ES2298823T3 - Derivados de la oxima de (4-hidroxifenil)-1h-indol-3-carbaldehido como agentes estrogenos. - Google Patents

Abstract

Compuesto de fórmula: (Ver fórmula) en la que: R1 es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, halógeno, CN o alcoxi opcionalmente sustituido; R2 es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, o fenilo opcionalmente sustituido; o R1 y R2 pueden formar conjuntamente un anillo de 5 a 7 elementos; y R3 y R4 son cada uno, independientemente, H, OH, halógeno, CN, fenilo opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido o alcoxi opcionalmente sustituido; o su sal farmacéuticamente aceptable.

Description

Derivados de oxima de (4-hidroxifenil)-1H-indol-3-carbaldehído como agentes estrógenos.

La presente invención se refiere a derivados de la oxima de (hidroxifenil)-1H-indol-3-carbaldehído, a sus utilizaciones como agentes estrógenos y a los procedimientos para su preparación.

Antecedentes de la invención

Los efectos pleótropos de los estrógenos en los tejidos de mamíferos han sido bien documentados, y actualmente se aprecia que los estrógenos afectan a muchos sistemas orgánicos [Mendelsohn y Karas, New England Journal of Medicine 340: 1801-1811 (1999), Epperson, et al., Psychosomatic Medicine 61: 676-697 (1999), Crandall, Journal of Womens Health & Gender Based Medicine 8: 1155-1166 (1999), Monk y Brodaty, Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 11: 1-10 (2000), Hurn y Macrae, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 20: 631-652 (2000), Calvin, Maturitas 34: 195-210 (2000), Finking, et al., Zeitschrift fur Kardiologie 89: 442-453 (2000), Brincat, Maturitas 35: 107-117 (2000), Al-Azzawi, Postgraduate Medical Journal 77: 292-304 (2001)]. Los estrógenos pueden ejercer efectos en los tejidos de varias maneras. Probablemente, el mecanismo de acción mejor caracterizado es su interacción con los receptores de estrógenos que conducen a alteraciones en la transcripción génica. Los receptores de estrógenos son factores de transcripción de ligando activado y pertenecen a la superfamilia nuclear del receptor de la hormona. Otros miembros de esta familia incluyen los receptores de progesterona, andrógenos, glucocorticoides y mineralcorticoides. En la unión del ligando, estos receptores dimerizan y pueden activar la transcripción génica uniéndose directamente a secuencias específicas en el ADN (conocidas como elementos de respuesta) o interactuando con otros factores de transcripción (tal como AP1), que a su vez se unen directamente a las secuencias específicas del ADN [Moggs y Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001), McDonnell, Principles of Molecular Regulation, págs. 351-361 (2000)]. Una clase de proteínas "correguladoras" pueden interactuar también con el receptor unido al ligando y además modulan su actividad de transcripción [McKenna, et al., Endocrine Reviews 20: 321-344 (1999)]. Se ha demostrado también que los receptores de estrógenos pueden suprimir la transcripción mediada por NF\kappaB de manera tanto dependiente como independiente del ligando [Quaedackers, et al., Endocrinology 142: 1156-1166 (2001), Bhat, et al., Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 67: 233-240 (1998), Pelzer, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 286: 1153-7 (2001)].

Los receptores de estrógenos también pueden ser activados por fosforilación. Esta fosforilación está mediada por factores de crecimiento tal como EGF y produce cambios en la transcripción génica en ausencia de ligando [Moggs y Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001)].

Un medio no tan bien caracterizado mediante el cual los estrógenos pueden afectar a las células se cree que es un receptor denominado membranario. La existencia de dicho receptor es discutible, pero se ha comprobado que los estrógenos pueden producir respuestas no genómicas muy rápidas en las células. La entidad molecular responsable para transducir estos efectos no se ha aislado definitivamente, pero existen pruebas que sugieren que está relacionada por lo menos con las formas nucleares de los receptores de estrógenos [Levin, Journal of Applied Physiology 91: 1860-1867 (2001), Levin, Trends in Endocrinology & Metabolism 10: 374-377 (1999)].

Hasta el momento, se han descubierto dos receptores de estrógenos. El primer receptor de estrógenos se clonó aproximadamente hace 15 años y se denomina actualmente ER\alpha [Green, et al., Nature 320: 134-9 (1986)]. El segundo se descubrió en fechas comparativamente recientes y se denomina ER\beta [Kuiper, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 5925-5930 (1996)]. Los trabajos iniciales sobre ER\beta se centraron en definir su afinidad para una variedad de ligandos y, de hecho, se apreciaron algunas diferencias con ER\alpha. La distribución del tejido de ER\beta se ha cartografiado bien en roedores y no es coincidente con la de ER\alpha. Tejidos tales como el de útero de ratón y de rata expresan principalmente a ER\alpha, mientras que el pulmón de ratón y rata expresa principalmente a ER\beta [Couse, et al., Endocrinology 138: 4613-4621 (1997), Kuiper, et al., Endocrinology 138: 863-870 (1997)]. Incluso dentro del mismo órgano, la distribución de ER\alpha y ER\beta puede estar compartimentada. Por ejemplo, en el ovario de ratón, ER\beta está muy expresado en las células granulosas y ER\alpha está restringido a las células tecales y del estroma [Sar y Welsch, Endocrinology 140: 963-971 (1999), Fitzpatrick, et al., Endocrinology 140: 2581-2591 (1999)]. Sin embargo, existen ejemplos en los que los receptores están expresados conjuntamente y existen pruebas de estudios in vitro de que ER\alpha y ER\beta pueden formar heterodímeros [Cowley, et al., Journal of Biological Chemistry 272: 19858-19862 (1997)].

El estrógeno endógeno más potente es el 17\beta-estradiol. Se ha descrito un gran número de compuestos que simulan o bloquean la actividad del 17\beta-estradiol. Los compuestos que tienen aproximadamente los mismos efectos biológicos que el 17\beta-estradiol se denominan "agonistas del receptor de estrógenos". Los que bloquean los efectos del 17\beta-estradiol, cuando se proporcionan en combinación con éste, se denominan "antagonistas del receptor de estrógenos". En realidad, existe una continuidad entre la actividad del agonista del receptor de estrógenos y del antagonista del receptor de estrógenos y algunos compuestos se comportan como agonistas del receptor de estrógenos en algunos tejidos pero como antagonistas del receptor de estrógenos en otros. Estos compuestos con actividad mixta se denominan moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM) y son agentes terapéuticamente útiles (por ejemplo EVISTA) [McDonnell, Journal of the Society for Gynecologic Investigation 7: S10-S15 (2000), Goldstein, et al., Human Reproduction Update 6: 212-224 (2000)]. La razón exacta de por qué el mismo compuesto puede tener efectos específicos para las células no se ha aclarado, pero se han sugerido las diferencias en la configuración del receptor y/o en el medio de las proteínas correguladoras.

Se ha conocido durante algún tiempo que los receptores de estrógenos adoptan diferentes configuraciones cuando se unen a ligandos. Sin embargo, la consecuencia y sutileza de estos cambios solamente se ha puesto de manifiesto recientemente. Las estructuras tridimensionales de ER\alpha y ER\beta se han resuelto por cristalización conjunta con varios ligandos y demuestran claramente la recolocación de la hélice 12 en presencia de un antagonista del receptor de estrógenos, que impide estéricamente las secuencias proteicas requeridas para la interacción de la proteína del receptor corregulador [Pike, et al., Embo 18: 4608-4618 (1999), Shiau, et al., Cell 95: 927-937 (1998)]. Además, la técnica de presentación del fago se ha utilizado para identificar péptidos que interactúan con receptores de estrógenos en presencia de diferentes ligandos [Paige, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 3999-4004 (1999)]. Por ejemplo, se identificó un péptido que distinguía entre ER\alpha unido a todos los agonistas del receptor de estrógenos 17\beta-estradiol y dietilestilbestrol. Se demostró que un péptido diferente distinguía entre clomifeno unido a ER\alpha y ER\beta. Estos datos indican que cada ligando coloca potencialmente al receptor en una configuración única e impredecible que es probablemente la que tiene distintas actividades biológicas.

Tal como se mencionó anteriormente, los estrógenos afectan a un conjunto de procesos biológicos. Además, donde se han descrito diferencias de género (por ejemplo frecuencias y respuestas de la enfermedad a la prueba de provocación, etc.), es posible que la explicación implique la diferencia en las concentraciones de estrógeno entre machos y hembras.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a derivados de la oxima de (hidroxifenil)-1H-indol-3-carbaldehído. En determinados aspectos, la invención se refiere a compuestos de fórmula I:

1

en la que:

R_{1} es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, halógeno, CN o alcoxi opcionalmente sustituido;

R_{2} es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o fenilo opcionalmente sustituido; o

R_{1} y R_{2} pueden formar conjuntamente un anillo de 5 a 7 elementos; y

R_{3} y R_{4} son cada uno, independientemente, H, OH, halógeno, CN, fenilo opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido o alcoxi opcionalmente sustituido; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

En determinadas formas de realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el compuesto 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otras formas de realización, la invención se refiere a la utilización de dichos compuestos en el tratamiento o prevención de enfermedades tales como las enfermedades inflamatorias del intestino.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona compuestos estrógenos de fórmula I, que resultan útiles en el tratamiento y/o prevención de enfermedades tales como las enfermedades inflamatorias del intestino (incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis).

2

en la que R_{1} es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, halógeno, CN o alcoxi opcionalmente sustituido; R_{2} es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o fenilo opcionalmente sustituido; o R_{1} y R_{2} pueden formar conjuntamente un anillo de 5 a 7 elementos; y R_{3} y R_{4} son cada uno, independientemente, H, OH, halógeno, CN, fenilo opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido o alcoxi opcionalmente sustituido; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

En determinadas formas de realización del compuesto 1, R_{1} es alquilo, preferentemente alquilo inferior, por ejemplo metilo. En otras formas de realización, R_{2} es hidrógeno, o alquilo, preferentemente alquilo inferior, por ejemplo metilo. Otras formas de realización abarcan composiciones en las que R_{1} y R_{2} conjuntamente forman un anillo de 6 elementos. En algunas formas de realización, R_{3} es H, halógeno o CN. R_{4} es hidrógeno en algunas formas de realización. En algunas otras formas de realización, R_{4} es fluoro. En algunas formas de realización, R_{4} es orto
fluoro.

Pueden formarse sales farmacéuticamente aceptables a partir de ácidos orgánicos e inorgánicos, por ejemplo, acético, propiónico, láctico, cítrico, tartárico, succínico, fumárico, maleico, malónico, mandélico, málico, ftálico, clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, metansulfónico, naftalensulfónico, bencensulfónico, toluensulfónico, alcanforsulfónico y adyuvantes aceptables igualmente conocidos cuando un compuesto de la presente invención contiene un resto básico. Asimismo, pueden formarse sales a partir de bases orgánicas e inorgánicas, tales como las sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio, litio o potasio) sales de metales alcalinotérreos, sales de amonio, sales de alquilamonio que contienen 1 a 6 átomos de carbono o sales de dialquilamonio que contienen 1 a 6 átomos de carbono en cada grupo alquilo, y sales de trialquilamonio que contienen 1 a 6 átomos de carbono en cada grupo alquilo, cuando un compuesto de la presente invención contiene un grupo ácido.

El término "alquilo", tal como se utiliza en la presente memoria, si se utiliza solo o como parte de otro grupo, se refiere a una cadena hidrocarbonada alifática sustituida o no sustituida e incluye, pero no se limita a cadenas lineales y ramificadas que contienen de 1 a 12 átomos de carbono, preferentemente de 1 a 6 átomos de carbono, a menos que se especifique explícitamente de otra manera. Por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, i-butilo y t-butilo están comprendidos dentro del término "alquilo". Se incluyen específicamente dentro de la definición de "alquilo" aquellas cadenas hidrocarbonadas alifáticas que están opcionalmente sustituidas. La expresión "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, en algunas formas de realización de 1 a 3 átomos de carbono. El término "alcoxi", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere al grupo R-O- en el que R es un grupo alquilo preferentemente de 1 a 6 átomos de carbono.

El número de carbonos tal como se utiliza en las definiciones en la presente memoria se refiere a un eje central de carbono y a la ramificación de carbono, pero no incluye los átomos de carbono de los sustituyentes, tales como las sustituciones alcoxi y similares.

El término "fenilo", tal como se utiliza en la presente memoria, si se utiliza solo o como parte de otro grupo, se refiere a un grupo fenilo sustituido o no sustituido.

