ES2289538T3

ES2289538T3 - Derivados de la oxima del hidroxibifenilcarbaldehido y su uso como agentes estrogenicos.

Info

Publication number: ES2289538T3
Application number: ES04750947T
Authority: ES
Inventors: Richard Eric Mewshaw; Cijiang Yang
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2003-05-02
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2024-04-30
Also published as: DE602004007257D1; CA2523712A1; EP1620392A2; WO2004099122A3; PL1620392T3; US7279600B2; DK1620392T3; US20080033049A1; WO2004099122A2; JP2006525346A; BRPI0409960A; AU2004236213A1; DE602004007257T2; US20050020676A1; EP1620392B1; MXPA05011679A; ATE365708T1

Abstract

Compuesto de fórmula: en la que R1 y R2 son, cada uno independientemente, H, halógeno, CN, fenilo opcionalmente sustituido, o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; R3, R4, R5 y R6 son, cada uno independientemente, H, OH, halógeno, CN, fenilo opcionalmente sustituido, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido o alcoxi C1-C6 opcionalmente sustituido; cada R8 es H; y R9 es alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Derivados de la oxima del hidroxibifenilcarbaldehído y su uso como agentes estrogénicos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos derivados de la oxima del 4'-hidroxibifenilcarbaldehído, a sus usos como agentes estrogénicos, y a métodos para su preparación.

Antecedentes de la invención

Los efectos pleiotrópicos de los estrógenos en tejidos de mamíferos están bien documentados, y en la actualidad se conoce que los estrógenos afectan a muchos sistemas de órganos [Mendelsohn y Karas, New England Journal of Medicine 340: 1801-1811 (1999), Epperson, et al., Psychosomatic Medicine 61: 676-697 (1999), Crandall, Journal of Womens Health & Gender Based Medicine 8: 1155-1166 (1999), Monk y Brodaty, Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 11: 1-10 (2000), Hurn y Macrae, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 20: 631-652 (2000), Calvin, Maturitas 34: 195-210 (2000), Finking, et al., Zeitschrift fur Kardiologie 89: 442-453 (2000), Brincat, Maturitas 35: 107-117 (2000), Al-Azzawi, Postgraduate Medical Journal 77: 292-304 (2001)]. Los estrógenos pueden ejercer efectos en los tejidos, de diversas maneras. Probablemente, el mecanismo de acción mejor caracterizado es su interacción con receptores de estrógenos, lo que provoca alteraciones en la transcripción de genes. Los receptores de estrógenos son factores de transcripción activados por ligandos, y pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares de hormonas. Otros miembros de esta familia incluyen los receptores de progesterona, andrógenos, glucocorticoides y mineralocorticoides. Al unirse al ligando, estos receptores se dimerizan y pueden activar la transcripción de genes bien uniéndose directamente a secuencias específicas en el ADN (conocidas como elementos de respuesta), o bien interaccionando con otros factores de transcripción (tales como AP1) que, a su vez, se unen directamente a secuencias específicas de ADN [Moggs y Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001), McDonnell, Principles Of Molecular Regulation. págs. 351-361 (2000)]. Una clase de proteínas "correguladoras" pueden interaccionar también con el receptor unido al ligando, y modular de forma adicional su actividad transcripcional [McKenna, et al., Endocrine Reviews 20: 321-344 (1999)]. También se ha demostrado que los receptores de estrógenos pueden suprimir la transcripción mediada por NF\kappaB, tanto de forma dependiente del ligando como independiente del mismo [Quaedackers, et al., Endocrinology 142: 1156-1166 (2001), Bhat, et al., Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 67: 233-240 (1998), Pelzer, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 286: 1153-7 (2001)].

Los receptores de estrógenos también se pueden activar por fosforilación. Esta fosforilación está mediada por factores de crecimiento tales como EGF, y provoca cambios en la transcripción de genes en ausencia de ligando [Moggs y Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001)].

Un mecanismo, peor caracterizado, mediante el cual los estrógenos pueden afectar a las células es a través de un denominado receptor de membrana. La existencia de dicho receptor es controvertida, pero se ha documentado claramente que los estrógenos pueden provocar respuestas no genómicas muy rápidas en las células. La entidad molecular responsable de la transducción de estos efectos no ha sido aislada definitivamente, pero hay pruebas que indican que, por lo menos, está relacionada con las formas nucleares de los receptores de estrógenos [Levin, Journal of Applied Physiology 91: 1860-1867 (2001), Levin, Trends in Endocrinology & Metabolism 10: 374-377 (1999)].

Hasta el momento se han descubierto dos receptores de estrógenos. El primer receptor de estrógenos se clonó hace aproximadamente 15 años, y se conoce ahora como ER\alpha [Green, et al., Nature 320: 134-9 (1986)]. La segunda forma del receptor de estrógenos se ha descubierto en fecha relativamente reciente, y se denomina ER\beta [Kuiper, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 5925-5930 (1996)]. Los primeros estudios sobre ER\beta se centraron en definir su afinidad por diversos ligandos, y, de hecho, se observaron algunas diferencias con ER\alpha. La distribución tisular de ER\beta ha sido bien cartografiada en los roedores, y no coincide con la de ER\alpha. Tejidos tales como el útero de ratón y rata expresan predominantemente ER\alpha, mientras que el pulmón de ratón y rata expresan predominantemente ER\beta [Couse, et al., Endocrinology 138: 4613-4621 (1997), Kuiper, et al., Endocrinology 138: 863-870 (1997)]. Incluso dentro del mismo órgano, la distribución de ER\alpha y ER\beta puede estar separada en compartimentos. Por ejemplo, en el ovario de ratón, el ER\beta se expresa a altos niveles en las células granulosas, mientras que el ER\alpha se limita a las células tecales y del estroma [Sar y Welsch, Endocrinology 140: 963-971 (1999), Fitzpatrick, et al., Endocrinology 140: 2581-2591 (1999)]. Sin embargo, hay ejemplos en los que los receptores aparecen coexpresados, y hay pruebas procedentes de estudios in vitro que indican que ER\alpha y ER\beta pueden formar heterodímeros [Cowley, et al., Journal of Biological Chemistry 272: 19858-19862 (1997)].

El estrógeno endógeno más potente es el 17\beta-estradiol. Se ha descrito un gran número de compuestos que simulan o bloquean la actividad del 17\beta-estradiol. Los compuestos que ejercen aproximadamente los mismos efectos biológicos que el 17\beta-estradiol se denominan "agonistas del receptor de estrógenos". Los que, cuando se administran junto con 17\beta-estradiol, bloquean sus efectos se denominan "antagonistas del receptor de estrógenos". En realidad, existe un espectro continuo entre la actividad agonista del receptor de estrógenos y la actividad antagonista del receptor de estrógenos, y, de hecho, algunos compuestos se comportan como agonistas del receptor de estrógenos en algunos tejidos y como antagonistas del receptor de estrógenos en otros. Estos compuestos con actividad mixta se denominan moduladores selectivos del receptor de estrógenos (MSRE), y son agentes con utilidad terapéutica (por ejemplo: EVISTA) [McDonnell, Journal of the Society for Gynecologic Investigation 7: S10-S15 (2000), Goldstein, et al., Human Reproduction Update 6: 212-224 (2000)]. La razón precisa por la que el mismo compuesto puede tener efectos específicos de células no ha sido determinada, pero se han propuesto diferencias en la conformación del receptor y/o en el medio de las proteínas correguladoras.

Se sabe desde hace tiempo que los receptores de estrógenos adoptan diferentes conformaciones cuando se unen a ligandos. Sin embargo, sólo recientemente se han puesto de manifiesto las consecuencias y sutilezas de estos cambios. Las estructuras tridimensionales de ER\alpha y ER\beta han sido resueltas mediante cocristalización con varios ligandos, y demuestran claramente la reubicación de la hélice 12 en presencia de un antagonista del receptor de estrógenos, que supone un impedimento estérico para las secuencias de la proteína necesarias para la interacción entre el receptor y la proteína correguladora [Pike, et al., Embo 18: 4608-4618 (1999), Shiau, et al., Cell 95: 927-937 (1998)]. Además, se ha utilizado la técnica de presentación de fagos para identificar péptidos que interaccionan con los receptores de estrógenos en presencia de diferentes ligandos [Paige, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 3999-4004 (1999)]. Por ejemplo, se identificó un péptido capaz de distinguir entre el ER\alpha unido a los agonistas puros del receptor de estrógenos 17\beta-estradiol y dietilestilbestrol. Se comprobó que un péptido diferente era capaz de distinguir entre el clomifeno unido a ER\alpha y a ER\beta. Estos datos indican que cada ligando coloca potencialmente el receptor en una conformación única e impredecible, y que dichas conformaciones poseen probablemente diferentes actividades biológicas.

Minutolo et al, en Bioorganic & Medicinal Chemistry, 11 (2003) 1247-1257, tratan sobre un ligando de estrógeno que posee una estructura de 3,4-difenilsalicilaldoxima única, e investigan los efectos de la introducción de grupos hidroxi y metoxi en la estructura.

Como se ha mencionado anteriormente, los estrógenos afectan a múltiples procesos biológicos. Además, en los casos en los que se han descrito diferencias entre sexos (por ejemplo, frecuencias de enfermedades, respuestas a la exposición, etc.), es posible que la explicación resida en diferencias en los niveles de estrógenos entre varones y hembras.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula:

1

en la que

\quad: R^{1} y R^{2} son cada uno, independientemente, H, halógeno, CN, fenilo opcionalmente sustituido, o alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido;

\quad: R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} son, cada uno independientemente, H, OH, halógeno, CN, fenilo opcionalmente sustituido, alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido o alcoxi C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido;

\quad: cada R^{8} es H; y

\quad: R^{9} es alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un profármaco del mismo. En otro aspecto, la invención se refiere a un compuesto de la fórmula:

2

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un compuesto de la fórmula:

3

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más de los compuestos de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En aún otros aspectos, la invención se refiere al uso de compuestos de la invención para la preparación de un medicamento en el tratamiento o prevención de enfermedades tales como enfermedad inflamatorias del intestino.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevos derivados de la oxima del 4'-hidroxi-bifenil-carbaldehído. Estos compuestos, los cuales preferentemente actúan como agentes estrogénicos, son útiles para la preparación de un medicamento para el tratamiento y prevención de enfermedades tales como enfermedades inflamatorias del intestino (que incluyen enfermedad de Crohn y colitis). En un aspecto, la invención se refiere a compuestos de la fórmula:

4

en la que

\quad: R^{1} y R^{2} son, cada uno independientemente, H, halógeno, CN, fenilo opcionalmente sustituido, o alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido;

\quad: R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} son, cada uno independientemente, H, OH, halógeno, CN, fenilo opcionalmente sustituido, o alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido, o alcoxi C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido;

\quad: cada R^{8} es H; y

\quad: R^{9} es alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Compuestos según la invención pueden ser:

5

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En algunos aspectos, R^{3}, R^{5} y R^{6} son, cada uno independientemente, H, Cl, F, metilo o metoxi, y R^{2} es H, Cl, F o metilo. En otro aspecto, la invención se refiere a compuestos de la fórmula:

6

En algunos aspectos, R^{3}, R^{5} y R^{6} son, cada uno independientemente, H, Cl, F, metilo o metoxi, y R^{2} es H, Cl, F o metilo.

Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden formar a partir de ácidos orgánicos e inorgánicos, por ejemplo, acético, propiónico, láctico, cítrico, tartárico, succínico, fumárico, maleico, malónico, mandélico, málico, ftálico, clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, metanosulfónico, naftalenosulfónico, bencenosulfónico, toluenosulfónico, canfosulfónico, y ácidos conocidos similarmente aceptables, cuando un compuesto de la presente invención contiene un resto básico. Las sales también se pueden formar a partir de bases orgánicas e inorgánicas, tales como sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio, litio o potasio), sales de metales alcalino-térreos, sales de amonio, sales de alquilamonio que contienen 1-6 átomos de carbono o sales de dialquilamonio que contienen 1-6 átomos de carbono en cada grupo alquilo, y sales de trialquilamonio que contienen 1-6 átomos de carbono en cada grupo alquilo, cuando un compuesto de la presente invención contiene un resto ácido.

El término "alquilo", tal como se utiliza en la presente memoria, bien sea por separado o como parte de otro grupo, se refiere a una cadena de hidrocarburo alifático, sustituida o no sustituida, e incluye, sin limitarse a las mismas, cadenas lineales o ramificadas que contienen de 1 a 12 átomos de carbono, preferentemente 1 a 6 átomos de carbono, a no ser que se especifique explícitamente otra cosa. Por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, i-butilo y t-butilo están comprendidos por el término "alquilo". En la definición de "alquilo" están específicamente incluidas las cadenas de hidrocarburos alifáticos que están opcionalmente sustituidas.

El número de carbonos, tal como se utiliza en la presente memoria en las definiciones, se refiere a los carbonos de la cadena principal y a los carbonos de las ramificaciones, pero no incluye los átomos de carbono de los sustituyentes, tales como los sustituyentes alcoxi y similares.

El término "alquenilo", tal como se utiliza en la presente memoria, bien sea por separado o como parte de otro grupo, se refiere a una cadena de hidrocarburo alifático, sustituida o no sustituida, e incluye, sin limitarse a las mismas, cadenas lineales o ramificadas que tienen 2 a 8 átomos de carbono, y que contienen por lo menos un enlace doble. Preferentemente, el resto alquenilo tiene 1 ó 2 enlaces dobles. Dichos restos alquenilo pueden existir en las conformaciones E o Z, y los compuestos de la presente invención incluyen ambas conformaciones. En la definición de "alquenilo" se incluyen específicamente las cadenas de hidrocarburos alifáticos que están opcionalmente sustituidas. Los heteroátomos, tales como O, S o N-R_{1}, unidos a un alquenilo, no deben estar enlazados a un átomo de carbono unido a un doble enlace.

El término "fenilo", tal como se utiliza en la presente memoria, bien sea por separado o como parte de otro grupo, se refiere a un grupo fenilo sustituido o no sustituido.

Un alquilo, alquenilo y fenilo opcionalmente sustituido puede estar sustituido con uno o más sustituyentes. Los sustituyentes opcionales adecuados se pueden seleccionar independientemente de nitro, ciano, -N(R_{11})(R_{12}), halo, hidroxi, carboxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, alquilalcoxi, alcoxicarbonilo, alcoxialcoxi, perfluoroalquilo, perfluoroalcoxi, arilalquilo, alquilarilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, alquiltio, -S(O)_{2}-N(R_{11})(R_{12}), -C(=O)-N(R_{11})(R_{12}), (R_{11})(R_{12})N-alquilo, (R_{11})(R_{12})N-alcoxialquilo, (R_{11})(R_{12})N-alquilariloxialquilo, -S(O)_{s}-arilo (en el que s = 0-2) o -S(O)_{s}-heteroarilo (en el que s = 0-2). En ciertas formas de realización de la invención, los sustituyentes preferidos de alquilo, alquenilo, alquinilo y cicloalquilo incluyen nitro, ciano, -N(R_{11})(R_{12}), halo, hidroxilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, alcoxialquilo, y alcoxicarbonilo. En ciertas formas de realización de la invención, los sustituyentes preferidos de arilo y heteroarilo incluyen -N(R_{11})(R_{12}), alquilo, halo, perfluoroalquilo, perfluoroalcoxi, arilalquilo y alquilarilo.

