DE602004004124T2

DE602004004124T2 - Aryl-carbaldehyd oxime-verbindungen und deren verwendung als oestrogenwirksame substanzen

Info

Publication number: DE602004004124T2
Application number: DE602004004124T
Authority: DE
Inventors: Richard Eric King of Prussia Meushaw; Todd Stephen Reading COHN
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2003-05-16
Filing date: 2004-05-13
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2024-05-14
Also published as: US7157491B2; PL1633699T3; CN100344610C; US20070043077A1; WO2004103941A3; BRPI0410645A; EP1633699B1; AU2004241246A1; DK1633699T3; EP1633699A2; DE602004004124D1; CN1791570A; ES2277273T3; JP2007503466A; CA2525310A1; ATE350366T1; MXPA05012249A; WO2004103941A2; US20050009907A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf Aryl-Carbaldehyd Oxime-Derivate und in gewissen Aspekten auf (Hydroxyphenyl)-Aryl-Carbaldehyd Oxime-Derivate, deren Verwendung als östrogenwirksame Substanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die pleiotropischen Wirkungen des Östrogens in Säugetiergeweben sind gut dokumentiert und man schätzt gegenwärtig, dass Östrogene auf viele Organsysteme einwirken [Mendelsohn und Karas, New England Journal of Medicine [Zeitschrift für Medizin in Neu England] 340: 1801-1811 (1999), Epperson et al., Psychosomatic Medicine [Psychosomatische Medizin] 61: 676-697 (1999), Crandall, Journal of Womens Health & Gender Based Medicine [Zeitschrift für die Gesundheit von Frauen und geschlechtsspezifische Medizin) 8: 1155-1166 (1999), Monk und Brodaty, Dementia & Geriatrie Cognitive Disorders [Demenz und geriatrische Störungen der Erkenntnisfähigkeit] 11: 1-10 (2000), Hum und Macrae, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism [Zeitschrift für zerebralen Blutstrom und Stoffwechsel] 20: 631-652 (2000), Calvin, Maturitas 34: 195-210 (2000), Finking et al., Zeitschrift für Kardiologie 89: 442- 453 (2000), Brincat, Maturitas 35: 107-117 (2000), Al-Azzawi, Postgraduate Medical Journal [Medizinische Zeitschrift für Postgraduierte] 77: 292-304 (2001)]. Östrogene können Effekte auf Gewebe in verschiedener Weise ausüben. Wahrscheinlich ist der bestcharakterisierte Aktionsmechanismus ihre Interaktion mit Östrogenrezeptoren, die zu Veränderungen in der Gentranskription führt. Östrogenrezeptoren sind Ligand-aktivierte Transkriptionsfaktoren und gehören zur Superfamilie der nuklearen Hormonrezeptoren. Andere Mitglieder dieser Familie umfassen das Progesteron, androgene, glucocorticoide und mineralcorticoide Rezeptoren. Nach der Ligandbindung dimerisieren diese Rezeptoren und können die Gentranskription aktivieren entweder durch direkte Bindung an spezifische Sequenzen auf der DNA (bekannt als Antwortelemente) oder durch Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren (wie dem AP1), die ihrerseits direkt an spezifische. DNA-Sequenzen anbinden [Moggs und Orphanides, EMBO Reports [EMBO Berichte] 2: 775-781 (2001), Hall et al., Journal of Biological Chemistry [Zeitschrift für Biochemie] 276: 36869-36872 (2001), McDonnell, Principles of Molecular Regulation [Grundsätze der molekularen Regulation] S. 351-361 (2000)]. Eine Klasse von "koregulatorischen" Proteinen kann auch mit dem Ligand-gebundenen Rezeptor interagieren und seine Transkriptionsaktivität weiter modulieren [McKenna et al., Endocrine Reviews [Endokrine Rezensionen] 20: 321-344 (1999)]. Es ist auch nachgewiesen, dass Östrogenrezeptoren die NFκB-vermittelte Transkription sowohl auf Ligand-abhängige als auch unabhängige Weise supprimieren können [Quaedackers et al., Endocrinology [Endokrinologie] 142: 1156-1166 (2001), Bhat et al., Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology [Zeitschrift für Steroidbiochemie & Molekularbiologie] 67: 233-240 (1998), Pelzer et al., Biochemical & Biophysical Research Communications [Biochemische und biophysikalische Forschungsmitteilungen] 286: 1153-7 (2001)].
Östrogenrezeptoren können auch durch Phosphorylierung aktiviert werden. Diese Phosphorylierung wird durch Wachstumsfaktoren wie der EGF vermittelt und verursacht Änderungen in der Gentranskription in Abwesenheit von Liganden [Moggs und Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001)].
Ein weniger gut charakterisierter Modus, in dem Östrogene Zellen beeinflussen können, geschieht durch einen so genannten Membranrezeptor. Die Existenz eines solchen Rezeptors wird kontrovers betrachtet, aber gut dokumentiert ist die Tatsache, dass Östrogene Zellen sehr schnelle nicht-genomische Antworten entlocken können. Die für die Transduktion dieser Effekte verantwortliche molekulare Einheit ist noch nicht endgültig isoliert worden, eindeutige Hinweise lassen aber vermuten, dass zumindest ein Zusammenhang besteht mit den nuklearen Formen der Östrogenrezeptoren [Levin, Journal of Applied Physiology [Zeitschrift für angewandte Physiologie] 91: 1860-1867 (2001), Levin, Trends in Endocrinology & Metabolism [Trends in Endokrinologie und Stoffwechsel] 10: 374-377 (1999)].
Zwei Östrogenrezeptoren sind bis jetzt entdeckt worden. Der erste Östrogenrezeptor wurde vor etwa 15 Jahren geklont und wird nun mit ERα bezeichnet [Green et al., Nature [Natur] 320: 134-9 (1986)]. Der zweite wurde vergleichsweise erst vor kurzem entdeckt und wird ERβ genannt [Kuiper et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [Verfahrensweisen der Nationalen Akademie für Wissenschaften der Vereinigten Staaten von Amerika] 93: 5925-5930 (1996)]. Die frühe Forschung über ERβ zielte darauf ab, seine Affinität für eine Vielfalt von Liganden zu definieren, und in der Tat wurden einige Unterschiede zum ERα herausgefunden. Die Gewebeverteilung des ERβ wurde am Nagetier gut kartographiert und stimmt nicht mit ERα überein. Gewebe wie Maus- und Rattenuterus exprimieren vorherrschend ERα, während Maus- und Rattenlunge vorherrschend ERβ exprimieren [Couse et al., Endocrinology 138: 4613-4621 (1997), Kuiper et al., Endocrinology 138: 863-870 (1997)]. Sogar innerhalb desselben Organs kann die Verteilung von ERα und ERβ in Felder aufgeteilt sein. Zum Beispiel wird im Mauseierstock ERβ hochgradig exprimiert in den granulierten Zellen und ERα ist auf die Theka- und Stromazellen beschränkt [Sar und Welsch, Endocrinology 140: 963-971 (1999), Fitzpatrick et al., Endocrinology 140: 2581-2591 (1999)). Es gibt jedoch Beispiele, bei denen die Rezeptoren koexprimiert sind, und aus In-vitro-Studien liegt der Beweis vor, dass ERα und ERβ Heterodimere bilden können [Cowley et al., Journal of Biological Chemistry 272: 19858-19862 (1997)].
Das potenteste endogene Östrogen ist das 17β-Östradiol. Über eine große Anzahl von Verbindungen wurde beschrieben, dass sie die Aktivität des 17β-Östradiols entweder nachahmen oder blockieren. Verbindungen, die praktisch dieselben biologischen Effekte wie das 17β-Östradiol haben, werden „Östrogenrezeptoragonisten" genannt. Solche, die die Wirkung des 17β-Östradiols blockieren, wenn sie in Kombination mit ihm verabreicht werden, werden „Östrogenrezeptorantagonisten" genannt. In Wirklichkeit besteht ein Kontinuum zwischen der Östrogenrezeptoragonisten- und Östrogenrezeptorantagonistenaktivität und einige Verbindungen verhalten sich in der Tat wie Östrogenrezeptoragonisten in einigen Geweben und wie Östrogenrezeptorantagonisten in anderen. Diese Verbindungen mit gemischter Aktivität werden selektive Östrogenrezeptormodulatoren (SERMS) genannt und sind therapeutisch brauchbare Agenzien (z. B. EVISTA) [McDonnell, Journal of the Society for Gynecologic Investigation [Zeitschrift der Gesellschaft für gynäkologische Untersuchungen] 7: S10-S15 (2000), Goldstein et al., Human Reproduction Update [Neuester Stand der humanen Reproduktion] 6: 212-224 (2000)]. Der genaue Grund, weshalb dieselbe Verbindung zellspezifische Effekte ausüben kann, ist noch nicht aufgeklärt, aber es ist auf die Unterschiede bei der Rezeptoranpassung und/oder im Milieu der koregulatorischen Proteine hingewiesen worden.
Seit einiger Zeit ist bekannt, dass Östrogenrezeptoren verschiedene Gestaltungen annehmen, wenn sie Liganden binden. Jedoch wurde die Konsequenz und Subtilität dieser Änderungen erst vor kurzem aufgedeckt. Die dreidimensionalen Strukturen von ERα und ERβ wurden durch Ko-Kristallisation mit verschiedenen Liganden gelöst und zeigen eindeutig die Repositionierung der Helix 12 in Gegenwart eines Östrogenrezeptorantagonisten, der die Proteinsequenzen, die für die Rezeptor-koregulatorische Proteininteraktion erforderlich sind, sterisch hindert (Pike et al., Embo 18: 4608-4618 (1999), Shiau et al., Cell [Zelle] 95: 927-937 (1998)]. Hinzu kommt, dass die Technik der Phagendarstellung angewandt wurde, um Peptide zu identifizieren, die mit Östrogenrezeptoren in Gegenwart verschiedener Liganden interagieren [Paige et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 3999-4004 (1999)]. Zum Beispiel wurde ein Peptid identifiziert, das zwischen ERα, der an die vollen Östrogenrezeptoragonisten 17β-Östradiol und Diethylstilbesterol gebunden ist, unterschied. Von einem anderen Peptid wurde nachgewiesen, dass es zwischen Clomiphen, das an ERα und ERβ gebunden war, unterschied. Diese Daten weisen darauf hin, dass jeder Ligand dem Rezeptor potentiell eine einmalige und nicht vorhersehbare Gestaltung verleiht, die wahrscheinlich unterschiedliche biologische Aktivitäten aufweist.
Wie oben erwähnt beeinflussen Östrogene ein Spektrum biologischer Prozesse. Außerdem ist es, wenn Geschlechtsunterschiede beschrieben werden (z. B. Krankheitshäufigkeiten, Reaktionen auf Ansteckung usw.), möglich, dass die Darstellung auf den Unterschied der Östrogenspiegel zwischen Männern und Frauen hinweist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf Aryl-Carbaldehyd Oxime-Derivate, insbesondere solche, die als östrogenwirksame Mittel Anwendung finden. Nach einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Aryl-Carbaldehydderivate der Formel:
R¹ Wasserstoff, Halogen, ein niedriges Alkyl, CN oder ein niedriges Alkoxy ist;
R² und R³ zusammen einen fusionierten Aryl- oder Heteroarylring bilden;
R⁴ Wasserstoff, Halogen, ein niedriges Alkyl, CN oder ein niedriges Alkoxy ist;
R⁵ Wasserstoff, ein niedriges Alkyl und -C(O)R⁶ und
R⁶ ein niedriges Alkyl ist,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. Bei einigen bevorzugten Ausführungen ist R⁵ H.
Nach einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine der oben genannten Verbindungen sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Nach noch weiteren Aspekten konzentriert sich die Erfindung auf die Verwendung oben genannter Verbindungen für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung und Verhütung von Krankheiten, einschließlich zum Beispiel der entzündlichen Darmerkrankung wie die Crohn-Krankheit und Kolitis.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung schlägt Aryl-Carbaldehyd Oxime-Derivate vor. Diese Verbindungen, die vorzugsweise als östrogenwirksame Substanzen wirken, sind für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung und Verhütung von Krankheiten wie den entzündlichen Darmerkrankungen (einschließlich der Crohn-Krankheit und Kolitis) von Nutzen. Nach einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen der Formel I:
wobei
R¹ Wasserstoff, Halogen, ein niedriges Alkyl, CN oder ein niedriges Alkoxy ist;
R² und R³ zusammen einen fusionierten Aryl- oder Heteroarylring bilden;
R⁴ Wasserstoff, Halogen, ein niedriges Alkyl, CN oder ein niedriges Alkoxy ist;
R⁵ Wasserstoff, ein niedriges Alkyl und -C(O)R⁶ und
R⁶ ein niedriges Alkyl ist,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. Bei einigen bevorzugten Ausführungen ist R⁵ H.
In gewissen bevorzugten Ausführungen ist R¹ Halogen, bilden R² und R³ zusammen einen 5- oder 6-gliedrigen fusionierten Ring wie Phenyl, Furan, Thiophen, und ist R⁴ H oder Halogen.
Pharmazeutisch annehmbare Salze können aus organischen und anorganischen Säuren gebildet werden wie zum Beispiel Essig-, Propion-, Milch, Citronen-, Wein-, Bernstein-, Fumar-, Malein-, Malon-, Mandel-, Apfel-, Phthal-, Salz-, Bromwasserstoff-, Phosphor-, Stickstoff-, Schwefel- , Methansulfon-, Naphthalensulfon-, Benzolsulfon-, Toluensulfon-, Kampfersulfon- und ähnlich bekannten annehmbaren Säuren, wenn eine erfindungsgemäße Verbindung einen basischen Anteil enthält. Salze können auch aus organischen und anorganischen Basen gebildet werden wie die Alkalimetallsalze, zum Beispiel erdalkalischen Natrium-, Lithium- oder Kalium-Metallsalze, Ammoniumsalze, Alkylammoniumsalze, die 1 bis 6 C-Atome enthalten oder Dialkylammoniumsalze, die 1 bis 6 C-Atome in jeder Alkylgruppe enthalten, und Trialkylammoniumsalze, die 1 bis 6 C-Atome in jeder Alkylgruppe enthalten, wenn eine erfindungsgemäße Verbindung einen sauren Anteil enthält.
Der Begriff „Aryl" bedeutet einen carbocyclischen aromatischen Ring mit 6 bis 10 C-Atomen wie Phenyl. Der Begriff „Heteroaryl" bedeutet einen 5- oder 6-gliedrigen aromatischen Ring, der 1 Heteroatom oder mehrere, z. B. 1 bis 3, Heteroatome enthält, die aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt sind. Aryl- und Heteroarylgruppen können optional substituiert sein.
Der Begriff „Alkyl", wie er hier verwendet wird, bezieht sich, gleichgültig ob allein oder als Teil einer anderen Gruppe verwendet, auf eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Kohlenwasserstoffkette und umfasst z. B. gerade und verzweigte Ketten, die 1 bis 12 C-Atome, vorzugsweise 1 bis 6 C-Atome enthalten, es sei denn, etwas Anderes wird ausdrücklich angegeben. Zum Beispiel werden Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, i-Butyl und t-Butyl vom Begriff „Alkyl" mit erfasst. Vor allem sind in der Definition des Begriffs „Alkyl" solche aliphatische Kohlenwasserstoffketten mit enthalten, die optional substituiert sind.
Die Kohlenstoffanzahl, die in den Definitionen dieser Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf die Kohlenstoffhauptkette und Kohlenstoffverzweigungen, enthält aber keine C-Atome der Substituenten, wie Alkoxysubstitutionen und Ähnliches.
Der Begriff "Alkenyl", wie er hier verwendet wird, bezieht sich, gleichgültig ob allein oder als Teil einer anderen Gruppe verwendet, auf eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Kohlenwasserstoffkette und umfasst z. B. gerade und verzweigte Ketten, die 2 bis 8 C-Atome und mindestens eine Doppelbindung aufweisen. Vorzugsweise hat der Alkenylanteil 1 oder 2 Doppelbindungen. Solche Alkenylanteile können in den E- oder Z-Gestaltungen existieren und die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen beide Gestaltungen. Besonders in der Definition von "Alkenyl" eingeschlossen sind solche aliphatische Kohlenwasserstoffketten, die optional substituiert sind. Heteroatome, wie O, S oder N-R₁, die an ein Alkenyl angeheftet sind, sollten nicht an ein C-Atom geheftet sein, das an eine Doppelbindung gebunden ist.
Der Begriff "Phenyl", wie er hier verwendet wird, bezieht sich, gleichgültig ob allein oder als Teil einer anderen Gruppe verwendet, auf eine substituierte oder unsubstituierte Phenylgruppe.
Ein optional substituiertes Alkyl, Alkenyl, Aryl, Heteroaryl und Phenyl kann durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein. Geeignete optionale Substituenten können unabhängig ausgewählt sein aus Nitro, Cyano, -N(R₁₁)(R₁₂), Halo, Hydroxy, Carboxy, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Aryloxy, Heteroaryloxy, Alkylalkoxy, Alkoxycarbonyl, Alkoxyalkoxy, Pertluoralkyl, Perfluoralkoxy, Arylalkyl, Alkylaryl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Alkylthio, -S(O)₂-N(R₁₁)(R₁₂), -C(=O)-N(R₁₁)(R₁₂), (R₁₁)(R₁₂)N-Alkyl, (R₁₁)(R₁₂)N-Alkoxyalkyl, (R₁₁)(R₁₂)N-Alkylaryloxyalkyl, -S(O)_s-Aryl (wobei s = 0 bis 2) oder -S(O)_s-Heteroaryl (wobei s = 0 bis 2). Bei gewissen erfindungsgemäßen Ausführungen schließen bevorzugte Substituenten für Alkyl, Alkenyl, Alkynyl und Cycloalkyl Nitro, Cyano -N(R₁₁)(R₁₂), Halo, Hydroxyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Alkoxyalkyl und Alkoxycarbonyl ein. Bei gewissen erfindungsgemäßen Ausführungen schließen bevorzugte Substituenten für Aryl und Heteroaryl -N(R₁₁)(R₁₂), Alkyl, Halo, Perfluoralkyl, Perfluoralkoxy, Arylalkyl und Alkylaryl ein.
