivitätsbereich umfassen, zumindest zum Teil auf deren Rezeptoraffinitätsselektivitätsprofilen basierend. Darüber hinaus, da jeder neuartige Rezeptor-Ligand- Komplex einzigartig ist und somit seine Interaktion mit verschiedenen Koregulatorproteinen einzigartig ist, werden Verbindungen dieser Erfindung unterschiedliche Modulationsverhalten zeigen, die von dem Zellkontext, in dem sie sich befinden, abhängen. Zum Beispiel ist es in einigen Zelltypen für eine Verbindung möglich, sich als ein Östrogenagonist, in anderen Geweben dagegen als Antagonist zu verhalten. Verbindungen mit einer solchen Aktivität wurden manchmal als SERM (Selective Estrogen Receptor Modulators, selektive Östrogenrezeptormodulatoren) bezeichnet. Im Gegensatz zu vielen Östrogenen bewirken viele der SERM jedoch keine Anstiege des Uterusnassgewichts. Diese Verbindungen sind im Uterus antiöstrogen und können die trophischen Wirkungen von Östrogenagonisten in Uterusgewebe vollständig antagonisieren. Diese Verbindungen fungieren im Knochen, Herz-Kreislauf-System und Zentralnervensystem jedoch als Östrogenagonisten. Aufgrund der gewebeselektiven Beschaffenheit dieser Verbindungen sind sie beim Behandeln oder Verhindern von Krankheitszuständen oder Syndromen, die von einem Östrogenmangel (in bestimmten Geweben, wie der Knochen oder des Herz-Kreislauf-Systems) oder einem Östrogenüberschuss (im Uterus oder den Brustdrüsen) verursacht oder mit einem solchen assoziiert werden, in einem Säuger von Nutzen.
Sogar über eine solche zellspezifische Modulation hinaus weisen Verbindungen dieser Erfindung das Potential auf, sich an einem Rezeptortyp als Agonisten zu verhalten, während sie sich an dem anderen als Antagonisten verhalten. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Verbindungen an ERβ ein Antagonist sein können, während sie an ERα ein Agonist sind (Marvin J. Meyers; Jun Sun; Kathryn E. Carlson; Benita S. Katzenellenbogen; John A. Katzenellenbogen. J. Med. Chem. (1999), 42(13), 2456–2468). Eine solche ERSAH-Aktivität (ERSAA = Estrogen Receptor Selective Agonist Antagonist, östrogenrezeptorselektiver Agonist/Antagonist) stellt eine pharmakologisch ausgeprägt östrogene Aktivität in dieser Reihe von Verbindungen bereit.
Pharmakologische Standardtestverfahren sind leicht erhältlich, um das Aktivitätsprofil einer gegebenen Testverbindung zu bestimmen. Das Folgende fasst mehrere repräsentative Testverfahren kurz zusammen. Pharmakologische Standardtestverfahren für SERM sind auch in den US-Patentschriften 4,418,068 und 5,998,402 bereitgestellt.
Beispiel 12
Uterotrophie/Antiuterotrophie-Testverfahren an Ratten
Die östrogenen und antiöstrogenen Eigenschaften der Verbindungen können in einem Uterotrophie-Assay an nicht geschlechtsreifen Ratten (4 Tage) bestimmt werden (wie zuvor von L. J. Black und R. L. Goode, Life Sciences, 26, 1453 (1980), beschrieben). Nicht geschlechtsreife Sprague-Dawley-Ratten (weibliche Tiere, 18 Tage alt) wurden in Gruppen von sechs getestet. Die Tiere werden mit einer täglichen intraperitonealen Injektion mit 10 μg Verbindung, 100 μg Verbindung, (100 μg Verbindung + 1 μg 17β-Östradiol), um auf antiöstrogene Wirkung zu prüfen, und 1 μg 17β-Östradiol behandelt, mit 50% DMSO/50% Kochsalzlösung als Injektionsvehikel. An Tag 4 werden die Tiere mittels CO₂-Erstickung getötet und ihre Uteri entfernt und diesen überschüssiges Lipid entzogen, jegliche Flüssigkeit entfernt und ihr Nassgewicht bestimmt. Ein kleiner Abschnitt des Gebärmutterzipfels wird zur Histologie vorgelegt und der Rest zum Isolieren der Gesamt-RNA verwendet, um die Genexpression der Komplement-Komponente 3 auszuwerten.
Beispiel 13
6-wöchiges Testverfahren an ovariektomierten Ratten – Schutz von Knochen und Herz-Kreislauf-System
Weibliche Sprague-Dawley-CD-Ratten, ovariektomiert (ovx) oder scheinovariektomiert (sham ovx), werden 1 Tag nach dem chirurgischen Eingriff von der Taconic Farm (Gewichtsbereich 240–275 g) bezogen. Sie werden zu 3 oder 4 Ratten/Käfig in einem Raum mit einem 12/12-Zeitplan (hell/dunkel) untergebracht und mit Nahrung (Purina-5K96C-Rattenfutter) und Wasser ad libitum versorgt. Die Behandlung für alle Studien beginnt 1 Tag nach dem Eintreffen der Tiere und ihnen wurde 7 Tage in der Woche eine Dosis, wie angegeben, für 6 Wochen gegeben. Eine Gruppe von altersgleichen zum Schein operierten Ratten, die keinerlei Behandlung erhielten, dient für jede Studie als eine intakte, mit Östrogen übersättigte Kontrollgruppe.
Alle Behandlungen werden in 1% Tween 80 in normaler Kochsalzlösung in definierten Konzentrationen zubereitet, so dass das Behandlungsvolumen 0,1 ml/100 g Körpergewicht ist. 17β-Östradiol wird in Maisöl (20 μg/ml) gelöst und subkutan gegeben, 0,1 ml/Ratte. Alle Dosierungen werden in Drei-Wochenintervallen entsprechend der durchschnittlichen Körpergewichtsmessungen der jeweiligen Gruppe angepasst.
Fünf Wochen nach Beginn der Behandlung und eine Woche vor der Beendigung der Studie wird jede Ratte auf Knochenmineraldichte (bone mineral density, BMD) bewertet. Die Gesamtdichte und Trabekeldichte der proximalen Tibia werden in anästhesierten Ratten unter Verwendung von XCT-960M (pQCT; Stratec Medizintechnik, Pforzheim, Deutschland) ausgewertet. Die Messungen werden wie folgt durchgeführt: Fünfzehn Minuten vor dem Scan wird jede Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von 45 mg/kg Ketamin, 8,5 mg/kg Xylazin und 1,5 mg/kg Acepromazin anästhesiert.