Cuando los restos alquilo o alquenilo están sustituidos, por ejemplo, típicamente pueden estar mono-, di-, tri- o persustituidos. Los ejemplos para un sustituyente halógeno incluyen 1-bromovinilo, 1-fluorovinilo, 1,2-difluorovinilo, 2,2-difluorovinilo, 1,2,2-trifluorovinilo, 1,2-dibromoetano, 1,2-difluoroetano, 1-fluoro-2-bromoetano, CF_{2}CF_{3}, CF_{2}CF_{2}CR_{3} y similares.

El término halógeno incluye bromo, cloro, flúor y yodo.

El término "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que tiene 1 a 6 átomos de carbono; en algunas formas de realización, se prefieren 1 a 3 átomos de carbono.

El término "alcoxi inferior", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere al grupo R-O-, en el que R es un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; en algunas realizaciones, se prefieren 1 a 3 átomos de carbono.

Tal y como se utiliza en la presente invención, el término "proporcionar", cuando se refiere a proporcionar un compuesto o sustancia cubiertos por la presente invención, significa la administración directa de dicho compuesto o sustancia, o la administración de un profármaco, derivado o análogo que formará la cantidad equivalente del compuesto o sustancia en el interior del organismo.

Los compuestos de la presente invención se pueden usar como moduladores del receptor de estrógenos, útiles en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la inhibición de afecciones, trastornos o enfermedades mediadas, al menos en parte, por una insuficiencia o un exceso de estrógenos, o que se pueden tratar o inhibir utilizando un agente estrogénico. Los compuestos de la presente invención son particularmente útiles para el tratamiento de una paciente cercana a la menopausia, menopáusica o posmenopáusica, en la que los niveles de estrógenos endógenos producidos están considerablemente disminuidos. La menopausia se define generalmente como el último período menstrual natural, y se caracteriza por el cese de la función ovárica, que da lugar a una disminución sustancial de los niveles de estrógenos circulantes en el torrente sanguíneo. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la menopausia incluye asimismo trastornos que cursan con disminución de la producción de estrógenos, que pueden ser de origen quirúrgico, químico, o estar causados por un trastorno patológico que da lugar a la disminución prematura o al cese de la función ovárica.

Por consiguiente, los compuestos de la presente invención son útiles en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la inhibición de la osteoporosis, y para la inhibición de la desmineralización ósea, que pueden provenir de un desequilibro en la formación de nuevos tejidos óseos de un individuo y la reabsorción de tejidos viejos, dando lugar a una pérdida neta de la masa ósea. Tal agotamiento del tejido óseo tiene lugar en diversos individuos, especialmente en mujeres posmenopáusicas, mujeres sometidas a ovariectomía bilateral, personas que reciben o han recibido tratamientos prolongados con corticosteroides, personas con disgenesia gonadal y personas que sufren el síndrome de Cushing. Los compuestos de la presente memoria también pueden ser útiles en casos con necesidades especiales de sustitución ósea, incluidos dientes y huesos de la boca, en individuos con fracturas óseas, estructuras óseas defectuosas y personas sometidas a cirugía ósea y/o implante de prótesis. Además de los problemas descritos anteriormente, los compuestos de la presente memoria se pueden utilizar para el tratamiento o la inhibición de la osteoartritis, hipocalcemia, hipercalcemia, enfermedad de Paget, osteomalacia, osteohalistéresis, mieloma múltiple y otras formas de cáncer que tienen efectos perjudiciales en los tejidos óseos.

Los compuestos de la presente invención son asimismo útiles en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la inhibición del crecimiento anómalo, benigno o maligno, de tejidos, incluidos hipertrofia prostática, leiomiomas uterinos, cáncer de mama, endometriosis, cáncer de endometrio, poliquistosis ovárica, pólipos del endometrio, enfermedad benigna de la mama, adenomiosis, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de próstata, cánceres del colon, cánceres del SNC, tales como glioma o astroblastoma.

Los compuestos de la presente invención son cardioprotectores, y son útiles para la preparación de un medicamento para reducir los niveles de colesterol, triglicéridos, Lp(a) y LDL; para inhibir o tratar la hipercolesterolemia, hiperlipidemia, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, insuficiencia venosa periférica, restenosis y vasoespasmo, y para inhibir las lesiones en las paredes vasculares derivadas de acontecimientos celulares que dan lugar a lesiones vasculares de origen inmunitario. Estas propiedades de protección cardiovascular son muy importantes a la hora de tratar pacientes posmenopáusicas con estrógenos para inhibir la osteoporosis, y, en el varón, cuando esté indicado el tratamiento con estrógenos.

Los compuestos de la presente invención son también antioxidantes, y por tanto son útiles para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la inhibición de trastornos patológicos provocados por radicales libres. Situaciones específicas en las que está indicada la terapia con antioxidantes son cánceres, trastornos del sistema nervioso central, enfermedad de Alzheimer, osteopatía, envejecimiento, trastornos inflamatorios, insuficiencia venosa periférica, artritis reumatoide, enfermedades autoinmunitarias, insuficiencia respiratoria, enfisema, prevención de lesión por reperfusión, hepatitis vírica, hepatitis crónica activa, tuberculosis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, síndrome disneico del adulto, traumatismo del sistema nervioso central e ictus.

Los compuestos de la presente invención también son útiles para la preparación de un medicamento para mejorar la capacidad cognitiva, y para el tratamiento o la inhibición de demencias seniles, enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo, trastornos neurodegenerativos, y proporcionan neuroprotección o mejora de la capacidad cognitiva.

Los compuestos de la presente invención también son útiles en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la inhibición de la enfermedad inflamatoria intestinal, proctitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, y colitis; trastornos relacionados con la menopausia, tales como síntomas vasomotores, incluidos sofocos, atrofia vaginal o vulvar, vaginitis atrófica, sequedad vaginal, prurito, dispareunia, disuria, aumento en la frecuencia de micción, incontinencia urinaria, infecciones de las vías urinarias, síntomas vasomotores, incluidos sofocos, mialgia, artralgia, insomnio, irritabilidad, y similares; alopecia androgénica, atrofia cutánea, acné, diabetes de tipo II, metrorragia funcional, y esterilidad.

Los compuestos de la presente invención son útiles en enfermedades en las que es ventajosa la amenorrea, tales como leucemia, ablaciones del endometrio, enfermedad crónica renal o hepática, o enfermedades o trastornos de la coagulación.

Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar como agentes anticonceptivos, particularmente cuando se combinan con un progestágeno.

Cuando se administran para el tratamiento o la inhibición de un trastorno o enfermedad particular, deberá entenderse que la dosis eficaz puede variar en función del compuesto particular utilizado, la forma de administración, el trastorno en cuestión y su gravedad, o el trastorno tratado, así como de los diversos factores físicos relacionados con el individuo tratado. La administración eficaz de los compuestos de la presente invención se puede realizar con una dosis por vía oral de 0,1 mg/día hasta 1.000 mg/día. Preferentemente, la administración será de 10 mg/día hasta 600 mg/día, más preferentemente de 50 mg/día hasta 600 mg/día, en una dosis única o en dos o más dosis divididas. Se espera que las dosis diarias previstas varíen con la vía de administración.

Dichas dosis se pueden administrar de cualquier forma que sirva para suministrar los compuestos activos de la presente memoria al torrente sanguíneo del paciente, incluidas la vía oral, por medio de implantes, parenteral (incluidas las inyecciones intravenosas, intraperitoneales y subcutáneas), rectal, intranasalmente, vaginal y transdérmica.

Las formulaciones orales que contienen los compuestos activos de la presente invención pueden comprender cualquiera de las formas orales utilizadas habitualmente, incluidos comprimidos, cápsulas, formas para administración bucofaríngea, trociscos, pastillas para chupar y líquidos por vía oral, suspensiones o disoluciones. Las cápsulas pueden contener mezclas del compuesto o compuestos activos con cargas y/o diluyentes inertes tales como almidones farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, almidón de maíz, de patata o de tapioca), azúcares, edulcorantes artificiales, celulosas en polvo, tales como celulosas cristalinas y microcristalinas, harinas, gelatinas, gomas, etc. Pueden prepararse formulaciones útiles para comprimidos por métodos convencionales de compresión, de granulación por vía húmeda y de granulación por vía seca, utilizando diluyentes, aglutinantes, lubricantes, disgregantes, agentes modificadores de la actividad superficial (incluidos tensioactivos), dispersantes o estabilizantes, farmacéuticamente aceptables, que incluyen, sin limitarse a los mismos, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, laurilsulfato de sodio, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa de calcio, polivinilpirrolidona, gelatina, ácido algínico, goma arábiga, goma xantana, citrato de sodio, silicatos complejos, carbonato de calcio, glicina, dextrina, sacarosa, sorbitol, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, lactosa, caolín, manitol, cloruro de sodio, talco, almidones secos y azúcar en polvo. Los agentes preferidos modificadores de la actividad superficial incluyen agentes modificadores de la actividad superficial no iónicos y aniónicos. Ejemplos representativos de agentes modificadores de la actividad superficial incluyen, sin limitarse a los mismos, poloxámero 188, cloruro de benzalconio, estearato de calcio, alcohol cetoestearílico, cera emulsionante de cetomacrogol, ésteres de sorbitán, dióxido de silicio coloidal, fosfatos, dodecilsulfato de sodio, silicato de magnesio y aluminio, y trietanolamina. Las formulaciones orales descritas en la presente memoria pueden utilizar formulaciones estándar de retardo o de liberación controlada para alterar la absorción del compuesto o compuestos activos. La formulación oral también puede consistir en la administración del principio activo en agua o en zumo de frutas, que contiene solubilizantes o emulsionantes apropiados, según convenga.

En algunos casos puede ser deseable administrar los compuestos directamente en las vías respiratorias en forma de aerosol.

Los compuestos de la presente invención también se pueden administrar por vía parenteral o intraperitoneal. Las disoluciones o suspensiones de estos compuestos activos en forma de base libre o de sal farmacológicamente aceptable se pueden preparar en agua mezclada de forma adecuada con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y utilización, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir la proliferación de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para su uso en inyecciones incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles, y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser líquida, para que pueda administrarse fácilmente con jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe protegerse de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El excipiente puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales.

Para los efectos de la presente descripción, se entiende que las administraciones transdérmicas incluyen todas las administraciones a través de la superficie corporal y los revestimientos interiores de los conductos corporales, incluidos los tejidos epiteliales y las mucosas. Dichas administraciones se pueden llevar a cabo utilizando los compuestos de la presente memoria, o sales de los mismos farmacéuticamente aceptables, en lociones, cremas, espumas, parches, suspensiones, disoluciones y supositorios (por vía rectal y vaginal).

La administración por vía transdérmica se puede realizar por medio del uso de un parche transdérmico que contiene el compuesto activo y un excipiente que es inerte para el compuesto activo, no es tóxico para la piel y permite el suministro del agente por absorción sistémica en el torrente sanguíneo a través de la piel. El excipiente puede adoptar diversas formas tales como cremas y ungüentos, pastas, geles y dispositivos oclusivos. Las cremas y ungüentos pueden ser emulsiones líquidas viscosas o semisólidas del tipo aceite en agua o agua en aceite. También pueden ser adecuadas las pastas que comprenden polvos absorbentes dispersos en petróleo o petróleo hidrófilo, que contienen el principio activo. Se pueden usar diversos dispositivos oclusivos para liberar el principio activo en el torrente sanguíneo, tales como una membrana semipermeable que cubre un depósito que contiene el principio activo, con o sin excipiente, o una matriz que contiene el principio activo. Otros dispositivos oclusivos se conocen en la bibliografía.

Las formulaciones en forma de supositorios se pueden preparar con materiales tradicionales, entre ellos manteca de cacao, con o sin adición de ceras para alterar el punto de fusión del supositorio, y glicerina. También se pueden utilizar bases hidrosolubles para supositorios, tales como polietilenglicoles de diversos pesos moleculares.

Los reactivos utilizados en la preparación de los compuestos de la presente invención están disponibles en el mercado, o se pueden preparar mediante procedimientos estándar descritos en la bibliografía.

La preparación de varios ejemplos representativos de la presente invención se describe a continuación en los Esquemas 1 a 11.

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Esquema 1

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7

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Esquema 2

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8

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Esquema 3

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100

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Esquema 4

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9

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Esquema 5

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101

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Esquema 6

10

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Esquema 7

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Esquema 8

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Esquema 9

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Esquema 10

104

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Esquema 11

12

Ejemplo 1 Ácido 4-terc-butil-dimetilsilioxifenilborónico

Método A. A una disolución de (4-bromofenoxi)-terc-butil-dimetilsilano (20 ml, 23,48 g, 0,082 moles) en tetrahidrofurano (200 ml) a -78ºC se añadió lentamente n-butil-litio (39,2 ml de una disolución 2,5 M en hexano, 0,098 moles) en N_{2}, con agitación durante algunos minutos. La disolución se agitó durante 1 hora, y se añadió borato de triisopropilo (66,2 ml, 54,0 g, 0,29 moles) mediante una jeringa, a -78ºC. La disolución se agitó durante 1 h a -78ºC, y después se dejó calentar hasta temperatura ambiente toda la noche. La reacción se enfrió hasta 0ºC, y se añadieron a la mezcla de reacción agua (20 ml) y HCl 2N (20 ml). Después, la totalidad de la mezcla se agitó con HCl 2N (360 ml) durante 10 minutos. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 250 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron hasta un volumen de aproximadamente 50 ml. La cristalización se indujo con hexano frío, y el producto sólido se recolectó por filtración y se secó a vacío para proporcionar 14,5 g (70%) del compuesto del título como un sólido blanco: RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 0,19 (6H, s), 0,94 (9H, s), 6,80 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,36 Hz), 7,87 (2H, s).

Ejemplo 2 4'-Hidroxi-3-metil[1,1'-bifenil]-4-carbonitrilo

Método B. Se calentó a reflujo toda la noche una mezcla de 4-bromo-2-metilbenzonitrilo (1,8 g, 9,18 mmoles), ácido 4-terc-butil-dimetilsiloxifenilborónico (3,0 g, 11,9 mmoles), carbonato de sodio (13,8 ml de una disolución acuosa 2 M, 27,5 mmoles), tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0,53 g, 0,46 mmoles), y etilenglicoldimetiléter (70 ml). La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y se vertió en agua, después se extrajo con acetato de etilo (3x), se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, y el disolvente se evaporó. La purificación mediante cromatografía en sílice (15% - 25% de acetato de etilo-hexano) proporcionó 1,81 g (94%) del compuesto del título como un sólido amarillento: p.f. 177-178ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 2,52 (3H, s), 6,88 (2H, d, J = 8,50 Hz), 7,60 (3H, d, J = 8,49 Hz), 7,71 (1H, s), 7,77 (2H, d, J = 8,12 Hz), 9,79 (1H, s); IR 2220 cm^{-1}; MS (ESI) m/z 208 (M-H)^{-}.

Anal. para C_{14}H_{11}NO:

	Calculado:	C: 80,36,	H: 5,30,	N: 6,69
	Encontrado:	C: 79,91,	H: 5,27,	N: 6,57.

Ejemplo 3 4'-Hidroxi-3-metil[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído

Se enfrió una disolución de 4'-hidroxi-3-metil[1,1-bifenil]-4-carbonitrilo (500 mg, 2,39 mmoles) en tolueno seco hasta -78ºC, y se añadió, de una sola vez, hidruro de diisobutilaluminio (4,0 ml de una disolución 1,5 M en tolueno, 5,98 mmoles). Se dejó que la mezcla de reacción se calentase hasta temperatura ambiente durante un período de 3,5 h. Se agregó metanol (1,2 ml), seguido de agua (1,2 ml) a 0ºC, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 min. Se añadió con agitación una disolución de HCl 1N hasta pH < 7. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (3x), se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, y se evaporó el disolvente. La purificación mediante cromatografía en sílice (15% - 25% de acetato de etilo-hexano) proporcionó 459 mg (91%) del compuesto del título como un sólido blanco: p.f. 161-162ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 2,67 (3H, s), 6,88 (2H, d, J = 8,41 Hz), 7,59-7,65 (4H, m), 7,85 (1H, d, J = 8,03 Hz), 9,78 (1H, s), 10,22 (1H, s); IR 1680 cm^{-1}; MS (ESI) m/z 211 (M-H)^{-}.