Der Begriff Halogen umfasst Brom, Chlor, Fluor und Iod.
Der Begriff „niedriges Alkyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, die 1 bis 6 C-Atome, in einigen bevorzugten Ausführungen 1 bis 3 C-Atome, besitzt.
Der Begriff "niedriges Alkoxy" bezieht sich, wie er hier verwendet wird, auf die Gruppe R-O-, wobei R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 C-Atomen, in einigen bevorzugten Ausführungen 1 bis 3 C-Atomen, ist.
Wie in Übereinstimmung mit dieser Erfindung verwendet bedeutet der Begriff "liefern" in Bezug auf die Lieferung einer Verbindung oder Substanz, die von dieser Erfindung erfasst wird, entweder die direkte Verabreichung einer solchen Verbindung oder Substanz oder die Verabreichung einer Arzneimittelvorstufe, eines Derivats oder Analogs, die die wirksame Menge der Verbindung oder Substanz innerhalb des Körpers bilden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Östrogenrezeptormodulatoren, die für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Hemmung von Zuständen, Störungen oder Krankheitszuständen, die zumindest teilweise durch einen Östrogenmangel oder -überschuss ausgelöst werden, oder die durch die Anwendung von östrogenen Wirkstoffen behandelt oder gehemmt werden können, von Nutzen sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind besonders brauchbar zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer peri-menopausalen, menopausalen oder postmenopausalen Patientin, bei der die Spiegel der produzierten endogenen Östrogene erheblich gesenkt sind. Die Menopause wird im Allgemeinen definiert als die letzte natürliche mensuale Periode und ist gekennzeichnet durch die Einstellung der Eierstockfunktion, die zu einer wesentlichen Verminderung der Östrogenzirkulation im Blutstrom führt. Wie hier verwendet schließt der Begriff Menopause auch Zustände einer verminderten Östrogenproduktion ein, die chirurgisch, chemisch oder durch einen zur vorzeitigen Verminderung oder Einstellung der Eierstockfunktion führenden Krankheitszustand verursacht sein kann.
Dementsprechend sind die erfindungsgemäßen Verbindungen von Nutzen für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Hemmung von Osteoporose und zur Hemmung von Knochendemineralisation, die aus einem Ungleichgewicht der Bildung neuer Knochengewebe und der Resorption älterer Gewebe bei einem Individuum resultieren kann, das zu einem deutlichen Knochenverlust führt. Ein solcher Knochenflüssigkeitsentzug entsteht bei einer Reihe von Individuen, insbesondere bei Frauen nach der Menopause, bei Frauen, die einer beidseitigen Oophorektomie unterzogen wurden, eine ausgedehnte Kortikosteroidtherapie durchführen oder durchgeführt haben, unter Gonadendysgenesie leiden und bei Frauen, die am Cushing-Syndrom leiden. Auch kann der besondere Bedarf an Knochen-, einschließlich Zahn- und Mundknochenersatz bei Personen mit Knochenfrakturen, defekten Knochenstrukturen und solchen, die Knochenoperationen und/oder einer Prothesenimplantation unterzogen wurden, durch die Anwendung dieser Verbindungen gedeckt werden. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Problemen können diese Verbindungen zur Behandlung oder Hemmung der Osteoarthritis, Hypokalzämie, Hyperkalzämie, des Paget-Krankheit, der Osteomalazie, Osteohalisterese, multipler Myelome und anderer Formen von Krebs mit deletären Wirkungen auf das Knochengewebe von Nutzen sein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch brauchbar für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Hemmung anormalen benignen oder malignen Gewebewachstums, einschließlich der Prostatahyperplasie, uterinen Leiomyome, des Brustkrebses, der Endometriose, eines Endometriumkarzinoms, polyzystischen Eierstocksyndroms, der Endometriumpolypen, einer benignen Brusterkrankung, Adenomyose, eines Ovarialkarzinoms, Melanoms, Prostratakarzinoms, Kolonkarzinoms, der Karzinome des ZNS, wie Glioma oder Astroblastoma.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind kardioprotektiv und brauchbar zur Senkung der Cholesterin-, Triglyzerid-, Lp(a)- oder LDL-Spiegel, zur Inhibierung oder Behandlung der Hypercholesterinämie, Hyperlipidämie, kardiovaskulären Erkrankung, Atherosklerose, peripheren vaskulären Erkrankung, Restenose oder eines Vasospasmus, zur Inhibierung eines Gefäßwandschadens nach zellulären Ereignissen, der zum immunvermittelten Gefäßschaden führt. Diese kardioprotektiven Eigenschaften sind von großer Bedeutung bei der Behandlung von Patienten nach der Menopause mit Östrogenen zur Hemmung der Osteoporose und bei Männern im Falle einer indizierten Östrogentherapie.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch Antioxidanzien und daher brauchbar zur Behandlung oder Inhibierung von durch freie Radikale induzierten Krankheitszuständen. Spezifische Situationen, in denen die Sicherstellung einer Antioxidans-Therapie indiziert ist, sind Karzinome, Störungen des Zentralnervensystems, die Alzheimer-Krankheit, Knochenkrankheit, der Alterungsprozess, entzündliche Syndrome, periphere vaskuläre Erkrankungen, rheumatoide Arthritis, Autoimmunkrankheiten, respiratorische Leiden, Emphysem, Verhinderung eines Reperfusionsschadens, virale Hepatitis, chronische aktive Hepatitis, Tuberkulose, Psoriasis, systemischer Lupus erythematodes, akutes Lungenversagen, Trauma des Zentralnervensystems und Schlaganfall.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch brauchbar zur Verbesserung des Erkenntnisvermögens oder für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Inhibierung der senilen Demenz, Alzheimer-Krankheit, der Abnahme des Erkenntnisvermögens, neurodegenerativer Störungen sowie zur Neuroprotektion oder Steigerung der Erkenntnisfähigkeit.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sich auch von Nutzen zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Inhibierung der entzündlichen Darmerkrankung, ulzerativen Proktitis, Crohn-Krankheit und Kolitis, mit der Menopause zusammenhängender Zustände wie vasomotorischer Symptome einschließlich Hitzewallungen, der vaginalen oder vulvären Atrophie, atrophischen Vaginitis, vaginalen Trockenheit, Pruritus, Dyspareunie, Dysurie, Pollakiurie, der Harninkontinenz, Infektionen des Harntrakts, vasomotorischer Symptome einschließlich Hitzewallungen, Myalgie, Arthraigie, Schlaflosigkeit, Reizbarkeit und Ähnliches; der männlichen Kahlköpfigkeit, Hautatrophie; Akne; des Typ-2-Diabetes, der dysfunktionellen uterinen Blutung oder Infertilität.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sich auch von Nutzen bei Krankheitszuständen, bei denen Amenorrhö von Vorteil ist, wie bei Leukämie, Endometriumablationen, chronischen Nieren- oder Leberleiden oder Koagulationskrankheiten oder -störungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Kontrazeptiva, insbesondere in Kombination mit einem Progesteron, eingesetzt werden.
Bei der Verabreichung zur Behandlung oder Inhibierung eines besonderen Krankheitszustands oder einer Stärung ist es selbstverständlich, dass die wirksame Dosis von der besonderen, applizierten Verbindung, dem Verabreichungsmodus, dem Zustand und der Schwere des zu behandelnden Leidens sowie von verschiedenen physischen Faktoren abhängt, die mit dem zu behandelnden Individuum verbunden sind. Die wirksame Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in einer oralen Dosis von etwa 0,1 mg/Tag bis etwa 1.000 mg/Tag betragen. Vorzugsweise beträgt die Verabreichung von etwa 10 mg/Tag bis etwa 600 mg/Tag, bevorzugter von etwa 50 mg/Tag bis etwa 600 mg/Tag, in einer Einzeldosis oder in zwei oder mehreren unterteilten Dosierungen. Man geht davon aus, dass die vorgesehenen Tagesdosierungen mit der Verabreichungsroute variieren.
Solche Dosen können auf eine Weise verabreicht werden, die sinnvoll ist, um die erfindungsgemäßen aktiven Verbindungen in den Blutstrom des Empfängers zu leiten, einschließlich der oralen Verabreichung, über Implantate, der parenteralen (einschließlich intraveröser, intraperitonealer und subkutaner Injektionen), rektalen, intranasalen vaginalen und transdermalen Verabreichung.
Orale Zubereitungen, die die aktive erfindungsgemäße Verbindungen enthalten, können jede herkömmlich verwendete orale Form annehmen, einschließlich Tabletten, Kapseln, Lutschtabletten in verschiedenen Formen wie Pastillen oder Rauten, und oral einzunehmende Flüssigkeiten, Suspensionen oder Lösungen. Kapseln können Mixturen der aktiven Verbindungen) mit inerfen Füllstoffen und/oder Verdünnungsmitteln enthalten wie pharmazeutisch annehmbare Stärken (z. B. Mais-, Kartoffel- oder Tapiokastärke), Zuckerarten, künstliche Süßstoffe, pulverisierte Cellulosen, wie kristalline und mikrokristalline Cellulosen, Mehlsorten, Gelatinen, Gummis usw. Nützliche Tablettenzubereitungen können mittels herkömmlicher Kompression, nasser oder trockener Granulationsmethoden hergestellt werden und pharmazeutische annehmbare Verdünnungsmittel, Bindemittel, Schmiermittel, Zerkleinerungsmittel, Oberflächen modifizierende Mittel (einschließlich Tenside), Suspendiermittel oder Stabilisatoren, einschließlich zum Beispiel Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talk, Natriumlaurylsulfat, mikrokristalline Cellulose, Carboxymethylcellulose, Calcium, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Alginsäure, Gummi arabicum, Xanthangummi, Natriumcitrat, Komplexsilikate, Calciumcarbonat, Glycin, Dextrin, Saccharose, Sorbitol, Dicalciumphosphat, Calciumsulfat, Lactose, Kaolin, Mannit, Natriumchlorid, Talk, trockene Stärken und pulverisierten Zucker enthalten. Bevorzugte Oberflächen modifizierende Agenzien umfassen nicht ionische und anionische Oberflächen modifizierende Agenzien. Repräsentative Beispiele Oberflächen modifizierender Agenzien umfassen beispielsweise Poloxamer 188, Benzalkoniumchlorid, Calciumstearat, Cetostearl Alkohol, Cetomacrogol emulsifizierendes Wachs, Sorbitanester, Kolloidolsilicondioxid, Phosphate, Natriumdodecylsulfat, Magnesiumaluminiumsilikat und Triethanolamin. Orale erfindungsgemäße Zubereitungen können Formulierungen verwenden, die verzögert oder über einen gewissen Zeitraum freigesetzt werden, um die Absorption der aktiven Verbindungen) zu verändern. Die orale Zubereitung kann auch in der Verabreichung des aktiven Wirkstoffs in Wasser oder in einem Obstsaft bestehen und geeignete Lösungsvermittler oder Emulgatoren je nach Bedarf beinhaften.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Verbindungen direkt in die Luftwege in Form eines Aerosols zu verabreichen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Lösungen oder Suspensionen dieser aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch annehmbares Salz können in Wasser zubereitet werden, das auf geeignete Weise mit einem Tensid wie Hydroxypropylcellulose vermischt ist. Dispersionen können auch in Glyzerin, flüssigen Polyethylenglykolen und Mixturen davon in Ölen zubereitet werden. Unter normalen Lager- und Benutzungsbedingungen enthaften diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Formen, die für die injizierbare Anwendung geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die Zubereitung im Moment der Verabreichung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muss die Farm steril und in dem Maße flüssig sein, dass ein leichtes Aufziehen in die Spritze gegeben ist. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und vor der kontaminierenden Aktion von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze bewahrt werden. Der Träger kann ein Lösungs- oder Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, ein Polyol (z. B. Glyzerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol), geeignete Mixturen davon und pflanzliche Öle enthält.
Zum Zweck dieser Offenlegung umfasst der Begriff der transdermalen Verabreichungen alle Verabreichungen durch die Oberfläche des Körpers und die Innenverkleidungen der körperlichen Passagen einschließlich epithelialer und muköser Gewebe. Solche Verabreichungen können unter Verwendung der vorliegenden Verbindungen oder pharmazeutisch annehmbarer Salze davon in Form von Lotionen, Cremes, Schäumen, Pflastern, Suspensionen, Lösungen und (rektalen und vaginalen) Suppositorien durchgeführt werden.
Die transdermale Verabreichung kann mittels Verwendung eines transdermalen Pflasters erfolgen, das die aktive Verbindung und einen Träger enthält, der für die aktive Verbindung inert und für die Haut nicht toxisch ist, und die Freisetzung des Wirkstoffs zur systemischen Absorption in den Blutstrom über die Haut ermöglicht. Der Träger kann irgendeine der Vielzahl der Formen wie Cremes und Salben, Pasten, Gele und Verschlussartikel annehmen. Die Cremes und Salben müssen viskösflüssige oder halbfeste Emulsionen entweder vom Öl-in-Wasser- oder vom Wasser-in-Öl-Typ sein. Pasten, die aus absorptiven Pulvern bestehen, die in Petroleum oder hydrophilem Petroleum fein verteilt sind und den aktiven Wirkstoff enthalten, können auch geeignet sein. Eine Vielfalt von Verschlussartikeln kann verwendet werden, um den aktiven Wirkstoff in den Blutstrom freizusetzen, wie eine semipermeable Membran, die ein Behältnis bedeckt, das den aktiven Wirkstoff mit einem Träger oder ohne einen solchen enthält, oder eine Matrix, die den aktiven Wirkstoff enthält. Weitere Verschlussartikel sind in der Literatur bekannt.
Präparate in Form von Suppositorien können aus traditionellen Materialien hergestellt sein, einschließlich Kakaobutter, mit Zugabe von Wachsen oder ohne eine solche, um den Schmelzpunkt der Suppositorien zu verändern, und Glyzerin. Wasserlösliche Suppositoriengrundlagen wie Polyethylenglykole mit verschiedenen Molekulargewichten können auch verwendet werden.
Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendeten Reagenzien können entweder im Handel bezogen oder mittels in der Literatur beschriebener Standardverfahren zubereitet werden.
Die Herstellung mehrerer repräsentativer Verbindungen ist in den folgenden Schemata 1 bis 7 beschrieben.
Beispiel 1
4-Bromnaphthalen-1-Carbaldehyd
Zu einem 150 ml Kolben wurden 1,4-Dibromnaphthalen (2,0 g, 7,0 mmol) und wasserfreier Ether (50 ml) zugefügt. Nach Abkühlung auf 0 °C wurde n-BuLi (3,1 ml von 2,5 M in Hexanen, 7,7 mmol) tropfweise zugefügt und 20 Minuten gerührt, wonach wasserfreies DMF (1,62 ml, 21 mmol) zugefügt wurde. Die Reaktion wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und nach 1 h wurde die Reaktion mit Wasser (10 ml) gelöscht, 10 Minuten gerührt und mit Ether (3×) extrahiert. Die Etherschicht wurde über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert, um 1,02 g (62%) des Produkts als reinen gebrochen weißen Feststoff zu ergeben:
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 7,80-7,85 (2H, m), 8,10 (1H, d, J = 7,7 Hz), 8,20 (1H, d, J = 7,7 Hz), 8,32 (1H, m), 9,24 (1H, m), 10,42 (1H, s).
Analyse für C₁₁H₇BrO:
Errechnet: C: 56,20 H: 3,00
Ergebnis: C: 56,13 H: 2,98
Beispiel 2
4-[4-(fert-Butyldimethylsilanyloxy)-Phenyl]-Naphthalen-1-Carbaldehyd
Eine Mixtur aus 4-Bromnaphthalen-1-Carbaldehyd (500 mg, 2,13 mmol), Na₂CO₃ (3,5 ml 2 N wässrig, 7,0 mmol), Pd(PPh₃)₄ (0,130 g, 0,11 mmol), 4-(tert-Butyldimethylsilanoxy)Borsäure (680 mg, 2,55 mmol) und Ethylenglykoldimethylether (55 ml) wurde 6 h auf Reflux erhitzt. Die Reaktion wurde abgekühlt und mit EtOAc verdünnt. Die organische Schicht wurde über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert. Die Säulenchromatographie (20% EtOAc-Hexane) lieferte 510 mg (66%) des Produkts als gelben Feststoff: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 0,28 (6H, s), 1,01 (9H, s), 7,05 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,43 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,60-7,70 (2H, m), 7,77 (1H, t, J = 8,2 Hz), 7,95 (1H, d, J = 8,5 Hz), 8,23 (1H, d, J = 7,3 Hz), 9,29 (1H, d, J = 8,5 Hz), 10,43 (1H, s).
Beispiel 3
4-(4-Hydroxyphenyl)-1-Naphthaldehyd Oxim
Eine Mixtur aus 4-[4-(tert-Butyldimethylsilanyloxy)-Phenyl]-Naphthalen-1-Carbaldehyd (510 mg, 1,40 mmol), Hydroxylaminhydrochlorid (196 mg, 2,82 mmol) und wasserfreiem Pyridin (0,228 ml, 2,82 mmol) in MeOH (3,2 ml) wurde 3 h bis Reflux erhitzt. Die Mixtur wurde dann unter reduziertem Druck konzentriert und in Ether aufgelöst (5 ml). Dann wurde 1,0 M TBAF in THF (5,1 ml, 4,2 mmol) zugefügt und 5 Minuten gerührt. Zur Reaktion wurde Wasser (5 ml) zugefügt und dann wurde sie mit EtOAc extrahiert. Die organischen Substanzen wurden über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet und durch einen Silikastopfen passiert. Die Evaporation des Lösungsmittels und Reinigung durch Säulenchromatographie (10% MeOH-EtOAc) lieferte 150 mg (41 %) des Produkts als weißen Feststoff: Schmelzpunkt 200,0-200,5 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 6,93 (2H, d, J-8,0 Hz), 7,29 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,42 (1H, d, J = 7,3 Hz), 7,54 (1H, appt, J = 7,6 Hz), 7,61 (1H, appt, J = 7,6 Hz), 7,83 (1H, d, J = 7,3), 7,92 (1H, d, J = 8,4 Hz), 8,73 (1H, d, J = 8,4 Hz), 8,81 (1H, s), 9,66 (1H, s), 11,45 (1H, s); MS (ESI) m/z 262 ([M-H]^–).