Die rechte Hinterextremität wird durch ein Polycarbonatrohr mit einem Durchmesser von 25 mm geschoben und mit dem Knöchelgelenk in einem Winkel von 90° und dem Kniegelenk mit 180° an einem Acrylrahmen festgeklebt. Das Polycarbonatrohr wird an einer gleitenden Plattform angebracht, die es senkrecht zu der Öffnung des pQCT hält. Die Plattform wird derart angepasst, dass sich das distale Ende des Femurs und das proximale Ende der Tibia in dem Scanbereich befinden würden. Eine zweidimensionale Scout-Ansicht wird über eine Länge von 10 mm und mit einer Zeilenauflösung von 0,2 mm laufen gelassen. Wenn die Scout-Ansicht auf dem Monitor angezeigt wird, wird das proximale Ende der Tibia lokalisiert. Der pQCT-Scan wird 3, 4 mm distal von diesem Punkt initiiert. Der pQCT-Scan ist 1 mm dick, hat eine Voxelgröße (Voxel = dreidimensionale Pixel) von 0,140 mm und besteht aus 145 Projektionen durch den Schnitt.
Nachdem der pQCT-Scan abgeschlossen wurde, wird das Bild auf dem Monitor angezeigt. Ein Bereich von Interesse, einschließlich der Tibia, jedoch ausschließlich der Fibula, wird umrissen. Die Weichteile werden unter Verwendung eines iterativen Algorithmus automatisch entfernt. Die Dichte des verbleibenden Knochens (Gesamtdichte) wird in mg/cm³ angegeben. Die äußeren 55% des Knochens werden in einer konzentrischen Spirale abgelöst. Die Dichte des verbleibenden Knochens (Trabekeldichte) wird in mg/cm³ angegeben. Eine Woche nach der BMD-Auswertung werden die Ratten mittels Kohlendioxiderstickung eingeschläfert und Blut wurde zur Cholesterinbestimmung abgenommen. Die Uteri werden entfernt und die Gewichte genommen. Das Gesamtcholesterin wird unter Verwendung eines klinischen Boehringer-Mannheim Hitachi 911-Analysegeräts mit dem Cholesterin/HP-Kit bestimmt. Die Statistiken wurden unter Anwendung einer Einweg-Varianzanalyse mit dem Dunnett-Test verglichen.
Beispiel 14
MCF-7/ERE-Antiproliferationstestverfahren
Stammlösungen der Testverbindungen (in der Regel 0,1 M) werden in DMSO präpariert und dann 10- bis 100-fach mit DMSO verdünnt, um Arbeitslösungen von 1 oder 10 mM herzustellen. Die DMSO-Stammlösungen werden bei entweder 4°C (0,1 M) oder –20°C (< 0,1 M) gelagert. MCF-7-Zellen werden zweimal wöchentlich auf ein Wachstumsmedium [D-MEM/F-12-Medium, das 10 Vol.-% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum, 1 Vol.-% Penicillin-Streptomycin und 2 mM glutaMax-1 enthält] übertragen. Die Zellen werden in Vakuumkolben bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO₂/95% befeuchteter Luft gehalten. Einen Tag vor der Behandlung werden die Zellen mit Wachstumsmedium in 96- Well-Platten zu 25.000/Well plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die Zellen werden 2 h bei 37°C mit 50 μl/Well einer 1:10-Verdünnung von Adenovirus-5-ERE-tk-Luciferase in Versuchsmedium [phenolrotfreies D-MEM/F-12-Medium, das 10 Vol.-% hitzeinaktiviertes, über Aktivkohle abgezogenes fötales Rinderserum, 1 Vol.-% Penicillin-Streptomycin, 2 mM glutaMax-1, 1 mM Natriumpyruvat enthält] infiziert. Die Wells werden dann einmal mit 150 μl Versuchsmedium gewaschen. Schließlich werden die Zellen 24 h bei 37°C in Replikaten von 8 Wells/Behandlung mit 150 μl/Well Vehikel (< 0,1 Vol.-% DMSO) oder Verbindung, die ≥ 1000-fach in Versuchsmedium verdünnt wird, behandelt.
Ein erstes Screening der Testverbindungen wird in einer einzigen Dosis von 1 μM vorgenommen, die für sich (Agonistmodus) oder in Kombination mit 0,1 nM 17β-Östradiol (EC₈₀; Antagonistmodus) getestet wird. Jede 96-Well-Platte enthält außerdem eine Vehikelkontrollgruppe (0,1 Vol.-% DMSO) und eine Agonistenkontrollgruppe (entweder 0,1 oder 1 nM 17β-Östradiol). Dosis-Wirkungsversuche werden in entweder dem Agonisten- und/oder dem Antagonistenmodus an Wirkverbindungen in log-Anstiegen von 10^–14 bis 10^–5 M durchgeführt. Aus diesen Dosis-Wirkungskurven werden EC₅₀- bzw. IC₅₀-Werte erstellt. Das letzte Well in jeder Behandlungsgruppe enthält 5 μl 3 × 10^–5 M ICI-182,780 (Endkonzentration: 10^–6 M) als ER-Antagonistenkontrolle.
Nach der Behandlung werden die Zellen auf einer Schüttelvorrichtung 15 min mit 25 μl/Well 1X Zellkulturlysereagens (Promega Corporation) lysiert. Die Zelllysate (20 μl) werden in eine 96-Well-Luminometerplatte überführt und die Luciferaseaktivität wird in einem MicroLumat LB 96 P-Luminometer (EG & G Berthold) unter Verwendung von 100 μl/Well Luciferasesubstrat (Promega Corporation) gemessen. Vor der Injektion des Substrats wird für jedes Well eine 1-Sekunden-Hintergrundmessung durchgeführt. Nach der Injektion des Substrats wird die Luciferaseaktivität für 10 Sekunden nach einer Verzögerung von 1 Sekunde gemessen. Die Daten werden von dem Luminometer auf einen Macintosh-Personalcomputer übertragen und unter Verwendung der JMP-Software (SAS Institute) analysiert; dieses Programm subtrahiert für jeden Well den Hintergrundmesswert von dem Luciferase-Messwert und ermittelt dann die mittlere und Standardabweichung von jeder Behandlung.