Anal. para C_{14}H_{12}O_{2}:

	Calculado:	C: 79,23,	H: 5,70
	Encontrado:	C: 78,79,	H: 5,90.

Ejemplo 4 4'-{[terc-Butil(dimetil)silil]oxi}-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 4-bromobenzaldehído (730 mg, 3,97 mmoles) con ácido 4-terc-butil-dimetilsilioxifenilborónico (1,3 g, 5,16 mmoles) según el método B, para proporcionar 600 mg (48%) de cristal blanco: RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 0,24 (6H, s), 1,01 (9H, s), 6,94 (2H, d, J = 8,54 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,56 Hz), 7,72, (2H, d, J = 8,19 Hz), 7,93 (2H, d, 8,20 Hz), 10,04 (1H, s).

Ejemplo 5 4'-Hidroxi[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído

Se agitó una mezcla de 4'-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (320 mg, 1,03 mmoles), KF anhidro (120 mg, 2,06 mmoles) y HBr acuoso al 48% (35 \mul, 0,31 mmoles) en 6 ml de DMF seca, a temperatura ambiente en N_{2} durante 1 h. La TLC indicó que existe material inicial presente, y por lo tanto se añadió más HBr acuoso al 48% (35 \mul, 0,31 mmoles) a la reacción, y la mezcla se continuó agitando durante 1,5 h. La mezcla después se vertió, con enfriamiento, en HCl acuoso 1 N (30 ml). La mezcla acuosa se extrajo con EtOAc (3x). Los extractos combinados se lavaron con una disolución saturada de NaCl, y se secaron sobre Na_{2}SO_{4}. El disolvente se evaporó a presión reducida, y el producto (100%) se utilizó directamente en la siguiente etapa. RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,89 (2H, d, J =
8,43 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,46 Hz), 7,83 (2H, d, J = 8,16 Hz), 7,94 (2H, d, J = 8,02 Hz), 9,79 (1H, s), 10,01 (1H, s).

Ejemplo 6 Éster 3-cloro-4-formil-fenílico del ácido trifluoro-metanosulfónico

Método D. A una disolución de 2-cloro-4-hidroxibenzaldehído (1,31 g, 8,4 mmoles) y piridina (1,1 ml, 13,4 mmoles) en 80 ml de diclorometano a 0ºC se añadió anhídrido trifluorometanosulfónico (1,84 ml, 3,08 g, 10,9 mmoles). Se dejó que la disolución se calentase lentamente hasta la temperatura ambiente, y se agitó durante 2,5 h. La disolución se enfrió hasta 0ºC, y se agitó en agua con hielo para descomponer cualquier exceso de anhídrido. La mezcla se volvió ligeramente básica mediante adición de una disolución saturada de bicarbonato de sodio. Las capas resultantes se separaron, y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron, y el disolvente se eliminó a vacío para proporcionar un aceite naranja, el cual se purificó mediante cromatografía en sílice (5% de acetato de etilo-hexanos) para proporcionar 1,83 g (76%) del compuesto del título como un aceite incoloro y transparente: RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 7,73 (1H, dd,
J = 2,35 Hz, J = 8,64 Hz), 8,04-8,07 (2H, m), 10,30 (1H, s).

Ejemplo 7 Éster 2-fluoro-4-formil-fenílico del ácido trifluoro-metanosulfónico

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 3-fluoro-4-hidroxibenzaldehído (1,2 g, 8,56 mmoles) con anhídrido trifluorometanosulfónico (1,87 ml, 3,14 g, 11,1 mmoles) según el método D, para proporcionar un aceite amarillo, el cual se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación: RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta 7,53-7,58 (1H, m), 7,77-7,85 (2H, m), 10,01 (1H, d, J = 1,45 Hz).

Ejemplo 8 4'-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-3-cloro-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar éster 3-cloro-4-formilfenílico de ácido trifluorometanosulfónico (1,78 g, 6,18 mmoles) con ácido 4-terc-butil-dimetilsilioxifenilborónico (2,03 g, 8,03 mmoles) según el método B, para proporcionar 0,92 g (43%) de un sólido blanco: p.f. 38-39ºC; RMN ^{1}H (DMDO-d_{6}): \delta 0,23 (6H, s), 0,97 (9H, s), 6,98 (2H, d, J = 8,79 Hz), 7,74 (2H, d, J = 8,79 Hz), 7,81 (1H, d, J = 7,81 Hz), 7,89 (1H, d, J = 1,95 Hz), 7,91 (1H, d, J = 7,81 Hz), 10,34 (1H, s); MS (ESI) m/z 231/233 (M-H)^{-} (ion del producto desprotegido).

Anal. para C_{19}H_{23}CiO_{2}Si:

	Calculado:	C: 65,78,	H: 6,68
	Encontrado:	C: 65,59,	H: 6,60.

Ejemplos 9 y 10

Se hace reaccionar el éster 2-fluoro-4-formilfenílico del ácido trifluorometanosulfónico (2,1 g, 7,72 mmoles) con ácido 4-terc-butil-dimetilsilioxifenilborónico (2,14 g, 8,49 mmoles) según el método B, para producir los dos compuestos siguientes:

4'-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-2-fluoro-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

1,62 g (63%) de un sólido amarillento ceroso: RMN ^{1}H (Acetona-d_{6}): \delta 0,28 (6H, s), 1,02 (9H, s), 7,02-7,06 (2H, m), 7,57-7,60 (2H, m), 7,71-7,78 (2H, m), 7,85 (1H, dd, J = 7,91 Hz, J = 1,51 Hz), 10,07 (1H, d, J = 1,73 Hz); RMN ^{13}C (Acetona-d_{6}): \delta -4,29, 18,80, 26,00, 116,82 (d, J = 23,90 Hz), 121,15, 126,69 (d, J = 3,25 Hz), 128,42 (d, 1,21 Hz), 131,30 (d, J = 3,48 Hz), 132,20 (d, J = 3,44 Hz), 135,27 (d, J = 13,61), 138,09 (d, J = 6,64 Hz), 157,23, 160,68 (d, J = 248,56 Hz), 191,51; IR 1692 cm^{-1}; MS (ESI) m/z 331 (M+H)^{+}, 372 (M+H+ACN)^{+}.

Anal. para C_{19}H_{23}FO_{2}Si:

	Calculado:	C: 69,06	H: 7,02
	Encontrado:	C: 69,71	H: 7,34.

2-Fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

0,32 g (19%) como un sólido amarillento: p.f. 149-150ºC; RMN ^{1}H (Acetona-d_{6}): \delta 7,08-7,13 (2H, m), 7,62-7,67 (2H, m), 7,80-7,91 (2H, m), 7,94 (1H, dd, J = 7,92 Hz, J = 1,58 Hz), 8,93 (1H, s), 10,16 (1H, d, J = 1,73 Hz); IR 1669 cm^{-1}; MS (ESI) m/z 215 (M-H)^{-1}.

Anal. para C_{13}H_{9}FO_{2}:

	Calculado:	C: 72,22,	H: 4,20
	Encontrado:	C: 71,38,	H: 4,12.

Ejemplo 11 Oxima del 4'-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-3-cloro[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 4'-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-3-cloro-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (405 mg, 1,17 mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (154 mg, 2,22 mmoles) según el método C, para proporcionar un aceite amarillento, el cual se usó en la siguiente etapa sin purificación: MS (ESI) m/z 362/364 (M+H)^{+}.

Ejemplo 12 Oxima del 4'-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-2-fluoro-[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 4'-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-2-fluoro-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (450 mg, 1,36 mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (190 mg, 2,73 mmoles) según el método C, para proporcionar un sólido blanco, el cual se usó en la siguiente etapa sin purificación: MS (ESI) m/z 344 (M-H)^{-}, 346 (M+H)^{+}.

Ejemplo 13 3-Fluoro-4'-metoxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 4-bromo-2-fluorobenzaldehído (3 g, 14,8 mmoles) con ácido 4-metoxifenilborónico (2,70 g, 17,8 mmoles) según el método B, para proporcionar 3,2 g (94%) de un sólido blanco: p.f. 85-86ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 3,83 (3H, s), 7,06-7,09 (2H, m), 7,70-7,75 (2H, m), 7,79-7,82 (2H, m), 7,88 (1H, t, J = 7,96 Hz), 10,22 (1H, s); IR 1681 cm^{-1}; MS (ESI) m/z 231 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{14}H_{11}FO_{2}:

	Calculado:	C: 73,03,	H: 4,82
	Encontrado:	C: 72,99,	H: 4,73.

Ejemplo 14 3-Fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

Método F. A una mezcla de 3-fluoro-4'-metoxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (0,986 g, 4,29 mmoles) en cloruro de metileno (35 ml) a 0ºC se añadió lentamente tribromuro de boro (10,7 ml de una disolución 1 N en cloruro de metileno, 10,7 mmoles). Se dejó que la mezcla se calentase lentamente hasta la temperatura ambiente, y se agitó toda la noche. Se inyectó agua (4 ml) en la mezcla, con agitación, en un baño de agua con hielo. La mezcla resultante se vertió en agua y se extrajo con acetato de etilo (3x). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron, se evaporó el disolvente, y se purificó mediante cromatografía en columna de sílice (15%-30% de acetato de etilo-hexano) para proporcionar 150 mg (16%) del compuesto del título como un sólido blanco. Se proporcionó una muestra analítica mediante HPLC preparativa de fase inversa: p.f. 164-166ºC; RMN ^{1}H (Acetona-d_{6}); \delta 76,98-7,01 (2H, m), 7,56 (1H, dd, J = 12,49 Hz, J = 1,64 Hz), 7,63-7,66 (1H, m), 7,67-7,70 (2H, m), 7,89 (1H, t, J = 7,85 Hz), 8,88 (1H, bs), 10,31 (1H, s); MS (ESI) m/z 215 (M-H)^{-}.

Anal. para C_{13}H_{9}FO_{2}:

	Calculado:	C: 72,22,	H: 4,20
	Encontrado:	C: 71,83,	H: 4,04

Ejemplo 15 Éster 2-cloro-4-formil-fenílico del ácido trifluoro-metanosulfónico

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 3-cloro-4-hidroxibenzaldehído (5 g, 31,9 mmoles) con anhídrido trifluorometanosulfónico (7,0 ml, 11,7 g, 41,5 mmoles) según el método D, para proporcionar 9,15 g (100%) de un aceite amarillo, el cual se usó directamente en la siguiente etapa, sin purificación: RMN ^{1}H: \delta 7,92 (1H, d, J = 8,48 Hz), 8,07 (1H, dd, J = 8,51 Hz, J = 1,93 Hz), 8,30 (1H, d, J = 1,92 Hz), 10,04 (1H, s).

Ejemplo 16 2-cloro-4'-metoxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar el éster 2-cloro-4-formilfenílico del ácido trifluorometanosulfónico (5 g, 17,4 mmoles) con el ácido 4-metoxifenilborónico (3,44 g, 22,6 mmoles) según el método B, para proporcionar 3,83 g (89%) de un sólido blanco: p.f. 85-87ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): 83,82 (3H, s), 7,07 (2H, d, J = 8,83 Hz), 7,46 (2H, d, J = 8,45 Hz), 7,63 (1H, d, J = 7,87 Hz), 7,92 (1H, dd, J = 7,87 Hz, J = 1,56 Hz), 8,07 (1H, d, J = 1,49 Hz); RMN ^{13}C (DMSO-d_{6}): \delta 55,14, 113,72, 127,80, 129,72, 130,42, 130,82, 132,15, 132,21, 136,11, 144,90, 159,33, 191,73; IR 1692 cm^{-1}; MS (El) m/z 246/248 M^{+}.

Anal. para C_{14}H_{11}ClO_{2}:

	Calculado:	C: 68,16	H: 4,49
	Encontrado:	C: 67,76	H: 4,36

Ejemplo 17 2'-cloro-4'-(dibromometil)-1,1'-bifenil-4-ol

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 2-cloro-4'-metoxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (800 mg, 3,25 mmoles) con tribromuro de boro (8,1 ml de una disolución 1 N en cloruro de metileno, 8,13 mmoles) según el método F, para proporcionar 600 mg (50%) de un sólido amarillento: p.f. 107-108ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,86 (2H, d, J = 8,52 Hz), 7,29 (2H, d, J = 8,50 Hz), 7,43 (1H, s), 7,45 (1H, d, J = 8,12 Hz), 7,64 (1H, dd, J = 8,07 Hz, J = 1,83 Hz), 7,74 (1H, d, J = 1,79 Hz), 9,71 (1H, bs); RMN ^{13}C (DMSO-d_{6}): \delta 40,66, 114,94, 125,66, 127,34, 128,14, 130,39, 130,87, 131,80, 140,95, 142,14, 157,36; MS (ESI) m/z 373/375/3771379 (M-H)^{-}.

Anal. para C_{13}H_{9}Br_{2}ClO:

	Calculado:	C: 41,48,	H: 2,41
	Encontrado:	C: 41,64,	H: 2,14

Ejemplo 18 Éster 4-formil-3-metoxi-fenílico del ácido trifluoro-metanosulfónico

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 4-hidroxi-2-metoxibenzaldehído (3 g, 19,7 mmoles) con anhídrido trifluorometanosulfónico (4,3 ml, 7,2 g, 25,6 mmoles) según el método D, para proporcionar un jarabe pardo, el cual se usó en la siguiente etapa, sin purificación: RMN ^{1}H: \delta 3,97 (3H, s), 7,21 (1H, dd, J = 8,64 Hz, J = 2,17 Hz), 7,47 (1H, d, J = 2,24 Hz), 7,87 (1H, d, J = 8,64 Hz), 10,31 (1H, s).

Ejemplo 19 Éster 4-formil-2-metil-fenílico del ácido trifluoro-metanosulfónico

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 4-hidroxi-3-metilbenzaldehído (2,5 g, 18,4 mmoles) con anhídrido trifluorometanosulfónico (4,0 ml, 6,75 g, 23,9 mmoles) según el método D, para proporcionar un aceite pardo, el cual se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación.

Ejemplo 21 4'-Hidroxi-2-metil-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar el éster 4-formil-2-metilfenílico del ácido trifluorometanosulfónico (9,3 mmoles) con ácido 4-terc-butil-dimetilsilioxifenilborónico (2,35 g, 9,3 mmoles) según el método B, para proporcionar 1,12 mg (57%, a lo largo de dos etapas) de un sólido amarillento: p.f. 94-96ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 2,33 (3H, s), 6,86 (2H, d, J = 8,55 Hz), 7,22 (2H, d, J = 8,51 Hz), 7,39 (1H, d, J = 7,81 Hz), 7,61 (1H, d, J = 7,82 Hz), 7,81 (1H, s), 9,65 (1H, s), 10,00 (1H, s); IR 1670 cm^{-1}; MS (ESI) m/z 211 (M-H)^{-}, 213 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{14}H_{12}O_{2}:

	Calculado:	C: 79,23	H: 5,70
	Encontrado:	C: 77,49	H: 5,67

Ejemplo 22 Ácido 3-fluoro-4-metoxifenilborónico

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 4-bromo-2-fluoroanisol (10 g, 0,049 moles) con n-butil-litio (23,4 ml de una disolución 2,5 M en hexano, 0,059 moles) seguido de borato de triisopropilo (45,2 ml, 36,9 g, 0,196 moles) según el método A, para proporcionar 7,1 g (85,2%) de un sólido blanco: MS (ESI) m/z 169 (M-H)^{-}.

