DE602004007257T2

DE602004007257T2 - Hydroxy-diaryl-carbaldehyd- oxim-verbindungen und deren verwendung als oestrogenwirksame substanzen

Info

Publication number: DE602004007257T2
Application number: DE602004007257T
Authority: DE
Inventors: Richard Eric Pottstown Montgomery County Mewshaw; Cijiang Collegeville Yang
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2003-05-02
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2024-05-01
Also published as: US20080033049A1; WO2004099122A2; JP2006525346A; AU2004236213A1; CA2523712A1; PL1620392T3; ES2289538T3; EP1620392B1; WO2004099122A3; MXPA05011679A; EP1620392A2; US20050020676A1; DE602004007257D1; DK1620392T3; BRPI0409960A; ATE365708T1; US7279600B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf neuartige 4'-Hydroxy-Biphenyl-Carbaldehyd-Oxim-Derivate, deren Verwendungen als östrogenwirksame Substanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die pleiotropischen Wirkungen der Östrogene in Säugetiergeweben sind gut dokumentiert und man schätzt gegenwärtig, dass Östrogene viele Organsysteme beeinflussen [Mendelsohn und Karas, New England Journal of Medicine [Zeitschrift für Medizin in Neu England] 340: 1801-1811 (1999), Epperson et al., Psychosomatic Medicine [Psychosomatische Medizin] 61: 676-697 (1999), Crandall, Journal of Womens Health & Gender Based Medicine [Zeitschrift für die Gesundheit von Frauen und geschlechtsspezifische Medizin] 8: 1155-1166 (1999), Monk und Brodaty, Dementis & Geriatric Cognitive Disorders [Demenz und geriatrische Störungen der Erkenntnisfähigkeit] 11: 1-10 (2000), Hurn und Macrae, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism [Zeitschrift für zerebralen Blutstrom und Stoffwechsel] 20: 631-652 (2000), Calvin, Maturitas 34: 195-210 (2000), Finking et al., Zeitschrift für Kardiologie 89: 442- 453 (2000), Brincat, Maturitas 35: 107-117 (2000), Al-Azzawi, Postgraduate Medical Journal [Medizinische Zeitschrift für Postgraduierte] 77: 292-304 (2001)]. Östrogene können auf Gewebe auf verschiedene Weise einwirken. Wahrscheinlich ist der am besten charakterisierte Aktionsmechanismus ihre Wechselwirkung mit Ostrogenrezeptoren, die zu Veränderungen in der Gentranskription führt. Ostrogenrezeptoren sind ligandaktivierte Transkriptionsfaktoren und gehören zur Superfamilie der nukleären Hormonrezeptoren. Andere Mitglieder dieser Familie umfassen die Progesteron-, Androgen-, Glucocorticoid- und Mineralcorticoidrezeptoren. Nach Bindung des Liganden dimerisieren diese Rezeptoren und können die Gentranskription aktivieren entweder durch direkte Bindung an spezifische Sequenzen auf der DNA (bekannt als Antwortelemente) oder durch Wechselwirkung mit anderen Transkriptionsfaktoren (wie dem API), die ihrerseits direkt an spezifische DNA-Sequenzen anbinden [Moggs und Orphanides, EMBO Reports [EMBO Berichte] 2: 775-781 (2001), Hall et al., Journal of Biological Chemistry [Zeitschrift für Biochemie] 276: 36869-36872 (2001), McDonnell, Principles of Molecular Regulation [Grundsätze der molekularen Regulation] S. 351-361 (2000)]. Eine Klasse von "koregulatorischen" Proteinen kann auch mit dem ligandgebundenen Rezeptor interagieren und seine Transkriptionsaktivität weiter modulieren [McKenna et al., Endocrine Reviews [Endokrine Rezensionen] 20: 321-344 (1999)]. Auch ist nachgewiesen worden, dass Östrogenrezeptoren die NFκB-vermittelte Transkription sowohl auf ligandabhängige als auch ligandunabhängige Weise supprimieren können [Quaedackers et al., Endocrinology [Endokrinologie] 142: 1156-1166 (2001), Bhat et al., Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology [Zeitschrift für Steroidbiochemie & Molekularbiologie] 67: 233-240 (1998), Pelzer et al., Biochemical & Biophysical Research Communications [Mitteilungen aus der biochemischen und biophysikalischen Forschung] 286: 1153-7 (2001)].
Ostrogenrezeptoren können auch durch Phosphorylierung aktiviert werden. Diese Phosphorylierung wird durch Wachstumsfaktoren wie den EGF vermittelt und verursacht Änderungen in der Gentranskription in Abwesenheit von Liganden [Moggs und Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001)].
Ein weniger gut charakterisierter Modus, durch welchen Östrogene Zellen beeinflussen können, geschieht durch einen so genannten Membranrezeptor. Die Existenz eines solchen Rezeptors wird kontrovers betrachtet, aber die Tatsache, dass Östrogene sehr schnelle nicht-genomische Antworten Zellen entlocken können, ist gut dokumentiert. Die für die Transduktion dieser Effekte verantwortliche molekulare Einheit ist noch nicht endgültig isoliert worden, eindeutige Hinweise lassen aber vermuten, dass zumindest ein Zusammenhang besteht mit den nukleären Formen der Ostrogenrezeptoren [Levin, Journal of Applied Physiology [Zeitschrift für angewandte Physiologie] 91: 1860-1867 (2001), Levin, Trends in Endocrinology & Metabolism [Trends in Endokrinologie und Stoffwechsel] 10: 374-377 (1999)].
Zwei Ostrogenrezeptoren sind bis jetzt entdeckt worden. Der erste Ostrogenrezeptor wurde vor etwa 15 Jahren geklont und wird nun mit ERα bezeichnet [Green et al., Nature [Natur] 320: 134-9 (1986)]. Der zweite wurde vergleichsweise in jüngster Zeit entdeckt und wird ERβ genannt [Kuiper et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Amerika [Verfahrensweisen der Nationalen Akademie für Wissenschaften der Vereinigten Staaten von Amerika] 93: 5925-5930 (1996)]. Frühe Arbeiten über ERβ zielten auf die Definition seiner Affinität für eine Vielfalt von Liganden ab, und in der Tat wurden einige Unterschiede zum ERα herausgefunden. Die Gewebeverteilung des ERβ ist am Nagetier gut kartographiert worden und deckt sich nicht mit ERα. Gewebe wie Maus- und Rattenuterus exprimieren vorherrschend ERα, während Maus- und Rattenlunge vorherrschend ERβ exprimieren [Couse et al., Endocrinology 138: 4613-4621 (1997), Kuiper et al., Endocrinology 138: 863-870 (1997)]. Sogar innerhalb desselben Organs kann die Verteilung von ERα und ERβ in Felder aufgeteilt sein. Zum Beispiel wird im Mauseierstock ERβ hochgradig exprimiert in den Granulosazellen und ERα ist auf die Theka- und Stromazellen beschränkt [Sar und Welsch, Endocrinology 140: 963-971 (1999), Fitzpatrick et al., Endocrinology 140: 2581-2591 (1999)]. Es gibt jedoch Beispiele, bei denen die Rezeptoren koexprimiert sind, und aus In-vitro-Studien liegt der Beweis vor, dass ERα und ERβ Heterodimere bilden können [Cowley et al., Journal of Biological Chemistry 272: 19858-19862 (1997)].
Das potenteste endogene Östrogen ist das 17β-Östradiol. Über eine große Anzahl von Verbindungen wurde beschrieben, dass sie die Aktivität des 17β-Östradiols entweder nachahmen oder blockieren. Verbindungen, die praktisch dieselben biologischen Effekte wie das 17β-Östradiol haben, werden „Östrogenrezeptoragonisten" genannt. Solche, die die Wirkung des 17β-Östradiols blockieren, wenn sie in Kombination mit ihm verabreicht werden, werden „Östrogenrezeptorantagonisten" genannt. In Wirklichkeit besteht ein Kontinuum zwischen der Östrogenrezeptoragonisten- und Östrogenrezeptorantagonistenaktivität und einige Verbindungen verhalten sich wie Östrogenrezeptoragonisten in einigen Geweben und wie Östrogenrezeptorantagonisten in anderen. Diese Verbindungen mit gemischter Aktivität werden selektive Östrogenrezeptormodulatoren (SERMS) genannt und sind therapeutisch brauchbare Agenzien (z. B. EVISTA) [McDonnell, Journal of the Society for Gynecologic Investigation [Zeitschrift der Gesellschaft für gynäkologische Untersuchungen] 7: S10-S15 (2000), Goldstein et al., Human Reproduction Update [Neuester Stand der humanen Reproduktion] 6: 212-224 (2000)]. Der genaue Grund, weshalb dieselbe Verbindung zellspezifische Effekte ausüben kann, ist noch nicht aufgeklärt, aber auf die Unterschiede bei der Rezeptoranpassung und/oder im Milieu der koregulatorischen Proteine ist hingewiesen worden.
Seit einiger Zeit ist bekannt, dass Östrogenrezeptoren verschiedene Gestaltungen annehmen, wenn sie Liganden binden. Jedoch wurden Konsequenz und Subtilität dieser Änderungen erst vor kurzem aufgedeckt. Die dreidimensionalen Strukturen von ERα und ERβ wurden durch Ko-Kristallisation mit verschiedenen Liganden gelöst und zeigen eindeutig die Repositionierung der Helix 12 in Gegenwart eines Östrogenrezeptorantagonisten, der die Proteinsequenzen, die für die Rezeptor-koregulatorische Proteinwechselwirkung erforderlich sind, sterisch hindert (Pike et al., Embo 18: 4608-4618 (1999), Shiau et al., Cell [Zelle] 95: 927-937 (1998)]. Hinzu kommt, dass die Technik der Phagendarstellung angewandt wurde, um Peptide zu identifizieren, die mit Östrogenrezeptoren in Gegenwart verschiedener Liganden interagieren [Paige et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 3999-4004 (1999)]. Zum Beispiel wurde ein Peptid identifiziert, das zwischen ERα, der an die vollständigen Östrogenrezeptoragonisten 17β-Östradiol und Diethylstilbesterol gebunden ist, unterschied. Von einem anderen Peptid wurde nachgewiesen, dass es zwischen Clomiphen, das an ERα und ERβ gebunden war, unterschied. Diese Daten weisen darauf hin, dass jeder Ligand dem Rezeptor potentiell eine einmalige und unvorhersehbare Gestaltung verleiht, die wahrscheinlich unterschiedliche biologische Aktivitäten aufweist.
Minutolo et al. erörtern in Bioorganic & Medicinal Chemistry [Bioorganische und medizinische Chemie] 11, (2003) 1247-1257, einen Östrogenliganden, der eine einmalige 3,4-Diphenylsalicylaldoxim-Struktur aufweist, und untersuchen die Wirkungen der Einführung von Hydroxy- und Methoxy-Gruppen auf die Struktur.
Wie oben erwähnt beeinflussen Östrogene ein Spektrum biologischer Prozesse. Außerdem ist es, wenn Geschlechtsunterschiede beschrieben werden (z. B. Krankheitshäufigkeiten, Reaktionen auf Ansteckung usw.), möglich, dass die Darstellung den Unterschied der Östrogenspiegel zwischen Männern und Frauen involviert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf eine Verbindung folgender Formel:
wobei
R¹ und R² ein jedes unabhängig H, Halogen, CN, optional substituiertes Phenyl oder optional substituiertes C₁-C₆ Alkyl ist;
R³, R⁴, R⁵ und R⁶ ein jedes unabhängig H, OH, Halogen, CN, optional substituiertes Phenyl, optional substituiertes C₁-C₆ Alkyl oder optional substituiertes C₁-C₆ Alkoxy ist;
jedes R⁸ H ist und
R⁹ optional substituiertes C₁-C₆ Alkyl ist,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon oder eine Arzneimittelvorstufe davon. Bei einer anderen Ausführung bezieht sich die Erfindung auf eine Verbindung mit der Formel:
Nach einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Verbindung folgender Formel:
Nach noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Verbindung sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Nach noch weiteren Aspekten richtet sich die Erfindung auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung und Verhütung von Krankheiten wie der entzündlichen Darmerkrankungen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung schlägt neuartige 4'-Hydroxy-Biphenyl-Carbaldehyd-Oxim-Derivate vor. Diese Verbindungen, die vorzugsweise als östrogenwirksame Substanzen wirken, sind für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung und Verhütung von Krankheiten wie den entzündlichen Darmerkrankungen (einschließlich der Crohn-Krankheit und Kolitis) von Nutzen. Nach einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen der folgenden Formel:
wobei
R¹ und R² ein jedes unabhängig H, Halogen, CN, optional substituiertes Phenyl oder optional substituiertes C₁-C₆ Alkyl ist;
R³, R⁴, R⁵ und R⁶ ein jedes unabhängig H, OH, Halogen, CN, optional substituiertes Phenyl, optional substituiertes C₁-C₆ Alkyl oder optional substituiertes C₁-C₆ Alkoxy ist;
jedes R⁸ H ist und
R⁹ optional substituiertes C₁-C₆ Alkyl ist,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. Erfindungsgemäße Verbindungen können folgende Formel aufweisen:
Nach gewissen Aspekten sind R³, R⁵ und R⁶ ein jedes unabhängig H, Cl, F, Methyl oder Methoxy und R ² ist H, Cl, F oder Methyl. Nach einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Verbindung mit folgender Formel:
Nach gewissen Aspekten sind R³, R⁵ und R⁶ ein jedes unabhängig H, Cl, F, Methyl oder Methoxy und R² ist H, Cl, F oder Methyl.
Pharmazeutisch annehmbare Salze können aus organischen und anorganischen Säuren gebildet werden wie zum Beispiel Essig-, Propion-, Milch, Zitronen-, Wein-, Bernstein-, Fumar-, Malein-, Malon-, Mandel-, Apfel-, Phthal-, Salz-, Bromwasserstoff-, Phosphor-, Stickstoff-, Schwefel-, Methansulfon-, Naphthalensulfon-, Benzolsulfon-, Toluensulfon-, Kampfersulfon- und ähnlich bekannten annehmbaren Säuren, wenn eine erfindungsgemäße Verbindung einen basischen Anteil enthält. Salze können auch aus organischen und anorganischen Basen gebildet werden wie die Alkalimetallsalze, zum Beispiel erdalkalischen (Natrium-, Lithium- oder Kalium-)Metallsalze, Ammoniumsalze, Alkylammoniumsalze, die 1 bis 6 C-Atome enthalten oder Dialkylammoniumsalze, die 1 bis 6 C-Atome in jeder Alkylgruppe enthalten, und Trialkylammoniumsalze, die 1 bis 6 C-Atome in jeder Alkylgruppe enthalten, wenn eine erfindungsgemäße Verbindung einen sauren Anteil enthält.
Der Begriff „Alkyl", wie er hier verwendet wird, bezieht sich, gleichgültig ob allein oder als Teil einer anderen Gruppe verwendet, auf eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Kohlenwasserstoffkette und umfasst z. B. gerade und verzweigte Ketten, die 1 bis 12 C Atome, vorzugsweise 1 bis 6 C-Atome enthalten, wenn nichts Anderes ausdrücklich angegeben ist. Zum Beispiel werden Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, i-Butyl und t-Butyl vom Begriff „Alkyl" mit erfasst. Vor allem sind in der Definition des Begriffs „Alkyl" solche aliphatische Kohlenwasserstoffketten mit enthalten, die optional substituiert sind.
Die Kohlenstoffanzahl, die in den Definitionen dieser Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf die Kohlenstoffhauptkette und Kohlenstoffverzweigungen, enthält aber keine C-Atome der Substituenten, wie der Alkoxysubstitutionen und Ähnlichem.
Der Begriff "Alkenyl", wie er hier verwendet wird, bezieht sich, gleichgültig ob allein oder als Teil einer anderen Gruppe verwendet, auf eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Kohlenwasserstoffkette und umfasst z. B. gerade und verzweigte Ketten, die 2 bis 8 C-Atome und mindestens eine Doppelbindung aufweisen. Vorzugsweise besitzt der Alkenylanteil 1 oder 2 Doppelbindungen. Solche Alkenylanteile können in den E- oder Z-Gestaltungen vorliegen und die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen beide Gestaltungen. Besonders in der Definition von "Alkenyl" eingeschlossen sind solche aliphatische Kohlenwasserstoffketten, die optional substituiert sind. Heteroatome, wie O, S oder N-R₁, die an ein Alkenyl angeheftet sind, sollten nicht an ein C-Atom geheftet sein, das an eine Doppelbindung gebunden ist.
Der Begriff "Phenyl", wie er hier verwendet wird, bezieht sich, gleichgültig ob allein oder als Teil einer anderen Gruppe verwendet, auf eine substituierte oder unsubstituierte Phenylgruppe.
Ein optional substituiertes Alkyl, Alkenyl und Phenyl kann durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein. Geeignete optionale Substituenten können unabhängig ausgewählt sein aus Nitro, Cyano, -N(R₁₁)(R₁₂), Halo, Hydroxy, Carboxy, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Aryloxy, Heteroaryloxy, Alkylalkoxy, Alkoxycarbonyl, Alkoxyalkoxy, Perfluoralkyl, Perfluoralkoxy, Arylalkyl, Alkylaryl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Alkylthio, -S(O)₂-N(R₁₁)(R₁₂), -C(=O)-N(R₁₁)(R₁₂), (R₁₁)(R₁₂)N-Alkyl, (R₁₁)(R₁₂)N-Alkoxyalkyl, (R₁₁)(R₁₂)N-Alkylaryloxyalkyl, -S(O)_s-Aryl (wobei s = 0 bis 2) oder -S(O)_s-Heteroaryl (wobei s = 0 bis 2). Bei gewissen erfindungsgemäßen Ausführungen schließen bevorzugte Substituenten für Alkyl, Alkenyl, Alkynyl und Cycloalkyl Nitro, Cyano, -N(R₁₁)(R₁₂), Halo, Hydroxyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Alkoxyalkyl und Alkoxycarbonyl ein. Bei gewissen erfindungsgemäßen Ausführungen schließen bevorzugte Substituenten für Aryl und Heteroaryl -N(R₁₁)(R₁₂), Alkyl, Halo, Perfluoralkyl, Perfluoralkoxy, Arylalkyl und Alkylaryl ein.
Werden Alkyl- oder Alkenylanteile substituiert zum Beispiel, können sie typischerweise mono-, di-, tri- oder persubstituiert sein. Beispiele für einen Halogensubstituenten umfassen 1-Bromvinyl, 1-Fluorvinyl, 1,2-Difluorvinyl, 2,2-Difluorvinyl, 1,2,2-Trifluorvinyl, 1,2-Dibromethan, 1,2 Difluorethan, 1-Fluor-2-Bromethan, CF₂CF₃, CF₂CF₂CF₃ und Ähnliches.
Der Begriff Halogen umfasst Brom, Chlor, Fluor und Iod. Der Begriff „niedrigeres Alkyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, die 1 bis 6 C-Atome besitzen, in einigen Ausführungen sind 1 bis 3 C-Atome bevorzugt.
Der Begriff "niedrigeres Alkoxy" bezieht sich, wie er hier verwendet wird, auf die Gruppe R-O-, wobei R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 C-Atomen ist, in einigen Ausführungen sind 1 bis 3 C-Atome bevorzugt.
Wie in Übereinstimmung mit dieser Erfindung verwendet bedeutet der Begriff "verabreichen" in Bezug auf die Verabreichung einer von dieser Erfindung erfassten Verbindung oder Substanz entweder die direkte Verabreichung einer solchen Verbindung oder Substanz oder die Verabreichung einer Arzneimittelvorstufe, eines Derivats oder Analogs, die die wirksame Menge der Verbindung oder Substanz innerhalb des Körpers bilden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Ostrogenrezeptormodulatoren verwendet werden, die für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Hemmung von Zuständen, Störungen oder Krankheitszuständen, die zumindest teilweise durch einen Ostrogenmangel oder -überschuss ausgelöst werden, oder die durch die Anwendung einer östrogenwirksamen Substanz behandelt oder gehemmt werden können, von Nutzen sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind besonders brauchbar zur Behandlung einer peri-menopausalen, menopausalen oder postmenopausalen Patientin, bei der die Spiegel der produzierten endogenen Östrogene erheblich abgesenkt sind. Die Menopause wird im Allgemeinen definiert als die letzte natürliche mensuale Periode und ist gekennzeichnet durch die Einstellung der Eierstockfunktion, die zu einer wesentlichen Verminderung der Östrogenzirkulation im Blutstrom führt. Wie hier verwendet schließt der Begriff Menopause auch Zustände einer verminderten Ostrogenproduktion ein, die chirurgisch, chemisch oder durch einen zur vorzeitigen Verminderung oder Einstellung der Eierstockfunktion führenden Krankheitszustand verursacht sein kann.