Un alquilo, alquenilo y fenilo opcionalmente sustituidos pueden estar sustituidos con uno o más sustituyentes. Los sustituyentes opcionalmente adecuados pueden seleccionarse independientemente de entre nitro, ciano, -N(R_{11})(R_{12}), halo, hidroxi, carboxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, alquilalcoxi, alcoxicarbonilo, alcoxialcoxi, perfluoroalquilo, perfluoroalcoxi, arilalquilo, alquilarilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, alquiltio, -S(O)_{2}-N(R_{11})(R_{12}), -C(=O)-N(R_{11})(R_{12}), (R_{11})(R_{12})N-alquilo, (R_{11})(R_{12})N-alcoxialquilo, (R_{11})(R_{12})N-alquilariloxi-alquilo, -S(O)_{s}-arilo (en el que s=0-2) o -S(O)_{s}-heteroarilo (en el que s=0-2). En determinadas formas de realización de la invención, los sustituyentes preferidos para alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo o fenilo incluyen nitro, ciano, -N(R_{11})(R_{12}), halo, hidroxilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, alcoxialquilo y alcoxicarbonilo. En determinadas formas de realización de la invención, los sustituyentes preferidos para arilo y heteroarilo incluyen -N(R_{11})(R_{12}), alquilo, halo, perfluoroalquilo, perfluoroalcoxi, arilalquilo y alquilarilo. R_{11} y R_{12} se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno y alquilo.

El término "alquenilo", tal como se utiliza en la presente memoria, si se utiliza solo o como parte de otro grupo, se refiere a una cadena hidrocarbonada alifática no sustituida e incluye, pero no se limita a, cadenas lineales y ramificadas que tienen 2 a 8 átomos de carbono y que contienen por lo menos un doble enlace. Preferentemente, el grupo alquenilo tiene 1 ó 2 dobles enlaces. Dichos grupos alquenilo pueden existir en las configuraciones E o Z y los compuestos de la presente invención incluyen ambas configuraciones. Se incluyen específicamente en la definición de "alquenilo" aquellas cadenas hidrocarbonadas alifáticas que están opcionalmente sustituidas. Heteroátomos, tales como O, S o N-R, unidos a un alquenilo no deberían estar unidos a otro átomo de carbono que esté unido a un doble
enlace.

Cuando se utiliza en la presente memoria el término alquinilo se refiere a una cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, alifática que tiene de 2 a 7 átomos de carbono que puede contener 1 a 3 triples enlaces. Cuando se utiliza en la presente memoria, el término cicloalquilo se refiere a un anillo monocarbocíclico que tiene de 3 a 8 átomos de carbono, por ejemplo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. Cuando se utiliza en la presente memoria, solo o como parte de un grupo, el término arilo se refiere a un anillo mono- o bi-carbocíclico aromático de 5 a 13 elementos tal como fenilo o naftilo. Preferentemente, los grupos que contienen restos arilo son monocíclicos con 5 a 7 átomos de carbono en el anillo. Cuando se utiliza en la presente memoria solo o como parte de un grupo el término heteroarilo se refiere a un anillo mono o bicíclico aromático que contiene de 5 a 13 elementos de carbono que tiene uno a cinco heteroátomos que independientemente pueden ser nitrógeno, oxígeno o azufre. Preferentemente, los grupos que contienen restos heteroarilo son monocíclicos con 5 a 7 elementos en el anillo donde uno o dos de los elementos del anillo se seleccionan independientemente de entre nitrógeno, oxígeno o azufre. Los grupos arilo adecuados incluyen furanilo, tienilo, piridinilo, indolilo y quinolilo.

Ejemplos de alquilos y alquenilos sustituidos por halógeno incluyen 1-bromovinilo, 1-fluorovinilo, 1,2-difluorovinilo, 2,2-difluorovinilo, 1,2,2-trifluorovinilo, 1,2-dibromoetano, 1,2 difluoroetano, 1-fluoro-2-bromoetano, CF_{2}CF_{3}, CF_{2}CF_{2}CF_{3} y similares.

El término halógeno incluye bromo, cloro, flúor y yodo, preferentemente bromo, cloro o flúor.

Tal como se utiliza según la presente invención, el término "proporcionar", con respecto a proporcionar un compuesto o sustancia comprendido por la presente invención, significa administrar directamente dicho compuesto o sustancia, o administrar un derivado, o halógeno que forme la cantidad eficaz del compuesto o sustancia dentro del cuerpo.

Los reactivos utilizados en la preparación de los compuestos de la presente invención pueden conseguirse comercialmente o pueden prepararse por los procedimientos habituales descritos en la bibliografía.

En los siguientes Esquemas 1 a 3 se describe la preparación de varios ejemplos representativos de la presente invención.

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Esquema 1

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3

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Esquema 2

4

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Esquema 3

5

Los compuestos de la presente invención son moduladores del receptor de estrógenos útiles en el tratamiento o inhibición de afecciones, trastornos o enfermedades que están por lo menos mediadas en parte por una carencia o exceso de estrógeno, o que pueden ser tratados o inhibidos mediante la utilización de un agente estrogénico. Los compuestos de la presente invención son particularmente útiles en el tratamiento de una paciente perimenopáusica, menopáusica o posmenopáusica en la que las concentraciones de estrógenos endógenos producidas están muy disminuidas. La menopausia se define generalmente como el último periodo de menstruación natural y se caracteriza por la interrupción de la función ovárica, lo que conduce a la disminución sustancial del estrógeno circulante en el torrente sanguíneo. Tal como se utiliza en la presente memoria, la menopausia incluye también afecciones de la producción disminuida de estrógenos que pueden ser producidas quirúrgica o químicamente por una enfermedad que conduce a la disminución prematura o a la interrupción de la función ovárica.

Por consiguiente, los compuestos de la presente invención son útiles en el tratamiento o inhibición de la osteoporosis y en la inhibición de la desmineralización ósea, lo que puede producir un desequilibrio en la formación en el individuo de nuevos tejidos óseos y la reabsorción de tejidos más viejos, lo que conduce a una pérdida neta de hueso. Dicha eliminación ósea da como resultado una gama de individuos, particularmente en las mujeres posmenopáusicas, las mujeres que han experimentado ovariectomía bilateral, las que reciben o las que han recibido terapias prolongadas de corticoesteroides, las que experimentan disgenesia gonadal y las que padecen del síndrome de Cushing. Especiales necesidades para los huesos, incluyendo los dientes y los huesos bucales, el reemplazamiento puede estudiarse también utilizando estos compuestos en individuos con fracturas óseas, estructuras óseas defectuosas y los que se someten a intervenciones quirúrgicas óseas y/o a la implantación de prótesis. Además de los problemas descritos anteriormente, estos compuestos pueden utilizarse en el tratamiento o inhibición de la osteoartritis, hipocalcemia, hipercalcemia, enfermedad de Paget, osteomalacia, osteohalistéresis, mieloma múltiple y otras formas de cáncer con efectos perjudiciales en los tejidos óseos.

Los compuestos de la presente invención son útiles también en el tratamiento o inhibición del crecimiento de tejidos anormales benignos o malignos, incluyendo la hipertrofia prostática, liomiomas uterinos, cáncer de mama, endometriosis, cáncer de endometrio, síndrome del ovario poliquístico, pólipos de endometrio, mastopatía benigna, adenomiosis, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de próstata, cánceres de colon, cánceres del SNC, tal como glioma o astioblastomia.

Los compuestos de la presente invención son cardioprotectores y son útiles en la disminución de las concentraciones de colesterol, triglicéridos, Lp(a) y LDL; la inhibición o tratamiento de hipercolesterolemia; hiperlipidemia; cardiovasculopatía; ateroesclerosis; vasculopatía periférica; restenosis y vasoespasmo; y en la inhibición de la lesión de la pared vascular procedente de episodios celulares que conducen a la lesión vascular inmunomediada. Estas propiedades cardiovasculares protectoras son de gran importancia cuando se tratan pacientes posmenopáusicas con estrógenos para inhibir la osteoporosis y en varones cuando está indicada la terapia con estrógenos.

Los compuestos de la presente invención son también antioxidantes, y por consiguiente, resultan útiles en el tratamiento o inhibición de enfermedades producidas por radicales libres. Las situaciones específicas en las que se indica que la terapia antioxidante está garantizada son en cánceres, trastornos del sistema nervioso central, enfermedad de Alzheimer, osteopatías, envejecimiento, trastornos inflamatorios, vasculopatía periférica, artritis reumatoide, enfermedades autoinmunitarias, molestias respiratorias, enfisema, prevención de la lesión por reperfusión, hepatitis vírica, hepatitis crónica activa, tuberculosis, psoriasis, lupus eritematoso generalizado, síndrome de la disnea respiratoria del adulto, traumatismo del sistema nervioso central e ictus.

Los compuestos de la presente invención son también útiles al proporcionar la mejoría del conocimiento, y en el tratamiento o inhibición de demencias seniles, enfermedad de Alzheimer, disminución cognitiva, trastornos neurodegenerativos, aporte de neuroprotección o mejora del conocimiento.

Los compuestos de la presente invención son también útiles en el tratamiento o inhibición de la enfermedad inflamatoria del intestino, proctitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y colitis; afecciones menopáusicas, tales como los síntomas vasomotores incluyendo los sofocos, atrofia vaginal o vulvar, vaginitis atrófica, sequedad vaginal, prurito, dispareunia, disuria, micción frecuente, incontinencia urinaria, infecciones del conducto urinario, síntomas vasomotores, incluyendo los sofocos, mialgia, artralgia, insomnio, irritabilidad y similares; calvicie de tipo masculino; atrofia de la piel; acné; diabetes tipo II; hemorragia disfuncional uterina; e infecundidad.

Los compuestos de la presente invención son útiles en enfermedades en las que presente ventajas la amenorrea, tales como la leucemia, ablaciones del endometrio, nefritis o hepatitis crónica o enfermedades o trastornos de coagulación.

Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse como agentes anticonceptivos, particularmente cuando se combinan con una progestina.

Cuando se administran para el tratamiento o inhibición de una determinada enfermedad o trastorno, se entiende que la dosificación eficaz puede variar dependiendo del compuesto específico utilizado, del modo de administración, de la afección y gravedad de la misma, de la afección en tratamiento, así como de varios factores físicos relacionados con el individuo en tratamiento. La administración eficaz de los compuestos de la presente invención puede proporcionarse en una dosis oral desde aproximadamente 0,1 mg/día hasta aproximadamente 1.000 mg/día. Preferentemente, la administración será desde aproximadamente 10 mg/día hasta aproximadamente 600 mg/día, más preferentemente desde aproximadamente 50 mg/día hasta aproximadamente 600 mg/día, en una sola dosis o en dos o más dosis divididas. Las dosis diarias programadas es de esperar que varíen con la vía de administración.

Dichas dosis pueden administrarse de cualquier manera que sea útil para dirigir los compuestos activos en la presente memoria al torrente sanguíneo del receptor, incluyendo por vía oral, por vía de implante, por vía parenteral (incluyendo las inyecciones intravenosas, intraperitoneales y subcutáneas), por vía rectal, intranasal, vaginal y transdérmica.

Las formulaciones orales que contienen los compuestos activos de la presente invención pueden comprender cualquiera de las formas orales utilizadas de forma convencional, incluyendo comprimidos, cápsulas, formas bucales, grageas, pastillas y líquidos, suspensiones o soluciones bucales. Las cápsulas pueden contener mezclas del o de los compuestos activos, con cargas inertes y/o diluyentes tales como los almidones farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, almidón de maíz, patata o tapioca), azúcares, agentes edulcorantes artificiales, celulosas en polvo, tales como las celulosas cristalina y microcristalina, harinas, gelatinas, gomas, etc. Las formulaciones de comprimidos útiles pueden prepararse por procedimientos convencionales de compresión, granulación en húmedo o granulación en seco y utilizan diluyentes, agentes aglutinantes, lubricantes, disgregadores, agentes modificadores de superficie farmacéuticamente aceptables (incluyendo tensioactivos), agentes de suspensión o estabilizantes, incluyendo pero sin limitarse al estearato magnésico, ácido esteárico, talco, lauril-sulfato sódico, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa cálcica, polivinilpirrolidona, gelatina, ácido algínico, goma de acacia, goma xantana, citrato sódico, silicatos complejos, carbonato cálcico, glicina, dextrina, sacarosa, sorbitol, fosfato dicálcico, fosfato cálcico, lactosa, caolín, manitol, cloruro sódico, talco, almidones anhidros y azúcar en polvo. Los agentes modificadores de superficie preferidos incluyen los agentes modificadores de superficie no iónicos y aniónicos. Ejemplos representativos de agentes modificadores de superficie incluyen, pero no se limitan a poloxámero 188, cloruro de benzalconio, estearato cálcico, alcohol cetoestearílico, cera emulsionante cetomacrogol, ésteres de sorbitol, dióxido de silicio coloidal, fosfatos, dodecilsulfato sódico, silicato de magnesio y aluminio y trietanolamina. Las formulaciones bucales en la presente memoria pueden utilizar formulaciones habituales de liberación retardada o temporal para alterar la absorción del o de los compuesto(s) activo(s).
La formulación oral puede consistir también en la administración del ingrediente activo en agua o en zumo de frutas, que contiene disolventes o emulsionantes apropiados según se necesite.

