DE602004012326T2 - Vorkonzentrationsverbindung zur Kopplung von kapillarer Elektrochromatografie und Kapillarzonenelektrophorese - Google Patents

Vorkonzentrationsverbindung zur Kopplung von kapillarer Elektrochromatografie und Kapillarzonenelektrophorese Download PDF

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Description

  • Erfindungsgemäßes Gebiet:
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anordnung und ein Verfahren einer zwei-dimensionalen Trennung einer komplexen Mischung z. B. von Peptiden. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Kapillar-Elektrochromatographie (capillary electrochomatography CEC) gefolgt von einer Kapillarzonenelektrophorese (capillary zone electrophoresis CZE), welche direkt in ein Massenspektrometer sprüht.
  • Erfindungsgemäßer Hintergrund:
  • Zwei-dimensionale flüssigkeitschromatographische/massenspektrometrische Verfahren (LC/MS) beginnen eine Schlüsselrolle in der Proteomforschung und bei Anwendungen aufgrund der Tatsache zu spielen, dass gefunden wurde, dass 2D-LC einige der Beschränkungen überwindet, welche für eine 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) entscheidend sind, was gut zusammengefasst ist [Lit. 1]. Hauptvorteile sind Automatisierung, kürzere Analysezeit, höhere Empfindlichkeit und erhöhte Reproduzierbarkeit. Verdünnte Proben können auf der Säule konzentriert werden, und Koppeln mit verschiedenen Detektionssystemen ist möglich, wie UV, LIF und insbesondere MS, was zu einer schnelleren Identifizierung und Quantifizierung führt.
  • Eine Analyse auf der Peptidebene ist aus mehreren Gründen bevorzugt, hauptsächlich aber, weil Peptide anfänglich in einer großen Vielfalt von Lösungsmitteln besser löslich sind und leichter zu trennen sind als die Ausgangsproteine. Es gibt jedoch einen Nachteil beim Arbeiten mit Peptiden, nämlich die Anzahl der Spezies, welche gelöst werden sollen, was daher eine höhere Auflösung während der Trennung erfordert und die Verwendung von verfügbaren Vorfraktionierungstechniken wichtiger macht.
  • Die grundlegende Idee eines online-2D-LC-Systems ist es, dass es eine langsame Trennung in der ersten Dimension und eine schnelle Trennung in der zweiten Dimension aufweist. Um die Erfordernisse für eine hohe Auflösung in der zweiten Dimension ohne Verminderung der Probennahmerate oder Verlangsamen der ersten Dimension zu erfüllen, müssen wenigstens zwei Säulen der zweiten Dimension parallel eluiert werden. Der am häufigsten beschriebene, aber ebenso der am häufigsten angewendete und kommerzialisierte 2D-LC-Ansatz ist Ionenaustauschchromatographie (ion exchange chromatography IEX) gefolgt von RPLC. Die zwei Techniken sind vollständig orthogonal, die erste basiert auf einem Ladungstrennungsmechanismus (Salzeluierungsschritte), die zweite basiert auf Hydrophobizität (Gradienteneluierung mit einem organischen Lösungsmittel). IEX ist nicht kompatibel mit MS, weshalb es als erste Dimension verwendet wird. Die Fraktionen von IEX werden aufgefangen und auf einer oder zwei parallelen