Dementsprechend sind die erfindungsgemäßen Verbindungen von Nutzen für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Hemmung von Osteoporose und zur Hemmung von Knochendemineralisation, die aus einem Ungleichgewicht der Bildung neuer Knochengewebe und der Resorption älterer Gewebe bei einem Individuum resultieren kann, das zu einem deutlichen Knochenverlust führt. Ein solcher Knochenflüssigkeitsentzug entsteht bei einer Reihe von Individuen, insbesondere bei Frauen nach der Menopause, bei Frauen, die einer beidseitigen Oophorektomie unterzogen wurden, ausgedehnte Kortikosteroidtherapien durchführen oder durchgeführt haben, unter Gonadendysgenesie leiden, sowie bei Frauen, die unter dem Cushing-Syndrom leiden. Auch kann der besondere Bedarf an Knochen-, einschließlich Zahn- und Mundknochenersatz bei Personen mit Knochenfrakturen, defekten Knochenstrukturen und solchen, die Knochenoperationen und/oder einer Prothesenimplantation unterzogen wurden, durch die Anwendung dieser Verbindungen gedeckt werden. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Problemen können diese Verbindungen zur Behandlung oder Hemmung der Osteoarthritis, Hypokalziämie, Hyperkalziämie, des Paget-Karzinoms, der Osteomalazie, Osteohalisterese, des multiplen Myeloms und anderer Formen von Krebs mit zerstörerischen Wirkungen auf das Knochengewebe von Nutzen sein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch brauchbar für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Hemmung anormalen benignen oder malignen Gewebewachstums, einschließlich der Prostatahyperplasie, uteriner Leiomyome, des Brustkrebses, der Endometriose, des Endometriumkarzinoms, polyzystischen Eierstocksyndroms, der Endometriumpolypen, einer benignen Brusterkrankung, Adenomyose, des Ovarialkarzinoms, Melanoms, Prostratakarzinoms, Kolonkarzinoms, der Karzinome des ZNS, wie Gliome oder Astroblastome.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind kardioprotektiv und brauchbar zur Herstellung eines Medikamentes zur Senkung der Cholesterin-, Triglyzeride-, Lp(a)- oder LDL-Spiegel, zur Inhibierung oder Behandlung der Hypercholesterinämie, Hyperlipidämie, kardiovaskulären Erkrankung, Atherosklerose, peripheren vaskulären Erkrankung, Restenose oder eines Vasospasmus, zur Inhibierung eines Gefäßwandschadens nach zellulären Ereignissen, der zum immunvermittelten Gefäßschaden führt. Diese kardiovaskulärprotektiven Eigenschaften sind von großer Bedeutung bei der Behandlung von Patienten nach der Menopause mit Östrogenen zur Hemmung der Osteoporose und bei Männern im Falle einer indizierten Östrogentherapie.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch Antioxidanzien und daher brauchbar zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Inhibierung von durch freie Radikale induzierten Krankheitszuständen. Spezifische Situationen, in denen die Sicherstellung einer Antioxidans-Therapie indiziert ist, sind Karzinome, Störungen des Zentralnervensystems, die Alzheimer-Krankheit, Knochenerkrankung, der Alterungsprozess, entzündliche Störungen, die periphere Gefäßerkrankung, rheumatoide Arthritis, Autoimmunkrankheiten, das Atemnotsyndrom, Emphysem, Verhütung eines Reperfusionsschadens, die virale Hepatitis, chronische aktive Hepatitis, Tuberkulose, Psoriasis, der systemische Lupus erythematodes, das akute Lungenversagen, ein Trauma des Zentralnervensystems und der Schlaganfall.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch brauchbar zur Herstellung eines Medikamentes zur Verbesserung des Erkenntnisvermögens oder zur Behandlung oder Inhibierung der senilen Dementien, Alzheimer-Krankheit, Abnahme des Erkenntnisvermögens, neurodegenerativer Störungen sowie zur Neuroprotektion oder Steigerung der Erkenntnisfähigkeit.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sich auch von Nutzen zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Inhibierung der entzündlichen Darmerkrankung, ulzerativen Proktitis, Crohn-Krankheit und Kolitis, mit der Menopause zusammenhängender Zustände wie vasomotorischer Symptome einschließlich Hitzewallungen, der vaginalen oder vulvären Atrophie, atrophischen Vaginitis, vaginalen Trockenheit, des Pruritus, der Dyspareunie, Dysurie, Pollakiurie, Harninkontinenz, Infektionen des Harntrakts, vasomotorischer Symptome einschließlich Hitzewallungen, Myalgie, Arthralgie, Schlaflosigkeit, Reizbarkeit und Ähnliches; des Haarausfalls beim Mann, der Hautatrophie; Akne; des Typ-2-Diabetes, der dysfunktionellen Uterusblutung oder Infertilität.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sich auch von Nutzen bei Krankheitszuständen, bei denen Amenorrhö von Vorteil ist, wie bei Leukämie, Endometriumablationen, einem chronischen Nieren- oder Leberleiden oder Koagulopathien.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Kontrazeptiva, insbesondere in Kombination mit einem Progestin, eingesetzt werden.
Bei der Verabreichung zur Behandlung oder Inhibierung eines besonderen Krankheitszustands oder einer Störung ist es selbstverständlich, dass die wirksame Dosis von der besonderen applizierten Verbindung, dem Verabreichungsmodus, der Bedingung und deren Schwere, dem zu behandelnden Zustand sowie von verschiedenen physischen Faktoren abhängt, die mit dem zu behandelnden Individuum zusammen hängen. Die wirksame Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in einer oralen Dosis von 0,1 mg/Tag bis 1.000 mg/Tag betragen. Vorzugsweise beträgt die Verabreichung von 10 mg/Tag bis 600 mg/Tag, bevorzugter von 50 mg/Tag bis 600 mg/Tag, in einer Einzeldosis oder in zwei oder mehreren aufgeteilten Dosierungen. Man geht davon aus, dass die vorgesehenen Tagesdosierungen mit der Verabreichungsroute variieren.
Solche Dosen können auf eine Weise verabreicht werden, die zweckmäßig ist, um die erfindungsgemäßen aktiven Verbindungen in den Blutstrom des Empfängers zu leiten, einschließlich der oralen Verabreichung, über Implantate, der parenteralen (einschließlich intravenöser, intraperitonealer und subkutaner Injektionen), rektalen, intranasalen, vaginalen und transdermalen Verabreichung.
Orale Zubereitungen, die die aktiven erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, können irgendwelche herkömmlich verwendete orale Formen annehmen, einschließlich Tabletten, Kapseln, Lutschtabletten in verschiedenen Formen wie Pastillen oder Rauten, und oral einzunehmende Flüssigkeiten, Suspensionen oder Lösungen. Kapseln können Mixturen der aktiven Verbindung(en) mit inerten Füllstoffen und/oder Verdünnungsmitteln enthalten wie pharmazeutisch annehmbare Stärken (z. B. Mais-, Kartoffel- oder Tapiokastärke), Zuckerarten, künstliche Süßstoffe, pulverisierte Cellulosen, wie kristalline und mikrokristalline Cellulosen, Mehlsorten, Gelatinen, Gummis usw. Brauchbare Tablettenzubereitungen können mittels herkömmlicher Kompression, nasser oder trockener Granulationsmethoden hergestellt werden und pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel, Bindemittel, Schmiermittel, Zerkleinerungsmittel, Oberflächen-modifizierende Mittel (einschließlich Tenside), Suspendiermittel oder Stabilisatoren, einschließlich zum Beispiel Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talk, Natriumlaurylsulfat, mikrokristalliner Cellulose, Carboxymethylcellulose, Calcium, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Alginsäure, Gummi arabicum, Xanthangummi, Natriumcitrat, Komplexsilikate, Calciumcarbonat, Glycin, Dextrin, Saccharose, Sorbitol, Dicalciumphosphat, Calciumsulfat, Lactose, Kaolin, Mannit, Natriumchlorid, Talk, trockene Stärken und pulverisierten Zucker enthalten. Bevorzugte Oberflächen-modifizierende Agenzien umfassen nicht-ionische und anionische Oberflächen-modifizierende Agenzien. Repräsentative Beispiele Oberflächen-modifizierender Agenzien umfassen beispielsweise Poloxamer 188, Benzalkoniumchlorid, Calciumstearat, Cetostearl Alkohol, Cetomacrogol emulsifizierendes Wachs, Sorbitanester, Kolloidolsilicondioxid, Phosphate, Natriumdodecylsulfat, Magnesiumaluminiumsilikat und Triethanolamin. Orale erfindungsgemäße Zubereitungen können Formulierungen verwenden, die verzögert oder über einen gewissen Zeitraum freigesetzt werden, um die Absorption der aktiven Verbindung(en) zu verändern. Die orale Zubereitung kann auch in der Verabreichung des aktiven Wirkstoffs in Wasser oder in einem Obstsaft bestehen und geeignete Lösungsvermittler oder Emulgatoren je nach Bedarf beinhalten.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Verbindungen in Form eines Aerosols direkt in die Luftwege zu verabreichen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Lösungen oder Suspensionen dieser aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch annehmbares Salz können in Wasser zubereitet werden, das auf geeignete Weise mit einem Tensid wie Hydroxypropylcellulose vermischt ist. Dispersionen können auch in Glyzerin, flüssigen Polyethylenglykolen und Mixturen davon in Ölen zubereitet werden. Unter normalen Lager- und Benutzungsbedingungen enthalten diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Formen, die für die injizierbare Anwendung geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muss die Form steril und in einem Grad flüssig sein, dass ein leichtes Aufziehen in die Spritze gegeben ist. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und vor der kontaminierenden Aktion von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen bewahrt werden. Der Träger kann ein Lösungs- oder Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glyzerin, Propylenglykol und flüssigen Polyethylenglykol), geeignete Mixturen davon und pflanzliche Öle enthält.
Zum Zweck dieser Offenlegung umfasst der Begriff der transdermalen Verabreichungen alle Verabreichungen durch die Oberfläche des Körpers und die Innenverkleidungen der körperlichen Passagen einschließlich epithelialer und muköser Gewebe. Solche Verabreichungen können unter Verwendung der vorliegenden Verbindungen oder pharmazeutisch annehmbarer Salze davon in Form von Lotionen, Cremes, Schäumen, Pflastern, Suspensionen, Lösungen und (rektalen und vaginalen) Suppositorien durchgeführt werden.
Die transdermale Verabreichung kann mittels Verwendung eines transdermalen Pflasters erfolgen, das die aktive Verbindung und einen Träger enthält, der für die aktive Verbindung inert und für die Haut nicht-toxisch ist, und die Freisetzung des Wirkstoffs zur systemischen Absorption in den Blutstrom über die Haut ermöglicht. Der Träger kann irgendeine der Vielzahl der Formen wie Cremes und Salben, Pasten, Gele und Verschlussartikel annehmen. Cremes und Salben müssen viskösflüssige oder halbfeste Emulsionen entweder der Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Form sein. Pasten, die aus absorptiven Pulvern bestehen, die in Petroleum oder hydrophilem Petroleum fein verteilt sind und den aktiven Wirkstoff enthalten, können auch geeignet sein. Eine Vielfalt von Verschlussartikeln kann verwendet werden, um den aktiven Wirkstoff in den Blutstrom freizusetzen, wie eine semipermeable Membran, die ein Behältnis bedeckt, das den aktiven Wirkstoff mit einem Träger oder ohne einen solchen enthält, oder eine Matrix, die den aktiven Wirkstoff enthält. Weitere Verschlussartikel sind in der Literatur bekannt.
Präparate in Form von Suppositorien können aus traditionellen Materialien hergestellt sein, einschließlich Kakaobutter, mit Zugabe von Wachsen oder ohne eine solche, um den Schmelzpunkt der Suppositorien zu verändern, und Glyzerin. Wasserlösliche Suppositoriengrundlagen wie Polyethylenglykole verschiedener Molekularmassen können auch verwendet werden.
Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendeten Reagenzien können entweder im Handel bezogen oder mittels in der Literatur beschriebener Standardverfahren zubereitet werden.
Die Herstellung mehrerer repräsentativer Beispiele dieser Erfindung ist in den folgenden Schemata 1 bis 11 beschrieben. Schema 1
Schema 2
Schema 3
Schema 4
Schema 5
Schema 6
Schema 7
Schema 8
Schema 9
Schema 10
Schema 11
Beispiel 1
4-tert-Butyl-Dimethylsilyoxyphenyl-Borsäure
Methode A. Zu einer Lösung von (4-Brom-Phenoxy)-tert-Butyldimethylsilan (20 ml, 23,48 g, 0,082 mol) in Tetrahydrofuran (200 ml) bei –78 °C wurde n-Butyllithium (39,2 ml von 2,5 M Lösung in Hexan, 0,098 mol) unter N₂ bei Rühren während weniger Minuten langsam zugefügt. Die Lösung wurde für 1 Stunde gerührt und Triisopropylborat (66,2 ml, 54,0 g, 0,29 mol) mittels Spritze bei –78 °C zugefügt. Die Lösung wurde für 1 Stunde bei –78 °C gerührt und dann ließ man sie auf Raumtemperatur über Nacht erwärmen. Die Reaktion wurde auf 0 °C abgekühlt und Wasser (20 ml) und 2 N HCl (20 ml) wurden der Reaktionsmixtur zugefügt. Dann wurde die gesamte Mixtur mit 2 N HCl (360 ml) für 10 Minuten gerührt. Die Mixtur wurde mit Ethylacetat (3 × 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden zu einem Volumen von etwa 50 ml konzentriert. Die Kristallisation wurde mit kaltem Hexan induziert und das feste Produkt durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet, um 14,5 g (70%) der Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben: ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 0,19 (6H, s), 0,94 (9H, s), 6,80 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,36 Hz), 7,87 (2H, s).
Beispiel 2
4'-Hydroxy-3-Methyl[1,1'-Biphenyl]-4-Carbonitril
Methode B. Eine Mixtur von 4-Brom-2-Methylbenzonitril (1,8 g, 9,18 mmol), 4-tert-Butyl-Dimethylsilyoxyphenyl-Borsäure (3,0 g, 11,9 mmol), Natriumcarbonat (13,8 ml von 2 M wässriger Lösung, 27,5 mmol), Tetrakis(Triphenylphosphin)Palladium (0,53 g, 0,46 mmol) und Ethylenglycoldimethylether (70 ml) wurden auf Reflux über Nacht erhitzt. Die Mixtur wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und in Wasser gegossen, dann mit Ethylacetat (3 ×) extrahiert, mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel verdampft. Die Reinigung durch Silikachromatographie (15%-25% Ethylacetat-Hexan) ergab 1,81 g (94%) der Titelverbindung als gelblichen Feststoff: Schmelzpunkt 177-178 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 2,52 (3H, s), 6,88 (2H, d, J = 8,50 Hz), 7,60 (3H, d, J = 8,49 Hz), 7,71 (1H, s), 7,77 (2H, d, J = 8,12 Hz), 9,79 (1H, s); IR 2220 cm^–1; MS (ESI) m/z 208 (M-H)^–.
Analyse für C₁₄H₁₁NO:
Errechnet: C: 80,36, H: 5,30, N: 6,69
Ergebnis: C: 79,91, H: 5,27, N: 6,57.
Beispiel 3
4'-Hydroxy-3-Methyl[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd
Eine Lösung von 4'-Hydroxy-3-Methyl[1,1'-Biphenyl]-4-Carbonitril (500 mg, 2,39 mmol) in trockenem Toluen wurde auf –78 °C abgekühlt und Diisobutylaluminiumhydrid (4,0 ml von 1,5 M Lösung in Toluen, 5,98 mmol) alles auf einmal zugefügt. Die Reaktionsmixtur ließ man auf Raumtemperatur über einen Zeitraum von 3,5 h erwärmen. Methanol (1,2 ml) wurde zugefügt, gefolgt von Wasser (1,2 ml) bei 0 °C und die Mixtur bei Raumtemperatur für 20 min gerührt. 1 N HCl-Lösung wurde unter Rühren zugefügt, bis ein pH < 7 erreicht war. Die Mixtur wurde mit Ethylacetat (3 ×) extrahiert, mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel verdampft. Die Reinigung durch Silikachromatographie (15%-25% Ethylacetat-Hexan) ergab 459 mg (91%) der Titelverbindung als weißen Feststoff: Schmelzpunkt 161-162 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 2,67 (3H, s), 6,88 (2H, d, J = 8,41 Hz), 7,59-7,65 (4H, m), 7,85 (1H, d, J = 8,03 Hz), 9,78 (1H, s), 10,22 (1H, s); IR 1680 cm^–1; MS (ESI) m/z 211 (M-H)^–.
Analyse für C₁₄H₁₂O₂:
Errechnet: C: 79,23, H: 5,70
Ergebnis: C: 78,79, H: 5,90.
Beispiel 4
4'-{[tert-Butyl(Dimethyl)Silyl]oxy}-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 4-Brombenzaldehyd (730 mg, 3,97 mmol) mit 4-tert-Butyl-Dimethylsilyoxyphenyl-Borsäure (1,3 g, 5,16 mmol) nach der Methode B zubereitet, um 600 mg (48%) eines weißen Kristalls zu ergeben: ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 0,24 (6H, s), 1,01 (9H, s), 6,94 (2H, d, J = 8,54 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,56 Hz), 7,72 (2H, d, J = 8,19 Hz), 7,93 (2H, d, 8,20 Hz), 10,04 (1H, s).
Beispiel 5
4'-Hydroxy[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd
Eine Mixtur von 4'-{[tert-Butyl(Dimethyl)Silyl]oxy}-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (320 mg, 1,03 mmol), wasserfreiem KF (120 mg, 2,06 mmol) und 48% wässriger HBr (35 ul, 0,31 mmol) in 6 ml trockenem DMF wurde bei Raumtemperatur unter N₂ für 1 h gerührt. Die TLC zeigte das vorhandene Ausgangsmaterial an und daher wurden weitere 48% wässriger HBr (35 ul, 0,31 mmol) zu der Reaktion zugefügt und die Mixtur weitere 1,5 h gerührt. Dann wurde die Mixtur unter Abkühlen in 1 N wässriger HCl (30 ml) gegossen. Die wässrige Mixtur wurde mit EtOAc (3 ×) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Das Lösemittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und das Produkt (100%) direkt beim nächsten Schritt verwendet. ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 6,89 (2H, d, J = 8,43 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,46 Hz), 7,83 (2H, d, J = 8,16 Hz), 7,94 (2H, d, J = 8,02 Hz), 9,79 (1H, s), 10,01 (1H, s).
Beispiel 6
Trifluormethansulfonsäure 3-Chlor-4-Formylphenylester
Methode D. Zu einer Lösung von 2-Chlor-4-Hydroxybenzaldehyd (1,31 g, 8,4 mmol) und Pyridin (1,1 ml, 13,4 mmol) in 80 ml Dichlormethan bei 0 °C wurde Trifluormethansulfon-Anhydrid (1,84 ml, 3,08 g, 10,9 mmol) zugefügt. Die Lösung ließ man langsam auf Raumtemperatur erwärmen und rührte sie für 2,5 h. Die Lösung wurde auf 0 °C abgekühlt und mit Eiswasser gerührt, um jegliches überschüssiges Anhydrid aufzulösen. Die Mixtur wurde leicht basifiziert durch Zugabe einer gesättigten Natriumbicarbonat-Lösung. Die resultierenden Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel wurde unter Vakuum entfernt, um ein orangefarbenes Öl zu erhalten, das durch Silikachromatographie (5% Ethylacetat-Hexane) gereinigt wurde, um 1,83 g (76%) der Titelverbindung als ein klares farbloses Öl zu erhalten: ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7,73 (1H, dd, J = 2,35 Hz, J = 8,64 Hz), 8,04-8,07 (2H, m), 10,30 (1H, s).
Beispiel 7
Trifluormethansulfonsäure 2-Fluor-4-Formylphenylester
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 3-Fluor-4-Hydroxybenzaldehyd (1,2 g, 8,56 mmol) mit Trifluormethansulfon-Anhydrid (1,87 ml, 3,14 g, 11,1 mmol) nach der Methode D zubereitet, um ein gelbes Öl zu erhalten, das beim nächsten Schritt direkt ohne Reinigung verwendet wurde: ¹H NMR (CDCl₃): δ 7,53-7,58 (1H, m), 7,77-7,85 (2H, m), 10,01 (1H, d, J = 1,45 Hz).
Beispiel 8
4'-{[tert-Butyl(Dimethyl)Silyl]oxy}-3-Chlor-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von Trifluormethansulfonsäure 3-Chlor-4-Formylphenylester (1,78 g, 6,18 mmol) mit 4-tert-Butyl-Dimethylsilyoxyphenyl-Borsäure (2,03 g, 8,03 mmol) nach der Methode B zubereitet, um 0,92 g (43%) eines weißen Feststoffs zu ergeben: Schmelzpunkt 38-39 °C; ¹H NMR (DMDO-d₆): δ 0,23 (6H, s), 0,97 (9H, s), 6,98 (2H, d, J = 8,79 Hz), 7,74 (2H, d, J = 8,79 Hz), 7,81 (1H, d, J = 7,81 Hz), 7,89 (1H, d, J = 1,95 Hz), 7,91 (1H, d, J = 7,81 Hz), 10,34 (1H, s); MS (ESI) m/z 231/233 (M-H)^– (entschütztes Produkt-Ion).
Analyse für C₁₉H₂₃ClO₂Si:
Errechnet: C: 65,78, H: 6,68
Ergebnis: C: 65,59, H: 6,60.
Beispiele 9 und 10
Trifluormethansulfonsäure 2-Fluor-4-Formylphenylester (2,1 g, 7,72 mmol) wurde mit 4-tert-Butyl-Dimethylsilyoxyphenyl-Borsäure (2,14 g, 8,49 mmol) nach der Methode B reagiert, um die folgenden zwei Verbindungen zu produzieren:
4'-{[tert-Butyl(Dimethyl)Silyl]oxy}-2-Fluor-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd

1,62 g (63%) eines wachsartigen gelblichen Feststoffs: ¹H NMR (Aceton-d₆): δ 0,28 (6H, s), 1,02 (9H, s), 7,02-7,06 (2H, m), 7,57-7,60 (2H, m), 7,71-7,78 (2H, m), 7,85 (1H, dd, J = 7,91 Hz, J = 1,51 Hz), 10,07 (1H, d, J = 1,73 Hz); ¹³C NMR (Aceton-d₆): δ –4,29, 18,80, 26,00, 116,82 (d, J = 23,90 Hz), 121,15, 126,69 (d, J = 3,25 Hz), 128,42 (d, 1,21 Hz), 131,30 (d, J = 3,48 Hz), 132,20 (d, J = 3,44 Hz), 135,27 (d, J = 13,61), 138,09 (d, J = 6,64 Hz), 157,23, 160,68 (d, J = 248,56 Hz), 191,51; IR 1692 cm^–1; MS (ESI) m/z 331 (M+H)⁺, 372 (M+H+ACN)⁺.
Analyse für C₁₉H₂₃FO₂Si:
Errechnet: C: 69,06 H: 7,02
Ergebnis: C: 69,71 H: 7,34.

2-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd

0,32 g (19%) eines gelblichen Feststoffs: Schmelzpunkt 149-150 °C; ^1H NMR (Aceton-d₆): δ 7,08-7,13 (2H, m), 7,62-7,67 (2H, m), 7,80-7,91 (2H, m), 7,94 (1H, dd, J = 7,92 Hz, J = 1,58 Hz), 8,93 (1H, s), 10,16 (1H, d, J = 1,73 Hz); IR 1669 cm^–1; MS (ESI) m/z 215 (M-H)^–1.
Analyse für C₁₃H₉FO₂:
Errechnet: C: 72,22, H: 4,20
Ergebnis: C: 71,38, H: 4,12.