En algunos casos puede ser deseable administrar los compuestos directamente a las vías respiratorias en forma de aerosol.

Los compuestos de la presente invención pueden administrarse también por vía parenteral o intraperitoneal. Pueden prepararse soluciones o suspensiones de estos compuestos activos en forma de base libre o sal farmacológicamente aceptable en agua de forma adecuada mezclada con un tensioactivo tal como la hidroxi-propilcelulosa. Pueden prepararse también dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y utilización, estas preparaciones contienen un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para su utilización inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esterilizadas y polvos esterilizados para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables esterilizadas. En todos los casos, la forma debe ser esterilizada y debe ser fluida hasta el punto que sea fácil de inyectar. Debe ser estable en las condiciones de preparación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales.

En la presente exposición, las administraciones transdérmicas incluyen todas las administraciones a través de la superficie del cuerpo y los recubrimientos internos de los conductos corporales incluyendo los tejidos epidérmico y de las mucosas. Dichas administraciones pueden realizarse utilizando los presentes compuestos, o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en lociones, cremas, espumas, parches, suspensiones, soluciones y supositorios (rectal y vaginal).

La administración transdérmica puede realizarse mediante la utilización de un parche transdérmico que contiene el compuesto activo y un vehículo que sea inerte al compuesto activo, no sea tóxico para la piel y permita la administración del agente para la absorción generalizada en el torrente sanguíneo a través de la piel. El vehículo puede tener numerosas formas tales como cremas y pomadas, pastas, geles y dispositivos oclusivos. Las cremas y pomadas pueden ser emulsiones líquidas o semisólidas viscosas de tipo aceite en agua o de agua en aceite. También pueden ser adecuadas las pastas compuestas por polvos absorbibles dispersadas en vaselina o vaselina hidrófila que contienen el ingrediente activo. Para liberar el ingrediente activo dentro del torrente sanguíneo puede utilizarse una variedad de dispositivos oclusivos tal como una membrana semipermeable que cubre un depósito que contiene el ingrediente activo con o sin un vehículo, o una matriz que contiene el ingrediente activo. Otros dispositivos oclusivos se conocen en la bibliografía.

Las formulaciones en supositorio pueden prepararse a partir de materiales tradicionales, incluyendo la manteca de cacao, con o sin adición de ceras para alterar el punto de fusión del supositorio y glicerina. Pueden utilizarse también bases para supositorio solubles en agua, tales como los polietilenglicoles de varios pesos moleculares.

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Ejemplo 1a

1-(4-benciloxifenil)-2-metil-1H-indol

A una mezcla de 2-metilindol (3,28 g, 25 mmoles), 4-benciloxi yodobenceno (7,76 g, 25 mmoles), carbonato potásico (2,65 g, 25 mmoles) y N-metilpirrolidinona (250 ml) se añadió bromuro de cobre (I) (0,5 g, 3,5 mmoles). La solución agitada se calentó a 180ºC y se mantuvo durante 18 h. La mezcla de reacción se enfrió, se vertió en hielo y se extrajo con acetato de etilo. Después de lavar la capa orgánica con agua y salmuera, y de secar sobre MgSO_{4} anhidro se eliminó el disolvente para proporcionar un líquido oscuro. La purificación por cromatografía en gel de sílice (2% de acetato de etilo-hexanos) proporcionó el compuesto del título como un sólido blanco (30%): p.f. 95-96ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,24 (3 H, s), 5,19 (2 H, s), 6,38 (1 H, s), 6,93-7,04 (3 H, m), 7,20 (2 H, d, J=1,9 Hz), 7,23 (2 H, d, J=3,1 Hz), 7,32-7,53 (8 H, m); MS m/z (M+H)^{+} 314:

Anal. para C_{22}H_{19}NO 0,1 H_{2}O:

	Calc.:	C, 83,83; H, 6,14; N, 4,44.
	Obtenido:	C, 83,84; H, 6,18; N, 4,29.

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Ejemplo 1b

5-fluoro-1-(4-benciloxifenil)-2-metil-1H-indol

Se hicieron reaccionar el 5-fluoro-2-metilindol (5,0 g, 33,5 mmoles) y 4-benciloxi yodobenceno (10,40 g, 33,5 mmoles) según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 1a anterior para proporcionar un sólido blanco (23%): p.f. 94-95ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,23 (3 H, s), 5,19 (2 H, s), 6,39 (1 H, s), 6,84-6,94 (2 H, m), 7,19-7,29 (3 H, m), 7,34-7,44 (5 H, m), 7,51 (2 H, d, J=7,1 Hz); MS m/z (M+H)^{+} 332.

Anal. para C_{22}H_{18}NOF:

	Calc:	C, 79,74; H, 5,47; N, 4,23.
	Obtenido:	C, 79,54; H, 5,54; N, 4,21.

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Ejemplo 1c

5-cloro-1-(4-metoximetiloxifenil)-2-metil-1H-indol

Se hicieron reaccionar 5-cloro-2-metilindol (4,14 g, 25 mmoles) y 4-metoximetiloxi yodobenceno (6,20 g, 25 mmoles) según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 1a anterior para proporcionar un líquido incoloro (19%): RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,25 (3 H, s), 3,44 (2 H, s), 5,28 (2 H, s), 6,40 (1 H, s), 6,96 (1 H, d, J=8,8 Hz), 7,02 (1 H, dd, J=2,0 Hz, J=8,8 Hz), 7,22 (2 H, d, J=8,8 Hz), 7,36 (2 H, d, J=8,8 Hz), 7,55 (1 H, d, J=2,0 Hz); MS m/z (M+H)^{+} 302/304 (1 Cl).

Anal. para C_{17}H_{16}ClNO_{2}:

	Calc. para	C, 67,66; H, 5,34; N, 4,64.
	Obtenido:	C, 67,49; H, 5,17; N, 4,51.

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Ejemplo 1d

5-bromo-1-(4-metoximetiloxifenil)-2-metil-1H-indol

Se hicieron reaccionar el 5-bromo-2-metilindol (5,59 g, 23,8 mmoles) y 4-metoximetiloxi yodobenceno (7,47 g, 23,8 mmoles), según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 1a anterior para proporcionar un líquido incoloro (8,4%): RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,23 (3 H, s), 3,43 (2 H, s), 5,26 (2 H, s), 6,39 (1 H, s), 6,94 (1 H, d, J=8,7 Hz), 7,01 (1 H, dd, J=2,2 Hz, J=8,6 Hz), 7,20 (2 H, d, J=8,6 Hz), 7,34 (2 H, d, J=8,6 Hz), 7,53 (1 H, d, J=2,2 Hz); MS m/z (M+H)^{+} 346/348 (1 Br).

Anal. para C_{17}H_{16}BrNO_{2}:

	Calc. para	C, 58,98; H, 4,66; N, 4,05.
	Obtenido:	C, 58,72; H, 4,53; N, 4,17.

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Ejemplo 1e

(4E)-9-(4-benciloxifenil)-1,2,3,9-tetrahidro-4H-carbazol

Se hicieron reaccionar carbazol (8,70 g, 39,7 mmoles) y 4-benciloxi yodobenceno (12,33 g, 39,7 mmoles) según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 1a anterior para proporcionar un sólido marrón claro (20%): p. f. 128-129ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 1,86 (4 H, br s), 2,55 (2 H, br s), 2,72 (2 H, br s), 5,16 (2 H, s), 7,00-7,03 (2 H, m), 7,05-7,08 (1 H, m), 7,13-7,16 (2 H, m), 7,27-7,30 (2 H, m), 7,33-7,36 (1 H, m), 7,40-7,43 (2 H, m), 7,49 (2 H, d, J=7,2 Hz); MS m/z (M+H)^{+} 354.

Anal. para C_{25}H_{23}NO:

	Calc. para	C, 84,95; H, 6,56; N, 3,96.
	Obtenido:	C, 84,74; H, 6,76; N, 3,91.

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Ejemplo 1f

1-(4-benciloxi-3-fluorofenil)-2-metil-1H-indol

A una mezcla de 2-metilindol (6,23 g, 47,5 mmoles), 4-benciloxi-3-fluoro-bromobenceno (14,066 g, 50 mmoles), carbonato potásico (5,83 g, 55 mmoles) y N-metilpirrolidinona (500 ml) se añadió bromuro de cobre (I) (1,0 g, 7 mmoles). La solución agitada se calentó a 180ºC y se mantuvo durante 18 h. La mezcla de reacción se enfrió, se vertió en hielo y se extrajo con acetato de etilo. Después de lavar la capa orgánica con agua y salmuera y de secar sobre MgSO_{4} se eliminó el disolvente para proporcionar un líquido oscuro, que se purificó por cromatografía en gel de sílice (2% de acetato de etilo-hexanos para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (3,45 g, 22% de rendimiento): p. f. 70-71ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,26 (3 H, s), 5,28 (2 H, s), 6,39 (1 H, s), 6,99-7,05 (3 H, m), 7,21-7,24 (2 H, m), 7,36-7,54 (7 H, m); MS m/z (M+H)^{+} 332:

Anal. para C_{22}H_{18}NOF 0,1 H_{2}O:

	Calc. para	C, 79,31; H, 5,51; N, 4,20.
	Obtenido:	C, 79,29; H, 5,39; N, 4,16.

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Ejemplo 2a

1-(4-benciloxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

Se añadió oxicloruro de fósforo (3 ml) a dimetilformamida anhidra (6 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió una mezcla de 1-(4-benciloxi-fenil)-2-metil-1H-indol (0,94 g, 3 mmoles) en dimetilformamida (10 ml) y se calentó la mezcla a 80ºC durante 18 h. La mezcla de reacción se vertió en hielo y se ajustó a un pH de 7 mediante la adición de NaOH 2 N. Se extrajo la mezcla con acetato de etilo (2 \times 100 ml). Se lavó la capa orgánica con agua y salmuera y se secó sobre MgSO_{4}. La evaporación proporcionó el producto en forma de un sólido oscuro. La purificación por cromatografía en gel de sílice (10% de EtOAc-hexanos) proporcionó un sólido blanco (63%:): p. f. 150-152ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,54 (3 H, s), 5,22 (2 H, s), 6,99 (1 H, d, J=7,9 Hz), 7,17-7,42 (4 H, m), 7,45-7,54 (7 H, m), 8,17 (1 H, d, J=7,5 Hz), 10,19 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 342:

Anal. para C_{23}H_{19}NO_{2}:

	Calc. para	C, 80,92; H, 5,61; N, 4,10.
	Obtenido:	C, 80,76; H, 5,70; N, 3,93.

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Ejemplo 2b

5-fluoro-1-(4-benciloxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

Se añadió oxicloruro de fósforo (5 ml) a dimetilformamida anhidra (10 ml) y se dejó agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos en los que se añadió una solución de 5-fluoro-1-(4-benciloxifenil)-2-metil-1H-indol (1,63 g, 4,9 mmoles) en dimetil-formamida (10 ml) y se hizo reaccionar según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 2a para proporcionar un sólido marrón claro (85%): p. f. 219-220ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,53 (3 H, s), 5,22 (2 H, s), 6,99-7,06 (2 H, m), 7,27 (2 H, d, J=8,9 Hz), 7,37-7,53 (7 H, m), 7,86 (1 H, dd, J=2,5 Hz, J=9,5 Hz); MS m/z (M+H)^{+} 360:

Anal. para C_{23}H_{18}FNO_{2}\cdot0,5 H_{2}O:

	Calc. para	C, 74,99; H, 5,20; N, 3,80.
	Obtenido:	C, 74,91; H, 4,96; N, 3,59.

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Ejemplo 2c

5-cloro-1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

Se añadió oxicloruro de fósforo (5 ml) a dimetilformamida anhidra (10 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. sobre lo que se añadió una solución de 5-cloro-1-(4-metoximetiloxifenil)-2-metil-1H-indol (1,22 g, 3,5 mmoles) en dimetilformamida (10 ml). La solución se hizo reaccionar según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 2a para proporcionar un sólido marrón claro (85%): p.f. >240ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,52 (3 H, s), 6,97-7,02 (3 H, m), 7,22 (1 H, dd, J=2,3 Hz, J=8,7 Hz), 7,30 (2 H, d, J=8,6 Hz), 8,40 (1 H, d, J=2,1 Hz), 10,02 (1 H, s), 10,16 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 286/288 (1 Cl).

Anal. para C_{16}H_{12}ClNO_{2}\cdot0,3 H_{2}O:

	Calc. para	C, 66,01; H, 4,36; N, 4,81.
	Obtenido:	C, 65,85; H, 4,10; N, 4,74.