Die Luciferase-Daten werden mittels Logarithmen transformiert und der Huber M-Estimator wird zur Heruntergewichtung der zugrunde liegenden transformierten Beobachtungen verwendet. Die JMP-Software wird zum Analysieren der transformierten und gewichteten Daten für eine Einweg-ANOVA (Dunnett-Test) verwendet. Die Behandlungen mit Verbindungen werden mit den Vehikelkontrollergebnissen im Agonistenmodus oder den positiven Agonistenkontrollergebnissen (0,1 nM 17β-Östradiol) im Antagonistenmodus verglichen. Für den anfänglichen Versuch mit einer einzigen Dosis, wenn die Verbindungsbehandlungsergebnisse sich von der entsprechenden Kontrolle erheblich unterscheiden (p < 0,05), werden die Ergebnisse als der Prozentanteil in Bezug auf die 17β-Östradiol-Kontrolle angegeben [d. h. ((Verbindung – Vehikelkontrolle)/(17β-Östradiol-Kontrolle – Vehikelkontrolle)) × 100]. Die JMP-Software wird außerdem zum Bestimmen der EC₅₀- und/der IC₅₀-Werte aus den nichtlinearen Dosis-Wirkungskurven verwendet.
Beispiel 15
Inhibition von LDL-Oxidation – Antioxidansaktivität
Aorten von Schweinen wurden von einem Schlachthof bezogen, gewaschen, in gekühlter PBS transportiert und den Aorten wurden Endothelzellen entnommen. Um die Zellen zu entnehmen, werden die Interkostalblutgefäße der Aorta abgebunden und ein Ende der Aorta wurde abgeklemmt. Frische, sterilfiltrierte 0,2%-ige Kollagenase (Sigma Typ I) wird in das Gefäß gegeben und das andere Ende des Gefäßes wurde dann abgeklemmt, um ein geschlossenes System zu bilden. Die Aorta wird 15–20 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach die Kollagenaselösung gesammelt und 5 Minuten bei 2000 × g zentrifugiert wird. Jedes Pellet wird in 7 ml Endothelzellkulturmedium, das aus phenolrotfreiem D-MEM/Ham-F-12-Medium besteht, das mit über Aktivkohle abgezogenem FBS (5%), NuSerum (5%), L-Glutamin (4 mM), Penicillin-Streptomycin (1000 E/ml, 100 μg/ml) und Gentimicin (75 μg/ml) supplementiert ist, suspendiert, in einer 100-mm-Petrischale gesät und bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Nach 20 Minuten werden die Zellen mit PBS gespült und frisches Medium wird zugegeben, dies wurde wiederum nach 24 Stunden wiederholt. Die Zellen sind nach ungefähr 1 Woche konfluent. Die Endothelzellen werden routinemäßig zweimal wöchentlich gefüttert und, wenn sie konfluent sind, trypsinisiert und in einem Verhältnis von 1:7 gesät. Zellvermittelte Oxidation von 12,5 μg/ml LDL wird in Gegenwart der zu prüfenden Verbindung (5 μM) 4 Stunden bei 37°C weiterlaufen gelassen. Die Ergebnisse werden als die prozentuale Inhibition des Oxidationsprozesses gemäß Messung mittels des TBARS-Verfahrens (TBARS = thiobarbituric acid reactive substances, auf Thiobarbitursäure reagierende Substanzen) zur Analyse von freien Aldehyden (K. Yagi, Biochem. Med. 15: 212–216 (1976)) ausgedrückt.
Beispiel 16
D12-Hypothalamuszellentestverfahren
D12-Hypothalamuszellen von Ratten werden aus der RC17-Mutterzelllinie subkloniert und gefroren gelagert. Sie werden routinemäßig in DMEM:F12 (1:1), glutaMAX-1 (2 mM), Penicillin (100 E/ml)-Streptomycin (100 mg/ml) plus 10% fötales Rinderserum (fetal bovine serum, FBS) gewachsen. Die Zellen werden in phenolrotfreiem Medium (DMEM:F12, glutaMAX, Penicillin-Streptomycin), das 2–10% über Aktivkohle abgezogenes FBS enthält, in einer subkonfluenten Dichte (1–4 × 10⁶ Zellen/150-mm-Schale) plattiert. Die Zellen werden 24 h später wieder mit Medium gefüttert, das 2% abgezogenes Serum enthält. Um auf Agonistenaktivität zu testen, werden die Zellen mit 10 nM 17β-Östradiol oder verschiedenen Dosen der Testverbindung (1 mM oder ein Bereich von 1 pM bis 1 mM) behandelt. Um auf Antagonistenaktivität zu testen, werden die Zellen mit 0,1 nM 17β-Östradiol in Abwesenheit oder Gegenwart variierender Dosen (100 pM bis 1 mM) der Testverbindung behandelt. Kontrollschalen werden ebenfalls mit DMSO als Negativkontrolle behandelt. Achtundvierzig Stunden nach der Hormonzugabe werden die Zellen lysiert und ein Bindungstestverfahren durchgeführt.
Für jedes Bindungstestverfahren werden 100–150 mg Protein mit 10 nM ³H-R5020 + 100-fachem Überschuss von R5020 in einem 150-ml-Volumen inkubiert. Dreifach ausgeführte Reaktionsgemische (drei mit R5020, drei ohne R5020) werden in einer 96-Well-Platte präpariert. Der Proteinextrakt wird zuerst zugegeben, worauf ³H-R5020 oder ³H-R5020 + 100-fach unmarkiertes R5020 folgt. Die Reaktion wird 1–2 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktion wird mittels Zugabe von 100 ml kalter 5% Aktivkohle (Norit SX-4), 0,5% Dextran 69 K (Pharmacia) in TE, pH 7,4, angehalten. Nach 5 min bei Raumtemperatur werden die gebundenen und ungebundenen Liganden mittels Zentrifugation (5 min, 1000 RZK, 4°C) getrennt. Die Überstandslösung (~150 ml) wird abgezogen und in eine Szintillationsampulle überführt. Nach Zugabe der Szintillationsflüssigkeit (Beckman Ready Protein+) werden die Proben 1 min lang in einem Szintillationszähler gezählt.
Beispiel 17
Progesteronrezeptor in der Area praeoptica des ZNS
Sechzig (60) Tage alte weibliche Sprague-Dawley-Ratten werden ovariektomiert. Die Tiere werden in einer Tierpflegeeinrichtung mit einer Lichtperiode mit 12 h hellen, 12 h dunklen Bedingungen und freiem Zugang zu Leitungswasser und Nagetierfutter untergebracht.