Beispiel 11
4'-{[tert-Butyl(Dimethyl)Silyl]oxy}-3-Chlor[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 4'-{[tert-Butyl(Dimethyl)Silyl]oxy}-3-Chlor-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (405 mg, 1,17 mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (154 mg, 2,22 mmol) nach der Methode C zubereitet, um ein gelbliches Öl zu erhalten, das beim nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet wurde: MS (ESI) m/z 362/364 (M+H)⁺.
Beispiel 12
4'-{[Tert-Butyl(Dimethyl)Silyl]oxy}-2-Fluor-(1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 4'-{[tert-Butyl(Dimethyl)Silyl]oxy}-2-Fluor-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (450 mg, 1,36 mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (190 mg, 2,73 mmol) nach der Methode C zubereitet, um einen weißen Feststoff zu erhalten, der beim nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet wurde: MS (ESI) m/z 344 (M-H)^–, 346 (M+H)⁺.
Beispiel 13
3-Fluor-4'-Methoxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 4-Brom-2-Fluorbenzaldehyd (3 g, 14,8 mmol) mit 4-Methoxyphenylborsäure (2,70 g, 17,8 mmol) nach der Methode B zubereitet, um 3,2 g (94%) eines weißen Feststoffs zu erhalten: Schmelzpunkt 85-86 °C; ^1H NMR (DMSO-d₆): δ 3,83 (3H, s), 7,06-7,09 (2H, m), 7,70-7,75 (2H, m), 7,79-7,82 (2H, m), 7,88 (1H, t, J = 7,96 Hz), 10,22 (1H, s); IR 1681 cm^–1; MS (ESI) m/z 231 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₄H₁₁FO₂:
Errechnet: C: 73,03, H: 4,82
Ergebnis: C: 72,99, H: 4,73.
Beispiel 14
3-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
Methode F. Zu einer Mixtur von 3-Fluor-4'-Methoxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (0,986 g, 4,29 mmol) in Methylenchlorid (35 ml) bei 0 °C wurde Bortribromid (10,7 ml von 1 N Lösung in Methylenchlorid, 10,7 mmol) langsam zugefügt. Die Mixtur ließ man langsam auf Raumtemperatur erwärmen und rührte sie über Nacht. Wasser (4 ml) wurde in die Mixtur unter Rühren im Eiswasserbad injiziert. Die resultierende Mixtur wurde in Wasser gegossen und mit Ethylacetat (3 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Verdampfung des Lösemittels und Reinigung durch Silikasäulenchromatographie (15%-30% Ethylacetat-Hexan) ergaben 150 mg (16%) der Titelverbindung als weißen Feststoff. Eine analytische Probe wurde durch präparative Reverse-Phasen-HPLC erhalten: Schmelzpunkt 164-166 °C; 1H NMR (Aceton-d₆); δ 76,98-7,01 (2H, m), 7,56 (1H, dd, J = 12,49 Hz, J = 1,64 Hz), 7,63-7,66 (1H, m), 7,67-7,70 (2H, m), 7,89 (1H, t, J = 7,85 Hz), 8,88 (1H, bs), 10,31 (1H, s); MS (ESI) m/z 215 (M-H)^–.
Analyse für C₁₃H₉FO₂:
Errechnet: C: 72,22, H: 4,20
Ergebnis: C: 71,83, H: 4,04.
Beispiel 15
Trifluormethansulfonsäure 2-Chlor-4-Formylphenylester
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 3-Chlor-4-Hydroxybenzaldehyd (5 g, 31,9 mmol) mit Trifluormethansulfonanhydrid (7,0 ml, 11,7 g, 41,5 mmol) nach der Methode D zubereitet, um 9,15 g (100%) eines gelben Öls zu erhalten, das direkt beim nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet wurde: 1H NMR: δ 7,92 (1H, d, J = 8,48 Hz), 8,07 (1H, dd, J = 8,51 Hz, J = 1,93 Hz), 8,30 (1H, d, J = 1,92 Hz), 10,04 (1H, s).
Beispiel 16
2-Chlor-4'-Methoxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion des Trifluormethansulfonsäure 2-Chlor-4-Formylphenylesters (5 g, 17,4 mmol) mit 4-Methoxyphenylborsäure (3,44 g, 22,6 mmol) nach der Methode B zubereitet, um 3,83 g (89%) eines weißen Feststoffs zu erhalten: Schmelzpunkt 85-87 °C; ^1H NMR (DMSO-d₆): δ 3,82 (3H, s), 7,07 (2H, d, J = 8,83 Hz), 7,46 (2H, d, J = 8,45 Hz), 7,63 (1H, d, J = 7,87 Hz), 7,92 (1H, dd, J = 7,87 Hz, J = 1,56 Hz), 8,07 (1H, d, J = 1,49 Hz); ¹³C NMR(DMSO-d₆): δ 55,14, 113,72, 127,80, 129,72, 130,42, 130,82, 132,15, 132,21, 136,11, 144,90, 159,33, 191,73; IR 1692 cm ¹; MS (EI) m/z 246/248 M⁺.
Analyse für C₁₄H₁₁ClO₂:
Errechnet: C: 68,16 H: 4,49
Ergebnis: C: 67,76 H: 4,36.
Beispiel 17
2'-Chlor-4'-(Dibrommethyl)-1,1'-Biphenyl-4-ol
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 2-Chlor-4'-Methoxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (800 mg, 3,25 mmol) mit Bortribromid (8,1 ml von 1 N Lösung in Methylenchlorid, 8,13 mmol) nach der Methode F zubereitet, um 600 mg (50%) eines gelblichen Feststoffs zu erhalten: Schmelzpunkt 107-108 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 6,86 (2H, d, J = 8,52 Hz), 7,29 (2H, d, J = 8,50 Hz), 7,43 (1H, s), 7,45 (1H, d, J = 8,12 Hz), 7,64 (1H, dd, J = 8,07 Hz, J = 1,83 Hz), 7,74 (1H, d, J = 1,79 Hz), 9,71 (1H, bs); ¹³C NMR (DMSO-d₆): δ 40,66, 114,94, 125,66, 127,34, 128,14, 130,39, 130,87, 131,80, 140,95, 142,14, 157,36; MS (ESI) m/z 373/375/377/379 (M- H)^–.
Analyse für C₁₃H₉Br₂ClO:
Errechnet: C: 41,48, H: 2,41
Ergebnis: C: 41,64, H: 2,14.
Beispiel 18
Trifluormethansulfonsäure 4-Formyl-3-Methoxyphenylester
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 4-Hydroxy-2-Methoxybenzaldehyd (3 g, 19,7 mmol) mit Trifluormethansulfonanhydrid (4,3 ml, 7,2 g, 25,6 mmol) nach der Methode D zubereitet, um einen braunen Sirup zu erhalten, der beim nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet wurde: ¹H NMR: δ 3,97 (3H, s), 7,21 (1H, dd, J = 8,64 Hz, J = 2,17 Hz), 7,47 (1H, d, J = 2,24 Hz), 7,87 (1H, d, J = 8,64 Hz), 10,31 (1H, s).
Beispiel 19
Trifluormethansulfonsäure 4-Formyl-2-Methylphenylester
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 4-Hydroxy-3-Methylbenzaldehyd (2,5 g, 18,4 mmol) mit Trifluomiethansulfonanhydrid (4,0 ml, 6,75 g, 23,9 mmol) nach der Methode D zubereitet, um ein braunes Öl zu erhalten, das ohne Reinigung direkt beim nächsten Schritt verwendet wurde.
Beispiel 21
4'-Hydroxy-2-Methyl-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion des Trifluormethansulfonsäure 4-Formyl-2-Methylphenylesters (9,3 mmol) mit 4-tert-Butyl-Dimethylsilyoxyphenylborsäure (2,35 g, 9,3 mmol) nach der Methode B zubereitet, um 1,12 mg (57%, in zwei Schritten) eines gelblichen Feststoffs zu erhalten: Schmelzpunkt 94-96 °C; 1H NMR (DMSO-d₆): δ 2,33 (3H, s), 6,86 (2H, d, J = 8,55 Hz), 7,22 (2H, d, J = 8,51 Hz), 7,39 (1H, d, J = 7,81 Hz), 7,61 (1H, d, J = 7,82 Hz), 7,81 (1H, s), 9,65 (1H, s), 10,00 (1H, s); IR 1670 cm^–1; MS (ESI) m/z 211 (M-H)^–, 213 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₄H₁₂O₂:
Errechnet: C: 79,23 H: 5,70
Ergebnis: C: 77,49 H: 5,67.
Beispiel 22
3-Fluor-4-Methoxyphenylborsäure
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 4-Brom-2-Fluoranisol (10 g, 0,049 mol) mit n-Butyllithium (23,4 ml von 2,5 M Lösung in Hexan, 0,059 mol), gefolgt von Triisopropylborat (45,2 ml, 36,9 g, 0,196 mol) nach der Methode A zubereitet, um 7,1 g (85,2%) eines weißen Feststoffs zu ergeben: MS (ESI) m/z 169 (M-H)^–.
Beispiel 23
3-Chlor-3'-Fluor-4'-Methoxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion des Trifluormethansulfonsäure 3-Chlor-4-Formylphenylesters (2,8 g, 9,62 mmol) mit 3-Fluor-4-Methoxyphenylborsäure (1,8 g, 10,6 mmol) nach der Methode B zubereitet, um 1,87 g (74%, in zwei Schritten) eines weißen Feststoffs zu erhalten: Schmelzpunkt 116-118 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 3,91 (3H, s), 7,30 (1H, t, J = 8,79 Hz), 7,66-7,68 (1H, m), 7,79 (1H, dd, J = 12,91 Hz, J = 2,47 Hz), 7,85-7,87 (1H, m), 7,91 (1H, d, J = 8,24 Hz), 7,96 (1H, d, J = 1,65 Hz), 10,34 (1H, s); IR 1688 cm^–1; MS (ESI) m/z 265/267 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₄H₁₀ClFO₂:
Errechnet: C: 63,53, H: 3,81
Ergebnis: C: 63,29, H: 3,63.
Beispiel 24
3-Chlor-3'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 3-Chlor-3'-Fluor-4'-Methoxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (990 mg, 3,75 mmol) mit Bortribromid (11,25 ml of 1 N Lösung in Methylenchlorid, 11,25 mmol) nach der Methode F zubereitet, um 940 mg (100%) eines gelblichen Feststoffs zu erhalten. Die Verbindung wurde beim nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet. Die analytische Probe wurde durch HPLC-Reinigung erhalten: Schmelzpunkt 206-208 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 7,06 (1H, t, J = 8,79 Hz), 7,51-7,53 (1H, m), 7,71 (1H, dd, J = 2,47 Hz, J = 12,63 Hz), 7,81-7,83 (1H, m), 7,89 (1H, d, J = 7,96 Hz), 7,91 (1H, d, J = 1,66 Hz), 10,329 (1H, s), 10,330 (1H, s); IR 1667 cm ¹; MS (ESI) m/z 249/251 (M-H)^–.
Analyse für C₁₃H₈ClFO₂:
Errechnet: C: 62,29, H: 3,22
Ergebnis: C: 61,97, H: 3,21.
Beispiel 25
3-Chlor-3',5'-Difluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion des Trifluormethansulfonsäure 3-Chlor-4-Formylphenylesters (1 g, 3,5 mmol) mit 3,5-Difluor-4-tert-Butyldimethylsilyoxyborsäure (1,1 g, 3,8 mmol) nach der Methode B zubereitet, um 0,56 g (60%) eines gelben Feststoffs zu erhalten: Schmelzpunkt 233-235 °C; 1H NMR (DMSO-d₆): δ 7,64 (2H, d, J = 7,85 Hz), 7,85-7,91 (2H, m), 7,98 (1H, s), 10,33 (1H, s), 10,70 (1H, bs); IR 1665 cm^–1; MS (ESI) m/z (267/269) (M-H)^–.
Analyse für C₁₃H₇ClF₂O₂:
Errechnet: C: 58,12, H: 2,63
Ergebnis: C: 57,79, H: 2,72.
Beispiele 26 und 27
Trifluormethansulfonsäure 3-Chlor-4-Formylphenylester (3,78 g, 13,12 mmol) wurde mit 4-Methoxy-2-Methylphenylborsäure (2,61 g, 15,7 mmol) nach der Methode B reagiert, um zwei Verbindungen zu produzieren:
3-Chlor-4'-Methoxy-2'-Methyl-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
2,18 g (64%) weißen Feststoffs: Schmelzpunkt: 77-79 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 2,26 (3H, s), 3,79 (3H, s), 6,88 (1H, dd, J = 8,41 Hz, J = 2,66 Hz), 6,93 (1H, d, J = 2,50 Hz), 7,23 (1H, J = 8,40 Hz), 7,50 (1H, dd, J = 7,93 Hz, J = 1,32 Hz), 7,58 (1H, d, J = 1,53 Hz), 7,91 (1H, d, J = 7,57 Hz), 10,36 (1H, s); IR 1682 cm^–1; MS (ESI) m/z 261/263 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₅H₁₃ClO₂:
Errechnet: C: 69,10, H: 5,03
Ergebnis: C: 69,13, H: 4,73.
4,4''-Dimethoxy-2,2''-Dimethyl-1,1':3',1''-Terphenyl-4'-Carbaldehyd
0,56 g (12%) farblos; ¹H NMR(DMSO-d₆): δ 2,10 (3H, s), 2,29 (3H, s), 3,78 (3H, s), 3,80 (3H, s), 6,85-6,88 (2H, m), 6,91 (1H, d, J = 2,38 Hz), 6,95 (1H, d, J = 2,38 Hz), 7,18 (1H, d, J = 8,32 Hz), 7,24-7,25 (2H, m), 7,52 (1H, dd, J = 7,74 Hz, J = 1,78 Hz), 7,95 (1H, d, J = 8,33 Hz), 9,68 (1H, s); IR 1679 cm^–1; MS (ESI) m/z 347 (M+H)⁺.
Analyse für C₂₃H₂₂O₃:
Errechnet: C: 79,74, H: 6,40
Ergebnis: C: 79,25, H: 6,05.
Beispiel 28
3-Chlor-4'-Hydroxy-2'-Methyl-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
3-Chlor-4'-Methoxy-2'-Methyl-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (1,0 g, 3,84 mmol) und Pyridinium-HCl (6 g) wurden in einem versiegelten Röhrchen auf 195 °C unter Rühren für 1 h erhitzt. Die Reaktionsmixtur wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 2 N HCl-Lösung und Ethylacetat gerührt. Die organische Schicht wurde getrennt und die wässrige Schicht mit Ethylacetat (2 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und die Verdampfung des Lösemittels lieferte einen dunkelgrünen Feststoff (1 g). Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Eine analytische Probe wurde durch HPLC-Reinigung erhalten, die einen weißen Feststoff ergab; Schmelzpunkt 125-127 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 2,21 (3H, s), 6,68-6,72 (2H, m), 7,11 (1H, d, J = 8,15 Hz), 7,47 (1H, d, J = 7,89 Hz), 7,55 (1H, d, J = 1,48 Hz), 7,89 (1H, d, J = 7,98 Hz), 9,62 (1H, s), 10,2 = 35 (1H, s); MS (ESI) m/z 245/247 (M-H)^–, 247/249 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₄H₁₁ClO₂:
Errechnet: C: 68,16, H: 4,49
Ergebnis: C: 67,63, H: 4,43.
Beispiel 29
4'-Hydroxy-3-Methyl[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd-Oxim
Eine Mixtur von 4'-Hydroxy-3-Methyl[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd (310 mg, 1,46 mmol), Hydroxylaminhydrochlorid (203 mg, 2,92 mmol) und Pyridin (236 ul, 2,92 mmol) in 15 ml reinen Methanols wurde für 2,5 h zum Rückfluss erhitzt. Das Lösemittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und die Mixtur in Ethylacetat und Wasser aufgelöst, mit Ethylacetat extrahiert (3 ×), mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Verdampfung des Lösemittels und Reinigung durch Rekristallisation (Ethylacetat, Aceton und Hexan) ergaben 177 mg (53%) der Titelverbindung als gelblichen Feststoff: Schmelzpunkt 195-197 °C;
¹H NMR (DMSO-d₆): δ 2,43 (3H, s), 6,84 (2H, d, J = 8,48 Hz), 7,42-7,45 (2H, m), 7,52 (2H, d, J = 8,51 Hz), 7,66 (1H, d, J = 8,00 Hz), 8,32 (1H, s), 9,60 (1H, s), 11,25 (1H, s);
¹³C NMR(DMSO-d₆): δ 19,62, 115,60, 123,40, 126,60, 127,56, 127,99, 129,05, 130,03, 136,34, 140,43, 146,80, 157,24; MS (ESI) m/z 226 (M-H)^–, 228 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₄H₁₃NO₂:
Errechnet: C: 73,99, H: 5,77, N: 6,16
Ergebnis: C: 73,81, H: 5,75, N: 6,04.
Beispiel 30
4'-Hydroxy[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 4'-Hydroxy[1,1'-Biphenyl]-4- Carbaldehyd (1,03 mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (140 mg, 2 mmol) nach der Methode C zubereitet, um 193 mg (79% in zwei Schritten) eines gelblichen Feststoffs zu ergeben: Schmelzpunkt 207-210 °C;
¹H NMR (DMSO-d₆): δ 6,85 (2H, d, J = 8,37 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,39 Hz), 7,62 (4H, s), 8,15 (1H, s), 9,62 (1H, s), 11,21 (1H, s); MS (ESI) m/z 212 (M-H)^–.
Analyse für C₁₃H₁₁NO₂:
Errechnet: C: 73,23, H: 5,20, N: 6,57
Ergebnis: C: 72,78, H: 5,41, N: 6,38.
Beispiel 31