Ejemplo 23 3-cloro-3'-fluoro-4'-metoxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar éster 3-cloro-4-formilfenílico del ácido trifluorometanosulfónico (2,8 g, 9,62 mmoles) con ácido 3-fluoro-4-metoxifenilborónico (1,8 g, 10,6 mmoles) según el método B, para proporcionar 1,87 g (74%, durante dos etapas) de un sólido blanco: p.f. 116-118ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 3,91 (3H, s), 7,30 (1H, t, J = 8,79 Hz), 7,66-7,68 (1H, m), 7,79 (1H, dd, J = 12,91 Hz, J = 2,47 Hz), 7,85-7,87 (1H, m), 7,91 (1H, d, J = 8,24 Hz), 7,96 (1H, d, J = 1,65 Hz), 10,34 (1H, s); IR 1688 cm^{-1}; MS (ESI) m/z 265/267 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{14}H_{10}ClFO_{2}:

	Calculado:	C: 63,53,	H: 3,81
	Encontrado:	C: 63,29,	H: 3,63.

Ejemplo 24 3-cloro-3'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 3-cloro-3'-fluoro-4'-metoxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (990 mg, 3,75 mmoles) con tribromuro de boro (11,25 ml de una disolución 1 N en cloruro de metileno, 11,25 mmoles) según el método F, para proporcionar 940 mg (100%) de un sólido amarillento. El compuesto se usó en la siguiente etapa, sin purificación. La muestra analítica se obtiene mediante purificación por HPLC: p.f. 206-208ºC, RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): 8 7,06 (1H, t, J = 8,79 Hz), 7,51-7,53 (1H, m), 7,71 (1H, dd, J = 2,47 Hz, J = 12,63 Hz), 7,81-7,83 (1H, m), 7,89 (1H, d, J = 7,96 Hz), 7,91 (1H, d, J = 1,66 Hz), 10,329 (1H, s), 10,330 (1H, s); IR 1667 cm^{-1}; MS (ESI) m/z 249/251 (M-H)^{-}.

Anal. para C_{13}H_{8}ClFO_{2}:

	Calculado:	C: 62,29,	H: 3,22
	Encontrado:	C: 61,97,	H: 3,21.

Ejemplo 25 3-cloro-3',5'-difluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar el éster 3-cloro-4-formilfenílico del ácido trifluorometanosulfónico (1 g, 3,5 mmoles) con ácido 3,5-difluoro-4-terc-butil-dimetilsilioxiborónico (1,1 g, 3,8 mmoles) según el método B, para proporcionar 0,56 g (60%) de un sólido amarillo: p.f. 233-235ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 7,64 (2H, d, J = 7,85 Hz), 7,85-7,91 (2H, m), 7,98 (1H, s), 10,33 (1H, s), 10,70 (1H, bs); IR 1665 cm^{-1}; MS (ESI) m/z (267/269) (M-H)^{-}.

Anal. para C_{13}H_{7}ClF_{2}O_{2}:

	Calculado:	C: 58,12,	H: 2,63
	Encontrado:	C: 57,79,	H: 2,72.

Ejemplos 26 y 27

Se hace reaccionar el éster 3-cloro-4-formilfenílico del ácido trifluorometanosulfónico (3,78 g, 13,12 mmoles) con ácido 4-metoxi-2-metilfenilborónico (2,61 g, 15,7 mmoles) según el método B para producir dos compuestos:

3-cloro-4'-metoxi-2'-metil-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

2,18 g (64%) sólido blanco: p.f. 77-79ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 2,26 (3H, s), 3,79 (3H, s), 6,88 (1H, dd, J = 8,41 Hz, J = 2,66 Hz), 6,93 (1H, d, J = 2,50 Hz), 7,23 (1H, J = 8,40 Hz), 7,50 (1H, dd, J = 7,93 Hz, J = 1,32 Hz), 7,58 (1H, d, J = 1,53 Hz), 7,91 (1H, d, J = 7,57 Hz), 10,36 (1H, s); IR 1682 cm^{-1}; MS (ESI) m/z 261/263 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{15}H_{13}ClO_{2}:

	Calculado:	C: 69,10,	H: 5,03
	Encontrado:	C: 69,13,	H: 4,73.

4,4''-Dimetoxi-2,2''-dimetil-1,1':3',1''-terfenil-4'-carbaldehído

0,56 g (12%) incoloro; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 2,10 (3H, s), 2,29 (3H, s), 3,78 (3H, s), 3,80 (3H, s), 6,85-6,88 (2H, m), 6,91 (1H, d, J = 2,38 Hz), 6,95 (1H, d, J = 2,38 Hz), 7,18 (1H, d, J = 8,32 Hz), 7,24-7,25 (2H, m), 7,52 (1H, dd, J = 7,74 Hz, J = 1,78 Hz), 7,95 (1H, d, J = 8,33 Hz), 9,68 (1H, s); IR 1679 cm^{-1}; MS (ESI) m/z 347 (M+H)^{+},

Anal. para C_{23}H_{22}O_{3}:

	Calculado:	C: 79,74,	H: 6,40
	Encontrado:	C: 79,25,	H: 6,05.

Ejemplo 28 3-cloro-4'-hidroxi-2'-metil-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

Se calentaron a 125ºC con agitación, durante 1 hora, 3-cloro-4'-metoxi-2'-metil-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (1,0 g, 3,84 mmoles) e hidrocloruro de piridinio (6 g), en un tubo sellado. La mezcla de reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente y se agitó con una disolución de HCl 2 N y acetato de etilo. La capa orgánica se separó, y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (x 2). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron, y la evaporación del disolvente proporcionó (1 g) un sólido verde oscuro. El producto se usó sin ninguna purificación adicional. Se obtuvo una muestra analítica por purificación por HPLC, lo que proporciona un sólido blanco; p.f. 125-127ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 2,21 (3H, s), 6,68-6,72 (2H, m), 7,11 (1H, d, J = 8,15 Hz), 7,47 (1H, d, J = 7,89 Hz), 7,55 (1H, d, J = 1,48 Hz), 7,89 (1H, d, J = 7,98 Hz), 9,62 (1H, s), 10,2 = 35 (1H, s); MS (ESI) m/z 245/247 (M-H)^{-}, 247/249 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{14}H_{11}ClO_{2}:

	Calculado:	C: 68,16,	H: 4,49
	Encontrado:	C: 67,63,	H: 4,43.

Ejemplo 29 Oxima del 4'-hidroxi-3-metil[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído

Una mezcla de 4'-hidroxi-3-metil[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído (310 mg, 1,46 mmoles), hidrocloruro de hidroxilamina (203 mg, 2,92 mmoles) y piridina (236 \mul, 2,92 mmoles) en 15 ml de metanol absoluto se somete a reflujo durante 2,5 h. El disolvente se separó a presión reducida, y la mezcla se disolvió en acetato de etilo y agua, se extrajo con acetato de etilo (x 3), se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se filtró. La evaporación del disolvente y la purificación mediante recristalización (acetato de etilo, acetona y hexano) proporcionó 177 mg (53%) del compuesto de título como un sólido amarillento: p.f. 195-197ºC;

RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 2,43 (3H, s), 6,84 (2H, d, J = 8,48 Hz), 7,42-7,45 (2H, m), 7,52 (2H, d, J = 8,51 Hz), 7,66(1H, d, J = 8,00 Hz), 8,32 (1H, s), 9,60 (1H, s), 11,25 (1H, s); RMN ^{13}C (DMSO-d_{6}): \delta 19,62, 115,60, 123,40, 126,60, 127,56, 127,99, 129,05, 130,03, 136,34, 140,43, 146,80, 157,24; MS (ESI) m/z 226 (M-H)^{-}, 228 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{14}H_{13}NO_{2}:

	Calculado:	C: 73,99,	H: 5,77,	N: 6,16
	Encontrado:	C: 73,81,	H: 5,75,	N: 6,04.

Ejemplo 30 Oxima del 4'-hidroxi[1,1'-bifeniI]-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 1,03 mmoles de 4'-hidroxi[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído con hidrocloruro de hidroxilamina (140 mg, 2 mmoles) según el método C, para proporcionar 193 mg (79%, en dos etapas) de un sólido amarillento: p.f. 207-210ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,85 (2H, d, J = 8,37 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,39 Hz), 7,62 (4H, s), 8,15 (1H, s), 9,62 (1H, s), 11,21 (1H, s); MS (ESI) m/z 212 (M-H)^{-}.

Anal. para C_{13}H_{11}NO_{2}:

	Calculado:	C: 73,23,	H: 5,20,	N: 6,57
	Encontrado:	C: 72,78,	H: 5,41,	N: 6,38.

Ejemplo 31 Oxima del 3-cloro-4'-hidroxi[1,1'-bifeniI]-4-carbaldehído

Método E. Se añadó fluoruro de tetrabutilamonio (1,29 ml de una disolución 1,0 M en tetrahidrofurano, 1,29 mmoles) a una disolución de la oxima del 4'-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-3-cloro[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído (1,17 mmoles) en 10 ml de tetrahidrofurano. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, y después se vertió en acetato de etilo y agua. Las capas resultantes se separaron, y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3x). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron, y el disolvente se eliminó a vacío. La purificación por cromatografía en sílice (20%-30% de acetato de etilo-hexano) proporcionó 1,86 g (64%) del compuesto del título como un sólido amarillento: p.f. 187-189ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,86 (2H, d, J = 8,55 Hz), 7,56-7,63 (3H, m), 7,71 (1H, d, J = 1,60 Hz), 7,84 (1H, d, J = 8,26 Hz), 8,36 (1H, s), 9,75 (1H, s), 11,66 (1H, s); MS (ESI) m/z 246 (M-H)^{-}, 248 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{13}H_{10}ClNO_{2}:

	Calculado:	C: 63,04,	H: 4,07,	N: 5,66
	Encontrado:	C: 62,96,	H: 4,10,	N: 5,42.

Ejemplo 32 Oxima del 2-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar la oxima del 4'-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-2-fluoro-[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído (1,02 mmoles) con fluoruro de tetrabutilamonio (1,12 ml de una disolución 1,0 M en tetrahidrofurano, 1,12 mmoles) según el método E, para proporcionar 198 mg (84%) de un sólido blanco: p.f. 178-180ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,84-6,89 (2H, m), 7,39-5,54 (5H, m), 8,17 (1H, s), 9,71 (1H, s), 11,43 (1H, s); MS (ESI) m/z 230 (M-H)^{-}, 232 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{13}H_{10}FNO_{2}:

	Calculado:	C: 67,53,	H: 4,36,	N: 6,06
	Encontrado:	C: 67,13,	H: 4,11,	N: 6,00.

Ejemplo 33 3-Fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído oxima

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 3-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (154 mg, 0,713 mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (99 mg, 1,43 mmoles) según el método C, para proporcionar 156 mg (95%) de un sólido amarillento: p.f. 181-183ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,84-6,87 (2H, m), 7,48-7,53 (2H, m), 7,57-7,60 (2H, m), 7,76 (1H, t, J = 8,14 Hz), 8,22 (1H, s), 9,74 (1H, s), 11,56 (1H, s); MS (ESI) m/z 230 (M-H)^{-}, 232 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{13}H_{10}FNO_{2}:

	Calculado:	C: 67,53,	H: 4,36,	N: 6,06
	Encontrado:	C: 68,10,	H: 4,28,	N: 6,01.

Ejemplo 34 Oxima del 2-cloro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 2'-cloro-4'-(dibromometil)-1,1'-bifenil-4-ol (270 mg, 0,722 mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (185 mg, 2,66 mmoles) según el método C, para proporcionar 160 mg (90%) de un sólido blanco: p.f. 178-179ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,85 (2H, d, J = 8,54 Hz), 7,28 (2H, d, J = 8,51 Hz), 7,39 (1H, d, J = 7,98 Hz), 7,60 (1H, dd, J = 7,65Hz, J = 1,42 Hz), 7,72 (1H, d, J = 1,34 Hz), 8,18 (1H, s), 9,67 (1H, s), 11,45 (1H, s); MS (ESI) m/z 246/248 (M-H)^{-}.

Anal. para C_{13}H_{10}ClNO_{2}:

	Calculado:	C: 63,04,	H: 4,07,	N: 5,66
	Encontrado:	C: 63,07,	H: 3,99,	N: 5,67.

Ejemplo 36 Oxima del 4'-hidroxi-2-metil-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del titulo se preparó haciendo reaccionar 4'-hidroxi-2-metil-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (350 mg, 1,65 mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (230 mg, 3,30 mmoles) según el método C, para proporcionar 360 mg (961) de un sólido blanco: p.f. 169-171ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 2,25 (3H, s), 6,82 (2H, d, J = 8,52 Hz), 7,16 (2H, d, J = 8,45 Hz), 7,18 (1H, d, J = 7,84 Hz), 7,44 (1H, d, J = 7,93 Hz), 7,47 (1H, s), 8,11 (1H, s), 9,52 (1H, s), 11,19 (1H, s); MS (ESI) m/z 226 (M-H)^{-}, 228 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{14}H_{13}NO_{2}:

	Calculado:	C: 73,99,	H: 5,77,	N: 6,16
	Encontrado:	C: 73,72,	H: 5,63,	N: 6,37.

Ejemplo 37 Oxima del 3-cloro-3'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 3-cloro-3'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (1,52 mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (233 mg, 3,34 mmoles) según el método C, para proporcionar 260 mg (66%) de un sólido amarillento: p.f. 198-200ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 7,03 (1H, t, J = 8,79 Hz), 7,41-7,43 (1H, m), 7,60 (1H, dd, J = 12,91 Hz, J = 2,20 Hz), 7,64-7,66 (1H, m), 7,77 (1H, d, J = 1,92 Hz), 7,84 (1H, d, J = 8,24 Hz), 8,36 (1H, s),10,16 (1H, bs), 11,68 (1H, bs); MS (ESI) m/z 264/266 (M-H)^{-}, 266/268 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{13}H_{9}ClFNO_{2}:

	Calculado:	C: 58,77,	H: 3,41,	N: 5,27
	Encontrado:	C: 58,67,	H: 3,65,	N: 4,99.

Ejemplo 38 Oxima del 3-cloro-3',5'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 3-cloro-3',5'-difluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (200 mg, 0,746 mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (156 mg, 2,24 mmoles) según el método C, para proporcionar 100 mg (47%) de un sólido blanco: p.f. 216-219ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 7,54 (2H, d, J = 8,51 Hz), 7,70 (1H, d, J = 7,97 Hz), 7,84-7,86 (2H, m), 8,37 (1H, s), 10,52 (1H, s), 11,74 (1H, s); MS (ESI) m/z 282/284 (M-H)^{-},
284/286 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{13}H_{8}ClF_{2}NO_{2}:

	Calculado:	C: 55,05,	H: 2,84,	N: 4,94
	Encontrado:	C: 54,96,	H: 3,02,	N: 4,75.