Anreicherungssäulen gewaschen, dann einer zweiten Trennung durch RPLC (eine oder zwei parallele Säulen) unterzogen, welche direkt mit MS gekoppelt werden kann, typischerweise durch eine ESI-Verbindung. Noch eine Beschränkung dieses Ansatzes ist die insgesamt lange Zeit der Analyse. Theoretisch ist eine der Kombinationen, welche die meisten Vorteile bieten, eine LC, welche von Kapillarzonenelektrophorese (CZE) gefolgt wird, aber bisher wurde nichts von dieser spezifischen Kopplung kommerzialisiert, und wenig kann in der Literatur gefunden werden. Diese zwei Techniken sind ebenso orthogonal und untereinander und mit Massenspektrometrie kompatibel. Beide stellen eine hohe Auflösung bereit, welche die gesamte Spitzenkapazität erhöht, und sie können zusammen schneller als eine beliebige andere 2D-Kombination sein. Die Rate, bei welcher CZE-Trennungen ausgeführt werden können, ermöglicht die kontinuierliche Probennahme des Effluats von der ersten Säule in die zweite, was die 2D-Analyse in der Zeit ausführt, welche notwendig ist, um die erste Dimension auszuführen, d. h. die Zeit, welche notwendig ist, um eine RPLC-Trennung durchzuführen. Der kritische Punkt, welcher historisch die Entwicklung von dieser Strategie verlangsamt hat, ist wahrscheinlich die Verbindung zwischen den zwei Trennungstechniken. Interessante Ideen, welche nicht immer für diese spezifische Kopplung vorgesehen sind, sind mehr oder weniger valide Lösungen. Wenige alternative Verfahren werden in der Patentliteratur beschrieben, wie solche, welche auf einem mechanischen Ventil basieren ( US 5 240 577 A ), und solche, welche auf einem Flussausguss- ( US 5 496 460 A ) oder optischem Ausgusskonzept ( US 5 269 900 A ) basieren. Wie im US-Patent 6 192 768 B1 beschrieben, könnte ein anderes Konzept ebenso verwendet werden, welches auf Dispergieren von Tröpfchen von definierten Volumina aus einem kontinuierlichen Fluß zum Beispiel in eine Kapillare für eine Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis CE) durch eines von mehreren Mittel basiert. Andere Konzepte, z. B. basiert auf der Kontrolle von EOF (electro osmotic flow, elektroosmotischer Fluß), werden in US 6 475 363 B1 beschrieben. Aber in allen Fällen, abgesehen einzelner Beschränkungen, verbleibt noch ein allgemeiner Nachteil, dass heißt, dass das meiste Effluats in den Abfall geht, mit dem Risiko, Informationen zu verlieren, und die Empfindlichkeit ist sicherlich nicht verbessert.
  • Es ist deshalb ein erfindungsgemäßer Gegenstand, eine Lösung zum Überwinden der Beschränkung auf der Verbindungsebene zwischen der ersten Trennung und dem folgenden Trennungsschritt ohne die Nachteile vorzuschlagen, welche in Beziehung zu den vorgeschlagenen Ideen angegeben werden.
  • Es ist insbesondere ein erfindungsgemäßer Gegenstand, eine Verbindung zwischen einer ersten CEC-Trennung und einer zweiten CZE-Trennung vorzuschlagen.
  • Die Erfindung schlägt eine Anordnung bzw. ein Verfahren gemäß dem Wortlaut von Anspruch 1 bzw. 5 und eine Verwendung gemäß Anspruch 13 vor.