3-Chlor-4'-Hydroxy[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd-Oxim
Methode E. Tetrabutylammoniumfluorid (1,29 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 1,29 mmol) wurde zu einer Lösung von 4'-{[tert-Butyl(Dimethyl)Silyl]oxy}-3-Chlor[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd-Oxim (1,17 mmol) in 10 ml Tetrahydrofuran zugefügt. Die Mixtur wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt, dann in Ethylacetat und Wasser gegossen. Die resultierenden Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat (3 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel unter Vakuum entfernt. Die Reinigung durch Silikachromatographie (20%-30% Ethylacetat-Hexan) lieferte 0,186 mg (64%) der Titelverbindung als gelblichen Feststoff: Schmelzpunkt 187-189 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 6,86 (2H, d, J = 8,55 Hz), 7,56-7,63 (3H, m), 7,71 (1H, d, J = 1,60 Hz), 7,84 (1H, d, J = 8,26 Hz), 8,36 (1H, s), 9,75 (1H, s), 11,66 (1H, s); MS (ESI) m/z 246 (M-H)^–, 248 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₃H₁₀ClNO₂:
Errechnet: C: 63,04, H: 4,07, N: 5,66
Ergebnis: C: 62,96, H: 4,10, N: 5,42.
Beispiel 32
2-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 4'-{[tert-Butyl(Dimethyl)Silyl]oxy}-2-Fluor-[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd-Oxim (1,02 mmol) mit Tetrabutylammoniumfluorid (1,12 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran, 1,12 mmol) nach der Methode E zubereitet, um 198 mg (84%) eines weißen Feststoffs zu liefern: Schmelzpunkt 178-180 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 6,84-6,89 (2H, m), 7,39-5,54 (5H, m), 8,17 (1H, s), 9,71 (1H, s), 11,43 (1H, s); MS (ESI) m/z 230 (M-H)^–, 232 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₃H₁₀FNO₂:
Errechnet: C: 67,53, H: 4,36, N: 6,06
Ergebnis: C: 67,13, H: 4,11, N: 6,00.
Beispiel 33
3-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 3-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (154 mg, 0,713 mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (99 mg, 1,43 mmol) nach der Methode C zubereitet, um 156 mg (95%) eines gelblichen Feststoffs zu erhalten: Schmelzpunkt 181-183 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 6,84-6,87 (2H, m), 7,48-7,53 (2H, m), 7,57-7,60 (2H, m), 7,76 (1H, t, J = 8,14 Hz), 8,22 (1H, s), 9,74 (1H, s), 11,56 (1H, s); MS (ESI) m/z 230 (M-H)^–, 232 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₃H₁₀FNO₂:
Errechnet: C: 67,53, H: 4,36, N: 6,06
Ergebnis: C: 68,10, H: 4,28, N: 6,01.
Beispiel 34
2-Chlor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 2'-Chlor-4'-(Dibrommethyl)-1,1'-Biphenyl-4-ol (270 mg, 0,722 mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (185 mg, 2,66 mmol) nach der Methode C zubereitet, um 160 mg (90%) eines weißen Feststoffs zu liefern: Schmelzpunkt 178-179 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 6,85 (2H, d, J = 8,54 Hz), 7,28 (2H, d, J = 8,51 Hz), 7,39 (1H, d, J = 7,98 Hz), 7,60 (1H, dd, J = 7,65 Hz, J = 1,42 Hz), 7,72 (1H, d, J = 1,34 Hz), 8,18 (1H, s), 9,67 (1H, s), 11,45 (1H, s); MS (ESI) m/z 246/248 (M-H)^–.
Analyse für C₁₃H₁₀ClNO₂:
Errechnet: C: 63,04, H: 4,07, N: 5,66
Ergebnis: C: 63,07, H: 3,99, N: 5,67.
Beispiel 36
4'-Hydroxy-2-Methyl-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 4'-Hydroxy-2-Methyl-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (350 mg, 1,65 mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (230 mg, 3,30 mmol) nach der Methode C zubereitet, um 360 mg (96%) eines weißen Feststoffs zu liefern: Schmelzpunkt 169-171 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 2,25 (3H, s), 6,82 (2H, d, J = 8,52 Hz), 7,16 (2H, d, J = 8,45 Hz), 7,18 (1H, d, J = 7,84 Hz), 7,44 (1H, d, J = 7,93 Hz), 7,47 (1H, s), 8,11 (1H, s), 9,52 (1H, s), 11,19 (1H, s); MS (ESI) m/z 226 (M-H)^–, 228 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₄H₁₃NO₂:
Errechnet: C: 73,99, H: 5,77, N: 6,16
Ergebnis: C: 73,72, H: 5,63, N: 6,37.
Beispiel 37
3-Chlor-3'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 3-Chlor-3'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (1,52 mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (233 mg, 3,34 mmol) nach der Methode C zubereitet, um 260 mg (66%) eines gelblichen Feststoffs zu ergeben: Schmelzpunkt 198-200 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 7,03 (1H, t, J = 8,79 Hz), 7,41-7,43 (1H, m), 7,60 (1H, dd, J = 12,91 Hz, J = 2,20 Hz), 7,64-7,66 (1H, m), 7,77 (1H, d, J = 1,92 Hz), 7,84 (1H, d, J = 8,24 Hz), 8,36 (1H, s), 10,16 (1H, bs), 11,68 (1H, bs); MS (ESI) m/z 264/266 (M-H)^–, 266/268 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₃H₉ClFNO₂:
Errechnet: C: 58,77, H: 3,41, N: 5,27
Ergebnis: C: 58,67, H: 3,65, N: 4,99.
Beispiel 38
3-Chlor-3',5'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 3-Chlor-3',5'-Difluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (200 mg, 0,746 mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (156 mg, 2,24 mmol) nach der Methode C zubereitet, um 100 mg (47%) eines weißen Feststoffs zu liefern: Schmelzpunkt 216-219 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 7,54 (2H, d, J = 8,51 Hz), 7,70 (1H, d, J = 7,97 Hz), 7,84-7,86 (2H, m), 8,37 (1H, s), 10,52 (1H, s), 11,74 (1H, s); MS (ESI) m/z 282/284 (M-H)^–, 284/286 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₃H₈ClF₂NO₂:
Errechnet: C: 55,05, H: 2,84, N: 4,94
Ergebnis: C: 54,96, H: 3,02, N: 4,75.
Beispiel 39
3-Chlor-4'-Hydroxy-2'-Methyl-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 3-Chlor-4'-Hydroxy-2'-Methyl-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (500 mg, 2,03 mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (425 mg, 6,10 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (50 ml) und Methanol (20 ml) nach der Methode C zubereitet, um 350 mg (57% in zwei Schritten) eines weißen Feststoffs zu erhalten: Schmelzpunkt 169-171 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 2,19 (3H, s), 6,65-6,70 (2H, m), 7,06 (1H, d, J = 8,14 Hz), 7,31 (1H, d, J = 8,05 Hz), 7,41 (1H, d, J = 1,40 Hz), 7,83 (1H, d, J = 8,08 Hz), 8,38 (1H, s), 9,51 (1H, s), 11,69 (1H, s); MS (ESI) m/z 260/262 (M-H)^–, 262/264 (M+H)⁺.
Analyse errechnet für C₁₄H₁₂ClNO₂:
Errechnet: C: 64,25; H: 4,62; N: 5,35
Ergebnis: C: 63,87; H: 4,43; N: 5,31.
Beispiel 40
(2,6-Dichlor-4-Methoxyphenyl)-Methanol
Eine Mixtur von 3,5 Dichloranisol (16,39 g, 92,59 mmol), HCl (250 ml konzentrierter Lösung) und Schwefelsäure (2,5 ml konzentrierter Lösung) wurde bei 60 °C über Nacht gerührt. Die Mixtur wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die organische Schicht entfernt. Die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan (2 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen und das Lösemittel wurde durch Verdampfung entfernt. Zum verbleibenden Öl wurden NaOH (180 ml 1N Lösung) und Dioxan (85 ml) zugefügt. Die Mixtur wurde bei Reflux für 3 Stunden gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die organische Schicht wurde entfernt und die wässrige Schicht mit Dichlormethan (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, dann mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Der Rückstand wurde auf Silika (90% Hexane – 10% Ethylacetat) gereinigt, um 5,82 g (30%) der Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben: Schmelzpunkt 71-72 °C; ¹H NMR (CDCl₃): δ 1,88 (1H, s), 3,73 (3H, s), 4,81 (2H, s), 6,81 (2H, s); MS (EI) m/z 206/208/210 (M⁺).
Analyse für C₈H₈Cl₂O₂:
Errechnet: C: 46,41 H: 3,89
Ergebnis: C: 46,38 H: 3,69.
Beispiel 41
2,6-Dichlor-4-Methoxybenzaldehyd
Eine Suspension von (²,6-Dichlor-4-Methoxyphenyl)-Methanol (5,69 g, 27,49 mmol) und MnO₂ (15 g) in Benzol (100 ml) wurde bei Reflux unter Verwendung eines Dean-Stark Wasserabscheiders über Nacht gerührt. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, durch Kieselgur filtriert und das Lösemittel durch Verdampfung entfernt, um 4,69 g (83%) eines rohen weißen Feststoffs zu ergeben. Eine analytische Probe wurde durch Rekristallisation aus Methanol erhalten, um weiße Nadelkristalle zu liefern: Schmelzpunkt 104-106°C; ¹H NMR (DMSO-d6): δ 3,90 (3H, s), 7,21 (2H, s), 10,29 (1H, s); MS (EI) m/z 204/206/218 (M⁺).
Analyse für C₈H₆Cl₂O₂:
Errechnet: C: 46,86 H: 2,
Ergebnis: C: 46,67 H: 2,89.
Beispiel 42
2,6-Dichlor-4-Hydroxybenzaldehyd
Zu einer Lösung von 2,6-Dichlor-4-Methoxybenzaldehyd (3,44 g, 16,8 mmol) in Dichlormethan (120 ml) bei 0 °C wurde Bortribromid (42 ml von 1N in Dichlormethan, 42 mmol) langsam zugefügt. Die Lösung ließ man unter Rühren über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen und löschte sie mit gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung (250 ml). Die resultierende Mixtur wurde mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, dann mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösemittel wurde durch Verdampfung entfernt und der Rückstand auf Silika (70% Hexane – 30% Ethylacetat) gereinigt, um 2,19 g (68%) eines rosafarbenen Feststoffs zu liefern. Die Trituration mit Ethylacetat-Hexanen ergab eine analytische Probe der Titelverbindung als weißen Feststoff: Schmelzpunkt: 214-217 °C; ¹H NMR (DMSO-d6): δ 6,95 (2H, s), 10,26 (1H, s), 11,44 (1H, s); MS (EI) m/z 189,8/191,8/193,8 (M⁺).
Analyse für C₇H₄Cl₂O₂:
Errechnet: C: 44,02 H: 2,11
Ergebnis: C: 44,08 H: 2,07.
Beispiel 43
3,5-Dichlor-4-Formylphenyl-Trifluormethansulfonat
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 2,6-Dichlor-4-Hydroxybenzaldehyd (2,35 g, 12,3 mmol) mit Trifluormethansulfon-Anhydrid (4,51 g, 16,0 mmol) nach der Methode E zubereitet, um 3,45 g (87%) eines klaren gelben Öls zu liefern. Die TLC-Analyse dieses Öls zeigte an, dass es sich durch das Stehen in das Ausgangsphenol zu zersetzen schien. ¹H NMR (DMSO-d6): δ 8,03 (2H, s), 10,31 (1H, s).
Beispiel 44
3,5-Dichlor-4'Hydroxybiphenyl-4-Carbaldehyd
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 3,5-Dichlor-4-Formylphenyl Trifluormethansulfonat (0,73 g, 2,26 mmol) mit 4-tert-Butyldimethylsilyoxyphenyl-Borsäure (0,80 g, 3,2 mmol) nach der Methode C zubereitet, um 0,30 g (50%) eines gelben Feststoffs zu ergeben: Schmelzpunkt: 178-180°C; ¹H NMR (DMSO-d6): δ 6,88 (2H, d, J = 8,84 Hz), 7,72 (2H, d, J = 8,71 Hz), 7,84 (2H, s), 9,95 (1H, s), 10,38 (1H, s); MS (EI) m/z 266,0/268,0/270,0 (M⁺).
Analyse für C₁₃H₈Cl₂CO₂·0,5 H₂O:
Errechnet: C: 56,55 H: 3,29
Ergebnis: C: 56,36 H: 2,90.
Beispiel 45
2,3-Dichlor-4-Methoxybenzaldehyd
Zu einer Lösung von 2,3-Dichloranisol (10,00 g, 56,6 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (45 ml) wurde TiCl₄ (10,5 ml, 96,1 mmol) schnell zugefügt. α,α'-Dichlormethyl-Methylether (5,1 ml, 56,6 mmol) wurden dann langsam zugefügt und die innere Temperatur wurde zwischen 15 °C bis 20 °C aufrechterhalten. Die Mixtur wurde bei Raumtemperatur für 5 h gerührt, langsam in zerstoßenes Eis gegossen, mit Dichlormethan (3 ×) extrahiert, mit gesättigtem Natriumbicarbonat bis zum pH-Wert = 7 gewaschen, dann mit Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um 11,34 g (98%) eines weißen Feststoffs zu liefern. Eine analytische Probe durch präparative Reverse-Phasen-HPLC erhalten: Schmelzpunkt 112-113°C; ¹H NMR (CDCl₃): δ 4,01 (3H, s), 6,97 (1H, d, J = 8,77 Hz), 7,90 (1H, d, J = 8,82 Hz), 10,36 (1H, s); MS (ESI) m/z 205/207/209 (M+H)⁺.
Analyse für C₈H₆Cl₂O₂:
Errechnet: C: 46,86 H: 2,95;
Ergebnis: C: 46,92 H: 2,70.
Beispiel 46
2,3-Dichlor-4-Hydroxybenzaldehyd
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 2,3-Dichlor-4-Methoxybenzaldehyd (10 g, 49 mmol) mit Bortribromid (147 ml von 1N Lösung in CH₂Cl₂, 147 mmol) nach der Methode D zubereitet, um 11,3 g eines dunkelgrauen Feststoffs zu liefern, der hauptsächlich das bezeichnete, durch ¹H-NMR angegebene Produkt ist. Es wurde trituriert mit 30% CHCl₃ in Hexan, um 3,6 g eines grauen Feststoffs als reines Produkt zu liefern. Eine analytische Probe wurde als weißer Feststoff durch präparative Reverse-Phasen-HPLC erhalten: Schmelzpunkt 176-178 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 7,10 (1H, d, J = 8,68 Hz), 7,74 (1H, d, J = 8,67 Hz), 10,16 (1H, s), 11,95 (1H, s); MS (ESI) m/z 189/191/193 (M-H)^–, 193/191/195 (M+H)⁺.
Analyse für C₇H₄Cl₂O₂
Errechnet: C: 44,02 H: 2,11
Ergebnis: C: 43,87 H: 1,67.
Beispiel 47
Trifluor-Methansulfonsäure 2,3-Dichlor-4-Formylphenylester
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 2,3-Dichlor-4-Hydroxybenzaldehyd (2,50 g, 13,2 mmol) mit Trifluormethansulfon-Anhydrid (2,88 ml, 4,80g, 17,1 mmol) nach Beispiel 43 zubereitet, um 3,69 g (82%) eines braunen Kristalls zu liefern, der beim nächsten Schritt direkt ohne Reinigung verwendet wurde. Eine analytische Probe wurde als weißer Feststoff durch Silikachromatographie (5% Ethylacetat-Hexan) geliefert: Schmelzpunkt 44-45 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 7,88 (1H, d, J = 8,74 Hz), 8,02 (1H, d, J = 8,81 Hz), 10,28 (1H, s); MS (EI) m/z 322/324/326 (M)⁺.
Analyse für C₆H₃Cl₂F₃O₄S:
Errechnet: C: 29,74 H: 0,94
Ergebnis: C: 30,19 H: 0,86.
Beispiele 48 bis 50
Trifluormethansulfonsäure 2,3-Dichlor-4-Formylphenylester (1,39 g, 4,33 mmol) wurde mit Borsäure 21 (1,20 g, 4,76 mmol) nach der Methode B reagiert, um die folgenden drei Verbindungen zu produzieren:
2,3-Dichlor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (48)