Analyse für C₁₇H₁₃NO₂:
Errechnet: C, 77,55; H, 4,98; N, 5,32
Ergebnis: C, 77,18; H, 4,93; N, 5,14
Beispiel 4
4(3-Fluor-4-Methoxyphenyl)-Naphthalen-1-Carbaldehyd
Eine Mixtur von 4-Bromnaphthalen-1-Carbaldehyd (550 mg, 2,34 mmol), Na₂CO₃ (2,34 ml 2 N wässrig, 4,68 mmol), Pd(PPh₃)₄ (0,135 g, 0,12 mmol), 3-Fluor-4-Methoxyborsäure (480 mg, 2,83 mmol) und Ethylenglykoldimethylether (25 ml) wurde 12 h auf Reflux erhitzt. Die Reaktion wurde abgekühlt, mit EtOAc verdünnt und die Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und bis zu 810 mg des rohen Produkts konzentriert, das ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde. Eine analytische Probe wurde durch Reverse-Phasen-HPLC (Wasser-CH₃CN-0,1% TFA) zubereitet: Schmelzpunkt 137-138 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,95 (3H, s), 7,30-7,47 (3H, m), 7,63-7,71 (3H, m), 7,95 (1H, d, J = 8,3 Hz), 8,24 (1H, d, J = 7,4 Hz), 9,28 (1H, d, J = 8,4 Hz), 10,44 (1H, s).
Analyse für C₁₈H₁₃FO₂
Errechnet: C, 77,13; N, 4,67
Ergebnis: C, 76,23; N, 4,74
Beispiel 5
4(3-Fluor-4Hydroxyphenyl)-Naphthalen-1-Carbaldehyd
In einen 35 ml Kolben wurden 4-(3-Fluor-4-Methoxyphenyl)-Naphthalen-1-Carbaldehyd (720 mg ~80% rein, 2,05 mmol) und Pyridinhydrochlorid (3 g, 26 mmol) gegeben. Die Mixtur wurde auf 195 °C 2 h erwärmt, leicht abgekühlt und das verbleibende Pyridinhydrochlorid in Wasser (50 ml) aufgelöst. Die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat (3×) extrahiert, über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert, um 570 mg (99%) des Produkts als gebrochen weißen Schaum zu ergeben. Das Material wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 7,16 (2H, m), 7,35 (1H, d, J = 12,00 Hz), 7,60-7,80 (3H, m), 7,98 (2H, d, J = 8,3 Hz), 8,22 (1H, d, J = 7,4 Hz), 9,28 (1 H, d, J = 8,4), 10,24 (1H, s), 10,43 (1 H, s).
Beispiel 6
4-(3-Fluor-4-Hydroxyphenyl)-Naphthalen-1-Carbaldehyd Oxim
Eine Mixtur aus 4-(3-Fluor-4-Hydroxyphenyl)-Naphthalen-1-Carbaldehyd (570 mg, 2,13 mmol), Hydroxylaminhydrochlorid (297 mg, 4,27 mmol) und wasserfreiem Pyridin (0,35 ml, 4,27 mmol) in MeOH (13 ml) wurde 1,5 h auf Reflux erhitzt. Die Mixtur wurde dann mit Ether verdünnt, mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert. Die Reinigung durch Reverse-Phasen-HPLC (Wasser-CH₃CN-0,1% TFA) lieferte 400 mg (67%) des Produkts als weißen Feststoff: Schmelzpunkt 187-188 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 7,12 (2H, m), 7,28 (1H, d, J = 11,4 Hz), 7,45 (1H, d, J = 7,4 Hz), 7,53-7,64 (2H, m), 7,83 (1H, d, J - 7,5 Hz), 7,90 (1H, d, J = 7,6), 8,73 (1H, d, J - 8,1 Hz), 8,81 (1H, s), 10,08 (1H, s), 11,46 (1H, s); MS m/z 282 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₇H₁₂FNO₂
Errechnet: C, 72,59; H, 4,30; N, 4,98
Ergebnis: C, 72,21; H, 4,34; N, 4,83,
Beispiel 7
Trifluormethansulfonsäure 4,5-Dihydro-1-Benzothiophen-4-yl Ester
In einen 1000 ml Rundkolben wurden 6,7-Dihydro-5H-Benzo[b]Thiophen-4-on (7,36 g, 48,35 mmol), wasserfreies CH₂Cl₂ (500 ml), 2,6-Lutidin (6,76 ml, 58,0 mmol) gegeben und die Lösung wurde bis 0 °C abgekühlt. Trifluormethansulfonanhydrid (15 g, 53,2 mmol) wurde zugefügt und die Reaktion bis Raumtemperatur erwärmt. Während der nächsten 2 h wurde eine zusätzliche Menge Tf₂O (0,6 g, 2,1 mmol) zugefügt und die Reaktion mit gesättigter NaHCO₃ gelöscht. Das Wässrige wurde mit CH₂Cl₂ (3×) extrahiert, durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert. Die Säulenchromatographie (10% EtOAc-Hexane) lieferte 10,1 g (74%) des Produkts als rotes Öl: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 2,62 (2H, m), 2,92 (2H, t, J = 9,0 Hz), 5,93 (1H, t, J = 4,7 Hz), 6,95 (1H, d, J = 5,2 Hz), 7,45 (1H, d, J = 5,2 Hz).
Beispiel 8
4-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen
Eine Mixtur von Trifluormethansulfonsäure 4,5-Dihydro-1-Benzothiophen-4-yl Ester (9,0 g, 31,7 mmol), Na₂CO₃ (39,6 ml 2 N wässrig, 79,2 mmol), Pd(PPh₃)₄ (1,83 g, 1,6 mmol), 4-Methoxyborsäure (5,78 mg, 38,03 mmol) und Ethylenglykoldimethylether (350 ml) wurde 6 h bis Reflux erhitzt. Die Reaktion wurde gekühlt, mit EtOAc verdünnt und die Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und zu 5,0 g Feststoff konzentriert (1,44:1 Verhältnis des gewünschten Produkts zu [6,7,6',7'-Tetrahydro[4,4']bi[Benzo[b]Thiophenyl]). Dieses Material wurde in Toluen (50 ml) gelöst und aktivierte MnO₂ (4,5 g) zugefügt. Die Mixtur wurde über Nacht refluxt, abgekühlt, gefiltert und konzentrert, um 5 g Feststoff zu liefern (1,4:1 Verhältnis von [4,4']bi[Benzo[b]Thiophenyl] zum gewünschten Produkt). Durch Säulenchromatographie (3:97 EtOAc/Hexane) gelang es, 880 mg des reinen Produkts zu isolieren: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,83 (3H, s), 7,09 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,33 (1H, d, J = 7,2 Hz), 7,40-7,45 (2H, m), 7,51 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,79 (1H, d, J = 5,5 Hz), 7,99 (1 H, d, J = 8,0 Hz).
Beispiel 9
7-Brom-4-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen
In einen 25 ml Rundkolben wurden 4-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen (500 mg, 2,08 mmol), CH₂Cl₂ (10 ml) zugefügt und die Lösung wurde auf –20 °C (Aceton-Wasser, CO₂) abgekühlt. Brom (8,33 ml von 0,25 M Vorrat in CH₂Cl₂, 2,08 mmol) wurde langsam tropfweise über 0,5 h zugefügt und die Reaktion weitere 0,5 h gerührt. Die Reaktion wurde dann mit Wasser gewaschen, über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und zu 460 mg orangefarbenen Öls konzentriert. Die Rekristallisation aus 3:97 EtOAc-Hexanen lieferte 350 mg (53%) des Produkts als weiße Kristalle: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,83 (3H, s), 7,10 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,31 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,56 (1H, d, J = 5,6 Hz), 7,68 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,92 (1H, d, J = 5,6 Hz).
Analyse für C₁₅H₁₁BrOS:
Errechnet: C: 56,44 N: 3,47
Ergebnis: C: 56,25 N: 3,42
Beispiel 10
4-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen-7-Carbaldehyd
In einen 25 ml Rundkolben wurde 7-Brom-4-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen (300 mg, 0,94 mmol) zu wasserfreier TNF (10 ml) zugefügt und die Lösung auf –78 °C abgekühlt. n-BuLi (0,38 ml von 2,5 M in Hexanen, 0,94 mmol) wurde tropfweise zugefügt und die Lösung 10 Minuten gerührt, wonach wasserfreies DMF (0,15 ml, 1,9 mmol) alles auf einmal bei –78 °C zugefügt wurde. Die Reaktion wurde 15 Minuten gerührt, dann mit Wasser (10 ml) gelöscht und mit Ether extrahiert. Die organischen Schichten wurden vermischt, über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet und zu 180 mg (71,4 %) Aldehydprodukte als gelbes Öl konzentriert. Die Reverse-Phasen-HPLC (CH₃CN 0,1 % TFA, Wasser 0,1% TFA) produzierte 160 mg einer 8:3 Mixtur des gewünschten Produkts und 4-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen-2-Carbaldehyd als einen einzigen Peak. Ein anderes Nebenprodukt (7-Brom-4-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen-2-Carbaldehyd, 20 mg) wurde erhalten: ¹H NMR (8:3 Verhältnis des gewünschten Produkts + 7-Brom-4-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen-2-Carbaldehyd) (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,86 (3H, s, gewünschtes + Nebenprodukt), 7,14 (2H, d, J = 8,9 Hz, Nebenprodukt), 7,14 (2H, d, J = 8,6 Hz, gewünschtes Produkt), 7,47 (1H, d, J = 7,3 Hz, Nebenprodukt), 7,54-7,67 (4H, m, gewünschtes + Nebenprodukt), 7,99 (1H, d, J = 5,6 Hz, gewünschtes Produkt), 8,09 (1H, d, J = 8,1 Hz, Nebenprodukt), 8,19 (1H, d, J = 7,5 Hz), 8,41 (1H, s, Nebenprodukt), 10,14 (1H, s, Nebenprodukt), 10,27 (1H, s, gewünschtes Produkt).
Analyse für C₁₆H₁₂O₂S:
Errechnet: C: 71,62 H: 4,51
Ergebnis: C: 71,32 H: 4,50
Beispiel 11
4-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzothiophen-7-Carbaldehyd
In einem 10 ml Rundkolben wurde eine Lösung aus 62,5% reinem 4-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen-7-Carbaldehyd (verblieben 37,5% 4-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen-2-Carbaldehyd) (102 mg, 0,38 mmol) und CH₂Cl₂ (2 ml) auf –78 °C abgekühlt. Dann wurde BBr₃ (0,8 ml 1,0 M in CH₂Cl₂, 0,8 mmol) tropfweise zugefügt, wonach die Reaktion eine dunkelrote Farbe annahm. Die Reaktion ließ man auf Raumtemperatur erwärmen und nach 1 h war die Reaktion durch TLC abgeschlossen, dann wurde sie durch Gießen in Wasser (15 ml) gelöscht. Die Mixtur wurde mit Ether verdünnt, die Schichten wurden getrennt und das Wässrige mit Ether weiter extrahiert. Die organischen Schichten wurden vermischt, über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und zu einem grünlichen Feststoff konzentriert. Die Reverse-Phasen-HPLC (CH₃CN 0,1 % TFA, Wasser 0,1 % TFA) lieferte 50 mg (52%) des gewünschten Produkts als gelben Feststoff: Schmelzpunkt 203-204 °C;
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 6,96 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,56 (1H, d, J = 5,6 Hz), 7,62 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,97 (1H, d, J = 5,6 Hz), 8,16 (1H, d, J = 7,5 Hz), 9,84 (1 H, s), 10,25 (1H, s); MS (ESI) m/z 253 ([M-H]).
Analyse für C15H₁₀O₂S:
Errechnet: C: 70,84 H: 3,96
Ergebnis: C: 70,56 H: 3,88
Beispiel 12
4-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzothiophen-7-Carbaldehyd Oxim
In einen 5 ml Rundkolben wurden 4-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzothiophen-7-Carbaldehyd (42,0 mg, 0,165 mmol), Hydroxylaminhydrochlorid (23 mg, 0,331 mmol) und wasserfreies Pyridin (0,027 ml, 0,331 mmol) in MeOH (1,0 ml) gegeben, 1,5 h bis Reflux gebracht und dann abkühlen gelassen. Die Mixtur wurde dann mit Ether verdünnt, mit Wasser (2 ml) gewaschen und die organische Schicht über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, dann durch einen Silikastopfen passiert. Die Konzentration unter reduziertem Druck produzierte 38 mg (85%) des Produkts als weißen Feststoff. Die weitere Reinigung durch Säulenchromatographie (30% EtOAc-Hexane) lieferte 22 mg eines für die analytische Analyse geeigneten Produkts: Schmelzpunkt 229,5-230,5 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 6,92 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,41 (3H, appt), 7,49 (1H, d, J = 5,7 Hz), 7,59 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,85 (1H, d, J = 5,6 Hz), 8,49 (1H, s), 9,68 (1H, s), 11,62 (1H, s); MS (ESI) m/z 268 ([M-H]).
Analyse für C₁₅H₁₁NO₂S:
Errechnet: C: 66,90 H: 4,12 N: 5,20
Ergebnis: C: 66,42 H: 4,25 N: 4,87
Beispiel 13
(2-Bromphenylsulfanyl)-Acetaldehyd Dimethylacetal
In einen 200 ml Kolben wurden 2-Brombenzolthiol (10,0 g, 52,9 mmol), Kaliumcarbonat (8,05 g, 58,2 mmol) und Aceton (85 ml) gegeben. Die Mixtur wurde 15 Minuten gerührt und Bromacetaldehyd-Dimethylacetal (6,8 ml, 58,2 mmol) tropfweise zugefügt. Die Reaktion ließ man 3 Tage sich entwickeln, dann wurde sie durch ein Filtermittel gefiltert und konzentriert. Die Chromatographie (5% EtOAc/Hexane bis 15% EtOAc/Hexane) produzierte 13,25 g (90%) des reinen Produkts als gelbes Öl: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,20 (2H, d, J = 5,8 Hz), 3,30 (6H, s), 4,58 (1H, t, J = 5,8 Hz), 7,11 (1H, m), 7,40 (2H, m), 7,61 (1H, d, J = 8,0 Hz).
Analyse für C₁₀H₁₃BrO₂S:
Errechnet: C: 43,33 H: 4,73
Ergebnis: C: 43,40 H: 4,95
Beispiel 14
7-Brom-1-Benzothiophen
In einem 500 ml dreihalsigen Kolben wurden 15 g Polyphosphorsäure (PPA) gefolgt von Chlorbenzol (250 ml) ausgewogen. Nachdem die Mixtur auf Reflux erhitzt worden war, wurde (2-Bromphenylsulfonyl)-Acetaldehyd Dimethylacetal (8,0 g in 60 ml Chlorbenzol, 28,9 mmol) tropfweise während 2,5 h über einen Zugabetrichter zugefügt und dies wurde weitere 24 h refluxt. Nach Abkühlung wurde die Reaktion durch einen Silikastopfen passiert und zu 6,04 g bernsteinfarbenen Öls konzentriert. Die weitere Reinigung durch Säulenchromatographie (100% Hexane) lieferte 5,47 g (89%) des Produkts als ein helles Öl: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 7,37 (1H, t, J = 7,8 Hz), 7,63 (2H, m), 7,90 (1H, d, J = 5,5 Hz), 7,94 (1H, d, J = 7,9 Hz).
Analyse für C₈H₅BrS:
Errechnet: C: 45,09 H: 2,36
Ergebnis: C: 45,41 H: 2,37
Beispiel 15
7-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen
In einen 50 ml Rundkolben wurden Pd₂(dba)₃ (107 mg, 0,117 mmol), KF (2,25 g, 3,9 mmol), 4-Methoxyphenylborsäure (2,14 g, 14,1 mmol) gegeben und der Kolben wurde mit Stickstoff geläutert. Wasserfreie THF (25 ml) wurde dann zugefügt, gefolgt von 7-Brom-1-Benzothiophen (2,5 g, 11,73 mmol) in 5 ml THF, gefolgt von der Zugabe von P(Cy)₃ (100 mg, 0,352 mmol). Nach 4 h wurde bei Raumtemperatur kein Produkt beobachtet. Die Erwärmung auf 60 °C über Nacht lieferte annähernd 50% Fertigstellung. Nach Zugabe von weiteren 2% Pd₂(dba)₃ (215 mg), 0,1 Äquivalent Borsäure (26 mg) und THF war die Reaktion in 2 h abgeschlossen. Die Reaktion wurde gekühlt, mit Ether verdünnt, durch einen Silikastopfen gefiltert und zu 3,33 g bernsteinfarbenen Öls konzentriert. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (Charge: 5% EtOAc/Hexane bis 10% EtOAc/Hexane) lieferte 2,75 g (97,5%) des Produkts als hellgelben Feststoff: Schmelzpunkt 74-75 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,84 (3H, s), 7,11 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,37 (1H, d, J = 7,1 Hz), 7,48 (1H, t, J = 7,6 Hz), 7,54 (1H, d, J = 5,5 Hz), 7,67 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,79 (1H, d, J = 5,5 Hz), 7,86 (1H, dd, J = 7,4 Hz, 0,8 Hz); MS (ESI) m/z 239 ([M-H]).
Analyse für C₁₅H₁₂OS:
Errechnet: C: 74,97 H: 5,03
Ergebnis: C: 74,54 H: 4,86
Beispiel 16
4-Brom-7-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen
Zu einer –20 °C Lösung von 7-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen (500 mg, 2,08 mmol) in CH₂Cl₂ (15 ml) wurde Br₂ (8,33 ml von 0,25 M Vorrat in CH₂Cl₂, 2,08 mmol) während 45 Minuten zugefügt. Die Reaktion wurde weitere 0,5 h gerührt, mit Wasser gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert, um 660 mg (100%) des Produkts als einen gelben Feststoff zu ergeben. Die weitere Reinigung erfolgte durch Rekristallisation aus 3% EtOAc in Hexanen: Schmelzpunkt 103-104 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,84 (3H, s), 7,12 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,31 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,54 (1H, d, J = 5,6 Hz), 7,65 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,72 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,98 (1H, d, J = 5,6 Hz).