Ovariektomierte Tiere werden willkürlich in Gruppen aufgeteilt, die mit Vehikel (50% DMSO, 40% PBS, 10% Ethanol-Vehikel), 17β-Östradiol (200 ng/kg) oder der zu testenden Verbindung injiziert. Weitere Tiere werden 1 h vor der Injektion von 17β-Östradiol mit der Testverbindung injiziert, um die antagonistischen Eigenschaften dieser Verbindung auszuwerten. Sechs Stunden nach der subkutanen Injektion werden die Tiere mit einer letalen Dosis von CO₂ eingeschläfert und ihre Gehirne wurden gesammelt und gefroren.
Gewebe, das von den Tieren gesammelt wurde, wird auf einem Kryostat bei –16°C geschnitten und auf mit Silan beschichteten Objektträgern gesammelt. Die Objektträger, auf denen die Schnitte aufgebracht wurden, werden dann auf einem Objektträgerwärmgerät, das bei 42°C gehalten wird, getrocknet und in getrockneten Objektträgerboxen bei –80°C gelagert. Vor der Verarbeitung werden die getrockneten Objektträgerboxen langsam auf Raumtemperatur (für 12–16 h –20°C; für 2 h 4°C; für 1 h Raumtemperatur) erwärmt, um die Bildung von Kondensation auf den Objektträgern auszuschließen und somit den Gewebe- und RNA-Abbau zu minimieren. Die trockenen Objektträger werden in Metallgestelle gegeben, 5 min in 4%-igem Paraformaldehyd (pH 9,0) postfixiert und wie zuvor beschrieben verarbeitet.
Ein Plasmid, das ein 815-bp-Fragment der Ratten-PR-cDNA 9 (Ligandenbindungsdomäne) enthält, wird linearisiert und zum Erzeugen einer S-35-UTP-markierten Sonde verwendet, die zu einem Abschnitt der Ratten-PR-mRNA komplementär ist. Verarbeitete Objektträger, auf denen die Schnitte aufgebracht wurden, werden mit 20 ml eines Hybridisierungsgemisches, das die Ribosonde (4–6 × 10⁶ DPM/Objektträger) und 50% Formamid enthält, hybridisiert und über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 55°C inkubiert. Am Morgen werden die Objektträger in Metallgestelle gegeben, die in 2 × SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat; pH 7,0)/10 mM DTT eingetaucht werden. Die Gestelle werden alle in einen großen Behälter überführt und 15 min bei RT unter leichtem Rühren in 2 × SSC/10 mM DTT gewaschen. Die Objektträger werden dann 30 min in RNase-Puffer bei 37°C gewaschen, 30 min bei 37°C mit RNase A (2 mg/ml) behandelt und 15 min in 1 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen. Anschließend werden die Objektträger bei 65°C in 0,1 × SSC gewaschen (2 × 30 min), um unspezifischen Marker zu entfernen, 15 min in 0,1 × SSC bei Raumtemperatur gespült und mit einer klassierten Alkoholreihe dehydriert: Ammoniumacetat (70%, 95% und 100%). Die an der Luft getrockneten Objektträger werden 3 Tage Röntgenfilm ausgesetzt und dann photographisch verarbeitet. Die Objektträger von allen Tieren werden zusammen hybridisiert, gewaschen, belichtet und photographisch verarbeitet, um Unterschiede aufgrund von einer Variation der Bedingungen zwischen den Assays auszuschließen.
Beispiel 18
Hitzewallungen von Ratten – Auswirkungen auf das ZNS
Ovariektomierte weibliche, 60 Tage alte Sprague-Dawley-Ratten werden nach dem chirurgischen Eingriff bezogen. Die chirurgischen Eingriffe werden mindestens 8 Tage vor der ersten Behandlung vorgenommen. Die Tiere werden einzeln unter einem 12-h-Hell/Dunkel-Zyklus untergebracht und ihnen wurde Standardrattenfutter und Wasser ad libitum gegeben.
Zwei Kontrollgruppen werden in jede Studie einbezogen. Dosen werden auf Basis von mg/kg mittleres Körpergewicht der Gruppe in entweder 10% DMSO in Sesamöl (sc-Studien) oder in 1,0% Tween 80 in Kochsalzlösung (po-Studien) hergestellt. Den Tieren werden Testverbindungen in Dosen im Bereich von 0,01 bis 10 mg/kg mittleres Körpergewicht der Gruppe verabreicht. Vehikel- und EE-Kontrollgruppen (EE = ethinyl estradiol, Ethinylöstradiol) (0,1 mg/kg, subkutan (sc), oder 0,3 mg/kg, oral (po)) werden in jeden Test einbezogen. Wenn die Verbindungen auf ihre Antagonistenaktivität getestet werden, wird EE zu 0,1 oder 0,3 mg/kg für sc- bzw. po-Studien koverabreicht. Die Testverbindungen werden bis zu dem Tag, an dem die Schwanzhauttemperatur gemessen wird, verabreicht.
Nach einem Akklimatisierungszeitraum von vier Tagen werden die Tiere einmal täglich mit der Verbindung bzw. den Verbindungen von Interesse behandelt. Es sind 10 Tiere pro Behandlungsgruppe. Die Verabreichung der Verbindung erfolgt entweder mittels subkutaner Injektion von 0,1 ml in den Nacken oder oral in einem Volumen von 0,5 ml. Am 3. Tag der Behandlung wird ein Morphinpellet (75 mg Morphinsulfat) subkutan implantiert. Am 5. Tag der Behandlung werden ein oder zwei weitere Morphinpellets implantiert. Am achten Tag wird ungefähr die Hälfte der Tiere mit Ketamin (80 mg/kg, intramuskulär) injiziert und ein Thermoelement, das an ein MacLab-Datenerfassungssystem (API Instruments, Milford, MA, USA) angeschlossen ist, wird an dem Schwanz ungefähr einen Zoll von der Schwanzwurzel festgeklebt. Dieses System ermöglichte die ständige Messung der Schwanzhauttemperatur. Die Grundtemperatur wird 15 min lang gemessen, dann wird Naloxon (1,0 mg/kg) subkutan (0,2 ml) gegeben, um die Wirkung von Morphin zu blockieren, und die Schwanzhauttemperatur wird eine Stunde danach gemessen. Am neunten Tag werden die übrigen Tiere in ähnlicher Weise arrangiert und analysiert.