Ejemplo 39 Oxima del 3-cloro-4'-hidroxi-2'-metil-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 3-cloro-4'-hidroxi-2'-metil-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (500 mg, 2,03 mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (425 mg, 6,10 mmoles) en tetrahidrofurano anhidro (50 ml) y metanol (20 ml) según el método C, para proporcionar 350 mg (57%, en dos etapas) de un sólido blanco: p.f. 169-171ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 2,19 (3H, s), 6,65-6,70 (2H, m), 7,06 (1H, d, J = 8,14 Hz), 7,31 (1H, d, J = 8,05 Hz), 7,41 (1H, d, J = 1,40 Hz), 7,83 (1H, d, J = 8,08 Hz), 8,38 (1H, s), 9,51 (1H, s), 11,69 (1H, s); MS (ESI) m/z 260/262 (M-H)^{-}, 262/264 (M+H)^{+}.

Anal. calc. para C_{14}H_{12}ClNO_{2}:

	Calculado:	C: 64,25;	H: 4,62;	N: 5,35
	Encontrado:	C: 63,87;	H: 4,43;	N: 5,31

Ejemplo 40 (2,6-dicloro-4-metoxi-fenil)-metanol

Se agitó toda la noche a 60ºC una mezcla de 3,5-dicloroanisol (16,39 g, 92,59 mmoles), HCl (250 ml de una disolución concentrada) y ácido sulfúrico (2,5 ml de una disolución concentrada). La mezcla se enfrió hasta la temperatura ambiente, y la capa orgánica se separó. La capa acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, y el disolvente se eliminó por evaporación. Al aceite que queda se le añadió NaOH (180 ml de una disolución 1 N) y dioxano (85 ml). La mezcla se agitó a reflujo durante 3 horas, y se enfrió hasta la temperatura ambiente. Se eliminó la capa orgánica, y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se filtraron. El residuo se purificó sobre sílice (90% de hexanos - 10% de acetato de etilo) para proporcionar 5,82 g (30%) del compuesto del título como un sólido blanco: p.f. 71-72ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta 1,88 (1H, s), 3,73 (3H, s), 4,81 (2H, s), 6,81 (2H, s); MS (El) m/z 206/208/210 (M^{+}).

Anal. para C_{8}H_{8}Cl_{2}O_{2}:

	Calculado:	C:46,41	H:3,89
	Encontrado:	C:46,38	H:3,69.

Ejemplo 41 2,6-dicloro-4-metoxi-benzaldehído

Una supensión de (2,6-dicloro-4-metoxifenil)-metanol (5,69 g, 27,49 mmoles) y MnO_{2} (15 g) en benceno (100 ml) se agitó a reflujo utilizando un colector Dean-Stark, toda la noche. La suspensión se enfrió hasta la temperatura ambiente, se filtró a través de Celite, y el disolvente se eliminó por evaporación para proporcionar 4,69 g (83%) de un sólido blanco bruto. Una muestra analítica se obtuvo por recristalización en metanol para proporcionar cristales de agujas blancas: p.f. 104-106ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 3,90 (3H, s), 7,21 (2H, s), 10,29 (1H, s); MS (El) m/z 204/206/218 (M^{+}).

Anal. para C_{8}H_{6}Cl_{2}O_{2}:

	Calculado:	C: 46,86	H: 2,0
	Encontrado:	C: 46,67	H: 2,89.

Ejemplo 42 2,6-dicloro-4-hidroxi-benzaldehído

A una disolución de 2,6-dicloro-4-metoxibenzaldehído (3,44 g, 16,8 mmoles) en diclorometano (120 ml) a 0ºC se añadió lentamente tribromuro de boro (42 ml de 1 N en diclorometano, 42 mmoles). La disolución se dejó calentar hasta la temperatura ambiente mientras se agitaba toda la noche, y se paralizó con una disolución saturada de bicarbonato de sodio (250 ml). La mezcla resultante se extrajo con acetato de etilo (3 x 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se filtraron. El disolvente se eliminó por evaporación, y el residuo se purificó sobre sílice (70% de hexanos - 30% de acetato de etilo) para proporcionar 2,19 g (68%) de un sólido rosa. El triturado con acetato de etilo - hexanos proporcionó una muestra analítica del compuesto del título como un sólido blanco: p.f. 214-217ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,95 (2H, s), 10,26 (1H, s), 11,44 (1H, s); MS (El) m/z 189,8/191,8/193,8 (M^{+}).

Anal. para C_{7}H_{4}Cl_{2}O_{2}:

	Calculado:	C: 44,02	H: 2,11
	Encontrado:	C: 44,08	H: 2,07.

Ejemplo 43 Trifluorometanosulfonato de 3,5-dicloro-4-formil-fenilo

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 2,6-dicloro-4-hidroxibenzaldehído (2,35 g, 12,3 mmoles) con anhídrido trifluorometanosulfónico (4,51 g, 16,0 mmoles) según el método E, para proporcionar 3,45 g (87%) de un aceite amarillo claro. El análisis por TLC de este aceite indicó que parece descomponerse en el fenol de partida al dejar reposar. RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 8,03 (2H, s), 10,31 (1H, s).

Ejemplo 44 3,5-dicloro-4'hidroxi-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar trifluorometanosulfonato de 3,5-dicloro-4-formilfenilo (0,73 g, 2,26 mmoles) con ácido 4-terc-butil-dimetilsiloxilifenilborónico (0,80 g, 3,2 mmoles) según el método C, para proporcionar 0,30 g (50%) de un sólido amarillo: p.f. 178-180ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,88 (2H, d, J = 8,84 Hz), 7,72 (2H, d, J = 8,71 Hz), 7,84 (2H, s), 9,95 (1H, s), 10,38 (1H, s); MS (El) m/z 266,0/268,0/270,0 (M^{+}).

Anal. para C_{13}H_{8}Cl_{2}O_{2} 0,5 H_{2}O:

	Calculado:	C: 56,55	H: 3,29
	Encontrado:	C: 56,36	H: 2,90.

Ejemplo 45 2,3-dicloro-4-metoxibenzaldehído

A una disolución de 2,3-dicloroanisol (10,00 g, 56,6 mmoles) en diclorometano anhidro (45 ml) se añadió rápidamente TiCl_{4} (10,5 ml, 96,1 mmoles). Posteriormente se añadió lentamente \alpha,\alpha-diclorometil-metil-éter (5,1 ml, 56,6 mmoles), y la temperatura interior se mantuvo entre 15ºC y 20ºC. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 h, se vertió lentamente en hielo machacado, se extrajo con diclorometano (3x), y se lavó con bicarbonato de sodio saturado hasta pH = 7, y después se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se concentró para proporcionar 11,34 g (98%) de un sólido blanco. Una muestra analítica se proporcionó medinte HPLC de fase inversa: p.f. 112-113ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta 4,01 (3H, s), 6,97 (1H, d, J = 8,77 Hz), 7,90 (1H, d, J = 8,82 Hz), 10,36 (1H, s); MS (ESI) m/z 205/207/209 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{8}H_{6}Cl_{2}O_{2}:

	Calculado:	C: 46,86	H: 2,95;
	Encontrado:	C: 46,92	H: 2,70.

Ejemplo 46 2,3-dicloro-4-hidroxibenzaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 2,3-dicloro-4-metoxibenzaldehído (10 g, 49 mmoles) con tribromuro de boro (147 ml de una disolución 1 N en CH_{2}Cl_{2}, 147 mmoles) según el método D, para proporcionar 11,3 g de un sólido gris oscuro el cual es principalmente el producto designado indicado por RMN ^{1}H. Se trituró con CHCl_{3} al 30% en hexano para proporcionar 3,6 g de un sólido gris como un producto puro. Se proporcionó una muestra analítica como un sólido blanco mediante HPLC de fase inversa: p.f. 176-178ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 7,10 (1H, d, J = 8,68 Hz), 7,74 (1H, d, J = 8,67 Hz), 10,16 (1H, s), 11,95 (1H, s); MS (ESI) m/z 189/191/193 (M-H)^{-}, 193/191/195 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{7}H_{4}Cl_{2}O_{2}

	Calculado:	C: 44,02	H: 2,11
	Encontrado:	C: 43,87	H: 1,67.

Ejemplo 47 Éster 2,3-dicloro-4-formil-fenílico del ácido trifluoro-metanosulfónico

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 2,3-dicloro-4-hidroxibenzaldehído (2,50 g, 13,2 mmoles) con anhídrido trifluorometanosulfónico (2,88 ml, 4,80 g, 17,1 mmoles) de acuerdo con el ejemplo 43, para proporcionar 3,69 g (82%) de un cristal pardo el cual se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación. Se proporcionó una muestra analítica como un sólido blanco por cromatografía en sílice (5% de acetato de etilo-hexano): p.f. 44-45ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 7,88 (1H, d, J = 8,74 Hz), 8,02 (1H, d, J = 8,81 Hz), 10,28 (1H, s); MS (El) m/z 322/324/326 (M)^{+}.

Anal. para C_{8}H_{3}Cl_{2}F_{3}O_{4}S:

	Calculado:	C: 29,74	H: 0,94;
	Encontrado:	C: 30,19	H: 0,86.

Ejemplos 48-50

Se hace reaccionar el éster 2,3-dicloro-4-formilfenílico del ácido trifluorometanosulfónico (1,39 g, 4,33 mmoles) con el ácido borónico 21 (1,20 g, 4,76 mmoles) según el método B, para producir los tres compuestos siguientes:

2,3-dicloro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (48)

310 mg (27%) de un sólido blanco: p.f. 172-174ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,86-6,91 (2H, m), 7,32-7,35 (2H, m), 7,53 (1H, dd, J = 7,94 Hz, J = 0,45 Hz), 7,85 (1H, d, J = 8,01 Hz), 9,85 (1H, s), 10,35 (1H, s); MS (ESI) m/z 265/267/269 (M-H)-.

Anal. para C_{13}H_{8}Cl_{2}O_{2}:

	Calculado:	C: 58,46	H: 3,02;
	Encontrado:	C: 57,75	H: 2,82.

2-cloro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (49)

90 mg (9%) de un sólido blanquecino: p.f. 114-116ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,85-6,90 (2H, m), 7,32-7,36 (2H, m), 7,61 (1H, d, J = 7,87 Hz), 7,89 (1H, dd, J = 7,90 Hz, J = 1,55 Hz), 8,05 (1H, d, J = 1,52 Hz), 9,79 (1H, s), 10,02 (1H, s); MS (ESI) m/z 231/233 (M-H)^{-}, 233/235 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{13}H_{9}ClO_{2}:

	Calculado:	C: 67,11	H: 3,90
	Encontrado:	C: 67,44	H: 3,87

2'-dicloro-4,4''-dihidroxi-1,1':3',1''-terfenil-4'-carbaldehído (50)

130 mg (9%) de un sólido blanquecino: p.f. 222-223ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,85-6,88 (2H, m), 6,88-6,91 (2H, m), 7,17-7,20 (2H, m), 7,31-7,35 (2H, m), 7,52 (1H, dd, J = 7,96 Hz, J = 0,89 Hz), 7,84 (1H, d, J = 8,07 Hz), 9,55 (1H, d, J = 0,77 Hz), 9,73 (1H, s), 9,74 (1H, s); MS (ESI) m/z 323/325 (M-H)^{-}, 325/327 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{19}H_{13}ClO_{3}:

	Calculado:	C: 70,27	H: 4,03
	Encontrado:	C: 69,80	H: 3,88.

\global\parskip0.970000\baselineskip

Ejemplo 51 2,3-dicloro-3'-fluoro-4'-metoxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar éster 2,3-dicloro-4-formilfenílico de ácido trifluorometanosulfónico (1,90 mg, 5,90 mmoles) con 21 (1,30 g, 7,67 mmoles) según el método B, para proporcionar 0,84 g (47%) de un sólido blanco: p.f. 160-164ºC; RMN ^{1}H (DMDO-d_{6}): \delta 3,90 (3H, m), 7,28-7,30 (2H, m), 7,41-7,43 (1H, m), 7,57 (1H, d, J = 8,30 Hz), 7,87 (1H, d, J = 7,81 Hz), 10,35 (1H, s); MS (El) m/z 298/300/302 (M)^{+}.

Anal. para C_{14}H_{9}Cl_{2}FO_{2}:

	Calculado:	C: 56,21	H: 3,03
	Encontrado:	C: 57,55	H: 2,97.

Ejemplos 52 y 53

Se hace reaccionar 2,3-dicloro-3'-fluoro-4'-metoxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (0,72 g, 2,42 mmoles) con tribromuro de boro (7,25 ml de una disolución 1 N en CH_{2}Cl_{2}, 7,25 mmoles) según el método E, para producir los dos compuestos siguientes:

2',3'-dicloro-4'-(dibromometil)-3-fluoro-1,1'-bifenil-4-ol (52)

130 mg (13%) de un jarabe espeso gris: RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 7,04 (1H, t, J =8,54 Hz), 7,11 (1H, dd, J =8,41 Hz, J =1,97 Hz), 7,32 (1H, dd, J =12,18 Hz, J = 1,94 Hz), 7,51 (1H, d, J =8,27 Hz), 7,54 (1H, s), 7,95 (1H, d, J =8,23 Hz), 10,23 (1H, s); MS (ESI) m/z 425/427/429 (M-H)^{-}.

Anal. para C_{13}H_{7}Br_{2}Cl_{2}FO:

	Calculado:	C: 36,40	H: 1,65
	Encontrado:	C: 37,60	H: 1,69.

2,3-dicloro-3'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (53)

140 mg (20%) de un sólido blanco: p.f. 170-171ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 7,07 (1H, t, J = 8,60 Hz), 7,15 (1H, dd, J =8,40 Hz, J =1,79 Hz), 7,35 (1H, dd, J =12,15 Hz, J = 1,87 Hz), 7,56 (1H, d, J = 7,97 Hz), 7,86 (1H, d, J = 8,09 Hz), 10,31 (1H, s), 10,35 (1H, s); MS (ESI) m/z 283/285/287 (M-H)^{-}.

Anal. para C_{13}H_{7}Cl_{2}FO_{2}:

	Calculado:	C: 54,77	H: 2,47
	Encontrado:	C: 54,93	H: 2,18.

Ejemplo 54 Oxima del 3,5-dicloro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 3,5-dicloro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (170 mg, 0,637 mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (89 mg, 1,27 mmoles) según el método F, para proporcionar 160 mg (89%) de un sólido blanco: p.f. 183-186ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,86 (2H, d, J = 8,79 Hz), 7,63 (2H, d,
J = 8,79 Hz), 7,76 (2H, s), 8,25 (1H, s), 9,81 (1H, s), 11,78 (1H, s); MS (ESI) m/z 280/282/284 (M-H)^{-}, 282/284/286 (M+H)^{+}.

Ejemplo 55 Oxima del 3,5-dicloro-3'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 3,5-dicloro-3'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído (290 mg, mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (140 mg, 1,27 mmoles) según el método F, para proporcionar 260 mg (85%) de un sólido blanco: p.f. 185-190ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 7,03 (1H, t, J = 8,86 Hz), 7,46-7,49 (1H, m), 7,68 (1H, dd, J = 12,74 Hz, J = 2,26 Hz), 7,82 (2H, s), 8,25 (1H, s), 10,24 (1H, s), 11,80 (1H, s); MS (ESI) m/z 298/300/302 (M-H)^{-}, 300/302/304 (M+H)^{+}.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Anal. para C_{13}H_{8}Cl_{2}FNO_{2} 0,2 H_{2}O:

	Calculado:	C: 51,41	H: 2,79	N: 4,61
	Encontrado:	C: 51,70	H: 2,75	N: 4,21.