Analyse für C₁₅H₁₁BrOS:
Errechnet: C: 56,44 H: 3,47
Ergebnis: C: 56,83 H: 3,48
Beispiel 17
7-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen-4-Carbaldehyd
In einem 25 ml Rundkolben wurde 4-Brom-7-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen (300 mg, 0,94 mmol) zu wasserfreier THF (10 ml) zugefügt und die Lösung auf –100 °C abgekühlt (N₂, Ether). Dann wurde BuLi (0,38 ml von 2,5 M in Hexanen, 0,94 mmol) tropfweise zugefügt und die Lösung 10 Minuten gerührt, wonach wasserfreies DMF (0,15 ml, 1,9 mmol), alles auf einmal, bei –100 °C zugefügt wurde. Die Reaktion wurde 15 Minuten gerührt, dann mit Wasser (10 ml) gelöscht und mit Ether extrahiert. Die organischen Schichten wurden vermischt, über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet und zu 60 mg (24%) des Produkts als gelben Feststoff konzentriert. Anmerkung: Diese Reaktion wurde auch bei –80 °C (CO₂, Ether) durchgeführt, um einen quantitativen Ertrag von Aldehydprodukten von annähernd 60% des gewünschten Produkts zu erhalten: Schmelzpunkt 98-99 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,86 (3H, s), 7,16 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,64 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,75 (2H, d, J = 8,7 Hz), 8,13 (1H, d, J = 7,7 Hz), 8,15 (1H, d, J = 5,7 Hz), 8,39 (1H, d, J = 5,6 Hz), 10,30 (1H, s); MS (ESI) m/z 269 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₆H₁₂O₂S:
Errechnet: C: 71,62 H: 4,51
Ergebnis: C: 71,29 H: 4,50
Beispiel 18
7-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzothiophen-4-Carbaldehyd
In einem 50 ml Rundkolben wurde 7-(4-Methoxyphenyl)-1-Benzothiophen-4-Carbaldehyd (420 mg, 1,57 mmol) zu CH₂Cl₂ (8,5 ml) zugefügt und die Lösung auf –78 °C abgekühlt. Zu der Lösung wurde tropfweise BBr₃ (3,14 ml von 1,0 M in CH₂Cl₂, 3,13 mmol) zugefügt, als die Reaktion eine dunkelrote Farbe annahm. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur erwärmt, als sie eine dunkelgrüne Farbe annahm, und wurde in 1 h durch TLC abgeschlossen. Nachdem die Reaktion mit Wasser (15 ml) gelöscht worden war, wurde sie mit Ether extrahiert und die organischen Substanzen wurden vermischt, über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet und zu 460 mg (> 95%) des Produkts als leicht unreinen grünen Feststoff konzentriert. Die Reverse-Phasen-HPLC (CH₃CN/Wasser mit 0,1% TFA) wurde durchgeführt, um eine analytische Probe (120 mg) als leicht gelben Feststoff zu erhalten: Schmelzpunkt 202-204 °C;
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 6,97 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,60 (1H, d, J = 7,6), 7,64 (2H, d, J = 8,5 Hz), 8,10 (1H, d, J = 7,6 Hz), 8,14 (1H, d, J = 5,6 Hz), 8,38 (1H, d, J = 5,6 Hz), 9,92 (1H, s), 10,29 (1H, s); MS (ESI) m/z 253 ([M-H]).
Analyse für C₁₅H₁₀O₂S:
Errechnet: C: 70,84 H: 3,96
Ergebnis: C: 69,34 H: 3,97
Beispiel 19
7-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzothiophen-4-Carbaldehyd Oxim
Einem 10 ml Rundkolben wurden 7-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzothiophen-4-Carbaldehyd (61,7 mg, 0,24 mmol), Hydroxylaminhydrochlorid (34 mg, 0,49 mmol) und wasserfreies Pyridin (0,04 ml, 0,49 mmol) in MeOH (1,5 ml) zugefügt, dies wurde 1 h bis Reflux erhitzt und dann ließ man es abkühlen. Die Mixtur wurde dann mit Ether verdünnt, mit Wasser gewaschen und die organische Schicht über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, dann durch einen Silikastopfen passiert. Die Konzentration unter reduziertem Druck produzierte 60 mg eines gelblichen Feststoffs und die Reinigung durch Säulenchromatographie (40% EtOAc-Hexane) lieferte 50 mg (92%) des Produkts als gelblichen Feststoff: Schmelzpunkt 230-231 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 6,93 (2H, d, J = 8,55 Hz), 7,38 (1H, d, J = 7,63 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,53 Hz), 7,68 (1H, d, J = 7,71 Hz), 7,91 (1H, d, J = 5,61 Hz), 8,12 (1H, d, J = 5,64 Hz), 8,57 (1H, s), 9,77 (1H, s), 11,41 (1H, s); MS (ESI) m/z 270 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₅H₁₁NO₂S
Errechnet: C: 66,90H: 4,12 N: 5,20
Ergebnis: C: 65,78 H: 4,16 N: 4,85
Beispiel 20
1-Brom-2-(2,2-Dimethoxy-Ethoxy)-4-Methylbenzol
Zu einer Lösung aus wasserfreiem Ethanol (40 ml), Natriumethoxid (31,7 ml 21 Gew.-%, 86,94 mmol) und 2-Brom-5-Methylphenol (Gewali Mohan B., Ronald Bruce P., J. Org. Chem. [Zeitschrift für organische Chemie] 1980, 45, 2224-2229) (16,25 g, 86,94 mmol) wurde 2-Brom-1,1-Dimethoxyethan (16,17 g, 95,64 mmol) zugefügt. Die Lösung wurde über Nacht auf Reflux erhitzt, unter Vakuum reduziert und zwischen Wasser und Ether aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde mit Ether extrahiert und die organischen Substanzen durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert, um 8,71 g (36%) des gewünschten Produkts als blassgelbes Öl zu liefern: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 2,19 (3H, s), 3,33 (6H, s), 3,96 (2H, d, J = 5,1 Hz), 4,64 (1H, t, J = 5,1 Hz), 6,98 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,08 (1H, dd, J = 8,4 Hz, 1,5 Hz), 7,35 (1H, d, J = 1,7 Hz).
Beispiel 21
7-Bromo-4-Methylbenzofuran
Einem 500 ml Rundkolben wurden 15,6 g Polyphosphorsäure (PPA) und wasserfreies Chlorbenzol (260 ml) zugefügt. Die Mixtur wurde bis Reflux erhitzt und 1-Brom-2-(2,2-Dimethoxyethoxy)-4-Methylbenzol (8,11 g, 29,5 mmol) in Chlorbenzol (60 ml) tropfweise über 2 h zugefügt. Die Reaktion wurde 3 h auf Reflux erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert. Die Säulenchromatographie (100% Hexan) lieferte 4,67 g (75%) des Produkts als weißen wachsartigen Feststoff: Schmelzpunkt 32-33 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 2,46 (3H, s), 7,02 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,16 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,43 (1H, d, J = 7,9 Hz), 8,10 (1H, d, J = 2,2 Hz); MS (EI) m/z 210 ([M⁺]).
Analyse für C₉H₇BrO:
Errechnet: C: 51,22 H: 3,34
Ergebnis: C: 50,83 H: 3:08
Beispiel 22
7-(4-Methoxyphenyl)-4-Methylbenzofuran
Eine Mixtur aus 4-Methoxyphenylborsäure (1,51 g, 9,95 mmol), Na₂CO₃ (10,66 ml 2 N wässrig, 21,32 mmol), Pd(PPh₃)₄ (0,411 g, 0,355 mmol), 7-Brom-4-Methylbenzofuran (1,5 g, 7,11 mmol) und Ethylenglykoldimethylether (75 ml) wurde über Nacht bis Reflux erhitzt. Die Reaktion wurde abgekühlt, mit EtOAc verdünnt und die Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert. Die Säulenchromatographie (10% EtOAc/Hexane) lieferte 1,59 g (94%) des Produkts als weißen wachsartigen Feststoff: Schmelzpunkt 39-40 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 2,51 (3H, s), 7,07 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,08 (1H, d, J = 2,3 Hz), 7,13 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,37 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,79 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,04 (1H, d, J = 2,2 Hz); MS (ESI) m/z 239 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₆H₁₄O₂:
Errechnet: C: 80,65 H: 5,92
Ergebnis: C: 80,89 H: 5,85
Beispiel 23
7-(4-Methoxyphenyl)-Benzofuran-4-Carbaldehyd
Zu einer Lösung aus 7-(4-Methoxyphenyl)-4-Methylbenzofuran (1,27 g, 5,34 mmol) in Carbontetrachlorid (150 ml) wurden NBS (1,05 g, 5,87 mmol) und AIBN (50 mg) zugefügt. Die Lösung wurde 2 h bis Reflux gebracht, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Feststoffe wurden herausgefiltert. Die Lösung wurde dann konzentriert und wasserfreies CH₃CN (50 ml) zugefügt. Dann wurden Kaliumbenzolselenit (Syper Ludwik, Mlochowski Jacek, Synthesis [Synthese] 1984, 9, 747-752) (1,33 g, 5,87 mmol) und K₂HPO₄ (0,93 g, 5,34 mmol) zugefügt und die Reaktion wurde für 1 h auf Reflux erhitzt, wonach man sie auf Raumtemperatur abkühlen ließ. Die Lösung wurde dann durch einen Silikastopfen passiert und der Stopfen mit 30% EtOAc/Hexanen gewaschen, wonach das CH₃CN unter hohem Vakuum abgestreift wurde. Die Chromatographie (100% CH₂Cl₂) entfernte das Ph₂Se₂-Nebenprodukt, um 1,0 g (75%) des Produkts als weißen Feststoff zu liefern: Schmelzpunkt 143-144 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,85 (3H, s), 7,15 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,57 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,75 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,96 (3H, appt), 8,33 (1H, d, J = 2,1 Hz), 8,04 (1H, d, J = 2,2 Hz); MS (ESI) m/z 253 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₆H₁₂O₃:
Errechnet: C: 76,18 H: 4,79
Ergebnis: C: 75,71 H: 4,96
Beispiel 24
7-(4-Hydroxyphenyl)-Benzofuran-4-Carbaldehyd
In einen 25 ml Rundkolben wurde eine auf –78 °C gekühlte Lösung von 7-(4-Methoxyphenyl)-Benzofuran-4-Carbaldehyd (450 mg, 1,79 mmol) in wasserfreier CH₂Cl₂ (10 ml) gegeben, wonach BBr₃ (3,57 ml von 1,0 M in CH₂Cl₂, 3,57 mmol) tropfweise zugefügt wurde. Die Reaktion ließ man auf Raumtemperatur erwärmen und rührte 1 h. Dann wurde die Reaktion mit Wasser gelöscht, mit Ether verdünnt und die organische Schicht getrennt und über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet. Die Lösung wurde durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert. Die Chromatographie (1:1 EtOAc/Hexane) lieferte 390 mg (92%) des Produkts als hellgrünen Feststoff: Schmelzpunkt 179-180 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO d₆): δ 6,96 (2H, d, J = 6,8 Hz), 7,56 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,71 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,84 (2H, d, J = 6,7 Hz), 7,95 (1H, d, J = 7,9 Hz), 8,31 (1H, d, J = 2,2 Hz), 9,93 (1H, s) 10,22 (1H, s); MS (ESI) m/z 239 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₅H₁₀O₃:
Errechnet: C: 75,62 H: 4,23
Ergebnis: C: 75,48 H: 4,29
Beispiel 25
7-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzofuran-4-Carbaldehyd Oxim
Zu einem 15 ml Rundkolben wurden 7-(4-Hydroxyphenyl)-Benzofuran-4- Carbaldehyd (250 mg, 1,05 mmol), Hydroxylaminhydrochlorid (146 mg, 2,10 mmol), wasserfreier MeOH (6,5 ml) und wasserfreies Pyridin (0,17 ml, 2,10 mmol) zugefügt. Der Kolben wurde dann versiegelt und auf 68 °C für 1 h erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Ether verdünnt und die Schichten wurden getrennt. Die Etherschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und zu 250 mg (94%) reinen Produkts als gelben Feststoff konzentriert. Die weitere Reinigung erfolgte durch Chromatographie (1:1, EtOAc/Hexane) für die analytische Analyse: Schmelzpunkt 216-217 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 6,92 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,36 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,49 (2H, app s), 7,74 (2H, d, J = 8,6 Hz), 8,14 (1H, d, J = 2,1 Hz), 8,42 (1H, s), 9,73 (1H, s) 11,36 (1H, s); MS (ESI) m/z 254 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₅H₁₁NO₃:
Errechnet: C: 71,14 H: 4,38 N: 5,53
Ergebnis: C: 70,53 H: 4,32 N: 5,40
Beispiel 26
4-Methoxy-4-Methylbiphenyl-3-ol
Eine Mixtur aus 4-Methoxyphenylborsäure (4,55 g, 21,38 mmol), Na₂CO₃ (32,1 ml 2 N wässrig, 64,2 mmol), Pd(PPh₃)₄ (1,24 g, 1,07 mmol), 5-Iod-2-Methylphenol (Hodgson, Moore J. Chem. Soc. [Zeitschrift der Chemischen Gesellschaft] 1926, 2038) (5,0 g, 21,38 mmol) und Ethylenglykoldimethylether (225 ml) wurde über Nacht bis Reflux erhitzt. Die Reaktion wurde abgekühlt, mit EtOAc verdünnt und die Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert. Die Chromatographie (30% EtOAc/Hexane) lieferte 1,64 g (36%) des Produkts als weißen Feststoff und 2 g 4-Methoxybiphenyl als unerwünschtes Nebenprodukt: Schmelzpunkt 146-147 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 2,13 (3H, s), 3,78 (3H, s), 6,94 (1H, dd, J = 8,1 Hz, 2,7 Hz), 7,00 (3H, m), 7,09 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,48 (1H, d, J = 9,5 Hz), 9,36 (1H, s).
Analyse für C₁₄H₁₄O₂:
Errechnet: C: 78,48 H: 6,59
Ergebnis: C: 77,71 H: 6,51
Beispiel 27
3-(2,2-Dimethoxyethoxy)-4'-Methoxy-4-Methylbiphenyl
Zu NaH (357 mg (600 mg 60% in Erdöl, mit Hexan 3× gewaschen), 14,86 mmol) wurden trockene THF (100 ml), 4'-Methoxy-4-Methylbiphenyl-3-ol (1,59 g, 7,43 mmol) und 2-Brom-1,1-Dimethoxyethan (1,76 g, 10,40 mmol) zugefügt. Die Reaktion wurde über Nacht bei 60 °C gerührt, abgekühlt, durch einen Silikastopfen passiert und zu 1,66 g (74%) des Produkts als weißen Feststoff konzentriert: Schmelzpunkt 39-40 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 2,17 (3H, s), 3,38 (6H, s), 3,79 (3H, s), 4,09 (2H, d, J = 5,2 Hz), 4,73 (1H, t, J = 5,2 Hz), 7,00 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,09 (1H, dd, J = 7,7 Hz, 1,5 Hz), 7,15 (1H, d, J = 1,2 Hz), 7,18 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,62 (2H, d, J = 8,8 Hz); MS (ESI) m/z 303 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₈H₂₂O₄:
Errechnet: C: 71,50 H: 7,33
Ergebnis: C: 71,46 H: 7,04
Beispiel 28
4-(4-Methoxyphenyl)-7-Methylbenzofuran
Eine Mixtur aus Polyphosphorsäure (etwa 0,5 g) und Chlorbenzol wurde bis zu Reflux gebracht und 3-(2,2-Dimethoxyethoxy)-4'-Methoxy-4-Methylbiphenyl (1,61 g, 5,33 mmol) in Chlorbenzol (12 ml) wurde tropfweise zugefügt. Nach 4 h wurde die Reaktion abgekühlt, durch einen Silikastopfen passiert (der Stopfen wurde mit Ether gewaschen) und zu 1,26 g (100%) des Produkts als hellbraunen Feststoff konzentriert: Schmelzpunkt 40-41 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 2,50, (3H, s), 3,82 (3H, s), 7,03 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,07 (2H, d, J = 9,5 Hz), 7,19 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,23 (1 H, d, J = 8,1 Hz), 7,56 (2H, d, J = 9,5 Hz), 8,06 (1H, d, J = 2,2 Hz).