Beispiel 19
Vasomotorische Funktion in isolierten Aortenringen von Ratten Sprague-Dawley-Ratten (240–260 Gramm) werden in 4 Gruppen aufgeteilt:

1. Normal, nicht ovariektomiert (intakt)
2. Ovariektomiert (ovex), mit Vehikel behandelt
3. Ovariektomiert, mit 17β-Östradiol behandelt (1 mg/kg/Tag)
4. Ovariektomierte Tiere, die mit Testverbindung behandelt werden (d. h. 1 mg/kg/Tag)

Die Tiere werden ungefähr 3 Wochen vor der Behandlung ovariektomiert. Jedes Tier erhält mittels einer Magensonde 1 mg/kg/Tag von entweder 17β-Östradiolsulfat oder Testverbindung, die in destilliertem, voll entsalztem Wasser mit 1% Tween-80 suspendiert ist. Die mit Vehikel behandelten Tiere erhielten ein entsprechendes Volumen des Vehikels, das in den mit den Arzneimitteln behandelten Gruppen verwendet wurde.
Die Tiere werden mittels CO₂-Einatmung und Ausblutung eingeschläfert. Ihre Brustschlagadern werden schnell entnommen und in physiologische Lösung bei 37°C mit der folgenden Zusammensetzung (mM): NaCl (54,7), KCl (5,0), NaHCO₃ (25,0), MgCl₂·2 H₂O (2,5), D-Glukose (11,8) und CaCl₂ (0,2), die mit CO₂/O₂ (95%/5%) begast wurde, auf einen endgültigen pH-Wert von 7,4 gegeben. Das Adventitia wird von der Außenfläche entfernt und das Gefäß wird in 2–3 mm breite Ringe geschnitten. Die Ringe werden in ein 10-ml-Gewebebad gehängt, wobei ein Ende am Boden des Bades und das andere an einem Kraftwandler befestigt wurde. Eine Ruhespannung von 2 Gramm wird auf die Ringe angelegt. Die Ringe werden 1 Stunde lang äquilibriert, die Signale werden erfasst und analysiert.
Nach dem Äquilibrieren werden die Ringe zunehmenden Konzentrationen von Phenylephrin (10^–8 bis 10^–4 M) ausgesetzt und die Spannung wurde aufgezeichnet. Die Bäder werden dann 3-mal mit frischem Puffer gespült. Nach dem Auswaschen werden dem Gewebebad 200 mM L-NAME zugegeben und es wird 30 Minuten lang äquilibriert. Die Phenylephrinkonzentration-Wirkungskurve wird dann wiederholt.
Beispiel 20
Labyrinth mit acht radialen Abzweigungen – Kognitionsverbesserung
Männliche Sprague-Dawley-CD-Ratten (Charles River, Kingston, NY, USA), die beim Eintreffen 200–250 g wiegen, werden verwendet. Eine Woche lang werden die Ratten untergebracht, sechs pro Käfig, mit Standardlaborfutter und Wasser ad libitum verfügbar. Die Unterbringung erfolgt in einem Kolonieraum, der bei 22°C gehalten wird und einen 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus aufwies, wobei das Licht um 6 Uhr morgens angeschaltet wurde. Nach Gewöhnung an die Einrichtung werden die Tiere einzeln untergebracht und auf 85% des Gewichts bei ungebundener Fütterung gehalten. Sobald stabile Gewichte erzielt wurden, werden die Ratten an das Labyrinth mit 8 radialen Abzweigungen gewöhnt.
Beim Aufbau des Labyrinths handelt es sich um eine Umarbeitung des Labyrinths von Peele und Baron (Pharmacology, Biochemistry, and Behavior, 29: 143–150, 1988). Das Labyrinth wird auf eine Höhe von 75,5 cm erhöht und besteht aus einem kreisförmigen Bereich, der von 8 Abzweigungen umgeben ist, die in gleichen Abständen voneinander von der Mitte weg ausstrahlen. Jede Abzweigung ist 58 cm lang × 13 cm hoch. Ein Zylinder aus klarem Plexiglas wird hinuntergelassen, um das Tier vor dem Start jeder Trainingseinheit in dem Mittelteil des Labyrinths einzuschließen. Jede Abzweigung des Labyrinths ist mit 3 Sätzen Fotozellen ausgestattet, die mit einer Datenerfassungseinheit verbunden sind, die wiederum mit einem Computer verbunden ist. Die Fotozellen werden zum Verfolgen der Bewegungen der Ratte in dem Labyrinth verwendet. Pelletfüttereinrichtungen, die sich über Futternäpfen am Ende jeder Abzweigung befanden, gaben zwei 45-mg-Schokoladenpellets aus, wenn die äußere Fotozelle der Abzweigung in einer gegebenen Trainingseinheit zum ersten Mal aktiviert wird. Das Labyrinth befindet sich in einem Versuchsraum mit geometrischen Schwarzweißpostern auf jeder Wand, um als optische Hinweise zu dienen. Bei allen Trainings- und Testverfahren ist weißes Rauschen hörbar (~70 db).
Das Trainingsverfahren besteht aus fünf Phasen, jede mit täglichen Trainingseinheiten, die 5 oder 10 Minuten dauern. Eine Verzögerung von 10 Sekunden wird zwischen dem Zeitpunkt, zu dem die Ratte in den Mittelteil des Labyrinths gesetzt wird, und dem Zeitpunkt, zu dem der Zylinder angehoben wird, um die Trainingseinheit zu beginnen, eingeführt. In Phase 1 werden Paare von Ratten, bei denen die Verfügbarkeit von Futter begrenzt wurde, 10 Minuten lang in das Labyrinth gesetzt, wobei 45-mg-Schokoladenpellets über die gesamten 8 Abzweigungen des Labyrinths verteilt sind. In Phase II wird jede Ratte einzeln für einen Zeitraum von 10 Minuten in das Labyrinth gesetzt, wobei Pellets von der mittleren Fotozelle zum Futternapf jeder Abzweigung verteilt sind. In Phase III wird jede Ratte für einen Zeitraum von 10 Minuten in das Labyrinth gesetzt, wobei Pellets sich nur in den Futternäpfen und um diese herum in jeder Abzweigung befinden. In Phase IV werden jeder Ratte 10 Minuten gegeben, zwei Pellets aus jeder Abzweigung zu sammeln. Ein erneutes Betreten einer Abzweigung wird als Fehler betrachtet. Die Ratten werden täglich auf diese Art und Weise trainiert, bis sie eine Maßstableistung von weniger als oder gleich 2 Fehlern insgesamt an drei aufeinander folgenden Trainingstagen erzielten. Die Gewöhnungs- und Trainingsgesamtzeit macht ungefähr 3 Wochen aus.