Ejemplo 56 Oxima del 2,3-dicloro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído

El compuesto del título se preparó haciendo reaccionar 48 (140 mg, 0,526 mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (110 mg, 1,58 mmoles) según el método F, para proporcionar 148 mg (100%) de un sólido blanquecino: p.f. 208-210ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 6,84-6,87 (2H, m), 7,26-7,29 (2H, m), 7,36 (1H, d, J = 7,94 Hz). 7,80 (1H, d, J = 8,20 Hz), 8,41 (1H, s), 9,72 (1H, s), 11,83 (1H, s); MS (ESI) m/z 280/282/284 (M-H)^{-}, 282/284/286 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{13}H_{9}Cl_{2}NO_{2}:

	Calculado:	C: 55,35	H: 3,22	N: 4,96
	Encontrado:	C: 55,78	H: 3,59	N: 4,44.

Ejemplo 57

Se hace reaccionar 52 (85 mg, 0,20 mmoles) con hidrocloruro de hidroxilamina (376 mg, 5,39 mmoles) y piridina (0,43 ml, 5,34 mmoles) durante 8 días según el método C para producir los dos compuestos siguientes:

Oxima del 2,3-dicloro-3'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehido (57)

17,6 mg (30%) de un sólido blanquecino: p.f. 225-227ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 7,04 (1H, t, J = 8,54 Hz ), 7,10 (1H, dd, J = 8,35 Hz, J = 1,88 Hz ), 7,28 (1H, dd, J = 12,22 Hz, J = 2,01 Hz), 7,39 (1H, d, J = 8,14 Hz), 7,81 (1H, d, J = 8,15 Hz), 8,41 (1H, s), 10,18 (1H, s), 11,87 (1H, s); MS (ESI) m/z 298/300/302 (M-H)^{-}, 300/302/304 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{13}H_{8}Cl_{2}FNO_{2} \cdot 0,09 TFA:

	Calculado:	C: 51,00	H: 2.63	N: 4,51
	Encontrado:	C: 50,97	H: 2,37	N: 4,33.

2,3-dicloro-3'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carboxilato de metilo

16,9 mg (27%) de un solido blanco: p.f. 152-154ºC; RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}): \delta 3,90 (3H, s), 7,05 (1H, t, J = 8,54 Hz), 7,11 (1H, dd, J = 8,41 H, J = 1,55 Hz), 7,31 (1H, dd, J = 12,16 Hz, J = 1,68 Hz), 7,47 (1H, d, J = 8,02 Hz), 7,76 (1H, d, J = 8,64 Hz); MS (ESI) m/z 313/315/317 (M+H)^{+}.

Anal. para C_{14}H_{9}CI_{2}FO_{3}:

	Calculado:	C: 53,36	H: 2,88
	Encontrado:	C: 51,94	H: 2,54.

Ejemplo 58 TABLA 1 Derivado de la oxima del 4'-hidroxi-bifenil-carbaldehído

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Los resultados obtenidos en el procedimiento estándar de ensayo farmacológico demuestran que los compuestos de la presente invención son compuestos estrogénicos, algunos de los cuales presentan una potente afinidad preferente por el receptor ER\beta. Los compuestos de la presente invención tienen desde una elevada afinidad preferente por el ER\delta frente al ER\alpha, hasta una afinidad casi igual por ambos receptores. De este modo, los compuestos de la presente invención comprenderán un intervalo de actividad basándose, al menos en parte, en sus perfiles de selectividad de la afinidad por el receptor. Además, dado que cada nuevo complejo receptor-ligando es único y, de este modo, su interacción con diversas proteínas correguladoras es única, los compuestos de la presente invención mostrarán diferente comportamiento modulador en función del contexto celular en el que se encuentren. Por ejemplo, en algunos tipos celulares es posible que un compuesto se comporte como un agonista estrogénico, mientras que en otros tejidos se comporte como un antagonista. Los compuestos con dicha actividad se han denominado a veces MSRE (Moduladores Selectivos del Receptor de Estrógenos). Sin embargo, a diferencia de muchos estrógenos, muchos de los MSRE no provocan aumentos en el peso uterino húmedo. Estos compuestos son antiestrogénicos en el útero, y pueden antagonizar completamente los efectos tróficos de los agonistas estrogénicos en el tejido uterino. No obstante, estos compuestos actúan como agonistas estrogénicos en los sistemas óseo, cardiovascular y nervioso central. Debido a esta naturaleza selectiva de tejidos de dichos compuestos, son útiles para el tratamiento o la prevención, en un mamífero, de enfermedades o síndromes causados por, o relacionados con, una insuficiencia de estrógenos (en ciertos tejidos tales como los huesos o el sistema cardiovascular) o con un exceso de estrógenos (en el útero o en las glándulas mamarias).

Incluso más allá de dicha modulación específica de células, los compuestos de la presente invención también tienen la capacidad de comportarse como agonistas en un tipo de receptor, mientras se comportan como antagonistas en el otro. Por ejemplo, se ha demostrado que los compuestos pueden ser antagonistas en el ER\beta siendo al mismo tiempo agonistas en el ER\alpha (Meyers, Marvin J.; Sun, Jun; Carlson, Kathryn E.; Katzenellenbogen, Benita S.; Katzenellenbogen, John A. J. Med. Chem. (1999), 42(13), 2456-2468). Dicha actividad ERSAA (Antagonista-agonista selectiva del receptor de estrógenos) proporciona la base de la actividad estrogénica farmacológicamente distinta en esta serie de compuestos.

Se dispone fácilmente de procedimientos estándar de ensayo farmacológico para determinar el perfil de actividad de un compuesto de ensayo dado. Los siguientes ejemplos resumen brevemente varios procedimientos de ensayo representativos. En las patentes US nº 4.418.068 y nº 5.998.402 se proporcionan asimismo procedimientos estándares de ensayo farmacológico para los MSRE.

Ejemplo 59 Procedimiento de ensayo uterotrófico/antiuterotrófico en ratas

Las propiedades estrogénicas y antiestrogénicas de los compuestos se pueden determinar en un ensayo uterotrófico en ratas inmaduras (de 4 días) que ha sido previamente descrito por L. J. Black y R. L. Goode, Life Sciences, 26, 1453 (1980). Se estudiaron ratas Sprague-Dawley inmaduras (hembras; de 18 días de edad) en grupos de seis. Los animales se trataron diariamente con una inyección intraperitoneal de 10 \mug de compuesto, 100 \mug de compuesto, (100 \mug de compuesto + 1 \mug de 17\beta-estradiol) para verificar la capacidad antiestrogénica, y 1 \mug de 17\beta-estradiol, con DMSO al 50%/disolución salina al 50% como vehículo de inyección. En el día 4 los animales se sacrificaron por asfixia con CO_{2}, y se extrajeron los úteros y se eliminó el exceso de lípidos, así como de todo líquido, y se determinó el peso húmedo. Una pequeña sección de un cuerno se destina al análisis histológico, y el resto se usó para aislar el ARN total con el objeto de evaluar la expresión del gen del componente 3 del complemento.

Ejemplo 60 Procedimiento de ensayo en ratas ovariectomizadas de 6 semanas - Osteoprotección y cardioprotección

Se obtienen ratas Sprague-Dawley CD hembras, ovariectomizadas o con operación simulada, 1 día después de la intervención quirúrgica, de Taconic Farms (intervalo de pesos: 240 - 275 g). Se alojan 3 ó 4 ratas/jaula en una habitación sometida a un programa 12/12 (luz/oscuridad) con alimentos (pienso Purina 5K96C para ratas) y agua ad libitum. El tratamiento para todos los estudios comienza 1 día después de la llegada de los animales, y las ratas reciben dosis 7 días por semana, según proceda, durante 6 semanas. Un grupo de ratas de edad equivalente y con operación simulada, que no recibió ningún tratamiento, servía como grupo testigo intacto, repleto de estrógeno, en cada estudio.

Todos los tratamientos se preparan en Tween 80 al 1% en disolución salina normal, a concentraciones definidas, de modo que el volumen de tratamiento es 0,1 ml/100 g de peso corporal. El 17\beta-estradiol se disuelve en aceite de maíz (20 \mug/ml), y se administra por vía subcutánea, 0,1 ml/rata. Todas las dosis se ajustan a intervalos de tres semanas en función de la media de las medidas de peso corporal del grupo.

Cinco semanas después del comienzo del tratamiento, y una semana antes del final del estudio, se evalúa la densidad mineral ósea (DMO) de cada una de las ratas. Se evalúan la densidad total y trabecular de la porción próxima de la tibia en ratas anestesiadas, utilizando un aparato XCT-960M (pQCT; Stratec Medizintechnik, Pforzheim, Alemania). Las medidas se realizan de la siguiente manera: quince minutos antes de la tomografía, cada rata se anestesia mediante una inyección intraperitoneal de 45 mg/kg de ketamina, 8,5 mg/kg de xilazina y 1,5 mg/kg de acepromazina.

La pata trasera derecha se hace pasar a través de un tubo de policarbonato con un diámetro de 25 mm y se fija a un marco acrílico manteniendo la articulación del tobillo a un ángulo de 90º, y la articulación de la rodilla a 180º. El tubo de policarbonato se fija a una plataforma deslizante que lo mantiene perpendicular a la abertura del aparato pQCT. La plataforma se ajusta de modo que el extremo distante del fémur y el extremo próximo de la tibia se encuentren en el campo de la tomografía. Se realiza una exploración bidimensional preliminar de una longitud de 10 mm y una resolución lineal de 0,2 mm. Una vez visualizada la exploración preliminar en el monitor, se localiza el extremo próximo de la tibia. La tomografía con pQCT se inicia en un lugar situado a 3,4 mm en posición distante de este punto. La tomografía con pQCT tiene un grosor de 1 mm y un tamaño de vóxel (píxel tridimensional) de 0,140 mm, y consta de 145 proyecciones a través del corte.

Tras completar la tomografía con pQCT, la imagen se visualiza en el monitor. Se resalta una región de interés que incluye la tibia pero que excluye el peroné. El tejido blando se elimina de forma automática utilizando un algoritmo iterativo. La densidad del hueso restante (densidad total) se notifica en mg/cm^{3}. El 55% de la zona exterior del hueso se elimina en una espiral concéntrica. La densidad del hueso restante (densidad trabecular) se da en mg/cm^{3}. Una semana después de la evaluación de la DMO, las ratas se sacrifican por asfixia con dióxido de carbono, y se extrae sangre para la determinación de colesterol. También se extraen y se pesan los úteros. El colesterol total se determina con un analizador clínico Hitachi 911 de Boehringer-Mannheim, utilizando el kit Cholesterol/HP. Los valores estadísticos se compararon utilizando análisis de la varianza unidireccional con la prueba de Dunnet.

Ejemplo 61 Procedimiento de ensayo antiproliferativo con MCF-7/ERE

Se preparan disoluciones madre de los compuestos de ensayo (generalmente 0,1 M) en DMSO, y después se diluyen 10 a 100 veces con DMSO para obtener disoluciones de trabajo de 1 ó 10 mM. Las disoluciones madre en DMSO se conservan a 4ºC (0,1 M) o a -20ºC (< 0,1 M). Las células MCF-7 se propagan por pasadas, dos veces a la semana, con medio de cultivo [medio D-MEM/F-12 que contiene suero fetal bovino termoinactivado al 10% (v/v), penicilina-estreptomicina al 1% (v/v), y glutaMAX-1 2 mM]. Las células se mantienen en matraces ventilados a 37ºC en el interior de un incubador con 5% de CO_{2}/95% de aire húmedo. Un día antes del tratamiento, las células se siembran con medio de cultivo a una densidad de 25.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos, y se incuban a 37ºC durante toda la noche.

Las células se infectan durante 2 h a 37ºC con 50 \mul/pocillo de una dilución 1:10 de adenovirus 5-ERE-tk-luciferasa en medio experimental [medio D-MEM/F-12 exento de rojo fenol, que contiene suero bovino fetal al 10% (v/v), termoinactivado, tratado con carbón, penicilina-estreptomicina al 1% (v/v), glutaMAX-1 2 mM, piruvato de sodio 1 mM]. Los pocillos se lavan después una vez con 150 \mu\lambda de medio experimental. Finalmente, las células se tratan durante 24 h a 37ºC en series de 8 pocillos/tratamiento con 150 \mu\lambda/pocillo de vehículo (\leq 0,1% de DMSO, v/v) o compuesto diluido \geq 1000 veces en medio experimental.

El cribado inicial de los compuestos de ensayo se realiza a una dosis única de 1 \muM, que se ensaya por separado (modo agonista) o en combinación con 17\beta-estradiol 0,1 nM (CE_{80}; modo antagonista). Cada placa de 96 pocillos incluye también un grupo testigo con vehículo (DMSO al 0,1%, v/v) y un grupo testigo con un agonista del receptor de estrógenos (17\beta-estradiol 0,1 ó 1 nM). Los experimentos de dosis-respuesta se realizan en los modos agonista y/o antagonista con los compuestos activos en incrementos logarítmicos de 10^{-14} a 10^{-5} M. A partir de estas curvas de dosis-respuesta se calculan los valores de CE_{50} y CI_{50}, respectivamente. El pocillo final en cada grupo de tratamiento contiene 5 \mul de ICI-182.780 3 x 10^{-5} M (concentración final de 10^{-6} M) como testigo antagonista del RE.

Después del tratamiento, las células se lisan en un agitador durante 15 min con 25 \mul/pocillo de reactivo de lisis de cultivo celular 1X (Promega Corporation). Los lisados celulares (20 \mul) se transfieren a una placa de luminómetro de 96 pocillos, y se mide la actividad de la luciferasa en un luminómetro MicroLumat LB 96 P (EG & G Berthold) utilizando 100 \mul/pocillo de sustrato de luciferasa (Promega Corporation). Antes de la inyección de sustrato, se hace una lectura del fondo durante 1 segundo para cada pocillo. Tras la inyección del sustrato, se mide la actividad luciferasa durante 10 segundos, tras un retardo de 1 segundo. Los datos se transfieren del luminómetro a un ordenador personal Macintosh y se analizan con el software JMP (SAS Institute), que resta los valores de la lectura del fondo de las mediciones de luciferasa para cada pocillo, y después determina la media y la desviación típica de cada tratamiento.

Se realiza la transformación logarítmica de los datos de la luciferasa, y se utiliza el estimador M de Huber para infraponderar las observaciones transformadas de los extremos. El software JMP se utiliza para analizar los datos transformados y ponderados con un ANOVA unidireccional (prueba de Dunnett). Los tratamientos con compuesto se comparan con los resultados del testigo con vehículo en el modo agonista, o con los resultados del testigo positivo del agonista (17\beta-estradiol 0,1 nM) en el modo antagonista. Para el experimento inicial con una dosis única, si los resultados del tratamiento con compuesto difieren significativamente de los del testigo apropiado (p < 0,05), entonces los resultados se dan como porcentaje relativo del testigo con 17\beta-estradiol [es decir, ((compuesto - testigo con vehículo)/(testigo con 17\beta-estradiol - testigo con vehículo)) x 100]. El software JMP se utiliza también para determinar los valores de CE_{50} y/o CI_{50} a partir de las curvas no lineales de dosis-respuesta.