Analyse für C₁₆H₁₄O₂:
Errechnet: C: 80,14 H: 5,92
Ergebnis: C: 80,14 H: 5,78
Beispiel 29
4-(4-Methoxyphenyl)-Benzofuran-7-Carbaldehyd
In einen 250 ml Rundkolben wurden 4-(4-Methoxyphenyl)-7-Methylbenzofuran (600 mg, 2,52 mmol), CCl₄ (70 ml), NBS (490 mg, 2,77 mmol) und eine katalytische Menge AIBN (25 mg) gegeben. Die Reaktion wurde für 2 h auf Reflux gebracht, wonach man die Reaktion abkühlen ließ. Die Feststoffe wurden herausgefiltert und die Lösung wurde konzentriert. CH₃CN (30 ml), K₂HPO₄ (440 mg, 2,53 mmol) und Kaliumbenzolselenit (630 mg, 2,77 mmol) wurden zugefügt und die Reaktion für 2 h auf Reflux gebracht. Die Reaktion wurde abgekühlt, durch einen Silikastopfen passiert (mit 30% EtOAc/Hex. gewaschen) und zu 810 mg eines orangefarbenen Feststoffs konzentriert. Die weitere Reinigung durch Chromatographie (100% CH₂Cl₂) lieferte 500 mg (78%) des Produkts als hellbraunen Feststoff: Schmelzpunkt 104-105 °C; ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆): δ 3,85 (3H, s), 7,14 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,20 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,56 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,91 (1H, d, J = 7,7 Hz), 8,26 (1H, d, J = 2,2 Hz), 10,36 (1H, s); HRMS (ESI+) m/z 253 08622 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₆H₁₂O₃:
Errechnet: C: 76,18 H: 4,79
Ergebnis: C: 75,61 H: 4,73
Beispiel 30
4-(4-Hydroxyphenyl)-Benzofuran-7-Carbaldehyd
In einen 100 ml Rundkolben wurden 4-(4-Methoxyphenyl)-Benzofuran-7-Carbaldehyd (480 mg, 1,90 mmol), CH₂Cl₂ (12 ml) gegeben und die Lösung wurde auf –78 °C abgekühlt. Dann wurde BBr₃ (3,8 ml 1,0 M in CH₂Cl₂, 3,8 mmol) tropfweise zugefügt und die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmt. Nach 1,5 h wurde die Reaktion mit Wasser (15 ml) gelöscht, mit Ether (3×) extrahiert, durch einen Silikastopfen passiert und zu 160 mg (35%) des Produkts als Schaum konzentriert. Die Chromatographie (1:1 EtOAc: Hex.) produzierte eine analytische Probe; Schmelzpunkt 184-185 °C; ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆): δ 6,96 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,20 (1H, d, J = 2,5 Hz), 7,52 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,89 (1H, d, J = 7,7 Hz), 8,24 (1H, d, J = 2,2 Hz), 9,84 (1H, s), 10,35 (1H, s); HRMS (ESI+) m/z 239 07027 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₅H₁₀O₃:
Errechnet: C: 75,62 H: 4,23
Ergebnis: C: 74,52 H: 4,27
Beispiel 31
4-(4-Hydroxyphenyl)-Benzofuran-7-Carbaldehyd Oxim
In einen 10 ml Rundkolben wurden 4-(4-Hydroxyphenyl)-Benzofuran-7-Carbaldehyd (100 mg, 0,42 mmol), Hydroxylaminhydrochlorid (58 mg, 0,84 mmol) und wasserfreies Pyridin (0,07 ml, 0,84 mmol) in MeOH (3,5 ml) gegeben, 1,5 h auf Reflux gebracht und dann ließ man dies abkühlen. Die Mixtur wurde dann mit Ether verdünnt, mit Wasser gewaschen und die organische Schicht über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, dann durch einen Silikastopfen passiert. Die Lösung wurde unter reduziertem Druck konzentriert und durch Säulenchromatographie (50% EtOAc-Hexane) gereinigt. Dies lieferte 30 mg (28%) des Produkts als gelblichen Feststoff. 4-(7-Dimethoxymethylbenzofuran-4-yl)-Phenol als unerwünschtes Nebenprodukt wurde isoliert (60 mg). Das Nebenprodukt (60 mg, 0,212 mmol) wurde durch Erhitzen auf 65 °C mit Hydroxylaminhydrochlorid (15 mg, 0,212 mmol) in MeOH (2 ml) über Nacht in einem versiegelten Kolben in das gewünschte Produkt konvertiert. Die Reaktion wurde dann mit Ether/Wasser verdünnt, die organische Schicht durch einen Silikastopfen passiert und zu 40 mg (75%) des Produkts als reinen weißen Feststoff konzentrert: Schmelzpunkt 219-220 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 6,92 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,11 (1 N, d, J = 2,2 Hz), 7,34 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,61 (1 H, d, J = 7,9 Hz), 8,12 (1H, d, J = 2,2 Hz), 8,44 (1H, s), 9,72 (1H, s), 11,53 (1 H, s); MS (ESI) m/z 254 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₅H₁₁NO₃:
Errechnet: C: 71,14 H: 4,38 N: 5,53
Ergebnis: C: 71,07 H: 4,41 N: 5,51
Beispiel 32
1-(2,2-Dimethyoxyethoxy)-4-Iod-2-Methylbenzol
In einem 1 l Rundkolben wurde eine Lösung von 4-Iod-2-Methylphenol (10,0 g, 42,7 mmol) in wasserfreiem DMF (300 ml) auf 0 °C abgekühlt. Dann wurde NaH (3,42 g 60% in Erdöl, 85,5 mmol) langsam in kleinen Portionen zugefügt und die Reaktion auf Raumtemperatur (etwa 0,5 h) erwärmt. Danach wurde 2-Brom-1,1-Dimethoxyethan (10,1 ml, 85,5 mmol) zugefügt und dann über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde bis 0 °C abgekühlt, 5% NaOH (300 ml) langsam zugefügt und die Mixtur mit Ether (1,5 l) verdünnt. Die Schichten wurden getrennt und das Wässrige mit Ether (3 × 500 ml) gewaschen. Die organischen Schichten wurden über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und unter reduziertem Druck konzentriert. Die Chromatographie (30% EtOAc/Hex.) lieferte 12,49 (91 %) des Produkts als klares Öl: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 2,11 (3H, s), 3,35 (6H, s), 3,95 (2H, d, J = 5,2 Hz), 4,68 (1H, t, J = 5,2 Hz), 6,80 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,43-7,48 (2H, m).
Analyse für C₁₁H₁₅IO₃:
Errechnet: C: 41,01 H: 4,69
Ergebnis: C: 40,73 H: 4,62
Beispiel 33
5-Iod-7-Methylbenzofuran
Einem dreihalsigen 1 Liter-Kolben wurden PPA (2,0 g), wasserfreies Chlorbenzol (300 ml) zugefügt und die Mixtur bis Reflux gebracht. Dann wurde 1-(2,2-Dimethyoxyethoxy)-4-Iod-2-Methylbenzol (11,16 g, 34,66 mmol) in Chlorbenzol (80 ml) langsam durch einen Zugaberichter über einen Zeitraum von 2 h zugefügt. Die Reaktion wurde dann abgekühlt und durch einen (mit Chlorbenzol gewaschenen) Silikastopfen passiert und zu einer Mixtur aus Produkt plus 4-Iod-2-Methylphenol konzentriert. Die Säulenchromatographie (100% Hexan) lieferte 4,49 g (53%) des Produkts als klares Öl: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 2,44 (3H, s), 6,91 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,46, (1H, brs), 7,86 (1H, d, J = 1,2 Hz), 8,00 (1H, d, J = 2,2 Hz); MS (EI) m/z 258 ([M]⁺).
Analyse für C₉H₇IO:
Errechnet: C: 41,89 H: 2,73
Ergebnis: C: 41,46 H: 2,63
Beispiel 34
5-(4-Methoxyphenyl)-7-Methylbenzofuran
Eine Mixtur aus 4-Methoxyphenylborsäure (4,64 g, 30,54 mmol), Na₂CO₃ (31 ml 2 N wässrig, 61,09 mmol), Pd(PPh₃)₄ (0,88 g, 0,76 mmol), 5-Iod-7-Methylbenzofuran (3,94 g, 15,27 mmol) und Ethylenglykoldimethylether (160 ml) wurde 1,5 h refluxt. Die Reaktion wurde abgekühlt, Ether/Wasser (1 l/50 ml) zugefügt und die Schichten wurden getrennt. Das Wässrige wurde weiter mit Ether (2 × 500 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und zu 6,54 g braunen Feststoffs konzentriert. Die Analyse durch ¹H NMR zeigte das gewünschte Produkt plus 4-Methoxybiphenyl in einem Verhältnis von etwa 1:1 (6,54 g etwa, 3,69 g Produkt, 99% Ertrag), die durch die Säulenchromatographie nicht getrennt werden konnten und für den nächsten Schritt verwendet wurden. Die Reverse-Phasen-HPLC (CH₃CN/Wasser/0,1 TFA) lieferte eine analytische Probe als weißen Feststoff: Schmelzpunkt 82-83 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 2,52 (3H, s), 3,80 (3H, s), 6,97 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,12 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,38 (1H, s), 7,60 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,66 (1H, d, J = 1,4 Hz), 8,01 (1H, d, J = 2,1 Hz); MS (EI) m/z 238 ([M]⁺).
Analyse für C₁₆H₁₄O₂:
Errechnet: C: 80,65 H: 5,92
Ergebnis: C: 80,52 H: 5,55
Beispiel 35
5-(4-Methoxyphenyl)-Benzofuran-7-Carbaldehyd
Zu einer Lösung aus 5-(4-Methoxyphenyl)-7-Methylbenzofuran (1,60 g, 2,83 g 1:1 Verhältnis zu 4-Methoxybiphenyl 6,72 mmol) in Carbontetrachlorid (190 ml) wurden NBS (1,32 g, 7,40 mmol) und AIBN (50 mg) zugefügt. Die Lösung wurde für 2 h auf Reflux gebracht, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Feststoffe wurden herausgefiltert. Die Lösung wurde dann konzentriert und wasserfreies CH₃CN (80 ml) zugefügt. Dann wurden Kaliumbenzolselenit (2,14 g, 9,41 mmol) und K₂HPO₄ (1,17 g, 6,72 mmol) zugefügt und dann wurde die Reaktion für 1 h bis Reflux erhitzt, wonach man dies auf Raumtemperatur abkühlen ließ. Die Lösung wurde dann durch einen Silikastopfen passiert und unter hohem Vakuum konzentriert. Die Chromatographie (100% CH₂Cl₂) lieferte 850 mg (50%) des Produkts als weißen Feststoff: Schmelzpunkt 94-95 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,82 (3H, s), 7,08 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,14 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,71 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,10 (1H, d, J = 1,9 Hz), 8,21 (1H, d, J = 2,2 Hz), 8,25 (1H, d, J = 1,9 Hz), 10,37 (1H, s); MS (ESI) m/z 253 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₆H₁₂O₃:
Errechnet: C: 76,18 H: 4,79
Ergebnis: C: 74,96 H: 4,32
Beispiel 36
5-(4-OH-Phenyl)-Benzofuran-7-Carbaldehyd
In einen 10 ml Rundkolben wurden 5-(4-Methoxyphenyl)-Benzofuran-7-Carbaldehyd (100 mg, 0,395 mmol) und Pyridinhydrochlorid (600 mg, 5,2 mmol) gegeben. Die Mixtur wurde 1 h auf 195 °C erhitzt, leicht abgekühlt, dann wurde Wasser zugefügt, um das verbleibende Pyridinhydrochlorid zu lösen. Das Wässrige wurde mit EtOAc extrahiert, durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert. Die weitere Reinigung durch Säulenchromatographie lieferte 76 mg (81 %) des Produkts als gelben Feststoff: Schmelzpunkt 148-149 °C, ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 6,86 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,09 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,6 Hz), 8,02 (1H, d, J = 1,8 Hz), 8,16 (2H, appd), 9,56 (1H, s), 10,32 (1H, s); MS (ESI) m/z 237 ([M-H]^–).
Analyse für C₁₅H₁₀O₃:
Errechnet: C: 75,62 H: 4,23
Ergebnis: C: 74,88 H: 4,08
Beispiel 37
5-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzofuran-7-Carbaldehyd Oxim
Zu einem 10 ml Rundkolben wurden 5-(4-Hydroxyphenyl)-Benzofuran-7-Carbaldehyd (76 mg, 0,32 mmol), Hydroxylaminhydrochlorid (44,4 mg, 0,64 mmol), wasserfreier MeOH (2 ml) und wasserfreies Pyridin (0,06 ml, 0,67 mmol) zugefügt. Die Reaktion wurde dann auf 68 °C erhitzt und die Reaktion erfolgte in 5 Minuten. Die Reaktion wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Ether verdünnt und die Schichten wurden getrennt. Die Etherschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und zu 20 mg (25%) des Produkts als gelben Feststoff konzentriert: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 6,86 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,03 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,73 (1H, d, J = 1,4 Hz), 7,84 (1H, d, J = 1,6 Hz), 8,08 (1H, d, J = 2,1 Hz), 8,45 (1H, s) 9,56 (1H, s), 11,57 (1H, s); MS (ESI) m/z 254 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₅H₁₁NO₃:
Errechnet: C: 71,14 H: 4,38 N: 5,53
Ergebnis: C: 69,67 H: 4,23 N: 5,15
Beispiel 38
2-Brom-1-(2,2-Dimethyoxyethoxy)-4-Methylbenzol
In einem 2 l Rundkolben wurde eine Lösung of 2-Brom-4-Methylphenol (25 g, 133,66 mmol) in wasserfreiem DMF (940 ml) auf 0 °C abgekühlt. Dann wurde NaH (10,7 g 60% in Erdöl, 267,3 mmol) langsam in kleinen Portionen zugefügt und die Reaktion auf Raumtemperatur (etwa 0,5 h) erwärmt, wonach 2-Brom-1,1-Dimethoxyethan (31,6 ml, 267,4 mmol) zugefügt wurde. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur für 3 h und dann auf 100 °C für 4 h erwärmt. Die Reaktion wurde abgekühlt, durch einen Silikastopfen passiert und konzentriert. Die braune Mixtur wurde mit EtOAc verdünnt, wieder durch einen Silikastopfen passiert, um die braunen Feststoffe zu entfernen, und zu 24,0 g (65%) eines bernsteinfarbenen Öls konzentriert: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 2,23 (3H, s), 3,37 (6H, s), 4,00 (2H, d, J = 5,2 Hz), 4,68 (1H, t, J = 5,2 Hz), 7,03 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,12 (1H, dd, J = 8,4 Hz, 1;7 Hz), 7,40 (1H, d, J = 1,7 Hz).
Beispiel 39
7-Brom-5-Methylbenzofuran
In einen 2 l Rundkolben wurden PPA (3 g), wasserfreies Chlorbenzol (1,0 l) gegeben und die Mixtur auf Reflux gebracht, gefolgt von der langsamen Zugabe von 2-Brom-1-(2,2-Dimethyoxyethoxy)-4-Methylbenzol (22,9 g, 83,3 mmol) in Chlorbenzol (200 ml) durch einen Zugabetrichter über einen Zeitraum von 2 h. Die Reaktion wurde dann abgekühlt und durch einen (mit Chlorbenzol gewaschenen) Silikastopfen passiert und zu einer Mixtur aus Produkt plus 4-Iod-2-Methylphenol konzentriert. Die Säulenchromatographie (10% EtOAc/Hexan) lieferte 11,54 g (66%) des Produkts als klares Öl: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 2,40 (3H, s), 7,02 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,39 (1H, s), 7,45 (1H, s), 8,07 (1H, d, J = 2,2 Hz).
Analyse für C₉H₇BrO:
Errechnet: C: 51,22 H: 3,34
Ergebnis: C: 52,54 H: 3,58
Beispiel 40
7-(4-Methoxyphenyl)-5-Methylbenzofuran
Eine Mixtur von 4-Methoxyphenylborsäure (4,76 g, 31,3 mmol), Na₂CO₃ (32,6 2 N wässrig, 65,2 mmol), Pd(PPh₃)₄ (1,5 g, 1,3 mmol), 7-Brom-5-Methylbenzofuran (5,5 g, 26,1 mmol) und Ethylenglykoldimethylether (275 ml) wurde für 12 h auf Reflux erhitzt. Die Reaktion wurde abgekühlt, Ether (500 ml) zugefügt und die Schichten wurden getrennt. Das Wässrige wurde weiter mit Ether extrahiert und die organischen Schichten wurden über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und zu 7,16 g braunen Öls konzentriert. Die weitere Reinigung durch Säulenchromatographie (10% EtOAc/Hexane) lieferte 5,62 g (91%) des Produkts als klares Öl: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,44 (3H, s), 3,82 (3H, s), 6,94 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,108 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,30 (1H, s), 7,38 (1H, s), 7,81 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,00 (1H, d, J = 2,2 Hz).
Beispiel 41
7-(4-Methoxyphenyl)-Benzofuran-5-Carbaldehyd
Zu einer Lösung von 7-(4-Methoxyphenyl)-5-Methylbenzofuran (4,66 g, 19,58 mmol) in Carbontetrachlorid (560 ml) wurden NBS (3,83 g, 21,54 mmol) und AIBN (75 mg) zugefügt. Die Lösung wurde 4 h auf Reflux gebracht, auf Raumtemperatur abgekühlt, um die Hälfte reduziert und die Feststoffe wurden herausgefiltert. Die Lösung wurde dann zu einem gelben Feststoff konzentriert und wasserfreies CH₃CN (230 ml) wurde zugefügt. Dann wurden Kaliumbenzolselenit (5,34 g, 23,5 mmol) und K₂HPO₄ (4,09 g, 23,48 mmol) zugefügt und dann wurde die Reaktion 1,5 h refluxt, wonach man sie auf Raumtemperatur abkühlen ließ. Die Lösung wurde dann durch einen Silikastopfen passiert und unter hohem Vakuum konzentriert. Die Chromatographie (100% CH₂Cl₂) lieferte 3,3 g (67%) des Produkts als hellorangefarbenen Feststoff: Schmelzpunkt 79-80 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 3,85 (3H, s), 7,13 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,23 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,88 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,02 (1H, d, J = 1,4 Hz), 8,23 (2H, m), 10,13 (1H, s); MS (ESI) m/z 253 ([M+H]*).
Analyse für C₁₆H₁₂O₃:
Errechnet: C: 76,18 H: 4,79
Ergebnis: C: 75,44 H: 4,85
Beispiel 42
7-(4-Hydroxyphenyl)-Benzofuran-5-Carbaldehyd
In einen 10 ml Rundkolben wurden 7-(4-Methoxyphenyl)-Benzofuran-5-Carbaldehyd (0,50 g, 1,98 mmol) und Pyridinhydrochlorid (1,2 g, 5,2 mmol) gegeben. Die Mixtur wurde 2 h auf 190 °C erhitzt, leicht abgekühlt, dann wurde Wasser (10 ml) zugefügt, um das verbleibende Pyridinhydrochlorid aufzulösen. Das Wässrige wurde mit EtOAc (3×) extrahiert, durch einen Silikastopfen passiert und zu 450 mg (96%) des rohen Produkts als hellgelben Schaum konzentriert. Das rohe Produkt aus dieser Reaktion wurde mit einer zweiten Charge (1 g Schalenreaktion) vermischt und durch Säulenchromatographie (1:1 EtOAc/Hexan) gereinigt, um 760 mg des Produkts als gelben Feststoff zu ergeben: Schmelzpunkt 154-155 °C; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 6,95 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,21 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,76 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,98 (1H, d, J = 1-5 Hz), 8,19 (1H, d, J = 1,5 Hz), 8,22 (1H, d, J = 2,2 Hz), 9,81 (1H, s), 10,12 (1H, s); MS (ESI) m/z 237 ([M-H]^–).