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\global\parskip0.950000\baselineskip

Ejemplo 2d

5-bromo-1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

Se añadió oxicloruro de fósforo (2,5 ml) a dimetilformamida anhidra (5 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. sobre lo que se añadió una solución de 5-bromo-1-(4-metoximetiloxifenil)-2-metil-1H-indol (0,65 g, 1,9 mmoles) en dimetilformamida (10 ml). La solución se hizo reaccionar según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 2a para proporcionar un sólido marrón claro (51%): p.f. >250ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,50 (3 H, s), 6,95-7,02 (3 H, m), 7,21 (1 H, dd, J=2,4 Hz, J=8,8 Hz), 7,28 (2 H, d, J=8,7 Hz), 8,38 (1 H, d, J=2,2 Hz), 9,98 (1 H, s), 10,14 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 318/320 (1 Br).

Anal. para C_{16}H_{12}BrNO_{2}\cdot0,2 H_{2}O:

	Calc. para	C, 55,99; H, 3,88; N, 4,35.
	Obtenido:	C, 55,69; H, 3,95; N, 4,15.

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Ejemplo 2e

(4E)-9-(4-benciloxifenil)-1,2,3,9-tetrahidro-4H-carbazol-4-ona

A una solución agitada de 4(E)-9-(4-benciloxifenil)-1,2,3,9-tetrahidro-4H-carbazol (1,55 g, 4,4 mmoles), tetrahidrofurano (30 ml) y agua (20 ml) se añadió DDQ (1 g, 4,4 mmoles). Se continuó la agitación durante 30 minutos con lo que el producto en bruto se filtró y se lavó con agua. El producto se purificó por cromatografía en gel de sílice (25% de EtOAc-hexanos) para dar un sólido blanco (57%): p.f. 219-220ºC; RMN de H^{1} (CDCl_{3}): \delta 2,18-2,25 (2 H, m), 2,62 (2 H, t, J=5,9 Hz), 2,79 (2 H, t, J=6,1 Hz), 5,16 (2 H, s), 7,11-7,51 (12 H, m), 8,30 (1 H, d, J=7,9 Hz); MS m/z
(M+H)^{+} 368.

Anal. para C_{25}H_{21}NO_{2}\cdot0,5 H_{2}O:

	Calc. para	C, 79,76; H, 5,86; N, 3,72.
	Obtenido:	C, 79,86; H, 5,75; N, 3,53.

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Ejemplo 2f

1-(4-benciloxifenil)-H-indol-3-carbaldehído

Se hicieron reaccionar 1H-indol-3-carbaldehído (3,63 g, 25 mmoles) y 4-benciloxi yodobenceno (7,76 g, 25 mmoles) según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 1a anterior para dar un sólido amarillo (12%): p. f. 62-64ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 5,22 (2 H, s), 7,26 (2 H, d, J=8,8 Hz), 7,32-7,52 (7 H, m), 7,61 (2 H, d, J=8,8 Hz), 8,19-8,22 (1 H, m), 8,54 (1 H, s), 10,02 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 328.

Anal. para C_{22}H_{17}NO_{2}\cdot0,1 H_{2}O:

	Calc. para	C, 80,27; H, 5,27; N, 4,25.
	Obtenido:	C, 80,15; H, 5,05; N, 3,97.

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Ejemplo 2g

1-(4-benciloxi-3-fluorofenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

Se añadió oxicloruro de fósforo (3 ml) a dimetilformamida anhidra (6 ml) y se dejó agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió una mezcla de 1-(4-benciloxi-3-fluorofenil)-2-metil-1H-indol (1,03 g, 3,1 mmoles) en dimetilformamida (10 ml), se calentó la mezcla a 80ºC y se mantuvo durante 18 h. La mezcla de reacción se vertió sobre hielo y se ajustó a un pH de 7 mediante adición de NaOH 2 N. Se extrajo la mezcla con acetato de etilo (2 x 100 ml), se lavó la capa orgánica con agua y salmuera, se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó para proporcionar el producto como un sólido oscuro. La purificación por cromatografía en gel de sílice (EtOAc al 25%-hexanos) proporcionó un sólido blanco (0,84 g, 76%): p. f. 166-168-152ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,55 (3 H, s), 5,30 (2 H, s), 7,04 (1 H, d, J=6,9 Hz), 7,19-7,28 (2 H, m), 7,23-7,52 (7H, m), 7,44 (2 H, dd, J=6,0 Hz, J=1,4 Hz), 7,59 (1 H, dd, J=11,7 Hz, J=2,5), 8,17 (1 H, dd, J=7,0 Hz, J=1,0), 10,20 (1H, s); MS m/z (M+H)^{+} 360:

Anal. para C_{23}H_{18}FNO_{2}\cdot(0,1 H_{2}O):

	Calc. para	C, 76,48; H, 5,08; N, 3,88.
	Obtenido:	C, 76,39; H, 4,81; N, 3,69.

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Ejemplo 3a

Oxima de 1-(4-benciloxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

Se calentó a reflujo durante 30 min. una solución de 1-(4-benciloxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído (0,64 g, 1,9 mmoles), hidrocloruro de hidroxilamina (0,25 g, 3,6 mmoles), metanol (25 ml) y piridina (1 ml). Se enfrió la mezcla y se eliminó el metanol por evaporación. Se extrajo el producto en acetato de etilo (2 \times 50 ml) y se lavó la capa orgánica con agua y salmuera y se secó sobre MgSO_{4}. Se evaporó el disolvente y se purificó el producto por cromatografía en gel de sílice (25% de acetato de etilo-hexanos) para proporcionar un sólido blanco (53%): p. f. 171-173ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,31 (3 H, s), 5,20 (2 H, s), 6,94-7,01 (1 H, m), 7,10-7,14 (2 H, m), 7,23 (2 H, d, J=8,9 Hz), 7,37-7,47 (5 H, m), 7,52 (2 H, d, J=7,4 Hz), 8,01-8,03 (1 H, m), 8,41 (1 H, s), 10,66 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 357.

Anal. para C_{23}H_{20}N_{2}O_{2}\cdot0,5 H_{2}O:

	Calc. para	C, 75,60; H, 5,79; N, 7,67.
	Obtenido:	C, 75,12; H, 5,53; N, 7,34.

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Ejemplo 3b

Oxima de 5-fluoro-1-(4-benciloxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

Una mezcla de 5-fluoro-1-(4-benciloxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído (0,97 g, 2,7 mmoles), hidrocloruro de hidroxilamina (0,25 g, 3,6 mmoles), metanol (25 ml) y piridina (1 ml) se hizo reaccionar según el procedimiento del Ejemplo 3a para proporcionar un sólido blanco (88%): p. f. 183-185ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,30 (3 H, s), 5,20 (2 H, s), 6,94-6,97 (2 H, m), 7,23 (2 H, d, J=8,9 Hz), 7,37-7,46 (5 H, m), 7,52 (2 H, d, J=6,8 Hz), 7,71 (1 H, d, J=10,1 Hz), 8,41 (1 H, s), 10,72 (1 H, s);MS m/z (M+H)^{+} 375.

Anal. para C_{23}H_{19}FN_{2}O_{2}:

	Calc. para	C, 73,78; H, 5,11; N, 7,48.
	Obtenido:	C, 73,55; H, 5,03; N, 7,35.

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Ejemplo 3e

Oxima de (4E)-9-(4-benciloxifenil)-1,2,3,9-tetrahidro-4H-carbazol-4-ona

Una mezcla de 4(E)-9-(4-benciloxifenil)-1,2,3,9-tetrahidro-4H-carbazol-4-ona (1,00 g, 2,7 mmoles), hidrocloruro de hidroxilamina (0,56 g, 8,1 mmoles), metanol (25 ml) y piridina (1 ml) se hizo reaccionar según el procedimiento del Ejemplo 3a para proporcionar un sólido blanco (51%): p.f. 241-243ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 1,83-1,92 (2H, m), 2,65 (2 H, t, J=5,9 Hz), 2,72 (2 H, t, J=6,0 Hz), 5,20 (2 H, s), 7,09-7,14 (3 H, m), 7,22 (2H, d, J=8,8 Hz), 7,36-7,46 (5 H, m), 7,51 (2 H, d, J=6,9 Hz), 8,00-8,02 (1H, m), 10,46 (1 H, s); MS m/z (M-H)^{-} 379.

Anal. para C_{25}H_{24}N_{2}O_{2}:

	Calc. para	C, 78,51; H, 5,80; N, 7,32.
	Obtenido:	C, 78,24; H, 5,52; N, 7,26.

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Ejemplo 3f

Oxima de 1-(4-benciloxifenil)-H-indol-3-carbaldehído

Una mezcla de 1-(4-benciloxifenil)-H-indol-3-carbaldehído (0,50 g, 1,5 mmoles), hidrocloruro de hidroxilamina (0,25 g, 3,6 mmoles), metanol (25 ml) y piridina (1 ml) se hizo reaccionar según el procedimiento del Ejemplo 3a para proporcionar un sólido amarillo (61%): p.f. 152-154ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 5,20 (2 H, s), 7,19-7,53 (12 H, m), 7,86 (1 H, s), 8,10 (1 H, d, J=7,5 Hz), 10,75 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 383.

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Anal. para C_{22}H_{18}N_{2}O_{2}:

	Calc. para	C, 77,17; H, 5,30; N, 8,18.
	Obtenido:	C, 77,49; H, 5,44; N, 7,85.

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Ejemplo 3g

Oxima del 1-(4-benciloxi-3-fluorofenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

A una solución agitada de 1-(4-benciloxi-3-fluorofenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído (0,81 g, 2,3 mmoles), hidrocloruro de hidroxilamina (0,25 g, 3,6 mmoles) y metanol (25 ml) se añadió piridina (1 ml). La mezcla de reacción se calentó a reflujo y se mantuvo durante 30 min. La mezcla se enfrió, se eliminó el metanol por evaporación y se absorbió el residuo en acetato de etilo/agua. Se extrajo el producto en acetato de etilo (2 \times 50 ml), se lavó el acetato de etilo con agua y salmuera y se secó sobre MgSO_{4}. Se evaporó el disolvente, y se purificó el producto en bruto por cromatografía en gel de sílice (25% de acetato de etilo-hexanos) para proporcionar un sólido blanco (0,7 g, 83%): p. f. 167-168ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,32 (3 H, s), 5,29 (2 H, s), 6,99-7,01 (1 H, m), 7,10-7,17 (2 H, m), 7,25-7,28 (1 H, m), 7,37-7,42 (1 H, m), 7,43-7,49 (3 H, m), 7,49-7,54 (2 H, m), 8,01-8,04 (1 H, m), 8,41 (1 H, s), 10,67 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 375:

Anal. para C_{23}H_{19}FN_{2}O_{2}:

	Calc. para	C, 73,78; H, 5,11; N, 7,48.
	Obtenido:	C, 73,53; H, 5,06; N, 7,32.

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Ejemplo 4

Oxima del 1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

A una solución agitada de diclorometano (20 ml), Pd(OAc)_{2} (50 mg, 0,2 mmoles) y trietilsilano (2 ml) se añadió trietilamina (1 ml) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min. A la mezcla se añadió oxima de 1-(4-benciloxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído (0,36 g, 1 mmol) en diclorometano (10 ml) y se agitó durante 90 min. Se añadieron acetato de etilo (25 ml) y cloruro amónico (25 ml de solución al 10%) y se extrajo el producto en acetato de etilo (2 \times 25 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (3 \times 25 ml) y salmuera (25 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Después de eliminar el disolvente, se obtuvo un líquido, que se disolvió en tetrahidrofurano anhidro (10 ml). A esta mezcla se añadió fluoruro de tetrabutilamonio (3 ml). Después de agitar durante 30 min, se absorbió la mezcla con acetato de etilo y agua. Se lavó la capa orgánica con agua y salmuera y se secó sobre MgSO_{4}. Tras la evaporación del disolvente se proporcionó el sólido en bruto que se purificó por cromatografía en gel de sílice (25% de acetato de etilo/hexanos) para dar un sólido amarillo pálido (83%): p. f. 171-173ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,29 (3 H, s), 6,95 (4 H, d, J=7,7 Hz), 7,09-7,13 (2 H, m), 7,22 (2 H, d, J=8,7 Hz), 7,98-8,01 (1 H, m), 8,40 (1 H, s), 9,89 (1 H, s), 10,63 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 267.

Anal. para C_{16}H_{14}N_{2}O_{2}:

	Calc. para	C, 72,17; H, 5,30; N, 10,52.
	Obtenido:	C, 71,78; H, 5,23; N, 10,37.

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Ejemplo 5

Oxima del 5-fluoro-1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

Se hizo reaccionar la oxima de 5-fluoro-1-(4-benciloxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído (0,49 g, 1,3 mmoles) según el procedimiento utilizado en el ejemplo 4 para proporcionar un sólido blanco (67%): p. f. 162-163ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,29 (3 H, s), 6,94-6,97 (4 H, m), d 7,23 (2 H, d, J=8,6 Hz), 7,70 (2 H, d, J=10,1 Hz), 8,39 (1 H, s), 9,92 (1 H, s), 10,70 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 285.