Ejemplo 62 Inhibición de la oxidación de la LDL- Actividad antioxidante

Se obtienen aortas porcinas de un matadero, se lavan y se transportan en PBS enfriada, y se extraen las células endoteliales aórticas. Para la extracción de las células, se atan los vasos intercostales de la aorta y se pinza un extremo de la aorta. Se coloca en un vaso colagenasa (Sigma, tipo I) al 0,2%, recién preparada, esterilizada por filtración, y el otro extremo del vaso se pinza después para formar un sistema cerrado. La aorta se incuba a 37ºC durante 15-20 minutos, y después se recoge la disolución de colagenasa y se centrifuga durante 5 minutos a 2.000 x g. Cada pelete se resuspende en 7 ml de medio de cultivo de células endoteliales, que consta de medio DMEM/F12 de Ham exento de rojo fenol, enriquecido con FBS tratado con carbón (5%), NuSerum (5%), L-glutamina (4 mM), penicilina-estreptomicina (1.000 U/ml, 100 \mug/ml) y gentamicina (75 \mug/ml), se siembra en placas de Petri de 100 mm y se incuba a 37ºC en CO_{2} al 5%. Tras 20 minutos, las células se lavan con PBS y se añade medio nuevo, y esta operación se repite otra vez a las 24 horas. Las células son confluentes tras aproximadamente 1 semana. Las células endoteliales reciben aporte nutritivo de forma sistemática dos veces a la semana y, cuando son confluentes, se tratan con tripsina y se siembran en una relación 1:7. Se deja transcurrir la oxidación, mediada por células, de 12,5 \mug/ml de LDL en presencia del compuesto a evaluar (5 \muM), durante 4 horas a 37ºC. Los resultados se expresan como porcentaje de la inhibición del proceso oxidativo, medido por el método TBARS (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico) para el análisis de aldehídos libres [Yagi K., Biochem Medicine 15: 212-216 (1976)].

Ejemplo 63 Procedimiento de ensayo con células hipotalámicas D12

Se subclonaron células hipotalámicas D12 de rata a partir de la línea celular progenitora RCF17, y se conservaron congeladas. Se cultivan de forma sistemática en DMEM:F12 (1:1), glutaMAX-1 (2 mM), penicilina (100 U/ml)-estreptomicina (100 mg/ml), con suero bovino fetal (FBS) al 10%. Las células se siembran en placas en medio exento rojo fenol (DMEM:F12, glutaMAX, penicilina-estreptomicina) que contiene FBS al 2-10% tratado con carbón, a una densidad subconfluente (1-4 x 10^{6} células/pocillo de 150 mm). Las células reciben nutrientes nuevamente 24 h después con medio que contiene suero tratado al 2%. Para analizar la actividad agonista, las células se tratan con 17\beta-estradiol 10 nM o con diversas dosis del compuesto de ensayo (1 mM, o un intervalo de 1 pM a 1 mM). Para analizar la actividad antagonista, las células se tratan con 17\beta-estradiol 0,1 nM en ausencia o en presencia de dosis variables (100 pM a 1 mM) del compuesto de ensayo. Las placas testigo también se tratan con DMSO como testigo negativo. Cuarenta y ocho horas después de la adición de la hormona, las células se lisan y se lleva a cabo el procedimiento de ensayo de unión.

Para cada procedimiento de ensayo de unión se incuban 100-150 mg de proteína con 10 nM de ^{3}H-R5020 + un exceso de 100 veces de R5020 en un volumen de 150 ml. Se preparan reacciones por triplicado (tres con R5020, tres sin R5020) en una placa de 96 pocillos. Se añade primero el extracto de proteínas, seguido de ^{3}H-R5020 o ^{3}H-R5020 + 100x de R5020 no marcado. La reacción se realiza durante 1-2 h a temperatura ambiente. La reacción se detiene añadiendo 100 ml de carbón frío al 5% (Norit SX-4), dextrano 69K al 0,5% (Pharmacia) en TE pH 7,4. Tras 5 min. a temperatura ambiente, se separan por centrifugación el ligando unido y el no unido (5 min, 1000 FCR, 4ºC). Se retira la disolución de sobrenadante (\sim150 ml), y se transfiere a un vial de centelleo. Tras la adición de líquido de centelleo (Beckman Ready Protein+), las muestras se cuentan durante 1 min. en un contador de centelleo.

Ejemplo 64 Receptor de progesterona en el área preóptica del SNC

Se someten a ovariectomía ratas Sprague-Dawley hembras de sesenta (60) días. Los animales se alojan en un animalario con un régimen de 12 horas de luz, 12 horas de oscuridad, y acceso libre a agua corriente y pienso para roedores.

Los animales ovariectomizados se dividen de forma aleatoria en grupos que reciben inyecciones de vehículo
(DMSO al 50%, PBS al 40%, vehículo de etanol al 10%), 17\beta-estradiol (200 ng/kg) o del compuesto a ensayar. A otros animales se les inyecta el compuesto de ensayo 1 h antes de la inyección de 17\beta-estradiol, con el objeto de evaluar las propiedades antagonistas de dicho compuesto. Seis horas después de la inyección subcutánea, los animales se sacrifican con una dosis letal de CO_{2}, y se extraen los cerebros y se congelan.

El tejido extraído de los animales se corta con un criotomo a -16ºC y se coloca en portaobjetos para microscopio recubiertos con silano. Los portaobjetos con las secciones montadas se secan a continuación en un calefactor de portaobjetos, mantenido a 42ºC, y se conservan en cajas desecadas para portaobjetos, a -80ºC. Antes de su tratamiento, las cajas desecadas para portaobjetos se calientan lentamente hasta la temperatura ambiente (-20ºC durante 12-16 h; 4ºC durante 2 h; temperatura ambiente durante 1 h) para evitar la formación de condensación en los portaobjetos y reducir al mínimo de esta manera la degradación del tejido y del ARN. Los portaobjetos secos se cargan en soportes metálicos, y se fijan después en paraformaldehído al 4% (pH 9,0) durante 5 min, y se tratan como se ha descrito anteriormente.

Un plásmido que contenía un fragmento de 815 pb del ADNc 9 del RP de rata (dominio de unión al ligando) se hace lineal y se utiliza para generar una sonda marcada con ^{35}S-UTP que es complementaria a una porción del ARNm del RP de rata. Los portaobjetos con las secciones montadas y tratadas se hibridan con 20 ml de una mezcla de hibridación contiene la ribosonda (4-6 x 10^{6} DPM/portaobjetos) y formamida al 50%, y se incuban toda la noche en una cámara húmeda a 55ºC. Por la mañana, los portaobjetos se colocan en soportes metálicos que se sumergen en SSC 2X (NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M; pH 7,0)/DTT 10 mM. Todos los soportes se transfieren a un recipiente grande y se lavan con SSC 2X/ DTT 10 mM durante 15 min. a temperatura ambiente con agitación suave. Después los portaobjetos se lavan con tampón de ARNasa a 37ºC durante 30 min, se tratan con ARNasa A (20 mg/ml) durante 30 min. a 37ºC, y se lavan durante 15 min. con SSC 1X a temperatura ambiente. A continuación los portaobjetos se lavan (2 x 30 min) en SSC 0,1X a 65ºC para eliminar el marcador no específico, se aclaran en SSC 0,1X a temperatura ambiente durante 15 min, y se deshidratan con una serie graduada de alcohol: acetato de amonio (70%, 95% y 100%). Los portaobjetos secados con aire se oponen a una película radiográfica durante 3 días, que se somete después a procesamiento fotográfico. Los portaobjetos procedentes de todos los animales se hibridan, se lavan, se exponen y se someten a procesamiento fotográfico juntos, para eliminar las diferencias debidas a las variaciones entre ensayos en las condiciones.

Ejemplo 65 Sofocos en ratas - Efectos en el SNC

Tras su intervención quirúrgica, se obtienen ratas Sprague-Dawley hembras, ovariectomizadas, de 60 días. Las intervenciones quirúrgicas se realizan un mínimo de 8 días antes del primer tratamiento. Los animales se alojan de forma individual con un ciclo de 12 h de luz/oscuridad, y reciben pienso estándar para ratas y agua ad libitum.

Se incluyen dos grupos testigo en cada estudio. Se preparan dosis basadas en el peso medio corporal del grupo en mg/kg, bien en DMSO al 10% en aceite de sésamo (estudios por vía subcutánea) o bien en Tween 80 al 1,0% en disolución salina (estudios por vía oral). Se administran los compuestos de ensayo a los animales, en dosis que oscilan de 0,01 hasta 10 mg/kg de peso medio corporal del grupo en mg/kg. Se incluyen grupos testigo con vehículo y etinil-estradiol (EE) (0,1 mg/kg, por vía subcutánea, o 0,3 mg/kg, por vía oral) en cada ensayo. Cuando se analiza la actividad antagonista de los compuestos, se coadministra EE a 0,1 ó 0,3 mg/kg para los estudios por vía subcutánea u oral, respectivamente. Los compuestos de ensayo se administran hasta el día en que se mide la temperatura de la piel de la cola.

Después de un período de aclimatación de cuatro días, los animales se tratan una vez al día con el compuesto o compuestos de interés. Hay 10 animales/grupo de tratamiento. La administración del compuesto se realiza bien por inyección subcutánea de 0,1 ml en la nuca, o por vía oral en un volumen de 0,5 ml. En el tercer día de tratamiento se implanta por vía subcutánea un pelete de morfina (75 mg de sulfato de morfina). En el 5º día de tratamiento se implantan uno o dos peletes adicionales de morfina. En el octavo día, se inyecta ketamina (80 mg/kg, por vía intramuscular) a aproximadamente la mitad de los animales y se pega un termopar, conectado a un sistema de adquisición de datos MacLab (API Instruments, Milford, MA) en la cola, a una distancia de aproximadamente una pulgada (2,54 cm) desde el inicio de la cola. Este sistema permitió la medición continua de la temperatura de la piel de la cola. Se mide la temperatura inicial durante 15 min, y después se administra naloxona (1,0 mg/kg) por vía subcutánea (0,2 ml) para bloquear el efecto de la morfina, y a continuación se midió la temperatura de la piel de la cola durante una hora. En el noveno día, se preparan y analizan de forma similar el resto de los animales.

Ejemplo 66 Función vasomotora en anillos aórticos aislados de rata

Se dividen ratas Sprague-Dawley (240-260 gramos) en 4 grupos:

1.: Normales, no ovariectomizadas (intactas)

2.: Ovariectomizadas (ovex), tratadas con vehículo

3.: Ovariectomizadas, tratadas con 17\beta-estradiol (1 mg/kg/día)

4.: Animales ovariectomizados tratados con el compuesto de ensayo (es decir, 1 mg/kg/día)

Los animales se someten a ovariectomía aproximadamente 3 semanas antes del tratamiento. Cada animal recibe 1 mg/kg/día de sulfato de 17\beta-estradiol o del compuesto de ensayo suspendido en agua destilada y desionizada con Tween-80 al 1%, mediante sonda nasogástrica. Los animales tratados con vehículo recibieron un volumen adecuado del vehículo utilizado en los grupos de tratamiento con fármaco.

Los animales se sacrifican por inhalación de CO_{2} y sangrado. Se retiran rápidamente las aortas torácicas y se colocan en disolución fisiológica a 37ºC que tenía la siguiente composición (mM): NaCl (54,7), KCl (5,0), NaHCO_{3} (25,0), MgCl_{2} 2H_{2}O (2,5), D-glucosa (11,8) y CaCl_{2} (0,2), burbujeada con gas CO_{2}-O_{2}, 95%/5%, para obtener un pH final de 7,4. Se elimina la túnica adventicia de la superficie externa, y el vaso se corta en anillos de 2-3 mm de anchura. Los anillos se suspenden en 10 ml de baño de tejidos con un extremo atado al fondo del baño y el otro extremo a un transductor de fuerza. Se ejerce una tensión en reposo de 1 gramo sobre los anillos. Los anillos se equilibran durante 1 hora, y las señales se miden y se analizan.

Tras el equilibrado, los anillos se exponen a concentraciones crecientes de fenilefrina (10^{-8} a 10^{-4} M), y se registra la tensión. Después los baños se lavan 3 veces con tampón nuevo. Tras el lavado, se añade L-NAME 200 mM al baño de tejidos y se equilibra durante 30 minutos. A continuación se repite la curva de respuesta a la concentración de fenilefrina.

Ejemplo 67 Laberinto radial de ocho brazos - Mejora de la capacidad cognitiva

Se utilizaron ratas CD Sprague-Dawley machos (Charles River, Kingston, NY) de 200-250 g de peso inicial. Las ratas se alojan durante una semana, seis por jaula, y reciben pienso estándar de laboratorio y agua ad libitum. El alojamiento tiene lugar en una habitación de tipo colonia mantenida a 22ºC, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, con la luz encendida a las 6:00 de la mañana. Tras la habituación a las instalaciones, los animales se alojan de forma individual y se mantienen al 85% del peso obtenido con alimentación libre. Una vez alcanzados pesos estables, las ratas se aclimatan al laberinto radial de 8 brazos.

La estructura del laberinto es una adaptación del descrito por Peele y Baron (Pharmacology, Biochemistry, and Behavior, 29:143-150, 1988). El laberinto está elevado a una altura de 75,5 cm y se compone de un área circular rodeada de 8 brazos que se extienden de forma radial a partir del centro y son equidistantes entre sí. Cada brazo tiene unas dimensiones de 58 cm de longitud x 13 cm de anchura. Se hace descender un cilindro transparente de plexiglás para rodear al animal en la porción central del laberinto antes del comienzo de cada sesión. Cada brazo del laberinto está provisto de 3 juegos de células fotoeléctricas conectadas mediante interfaz a una unidad de adquisición de datos, que está conectada su vez mediante interfaz a un ordenador. Las células fotoeléctricas se utilizan para seguir el movimiento de la rata en el laberinto. Conductos de distribución de peletes situados por encima de vasos de comida al final de cada brazo dispensaban dos peletes de chocolate de 45 mg cuando la célula fotoeléctrica exterior del brazo se activaba por primera vez en una sesión dada. El laberinto está situado en una cámara de pruebas con paneles geométricos blancos y negros en cada pared, que servían de referencia. Durante todos los procedimientos de entrenamiento y de pruebas se oye ruido blanco (\sim70 db).

El procedimiento de entrenamiento consta de cinco fases, cada una con sesiones diarias de 5 ó 10 minutos. Se intercala un retardo de 10 segundos entre el tiempo en el que la rata se coloca en la porción central del laberinto y el momento en el que se eleva el cilindro para comenzar la sesión. Durante la fase 1, se colocan en el laberinto pares de ratas, sin acceso previo a alimentos, durante 10 minutos con peletes de chocolate de 45 mg dispersos en los 8 brazos del laberinto. Durante la fase II, cada rata se coloca de forma individual en el laberinto durante un período de 10 minutos, con peletes dispersos a partir de la célula fotoeléctrica del medio hasta el vaso de comida de cada brazo. Durante la fase III, cada rata se coloca en el laberinto durante un periodo 10 minutos, con peletes de comida situados solamente en los vasos de comida y en sus proximidades, en cada brazo. En la fase IV, se deja a cada rata 10 minutos para recoger dos peletes de cada brazo. La entrada de nuevo en un brazo se considera un error. Las ratas se entrenan diariamente de esta manera hasta que alcanzan un criterio de rendimiento menor o igual a 2 errores totales en tres días consecutivos de entrenamiento. El tiempo total de habituación y entrenamiento es aproximadamente 3 semanas.

El compuesto de ensayo se prepara en disolución salina tamponada con fosfato, y se administra en un volumen de 1 ml/kg. El HBr de escopolamina (0,3 mg/kg por vía subcutánea) servía como agente perturbador, que producía un aumento en la tasa de error (pérdida de memoria). El compuesto de ensayo se administra por vía intraperitoneal de forma simultánea con escopolamina, 30 minutos antes de la primera exposición al laberinto en cualquier día del ensayo.