  • Diese Erfindung offenbart hauptsächlich eine Anordnung bzw. ein Verfahren zur Probennahme des Effluats der ersten Säule in die zweite so, dass hinreichend Zeit für eine Kapillarzonenelektrophoresetrennung einer injizierten Fraktion ohne Kontamination vom kontinuierlichen Fluß gegeben ist. Fraktionen, welche von der ersten Säule eluieren, werden in einem kurzen Segment, welches durch zwei Elektroden definiert ist, vor der nächsten Injektion zwischen einer zweiten Trennung und einer anderen konzentriert. Dies führt nicht nur zur Konservierung von der gesamten Information, welche in der Trennung der ersten Dimension enthalten ist, sondern ebenso zu einer stark erhöhten Empfindlichkeit und Auflösung in der zweiten Dimension. Vorkonzentrieren auf der Säule in einer Kapillarelektrophorese ist nicht neu [Lit. 10–11], aber diese bekannten Verfahren benötigen entweder diskontinuierliche Puffersysteme, z. B. für Isotachophorese und Feldamplifizierung, oder die Verwendung von absorbierenden oder bindenden Materialien, welche generell ebenso eine Veränderung in der mobilen Phase oder im Puffer für die Desorption benötigen. Elektrokinetisches Einfangen wurde kürzlich ebenso in US 6 428 666 B1 angegeben, wobei Proteine auf Silicapartikeln in einem angewendeten elektrischen Feld gefangen werden und durch Druck in Abwesenheit von einem elektrischen Feld eluiert werden. Kürzlich wurde parallel und unabhängig von dieser Erfindung eine fluidische Elektroeinfangvorrichtung entwickelt und publiziert, welche auf dem Gleichgewicht zwischen hydrodynamischen und elektrischen Kräften basiert [Lit. 11–12]. Dies war jedoch für eine Ein-Schritt-Probenreinigung von Peptiden und Proteinen vor z. B. einer Matrix-assistierten Laserdesorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) oder Vorkonzentration vor einer eindimensionalen Offline-Analyse durch Kapillarelektrophorese vorgesehen, und tatsächlich hilft es nur, das Prinzip zu demonstrieren, auf welchem die Verbindung von dieser Erfindung basiert.
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der Fluß niemals gestoppt, sondern bei der Rate, bei welcher die erste Trennung läuft (z. B. 100 nl/min), konstant gehalten, ungeachtet vom EOF-Wert während der Trennung des zweiten Schritts oder eines Druckabfalls innerhalb des Systems aus welchem Grund auch immer, z. B. Verstopfen oder Blasen. Dies kann dank eines kürzlichen Fortschrittes in der Nanopumpentechnologie ermöglicht werden, welche z. B. durch Agilent Technologies und Dionex LC Packings kommerzialisiert wird. Eine Wirkung davon ist, dass ebenso ein stabiles Elektrospray für die MS-Analyse sichergestellt werden kann.
  • Deshalb bezieht sich eine Alternative der vorliegenden Erfindung, welche in der Stammanmeldung dieser Erfindung beansprucht wird, auf die Kombination von Nano-RPLC anstatt von Mikro-RPLC mit CZE. Mikro-RPLC basiert normalerweise auf Säulen mit einem inneren Durchmesser im Bereich von 0,3 bis 3 mm und welche typische Flussraten im Bereich von 1 bis 500 μl/min haben, während Nano-RPLC auf Säulen mit einem inneren Durchmesser im Bereich von 75 bis 100 Mikron und typischen Flussraten von 0,1 bis 1 μl/min (100 bis 1000 nl/min) basiert. Als Konsequenz sind die Flussraten, welche für LC (< 200 nl/min) angewendet werden, mit der Trennungsgeschwindigkeit von CZE kompatibel, welche jetzt perfekt in Übereinstimmung mit der ersten Säule ist und wiederum mit MS über eine ESI-Verbindung gekoppelt ist. Mit anderen Worten gesagt bedeutet dies, dass das gesamte Effluat aus der RPLC direkt durch den CZE-Kanal ohne Ventile oder Totvolumina fließt, nichts geht in den Abfall, und keine Verdünnung tritt auf.