Anal. para C_{16}H_{13}FN_{2}O_{2}:

	Calc. para	C, 67,60; H, 4,61; N, 9,85.
	Obtenido:	C, 67,44; H, 4,67; N, 9,79.

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Ejemplo 6

Oxima del 5-cloro-1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

Se hizo reaccionar una mezcla de la oxima de 5-cloro-1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído (0,63 g, 2,2 mmoles), hidrocloruro de hidroxilamina (0,30 g, 4,3 mmoles), metanol (25 ml) y piridina (1 ml) según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 para proporcionar un sólido blanco (68%): p. f. 212-213ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,29 (3 H, s), 6,96 (3 H, d, J=8,7 Hz), 7,12 (1 H, dd, J=2,2 Hz, J=8,7 Hz), 7,24 (2 H, d, J=8,7 Hz), 8,03 (1 H, d, J=2,1 Hz), 8,40 (1 H, s), 9,93 (1 H, s), 10,75 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 301/303 (1 Cl).

Anal. para C_{16}H_{13}ClN_{2}O_{2}:

	Calc. para	C, 63,90; H, 4,36; N, 9,31.
	Obtenido:	C, 63,63; H, 4,12; N, 9,17.

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Ejemplo 7

Oxima del 5-bromo-1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

Se hizo reaccionar una mezcla de la oxima de 5-bromo-1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído (0,16 g, 0,5 mmoles), hidrocloruro de hidroxilamina (0,10 g, 1,4 mmoles), metanol (10 ml) y piridina (0,2 ml) según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 para proporcionar un sólido blanco (66%): p. f. 209-211ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,29 (3 H, s), 6,92-6,97 (3 H, m), 7,20-7,25 (3 H, m), 8,19 (1 H, d, J=1,9 Hz), 8,39 (1 H, s), 9,94 (1 H, br s), 10,76 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 345/347 (1 Br).

Anal. para C_{16}H_{13}BrN_{2}O_{2}\cdot0,5 H_{2}O:

	Calc. para	C, 54,26; H, 3,98; N, 7,91.
	Obtenido:	C, 54,26; H, 3,68; N, 7,65.

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Ejemplo 8

Oxima de (4E)-9-(4-hidroxifenil)-1,2,3,9-tetrahidro-4H-carbazol-4-ona

La oxima de (4E)-9-(4-benciloxifenil)-1,2,3,9-tetrahidro-4H-carbazol-4-ona (0,23 g, 0,6 mmoles) se hizo reaccionar según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 para proporcionar un sólido marrón claro (40%): p. f. 227-229ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 1,87-1,91 (2 H, m), 2,63 (2 H, t, J=5,9 Hz), 2,71 (2 H, t, J=6,1 Hz), 6,95 (2 H, d, J=8,6 Hz), 7,09-7,13 (3 H, m), 7,26 (2 H, d, J=8,5 Hz), 7,98-8,00 (1 H, m), 9,85 (1 H, s), 10,43 (1 H, s); MS m/z (M+H)^{+} 293.

Anal. para C_{18}H_{16}N_{2}O_{2}:

	Calc. para	C, 73,95; H, 5,52; N, 9,58.
	Obtenido:	C, 73,61; H, 5,39; N, 9,42.

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Ejemplo 9

Oxima de 1-(4-hidroxifenil)-1H-indol-3-carbaldehído

La oxima de 1-(4-benciloxifenil)-1H-indol-3-carbaldehído (0,31 g, 0,9 mmoles) se hizo reaccionar según el procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 para dar un sólido amarillo (18%): p. f. 95-97ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 6,94-6,98 (2 H, m), 7,19-7,29 (2 H, m), 7,36-7,45 (4 H, m), 8,31 (1 H, s), 9,80-9,83 (1 H, m), 10,72 (1 H, s), 11,44 (1 H, s): MS m/z (M+H)^{+} 253.

Anal. para C_{15}H_{12}N_{2}O_{2}:

	Calc. para	C, 71,42; H, 4,79; N, 11,10.
	Obtenido:	C, 71,85; H, 5,36; N, 9,70.

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Ejemplo 10

Oxima del 1-(3-fluoro-4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

A una solución agitada de diclorometano (10 ml), Pd(OAc)_{2} (50 mg, 0,2 mmoles) y trietilsilano (3 ml) se añadió trietilamina (1,5 ml) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min. A la mezcla se añadió oxima de 1-(4-benciloxi-3-fluorofenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído (0,52 g, 1,4 mmoles) en diclorometano (15 ml) y se continuó la agitación durante 4 h. Se añadieron acetato de etilo (25 ml) y cloruro amónico (25 ml de solución al 10%) y se extrajo el producto en acetato de etilo (2 \times 25 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (3 \times 25 ml) y salmuera (25 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Después de eliminar el disolvente, se obtuvo un líquido, que se disolvió en tetrahidrofurano anhidro (10 ml). A esta mezcla se añadió fluoruro de tetrabutilamonio (3 ml). Después de agitar durante 30 min, se absorbió la mezcla con acetato de etilo y agua, se agitó y se separaron las capas. Se lavó la capa orgánica con agua y salmuera y se secó sobre MgSO_{4}. Tras la evaporación del disolvente se purificó el sólido en bruto por cromatografía en gel de sílice (25% de acetato de etilo/hexanos) para dar un sólido amarillo pálido (0,22 g, 56%): p. f. 182-184ºC; RMN de H^{1} (DMSO-d_{6}): \delta 2,31 (3 H, s), 6,98-7,01 (1 H, m), 7,07-7,17 (4 H, m), 7,35 (1 H, dd, J=11,7 Hz, J=2,4 Hz), 7,99-8,03 (1 H, m), 8,40 (1 H, s), 10,35 (1 H, br s), 10,64 (1H, s); MS m/z (M+H)^{+} 285.

Anal. para C_{16}H_{13}FN_{2}O_{2} (0,3 H_{2}O):

	Calc. para	C, 66,34; H, 4,57; N, 9,30.
	Obtenido:	C, 66,38; H, 4,61; N, 9,85.

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Ejemplo 11

Selectividad para los receptores de ER\alpha o ER\beta

Se evaluaron ejemplos representativos de la invención por su capacidad tanto de ER\alpha como de ER\beta para competir con 17\beta-estradiol. Este procedimiento analítico proporciona la metodología para determinar si un compuesto concreto se une al receptor de estrógeno (y por lo tanto es "estrógeno") y si existe selectividad para ER\alpha o ER\beta. En la Tabla a continuación se presentan los valores y se describen como IC_{50}. El 17\beta-estradiol está incluido como una referencia convencional para comparación. El procedimiento utilizado se describe brevemente a continuación. Se preparó un lisado en bruto de E. coli que expresa los dominios de fijación del ligando del receptor de estrógeno (D, E y F) de ER\alpha o ER\beta humanos. Tanto los receptores como los compuestos se diluyeron en 1 \times PBS de Dulbecco (DPBS) enriquecido con EDTA 1 mM. Utilizando una placa de microvaloración enmascarada de fijación elevada, se combinaron 100 \mul de receptor (1 \muG/pocillo) con [^{3}H]-17\beta-estradiol 2 nM y varias concentraciones de compuesto. Después de entre 5 y 15 horas a temperatura ambiente, las placas se lavaron con DPBS/EDTA 1 mM y se determinó la radioactividad ligada por recuento de centelleo líquido. La IC_{50} se define como la concentración del compuesto que disminuye la fijación total del 17\beta-estradiol en un 50%. Los resultados obtenidos se describen en la tabla siguiente.

TABLA 1 Derivados de oxima de 1-(4'-hidroxi-fenil)-1H-indol-3-carbaldehído

6

Los resultados obtenidos en el procedimiento analítico farmacológico normalizado demuestran que los compuestos de la presente invención son compuestos estrógenos, algunos con fuerte afinidad preferencial para el receptor ER\beta. Los compuestos de la presente invención oscilan desde los que presentan gran afinidad preferencial por ER\beta sobre ER\alpha a los que presentan afinidad casi igual por ambos receptores. Por lo tanto, los compuestos de la presente invención abarcarán un intervalo de actividad basado, por lo menos en parte, en sus características de selectividad de la afinidad del receptor. Además, ya que cada nuevo complejo del ligando del receptor es único y por lo tanto su interacción con varias proteínas correguladoras es única, los compuestos de la presente invención presentarán diferente comportamiento modulador dependiendo del contexto celular en el que estén. Por ejemplo, en algunos tipos celulares, es posible que un compuesto se comporte como agonista estrógeno mientras que en otros tejidos, como antagonista. Los compuestos con tal actividad se han denominado algunas veces SERM (Moduladores Selectivos del Receptor del Estrógeno). A diferencia de muchos estrógenos, sin embargo, muchos de los SERM no producen aumentos del peso uterino en húmedo. Estos compuestos son antiestrógenos en el útero y pueden antagonizar completamente los efectos tróficos de los antagonistas del estrógeno en tejido uterino. Estos compuestos, sin embargo, actúan como agonistas del estrógeno en los sistemas óseo, cardiovascular y nervioso central. Debido a esta naturaleza selectiva del tejido de estos compuestos, son útiles en el tratamiento o la prevención en una enfermedad o síndromes en mamíferos que están producidos por una insuficiencia del estrógeno o asociados a la misma (en determinados tejidos tal como el óseo o el cardiovascular) o en exceso de estrógeno (en el útero o en las glándulas mamarias).

Incluso más allá de dicha modificación específica para las células, los compuestos de la presente invención tienen también potencial para comportarse como agonistas en un tipo de receptor mientras que se comportan como antagonistas en el otro. Por ejemplo, se ha demostrado que los compuestos pueden ser antagonistas en ER\beta mientras que son agonistas en ER\alpha (Meyers, Marvin J.; Sun, Jun; Carlson, Kathryn E.; Katzenellenbogen, Benita S.; Katzenellenbogen, John A., J. Med. Chem. (1999), 42(13), 2456-2468. Dicha actividad de ERSAA (Antagonista del Agonista Selectivo del Receptor de Estrógeno) proporciona actividad estrógena farmacológicamente distinta dentro de esta serie de compuestos.

Los procedimientos analíticos farmacológicos habituales están disponibles fácilmente para determinar el perfil de actividad de un compuesto analítico dado. A continuación se resumen brevemente varios procedimientos analíticos representativos. Los procedimientos analíticos farmacológicos normalizados para SERM se proporcionan también en las patentes US nº 4.418.068 y nº 5.998.402.

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Ejemplo 12

Procedimiento de ensayo uterótrofo/antiuterótrofo en rata

Las propiedades estrógenas y antiestrógenas de los compuestos pueden determinarse en un ensayo uterótrofo en rata inmadura (4 días) que (como describió anteriormente L.J. Black y R.L. Goode, Life Sciences, 26, 1453 (1980)). Ratas Sprague-Dawley inmaduras (hembras, de 18 días) se ensayaron en grupos de seis. Los animales se tratan mediante inyección ip diaria con 10 \muG de compuesto, 100 \muG de compuesto, (100 \muG de compuesto + 1 \muG de 17\beta-estradiol) para comparar la antiestrogenicidad y 1 \muG de 17\beta-estradiol, con 50% de DMSO/50% de solución salina como vehículo de inyección. El 4º día se sacrifican los animales por afixia por CO_{2} y se extirpa su útero y se despojan del lípido en exceso, se elimina cualquier fluido y se determina el peso en húmedo. Una sección pequeña de una trompa uterina se somete a histología y el resto se utiliza para aislar el ARN total con el objetivo de evaluar la expresión del gen 3 del componente complementario.

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Ejemplo 13

Procedimiento de ensayo en ratas ovarioectomizadas de 6 semanas - Protección ósea y cardíaca

Se adquieren ratas CD Sprague Dawley hembras, ovx o pseudo ovx, 1 día después de la cirugía en Taconic Farm (intervalo de peso de 240 a 275 g). Se enjaulan 3 ó 4 ratas/jaula en una sala en un programa 12/12 (luz/oscuridad) y se les proporciona pienso (pienso para ratas Purina 5K96C) y agua a discreción. El tratamiento de todos los estudios comienza 1 día después de la llegada de los animales y se dosifican 7 días a la semana como se indica para 6 semanas. Un grupo de ratas pseudo-operadas de igual edad que no recibieron ningún tratamiento sirven como grupo de referencia intacto, repleto de estrógeno para cada estudio.

Se preparan todos los tratamientos en Tween 80 al 1% en solución salina normal a las concentraciones definidas de modo que el volumen de tratamiento sea 0,1 ml/100 g de peso corporal. Se disuelve el 17\beta-estradiol en aceite de maíz (20 \mug/ml) y se administran por vía subcutánea, 0,1 ml/rata. Se ajustan todas las dosis a intervalos de tres semanas según las mediciones medias de peso corporal.