Die Testverbindung wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung hergestellt und in einem Volumen von 1 ml/kg verabreicht. Scopolamin-HBr (0,3 mg/kg, subkutan) diente als beeinträchtigendes Mittel, mit dem ein Anstieg der Fehlerquote (Gedächtnisverlust) hervorgerufen wird. Die Testverbindung wird gleichzeitig mit Scopolamin intraperitoneal gegeben, 30 Minuten vor dem ersten Aussetzen in dem Labyrinth an einem beliebigen gegebenen Testtag.
Um die Testverbindung auszuwerten, wird ein 8 × 8 großes ausbalanciertes lateinisches Quadrat für Wiederholungsmessungen entworfen, um eine hohe Versuchseffizienz mit der geringsten Anzahl von Tieren zu erzielen. Acht Versuchstrainingseinheiten, zwei in der Woche, werden mit den 8 Behandlungen (Vehikel, Scopolamin, 3 Dosen der Testverbindung in Kombination mit Scopolamin) durchgeführt, die in jeder Trainingseinheit randomisiert werden. Jede Behandlung folgte in identischer Zahl auf jede andere Behandlung. Folglich konnte die Restwirkung jeder Behandlung geschätzt und von der direkten Behandlungswirkung subtrahiert werden. Nach einer ANOVA werden mehrere Vergleiche unter Anwendung des zweiseitigen Dunnett-Tests an justierten Mitteln durchgeführt.
Tiere, die bei der ersten Aussetzung nicht innerhalb von 5 Minuten 4-mal die richtige Wahl trafen oder die zum Ende der 2. Aussetzung nicht insgesamt 8-mal die richtige Wahl getroffen hatten, werden als für diese Trainingseinheit „timed out" (Überschreitung der Zeit) angesehen. Jedes Tier, das nach Verabreichung von mehr als einer Dosis der Testverbindung „timed out" war, wird von der Analyse ausgeschlossen.
Beispiel 21
Neuroprotektion
Inhibition von zeitabhängigem Tod von Zellen in primären Cortexneuronenkulturen
Primäre Cortexneuronen wurden unter Anwendung einer Variation von Verfahren, die von Monyer et al., 1989, Brain Research 483: 347–354, beschrieben, aus Rattengehirnen, die 0–1 Tag alt waren, gewonnen. Aufgelöstes Hirngewebe wurde drei Tage in DMEM/10% PDHS (pregnant donor horse serum, Pferdeserum von einem trächtigen Tier) gezüchtet und dann zwei Tage mit Cytosinarabinosid (ARC) behandelt, um kontaminierende Gliazellen zu entfernen. An Tag 5 wurde das ARC-Medium entfernt und durch DMEM/10% PDHS ersetzt. Die Nervenzellen wurden vor dem Gebrauch weitere 4–7 Tage kultiviert.
Primäre Neuronenkontrollkulturen zeigen zwischen Tag 12 und 18 in Kultur einen progressiven Zelltod. Zwölf Kulturen wurden an Tag 12 und 26 auf Spiegel des Enzyms Laktatdehydrogenase (LD) nach Zugabe der Testverbindung zu 6 Kulturen, die in DMEM und 10% PDHS gehalten wurden, an Tag 9 und Halten der verbleibenden Kulturen als Kontrollen ausgewertet. Die LD wurde unter Anwendung einer Variation des Verfahrens von Wroblewski et al., 1955, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 90: 210–213, geprüft. LD ist ein zytosolisches Enzym, das allgemein in sowohl der klinischen als auch der allgemeinen Forschung zum Bestimmen der Gewebelebensfähigkeit verwendet wird. Ein Anstieg der Medien-LD hängt direkt mit dem Zelltod zusammen.
Neuroprotektion gegen Zytotoxizität, die von Hypoglykämie induziert wurde
C6-Gliomazellen, die von der ATCC bezogen wurden, wurden in RPMI-Medium mit FBS in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml in FALCON-25-cm²-Gewebekulturkolben plattiert. Vier Stunden vor Ausbruch von Hypoglykämie wurde das Kulturmedium verworfen, Monoschichten wurden zweimal in den adäquaten Medien gewaschen und dann vier Stunden bei 37°C in entweder serumfreiem Medium oder serumfreiem Medium plus Testverbindung inkubiert. Kreb-Ringer-Phosphatpuffer wurde verwendet, um die Monoschichten zweimal vor Zugabe der adäquaten Glukosebehandlung zu waschen. Das RPMI-Medium enthält 2 mg Glukose/ml; die Kolben wurden in Gruppen zu 6 aufgeteilt, die jeweils 100% Glukose (2 mg/ml), 80% Glukose (1,6 mg/ml), 60% Glukose (1,2 mg/ml) oder 0% Glukose (Puffer) oder mit Testverbindung supplementiert erhielten. Alle Kolben wurden 20 Stunden inkubiert und dann unter Verwendung von Trypsinblau auf Gesamtzellenzahl, Zahl der lebendigen und der toten Zellen bewertet.
Neuroprotektion gegen exzitotoxische Aminosäuren
Fünf Kulturschalen, die SK-N-SH-Neuroblastomzellen enthielten, wurden mit Testverbindung behandelt und fünf Kulturschalen wurden mit RPMI-Medium behandelt. Vier Stunden später wurden alle Zellen 5 Minuten mit NMDA (500 μM) behandelt. Dann wurden die lebendigen Zellen und die toten Zellen insgesamt bestimmt.