  • Verändern des Puffers vor einer CZE-Analyse ist für diese Alternative der vorliegenden Erfindung, welche in der Stammanmeldung dieser Erfindung beansprucht wird, nicht notwendig, da Bedingungen gefunden werden können, welche beide mit RPLC- und CZE-Trennungen und ebenso mit Massenspektrometrie kompatibel sind. Dies wurde mit einigen Experimenten bewiesen, wobei die Auflösung, welche durch CZE für eine Mischung von Peptiden (tryptischer Verdau von IgG, was 30 Peptide ergab) in einem Puffer erzielt wurde, welcher aus 20% Acetonitril (ACN)/0,4% Triethylamin (TEA)/0,3% Trifluoressigsäure (TFA) besteht (1c, Alternative der vorliegenden Erfindung, welche in der Stammanmeldung der vorliegenden Erfindung beansprucht wird), mit der Auflösung vergleichbar war, welche in optimalen genau beschriebenen Puffersystemen erzielt werden, welche mit MS und RPLC aufgrund des hohen Salzgehalts und der Anwesenheit von Zusätzen wie zum Beispiel Harnstoff (1a und 1b) inkompatibel waren. Puffer 1 gemäß 1a besteht aus Iminodiessigsäure (IDA) 50 mM, Hydroxyethylcellulose (HEC) 0,5% 7 M Harnstoff. Puffer 2 besteht aus 50 mM IDA/10% Trifluorethanol (TFE)/0,5% HEC. Der Graph gemäß 1c zeigt eine Trennung in einer zweiten Dimension, welche das Ergebnis der vorliegenden Erfindung sein konnte.
  • Erfindungsgemäß wird Kapillar-Elektrochromatographie (CEC) zur Trennung in der ersten Dimension verwendet.
  • Das Problem von Elektrolyse und Blasenbildung, welche auftreten, wenn interne Elektroden verwendet werden, kann verhindert werden, indem anstatt dessen Salzbrückenelektroden oder leitfähige Membranen wie in [Lit. 12–13] integriert werden. Als Teil dieser Erfindung werden zwei Mikroelektroden zur Vorkonzentrierung verwendet, welche gemäß einem möglichen Beispiel aus Mikrokanälen bestehen, welche mit dem CE-Kanal mittels einer sehr engen Öffnung in der Größenordnung von z. B. 2–3 μm in Kontakt stehen und z. B. mit einem Polymer aus Nafion® oder einem anderem ionenselektiven Material gefüllt sind. Nafion® ist im Grunde Teflon® mit Sulfonsäuregruppen, welche darin eingestreut sind, mit einer sehr hohen Affinität für Wasser. Jede Sulfonsäure kann bis zu 13 Wassermoleküle binden, welche als Hydratationswasser angezogen werden. Verbindungen zwischen den Sulfonsäuregruppen führen zu einem sehr schnellen Transfer von Wasser durch das Nafion® und daher ebenso von Protonen. Eine der hauptsächlichen Anwendungen von Nafion® ist tatsächlich als Protonenaustauschmembran in Polymerelektrodenbrennstoffzellen. Gegebenenfalls können andere kleine positive Ionen durchgehen, aber nicht Analyte von der Größe eines Peptids. Dies macht es möglich, dass Peptide, welche in einem chromatographischen Peak ko-eluieren, innerhalb einer kurzen Zone umfasst zwischen zwei dieser Elektroden durch Anwenden einer Spannung darüber mit einer Polarität entgegengesetzt zur Ladung der Peptide (positiv in diesem Fall) konzentriert werden können, wobei die Spannung ausreichend stark ist, um eine Zugkraft auf den hydrodynamischen Fluß zu erreichen. Eine Injektion für CE wird ausgeführt, indem die Potentialdifferenz zwischen den zwei Elektroden abgestellt wird und indem ermöglicht wird, dass der kompaktierte Probenbolus durch den Fluß für eine Zeit transportiert wird, welche notwendig ist, um die zweite Elektrode zu passieren und die Konzentrationszone zu verlassen. Die Spannung, welche zur Trennung zwischen einer zweiten Elektrode und einer Kathode angewendet wird, ist immer an, während diejenige zwischen den zwei Konzentrationselektroden nur während der Injektion abgestellt ist.
  • Die Erfindung ist z. B. in weiteren Details unter Bezugnahme auf 2 beschrieben, welche eine schematische Darstellung der Erfindung zeigt.
  • Nach einer ersten Trennungsvorrichtung 1, wie zum Beispiel einer RPLC-Säule, werden die getrennten Proben bzw. Fraktionen in eine Zwischenprodukt-Zone 11 gebracht, welche in einer Weiterverarbeitungs-Trennungsvorrichtung 3 endet, wie zum Beispiel einem CE-Trennkanal. Wenn die Proben den Trennkanal 3 verlassen, werden sie weitergeleitet und in eine massenspektrometrische Vorrichtung 5 injiziert oder gesprüht.