Cinco semanas después del inicio del tratamiento y una semana antes de la terminación del estudio, se evalúa la densidad mineral del hueso (BMD) en cada rata. Se evalúa la densidad total y trabecular de la tibia proximal en ratas anestesiadas utilizando XCT-960M (pQCT; Stratec Medizintechnik, Pforzheim, Alemania). Las mediciones se realizan de la manera siguiente: Quince minutos antes de la exploración, cada rata se anestesia con una inyección intraperitoneal de 45 mg/kg de cetamina, 8,5 mg/kg de xilazina y 1,5 mg/kg de acepromazina.

La extremidad trasera derecha se hace pasar a través de un tubo de policarbonato con un diámetro de 25 mm y se une con cinta a un marco acrílico con la articulación del tobillo en un ángulo de 90º y la articulación de la rodilla a 180º. El tubo de policarbonato se fija a una plataforma deslizante que lo mantiene perpendicular a la abertura de la pQCT. La plataforma se ajusta de modo que el extremo distal del fémur y el extremo proximal de la tibia estén en el campo de exploración. Se realiza una vista exploratoria en dos dimensiones para una longitud de 10 mm y una resolución de la línea de 0,2 mm. Una vez se presenta en el monitor la vista de exploración, se localiza el extremo proximal de la tibia. La exploración de pQCT se inicia a 3,4 mm distal de este punto. La exploración de pQCT es de 1 mm de espesor, tiene un tamaño de vóxel (píxel tridimensional) de 0,140 mm y consta de 145 proyecciones a través de la sección.

Una vez se termina la exploración de pQCT, se presenta la imagen en el monitor. Se esboza una zona de interés que incluye la tibia pero que excluye el peroné. El tejido blando se elimina automáticamente utilizando un algoritmo iterativo. La densidad del hueso restante (densidad total) se presenta en mg/cm^{3}. El 55% externo del hueso se desprende en una espiral concéntrica. La densidad del hueso restante (densidad trabecular) se expresa en mg/cm^{3}. Una semana después de la evaluación de BMD se practica la eutanasia a las ratas por sofoco con dióxido de carbono y se recoge sangre para la determinación de colesterol. Se eliminan los úteros y se toman los pesos. Se determina el colesterol total utilizando un analizador clínico Hitachi 911 de Boehringer-Mannheim utilizando el kit HP para colesterol. Se compararon las estadísticas utilizando un análisis de varianza de una vía con la prueba de Dunnet.

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Ejemplo 14

Procedimiento de ensayo antiproliferante de MCF-7/ERE

Se preparan soluciones madre de los compuestos de ensayo (habitualmente 0,1 M) en DMSO y a continuación se diluyen de 10 a 100 veces con DMSO para preparar soluciones de trabajo de 1 ó 10 mM. Las soluciones madre de DMSO se guardan a 4ºC (0,1 M) o a -20ºC (<0,1 M). Se atenúan las células MCF-7 dos veces a la semana con medio de crecimiento [medio D-MEM/F-12 que contiene suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (v/v), 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina y glutaMax-1 2 mM]. Se mantienen las células en matraces ventilados a 37ºC dentro de un incubador con 5% de CO_{2}/95% de aire humectado. Antes del primer día de tratamiento, se colocan las células en placas con un medio de crecimiento a 25.000/pocillo en placas de 96 pocillos y se incuban a 37ºC durante la
noche.

Las células se infectan durante 2 h a 37ºC con 50 \mul/pocillo de una dilución 1:10 de adenovirus 5-ERE-tk-luciferasa en medio experimental [medio D-MEM/F-12 exento de rojo de fenol que contiene 10% (v/v) de suero bovino fetal agotado en carbón inactivado térmicamente, 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina, glutaMax-1 2 mM y piruvato sódico 1 mM]. Los pocillos se lavan a continuación una vez con 150 \mu\lambda de medio experimental. Por último, se tratan las células durante 24 h a 37ºC en réplicas de tratamiento en 8 pocillos con 150 \mu\lambda/pocillo de vehículo (\leq 0,1% v/v de DMSO) o compuesto que se diluye \geq1.000 veces en el medio experimental.

La identificación inicial de los compuestos de ensayo se realiza a una sola dosis de 1 \muM que se determina sola (modo agonista) o en combinación con 17\beta-estradiol 0,1 nM (EC_{80}; modo antagonista). Cada placa de 96 pocillos incluye también un grupo de vehículo de referencia (0,1% v/v de DMSO) y un grupo agonista de referencia (17\beta-estradiol 0,1 ó 1 nM). Se realizan experimentos de respuesta a la dosis en modos agonista y/o antagonista en compuestos activos en incrementos log desde 10^{-14} a 10^{-5} M. A partir de estas curvas de respuesta a la dosis, se generan valores de EC_{50} e IC_{50}, respectivamente. El pocillo final en cada grupo de tratamiento contiene 5 \mul de 3 \times 10^{-5} M ICI 182.780 (concentración final 10^{-6} M) como una referencia del antagonista de ER.

Después del tratamiento, se lisan las células en un agitador durante 15 min. con 25 \mul/pocillo de 1 \times reactivo de lisis de cultivo celular (Promega Corporation). Los lisados celulares (20 \mul) se transfieren a una placa con luminómetro de 96 pocillos y se mide la actividad de luciferasa en un luminómetro LB 96 P de MicroLumat (EG & G Berthold) utilizando 100 \mul/pocillo de sustrato de luciferasa (Promega Corporation). Antes de la inyección de sustrato, se realiza medición de fondo de 1 segundo para cada pocillo. Después de la inyección del sustrato, se mide la actividad de luciferasa durante 10 segundos después de un retardo de 1 segundo. Se transfieren los datos desde el luminómetro a un ordenador personal Macintosh y se analizan utilizando el programa informático JMP (SAS Institute); este programa sustrae la lectura de fondo de la medición de luciferasa para cada pocillo y a continuación determina la media y la desviación estándar de cada tratamiento.

Los datos de luciferasa se transforman mediante logaritmos y se utiliza el M-estimador de Huber para sopesar las observaciones transformadas subyacentes. El programa informático JPM se utiliza para analizar los datos transformados y ponderados de ANOVA de una vía (ensayo de Dunnett). Los tratamientos del compuesto se comparan con los resultados de referencia del vehículo en modo agonista, o los resultados de referencia positivos del agonista (17\beta-estradiol 0,1 nM) en modo antagonista. Para el experimento inicial de una sola dosis, si los resultados del tratamiento del compuesto son significativamente diferentes de la referencia apropiada (p<0,05), entonces los resultados se describen como el porcentaje relativo a la referencia de 17\beta-estradiol [es decir, ((compuesto - vehículo de referencia)/(referencia de 17\beta-estradiol - vehículo de referencia)) \times 100]. El programa informático JMP se utiliza también para determinar los valores de EC_{50} y IC_{50} a partir de curvas no lineales de respuesta a la dosis.

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Ejemplo 15

Inhibición de la oxidación de LDL - Actividad antioxidante

Se obtuvieron aortas porcinas de un matadero, se lavaron, se transportaron en PBS enfriado y se recogieron las células aórticas endoteliales. Para recoger las células, se atan los vasos intercostales de la aorta y se pinza un extremo de la aorta. Se coloca colagenasa al 0,2% (Sigma tipo I), filtrada esterilizada y reciente en el recipiente y el otro extremo del recipiente a continuación se pinza para formar un sistema cerrado. La aorta se incuba a 37ºC durante 15 a 20 minutos, después de los cuales se recoge la solución de colagenasa y se centrifuga durante 5 minutos a 2.000 \times g. Cada sedimento se pone en suspensión en 7 ml de medio de cultivo de células endoteliales constituido por rojo de fenol exento de DMEM/medio F12 de Ham enriquecido con FBS agotado en carbón vegetal (5%), NuSerum (5%), L-glutamina (4 mM), penicilina-estreptomicina (1.000 U/ml, 100 \mug/ml) y gentimicina (75 \mug/ml), sembrado en placa de petri de 100 mm e incubado a 37ºC en 5% de CO_{2}. Después de 20 minutos, las células se enjuagan con PBS y se añade medio reciente, esto se repitió otra vez a las 24 horas. Las células son confluentes después de aproximadamente 1 semana. Las células endoteliales se alimentan de manera rutinaria dos veces a la semana y, cuando son confluentes, se tripsinizan y se siembran en una relación 1:7. La oxidación mediada por células de 12,5 \mug/ml de LDL se deja que proceda en presencia del compuesto que ha de evaluarse (5 \muM) durante 4 horas a 37ºC. Los resultados se expresan en porcentaje de inhibición del proceso oxidativo medido por el método de análisis TBARS (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico) de aldehídos libres (Yagi K., Biochem. Med. 15:212-216 (1976)).

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Ejemplo 16

Procedimiento de ensayo con células D12 hipotalámicas

Se subclonan células D12 hipotalámicas de rata de la estirpe celular parental RCF17 y se guardan congeladas. Se cultivan de manera rutinaria en DMEM:F12 (1:1), glutaMAX-1 (2 mM), penicilina (100 U/ml)-estreptomicina (100 mg/ml), más 10% de suero bovino fetal (FBS). Las células se colocan en placas en medio exento de rojo de fenol (DMEM:F12, glutaMAX, penicilina-estreptomicina) que contiene 2 a 10% de FBS agotado en carbón vegetal a una densidad subconfluente (1-4 \times 10^{6} células/placa de 150 mm). Las células se realimentan 24 h después con medio que contiene 2% de suero agotado. Para probar la actividad agonística, se tratan las células con 17\beta-estradiol 10 nM o varias dosis de compuesto de ensayo (1 mM o un intervalo entre 1 pM y 1 mM). Para probar la actividad antagonista las células se tratan con 17\beta-estradiol 0,1 mM en ausencia o presencia de dosis variables (100 pM a 1 mM) del compuesto de ensayo. Se tratan también las placas de referencia con DMSO como referencia negativa. Cuarenta y ocho horas después de la adición de la hormona, las células se lisan y se lleva a cabo el procedimiento de ensayo de fijación.

Para cada procedimiento de ensayo de fijación se incuban de 100 a 150 mg de proteína con ^{3}H-R5020 10 nM + 100 veces en exceso de R5020 en un volumen de 150 ml. Se preparan reacciones por triplicado (tres con R5020, tres sin R5020) en una placa de 96 pocillos. Se añade el extracto de proteína en primer lugar seguido por ^{3}H-R5020 o ^{3}H-R5020 + 100 \times R5020 sin marcar. La reacción se lleva a cabo durante 1 a 2 h a temperatura ambiente. La reacción se interrumpe mediante la adición de 100 ml de 5% de carbón vegetal (Norit SX-4) frío, 0,5% de dextrano 69K (Pharmacia) en TE pH 7,4. Después de 5 min. a temperatura ambiente, los ligandos unidos y no unidos se separan por centrifugación (5 min., 1.000 RCF, 4ºC). La solución sobrenadante (\sim150 ml) se elimina y se transfiere a un vial de centelleo. Después de la adición del fluido de centelleo (Beckman Ready Protein+), se hace el recuento en las muestras durante 1 min. en un contador de centelleo.

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Ejemplo 17

Receptor de progesterona en el área preóptica del SNC

Se extirpan los ovarios de ratas Sprague-Dawley hembras de sesenta (60) días de vida. se enjaulan los animales en una instalación de cuidado animal con un fotoperiodo de 12 h de luz, 12 h de oscuridad y libre acceso al agua potable y pienso para roedores.

Los animales ovarioectomizados se dividen al azar en grupos que se inyectan con vehículo (50% de DMSO, 40% de PBS y 10% de vehículo de etanol), 17\beta-estradiol (200 ng/kg) o con el compuesto que va a ensayarse. Se inyectan animales adicionales con el compuesto de ensayo 1 h antes de la inyección de 17\beta-estradiol para evaluar las propiedades antagonistas de este compuesto. Seis horas después de la inyección s.c., se practica la eutanasia a los animales con una dosis letal de CO_{2} y se recogen sus cerebros y se congelan.

El tejido recogido de los animales se corta en un criostato a -16ºC y se recogen las secciones del microscopio recubiertas con silano. Las secciones de la sección montada se secan a continuación en un calentador de secciones mantenido a 42ºC y almacenado en cajas de secciones disecadas a -80ºC. Antes del tratamiento, las cajas de secciones disecadas se calientan lentamente hasta la temperatura ambiente (-20ºC durante 12 a 16 h; 4ºC durante 2 h; a temperatura ambiente durante 1 h) para eliminar la formación de condensación en las secciones y de este modo minimizar la degradación del tejido y del ARN. Las secciones secas se cargan en estantes metálicos, se fijan después en 4% de paraformaldehído (pH 9,0) durante 5 min. y se procesan como se describió anteriormente.