Analyse für C₁₅H₁₀O₃:
Errechnet: C: 75,62 H: 4,23
Ergebnis: C: 75,19 H: 4,01
Beispiel 43
7-(4-Hydroxyphenyl)-Benzofuran-5-Carbaldehyd Oxim
In einen 25 ml Rundkolben wurden 7-(4-Hydroxyphenyl)-Benzofuran-5-Carbaldehyd (400 mg, 1,68 mmol), Hydroxylaminhydrochlorid (234 mg, 3,36 mmol), wasserfreier MeOH (10,4 ml) und wasserfreies Pyridin (0,272 ml, 3,36 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde dann auf 68 °C erhitzt und 1 h auf Reflux gebracht. Die Reaktion wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Ether verdünnt und die Schichten wurden getrennt. Die Etherschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreier Na₂SO₄ getrocknet, durch einen Silikastopfen passiert und zu 410 mg (96%) des Produkts als gelben Feststoff konzentriert. Das rohe Material wurde rein durch ¹H NMR (~4% cis-Isomer wurde detektiert) und LC-MS (ein Peak): Schmelzpunkt 192-194 °C ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 6,92 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,05 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,69-7,72 (3H, m), 7,79 (1H, d, J = 1,4 Hz), 8,09 (1H, d, J = 1,1 Hz), 8,27 (1H, s), 9,74 (1H, s), 11,14 (1H, s); MS (ESI) m/z 254 ([M+H]⁺).
Analyse für C₁₅H₁₁NO₃:
Errechnet: C: 71,14 H: 4,38 N: 5,53
Ergebnis: C: 70,82 H: 4,22 N: 5,45,
Beispiel 44
Repräsentative Beispiele der Erfindung wurden auf ihre Fähigkeit, mit 17β-Östradiol sowohl für ERα als auch für ERβ zu konkurrieren, ausgewertet. Dieses Testverfahren liefert die Methodik, um zu bestimmen, ob eine besondere Verbindung an den Östrogenrezeptor bindet (und daher "östrogenwirksam" ist) und ob eine Selektivität für ERα oder ERβ vorliegt. Die Werte sind in nachstehender Tabelle angegeben und mit IC₅₀s bezeichnet. 17β-Östradiol ist als ein Standardbezug zum Vergleich eingeschlossen. Das angewandte Verfahren ist nachstehend kurz beschrieben. Ein rohes Lysat von E. coli, das die Östrogenrezeptorligandenbindungsdomänen (D, E, & F) des humanen ERα oder ERβ exprimiert, wurde zubereitet. Sowohl die Rezeptoren als auch die Verbindungen wurden in 1× Dulbecco's PBS (DPBS), ergänzt durch –1 mM EDTA, verdünnt. Unter Verwendung einer abgedeckten Hochbindungs-Mikrotiter-Platte wurden 100 ul des Rezeptors (1 uG/Well) mit 2 nM [³H]-17β-Östradiol und verschiedenen Konzentrationen der Verbindung vermischt. Nach zwischen 5 und 15 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Platten mit DPBS/1 mM EDTA gewaschen und die gebundene Radioaktivität durch Flüssigszintillationszählung bestimmt. Der IC₅₀-Wert wird als die Konzentration der Verbindung definiert, die die Bindung des gesamten 17β-Östradiols um 50% verringert. Die erhaltenen Resultate sind in nachstehender Tabelle beschrieben.
Tabelle: 1-(4'-Hydroxyphenyl)-Aryl-Carbaldehyd Oximderivate
Die beim pharmakologischen Standardtestverfahren erhaltenen Resultate beweisen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen östrogenwirksame Verbindungen sind, einige mit stark bevorzugter Affinität für den ERβ-Rezeptor. Die Affinität der erfindungsgemäßen Verbindungen reicht von einer hohen Vorzugsaffinität für ERβ vorrangig vor ERα bis zu einer beinahe gleichen Affinität für beide Rezeptoren. So umspannen die erfindungsgemäßen Verbindungen einen Aktivitätsbereich, der zumindest teilweise auf ihren Rezeptoraffinitätsselektionsprofilen basiert. Hinzu kommt, dass, da jeder neue Rezeptorligandkomplex einmalig und somit seine Interaktion mit unterschiedlichen koregulatorischen Proteinen einmalig ist, erfindungsgemäße Verbindungen unterschiedliches modulatorisches Verhalten abhängig vom zellularen Kontext, in dem sie sich befinden, zeigen. Zum Beispiel ist es in manchen Zelltypen möglich, dass sich eine Verbindung wie ein Östrogenagonist, wohingegen in anderen Geweben wie ein Antagonist verhält. Verbindungen mit einer solchen Aktivität sind gelegentlich als SERMs (Selektive Östrogenrezeptormodulatoren) bezeichnet worden. Anders als viele Östrogene verursachen viele der SERMs keine Vermehrung des Uterusgewichts. Diese Verbindungen sind antiöstrogenwirksam im Uterus und können die trophischen Effekte der Östrogenagonisten im Uterusgewebe komplett antagonisieren. Diese Verbindungen wirken jedoch als Östrogenagonisten im Knochen-, Herzgefäß- und Zentralnervensystem. Dank dieser gewebeselektiven Natur dieser Verbindungen sind sie nützlich für die Behandlung oder Verhütung bei einem Säugetier von Krankheitszuständen oder Syndromen, die durch einen Östrogenmangel (in gewissen Geweben wie Knochen- oder Herzgefäßgeweben) oder Östrogenüberschuss (im Uterus oder in den Brustdrüsen) ausgelöst werden oder mit diesen einhergehen.
Sogar jenseits einer solchen zellspezifischen Modulation haben die erfindungsgemäßen Verbindungen auch das Potential, sich als Agonisten an einem Rezeptortyp zu verhalten, während sie sich wie Antagonisten an einem anderen verhalten. Zum Beispiel wurde nachgewiesen, dass Verbindungen am ERβ ein Antagonist, aber am ERα ein Agonist sein können (Meyers Marvin J.; Sun Jun; Carlson Kathryn E.; Katzenellenbogen Benita S.; Katzenellenbogen John A., J. Med. Chem. [Zeitschrift für medizinische Chemie] (1999), 42 (13), 2456-2468). Diese ERSAA- (Estrogen Rezeptor Selective Agonist Antagonist) [Östrogenrezeptor-selektive Agonisten-Antagonisten-] Aktivität bietet eine pharmakologisch unterschiedliche östrogene Aktivität innerhalb dieser Verbindungsreihen.
Pharmakologische Standardtestverfahren zur Bestimmung des Aktivitätsprofils einer gegebenen Testverbindung sind fertig erhältlich. Im Folgenden sollen mehrere repräsentative Testverfahren kurz zusammengefasst beschrieben werden. Pharmakologische Standardtestverfahren für SERMs sind auch in den US Patenten 4 418 068 und 5 998 402 vorgeschlagen.
Beispiel 45
Uterotrophische/anti-uterotrophische Testverfahren an Ratten
Die östrogen- und antiöstrogenwirksamen Eigenschaften der Verbindungen können durch ein uterotrophisches Nachweisverfahren an unreifen Ratten (4 Tage alt) bestimmt werden (wie bereits durch L. J. Black und R. L. Goode, Life Sciences [Biowissenschaften), 26, 1453 (1980) beschrieben. Unreife Sprague-Dawley Ratten (weiblich, 18 Tage alt) wurden in Gruppen zu sechs getestet. Die Tiere wurden durch tägliche intraperitoneale Injektion von 10 uG der Verbindung, 100 uG der Verbindung (–100 uG der Verbindung +1 uG 17β-Östradiol) zur Prüfung der Antiöstrogenizität und 1 uG 17β-Östradiol mit 50% DMSO/50% Salzlösung als Injektionsvehikel behandelt. Am Tag 4 wurden die Tiere durch CO₂ Asphyxierung geopfert, ihr Uterus wurde entfernt und überschüssiges Fett abgestreift, jegliche Flüssigkeit entfernt und das Nassgewicht bestimmt. Ein kleiner Schnitt eines Horns wird der Histologie unterbreitet und der Rest zur Isolierung der gesamten RNA für die Bewertung der Genexpression der Komplementärkomponente 3 verwendet.
Beispiel 46
Testverfahren mit 6 Wochen alten ovariektomierten Ratten- Knochen- und Kardioprotektion
Weibliche Sprague-Dawley CD Ratten, beidseitig ovariektomiert (OVX) oder scheinoperiert (Sham), werden 1 Tag nach der Operation von der Taconic Farm bezogen (Gewicht um 240-275 g). 3 oder 4 Ratten werden pro Käfig in einem Raum bei einem Hell-Dunkelzeitplan von 12/12 untergebracht und mit Nahrung (Purina 5K96C Rattenfutter) und Wasser nach Belieben versorgt. Die Behandlung für alle Studien beginnt 1 Tag nach Ankunft der Tiere und wird an 7 Tagen pro Woche wie angegeben 6 Wochen lang dosiert. Eine gleichaltrige Gruppe Sham-operierter Ratten, die keine Behandlung erfuhren, dienen als intakte, mit Östrogen voll ausgestattete Kontrollgruppe für jede Studie.
Alle Behandlungen werden in 1 % Tween 80 in normaler Salzlösung mit definierten Konzentrationen zubereitet, so dass das Behandlungsvolumen 0,1 ml/100 g Körpergewicht ausmacht. 17β-Östradiol wird in Maisöl aufgelöst (20 μg/ml) und subkutan verabreicht, 0,1 ml/Ratte. Alle Dosierungen werden in Abständen von drei Wochen nach Messungen des Durchschnittsgewichts der Gruppe angepasst.
Fünf Wochen nach Initiierung der Behandlung und eine Woche vor Beendigung der Studie wird jede Ratte nach ihrer mineralischen Knochendichte (BMD) ausgewertet. Gesamtdichte und trabekuläre Dichte der proximalen Tibia werden an anästhetisierten Ratten mittels XCT-960 M (pQCT; Stratec Medizintechnik, Pforzheim, Deutschland) ausgewertet. Die Messungen werden wie folgt durchgeführt: Fünfzehn Minuten vor dem Scannen wird jede Ratte durch intraperitoneale Injektion von 45 mg/kg Ketamin, 8,5 mg/kg Xylazin und 1,5 mg/kg Acepromazin anästhetisiert.
Die rechte hintere Gliedmaße wird in ein Polycarbonatröhrchen mit einem Durchmesser von 25 mm eingeführt und mit einem Pflaster auf einem Akrylrahmen mit dem Fußgelenk im 90° Winkel und dem Kniegelenk im 180° Winkel befestigt. Das Polycarbonatröhrchen wird auf einer Gleitplattform fixiert, die es senkrecht zur Öffnung des pQCT festhält. Die Plattform wird derart angepasst, dass das distale Ende des Femur und das proximale Ende der Tibia im Scanbereich zu liegen kommen. Ein zweidimensionales Sichtfeld wird über eine Länge von 10 mm und mit einer Zeilenauflösung von 0,2 mm bewegt. Nachdem das Sichtfeld auf dem Monitor dargestellt ist, wird das proximale Ende der Tibia lokalisiert. Der pQCT Scan wird 3,4 mm distal von diesem Punkt aus initiiert. Der pQCT Scan ist 1 mm dick, hat eine Voxel- (dreidimensionale Pixel-)Größe von 0,140 mm und besteht aus 145 Projektionen durch den Schlitz.
Nach Beendigung des pQCT Scans wird das Bild auf dem Monitor dargestellt. Eine Region von Interesse, die die Tibia einschließt, die Fibula aber ausschließt, wird umrissen. Das weiche Gewebe wird automatisch mittels eines wiederholten Algorithmus entfernt. Die Dichte des verbleibenden Knochens (Gesamtdichte) wird in mg/cm³ angegeben. Die äußeren 55% des Knochens werden in einer konzentrischen Spirale abgeschält. Die Dichte des verbleibenden Knochens (trabekuläre Dichte) wird in mg/cm³ angegeben. Eine Woche nach der BMD-Bewertung werden die Ratten durch Kohlendioxiderstickung euthanasiert und Blut wird zur Cholesterinbestimmung entnommen. Die Uteri werden entfernt und ihre Gewichte erfasst. Das Gesamtcholesterin wird mittels eines klinischen Analysiergerätes Hitachi 911 von Boehringer-Mannheim unter Verwendung des Cholesterin/HP-Kits bestimmt. Die statistischen Werte werden mittels Einweg-Varianzanalyse mit dem Dunnett-Test verglichen.
Beispiel 47
Antiproliferatives MCF-7/ERE Testverfahren
Vorratslösungen von Testverbindungen (üblicherweise 0,1 M) werden in DMSO zubereitet und dann 10- bis 100-fach mit DMSO verdünnt, um Funktionslösungen von 1 oder 10 mM herzustellen. Die DMSO-Vorräte werden entweder bei 4 °C (0,1 M) oder –20 °C (< 0,1 M) gelagert. MCF-7 Zellen werden zweimal in der Woche mit Wachstumsmedium behandelt [D-MEM/F-12 Medium, das 10% (v/v) hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum, 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin und 2 mM GIutaMAX-1 enthält]. Die Zellen werden in gelüfteten Kolben bei 37 °C innerhalb eines 5% CO₂/95% Feuchtluftinkubators aufbewahrt. Ein Tag vor der Behandlung werden die Zellen mit Wachstumsmedium mit 2 pro Well in 96 Well-Platten überzogen und bei 37 °C über Nacht inkubiert.
Die Kultur wird 2 h bei 37 °C mit 50 μl/Well einer 1:10 Verdünnung des Adenovirus 5-ERE-tk-Luciferase im Experimentiermedium [Phenolrotfreies D-MEM/F-12 Medium, das 10% (v/v) hitzeinaktiviertes, charcoal-stripped fetales Rinderserum, 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin, 2 mM GIutaMAX-1, 1 mM Natriumpyruvat enthält] infiziert. Die Wells werden dann einmal mit 150 μλ Experimentiermedium gewaschen. Schließlich werden die Zellen 24 h bei 37 °C in Unterteilungen von 8 Wells/Behandlung mit 150 μλ/Well des Vehikels (≤ 0,1% v/v DMSO) oder einer Verbindung, die ≥ 1000-fach im Experimentiermedium verdünnt wird, behandelt.
Das anfängliche Screening der Testverbindungen erfolgt in einer Einzeldosis von 1 μM, die allein (Agonistenmodus) oder in Kombination mit 0,1 nM 17β-Östradiol (EC₈₀, Antagonistenmodus) getestet wird. Jede 96 Well-Platte umfasst auch eine Vehikelkontrollgruppe (0,1 % v/v DMSO) und eine Agonistenkontrollgruppe (entweder 0,1 oder 1 nM 17β-Östradiol). Dosisantwortexperimente werden durchgeführt in einem der Agonisten- und/oder Antagonistenmodi mit aktiven Verbindungen bei Log.-Anstiegen von 10^–14 bis 10^–5 M. Aus diesen Dosisantwortkurven werden jeweils die EC₅₀- und IC₅₀-Werte generiert. Der letzte Well einer jeden Behandlungsgruppe enthält 5 μl von 3 × 10^–5 M ICI-182 780 (10^–6 M Endkonzentration) als ER Antagonistenkontrolle.
Nach der Behandlung werden die Zellen auf einem Schüttelgerät für 15 Minuten mit 25 μl/Well eines 1× Zellkulturlysereagens (Promega Corporation) lysiert. Die Zelllysate (20 μl) werden auf eine 96 Well-Luminometerplatte übertragen und die Luciferaseaktivität wird in einem MicroLumat LB 96 P Luminometer (EG & G Berthold) unter Verwendung von 100 μl/Well des Luciferasesubstrats (Promega Corporation) gemessen. Vor Injektion des Substrats wird eine Einsekunden-Hintergrundmessung für jeden Well durchgeführt. Nach Injektion des Substrats wird die Luciferaseaktivität für 10 Sekunden nach einer Einsekundenverzögerung gemessen. Die Daten werden vom Luminometer zu einem Macintosh Personal Computer übertragen und unter Verwendung der JMP Software (SAS Institut) analysiert; dieses Programm subtrahiert die Hintergrundaufzeichnungen aus den Luciferasemessungen für jeden Well und bestimmt dann die Durchschnitts- und Standardabweichung einer jeden Behandlung.
Die Luciferasedaten werden durch Logarithmen transfarmiert und mit Hilfe des Huber M-Estimators wird das Gewicht der transformierten Randbeobachtungen bestimmt. Unter Verwendung der JMP Software werden die transformierten und gewichteten Daten für den Einwegetest ANOVA (Dunnett-Test) analysiert. Die abgeschlossenen Behandlungen werden mit den Vehikelkontrollresultaten im Agonistenmodus oder den positiven Agonistenkontrollresultaten (0,1 nM 17β-Östradiol) im Antagonistenmodus verglichen. Für das anfängliche Einzeldosisexperiment werden, wenn sich die Resultate der Verbindungsbehandlung signifikant von der geeigneten Kontrolle unterscheiden (p < 0,05), die Resultate als Prozent relativ zur 17β-Östradiolkontrolle [d. h. ((Verbindung – Vehikelkontrolle)/(17β-Östradiolkontrolle – Vehikelkontrolle)) × 100] angegeben. Mit der JMP Software können auch die EC₅₀- und/oder IC₅₀-Werte aus den nicht-linearen Dosisantwortkurven bestimmt werden.
Beispiel 48
Inhibierung der LDL-Oxidation – Antioxidansaktivität
Schweineaorten werden von einem Schlachthof bezogen, gewaschen, in schockgekühlter PBS transportiert und aortale Endothelialzellen werden geerntet. Um die Zellen zu ernten, werden die interkostalen Gefäße der Aorta abgetrennt und ein Ende der Aorta wird abgeklemmt. Frische, sterile gefilterte, 0,2% Kollagenase (Sigma Type 1) wird in das Gefäß gegeben und das andere Ende des Gefäßes abgeklemmt, um ein geschlossenes System herzustellen. Die Aorta wird bei 37 °C für 15 bis 20 Minuten inkubiert, wonach die Kollagenaselösung entnommen und für 5 Minuten mit 2000 × g zentrifugiert wird. Jedes Pellet wird in 7 ml eines Endothelialzellkulturmediums, das aus phenolrotfreiem DMEM/Ham's F-12 Medium, ergänzt durch charcoal-stripped FBS (5%), NuSerum (5%), L-Glutamin (4 mM), Penicillin-Streptomycin (1000 IE/ml, 100 μg/ml) und Gentamycin (75 μg/ml) besteht, suspendiert, in eine 100 mm Petrischale gesät und bei 37 °C in 5% CO₂ inkubiert. Nach 20 Minuten werden die Zellen mit PBS gespült und frisches Medium zugefügt. Dies wird nach 24 Stunden noch einmal wiederholt. Die Zellen sind nach etwa 1 Woche konfluent. Die Endothelialzellen werden routinemäßig zweimal pro Woche genährt und sobald sie konfluent sind, trypsinisiert und in einem 1:7 Verhältnis gesät. Die zellvermittelte Oxidation von 12,5 μg/ml LDL lässt man in Gegenwart der auszuwertenden Verbindung (5 μM) für 4 Stunden bei 37 °C stattfinden. Die Resultate werden als prozentuale Inhibierung des Oxidationsprozesses ausgedrückt, wie sie durch die TBARS-Methode (Thiobarbitursäure reaktive Substanzen) für die Analyse freier Aldehyde gemessen wird (Yagi K., Biochem Med 15: 212-216 (1976)).