  • Die Zwischenprodukt-Zone 11 umfasst zwei Elektroden E1 und E2, welche in einem Abstand angeordnet sind, innerhalb dessen eine sogenannte Vorkonzentrationszone 13 definiert ist.
  • Fraktionen, welche die Säule 1 verlassen, werden zuerst in der Vorkonzentrationszone 13 durch Aufrechthalten einer Potentialdifferenz zwischen den zwei Elektroden E1 und E2 auf eine Weise vorkonzentriert, dass Analyte in den Fraktionen nicht die Elektrode E2 passieren können. Nach einer bestimmten Zeit bzw. einer Vorkonzentrationszeit werden die Elektroden abgestellt oder die Polarität wird umgeschaltet, so dass die vorkonzentrierte Analytfraktion die Elektrode E2 passieren kann und in die zweite Trennungsvorrichtung 3 kommen kann, welche z. B. ein CE-Trennkanal ist. Durch Einführen einer Vor-Vorkonzentrationszone, welche durch Elektroden E0 und E1 definiert ist, ist es weiter möglich, das Hereinkommen von weiteren Bestandteilen zu stoppen, welche die RPLC-Vorrichtung in der Vorkonzentrationszone 13 verlassen, bevor eine Injektion in die CE-Zone 3 beendet ist.
  • Natürlich zeigt 2 nur ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Anordnung. Es ist natürlich möglich, weitere Elektroden anzuordnen, um weitere Zonen zur Vorkonzentration zu definieren.
  • Der große Vorteil der erfindungsgemäßen Anordnung ist, dass der Fluß als solcher nicht unterbrochen wird und der Fluß von beliebigen Lösungsmitteln oder Transportflüssigkeiten konstant bleiben soll. Außerdem geht kein Effluat in den Abfall mit dem Risiko, dass Information verloren werden.
  • Um eine Vorstellung der Dimensionen und der Werte für die erfinderischen Verfahren, der Werte für Flussraten, Spannungen und Analysezeiten zu geben, können die folgenden Berechnungen im Sinn eines Beispiels für eine Alternative der vorliegenden Erfindung, welche in der Stammanmeldung dieser Erfindung beansprucht wird, gemacht werden:
    Für RPLC kann eine C18-Säule, welche 15 cm lang × 75 μm ID (innerer Durchmesser) ist, verwendet werden, und es kann eine Flussrate für eine Gradienteneluierung von 100 nl/min angewendet werden. Der CE-Kanal, worin das RPLC-Effluat fließt, kann 50 μm ID aufweisen, und die wirksame Länge, worin Elektrophorese auftritt, kann 5 cm sein. Die Vorkonzentrationszone vor der CE-Trennung ist 1 mm lang.
  • In diesem System beträgt die lineare Flußgeschwindigkeit (vf) 0,085 cm/s. Die elektrophoretische Beweglichkeit (μ) von Peptiden, berechnet aus Trennungen im oben beschriebenen Puffersystem, liegt typischerweise im Bereich von 1,0 × 10–4 cm2 sek–1 V–1 bis 1,6 × 10–4 cm2 sek–1 V–1. Aus der Gleichung ve = μE, wobei ve die elektrophoretische Geschwindigkeit und E das elektrische Feld ist, würde ein elektrisches Feld von 2 KV/cm, d. h. 10 KV über 5 cm, ein ve im Bereich zwischen 0,2 cm/s und 0,36 cm/s ergeben. Deshalb würde die Gesamtgeschwindigkeit (Vtot), welche die Summe von vf und ve ist, im Bereich zwischen 0,285 cm/sek und 0,445 cm/sek liegen, was eine Detektionszeit zwischen 10 s für den ersten Peak und 18 s für den letzten Peak ist, während für einen chromatographischen Peak eine Schätzung von 30 s vernünftig ist. Dieses bedeutet, dass viel Zeit zur Verfügung steht, um eine Elektrophorese laufen zu lassen, während der nächste chromatographische Peak vor der nächsten Injektion konzentriert wird. Wärmebildung und Auflösungsverlust durch einen Joule-Effekt aufgrund der hohen Spannung ist kein großes Thema aufgrund der niedrigen Ionenstärke des flüssigen Systems, der kleinen Dimensionen des Kanals und der Flussrate, welche ständig frische Flüssigkeit bringt.