Un plásmido que contiene un fragmento de 815 bp del ADNc 9 de PR de rata (dominio de fijación del ligando) se linealiza y se utiliza para generar una sonda marcada con S 35 -UTP que es complementaria con una parte del ARNm de PR de rata. Las secciones de la sección montada procesadas se hibridan con 20 ml de mezcla de hibridación que contiene la ribosonda (4-6 \times 10^{6} DPM/sección) y 50% de formamida y se incuban durante la noche en una cámara humidificada a 55ºC. A la mañana, las secciones se colocan en estantes metálicos que se sumergen en 2 \times SSC (NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M; pH 7,0)/DTT 10 mM. Los estantes se transfieren todos a un recipiente grande y se lavan en 2 \times SSC/DTT 10 mM durante 15 min. a T.A. con agitación suave. Las secciones se lavan a continuación en tampón de ARNasa a 37ºC durante 30 min., se tratan con ARNasa A (2 mg/ml) durante 30 min. a 37ºC y se lavan durante 15 min. a temperatura ambiente 1 \times SSC. Posteriormente, las secciones se lavan (2 \times 30 min.) a 65ºC en 0,1 \times SSC para eliminar el marcador no específico, se enjuagan en 0,1 \times SSC a temperatura ambiente durante 15 min. y se deshidratan con una serie graduada de alcohol: acetato amónico (70%, 95% y 100%). Las secciones secadas al aire se oponen a una película de rayos X durante 3 días y a continuación se procesan fotográficamente. Las secciones de todos los animales se hibridan, se lavan, se exponen y se procesan fotográficamente juntas para eliminar las diferencias debido a la variación de condiciones entre los ensayos.

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Ejemplo 18

Efectos de sofocos de rata sobre el SNC

Se consiguen ratas Sprague-Dawley de 60 días de vida hembras con los ovarios extirpados tras la cirugía. Las intervenciones quirúrgicas se hacen un mínimo de 8 días antes del primer tratamiento. Los animales se enjaulan individualmente bajo un ciclo de 12 h de luz/oscuridad y se les administra pienso de ratas normal y agua a discreción.

Se incluyen en cada estudio dos grupos de referencia. Se preparan dosis basadas en el peso corporal medio del grupo en mg/kg en 10% de DMSO en aceite de sésamo (estudios sc) o en 1,0% de Tween 80 en solución salina (estudios po). Se administra a los animales los compuestos de ensayo a dosis que varían entre 0,01 y 10 mg/kg del peso corporal medio del grupo. Se incluyen grupos de referencia en cada prueba de referencias (0,1 mg/kg, sc o 0,3 mg/kg, po) del vehículo y de etinil estradiol (EE). Cuando se prueba su actividad antagonista en los compuestos, EE se administra conjuntamente a razón de 0,1 ó 0,3 mg/kg para los estudios sc o po, respectivamente. Los compuestos de ensayo se administran hasta el día en que se mide la temperatura de la piel de la cola.

Tras el periodo de aclimatación de cuatro días, se tratan los animales una vez al día con el/los compuesto(s) de interés. Existen 10 animales/grupo de tratamiento. La administración del compuesto es mediante inyección sc de 0,1 ml en la nuca del cuello o po en un volumen de 0,5 ml. El 3er día de tratamiento, se implanta por vía subcutánea un sedimento de morfina (75 mg de sulfato de morfina). El 5º día de tratamiento, se implantan uno o dos sedimentos de morfina adicionales. El octavo día, aproximadamente la mitad de los animales se inyectan con Ketamina (80 mg/kg, por vía intramuscular) y un termopar, conectado a un sistema de adquisición de datos MacLab (API Instruments, Milford, MA) se pega con cinta adhesiva en la cola aproximadamente a una pulgada del nacimiento de la cola. Este sistema permitió la medición continua de la temperatura de la piel de la cola. La temperatura de referencia se mide durante 15 minutos, a continuación se administra sc (0,2 ml) naloxona (1,0 mg/kg) para bloquear el efecto de la morfina y se mide la temperatura de la piel de la cola una hora después. El noveno día, el resto de los animales se instalan y se analizan de manera similar.

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Ejemplo 19

Función vasomotora en anillos aórticos aislados de rata

Las ratas Sprague-Dawley (240-260 gramos) se dividen en 4 grupos:

1.

No ovariectomizadas normales (intactas)

2.

Ovariectomizadas (ovex) tratadas con vehículo

3.

Ovariectomizadas tratadas con 17\beta-estradiol (1 mg/kg/día)

4.

Animales ovariectomizados tratados con compuesto de ensayo (es decir, 1 mg/kg/día)

Se extirpan los ovarios a los animales aproximadamente 3 semanas antes del tratamiento. Cada animal recibe 1 mg/kg/día de sulfato de 17\beta-estradiol o de compuesto de ensayo puesto en suspensión en agua destilada, desionizada con 1% de Tween-80 por sonda nasogástrica. Los animales tratados con vehículo recibieron un volumen apropiado del vehículo utilizado en los grupos tratados con fármaco.

Se practica la eutanasia a los animales mediante inhalación de CO_{2} y extracción de sangre. Sus aortas torácicas se eliminan rápidamente y se colocan en solución fisiológica a 37ºC con la siguiente composición (mM): NaCl (54,7), KCl (5,0), NaHCO_{3} (25,0), MgCl_{2} 2H_{2}O (2,5), D-glucosa (11,8) y CaCl_{2} (0,2) gasificada con CO_{2}-O_{2}, 95%/5% para un pH final de 7,4. Se retira la adventicia de la superficie externa y se corta el vaso en anillos de 2 a 3 mm de anchura. Se ponen en suspensión los anillos en un baño del tejido de 10 ml con un extremo unido al fondo del baño y el otro a un transductor de fuerzas. Se coloca una tensión de reposo de 1 gramo en los anillos. Los anillos se equilibran durante 1 hora, se obtienen señales y se analizan.

Tras el equilibrio, los anillos se exponen a concentraciones crecientes de fenilefrina (10^{-8} a 10^{-4} M) y se registra la tensión. Los baños se enjuagan a continuación 3 veces con tampón reciente. Tras el lavado, se añade L-NAME 200 mM al baño de tejido y se equilibra durante 30 minutos. Se repite a continuación la curva de respuesta de concentración de fenilefrina.

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Ejemplo 20

Mejora del conocimiento en el laberinto de brazos radiales de ocho brazos

Se utilizan ratas CD, Sprague-Dawley macho (Charles River, Kingston, NY) que pesan 200 a 250 g a la llegada. Durante una semana, las ratas se enjaulan, seis en cada jaula, con pienso de laboratorio normal y agua disponible a discreción. El enjaulado es en una sala de colonias mantenida a 22ºC y tenía un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad con luces a las 6:00 A.M. Tras la habituación a la instalación, los animales se enjaulan individualmente y se mantienen a 85% de peso sin alimento. Una vez se alcanzan pesos estables, las ratas se aclimatan al laberinto radial de 8
brazos.

La estructura del laberinto es una adaptación de la de Peele y Baron (Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 29:143-150, 1988). El laberinto está elevado a una altura de 75,5 cm y está compuesto de un área circular rodeada por 8 brazos que radian a partir del centro, equidistantes unos de otros. Cada brazo es de 58 cm de longitud \times 13 cm de altura. Un cilindro transparente de plexiglás se baja para encerrar al animal en la parte central del laberinto antes del comienzo de cada sesión. Cada brazo del laberinto está equipado con 3 conjuntos de fotocélulas con interfase en una unidad de adquisición de datos, que a su vez está interconectada a un ordenador. Las fotocélulas se utilizan para seguir la pista del movimiento de la rata en el laberinto. Alimentadores de gránulos situados por encima de las tazas de pienso al final de cada brazo, distribuyen dos gránulos de chocolate de 45 mg cuando la fotocélula externa del brazo se activa por primera vez en una sección dada. El laberinto está situado en una sala de ensayo con carteles geométricos negros y blancos en cada pared que sirven como señales visuales. Durante todos los procedimientos de entrenamiento y ensayo, es audible un ruido blanco (\sim70 db).

El procedimiento de entrenamiento consta de cinco fases, cada una con sesiones diarias que duran 5 ó 10 minutos. Un retraso de 10 segundos se impone entre el tiempo en que se coloca la rata en la parte central del laberinto y cuando se eleva el cilindro para comenzar la sesión. Durante la fase I, las parejas de ratas con alimento restringido se colocan en el laberinto durante 10 minutos con gránulos de pienso de chocolate de 45 mg esparcidos por los 8 brazos del laberinto. Durante la fase II, cada rata se coloca individualmente en el laberinto durante un periodo de 10 minutos, con los gránulos esparcidos desde la fotocélula del medio hasta la taza de pienso de cada brazo. Durante la fase III, cada rata se coloca en el laberinto durante un periodo de 10 minutos con los gránulos de pienso situados solamente en las tazas de pienso y alrededor de las mismas en cada brazo. En la fase IV se deja que cada rata recoja 10 minutos dos gránulos de cada brazo. La reentrada en un brazo se considera un error. Las ratas son entrenadas diariamente de esta manera hasta que alcanzan un criterio de rendimiento con menos o igual a 2 errores totales en tres días consecutivos de entrenamiento. El tiempo total de habituación y de entrenamiento es aproximadamente de 3
semanas.

El compuesto de ensayo se prepara en solución salina tamponada con fosfato y se administra en un volumen de 1 ml/kg. La escopolamina HBr (0,3 mg/kg s.c.) sirvió como agente incapacitante, produciendo un aumento en la tasa de error (pérdida de memoria). El compuesto de ensayo se administra por vía intraperitoneal simultáneamente con la escopolamina, 30 minutos antes de la primera exposición al laberinto en cualquier día de un ensayo dado.

Para evaluar el compuesto de ensayo, se diseña un cuadrado latino equilibrado 8 \times 8 para mediciones repetidas, con el objetivo de conseguir una eficacia experimental elevada con la cantidad mínima de animales. Se realizan ocho sesiones experimentales, dos a la semana, con los 8 tratamientos (vehículo, escopolamina, 3 dosis de compuesto de ensayo en combinación con escopolamina) al azar en cada sesión. Cada tratamiento siguió a cada uno de los demás tratamientos el mismo número de veces. Por consiguiente, el efecto residual de cada tratamiento pudo estimarse y separarse del efecto directo del tratamiento. Siguiendo ANOVA, se realizan múltiples comparaciones utilizando el ensayo de dos caras de Dunnett en medio ajustado.

Los animales que no realizan 4 elecciones correctas en 5 minutos durante la primera exposición, o que no han hecho un total de 8 elecciones al final de la 2ª exposición, se considera que han "agotado el tiempo" para esta sesión. Cada animal que ha "agotado el tiempo" después de la administración de una dosis del compuesto de ensayo se excluye del análisis.

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Ejemplo 21

Neuroprotección Inhibición de la muerte dependiente del tiempo de células en cultivos de neuronas corticales primarias

Se produjeron neuronas corticales primarias a partir de cerebros de rata que tenían de 0 a 1 días de vida utilizando una variación de los procedimientos descritos por Monyer et al. 1989, Brain Research 483:347-354. Tejido cerebral dispersado se cultivó en DMEM/10% de PDHS (suero de caballo donante preñado) durante tres días y a continuación se trató con citosina arabinósido (ARC) durante dos días para eliminar las células gliales contaminantes. El 5º día, se eliminó el medio con ARC y se sustituyó por DMEM/10% de PDHS. Se cultivaron células neuronales durante 4 a 7 días más antes de su utilización.

Los cultivos neuronales primarios de referencia muestran una muerte celular progresiva entre los días 12 y 18 en el cultivo. Se evaluaron en doce cultivos los días 12 y 16 las concentraciones de la enzima lactato deshidrogenasa (LD) después de añadir compuesto de ensayo a los 6 cultivos mantenidos en DMEM y 10% de PDHS el 9º día y manteniendo los cultivos restantes como referencias. Se analizó LD utilizando una variación del método de Wroblewski et al. 1955, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 90:210-213. LD es una enzima citosólica que se utiliza normalmente tanto en investigación clínica como básica para determinar la viabilidad del tejido. Un aumento en la LD media está directamente relacionado con la muerte celular.

Neuroprotección contra la citotoxicidad producida por hipoglucemia

Células C6 de glioma conseguidas en la ATCC se colocaron en placas en medio RPMI con FBS a una concentración de 1 \times 10^{6} células/ml en matraces de cultivo tisular FALCON de 25 cm^{2}. Cuatro horas antes del comienzo de la hipoglucemia, se descartó el medio de mantenimiento, se lavaron dos veces las monocapas en el medio apropiado y a continuación se incubaron durante cuatro horas a 37ºC en suero exento o suero exento más compuesto de ensayo. Se utilizó tampón fosfato Ringer de Krebs para lavar las monocapas dos veces antes de la adición del tratamiento de glucosa apropiado. El medio RPMI contiene 2 mg de glucosa/ml; se dividieron los matraces en grupos de 6, recibiendo cada uno glucosa al 100% (2 mg/ml), glucosa al 80% (1,6 mg/ml), glucosa al 60% (1,2 mg/ml) o 0% de glucosa (tampón) o enriquecidos con el compuesto de ensayo. Se incubaron todos los matraces durante 20 horas y a continuación se evaluó el número total de células vivas y muertas utilizando azul de tripano.