Neuroprotektion gegen Sauerstoff-Glukose-Entzug
Analyse von pyknotischen Nuklei zum Messen von Apoptose: Cortexneuronen werden aus E18-Rattenfötus gewonnen und in 8-Well-Kammerobjektträgern, die mit Poly-D-lysin (10 ng/ml) und Serum vorbeschichtet waren, in einer Dichte von 100.000 Zellen/Well plattiert. Die Zellen werden in DMEM mit hohem Glukoseanteil, das 10% FCS enthält, plattiert und in dem Inkubator bei 37°C mit 10% CO₂/90% Luft gehalten. Am nächsten Tag wird das Serum entfernt, indem das Kulturmedium mit DMEM mit hohem Glukoseanteil, das B27-Supplement enthält, ersetzt wird, und die Zellen werden ohne weiteren Medienaustausch bis zum Versuchstag in dem Inkubator gehalten. An Tag 6 werden die Objektträger in zwei Gruppen aufgeteilt: Kontrollgruppe und OGD- Gruppe. Zellen in der Kontrollgruppe erhalten DMEM mit Glukose und spezifischem B27 (ohne Antioxidantien). Zellen in der OGD-Gruppe erhalten DMEM ohne Glukose mit spezifischem 627, das 15 min unter Vakuum entgast worden war. Die Zellen werden 10 min in einer luftdichten Kammer mit 90% N₂/10% CO₂ gespült und 6 h bei 37°C inkubiert. Nach 6 h werden sowohl Kontroll- als auch OGD-Zellen einem Austausch des Mediums, das entweder Vehikel (DMSO) oder Testverbindung in glukosehaltigem DMEM mit spezifischem 627 enthält, unterzogen. Die Zellen werden wieder in einen normoxischen Inkubator bei 37°C gegeben. Nach 24 h werden die Zellen 10 min bei 4°C in 4%-igem PFA fixiert und mit Topro (fluoreszierender Kernbindungsfarbstoff) gefärbt. Die Apoptose wird unter Verwendung eines Laser-Scanning-Cytometers ausgewertet, indem die pyknotischen Nuklei gemessen werden.
Messung von LDH-Freisetzung als eine Anzeige des Zelltods: Cortexneuronen werden aus E18-Rattenfötus gewonnen und in 48-Well-Kulturplatten, die mit Poly-D-lysin (10 ng/ml) und Serum vorbeschichtet waren, in einer Dichte von 150.000 Zellen/Well plattiert. Die Zellen werden in DMEM mit hohem Glukoseanteil, das 10% FCS enthält, plattiert und in dem Inkubator bei 37°C mit 10% CO₂/90% Luft gehalten. Am nächsten Tag wird das Serum entfernt, indem das Kulturmedium mit DMEM mit hohem Glukoseanteil, das B27-Supplement enthält, ersetzt wird. An Tag 6 werden die Zellen in zwei Gruppen aufgeteilt: Kontrollgruppe und OGD-Gruppe. Zellen in der Kontrollgruppe erhalten DMEM mit Glukose und spezifischem B27 (ohne Antioxidantien). Zellen in der OGD-Gruppe erhalten DMEM ohne Glukose mit spezifischem 627, das 15 min unter Vakuum entgast worden war. Die Zellen werden 10 min in einer luftdichten Kammer mit 90% N₂/10% CO₂ gespült und 6 h bei 37°C inkubiert. Nach 6 h werden sowohl Kontroll- als auch OGD-Zellen einem Austausch des Mediums, das entweder Vehikel (DMSO) oder Testverbindung in glukosehaltigem DMEM mit spezifischem B27 enthält, unterzogen. Die Zellen werden wieder in einen normoxischen Inkubator bei 37°C gegeben. Nach 24 h wird der Zelltod durch Messen der zellulären Freisetzung von LDH (Laktosedehydrogenase) in das Kulturmedium ausgewertet. Zur LDH-Prüfung wird ein Aliquot von 50 μl Kulturmedium in die 96-Well-Platte überführt. Nach Zugabe von 140 μl 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) und 100 μl 0,2 mg/ml NADH wird die Platte 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wird mittels Zugabe von 10 μl Natriumpyruvat initiiert. Die Platte wird unverzüglich bei 340 nM in einem Thermomax-Plattenlesegerät (Molecular Devices) gelesen. Die Extinktion, ein Index der NADH-Konzentration, wird 5 Minuten lang alle 6 Sekunden aufgezeichnet und der Anstieg, der die Rate des Verschwindens von NADH anzeigt, wird zum Berechnen der LDH-Aktivität verwendet. LDH-Aktivität (E/ml) = (ΔA/min) (TCF)(20) (0,0833)/(0,78)wobei: 0,0833 = proportional konstant
0,78 = Instrumentlichtweglänge (cm)
Beispiel 22
HLA-Testverfahren an Ratten – Morbus Crohn und entzündliche Darmerkrankungen
Männliche HLA-B27-Ratten werden von Taconic bezogen und ihnen wurde uneingeschränkter Zugang zu einem Futtermittel (PMI Lab diet 5001) und Wasser gewährt. Zum Beginn der Studie sind die Ratten 22–26 Wochen alt.
Den Ratten wird einmal täglich sieben Tage lang eine Dosis der im Folgenden aufgeführten Formulierungen gegeben. Es gibt in jeder Gruppe fünf Ratten und die letzte Dosis wird zwei Stunden vor der Einschläferung verabreicht.

• Vehikel (50% DMSO/50% Dulbeccos PBS)
• 17α-Ethinyl-17β-östradiol (10 μg/kg)
• Testverbindung

Die Stuhlqualität wird täglich beobachtet und gemäß der folgenden Skala eingestuft: Diarrhoe = 3; weicher Stuhl = 2; normaler Stuhl = 1. Zum Ende des Testverfahrens wird Serum abgenommen und bei –70°C gelagert. Ein Kolonschnitt wird zur histologischen Analyse präpariert und ein weiteres Segment wird auf Myeloperoxidase-Aktivität analysiert.
Das folgende Verfahren wird zum Messen der Myeloperoxidase-Aktivität verwendet. Kolongewebe wird geerntet und in flüssigem Stickstoff blitzgefroren. Eine repräsentative Probe des gesamten Kolons wird zum Sicherstellen der Gleichheit zwischen Proben verwendet. Das Gewebe wird bis zum Gebrauch bei –80°C gelagert. Als Nächstes wird das Gewebe gewogen (ungefähr 500 mg) und in (1:15 (w/v)) 5 mM H₂KPO₄-Waschpuffer (pH 6) homogenisiert. Das Gewebe wird 45 Minuten bei 2–8°C mit 20.000 × g in einer Sorvall RC 5B-Zentrifuge nach unten geschleudert. Dann wird der Überstand verworfen. Das Gewebe wird resuspendiert und in 2,5 ml (1:5 (w/v)) 50 mM H₂KPO₄ mit 10 mM EDTA und 0,5% Hexammoniumbromid homogenisiert, um das Lösen der intrazellulären MPO zu unterstützen. Das Gewebe wird in flüssigem Stickstoff gefroren, in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut und 15 Sekunden beschallt, um die Membranlyse sicherzustellen. Dieser Vorgang wird 3-mal wiederholt. Die Proben werden dann 20 Minuten auf Eis gehalten und 15 Minuten bei 2–8°C mit 12.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird unter Befolgung dieser Schritte analysiert.