Beispiel 49
D12 Hypothalamuszellen-Testverfahren
Hypothalamuszellen von D12 Ratten werden aus der parentalen RCF17 Zelllinie subkloniert und gefroren gelagert. Sie werden routinemäßig in DMEM:F-12 (1:1), GlutaMAX-1 (2 mM), Penicillin (100 IE/ml)-Streptomycin (100 mg/ml) plus 10% fetalen Rinderserums (FBS) gezüchtet. Die Zellen werden in phenolrotfreiem Medium (DMEM:F-12, GlutaMAX, Penicillin-Streptomycin), das 2 bis 10% charcoal-stripped FBS in subkonfluenter Dichte (1 bis 4 × 10 6 Zellen/150 mm Schale) enthält, propagiert. Die Zellen werden 24 h später erneut mit Medium, das 2% stripped Serum enthält, genährt. Um die Agonistenaktivität zu testen, werden die Zellen mit 10 nM 17β-Östradiol oder unterschiedlichen Dosen der Testverbindung (1 mM oder im Bereich von 1 pM bis 1 mM) behandelt. Um auf ihre Antagonistenaktivität zu testen, werden die Zellen mit 0,1 nM 17β-Östradiol in Abwesenheit oder Anwesenheit verschiedener Dosen (100 pM bis 1 mM) der Testverbindung behandelt. Die Kontrollschalen werden auch mit DMSO als negative Kontrolle behandelt. Achtundvierzig Stunden nach der Hormonzugabe werden die Zellen lysiert und das Bindungstestverfahren durchgeführt.
Für jedes Bindungstestverfahren werden 100-150 mg Protein mit 10 nM ³H-R5020 + 100-fachem Überschuss von R5020 in einem 150 ml Volumen inkubiert. Triplikatreaktionen (drei mit R5020, drei ohne R5020) werden in einer 96 Well-Platte zubereitet. Der Proteinextrakt wird zugefügt, zunächst gefolgt von ³H-R5020 oder ³H-R5020 + 100 × unmarkiertem R5020. Die Reaktion wird für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 100 ml kalter 5% Charcoal (Norit SX-4), 0,5% Dextran 69K (Apotheke) in TE pH 7,4 gestoppt. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur werden der gebundene und der ungebundene Ligand durch Zentrifugation (5 Minuten, 1000 RCF, 4 °C) getrennt. Die überstehende Lösung (150 ml) wird entfernt und zu einem Szintillationsglasfläschchen übertragen. Nach Zugabe der Szintillationsflüssigkeit (Beckman fertiges Protein+) werden die Proben für 1 Minute in einem Szintillationszähler gezählt.
Beispiel 50
Progesteronrezeptor im präoptischen ZNS-Bereich
Sechzig (60) Tage alte weibliche Sprague-Dawley Ratten wurden ovariektomiert. Die Tiere werden in einer Tierversorgungseinrichtung mit 12-h Hell- und 12-h Dunkelphotoperiode untergebracht und erhalten Wasser und Nagetierfutter nach Belieben.
Ovariektomierte Tiere werden randomisiert in Gruppen unterteilt, die mit Vehikel (50% DMSO, 40% PBS, 10% Ethanolvehikel), 17β-Östradiol (200 ng/kg) oder der zu testenden Verbindung injiziert werden. Zusätzliche Tiere werden mit der Testverbindung 1 Stunde vor der Injektion von 17β-Östradiol injiziert, um die Antagonisteneigenschaften dieser Verbindung auszuwerten. Sechs Stunden nach subkutaner Injektion werden die Tiere mit einer letalen Dosis CO₂ euthanasiert und ihre Gehirne entnommen und gefroren.
Von Tieren entnommnes Gewebe wird auf einem Cryostat bei –16 °C geschnitten und auf Silan-überzogene Mikroskopobjektträger aufgebracht. Die mit Schnitten belegten Objektträger werden dann auf einem Objektträgererwärmer, dessen Temperatur bei 42 °C gehalten wird, getrocknet und in ausgetrockneten Objektträgerboxen bei –80 °C gelagert. Vor dem Prozess werden die ausgetrockneten Objektträgerboxen langsam auf Raumtemperatur (–20 °C für 12 bis 16 Stunden; 4 °C für 2 Stunden; Raumtemperatur für 1 Stunde) erwärmt, um die Kondensationsbildung auf den Objektträgern zu eliminieren und so die Gewebe- und RNA-Degradierung zu minimieren. Die trockenen Objektträger werden in Metallgestelle platziert, in 4% Paraformaldehyd (pH 9,0) für 5 Minuten postfixiert und wie vorher beschrieben bearbeitet.
Ein Plasmid, das ein 815bp-Fragment der Ratten PR-cDNA 9 (Ligandbindungsdomäne) enthält, wird linearisiert und verwendet, um eine S 35 -UTP-markierte Sonde zu generieren, die zu einem Abschnitt der Ratten PR-mRNA komplementär ist. Bearbeitete mit Schnitten belegte Objektträger werden mit 200 ml eines Hybridisierungsmix, der die Riboprobe (4 bis 6 × 10 6 DPM/Objektträger) und 50% Formamid enthält, hybridisiert und über Nacht in einer 55 °C befeuchteten Kammer inkubiert. Am Morgen werden die Objektträger in Metallgestelle gesetzt, die in 2 × SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natiumcitrat; pH 7,0)/10 mM DTT immergiert sind. Die Gestelle werden alle zu einem großen Behälter gebracht und in 2 × SSC/10 mM DTT für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln gewaschen. Die Objektträger werden dann in RNase-Puffer bei 37 °C für 30 Minuten gewaschen, mit RNase A (20 mg/ml) für 30 Minuten bei 37 °C behandelt und für 15 Minuten in Raumtemperatur aufweisender 1 × SSC gewaschen. Daraufhin werden die Objektträger gewaschen (2 × 30 Minuten) in 65 °C in 0,1 × SSC, um nichtspezifische Markierung zu entfernen, in Raumtemperatur aufweisender 0,1 × SSC für 15 Minuten gespült und mit aufsteigender Alkoholreihe: Ammoniumacetat (70%, 95% und 100%) dehydriert. Die luftgetrockneten Objektträger werden 3 Tage lang einem Röntgenfilm gegenüber gestellt und dann photographisch behandelt. Die Objektträger von allen Tieren werden zusammen hybridisiert, gewaschen, exponiert und photographisch bearbeitet, um Unterschiede auf Grund der Zwischenuntersuchungsvariation bei den Bedingungen zu eliminieren.
Beispiel 51
Rattenhitzewallung-ZNS-Effekte
Ovariektomierte weibliche, 60 Tage alte Sprague-Dawley Ratten werden nach der Operation bezogen. Die Operationen sind mindestens 8 Tage vor der ersten Behandlung durchgeführt. Die Tiere werden einzeln bei einem 12 h Hell-/Dunkelzyklus untergebracht und erhalten Standardrattenfutter und Wasser nach Belieben.
Zwei Kontrollgruppen werden in jede Studie mit aufgenommen. Dosierungen werden basierend auf mg/kg Durchschnittsgruppenkörpergewicht entweder in 10% DMSO in Sesamöl (subkutane Studien) oder in 1,0% Tween 80 in Salzlösung (orale Studien) zubereitet. Den Tieren werden Testverbindungen in Dosen verabreicht, die von 0,01 bis 10 mg/kg Durchschnittsgruppenkörpergewicht betragen. Kontrollgruppen für die Vehikel- und Ethinylöstradiol (EE)-Kontrollen (0,1 mg/kg, subkutan oder 0,3 mg/kg, per os) sind bei jedem Test eingeschlossen. Werden die Verbindungen auf ihre Antagonistenaktivität hin getestet, wird EE mitverabreicht in einer Dose von jeweils 0,1 oder 0,3 mg/kg für subkutane oder orale Studien. Die Testverbindungen werden bis zu dem Tag verabreicht, an dem die Schwanzhaartemperatur gemessen wird.
Nach der Akklimatisierungsperiode von vier Tagen werden die Tiere einmal pro Tag mit der (den) Verbindungen) von Interesse behandelt. Jede Behandlungsgruppe umfasst 10 Tiere. Die Verabreichung der Verbindung erfolgt entweder durch subkutane Injektion von 0,1 ml in den Nacken oder oral mit einem Volumen von 0,5 ml. Am 3. Tag der Behandlung wird ein Morphinpellet (75 mg Morphinsulfat) subkutan implantiert. Am 5. Tag der Behandlung werden ein Morphinpellet oder zwei Morphinpellets zusätzlich implantiert. Am achten Tag wird etwa der Hälfte der Tiere Ketamin (80 mg/kg intramuskulär) injiziert und ein Thermoelement verbunden mit einem MacLab Datenerfassungssystem (API Instruments, Milford, MA) mit dem Pflaster auf dem Schwanz etwa ein Inch (ca. 2,54 cm) von der Schwanzwurzel entfernt befestigt. Dieses System erlaubt die kontinuierliche Messung der Schwanzhauttemperatur. Die Basistemperatur wird 15 Minuten gemessen, dann wird Naloxon (1,0 mg/kg) subkutan appliziert (0,2 ml), um die Wirkung des Morphins zu blockieren, und die Schwanzhauttemperatur danach für eine Stunde gemessen. Am neunten Tag werden die verbleibenden Tiere vorbereitet und auf die gleiche Weise analysiert.
Beispiel 52
Vasomotorische Funktion isolierter Rattenaortaringe
Sprague-Dawley Ratten (240 bis 260 g) werden in 4 Gruppen aufgeteilt:

1. Normale, nicht ovariektomierte (intakte) Tiere,
2. Ovariektomierte (ovx), mit Vehikel behandelte Tiere,
3. Ovariektomierte, mit 17-β-Östradiol (1 mg/kg/Tag) behandelte Tiere,
4. Ovariektomierte mit der Testverbindung (d. h. 1 mg/kg/Tag) behandelte Tiere.

Die Tiere werden etwa 3 Wochen vor der Behandlung ovariektomiert.
Jedes Tier erhält 1 mg/kg/Tag entweder 17β-Östradiolsulfat oder die Testverbindung, suspendiert in destilliertem, entionisiertem Wasser, mit 1 Tween-80 durch Magenverabreichung. Die mit Vehikel behandelten Tiere erhielten ein angemessenes Volumen des bei den mit dem Arzneistoff behandelten Gruppen angewandten Vehikels.
Die Tiere werden durch CO₂-Inhalation und Ausbluten euthanasiert. Ihre Thoraxaorten werden schnell entfernt und in physiologische 37 °C Lösung mit folgender Zusammensetzung eingelegt (mM): NaCl (54,7), KCl (5,0), NaHCO₃ (25,0), MgCl₂ 2H₂O (2,5), D-Glucose (11,8) und CaCl₂ (0,2) begast mit CO₂-O₂, 95%/5% für einen Schluss-pH-Wert von 7,4. Die Adventitia wird von der äußeren Oberfläche entfernt und das Gefäß in 2 bis 3 mm breite Ringe geschnitten. Die Ringe werden in ein 10 ml Gewebebad gehängt, wobei das eine Ende auf dem Boden des Bades und das andere an einen Kraftumformer angeheftet wird. Eine Ruhespannung von 1 g wird auf die Ringe gelegt. Die Ringe werden für 1 Stunde ausbalanciert. Die Signale werden erfasst und analysiert.
Nach dem Ausbalancieren werden die Ringe ansteigenden Konzentrationen von Phenylephrin (10^–8 bis 10^–4 M) ausgesetzt und die Spannung aufgezeichnet. Die Bäder werden dreimal mit frischem Puffer gespült. Nach dem Auswaschen werden 200 mM L-NAME zu dem Gewebebad zugefügt und für 30 Minuten ausbalanciert. Die Phenylephrinkonzentrationsantwortkurve wird dann wiederholt.
Beispiel 53
Achtarmiges Radialarmlabyrinth – Steigerung der Erkenntnisfähigkeit
Männliche Sprague-Dawley CD Ratten (Charles River, Kingston, NY), die bei der Ankunft 200 bis 250 g wogen, werden verwendet. Eine Woche lang werden die Ratten zu sechst in einem Käfig mit nach Belieben verfügbarem Standard-Laborfutter und Wasser untergebracht. Die Unterbringung erfolgt in einem Kolonieraum, dessen Temperatur bei 22 °C gehalten wird, bei einem 12 Stunden Hell-/Dunkelzyklus mit Einschalten der Lampen um 6 h morgens. Nach Gewöhnung an die Einrichtung werden die Tiere einzeln untergebracht und bei 85% des Gewichts mit freiem Futter gehalten. Ist ein stabiles Gewicht erreicht, werden die Ratten an das Labyrinth mit acht radialen Armen gewöhnt.
Die Struktur des Labyrinths ist eine Adaptation nach dem von Peele und Baron (Pharmacology, Biochemistry, and Behavior, (Pharmakologie, Biochemie und Verhalten] 29: 143-150, 1988) Beschriebenen. Das Labyrinth wird in eine Höhe von 75,5 cm aufgerichtet und setzt sich zusammen aus einer kreisförmigen Fläche, umgeben von 8 Armen, die vom Zentrum aus weg radial in gleichem Abstand von einander verlaufen. Jeder Arm ist 58 cm lang × 13 cm hoch. Ein klarer Plexiglaszylinder wird abgesenkt, um das Tier im zentralen Abschnitt des Labyrinths vor Beginn einer jeden Übung einzuschließen. Jeder Arm des Labyrinths ist mit 3 Sätzen Photozellen mit einer Schnittstelle zu einer Datenerfassungseinheit ausgerüstet, die ihrerseits eine Schnittstelle mit einem Computer besitzt. Die Photozellen werden benutzt, um die Bewegung der Ratte im Labyrinth zu verfolgen. Über Futternäpfen am Ende eines jeden Arms angebrachte Pelletspender geben zwei 45 mg Chokoladepellets aus, wenn die äußere Photozelle des Arms zum ersten Mal in einer bestimmten Übung aktiviert wird. Das Labyrinth befindet sich in einem Versuchsraum mit schwarzen und weißen geometrischen Postern auf jeder Wand, die als visuelle Hinweise dienen sollen. Während sämtlicher Übungs- und Testverfahren ist weißes Rauschen hörbar (~70 db).
Das Übungsverfahren besteht aus fünf Phasen, jede mit täglichen Sitzungen, die 5 oder 10 Minuten dauern. Eine 10 Sekundenverzögerung wird zwischen der Zeit, in der die Ratte in den zentralen Abschnitt des Labyrinths platziert wird und der Zeit, in der der Zylinder hochgehoben wird, um die Sitzung zu beginnen, auferlegt. Während der Phase 1 werden Rattenpaare, die eingeschränktes Futter erhielten, für 10 Minuten auf das Labyrinth platziert, wobei 45 mg Chokoladefutterpellets in den 8 Armen des Labyrinths verteilt sind.
Während der Phase II wird jede Rate einzeln auf das Labyrinth für einen Zeitraum von 10 Minuten platziert, wobei Pellets von der mittleren Photozelle an bis zum Futternapf eines jeden Arms verteilt sind. Während der Phase III wird jede Ratte für einen Zeitraum von 10 Minuten auf das Labyrinth gesetzt, wobei Futterpellets sich nur in den Futternäpfen und um diese herum in jedem Arm befinden. In Phase IV wird es jeder Ratte 10 Minuten lang erlaubt, zwei Pellets aus jedem Arm zu entnehmen. Das Rückkehren in einen Arm wird als Irrtum bewertet. Die Ratten werden täglich auf diese Weise trainiert, bis sie eine Kriterienleistung von weniger als oder gleich 2 Gesamtirrtümern an drei aufeinander folgenden Trainingstagen erreichen. Die totale Gewöhnungs- und Übungszeit beträgt etwa 3 Wochen.
Die Testverbindung wird in Phosphat-gepufferter Salzlösung zubereitet und in einem Volumen von 1 ml/kg verabreicht. Scopolamin HBr (0,3 mg/kg subkutan) diente als schädigender Wirkstoff, der einen Anstieg der Irrtumsrate (Gedächtnisverlust) auslöste. Die Testverbindung wird intraperitoneal gleichzeitig mit Scopolamin 30 Minuten vor dem ersten Aussetzen im Labyrinth an irgendeinem gegebenen Testtag verabreicht.
Um die Testverbindung zu bewerten, wird ein 8 × 8 balancierter latin Square für wiederholte Messungen vorgesehen, um eine hohe experimentelle Effizienz mit der geringsten Menge an Tieren zu erzielen. Acht experimentelle Sitzungen, zwei pro Woche, werden mit den 8 Behandlungen (Vehikel, Scopolamin, 3 Dosen der Testverbindung in Kombination mit Scopolamin) randomisiert innerhalb jeder Sitzung durchgeführt. Jeder Behandlung folgte jede andere Behandlung gleich oft. Deshalb konnte der Residualeffekt einer jeden Behandlung geschätzt werden und vom direkten Behandlungseffekt entfernt werden. Nach ANOVA werden multiple Vergleiche angestellt unter Verwendung des zweiseitigen Dunnett-Tests auf eingestellten Mitteln.