Para evaluar el compuesto de ensayo, se diseña un cuadrado latino 8 x 8 equilibrado para medidas repetidas, con el objeto de lograr una alta eficacia experimental con una cantidad mínima de animales. Se llevan a cabo ocho sesiones experimentales, dos por semana, con los 8 tratamientos (vehículo, escopolamina, 3 dosis del compuesto de ensayo en combinación con escopolamina) aleatorizados en cada sesión. Cada tratamiento siguió a cada uno de los otros tratamientos el mismo número de veces. Por consiguiente, se pudo calcular el efecto residual de cada tratamiento y eliminarse del efecto directo del tratamiento. Tras realizar el ANOVA, se llevan a cabo múltiples comparaciones utilizando la prueba bilateral de Dunnett en las medias ajustadas.

Se consideró que los animales que no realizaron 4 elecciones correctas en el plazo de 5 minutos durante la primera exposición, o que no habían realizado un total de 8 elecciones al final de la 2ª exposición, habían "agotado el tiempo transcurrido" para dicha sesión. Cualquier animal que "agota el tiempo transcurrido" tras la administración de más de una dosis del compuesto de ensayo se excluye del análisis.

Ejemplo 68 Neuroprotección Inhibición de la muerte, dependiente del tiempo, de células en cultivos de neuronas corticales primarias

Se extrajeron neuronas corticales primarias de cerebros de rata que tenían 0-1 día, utilizando una variación de los métodos descritos por Monyer et al. 1989, Brain Research 483:347-354. El tejido cerebral dispersado se hizo crecer en DMEM/PDHS (suero de yegua preñada) al 10% durante tres días, y después se trató con arabinósido de citosina (ARC) durante dos días, para eliminar las células gliales contaminantes. En el día 5, se eliminó el medio con ARC y se sustituyó con DMEM/PDHS al 10%. Las células neuronales se cultivaron durante otros 4-7 días antes de su utilización.

Los cultivos testigo de células neuronales primarias presentaron muerte celular progresiva entre los días 12 y 18 del cultivo. Se evaluaron doce cultivos en los días 12 y 16 para determinar los niveles de la enzima lactato-deshidrogenasa (LD) tras la adición del compuesto de ensayo a 6 cultivos mantenidos en DMEM y PDHS al 10% en el día 9, y manteniendo el resto de los cultivos como testigos. La LD se evaluó utilizando una variación del método descrito por Wroblewski et al. 1955, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 90: 210-213. La LD es una enzima citosólica que se utiliza habitualmente tanto en investigación clínica como en investigación básica para determinar la viabilidad de los tejidos. Un aumento en la LD del medio está directamente relacionado con la muerte celular.

Neuroprotección frente a la citotoxicidad inducida por hipoglucemia

Células de glioma C6 obtenidas de la ATCC se sembraron en medio RPMI con FBS a una concentración de 1 x 10^{6} células/ml en matraces FALCON de cultivo de tejidos de 25 cm^{2}. Cuatro horas antes del inicio de la hipoglucemia se desechó el medio de mantenimiento, las monocapas se lavaron dos veces en el medio adecuado, y después se incubaron durante cuatro horas a 37ºC en suero libre o en suero libre más compuesto de ensayo. Se utilizó tampón de fosfato de Krebs-Ringer para lavar las monocapas dos veces antes de la adición del tratamiento apropiado con glucosa. El medio RPMI contiene 2 mg de glucosa/ml; los matraces se dividieron en grupos de 6, cada uno de los cuales recibió glucosa al 100% (2 mg/ml), glucosa al 80% (1,6 mg/ml), glucosa al 60% (1,2 mg/ml) o glucosa al 0% (tampón), o bien recibió compuesto de ensayo. Todos los matraces se incubaron durante 20 horas y se evaluaron a continuación para determinar el número de células totales, vivas y muertas, utilizando azul de tripán.

Neuroprotección contra aminoácidos excitotóxicos

Cinco placas de cultivo celular que contenían células de neuroblastoma SK-N-SH se trataron con el compuesto de ensayo, y 5 placas de cultivo celular se trataron con medio RPMI. Cuatro horas después, todas las células se trataron con NMDA (500 \muM) durante 5 minutos. A continuación se determinaron las células vivas y las células muertas totales.

Neuroprotección contra la privación de oxígeno-glucosa

Análisis de núcleos picnóticos para medir la apoptosis: Se preparan neuronas corticales a partir de fetos de ratas E18, y se siembran en portaobjetos de cámara de 8 pocillos previamente recubiertos con poli-D-lisina (10 ng/ml) y suero, a una densidad de 100.000 células/pocillo. Las células se siembran en medio DMEM con alta concentración de glucosa que contenía FCS al 10%, y se mantienen en el incubador a 37ºC con 10% de CO_{2}/90% de aire. Al día siguiente, el suero se elimina sustituyendo el medio de cultivo con medio DMEM con alta concentración de glucosa que contenía suplemento B27, y las células se mantienen en el incubador sin cambiar el medio hasta el día del experimento. En el día 6, los portaobjetos se dividen en dos grupos: el grupo testigo y el grupo OGD. Las células en el grupo testigo reciben DMEM con glucosa y B27 a medida (sin antioxidantes). Las células en el grupo OGD reciben DMEM sin glucosa, con B27 a medida, que había sido desgasificado a vacío durante 15 min. Las células reciben una corriente de 90% de N_{2}/10% de CO_{2} durante 10 min. en una cámara hermética, y se incuban a 37ºC durante 6 h. Tras 6 h, tanto las células testigo como las células OGD se someten a un cambio del medio que contenía vehículo (DMSO) o compuesto de ensayo en medio DMEM con glucosa y B27 a medida. Las células se devuelven al incubador normóxico a 37ºC. Tras 24 h, las células se fijan en PFA al 4% durante 10 min. a 4ºC, y se tiñen con Topro (colorante fluorescente que se une
a los núcleos). La apoptosis se evalúa utilizando un citómetro de barrido con láser, midiendo los núcleos picnóticos.

Medición de la liberación de LDH como indicador de la muerte celular: Se preparan neuronas corticales a partir de fetos de ratas E18 y se siembran en placas de cultivo de 48 pocillos, previamente recubiertas con poli-D-lisina (10 ng/ml) y suero a una densidad de 150.000 células/pocillo. Las células se siembran en medio DMEM con alta concentración de glucosa que contenía FCS al 10%, y se mantienen en el incubador a 37ºC con 10% de CO_{2}/90% de aire. Al día siguiente, el suero se elimina sustituyendo el medio de cultivo con medio DMEM con alta concentración de glucosa que contenía suplemento B27. En el día 6, se dividen las células en dos grupos: el grupo testigo y el grupo OGD. Las células en el grupo testigo reciben DMEM con glucosa y B27 a medida (sin antioxidantes). Las células en el grupo OGD reciben DMEM sin glucosa y B27 a medida, que había sido desgasificado en vacío durante 15 min. Las células reciben una corriente de 90% de N_{2}/10% de CO_{2} durante 10 min. en una cámara hermética, y se incuban a 37ºC durante 6 h. Tras 6 h, tanto las células testigo como las células OGD se someten a un cambio de medio que contenía vehículo (DMSO) o compuesto de ensayo en medio DMEM con glucosa y B27 a medida. Las células se devuelven al incubador normóxico a 37ºC. Tras 24 h, se evalúa la muerte celular midiendo la liberación celular de LDH (lactato-deshidrogenasa) en el medio de cultivo. Para el ensayo de la LDH, se transfiere una parte alícuota de 50 \mul de medio de cultivo a una placa de 96 pocillos. Tras la adición de 140 \mul de tampón de fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,5) y 100 \mul de NADH 0,2 mg/ml, la placa se deja reposar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min. La reacción se inicia mediante la adición de 10 \mul de piruvato de sodio. La placa se lee inmediatamente a 340 nm en un lector de placas Thermomax (Molecular Devices). Se registra la absorbancia, un indicador de la concentración de NADH, cada 6 segundos durante 5 minutos, y para calcular la actividad LDH se utiliza la pendiente que indica la velocidad de desaparición de NADH.

Actividad LDH (U/ml) = (\spadesuitA/min)(TCF)(20)(0,0833)/(0,78),

en la que:

0,0833 = constante de proporcionalidad

0,78 = longitud del paso de luz del instrumento (cm)

Ejemplo 69 Procedimiento de ensayo en ratas HLA - Enfermedad de Crohn y trastornos inflamatorios intestinales

Se obtienen ratas HLA-B27 machos de Taconic, y se les proporciona acceso libre a alimentos (dieta 5001 de PMI Lab) y agua. Al comienzo del estudio las ratas tienen 22-26 semanas.

Las ratas reciben dosis subcutáneas, una vez al día durante siete días, de una de las formulaciones presentadas a continuación. Hay cinco ratas en cada grupo, y la última dosis se administra dos horas antes del sacrificio.

\bullet: Vehículo (DMSO al 50%/PBS de Dulbecco al 50%)

\bullet: 17\beta-etinil-17\beta-estradiol (10 \mug/kg)

\bullet: Compuesto de ensayo

Se observa diariamente la calidad de las heces, y se puntúa de acuerdo con la siguiente escala: diarrea = 3; heces blandas = 2; heces normales = 1. Al final del procedimiento de ensayo se extrae suero y se conserva a -70ºC. Una sección del colon se prepara para el análisis histológico, y se analiza un segmento adicional para determinar la actividad mieloperoxidasa.

Se utiliza el método siguiente para medir la actividad de mieloperoxidasa. Se extrae tejido del colon y se congela instantáneamente en nitrógeno líquido. Se utiliza una muestra representativa del colon completo para garantizar la coherencia entre las muestras. El tejido se conserva a -80ºC hasta su utilización. Después, el tejido se pesa (aproximadamente 500 mg) y se homogeneiza en 1:15 p/v de tampón de lavado H_{2}KPO_{4} 5 mM (pH 6). El tejido se centrifuga a 20.000 x g en una centrifugadora Sorvall RC5B, durante 45 minutos a 2-8ºC. El sobrenadante se desecha luego. El tejido se resuspende y se homogeneiza en 2,5 ml (1:5 p/v) de H_{2}KPO_{4} 50 mM con EDTA 10 mM y bromuro de hex-amonio al 0,5%, para facilitar la solubilización de la MPO intracelular. El tejido se congela en nitrógeno líquido, se descongela en un baño de agua a 37ºC, y se somete a ultrasonidos durante 15 segundos, para garantizar la lisis de las membranas. Este procedimiento se repite 3 veces. Las muestras se mantienen después en hielo durante 20 minutos y se centrifugan a 12.000 x g durante 15 minutos a 2-8ºC. El sobrenadante se analiza después de dichas etapas.

La mezcla de ensayo se prepara añadiendo 2,9 ml de H_{2}KPO_{4} 50 mM con 0,167 de O-dianisidina/ml con H_{2}O_{2} al 0,0005% en un tubo de reacción. Cuando se degrada el peróxido de hidrógeno, la O-dianisidina se oxida y absorbe a 460 nm de forma dependiente de la concentración. La mezcla se calienta hasta 25ºC. Se añaden cien (100) \mul del sobrenadante del tejido al tubo de reacción, se incuba durante un minuto a 25ºC, a continuación se transfiere 1 ml a una cubeta de plástico desechable. Se mide la DO cada 2 minutos del tiempo de reacción, a 460 nm, frente a un blanco que contiene 2,9 ml de la mezcla de reacción y 100 \mul de la disolución de bromuro de amonio al 0,5%.

Las unidades de actividad enzimática se cuantifican comparando la absorbancia a 460 con una curva patrón preparada con MPO humana purificada, 31,1 unidades/vial. Se reconstituye la MPO y se diluye en serie utilizando H_{2}KPO_{4} 50 mM con EDTA 10 mM y bromuro de hex-amonio al 0,5% hasta cuatro concentraciones conocidas. Las absorbancias de la muestra se comparan frente a dicha curva para determinar la actividad.

El análisis histológico se realiza de la manera siguiente. El tejido del colon se sumerge en formol tamponado neutro al 10%. Cada espécimen de colon se separa en cuatro muestras para su evaluación. Los tejidos fijados con formol se procesan en un aparato de infiltración a vacío, para su inclusión en parafina. Las muestras se cortan a 5 \mum y se tiñen a continuación con hematoxilina y eosina (H&E) para las evaluaciones histológicas con ocultación de la identidad de la muestra, utilizando una escala modificada a partir de Boughton-Smith. Una vez completadas las puntuaciones, se identifican las muestras, y los datos se tabulan y se analizan empleando modelos lineales de ANOVA con comparaciones de medias múltiples.

Claims

1. Compuesto de fórmula:

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en la que

\quad: cada R^{8} es H; y

\quad: R^{9} es alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que:

\quad: R^{1} y R^{2} son, cada uno independientemente, H, halógeno, CN, fenilo no sustituido, o alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido.

3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto es de la fórmula:

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4. Compuesto según la reivindicación 1, en el que el compuesto es de la fórmula:

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5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R^{3}, R^{5} y R^{6} son, cada uno independientemente, H, Cl, F, metilo o metoxi, y R^{2} es H, Cl, F o metilo.

6. Compuesto según la reivindicación 1, que es:

(a) oxima del 4'-hidroxi-3-metil[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído;

(b) oxima del 4'-hidroxi[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído;

(c) oxima del 3-cloro-4'-hidroxi[1,1'-bifenil]-4-carbaldehído;

(d) oxima del 2-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído;

(e) oxima del 3-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído;

(f) oxima del 2-cloro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído;

(g) oxima del 3-cloro-4'-hidroxi-2'-metil-1,1'-bifenil-4-carbaldehído;

(h) oxima del 4'-hidroxi-2-metil-1,1'-bifenil-4-carbaldehído;

(i) oxima del 3-cloro-3'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído;

(j) oxima del 3-cloro-3', 5'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído;

(k) oxima del 3,5-dicloro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído;

(l) oxima del 3,5-dicloro-3'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído;

(m) oxima del 2,3-dicloro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído;

(n) oxima del 2,3-dicloro-3'-fluoro-4'-hidroxi-1,1'-bifenil-4-carbaldehído.

o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de estos.

7. Composición farmacéutica que comprende:

a): un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y

b): un vehículo farmacéutico.

8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso como medicamento.

9. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de un medicamento para la inhibición de oesteoporosis; la inhibición de osteoartritis, hipocalcemia, hipercalcemia, enfermedad de Paget, osteomalacia, osteohalistéresis, mieloma múltiple y otras formas de cáncer que tienen efectos perjudiciales en los tejidos óseos; la inhibición de crecimiento anómalo, benigno o maligno, de tejidos; la reducción de los niveles de colesterol, triglicéridos, Lp(a) y LDL; para inhibir la hipercolesterolemia, hiperlipidemia, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, insuficiencia venosa periférica, restenosis y vasoespasmo; para inhibir las lesiones en las paredes vasculares derivadas de acontecimientos celulares que dan lugar a lesiones vasculares de origen inmunitario; para la inhibición de trastornos patológicos provocados por radicales libres; para la provisión de potenciación o neuroprotección cognitiva; o el tratamiento o inhibición de demencias seniles, enfermedad de alzheimer, deterioro cognitivo, o trastornos neurodegenerativos; para la inhibición de la enfermedad inflamatoria intestinal, proctitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, y colitis, sofocos, atrofia vaginal o vulvar, vaginitis atrófica, sequedad vaginal, prurito, dispareunia, disuria, aumento en la frecuencia de micción, incontinencia urinaria, infecciones de las vías urinarias, síntomas vasomotores; alopecia androgénica, atrofia cutánea, acné, diabetes de tipo II, metrorragia funcional, o esterilidad; o la inhibición de leucemia, ablaciones del endometrio, enfermedad crónica renal o hepática, o enfermedades o trastornos de la coagulación, en un mamífero.