Das Testgemisch wird mittels Zugabe von 2,9 ml 50 mM H₂KPO₄ mit 0,167 O-Dianisidin/ml mit 0,0005% H₂O₂ in einem Reaktionsgefäß hergestellt. Wenn das Wasserstoffperoxid abgebaut wird, wird das O-Dianisidin oxidiert und absorbiert bei 460 nm in einer von der Konzentration abhängigen Weise. Das Gemisch wird auf 25°C erhitzt. Einhundert (100) μl des Gewebeüberstands werden in das Reaktionsgefäß gegeben, eine Minute bei 25°C inkubiert, dann wird 1 ml in eine Einwegkunststoffküvette überführt. Die OD wird alle 2 Minuten der Reaktionszeit bei 460 nm gegen eine Blindprobe, die 2,9 ml des Reaktionsgemischs und 100 μl der Lösung mit 0,5% Ammoniumbromid enthält, gemessen.
Enzymaktivitätseinheiten werden mittels Vergleich der Extinktion bei 460 nm mit einer Standardkurve, die mit gereinigtem menschlichem MPO, 31,1 Einheiten/Ampulle, erzeugt wurde, quantifiziert. Das MPO wird rekonstituiert und unter Verwendung von 50 mM H₂KPO₄ mit 10 mM EDTA und 0,5% Hexammoniumbromid auf vier bekannte Konzentrationen reihenverdünnt. Die Probenextinktionen werden mit dieser Kurve verglichen, um die Aktivität zu bestimmen.
Eine histologische Analyse wird wie folgt durchgeführt. Kolongewebe wird in 10%-iges, neutral gepuffertes Formalin eingetaucht. Jede Kolonprobe wird zur Auswertung in vier Proben aufgeteilt. Die mit Formalin fixierten Gewebe werden in einem Vakuuminfiltrationsprozessor zur Paraffin-Einbettung verarbeitet. Die Proben werden auf 5 μm getrennt und dann mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) für verblindete histologische Auswertungen unter Verwendung einer Skala, die nach Boughton-Smith modifiziert wurde, gefärbt. Nachdem die Scores abgeschlossen wurden, werden die Proben entblindet, und die Daten werden tabellarisiert und mittels linearer ANOVA-Modellbildung mit mehreren Durchschnittsvergleichen analysiert.
Alle Patente, Veröffentlichungen und anderen hierin angeführten Dokumente sind hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen.

Claims

Verbindung der Formel:
in der: R₁ Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Halogen, CN oder gegebenenfalls substituiertes Alkoxy ist; R₂ Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl ist oder R₁ und R₂ zusammen einen 5 bis 7-gliedrigen Ring bilden können und R₃ und R₄ unabhängig jeweils H, OH, Halogen, CN, gegebenenfalls substituiertes Phenyl, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Alkoxy sind; oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, in der R₁ gegebenenfalls substituiertes Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in der R₂ Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, in der R₁ und R₂ zusammen einen 6-gliedrigen Ring bilden.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der R₃ H, Halogen oder CN ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in der R₄ Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 6, in der R₄ F ist.
Verbindung nach Anspruch 1, bei der es sich um folgende handelt: (a) 1-(4-Hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim; (b) 5-Fluor-1-(4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim; (c) 5-Chlor-1-(4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim; (d) 5-Brom-1-(4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim; (e) (4E)-9-(4-Hydroxyphenyl)-1,2,3,9-tetrahydro-4H-carbazol-4-onoxim oder (f) 1-(4-Hydroxyphenyl)-H-indol-3-carbaldehydoxim, (g) 1-(3-Fluor-4-hydroxyphenyl)-2-methyl-1H-indol-3-carbaldehydoxim oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: a) eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und b) einen pharmazeutischen Trägerstoff.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung als ein Arzneimittel.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur: Inhibition von Osteoporose in einem Säuger, der dieser bedarf, Inhibition von Osteoarthrose, Hypokalziämie, Hyperkalziämie, Paget-Krebs, Osteomalazie, Osteohalisterese, Kahler-Krankheit oder anderen Krebsformen mit schädlichen Auswirkungen auf Knochengewebe in einem Säuger, der dieser bedarf, Inhibition von gutartigem oder bösartigem abnormem Gewebewachstum in einem Säuger, der dieser bedarf, Senkung von Cholesterin-, Triglycerid-, Lp(a)- oder LDL-Spiegeln oder Inhibition von Hypercholesterinämie; Hyperlipämie; Herz-Kreislauf-Erkrankung; Atherosklerose; peripherer Verschlusskrankheit; Restenose oder Vasospasmus oder Inhibition von Gefäßwandschädigung aufgrund von zellulären Ereignissen, die zu immunvermittelter Gefäßwandschädigung führen, in einem Säuger, der dieser bedarf, Inhibition von radikalinduzierten Krankheitszuständen in einem Säuger, der dieser bedarf, Bereitstellung von Kognitionsverbesserung oder Neuroprotektion oder Behandlung oder Inhibition von senilen Demenzen, Alzheimer-Krankheit, kognitiver Verschlechterung oder neurodegenerativer Erkrankungen in einem Säuger, der dieser bedarf, Inhibition von entzündlicher Darmerkrankung, ulzerativer Proktitis, Morbus Crohn, Kolitis, Hitzewallungen, Vaginal- oder Vulvaatrophie, atrophischer Vaginitis, vaginaler Trockenheit, Pruritus, Dyspareunie, Dysurie, häufiger Blasenentleerung, Harninkontinenz, Harnwegsinfektionen, vasomotorischer Symptome; androgenetischer Alopezie; Hautatrophie; Akne; Typ-II-Diabetes; dysfunktioneller Uterusblutung oder Infertilität in einem Säuger, der dieser bedarf, oder Inhibition von Leukämie, Endometriumablationen, chronischer Nieren- oder Lebererkrankung oder Blutgerinnungserkrankungen oder -störungen in einem Säuger, der dieser bedarf.