Tiere, die nicht 4 korrekte Wahlentscheidungen innerhalb von 5 Minuten während der ersten Exposition, oder die nicht insgesamt 8 Wahlentscheidungen bis zum Ende der 2. Exposition trafen, werden für diese Sitzung als „zeitlich ausgeschieden" angesehen. Jedes Tier, das nach Verabreichung von mehr als einer Dosis der Testverbindung „zeitlich ausgeschieden" ist, wird aus der Analyse ausgeschlossen.
Beispiel 54
Neuroprotektion
Inhibierung des zeitabhängigen Todes von Zellen in primären kortikalen Neuronenkulturen
Primäre kortikale Neuronen wurden aus Rattenhirnen produziert, die 0 bis 1 Tag alt waren, unter Anwendung einer Variation der von Monyer et al., 1989, Brain Research [Gehirnforschung] 483: 347-354 beschriebenen Methode. Ausgebreitetes Hirngewebe ließ man in DMEM/10% PDHS (Spenderserum von trächtigen Stuten) für drei Tage wachsen und behandelte es dann mit Cytosinarabinosid (ARC) für zwei Tage, um kontaminierende Gliazellen zu entfernen. Am Tag 5 wurde das ARC-Medium entfernt und durch DMEM/10% PDHS ersetzt. Die neuronalen Zellen wurden für weitere 4 bis 7 Tage gezüchtet, bevor sie verwendet wurden.
Primäre neuronale Kontrollkulturen zeigen progressiven Zelltod zwischen dem Tag 12 und 18 in der Kultur. Zwölf Kulturen wurden am Tag 12 und 16 auf ihre Spiegel des Enzyms Laktatdehydrogenase (LD) hin ausgewertet, nachdem die Testverbindung am Tag 9 sechs Kulturen, die in DMEM und 10% PDHS gehalten wurden, zugesetzt wurde, wobei die verbleibenden Kulturen zur Kontrolle erhalten blieben. Die LD wurde unter Anwendung einer Variation der von Wroblewski et al., 1955, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 90: 210-213 beschriebenen Methode bestimmt. Die LD ist ein zytosolisches Enzym, das üblicherweise sowohl in der klinischen als auch in der Grundlagenforschung zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Gewebe verwendet wird. Ein Anstieg des LD-Medienspiegels steht in direktem Zusammenhang mit dem Zelltod.
Neuroprotektion gegen durch Zytotoxizität induzierte Hypoalykämie
C6 Gliomazellen, die von ATCC bezogen wurden, wurden in RPMI Medium mit FBS in einer Konzentration von 1 × 10<6>Zellen/ml in FALCON 25 cm² Gewebekulturkolben propagiert. Vier Stunden vor Einsetzen der Hypoglykämie wurde das Unterhaltungsmedium entfernt, die Monolagen wurden zweimal im geeigneten Medium gewaschen und dann für vier Stunden bei 37 °C entweder Serum frei oder Serum frei plus Testverbindung inkubiert. Mittels Krebs-Ringer Phosphatpuffer wurden die Monolagen zweimal gewaschen, bevor die geeignete Glukosebehandlung zugesetzt wurde. Das RPMI Medium enthält 2 mg Glucose/ml; die Kolben wurden in Gruppen von 6 unterteilt, die jeweils 100% Glucose (2 mg/ml), 80% Glucose (1,6 mg/ml), 60% Glucose (1,2 mg/ml) oder 0% Glucose (Puffer) erhielten oder mit der Testverbindung ergänzt wurden. Alle Kolben wurden für 20 Stunden inkubiert und dann wurde unter Verwendung von Trypanblau die gesamte, lebende und tote Zellenanzahl ausgewertet.
Neuroprotektion gegen exzitotoxische Aminosäuren
Fünf SK-N-SH Neuroblastomzellen enthaltende Kulturschalen wurden mit der Testverbindung und fünf Kulturschalen wurden mit dem RPMI Medium behandelt. Vier Stunden später wurden alle Zellen mit NMDA (500 mu M) für 5 Minuten behandelt. Die Gesamtzahl der lebenden und toten Zellen wurde dann bestimmt.
Neuroprotektion gegen Sauerstoff-Glukoseentzug
Analyse von pyknotischen Nuklei zur Messung der Apoptosis:
Kortikale Neuronen werden aus E 18 Rattenfeten präpariert und in 8-Well-Kammerobjektträger propagiert, die zuvor mit Poly-D-Lysin (10 ng/ml) und Serum mit einer Dichte von 100 000 Zellen/Well überzogen worden sind. Die Zellen werden in Hoch-Glukose-DMEM, das 10% FCS enthält, geglättet und im Inkubator bei 37 °C mit 10% CO₂/90% Luft aufbewahrt. Am nächsten Tag wird das Serum durch Ersatz des Kulturmediums durch den B27-Zusatz enthaltendes Hoch-Glucose-DMEM entfernt, und die Zellen werden im Inkubator ohne weiteren Mediumaustausch bis zum Tag des Experiments aufbewahrt. Am Tag 6 werden die Objektträger in zwei Gruppen unterteilt: in die Kontrollgruppe und die OGD-Gruppe. Die Zellen der Kontrollgruppe erhalten DMEM mit Glucose und gebräuchlichen B27 (ohne Antioxidanzien). Die Zellen der OGD-Gruppe erhalten DMEM ohne Glucose mit gebräuchlichem B27, das unter Vakuum für 15 Minuten entgast worden ist. Die Zellen werden mit 90% N₂/10% CO₂ für 10 Minuten in einer luftdichten Kammer gespült und bei 37 °C für 6 Stunden inkubiert. Nach 6 Stunden werden Kontroll- und OGD-Zellen einem Austausch des Mediums, das entweder ein Vehikel (DMSO) oder die Testverbindung in Glucose-haltigem DMEM mit gebräuchlichem B27 enthält, unterzogen. Die Zellen werden wieder in den normoxischen Inkubator bei 37 °C gegeben. Nach 24 Stunden werden die Zellen in 4 % PFA für 10 Minuten bei 4 °C fixiert und mit Topro (nukleärer Fluoreszenz-Bindungsfarbstoff) gefärbt. Die Apoptose wird mittels Laser-Scan-Zytometer durch Messung der pyknotischen Nuklei bestimmt.
Messung der LDH Freisetzung als Indikation für den Zelltod:
Kortikale Neuronen werden aus E 18 Rattenfeten präpariert und in 48-Well-Kammerobjektträger propagiert, die zuvor mit Poly-D-Lysin (10 ng/ml) und Serum mit einer Dichte von 150 000 Zellen/Well überzogen worden sind. Die Zellen werden in Hoch-Glukose-DMEM, das 10% FCS enthält, geglättet und im Inkubator bei 37 °C mit 10% CO₂/90% Luft aufbewahrt. Am nächsten Tag wird das Serum durch Ersatz des Kulturmediums durch den B27 Zusatz enthaltendes Hoch-Glucose-DMEM entfernt, und die Zellen werden im Inkubator ohne weiteren Mediumaustausch bis zum Tag des Experiments aufbewahrt. Am Tag 6 werden die Objektträger in zwei Gruppen unterteilt: in die Kontrollgruppe und die OGD-Gruppe. Die Zellen der Kontrollgruppe erhalten DMEM mit Glucose und gebräuchlichem B27 (ohne Antioxidanzien). Die Zellen der OGD-Gruppe erhalten DMEM ohne Glucose mit gebräuchlichem B27, das unter Vakuum für 15 Minuten entgast worden ist. Die Zellen werden mit 90% N₂/10% CO₂ für 10 Minuten in einer luftdichten Kammer gespült und bei 37 °C für 6 Stunden inkubiert. Nach 6 Stunden werden Kontroll- und OGD-Zellen einem Austausch des Mediums unterzogen, das entweder ein Vehikel (DMSO) oder die Testverbindung in Glucose-haltigem DMEM mit gebräuchlichem B27 enthält. Die Zellen werden wieder in den normoxischen Inkubator bei 37 °C gegeben. Nach 24 Stunden wird der Zelltod bestimmt durch Messung der zellularen Freisetzung von LDH (Lactatdehydrogenase) in das Kulturmedium. Für die LDH Prüfung wird eine Aliquote von 50 μl Kulturmedium in die 96 Wellplatte übertragen. Nach Zugabe von 140 μl 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) und 100 μl 0,2 mg/ml NADH lässt man die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 Minuten sich setzen. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 μl Natriumpyruvat initiiert. Die Platte wird sofort bei 340 nM in einem Thermomax Plattenlesgerät (Molecular Devices) gelesen. Der Absorbtionskoeffizient, ein Index der NADH Konzentration, wird alle 6 Sekunden für 5 Minuten aufgezeichnet und anhand des Gefälles, das die Rate des Verschwindens von NADH anzeigt, wird die LDH Aktivität berechnet. LDH Aktivität(IE/ml) = (ΔA/Minute)(TCF)(20)(0,0833)/(0,78)wobei: 0,0833 = Proportionalitätskonstante
0,78 = Instrumentenlichtpfadlänge (cm).
Beispiel 55
HLA Rattentestverfahren-Crohn-Krankheit und entzündliche Darmerkrankungen
Männliche HLA-B27 Ratten werden von Taconic bezogen und erhalten uneingeschränkten Zugang zu Futter (PMI Labornahrung 5001) und Wasser. Zu Beginn der Studie sind die Ratten 22 bis 26 Wochen alt.
Den Ratten wird einmal täglich subkutan sieben Tage lang eine der nachstehend aufgelisteten Präparate verabreicht. Fünf Ratten befinden sich in jeder Gruppe und die letzte Dosis wird zwei Stunden vor dem Euthanasieren verabreicht.

– Vehikel (50% DMSO/50% Dulbecco's PBS)
– 17α-Ethinyl-17β-Östradiol (10 μg/kg)
– Testverbindung

Die Stuhlqualität wird täglich beobachtet und nach folgender Skala eingestuft: Diarrhö = 3; weicher Stuhl = 2; normaler Stuhl = 1. Am Ende des Testverfahrens wird Serum entnommen und bei –70 °C gelagert. Ein Kolonschnitt wird zur histologischen Analyse präpariert und ein zusätzliches Segment wird auf die Myeloperoxidaseaktivität hin analysiert.
Zur Messung der Myeloperoxidaseaktivität wird folgende Methode angewandt. Kolongewebe wird entnommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Eine repräsentative Probe des ganzen Kolons wird dazu verwendet, um die Übereinstimmung zwischen den Proben sicherzustellen. Das Gewebe wird bei –80 °C bis zur Verwendung gelagert. Als nächstes wird das Gewebe gewogen (etwa 500 mg) und homogenisiert in 1:15 w/v von 5 mM H₂KPO₄ (pH 6) Waschpuffer. Das Gewebe wird bei 20 000 × g in einer Sorvall RC 5B Zentrifuge für 45 Minuten bei 2 bis 8 °C herunter zentrifugiert. Der Überstand wird dann entfernt. Das Gewebe wird resuspendiert und homogenisiert in 2,5 ml (1 :5 w/v) von 50 mM H₂KPO₄ mit 10 mM EDTA und 0,5% Hex.-Ammoniumbromid, um das Auflösen der intrazellularen MPO zu begünstigen. Das Gewebe wird in flüssigem Stickstoff gefroren, in einem 37 °C-Wasserbad aufgetaut und für 15 Sekunden beschallt, um die Membranlyse sicherzustellen. Dieses Verfahren wird dreimal wiederholt. Die Proben werden dann für 20 Minuten auf Eis gehalten und mit 12 000 × g für 15 Minuten bei 2 bis 8 °C zentrifugiert. Der Überstand wird nach den folgenden Schritten analysiert.
Die Testmixtur wird zubereitet durch Zugabe von 2,9 ml von 50 mM H₂KPO₄ mit 0,167 O-Dianisidin/ml mit 0,0005% H₂O₂ in ein Reaktionsröhrchen.
Wenn das Wasserstoffperoxid degradiert ist, wird das O-Dianisidin oxidiert und absorbiert bei 460 nm in Abhängigkeit der Konzentration. Die Mixtur wird auf 25 °C erwärmt. Einhundert (100) μl des Gewebeüberstands werden in das Reaktionsröhrchen gegeben, für eine Minute bei 25 °C inkubiert, dann wird 1 ml zu einer verfügbaren Plastikwanne übertragen. Das OD wird alle 2 Minuten der Reaktionszeit bei 460 nm gegen eine Blindprobe, die 2,9 ml der Reaktionsmixtur und 100 μl der 0,5% Ammoniumbromidlösung enthält, gemessen.
Die Enzymaktivitätseinheiten werden quantifiziert durch Vergleich des Absorptionskoeffizienten @460 mit einer Standardkurve, die mit gereinigter humaner MPO, 31,1 Einheiten/Glasfläschchen, erstellt wurde. Die MPO wird rekonstituiert und serienweise verdünnt unter Verwendung von 50 mM H₂KPO₄ mit 10 mM EDTA und 0,5% Hex.-Ammoniumbromid in vier bekannte Konzentrationen. Die Absorptionskoeffizienten der Probe werden mit dieser Kurve verglichen, um die Aktivität zu bestimmen.
Die histologische Analyse wird wie folgt durchgeführt. Kolongewebe wird in 10% neutralem gepuffertem Formalin immergiert. Jede Kolonprobe wird zur Auswertung in vier Gruppen aufgeteilt. Die Formalin-fixierten Gewebe werden in einem Vakuuminfiltrationsprozessor für die Paraffineinbettung behandelt. Die Proben werden bei 5 μm geschnitten und dann mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) für histologische Blindauswertungen unter Verwendung einer nach Boughton-Smith modifizierten Skala gefärbt. Nach Abschluss der Zählung werden die Proben gereinigt und die Daten tabelliert und analysiert mittels linearer ANOVA Schablone mit multiplen Durchschnittsvergleichen.

Claims

Verbindung der Formel (I):
wobei R¹ Wasserstoff, Halogen, C_1-6Alkyl, CN oder C_1-6Alkoxy ist; R² und R³ zusammen einen kondensierten Aryl- oder Heteroarylring bilden; R⁴ Wasserstoff, Halogen, C_1-6Alkyl, CN oder C_1-6Alkoxy ist; jeder R⁵ gleich oder unterschiedlich ist und aus Wasserstoff, C_1-6Alkyl und -C(O)R⁶ ausgewählt ist und R⁶ C_1-6Alkyl ist oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R⁴ Wasserstoff oder Halogen ist.
Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei R¹ Halogen ist.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R² und R³ zusammen einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei: R² und R³ zusammen einen Phenyl-, Furan- oder Thiophenring bilden.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R¹ F und R⁴ Wasserstoff oder F ist.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei jeder R⁵ H ist.
Verbindung nach Anspruch 1, die eine der Folgenden darstellt: (a) 4-(4-Hydroxyphenyl)-1-Naphthaldehydoxim; (b) 4-(3-Fluor-4-Hydroxyphenyl)-Naphthalen-1-Carbaldehydoxim; (c) 4-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzothiophen-7-Carbaldehydoxim; (d) 7-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzothiophen-4-Carbaldehydoxim; (e) 7-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzofuran-4-Carbaldehydoxim; (f) 4-(4-Hydroxyphenyl)-Benzofuran-7-Carbaldehydoxim; (g) 5-(4-Hydroxyphenyl)-1-Benzofuran-7-Carbaldehydoxim oder (h) 7-(4-Hydroxyphenyl)-Benzofuran-5-Carbaldehydoxim.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel (I) nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I) nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Zubereitung eines Medikaments zur Inhibierung von Osteoporose bei einem Säugetier.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I) nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Zubereitung eines Medikaments zur Inhibierung der Osteoarthritis, Hypokalzämie, Hyperkalzämie, des Paget-Krankheit, der Osteomalazie, Osteohalisterese, des multiplen Myeloms oder anderer Formen von Krebs, die eine deletäre Wirkung auf die Knochengewebe bei einem Säugetier ausüben.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I) nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Zubereitung eines Medikaments zur Inhibierung des benignen oder malignen abnormen Gewebewachstums bei einem Säugetier.
13 Verwendung nach Anspruch 12, wobei das abnorme Gewebewachstum eine Prostatahypertrophie, uterine Leiomyoma, ein Mammakarzinom, Endometriose, ein Endometriumkarzinom, polyzystisches Eierstocksyndrom, Endometriumpolypen, eine benigne Brusterkrankung, Adenomyose, ein Ovarialkarzinom, Melanoma, ein Prostratakarzinom, Kolonkarzinom oder Karzinome des ZNS ist.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I) nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Zubereitung eines Medikaments zur Senkung der Cholesterin-, Triglyzerid-, Lp(a)- oder LDL-Spiegel oder zur Inhibierung der Hypercholesterinämie, Hyperlipidämie, eines kardiovaskulären Syndroms, der Atherosklerose, eines peripheren vaskulären Syndroms, einer Restenose oder eines vasospastischen Syndroms oder zur Inhibierung eines Gefäßwandschadens zellulärer Ereignisse, der zum immunvermittelten Gefäßschaden bei einem Säugetier führen.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I) nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Zubereitung eines Medikaments zur Inhibierung von durch freie Radikale induzierten Krankheitszuständen bei einem Säugetier.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I) nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Zubereitung eines Medikaments zur Verbesserung des Erkenntnisvermögens oder zur Neuroprotektion, oder zur Behandlung oder Inhibierung der senilen Demenz, Alzheimer-Krankheit, der Abnahme des Erkenntnisvermögens oder neurodegenerativer Störungen bei einem Säugetier.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I) nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Zubereitung eines Medikaments zur Inhibierung der entzündlichen Darmerkrankung, ulzerativen Proktitis, Crohn-Krankheit, Kolitis, von Hitzewallungen, der vaginalen oder vulvären Atrophie, atrophischen Vaginitis, vaginalen Trockenheit, Pruritus, Dyspareunie, Dysurie, von häufigem Urinieren, der Harninkontinenz, von Infektionen des Harntrakts, vasomotorischen Symptomen, der männlichen Kahlköpfigkeit, Hautatrophie; Akne; des Typ-2-Diabetes, der dysfunktionellen uterinen Blutung oder Infertilität bei einem Säugetier.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I) nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Zubereitung eines Medikaments zur Inhibierung der Leukämie, von Endometriumablationen, eines chronischen Nieren- oder Leberleidens oder von Koagulationskrankheiten oder -störungen bei einem Säugetier.