Neuroprotección contra aminoácidos excitotóxicos

Cinco placas de cultivo que contenían células SK-N-SH de neuroblastoma se trataron con el compuesto de ensayo y 5 placas de cultivo se trataron con medio RPMI. Cuatro horas después, se trataron todas las células con NMDA (500 \muM) durante 5 minutos. Se determinaron a continuación las células vivas y las células muertas totales.

Neuroprotección frente a la privación de oxígeno-glucosa

Análisis de núcleos picnóticos para medir la apoptosis: Se preparan neuronas corticales a partir de fetos E18 de rata y se colocan en placas en secciones en la cámara de 8 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (10 ng/ml) y suero a una densidad de 100.000 células/pocillo. Se colocan las células en placas en medio DMEM rico en glucosa que contiene 10% de FCS y se mantienen en la incubadora a 37ºC con 10% de CO_{2}/90% de aire. Al día siguiente, se retira el suero sustituyendo el medio de cultivo por DMEM rico en glucosa que contiene complemento B27 y las células se mantienen en la incubadora sin cambio adicional del medio hasta el día del experimento. El 6º día, las secciones se dividen en dos grupos; grupo de referencia y grupo OGD. Las células en el grupo de referencia reciben DMEM con glucosa y B27 habitual (sin antioxidantes). Las células en el grupo OGD reciben DMEM sin glucosa con el B27 habitual, que se ha desgasificado al vacío durante 15 min. Se rocían las células con 90% de N_{2}/10% de CO_{2} durante 10 min. en una cámara hermética y se incuban a 37ºC durante 6 h. Después de 6 h, tanto las células de referencia como las OGD se someten a la sustitución del medio que contiene vehículo (DMSO) o compuesto de ensayo en DMEM que contiene glucosa con el B27 habitual. Las células se devuelven a la incubadora normoxic a 37ºC. Después de 24 h, se fijan las células en 4% de PFA durante 10 min. a 4ºC y se tiñen con Topro (colorante fluorescente de fijación nuclear). Se evalúa la apoptosis utilizando el citómetro de exploración por láser midiendo los núcleos picnóticos.

Medición de la liberación de LDH como indicación de la muerte celular: Se preparan neuronas corticales procedentes del feto E18 de rata y se colocan en placas de cultivo de 48 pocillos recubiertas previamente con poli-D-lisina (10 ng/ml) y suero a una densidad de 150.000 células/pocillo. Se colocan las células en placas en medio DMEM que contiene 10% de FCS y se mantienen en la incubadora a 37ºC con 10% de CO_{2}/90% de aire. Al día siguiente, se retira el suero sustituyendo medio de cultivo por DMEM rico en glucosa que contiene complemento B27. El 6º día, las células se dividen en dos grupos; grupo de referencia y grupo OGD. Las células en el grupo de referencia reciben DMEM con glucosa y B27 habitual (sin antioxidantes). Las células en el grupo OGD reciben DMEM sin glucosa con el B27 habitual, que se ha desgasificado al vacío durante 15 min. Se rocían las células con 90% de N_{2}/10% de CO_{2} durante 10 min. en una cámara hermética y se incuban a 37ºC durante 6 h. Después de 6 h, tanto las células de referencia como las OGD se someten a la sustitución del medio que contiene vehículo (DMSO) o compuesto de ensayo en DMEM que contiene glucosa con el B27 habitual. Las células se devuelven a la incubadora normoxic a 37ºC. Después de 24 h, se evalúa la muerte celular midiendo la liberación celular de LDH (lactato deshidrogenasa) en el medio de cultivo. Para el análisis de LDH, se transfiere una alícuota de 50 \mul de medio de cultivo a la placa de 96 pocillos. Después de la adición de 140 \mul de tampón de fosfato potásico 0,1 M (pH 7,5) y 100 \mul 0,2 mg/ml de NADH, la placa se deja reposar a la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min. La reacción se inicia mediante la adición de 10 \mul de piruvato sódico. Se lee la placa inmediatamente a 340 nM en un lector de placas Thermomax (Molecular Devices). Se registra la absorbancia, índice de concentración de NADH, cada 6 segundos durante 5 minutos y se utiliza la pendiente que indica el ritmo de desaparición de NADH para calcular la actividad de LDH.

Actividad de LDH (U/ml) =

(\DeltaA/min) (TCF)(20) (0,0833/(0,78)

\quad

donde: 0,0833 = constante de proporcionalidad

\quad

0,78 = longitud de paso de la luz del instrumento (cm)

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Ejemplo 22

Procedimiento de ensayo en ratas de HLA - Enfermedad de Crohn y trastornos inflamatorios del intestino

Se adquieren ratas HLA-B27 macho en Taconic y se les proporciona acceso no restringido a un pienso (PMI Lab diet 5001) y agua. Al comienzo del estudio, las ratas tienen entre 22 y 26 semanas de vida.

Se dosifica por vía subcutánea a las ratas una vez al día durante siete días una de las formulaciones listadas a continuación. Había cinco ratas en cada grupo y la última dosis se administra dos horas antes de la eutanasia.

\bullet

vehículo (50% de DMSO/50% de PBS de Dulbecco)

\bullet

17\alpha-etinil-17\beta-estradiol (10 \mug/kg)

\bullet

compuesto de ensayo

Se observa la calidad de los excrementos y se clasifica según la escala siguiente: diarrea = 3; excremento blando = 2; excremento normal = 1. Al final del procedimiento del ensayo, se recoge el suero y se almacena a -70ºC. Se prepara una sección de colon para análisis histológico y se analiza la actividad de mieloperoxidasa en el segmento adicional.

Para medir la actividad de la mieloperoxidasa se utiliza el procedimiento siguiente. Se recoge tejido de colon y se conserva al instante en nitrógeno líquido. Una muestra representativa del colon completo se utiliza para garantizar la constancia entre las muestras. Se guarda el tejido a -80ºC hasta su utilización. A continuación, se pesa el tejido (aproximadamente 500 mg) y se homogeneiza en 1:15 p/v de tampón de lavado de H_{2}KPO_{4} 5 mM (pH 6). Se centrifuga el tejido a 20.000 \times g en una centrifugadora Sorvall RC 5B durante 45 minutos entre 2 y 8ºC. A continuación se descarta el sobrenadante. Se vuelve a poner en suspensión el tejido y se homogeneiza en 2,5 ml (1:5 p/v) de H_{2}KPO_{4} 50 mM con EDTA 10 mM y 0,5% de bromuro amónico Hex para ayudar a disolver el MPO intracelular. Se congela el tejido en nitrógeno líquido, se descongela en un baño de agua a 37ºC y se somete a ultrasonidos durante 15 segundos para asegurar la lisis de la membrana. Se repite 3 veces este procedimiento. A continuación se mantienen en hielo las muestras durante 20 minutos y se centrifugan a 12.000 \times g durante 15 minutos entre 2 y 8ºC. Se analiza el sobrenadante después de estas etapas.

Se prepara la mezcla de ensayo añadiendo 2,9 ml de H_{2}KPO_{4} 50 mM con 0,167 O-dianisidina/ml con 0,0005% de H_{2}O_{2} en un tubo de reacción. Cuando se degrada el peróxido de hidrógeno, se oxida la O-dianisidina y se absorbe a 460 nm en función de la concentración. Se calienta la mezcla a 25ºC. Cien (100) \mul del sobrenadante de tejido se añaden al tubo de reacción, se incuba durante un minuto a 25ºC, a continuación se transfiere 1 ml a una cubeta disponible de plástico. Se mide la D.O. cada periodo de reacción de 2 minutos a 460 nm frente a un blanco que contiene 2,9 ml de la mezcla de reacción y 100 \mul de la solución de bromuro amónico al 0,5%.

Se cuantifican las unidades de actividad enzimática por comparación de la absorbancia @ 460 en una curva patrón preparada con 31,1 unidades/vial de MPO humano. El MPO se redisuelve y se diluye en serie utilizando H_{2}KPO_{4} 50 mM con EDTA 10 mM y 0,5% de bromuro amónico Hex a cuatro concentraciones conocidas. Se comparan las absorbancias de la muestra frente a esta curva para determinar la actividad.

El análisis histológico se realiza de la manera siguiente. Se sumerge tejido de colon en 10% de formalina tamponada neutra. Cada muestra de colon se separa en cuatro muestras para su evaluación. Los tejidos fijados en formalina se procesan en un procesador de infiltración al vacío durante la impregnación con parafina. Las muestras se seccionan a 5 \mum y a continuación se tiñen con hematoxilina y eosina (H&E) para las evaluaciones histológicas a ciegas utilizando una escala modificada según Boughton-Smith. Una vez terminadas las puntuaciones las muestras se descubren y los datos se tabulan y analizan por modelado lineal ANOVA con múltiples comparaciones del medio.

Todas las patentes, publicaciones y otros documentos citados en la presente memoria se incorporan a la misma como referencia en su totalidad.

Claims (11)

1. Compuesto de fórmula:

7

en la que:

R_{1} es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, halógeno, CN o alcoxi opcionalmente sustituido;

R_{2} es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, o fenilo opcionalmente sustituido; o

R_{1} y R_{2} pueden formar conjuntamente un anillo de 5 a 7 elementos; y

R_{3} y R_{4} son cada uno, independientemente, H, OH, halógeno, CN, fenilo opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido o alcoxi opcionalmente sustituido; o su sal farmacéuticamente aceptable.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R_{1} es alquilo opcionalmente sustituido.

3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el que R_{2} es hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido.

4. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R_{1} y R_{2} forman conjuntamente un anillo de 6 elementos.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R_{3} es H, halógeno o CN.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que R_{4} es hidrógeno.

7. Compuesto según la reivindicación 6, en el que R_{4} es F.

8. Compuesto según la reivindicación 1, que es:

(a)

oxima del 1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído;

(b)

oxima del 5-fluoro-1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído;

(c)

oxima del 5-cloro-1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído;

(d)

oxima del 5-bromo-1-(4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído;

(e)

oxima de la (4E)-9-(4-hidroxifenil)-1,2,3,9-tetrahidro-4H-carbazol-4-ona; o

(f)

oxima del 1-(4-hidroxifenil)-H-indol-3-carbaldehído,

(g)

oxima del 1-(3-fluoro-4-hidroxifenil)-2-metil-1H-indol-3-carbaldehído

o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

9. Composición farmacéutica que comprende:

(a)

un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y

(b)

un vehículo farmacéutico.

10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su utilización como medicamento.

11. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la preparación de un medicamento destinado a:

la inhibición de la osteoporosis en un mamífero que lo necesita;

la inhibición de la osteoartritis, hipocalcemia, hipercalcemia, enfermedad de Paget, osteomalacia, osteohalistéresis, mieloma múltiple y otras formas de cáncer con efectos perjudiciales en los tejidos óseos en un mamífero que lo necesita,

la inhibición del crecimiento de tejidos anormales benignos o malignos en un mamífero que lo necesita,

la disminución de las concentraciones de colesterol, triglicéridos, Lp(a) y LDL; o la inhibición de la hipercolesterolemia; hiperlipidemia; cardiovasculopatía; ateroesclerosis; vasculopatía periférica; restenosis o vasoespasmo; o la inhibición de la lesión de la pared vascular procedente de episodios celulares que conducen a la lesión vascular inmunomediada en un mamífero que lo necesita,

la inhibición de enfermedades producidas por radicales libres en un mamífero que lo necesita,

el aporte de la mejora del conocimiento o de la neuroprotección; o al tratamiento o a la inhibición de las demencias seniles, la enfermedad de Alzheimer, la disminución cognitiva o los trastornos neurodegenerativos en un mamífero que lo necesita,

la inhibición de la enfermedad inflamatoria del intestino, proctitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, colitis, sofocos, atrofia vaginal o vulvar, vaginitis atrófica, sequedad vaginal, prurito, dispareunia, disuria, micción frecuente, incontinencia urinaria, infecciones del conducto urinario, síntomas vasomotores, calvicie de tipo masculino; atrofia de la piel; acné; diabetes tipo II; hemorragia disfuncional uterina; o infecundidad en un mamífero que lo necesita, o

la inhibición de la leucemia, ablaciones del endometrio, nefritis o hepatitis crónica o enfermedades o trastornos de coagulación en un mamífero que lo necesita.