310 mg (27%) weißen Feststoffs: Schmelzpunkt 172-174 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 6,86-6,91 (2H, m), 7,32-7,35 (2H, m), 7,53 (1H, dd, J = 7,94 Hz, J = 0,45 Hz), 7,85 (1H, d, J = 8,01 Hz), 9,85 (1H, s), 10,35 (1H, s); MS (ESI) m/z 265/267/269 (M-H)^–.
Analyse für C₁₃H₈Cl₂O₂:
Errechnet: C: 58,46 H: 3,02
Ergebnis: C: 57,75 H: 2,82.

2-Chlor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (49)

90 mg (9%) gebrochen weißen Feststoffs: Schmelzpunkt 114-116 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 6,85-6,90 (2H, m), 7,32-7,36 (2H, m), 7,61 (1H, d, J = 7,87 Hz), 7,89 (1H, dd, J = 7,90 Hz, J = 1,55 Hz), 8,05 (1H, d, J = 1,52 Hz), 9,79 (1H, s), 10,02 (1H, s); MS (ESI) m/z 231/233 (M-H)^–, 233/235 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₃H₉ClO₂:
Errechnet: C: 67,11 H: 3,90
Ergebnis: C: 67,44 H: 3,87.

2'-Dichlor-4,4''-Dihydroxy-1,1':3',1''-Terphenyl-4'-Carbaldehyd (50)

130 mg (9%) gebrochen weißen Feststoffs: Schmelzpunkt 222-223 °C; 1H NMR (DMSO-d₆): δ 6,85-6,88 (2H, m), 6,88-6,91 (2H, m), 7,17-7,20 (2H, m), 7,31-7,35 (2H, m), 7,52 (1H, dd, J = 7,96 Hz, J = 0,89 Hz), 7,84 (1H, d, J = 8,07 Hz), 9,55 (1H, d, J = 0,77 Hz), 9,73 (1H, s), 9,74 (1H, s); MS (ESI) m/z 323/325 (M-H)^–, 325/327 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₉H₁₃ClO₃:
Errechnet: C: 70,27 H: 4,03
Ergebnis: C: 69,80 H: 3,88.

Beispiel 51
2,3-Dichlor-3'-Fluor-4'-Methoxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von Trifluormethansulfonsäure 2,3-Dichlor-4-Formylphenylester (1,90 g, 5,90 mmol) mit 21 (1,30 g, 7,67 mmol) nach der Methode B zubereitet, um 0,84 g (47%) eines weißen Feststoffs zu erhalten: Schmelzpunkt 160-164 °C; ¹H NMR (DMDO-d₆): δ 3,90 (3H, m), 7,28-7,30 (2H, m), 7,41-7,43 (1H, m), 7,57 (1H, d, J = 8,30 Hz), 7,87 (1H, d, J = 7,81 Hz), 10,35 (1H, s); MS (EI) m/z 298/300/302 (M)⁺.
Analyse für C₁₄H₉Cl₂FO₂:
Errechnet: C: 56,21 H: 3,03
Ergebnis: C: 57,55 H: 2,97.
Beispiele 52 und 53
2,3-Dichlor-3'-Fluor-4'-Methoxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (0,72 g, 2,42 mmol) wurde mit Bortribromid (7,25 ml von 1N Lösung in CH₂Cl₂, 7,25 mmol) nach der Methode E reagiert, um die folgenden zwei Verbindungen zu erzeugen:
2',3'-Dichlor-4'-(Dibrommethyl)-3-Fluor-1,1'-Biphenyl-4-ol (52)

130 mg (13%) eines grauen dicken Sirups: ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 7,04 (1H, t, J = 8,54 Hz), 7,11 (1H, dd, J = 8,41 Hz, J = 1,97 Hz), 7,32 (1H, dd, J = 12,18 Hz, J = 1,94 Hz), 7,51 (1H, d, J = 8,27 Hz), 7,54 (1H, s), 7,95 (1H, d, J = 8,23 Hz), 10,23 (1H, s); MS (ESI) m/z 425/427/429 (M-H)^–.
Analyse für C₁₃H₇Br₂Cl₂FO:
Errechnet: C: 36,40 H: 1,65
Ergebnis: C: 37,60 H: 1,69.

2,3-Dichlor-3'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (53)

140 mg (20%) eines weißen Feststoffs: Schmelzpunkt 170-171 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 7,07 (1H, t, J = 8,60 Hz), 7,15 (1H, dd, J = 8,40 Hz, J = 1,79 Hz), 7,35 (1H, dd, J = 12,15 Hz, J = 1,87 Hz), 7,56 (1H, d, J = 7,97 Hz), 7,86 (1H, d, J = 8,09 Hz), 10,31 (1H, s), 10,35 (1H, s); MS (ESI) m/z 283/285/287 (M-H)^–.
Analyse für C₁₃H₇Cl₂FO₂:
Errechnet: C: 54,77 H: 2,47
Ergebnis: C: 54,93 H: 2,18.

Beispiel 54
3,5-Dichlor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 3,5-Dichlor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (170 mg, 0,637 mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (89 mg, 1,27 mmol) nach der Methode F zubereitet, um 160 mg (89%) eines weißen Feststoffs zu liefern: Schmelzpunkt 183-186 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 6,86 (2H, d, J = 8,79 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,79 Hz), 7,76 (2H, s), 8,25 (1H, s), 9,81 (1H, s), 11,78 (1H, s); MS (ESI) m/z 280/282/284 (M-H)^–, 282/284/286 (M+H)⁺.
Beispiel 55
3,5-Dichlor-3'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion von 3,5-Dichlor-3'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd (290 mg, mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (140 mg, 1,27 mmol) nach der Methode F zubereitet, um 260 mg (85%) eines weißen Feststoffs zu liefern: Schmelzpunkt 185-190 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 7,03 (1H, t, J = 8,86 Hz), 7,46-7,49 (1H, m), 7,68 (1H, dd, J = 12,74 Hz, J = 2,26 Hz), 7,82 (2H, s), 8,25 (1H, s), 10,24 (1H, s), 11,80 (1H, s); MS (ESI) m/z 298/300/302 (M-H)^–, 300/302/304 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₃H₈Cl₂FNO₂·0,2 H₂O:
Errechnet: C: 51,41 H: 2,79 N: 4,61
Ergebnis: C: 51,70 H: 2,75 N: 4,21.
Beispiel 56
2,3-Dichlor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim
Die Titelverbindung wurde durch Reaktion 48 (140 mg, 0,526 mmol) mit Hydroxylaminhydrochlorid (110 mg, 1,58 mmol) nach der Methode F zubereitet, um 148 mg (100%) eines gebrochen weinen Feststoffs zu ergeben: Schmelzpunkt 208-210 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 6,84-6,87 (2H, m), 7,26-7,29 (2H, m), 7,36 (1H, d, J = 7,94 Hz), 7,80 (1H, d, J = 8,20 Hz), 8,41 (1H, s), 9,72 (1H, s), 11,83 (1H, s); MS (ESI) m/z 280/282/284 (M-H)^–, 282/284/286 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₃H₉Cl₂NO₂:
Errechnet: C: 55,35 H: 3,22 N: 4,96
Ergebnis: C: 55,78 H: 3,59 N: 4,44.
Beispiel 57
52 (85 mg, 0,20 mmol) wurde mit Hydroxylaminhydrochlorid (376 mg, 5,39 mmol) und Pyridin (0,43 ml, 5,34 mmol) für 8 Tage nach der Methode C reagiert, um die folgenden zwei Verbindungen zu erzeugen:
2,3-Dichlor-3'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim (57)

17,6 mg (30%) eines weißen Feststoffs: Schmelzpunkt 225-227 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 7,04 (1H, t, J = 8,54 Hz), 7,10 (1H, dd, J = 8,35 Hz, J = 1,88 Hz), 7,28 (1H, dd, J = 12,22 Hz, J = 2,01 Hz), 7,39 (1H, d, J = 8,14 Hz), 7,81 (1H, d, J = 8,15 Hz), 8,41 (1H, s), 10,18 (1H, s), 11,87 (1H, s); MS (ESI) m/z 298/300/302 (M-H)^–, 300/302/304 (M+H)⁺.
Analyse für C₁₃H₈Cl₂FNO₂·0,09 TFA:
Errechnet: C: 51,00 H: 2,63 N: 4,51
Ergebnis: C: 50,97 H: 2,37 N: 4,33.