  • Der Wert des fangenden elektrischen Felds muß größer als das Verhältnis zwischen vf und der niedrigsten Peptidbeweglichkeit sein, d. h. größer als 850 V/cm, d. h. größer als 85 V über 1 mm. Die Zeit, während welcher dieses elektrische Feld Null sein sollte, um eine Injektion zu ermöglichen, ist dann 1,2 s.
  • Ein sehr hoher Konzentrationsfaktor kann erzielt werden.
  • In einer anderen Version von dieser Verbindung wird die Konzentrationszone (ebenfalls 1 mm × 50 μm) mit Kationenaustauschmaterial gefüllt, und die Probenansammlung findet in Abwesenheit eines elektrischen Felds in dieser Zone statt. Eine Probendesorption wird dann durch Anwenden einer ausreichenden Spannung mit Polarität in derselben Richtung wie der Flussrichtung erreicht. Eine Schätzung des benötigten elektrischen Felds wird in diesem Fall nicht gemacht, da dieses von der am Ende verwendeten stationären Phase abhängt, jedoch sollten der niedrige pH und die Anwesenheit von ionenpaarenden Mitteln wie zum Beispiel TFA den Wert dieses Feldes senken. Das oben erwähnte Beispiel als auch die schematische Darstellung, welche in 2 gezeigt wird, wird zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung verwendet, welche natürlich überhaupt nicht in irgend einem Sinn auf das Beispiel und die Darstellung, welche in 2 gezeigt wird, beschränkt ist.
  • Literaturliste
  • Referenzen
    • [1] Sarka Beranova-Giorgianni. Proteon analysis by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry: strengths and limitations [Proteomanalyse durch eine zwei-dimensionale Gelelektrophorese und Massenspektrometrie: Stärken und Beschränkungen] Trends in Anal. Chem. 2003, 22, 273-81.
    • [2] Opiteck et al. Comprehensive two-dimensional high-Performance liquid chromatography for the isolation of overexpressed Proteins and Protein mapping [Umfassende zwei-dimensionale Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie für die Isolierung von überexprimierten Proteinen und Proteinkartierung] Anal. Bioch. 1998, 258, 349-61.
    • [3] Opiteck et al. Comprehensive an-line LC/LC/MS of Proteins [Umfassende Online-LC/LC/MS von Proteinen] Anal. Chem. 1997, 69, 1518-24.
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    • [6] Wagner et al. An automated an-line multidimensional HPLC system for Protein and peptide mapping with integrated sample preparation [Ein automatisiertes onlinemultidimensionales HPLC-System für Protein- und Peptidkartierung mit integrierter Probenpräparation] Anal. Chem. 2002, 74, 809–820.
    • [7] Moore et al. Rapid comprehensive two-dimensional separations of peptides via RPLC-optically gated capillary zone electrophoresis [Schnelle umfassende zweidimensionale Trennungen von Peptiden über RPLC-Kapillarzonenelektrophorese mit optischem Ausguss] Anal. Chem. 1995, 67, 3448-55.
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    • [10] Damon et al. On-line preconcentration methods for capillary electrophoresis [Online-Vorkonzentrationsverfahren zur Kapillarelektrophorese] Electrophoresis [Elektrophorese] 2000, 21, 2768-79.
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    • [12] Astorga-Wells et al. Fluidic preconcentrator device for capillary electrophoresis of Proteins [Fluidische Vorkonzentrationsvorrichtung für eine Kapillarelektrophorese von Proteinen] Anal. Chem. October 1, 2003, 75, 5207-12.

Claims (13)

  1. Anordnung zur zwei-dimensionalen Trennung eines komplexen Analytgemischs beinhaltend eine Kapillar-Elektrochromatographie(CEC)-Säule als eine erste Trennungsvorrichtung zur Trennung in einer ersten Dimension; einen Kapillarzonenelektrophorese(CZE)-Kanal als eine zweite Trennungsvorrichtung zur Trennung in einer zweiten Dimension; und einen Verbindungsbereich zwischen der ersten Trennungsvorrichtung und der zweiten Trennungsvorrichtung, welcher dadurch charakterisiert ist, dass der Verbindungsbereich eine Konzentrationszone beinhaltet welche zwei oder mehr Elektroden zur Konzentrierung der einzelnen Probenfraktionen oder Probenkomponenten umfasst, welche die erste Trennungsvorrichtung verlassen, bevor die Probenfraktionen oder Probenkomponenten in die zweite Trennungsvorrichtung eingeführt werden.
  2. Anordnung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden aus Mikrokanälen bestehen, welche mit einem Nafion-Polymer oder einem anderen Ionenselektiven Material gefüllt sind.
  3. Anordnung gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokanäle mit dem CZE-Kanal mittels einer sehr engen Öffnung im Grössenbereich von 2–3 μm in Kontakt stehen.
  4. Anordnung gemäss einem der Ansprüche 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Verbindungsbereich wenigstens eine weitere Konzentrationszone beinhaltet.
  5. Zwei-dimensionales Kapillar-Elektrochromatographie (CEC)/Kapillarzonenelektrophorese (CZE)-Verfahren umfassend: Trennen eines komplexen Analytgemischs in der der (CEC) mit nachfolgender CZE, dadurch gekennzeichnet, dass im Verbindungsbereich zwischen der CEC und der CZE die Fraktionen, welche die CEC verlassen, in einer Konzentrationszone umfassend zwei oder mehr Elektroden konzentriert werden, bevor sie in die CZE eingeführt werden.
  6. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der vollständige Ausfluss aus der CEC in die CZE mit einer konstanten Flussrate einfliesst.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden aus Mikrokanälen bestehen, welche mit einem Nafion-Polymer oder einem anderen Ionenselektiven Material gefüllt sind.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktionen durch Anlegen wenigstens eines elektrischen Felds konzentriert werden und dass die konzentrierten Fraktionen in Abwesenheit oder unter Umkehr des wenigstens einen elektrischen Felds in die CZE eingeführt werden.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktionen, welche die CEC verlassen, durch Anlegen einer Spannung zwischen den Elektroden mit einer Polarität, welche umgekehrt zur Ladung der Komponenten der Fraktion ist, konzentriert werden, wobei die Spannung ausreichend stark ist, um eine Zugkraft auf die hydrodynamische Strömung zu erreichen und dass das Einführen der Fraktion in die CZE durch Abstellen der Potenzialdifferenz zwischen den Elektroden ausgeführt wird.
  10. Verfahren gemäss Anspruch 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentrationszone ferner ein Ionenaustauschmaterial beinhaltet und dass Probenanreicherung von Probenmaterial, welches die CEC verlässt, in Abwesenheit eines elektrischen Felds auftritt und dass Probendesorption in die CZE durch Anlegen einer Spannung zwischen den Elektroden mit einer Polarität in gleicher Richtung wie die Flussrichtung erreicht wird.
  11. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Komponenten der durch CZE getrennten Fraktion in ein Massenspektrometer eingesprüht werden.
  12. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche 5 bis 11 zur zweidimensionalen Trennung in der Proteomik.
  13. Verwendung einer Anordnung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, zur zweidimensionalen Trennung eines Peptidgemischs.
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