Methyl 2,3-Dichlor-3'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carboxylat

16,9 mg (27%) eines weißen Feststoffs: Schmelzpunkt 152-154 °C; ^1H NMR (DMSO-d₆): δ 3,90 (3H, s), 7,05 (1H, t, J = 8,54 Hz), 7,11 (1H, dd, J = 8,41 H, J = 1,55 Hz), 7,31 (1H, dd, J = 12,16 Hz, J = 1,68 Hz), 7,47 (1H, d, J = 8,02 Hz), 7,76 (1H, d, J = 8,64 Hz); MS (ESI) m/z 313/315/317 (M+H)⁺. Analyse für C₁₄H₉Cl₂FO₃:
Errechnet: C: 53,36 H: 2,88
Ergebnis: C: 51,94 H: 2,54.

Beispiel 58 Tabelle 1. 4'-Hydroxy-Biphenyl-Carbaldehyd-Oxim Derivate

Beispiel	R¹	R²	R³	R⁵	R⁶	R⁷	ER_β (nM)	ER_α (nM)
29	H	Me	H	H	H	H	163	3193
30	H	H	H	H	H	H	3840	> 5000
31	H	Cl	H	H	H	H	85	1540
32	H	H	F	H	H	H	421	3450
33	H	F	H	H	H	H	161	1720
34	H	H	Cl	H	H	H	98	398
35	H	OMe	H	H	H	H	1058	7990
36	H	H	Me	H	H	H	585	2821
37	H	Cl	H	H	F	H	54	1910
38	H	Cl	H	H	F	F	268	> 7000
39	H	Cl	H	Me	H	H	27	174
54	Cl	Cl	H	H	H	H	8	64
55	Cl	Cl	H	H	F	H	9	270
56	H	Cl	Cl	H	H	H	49	851
57	H	Cl	Cl	H	F	H	81	1957

Die beim pharmakologischen Standardtestverfahren erhaltenen Resultate beweisen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen östrogenwirksame Verbindungen sind, einige mit stark bevorzugter Affinität für den ERβ-Rezeptor. Die Affinität der erfindungsgemäßen Verbindungen reicht von einer hohen bevorzugten Affinität für ERβ über derjenigen für ERα bis zu einer beinahe gleichen Affinität für beide Rezeptoren. So umspannen die erfindungsgemäßen Verbindungen einen Aktivitätsbereich, der zumindest teilweise auf ihren Rezeptoraffinitätsselektivitätsprofilen basiert. Hinzu kommt, dass, da jeder neue Rezeptorligandkomplex einmalig und somit seine Wechselwirkung mit unterschiedlichen koregulatorischen Proteinen einmalig ist, erfindungsgemäße Verbindungen unterschiedliches modulatorisches Verhalten abhängig vom zellulären Kontext, in dem sie sich befinden, zeigen. Zum Beispiel ist es in manchen Zelltypen möglich, dass sich eine Verbindung wie ein Östrogenagonist, wohingegen sie sich in anderen Geweben wie ein Antagonist verhält. Verbindungen mit einer solchen Aktivität sind gelegentlich als SERMs (Selektive Östrogenrezeptormodulatoren) bezeichnet worden. Anders als viele Östrogene verursachen jedoch viele der SERMs keine Vermehrung des uterinen Nassgewichts. Diese Verbindungen sind im Uterus antiöstrogenwirksam und können die trophischen Effekte der Östrogenagonisten im Uterusgewebe komplett antagonisieren. Diese Verbindungen wirken jedoch als Östrogenagonisten in den Knochen-, Herzgefäß- und Zentralnervensystemen. Dank dieser gewebeselektiven Natur dieser Verbindungen sind sie nützlich für die Behandlung oder Verhütung bei einem Säugetier von Krankheitszuständen oder -syndromen, die durch einen Östrogenmangel (in gewissen Geweben wie Knochen- oder Herzgefäßgeweben) oder Östrogenüberschuss (im Uterus oder in den Brustdrüsen) ausgelöst werden oder mit diesen einhergehen.
Sogar über eine solche zellspezifische Modulation hinaus haben die erfindungsgemäßen Verbindungen auch das Potential, sich als Agonisten an einem Rezeptortyp zu verhalten, während sie sich wie Antagonisten an einem anderen verhalten. Zum Beispiel wurde nachgewiesen, dass Verbindungen am ERβ ein Antagonist, aber am ERα ein Agonist sein können (Meyers Marvin J.; Sun Jun; Carlson Kathryn E.; Katzenellenbogen Benita S.; Katzenellenbogen John A., J. Med. Chem. [Zeitschrift für medizinische Chemie] (1999), 42 (13), 2456-2468). Diese ERSAA (Estrogen Rezeptor Selective Agonist Antagonist) [Ostrogenrezeptor-selektive Agonisten-Antagonisten]-Aktivität bietet eine pharmakologisch unterschiedliche östrogene Aktivität innerhalb dieser Verbindungsreihen.
Pharmakologische Standardtestverfahren zur Bestimmung des Aktivitätsprofils einer gegebenen Testverbindung sind fertig erhältlich. Im Folgenden sollen mehrere repräsentative Testverfahren kurz zusammengefasst beschrieben werden. Pharmakologische Standardtestverfahren für SERMs sind auch in den US-Patenten 4.418.068 und 5.998.402 vorgeschlagen.
Beispiel 59
Uterotrophische/anti-uterotrophische Testverfahren an Ratten
Die östrogen- und antiöstrogenwirksamen Eigenschaften der Verbindungen können durch ein uterotrophisches Nachweisverfahren an unreifen (4 Tage alten) Ratten bestimmt werden (wie bereits durch L. J. Black und R. L. Goode, Life Sciences [Biowissenschaften], 26, 1453 (1980) beschrieben wurde). Unreife (weibliche, 18 Tage alte) Sprague-Dawley Ratten wurden in Gruppen von sechs Tieren getestet. Die Tiere wurden durch tägliche intraperitoneale Injektion von 10 uG der Verbindung, 100 uG der Verbindung (100 uG der Verbindung + 1 uG 17β-Östradiol) zur Prüfung der Antiöstrogenizität und 1 uG 17β-Östradiol mit 50% DMSO/50% Salzlösung als Injektionsvehikel behandelt. Am Tag 4 wurden die Tiere durch CO₂ Asphyxierung geopfert, ihr Uterus wurde entfernt und überschüssiges Fett abgestreift, jegliche Flüssigkeit entfernt und das Nassgewicht bestimmt. Ein kleiner Schnitt eines Horns wird der Histologie unterbreitet und der Rest zur Isolierung der gesamten RNA für die Bewertung der Genexpression der Komplementärkomponente 3 verwendet.
Beispiel 60
Testverfahren mit 6 Wochen alten ovariektomierten Ratten- Knochen- und Kardioprotektion
Weibliche Sprague-Dawley CD Ratten, beidseitig ovariektomiert (ovx) oder scheinoperiert (Sham ovx), werden 1 Tag nach der Operation von der Taconic Farm bezogen (Gewichtsbereich 240-275 g). 3 oder 4 Ratten werden pro Käfig in einem Raum bei einem Hell-Dunkelzeitplan von 12/12 untergebracht und mit Nahrung (Purina 5K96C Rattenfutter) und Wasser nach Belieben versorgt. Die Behandlung für alle Studien beginnt 1 Tag nach Ankunft der Tiere und wird an 7 Tagen pro Woche wie angegeben 6 Wochen lang dosiert. Eine gleichaltrige Gruppe Sham-operierter Ratten, die keine Behandlung erhalten, dienen als intakte, mit Östrogen voll ausgestattete Kontrollgruppe für jede Studie.
Alle Behandlungen werden in 1% Tween 80 in normaler Salzlösung mit definierten Konzentrationen zubereitet, so dass das Behandlungsvolumen 0,1 ml/100 g Körpergewicht ausmacht. 17β-Östradiol wird in Maisöl aufgelöst (20 μg/ml) und subkutan verabreicht, 0,1 ml/Ratte. Alle Dosierungen werden in Abständen von drei Wochen nach Messungen des Durchschnittsgewichts der Gruppe angepasst.
Fünf Wochen nach Initiierung der Behandlung und eine Woche vor Beendigung der Studie wird jede Ratte auf ihre mineralische Knochendichte (BMD) hin bewertet. Gesamtdichte und trabekuläre Dichte der proximalen Tibia werden an anästhetisierten Ratten mittels XCT-960 M (pQCT; Stratec Medizintechnik, Pforzheim, Deutschland) bewertet. Die Messungen werden wie folgt durchgeführt: Fünfzehn Minuten vor dem Scannen wird jede Ratte durch intraperitoneale Injektion von 45 mg/kg Ketamin, 8,5 mg/kg Xylazin und 1,5 mg/kg Acepromazin anästhetisiert.
Die rechte hintere Gliedmaße wird in ein Polycarbonatröhrchen mit einem Durchmesser von 25 mm eingeführt und mit einem Pflaster auf einem Akrylrahmen mit dem Fußgelenk im 90° Winkel und dem Kniegelenk im 180° Winkel befestigt. Das Polycarbonatröhrchen wird auf einer Gleitplattform fixiert, die es senkrecht zur Öffnung des pQCT festhält. Die Plattform wird derart angepasst, dass das distale Ende des Femur und das proximale Ende der Tibia im Scanbereich zu liegen kommen. Ein zweidimensionales Sichtfeld wird über eine Länge von 10 mm und mit einer Zeilenauflösung von 0,2 mm bewegt. Nachdem das Sichtfeld auf dem Monitor dargestellt ist, wird das proximale Ende der Tibia lokalisiert. Der pQCT Scan wird 3,4 mm distal von diesem Punkt aus initiiert. Der pQCT Scan ist 1 mm dick, hat eine Voxel-(dreidimensionale Pixel-)Größe von 0,140 mm und besteht aus 145 Projektionen durch den Schlitz.
Nach Beendigung des pQCT Scans wird das Bild auf dem Monitor dargestellt. Eine Region von Interesse, die die Tibia einschließt, die Fibula aber ausschließt, wird umrissen. Das weiche Gewebe wird automatisch mittels eines wiederholten Algorithmus entfernt. Die Dichte des verbleibenden Knochens (Gesamtdichte) wird in mg/cm³ angegeben. Die äußeren 55% des Knochens werden in einer konzentrischen Spirale abgeschält. Die Dichte des verbleibenden Knochens (trabekuläre Dichte) wird in mg/cm³ angegeben. Eine Woche nach der BMD-Bewertung werden die Ratten durch Kohlendioxiderstickung euthanasiert und Blut wird zur Cholesterinbestimmung entnommen. Die Uteri werden entfernt und ihre Gewichte erfasst. Das Gesamtcholesterin wird mittels eines klinischen Analysiergerätes Hitachi 911 von Boehringer-Mannheim unter Verwendung des Cholesterin/HP-Kits bestimmt. Die statistischen Werte werden mittels Einweg-Varianzanalyse mit dem Dunnett-Test verglichen.
Beispiel 61
Antiproliferatives MCF-7/ERE-Testverfahren
Vorratslösungen von Testverbindungen (üblicherweise 0,1 M) werden in DMSO zubereitet und dann 10- bis 100-fach mit DMSO verdünnt, um Arbeitslösungen von 1 oder 10 mM herzustellen. Die DMSO-Vorräte werden entweder bei 4 °C (0,1 M) oder –20 °C (< 0,1 M) gelagert. MCF-7-Zellen werden zweimal pro Woche mit Wachstumsmedium behandelt [D-MEM/F-12 Medium, das 10% (v/v) hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum, 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin und 2 mM GlutaMAX-1 enthält]. Die Zellen werden in gelüfteten Kolben bei 37 °C innerhalb eines 5% CO₂/95% Feuchtluftinkubators aufbewahrt. Ein Tag vor der Behandlung werden die Zellen mit Wachstumsmedium mit 25.000 pro Well in 96 Well-Platten propagiert und bei 37 °C über Nacht inkubiert.
Die Zellen werden für 2 h bei 37 °C mit 50 μl/Well einer 1:10 Verdünnung der Adenovirus 5-ERE-tk-Luciferase im Versuchsmedium [Phenolrotfreies D-MEM/F-12 Medium, das 10% (v/v) hitzeinaktiviertes, charcoal-stripped fetales Rinderserum, 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin, 2 mM GlutaMAX-1, 1 mM Natriumpyruvat enthält] infiziert. Die Wells werden dann einmal mit 150 μλ Versuchsmedium gewaschen. Schließlich werden die Zellen für 24 h bei 37 °C in Unterteilungen von 8 Wells/Behandlung mit 150 μλ/Well des Vehikels (≤ 0,1% v/v DMSO) oder der Verbindung, die ≥ 1000-fach im Versuchsmedium verdünnt wird, behandelt.
Das anfängliche Screening der Testverbindungen erfolgt in einer Einzeldosis von 1 μM, die allein (Agonistenmodus) oder in Kombination mit 0,1 nM 17β-Östradiol (EC₈₀, Antagonistenmodus) getestet wird. Jede 96 Well-Platte umfasst auch eine Vehikelkontrollgruppe (0,1% v/v DMSO) und eine Agonistenkontrollgruppe (entweder 0,1 oder 1 nM 17β-Östradiol). Dosisantwortexperimente werden durchgeführt in einem der Agonisten- und/oder Antagonistenmodi mit aktiven Verbindungen bei Log.-Anstiegen von 10^–14 bis 10^–5 M. Aus diesen Dosisantwortkurven werden jeweils die EC₅₀- und IC₅₀-Werte generiert. Der letzte Well einer jeden Behandlungsgruppe enthält 5 μl von 3 × 10^–5 M ICI-182, 780 (10⁶ M Endkonzentration) als ER-Antagonistenkontrolle.
Nach der Behandlung werden die Zellen auf einem Schüttelgerät für 15 Minuten mit 25 μl/Well eines 1X Zellkulturlysereagens (Promega Corporation) lysiert. Die Zelllysate (20 μl) werden auf eine 96 Well-Luminometerplatte übertragen und die Luciferaseaktivität wird in einem MicroLumat LB 96 P Luminometer (EG & G Berthold) unter Verwendung von 100 μl/Well des Luciferasesubstrats (Promega Corporation) gemessen. Vor Injektion des Substrats wird eine Einsekunden-Hintergrundmessung für jeden Well durchgeführt. Nach Injektion des Substrats wird die Luciferaseaktivität für 10 Sekunden nach einer Einsekundenverzögerung gemessen. Die Daten werden vom Luminometer zu einem Macintosh Personal Computer übertragen und unter Verwendung der JMP Software (SAS Institut) analysiert; dieses Programm subtrahiert die Hintergrundaufzeichnung von der Luciferasemessung für jeden Well und bestimmt dann die Durchschnitts- und Standardabweichung einer jeden Behandlung.
Die Luciferasedaten werden durch Logarithmen transformiert und mit Hilfe des Huber M-Estimators werden die transformierten Randbeobachtungen abgewogen. Unter Verwendung der JMP Software werden die transformierten und gewichteten Daten für den Einwegetest ANOVA (Dunnett-Test) analysiert. Die Verbindungsbehandlungen werden mit den Vehikelkontrollresultaten im Agonistenmodus oder den positiven Agonistenkontrollresultaten (0,1 nM 17β-Östradiol) im Antagonistenmodus verglichen. Für das anfängliche Einzeldosisexperiment werden, wenn sich die Resultate der Verbindungsbehandlung signifikant von der geeigneten Kontrolle unterscheiden (p < 0,05), die Resultate als Prozent relativ zur 17β-Östradiolkontrolle [d. h. ((Verbindung – Vehikelkontrolle)/(17β-Östradiolkontrolle – Vehikelkontrolle)) × 100] angegeben. Die JMP Software wird auch zur Bestimmung der EC₅₀- und/oder IC₅₀-Werte aus den nicht-linearen Dosisantwortkurven verwendet.
Beispiel 62
Inhibierung der LDL-Oxidation – Antioxidansaktivität
Schweineaorten werden von einem Schlachthof bezogen, gewaschen, in schockgekühlter PBS transportiert und aortale Endothelialzellen werden geerntet. Um die Zeilen zu ernten, werden die interkostalen Gefäße der Aorta abgetrennt und ein Ende der Aorta wird abgeklemmt. Frische, steril gefilterte, 0,2% Kollagenase (Sigma Type I) wird in das Gefäß gegeben und das andere Ende des Gefäßes dann abgeklemmt, um ein geschlossenes System zu bilden. Die Aorta wird bei 37 °C für 15 bis 20 Minuten inkubiert, wonach die Kollagenaselösung entnommen und für 5 Minuten mit 2000 × g zentrifugiert wird. Jedes Pellet wird in 7 ml eines Endothelialzellkulturmediums suspendiert, das aus phenolrotfreiem DMEM/Ham's F-12 Medium, ergänzt durch charcoal-stripped FBS (5%), NuSerum (5%), L-Glutamin (4 mM), Penicillin-Streptomycin (1000 IE/ml, 100 μg/ml) und Gentamycin (75 μg/ml) besteht, in eine 100 mm Petrischale gesät und bei 37 °C in 5% CO₂ inkubiert. Nach 20 Minuten werden die Zellen mit PBS gespült und frisches Medium wird zugefügt. Dies wird nach 24 Stunden noch einmal wiederholt. Die Zellen sind nach etwa 1 Woche konfluent. Die Endothelialzellen werden routinemäßig zweimal pro Woche genährt und, sobald sie konfluent sind, trypsinisiert und im 1:7 Verhältnis gesät. Die zellvermittelte Oxidation von 12,5 μg/ml LDL lässt man in Gegenwart der zu bewertenden Verbindung (5 μM) für 4 Stunden bei 37 °C stattfinden. Die Resultate werden als prozentuale Inhibierung des Oxidationsprozesses ausgedrückt, wie sie durch die TBARS-Methode (Thiobarbitursäure reaktive Substanzen) zur Analyse freier Aldehyde gemessen wird (Yagi K., Biochem Med 15: 212-216 (1976)).
Beispiel 63
D12 Hypothalamuszellen-Testverfahren
Hypothalamuszellen von D12 Ratten werden aus der parentalen RCF17 Zelllinie subkloniert und gefroren gelagert. Sie werden routinemäßig in DMEM:F-12 (1:1), GlutaMAX-1 (2 mM), Penicillin (100 IE/ml)-Streptomycin (100 mg/ml) plus 10% fetalen Rinderserums (FBS) gezüchtet. Die Zellen werden in phenolrotfreiem Medium (DMEM:F-12, GlutaMAX, Penicillin-Streptomycin), das 2 bis 10% charcoal-stripped FBS in subkonfluenter Dichte (1 bis 4 × 10⁶ Zellen/150 mm Schale) enthält, propagiert. Die Zellen werden 24 h später erneut mit Medium, das 2% stripped Serum enthält, genährt. Um auf die Agonistenaktivität hin zu testen, werden die Zellen mit 10 nM 17β-Östradiol oder unterschiedlichen Dosen der Testverbindung (1 mM oder im Bereich von 1 pM bis 1 mM) behandelt. Um auf die Antagonistenaktivität hin zu testen, werden die Zellen mit 0,1 nM 17β-Östradiol in Abwesenheit oder Anwesenheit variierender Dosen (100 pM bis 1 mM) der Testverbindung behandelt.
Kontrollschalen werden ebenfalls mit DMSO als negative Kontrolle behandelt. Achtundvierzig Stunden nach der Hormonzugabe werden die Zellen lysiert und das Bindungstestverfahren durchgeführt.
Für jedes Bindungstestverfahren werden 100-150 mg Protein mit 10 nM ³H-R5020 + 100-fachem Überschuss an R5020 in einem 150 ml Volumen inkubiert. Dreifache Reaktionen (drei mit R5020, drei ohne R5020) werden in einer 96 Well-Platte zubereitet. Der Proteinextrakt wird zugefügt, zunächst gefolgt von ³H-R5020 oder ³H-R5020 + 100 × unmarkiertem R5020. Die Reaktion wird für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 100 ml kalter 5% Charcoal (Norit SX-4), 0,5% Dextran 69K (Apotheke) in TE, pH 7,4, gestoppt. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur werden der gebundene und der ungebundene Ligand durch Zentrifugation (5 Minuten, 1000 RCF, 4 °C) getrennt. Die überstehende Lösung (~150 ml) wird entfernt und zu einem Szintillationsglasfläschchen übertragen. Nach Zugabe der Szintillationsflüssigkeit (Beckman fertiges Protein+) werden die Proben für 1 Minute in einem Szintillationszähler gezählt.
Beispiel 64
Progesteronrezeptor im präoptischen ZNS-Bereich
Sechzig (60) Tage alte weibliche Sprague-Dawley Ratten werden ovariektomiert. Die Tiere werden in einer Tierversorgungseinrichtung bei einer 12 h Hell- und 12 h Dunkelphotoperiode untergebracht und mit Wasser und Nagetierfutter nach Belieben versorgt.
Ovariektomierte Tiere werden zufällig in Gruppen unterteilt, die mit Vehikel (50% DMSO, 40% PBS, 10% Ethanolvehikel), 17β-Östradiol (200 ng/kg) oder der zu testenden Verbindung injiziert werden. Zusätzliche Tiere werden mit der Testverbindung 1 Stunde vor der Injektion von 17β-Östradiol injiziert, um die Antagonisteneigenschaften dieser Verbindung zu bewerten. Sechs Stunden nach subkutaner Injektion werden die Tiere mit einer letalen Dosis CO₂ euthanasiert und ihre Gehirne entnommen und eingefroren.
Von Tieren entnommenes Gewebe wird auf einem Cryostat bei –16 °C geschnitten und auf Silan-überzogene Mikroskopobjektträger aufgelegt. Die mit Schnitten belegten Objektträger werden dann auf einem Objektträgererhitzer bei aufrechterhaltener Temperatur von 42 °C getrocknet und in ausgetrockneten Objektträgerboxen bei –80 °C gelagert. Vor der Bearbeitung werden die ausgetrockneten Objektträgerboxen langsam auf Raumtemperatur (–20 °C für 12 bis 16 Stunden; 4 °C für 2 Stunden; Raumtemperatur für 1 Stunde) erwärmt, um eine Kondensationsbildung auf den Objektträgern auszuschließen und damit einen Gewebe- und RNA-Abbau zu minimieren. Die trockenen Objektträger werden in Metallgestelle platziert, in 4% Paraformaldehyd (pH 9,0) für 5 Minuten postfixiert und wie vorher beschrieben bearbeitet.
Ein Plasmid, das ein 815bp-Fragment der Ratten PR-cDNA 9 (Ligandbindungsdomäne) enthält, wird linearisiert und dazu verwendet, um eine S 35-UTP-markierte Sonde zu generieren, die zu einem Abschnitt der Ratten PR-mRNA komplementär ist. Bearbeitete, mit Schnitten belegte Objektträger werden mit 20 ml eines Hybridisierungsmixes, der die Riboprobe (4 bis 6 × 10⁶ DPM/Objektträger) und 50% Formamid enthält, hybridisiert und über Nacht in einer 55 °C Feuchtkammer inkubiert. Am Morgen werden die Objektträger in Metallgestelle gelegt, die in 2 × SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat; pH 7,0)/10 mM DTT immergiert werden. Die Gestelle werden alle zu einem großen Behälter gebracht und in 2 × SSC/10 mM DTT für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichter Bewegung gewaschen. Die Objektträger werden dann in RNase-Puffer bei 37 °C für 30 Minuten gewaschen, mit RNase A (20 mg/ml) für 30 Minuten bei 37 °C behandelt und für 15 Minuten in Raumtemperatur aufweisender 1X SSC gewaschen. Daraufhin werden die Objektträger (2 × 30 Minuten) in 65 °C in 0,1X SSC gewaschen, um nichtspezifische Markierung zu entfernen, in Raumtemperatur aufweisender 0,1X SSC für 15 Minuten gespült und mit aufsteigender Alkoholreihe: Ammoniumacetat (70%, 95% und 100%) dehydriert. Die luftgetrockneten Objektträger werden 3 Tage lang einem Röntgenfilm gegenüber gestellt und dann photographisch bearbeitet. Die Objektträger von allen Tieren werden zusammen hybridisiert, gewaschen, exponiert und photographisch bearbeitet, um Unterschiede auf Grund von Bedingungsschwankungen von Assay zu Assay zu eliminieren.
Beispiel 65
Hitzewallung-ZNS-Effekte bei Ratten
Ovariektomierte weibliche, 60 Tage alte Sprague-Dawley Ratten werden nach der Operation erhalten. Die Operationen wurden mindestens 8 Tage vor der ersten Behandlung durchgeführt. Die Tiere werden einzeln bei einem 12 h Hell-/Dunkelzyklus untergebracht und mit Standardrattenfutter und Wasser nach Belieben versorgt.
Zwei Kontrollgruppen werden in jede Studie aufgenommen. Dosierungen werden basierend auf mg/kg des durchschnittlichen Gruppenkörpergewichts entweder in 10% DMSO in Sesamöl (subkutane Studien) oder in 1,0% Tween 80 in Salzlösung (per os Studien) zubereitet. Den Tieren werden Testverbindungen in Dosen verabreicht, die von 0,01 bis 10 mg/kg des durchschnittlichen Gruppenkörpergewichts betragen. Kontrollgruppen für die Vehikel- und Ethinylöstradiol (EE)-Kontrollen (0,1 mg/kg subkutan oder 0,3 mg/kg per os) sind bei jedem Test eingeschlossen. Werden die Verbindungen auf ihre Antagonistenaktivität hin getestet, wird EE mitverabreicht in einer Dose von jeweils 0,1 oder 0,3 mg/kg für subkutane oder per os Studien. Die Testverbindungen werden bis zu dem Tag verabreicht, an dem die Schwanzhauttemperatur gemessen wird.
Nach einem Eingewöhnungszeitraum von vier Tagen werden die Tiere einmal pro Tag mit der (den) Verbindung(en) von Interesse behandelt. Jede Behandlungsgruppe umfasst 10 Tiere. Die Verabreichung der Verbindung erfolgt entweder durch subkutane Injektion von 0,1 ml in den Nacken oder per os mit einem Volumen von 0,5 ml. Am 3. Tag der Behandlung wird ein Morphinpellet (75 mg Morphinsulfat) subkutan implantiert. Am 5. Tag der Behandlung werden ein Morphinpellet oder zwei Morphinpellets zusätzlich implantiert. Am achten Tag wird etwa der Hälfte der Tiere Ketamin (80 mg/kg intramuskulär) injiziert und ein mit einem MacLab Datenerfassungssystem (API Instruments, Milford, MA) verbundenes Thermoelement auf dem Schwanz etwa ein Inch (ca. 2,54 cm) von der Schwanzwurzel entfernt mit einem Pflaster befestigt. Dieses System ermöglichte die kontinuierliche Messung der Schwanzhauttemperatur. Die Basistemperatur wird 15 Minuten lang gemessen, dann wird Naloxon (1,0 mg/kg) subkutan appliziert (0,2 ml), um die Wirkung des Morphins zu blockieren, und die Schwanzhauttemperatur danach eine Stunde lang gemessen. Am neunten Tag werden die übrigen Tiere vorbereitet und auf die gleiche Weise analysiert.
Beispiel 66
Vasomotorische Funktion in isolierten Rattenaortaringen
Sprague-Dawley Ratten (240 bis 260 g) werden in 4 Gruppen aufgeteilt:

1. Normale, nicht ovariektomierte (intakte) Tiere,
2. Ovariektomierte (ovx), mit Vehikel behandelte Tiere,
3. Ovariektomierte, mit 17β-Östradiol (1 mg/kg/Tag) behandelte Tiere,
4. Ovariektomierte mit der Testverbindung (d. h. 1 mg/kg/Tag) behandelte Tiere.

Die Tiere werden etwa 3 Wochen vor der Behandlung ovariektomiert. Jedes Tier erhält 1 mg/kg/Tag entweder 17β-Östradiolsulfat oder die Testverbindung, suspendiert in destilliertem, entionisiertem Wasser, mit 1% Tween-80 durch Magenverabreichung. Die mit Vehikel behandelten Tiere erhielten ein angemessenes Volumen des bei den mit dem Arzneistoff behandelten Gruppen angewandten Vehikels.
Die Tiere werden durch CO₂-Inhalation und Ausbluten euthanasiert. Ihre Thoraxaorten werden schnell entfernt und in physiologische 37 °C Lösung mit folgender Zusammensetzung eingelegt (mM): NaCl (54,7), KCl (5,0), NaHCO₃ (25,0), MgCl₂ 2H₂O (2,5), D-Glucose (11,8) und CaCl₂ (0,2) begast mit CO₂-O₂, 95%/5% für einen Schluss-pH-Wert von 7,4. Die Adventitia wird von der äußeren Oberfläche entfernt und das Gefäß in 2 bis 3 mm breite Ringe geschnitten. Die Ringe werden in ein 10 ml Gewebebad gehängt, wobei das eine Ende auf dem Boden des Bades und das andere an einen Kraftumformer angeheftet wird. Eine Ruhespannung von 1 g wird auf die Ringe gelegt. Die Ringe werden für 1 Stunde ausbalanciert, Signale erfasst und analysiert.
Nach dem Ausbalancieren werden die Ringe ansteigenden Konzentrationen von Phenylephrin (10^–8 bis 10^–4 M) ausgesetzt und die Spannung aufgezeichnet. Die Bäder werden dreimal mit frischem Puffer gespült. Nach dem Auswaschen werden 200 mM L-NAME dem Gewebebad zugefügt und für 30 Minuten ausbalanciert. Die Phenylephrinkonzentrationsantwortkurve wird dann wiederholt.
Beispiel 67
Achtarmiges Radialarmlabyrinth-Steigerung der Erkenntnisfähigkeit
Männliche Sprague-Dawley CD Ratten (Charles River, Kingston, NY), die bei der Ankunft 200 bis 250 g wogen, werden verwendet. Eine Woche lang werden die Ratten zu sechst in einem Käfig mit Standard-Laborfutter und Wasser, die nach Belieben verfügbar waren, untergebracht. Die Unterbringung erfolgt in einem Kolonieraum, dessen Temperatur bei 22 °C aufrechterhalten wird, bei einem 12 Stunden Hell-/Dunkelzyklus mit Einschalten der Lampen um 6 h morgens. Nach Gewöhnung an die Einrichtung werden die Tiere einzeln untergebracht und bei 85% des Gewichts mit freiem Futter gehalten. Nachdem stabile Gewichte erreicht sind, werden die Ratten an das 8-armige radiale Labyrinth gewöhnt.
Die Struktur des Labyrinths ist eine Adaptierung nach demjenigen von Peele und Baron (Pharmacology, Biochemistry, and Behavior, [Pharmakologie, Biochemie und Verhalten] 29: 143-150, 1988). Das Labyrinth wird in eine Höhe von 75,5 cm aufgerichtet und setzt sich zusammen aus einer kreisförmigen Fläche, umgeben von 8 Armen, die vom Zentrum aus radial in gleichem Abstand von einander verlaufen. Jeder Arm ist 58 cm lang × 13 cm hoch. Ein klarer Plexiglaszylinder wird abgesenkt, um das Tier im zentralen Abschnitt des Labyrinths vor Beginn einer jeden Übung einzuschließen. Jeder Arm des Labyrinths ist mit 3 Sätzen Photozellen ausgerüstet, die eine Schnittstelle mit einer Datenerfassungseinheit bilden, die ihrerseits eine Schnittstelle mit einem Computer bildet. Die Photozellen werden benutzt, um die Bewegung der Ratte im Labyrinth zu verfolgen. Über Futternäpfen am Ende eines jeden Arms angebrachte Pelletspender geben zwei 45 mg Schokoladepellets aus, wenn die äußere Photozelle des Arms zum ersten Mal in einer bestimmten Übung aktiviert wird. Das Labyrinth befindet sich in einem Versuchsraum mit schwarzen und weißen geometrischen Postern auf jeder Wand, die als visuelle Hinweise dienen sollen. Während des gesamten Übungs- und Testverfahrens ist weißes Rauschen hörbar (~70 db).
Das Übungsverfahren besteht aus fünf Phasen, jede mit täglichen Übungen, die 5 oder 10 Minuten dauern. Eine 10 Sekundenverzögerung wird zwischen dem Zeitpunkt, zu dem die Ratte in den zentralen Abschnitt des Labyrinths platziert wird und dem Zeitpunkt, zu dem der Zylinder hochgehoben wird, um die Übung zu beginnen, eingelegt. Während Phase I werden Rattenpaare, die eingeschränktes Futter erhielten, für 10 Minuten auf das Labyrinth platziert, wobei 45 mg Schokoladefutterpellets in den 8 Armen des Labyrinths verteilt sind. Während Phase II wird jede Rate einzeln auf das Labyrinth für einen Zeitraum von 10 Minuten platziert, wobei Pellets von der mittleren Photozelle an bis zum Futternapf eines jeden Arms verteilt sind. Während Phase III wird jede Ratte für einen Zeitraum von 10 Minuten auf das Labyrinth gesetzt, wobei Futterpellets sich nur in den Futternäpfen und um diese herum in jedem Arm befinden. In Phase IV wird es jeder Ratte 10 Minuten lang erlaubt, zwei Pellets aus jedem Arm zu entnehmen. Das Rückkehren in einen Arm wird als Irrtum bewertet. Die Ratten werden täglich auf diese Weise trainiert, bis sie eine Kriterienleistung von weniger als oder gleich 2 Gesamtirrtümern an drei aufeinander folgenden Trainingstagen erreichen. Die Gesamtgewöhnungs- und -übungszeit beträgt etwa 3 Wochen.
Die Testverbindung wird in Phosphat-gepufferter Salzlösung zubereitet und in einem Volumen von 1 ml/kg verabreicht. Scopolamin HBr (0,3 mg/kg subkutan) diente als schädigender Wirkstoff, der einen Anstieg der Irrtumsrate (Gedächtnisverlust) auslöste. Die Testverbindung wird intraperitoneal gleichzeitig mit Scopolamin 30 Minuten vor dem ersten Aussetzen im Labyrinth an irgendeinem gegebenen Testtag verabreicht.
Um die Testverbindung zu bewerten, ist ein 8 × 8 balancierter latin Square für wiederholte Messungen vorgesehen, um eine hohe experimentelle Effizienz mit der geringsten Menge an Tieren zu erzielen. Acht experimentelle Übungen, zwei pro Woche, werden mit den 8 Behandlungen (Vehikel, Scopolamin, 3 Dosen der Testverbindung in Kombination mit Scopolamin) randomisiert innerhalb jeder Übung durchgeführt. Jeder Behandlung folgte jede andere Behandlung gleich oft. Deshalb konnte der Residualeffekt einer jeden Behandlung geschätzt und vom direkten Behandlungseffekt entfernt werden. Nach ANOVA werden multiple Vergleiche angestellt unter Verwendung des zweiseitigen Dunnett-Tests auf angepassten Mitteln.
Tiere, die nicht 4 korrekte Wahlentscheidungen innerhalb von 5 Minuten während der ersten Exposition trafen, oder die nicht insgesamt 8 Wahlentscheidungen bis zum Ende der 2. Exposition trafen, werden für diese Übung als „zeitlich ausgeschieden" angesehen. Jedes Tier, das nach Verabreichung von mehr als einer Dosis der Testverbindung „zeitlich ausschied", wird aus der Analyse ausgeschlossen.
Beispiel 68
Neuroprotektion
Inhibierung des zeitabhängigen Todes von Zellen in primären kortikalen Neuronenkulturen
Primäre kortikale Neuronen wurden aus Rattenhirnen produziert, die 0 bis 1 Tag alt waren, unter Anwendung einer Variation der von Monyer et al., 1989, Brain Research [Hirnforschung] 483: 347-354, beschriebenen Methoden. Ausgebreitetes Hirngewebe wurde in DMEM/10% PDHS (Serum von trächtigen Stutenspendern) für drei Tage gezüchtet und dann mit Cytosinarabinosid (ARC) für zwei Tage behandelt, um kontaminierende Gliazellen zu entfernen. Am Tag 5 wurde das ARC-Medium entfernt und durch DMEM/10% PDHS ersetzt. Die neuronalen Zellen wurden vor ihrer Verwendung für weitere 4 bis 7 Tage gezüchtet.
Primäre neuronale Kontrollkulturen weisen den progressiven Zelltod zwischen dem Tag 12 und 18 in der Kultur auf. Zwölf Kulturen wurden am Tag 12 und 16 auf ihre Spiegel des Enzyms Laktatdehydrogenase (LD) hin ausgewertet, nachdem die Testverbindung am Tag 9 sechs Kulturen, die in DMEM und 10% PDHS gehalten wurden, zugesetzt wurde und die verbleibenden Kulturen als Kontrolle erhalten wurden. Die LD wurde unter Anwendung einer Variation der von Wroblewski et al., 1955, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 90: 210-213 beschriebenen Methode nachgewiesen. Die LD ist ein zytosolisches Enzym, das üblicherweise sowohl in der klinischen als auch in der Grundlagenforschung zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Gewebe verwendet wird. Ein Anstieg der Medien-LD steht in direktem Zusammenhang mit dem Zelltod.
Neuroprotektion gegen die durch Hypoglykämie induzierte Zytotoxizität
Von ATCC bezogene C6 Gliomazellen wurden in RPMI Medium mit FBS in einer Konzentration von 1 × 10<6>Zellen/ml in 25 cm² FALCON-Gewebekulturkolben propagiert. Vier Stunden vor Einsetzen der Hypoglykämie wurde das Erhaltungsmedium verworfen, die Monolagen wurden zweimal im geeigneten Medium gewaschen und dann für vier Stunden bei 37 °C entweder serumfrei oder serumfrei plus Testverbindung inkubiert. Mittels Krebs-Ringer Phosphatpuffer wurden die Monolagen zweimal gewaschen, bevor die geeignete Glukosebehandlung zugesetzt wurde. Das RPMI Medium enthält 2 mg Glucose/ml; die Kolben wurden in Gruppen von 6 unterteilt, die jeweils 100% Glucose (2 mg/ml), 80% Glucose (1,6 mg/ml), 60% Glucose (1,2 mg/ml) oder 0% Glucose (Puffer) erhielten oder mit der Testverbindung ergänzt wurden. Alle Kolben wurden für 20 Stunden inkubiert und dann unter Verwendung von Trypanblau auf die gesamte, lebende und tote Zellenanzahl hin ausgewertet.
Neuroprotektion gegen exzitotoxische Aminosäuren
Fünf SK-N-SH Neuroblastomzellen enthaltende Kulturschalen wurden mit der Testverbindung und fünf Kulturschalen mit dem RPMI Medium behandelt. Vier Stunden später wurden alle Zellen mit NMDA (500 mu M) für 5 Minuten behandelt. Die Gesamtzahl der lebenden und toten Zellen wurde dann bestimmt.
Neuroprotektion gegen Sauerstoff-Glukoseentzug
Analyse von pyknotischen Nuklei zur Messung der Apoptosis:
Kortikale Neuronen werden aus E18 Rattenfeten präpariert und in 8-Well-Kammerobjektträger propagiert, die zuvor mit Poly-D-Lysin (10 ng/ml) und Serum in einer Dichte von 100.000 Zellen/Well überzogen worden sind. Die Zellen werden in Hoch-Glukose-DMEM, das 10% FCS enthält, propagiert und im Inkubator bei 37 °C mit 10% CO₂/90% Luft aufbewahrt. Am nächsten Tag wird das Serum entfernt durch Ersatz des Kulturmediums durch den B27-Zusatz enthaltendes Hoch-Glucose-DMEM und die Zellen werden im Inkubator ohne weiteren Mediumaustausch bis zum Tag des Experiments aufbewahrt. Am Tag 6 werden die Objektträger in zwei Gruppen unterteilt: in die Kontrollgruppe und die OGD-Gruppe. Die Zellen der Kontrollgruppe erhalten DMEM mit Glucose und gebräuchlichem B27 (ohne Antioxidanzien). Die Zellen der OGD-Gruppe erhalten DMEM ohne Glucose mit gebräuchlichem B27, das unter Vakuum für 15 Minuten entgast worden ist. Die Zellen werden mit 90% N₂/10% CO₂ für 10 Minuten in einer luftdichten Kammer gespült und bei 37 °C für 6 Stunden inkubiert. Nach 6 Stunden werden Kontroll- und OGD-Zellen einem Austausch des Mediums unterzogen, das entweder ein Vehikel (DMSO) oder die Testverbindung in Glucose-haltigem DMEM mit gebräuchlichem 627 enthält. Die Zellen werden wieder in den Normoxic-Inkubator bei 37 °C gegeben. Nach 24 Stunden werden die Zellen in 4% PFA für 10 Minuten bei 4 °C fixiert und mit Topro (nukleärer Fluoreszenz-Bindungsfarbstoff) gefärbt. Die Apoptose wird mittels Laser-Scanning-Zytometer durch Messung der pyknotischen Nuklei bestimmt.
Messung der LDH-Freisetzung als Indikation für den Zelltod:
Kortikale Neuronen werden aus E18 Rattenfeten präpariert und in 48-Well-Kulturplatten propagiert, die zuvor mit Poly-D-Lysin (10 ng/ml) und Serum in einer Dichte von 150.000 Zellen/Well überzogen worden sind. Die Zellen werden in Hoch-Glukose-DMEM, das 10% FCS enthält, propagiert und im Inkubator bei 37 °C mit 10% CO₂/90% Luft aufbewahrt. Am nächsten Tag wird das Serum durch Ersatz des Kulturmediums durch den B27-Zusatz enthaltendes Hoch-Glucose- DMEM entfernt. Am Tag 6 werden die Zellen in zwei Gruppen unterteilt: in die Kontrollgruppe und die OGD-Gruppe. Die Zellen der Kontrollgruppe erhalten DMEM mit Glucose und gebräuchlichem B27 (ohne Antioxidanzien). Die Zellen der OGD-Gruppe erhalten DMEM ohne Glucose mit gebräuchlichem B27, das unter Vakuum für 15 Minuten entgast worden ist. Die Zellen werden mit 90% N₂/10% CO₂ für 10 Minuten in einer luftdichten Kammer gespült und bei 37 °C für 6 Stunden inkubiert. Nach 6 Stunden werden Kontroll- und OGD-Zellen einem Austausch des Mediums unterzogen, das entweder ein Vehikel (DMSO) oder die Testverbindung in Glucose-haltigem DMEM mit gebräuchlichem B27 enthält. Die Zellen werden wieder in den Normoxic-Inkubator bei 37 °C gegeben. Nach 24 Stunden wird der Zelltod bestimmt durch Messung der zellulären Freisetzung von LDH (Lactatdehydrogenase) in das Kulturmedium. Für den LDH-Nachweis wird eine Aliquote von 50 μl Kulturmedium in die 96 Wellplatte übertragen. Nach Zugabe von 140 μl 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) und 100 μl 0,2 mg/ml NADH lässt man die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 Minuten ruhen. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 μl Natriumpyruvat initiiert. Die Platte wird sofort bei 340 nM in einem Thermomax Plattenlesegerät (Molecular Devices) gelesen. Der Absorbtionskoeffizient, ein Index der NADH-Konzentration, wird alle 6 Sekunden für 5 Minuten aufgezeichnet und anhand des Gefälles, das die Rate des Verschwindens von NADH anzeigt, wird die LDH-Aktivität berechnet. LDH-Aktivität(IE/ml) = (♠ A/Minute)(TCF)(20) (0,0833)/(0,78)wobei: 0,0833 = Proportionalitätskonstante
0,78 = Instrumentenlichtpfadlänge (cm).
Beispiel 69
Testverfahren mit HLA Ratten-Crohn-Krankheit und entzündliche Darmerkrankungen
Männliche HLA-B27 Ratten werden von Taconic bezogen und erhalten uneingeschränkten Zugang zu Futter (PMI Labornahrung 5001) und Wasser. Zu Beginn der Studie sind die Ratten 22 bis 26 Wochen alt.
Den Ratten wird einmal täglich sieben Tage lang eines der nachstehend aufgelisteten Präparate subkutan verabreicht. Fünf Ratten befinden sich in jeder Gruppe und die letzte Dosis wird zwei Stunden vor dem Euthanasieren verabreicht.

– Vehikel (50% DMSO/50% Dulbecco's PBS)
– 17α-Ethinyl-17β-Östradiol (10 μg/kg)
– Testverbindung

Die Stuhlqualität wird täglich beobachtet und nach folgender Skala eingestuft: Diarrhö = 3; weicher Stuhl = 2; normaler Stuhl = 1. Am Ende des Testverfahrens wird Serum entnommen und bei –70 °C gelagert. Ein Kolonschnitt wird für die histologische Analyse präpariert und ein zusätzliches Segment auf die Myeloperoxidaseaktivität hin analysiert.
Zur Messung der Myeloperoxidaseaktivität wird folgende Methode angewandt. Kolongewebe wird entnommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Eine repräsentative Probe des ganzen Kolons wird dazu verwendet, um die Übereinstimmung zwischen den Proben sicherzustellen. Das Gewebe wird bei –80 °C bis zur Verwendung gelagert. Als nächstes wird das Gewebe gewogen (etwa 500 mg) und homogenisiert in 1:15 w/v von 5 mM H₂KPO₄ (pH 6) Waschpuffer. Das Gewebe wird bei 20.000 × g in einer Sorvall RC 56 Zentrifuge für 45 Minuten bei 2 bis 8 °C herunter zentrifugiert. Der Überstand wird dann verworfen. Das Gewebe wird in 2,5 ml (1:5 w/v) von 50 mM H₂KPO₄ mit 10 mM EDTA und 0,5% Hex.-Ammoniumbromid resuspendiert und homogenisiert, um das Auflösen der intrazellulären MPO zu begünstigen. Das Gewebe wird in flüssigem Stickstoff gefroren, in einem 37 °C-Wasserbad aufgetaut und für 15 Sekunden beschallt, um die Membranlyse sicherzustellen. Dieses Verfahren wird dreimal wiederholt. Die Proben werden dann für 20 Minuten auf Eis gehalten und mit 12.000 × g für 15 Minuten bei 2 bis 8 °C zentrifugiert. Der Überstand wird nach folgenden Schritten analysiert.
Die Testmixtur wird durch Zugabe von 2,9 ml von 50 mM H₂KPO₄ mit 0,167 O-Dianisidin/ml mit 0,0005% H₂O₂ in ein Reaktionsröhrchen zubereitet. Wenn das Wasserstoffperoxid abgebaut ist, wird das O-Dianisidin oxidiert und absorbiert bei 460 nm in Abhängigkeit der Konzentration. Die Mixtur wird auf 25 °C erwärmt. Einhundert (100) μl des Gewebeüberstands werden in das Reaktionsröhrchen zugefügt, für eine Minute bei 25 °C inkubiert, dann wird 1 ml zu einer verfügbaren Plastikwanne übertragen. Das OD wird alle 2 Minuten während der Reaktionszeit bei 460 nm gegen eine Blindprobe, die 2,9 ml der Reaktionsmixtur und 100 μl der 0,5% Ammoniumbromidlösung enthält, gemessen.
Die Enzymaktivitätseinheiten werden quantifiziert durch Vergleich des Absorptionskoeffizienten @ 460 mit einer Standardkurve, die mit gereinigter humaner MPO, 31,1 Einheiten/Glasfläschchen, erstellt wurde. Die MPO wird rekonstituiert und seriell verdünnt unter Verwendung von 50 mM H₂KPO₄ mit 10 mM EDTA und 0,5% Hex.-Ammoniumbromid in vier bekannte Konzentrationen. Die Absorptionskoeffizienten der Probe werden mit dieser Kurve verglichen, um die Aktivität zu bestimmen.
Die histologische Analyse wird wie folgt durchgeführt. Kolongewebe wird in 10% neutralem gepuffertem Formalin immergiert. Jede Kolonprobe wird zur Auswertung in vier Gruppen aufgeteilt. Die Formalin-fixierten Gewebe werden in einem Vakuum infiltrationsprozessor für die Paraffineinbettung behandelt. Die Proben werden bei 5 μm geschnitten und dann mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) für histologische Blindauswertungen unter Verwendung einer nach Boughton-Smith modifizierten Skala gefärbt. Nach Abschluss der Zählung werden die Proben gereinigt und die Daten tabelliert und mittels linearer ANOVA Schablone mit multiplen Durchschnittsvergleichen analysiert.

Claims

Verbindung der Formel:
wobei R¹ und R² ein jedes unabhängig H, Halogen, CN, optional substituiertes Phenyl oder optional substituiertes C₁-C₆ Alkyl ist; R³, R⁴, R⁵ und R⁶ ein jedes unabhängig H, OH, Halogen, CN, optional substituiertes Phenyl, optional substituiertes C₁-C₆ Alkyl oder optional substituiertes C₁-C₆ Alkoxy ist; jedes R⁸ H ist und R⁹ optional substituiertes C₁-C₆ Alkyl ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei: R¹ und R² ein jedes unabhängig H, Halogen, CN, unsubstituiertes Phenyl oder unsubstituiertes C₁-C₆ Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Verbindung folgende Formel aufweist:
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung folgende Formel aufweist:
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R³, R⁵ und R⁶ ein jedes unabhängig H, Cl, F, Methyl oder Methoxy und R² H, Cl, F oder Methyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, die eine der Folgenden ist: (a) 4'-Hydroxy-3-Methyl[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd-Oxim; (b) 4'-Hydroxy[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd-Oxim; (c) 3-Chlor-4'-Hydroxy[1,1'-Biphenyl]-4-Carbaldehyd-Oxim; (d) 2-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim; (e) 3-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim; (f) 2-Chlor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim; (g) 3-Chlor-4'-Hydroxy-2'-Methyl-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim; (h) 4'-Hydroxy-2-Methyl-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim; (i) 3-Chlor-3'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim; (j) 3-Chlor-3',5'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim; (k) 3,5-Dichlor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim; (l) 3,5-Dichlor-3'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim; (m) 2,3-Dichlor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim; (n) 2,3-Dichlor-3'-Fluor-4'-Hydroxy-1,1'-Biphenyl-4-Carbaldehyd-Oxim, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz einer dieser Verbindungen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: a) eine Verbindung, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 definiert ist und b) einen pharmazeutischen Träger.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als ein Medikament.
Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung der Osteoporose; zur Hemmung der Osteoarthritis, Hypokalziämie, Hyperkalziämie, des Paget-Krebses, Osteomalazie, Osteohalisterese, des multiplen Myeloms oder anderer Krebsformen, die schädliche Wirkungen auf Knochengewebe haben; zur Hemmung des benignen oder malignen abnormen Gewebewachstums; zur Senkung der Cholesterin-, Triglyzeride-, Lp(a)- oder LDL-Spiegel; zur Hemmung der Hypercholesterinämie; Hyperlipidämie; kardiovaskulären Erkrankung; Atherosklerose; peripheren vaskulären Erkrankung; Restenose oder des Vasospasmus; oder zur Hemmung eines durch zelluläre Ereignisse verursachten Gefäßwandschadens, der zum immunvermittelten Gefäßschaden führt; zur Hemmung von durch freie Radikale induzierten Krankheitszuständen; zur Steigerung der Erkenntnisfähigkeit oder Erzeugung einer Neuroprotektion; oder zur Behandlung oder Hemmung der senilen Dementien, Alzheimer-Krankheit, Abnahme der Erkenntnisfähigkeit oder von neurodegenerativen Störungen; zur Hemmung der entzündlichen Darmerkrankung, ulzerativen Proktitis, Crohn-Krankheit, Kolitis, von Hitzewallungen, der Atrophie der Vagina oder Vulva, atrophischen Vaginitis, vaginalen Trockenheit, des Pruritus, der Dyspareunie, Dysurie, des häufigen Urinierens, der Harninkontinenz, von Harntraktinfektionen, vasomotorischen Symptomen; des Haarausfalls beim Mann; der Hautatrophie; Akne; des Typ-II-Diabetes; der dysfunktionellen Uterusblutung oder Unfruchtbarkeit oder zur Hemmung der Leukämie, endometrialer Ablationen, chronischer Nieren- oder Lebererkrankungen oder Koagulopathien bei einem Säugetier.