DE602004007284T2

DE602004007284T2 - PYRIMIDINE ALS INHIBITOREN VON PHOSPHOINOSITID-3-KINASEN (PI3Ks)

Info

Publication number: DE602004007284T2
Application number: DE602004007284T
Authority: DE
Inventors: Michael Kevin Ann Arbor CONNOLLY; Rocco Dean Ann Arbor GOGLIOTTI; Mark Stephen Ann Arbor PLUMMER; Melean Ann Arbor VISNICK
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2004-10-19
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2024-10-20
Also published as: WO2005042519A1; JP2007509924A; EP1682532A1; ATE365732T1; BRPI0415860A; ES2285517T3; US20090227587A1; EP1682532B1; CA2543608A1; DE602004007284D1

Description

Phosphoinositid-3-Kinasen (PI3Ks) sind eine Familie von Lipidkinasen, die Phosphoinositole am 3'-OH phosphorylieren, um PI-3-P (Phosphatidylinositol-3-phosphat), PI-3,4-P2 und PI-3,4,5-P3 zu erzeugen. Eine Klasse von PI3Ks wird durch Wachstumsfaktoren stimuliert. Eine separate Klasse von PI3Ks wird durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren aktiviert und schließt PI3Kγ ein. Die Wachstumsfaktor-stimulierten PI3Ks (z.B. PI3Kα) wurden mit Zellproliferation und Krebs in Verbindung gebracht. Es wurde gezeigt, dass PI3Kγ in Signalkaskaden involviert ist. Z.B. wird PI3Kγ als Reaktion auf Liganden, wie C5a, fMLP, ADP und IL-8, aktiviert. Zusätzlich wurde PI3Kγ mit Immunerkrankungen in Verbindung gebracht (Hirsch et al., Science 2000; 287:1049-1053). Makrophagen ohne PI3Kγ ("PI3Kγ null macrophages") zeigen eine verringerte chemotaktische Reaktion und eine verringerte Fähigkeit, Entzündung zu bekämpfen (Hirsch et al., 2000, supra). Darüber hinaus wurde PI3Kγ mit thrombolytischen Erkrankungen (z.B. Thromboembolie, ischämische Erkrankungen, Herzanfälle und Schlaganfall) in Verbindung gebracht (Hirsch et al., FASEB J., 2000; 15(11):2019-2021; und Hirsch et al., FASEB J., 9. Juli 2001; 10.1096/fj.00-0810fje (hierin als Hirsch et al., 2001, zitiert)).
Inhibitoren für Mitglieder der PI3Ks werden zur Behandlung von Humankrankheiten entwickelt (siehe z.B. WO 01/81346 ; WO 01/53266 und WO 01/83456 ). Es besteht ein Bedarf für zusätzliche Verbindungen, die PIK3s inhibieren können, zur Verwendung als pharmazeutische Mittel.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt sorgt die vorliegende Erfindung für Pyrimidine der Formel I:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon; worin:
R⁶ Wasserstoff oder Methyl ist;
Y O, NH oder S ist;
R⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: einem C₂-C₆-Alkyl, einem -L-C₃-C₈-Cycloalkyl, einem Adamantyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyl und -J-R^c;
wobei R^c eine Phenylgruppe oder eine Naphthylgruppe ist,
wobei L nicht vorhanden ist oder ein C₁-C₃-Alkylen ist, und
wobei J nicht vorhanden oder ein C₁-C₄-Alkylen ist.
In bestimmten Ausführungsformen der Formel I ist Y O, R⁶ ist Wasserstoff und R⁴ ist ein C₃-C₈-Cycloalkyl – eine Verbindung der Formel II:
Beispiele einer Verbindung der Formel II schließen, ohne Einschränkung darauf, Folgendes ein:
4-Cycloheptyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid;
4-Cyclopentyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid;
4-Cyclohexyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid;
4-Cyclooctyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid;
4-(2-Cyclohexylethoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid;
4-Cyclohexylmethoxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid;
4-(3,3-Dimethylcyclohexyloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; und
4-(3,5-Dimethylcyclohexyloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
In bestimmten Ausführungsformen der Formel I ist Y O, R⁶ ist Methyl und R⁴ ist C₃-C₈-Cycloalkyl – eine Verbindung der Formel III:
Ein Beispiel einer Verbindung der Formel III ist:
4-Cycloheptyloxy-6-methyl-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
In bestimmten Ausführungsformen der Formel I ist Y NH und R⁶ ist Wasserstoff – eine Verbindung der Formel IV:
Beispiele einer Verbindung der Formel IV schließen, ohne Einschränkung darauf, Folgendes ein:
4-Cyclopentylamino-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(1H-tetrazol-5-yl)amid;
4-Benzylamino-2-morpholin-4-y1-pyrimidin-5-carbonsäure(1H-tetrazol-5-yl)amid; und
4-Cyclohexylamino-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(1H-tetrazol-5-yl)amid;
In bestimmten Ausführungsformen der Formel I ist Y S – eine Verbindung der Formel V:
Ein Beispiel einer Verbindung der Formel V ist:
4-Cycloheptylsulfany1-2-morpholin-4-y1-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
In einem anderen Aspekt sorgt die Erfindung für pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung einer beliebigen der Formeln I–V und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. In bestimmten Ausführungsformen sind diese Zusammensetzungen nützlich in der Behandlung einer PI3K-vermittelten Störung oder eines PI3K-vermittelten Zustands. Die Verbindungen der Erfindung können auch in einer pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert werden, die auch Verbindungen umfasst, die zur Behandlung von Krebs, einer thrombolytischen Erkrankung, Herzerkrankung, eines Schlaganfalls, einer Entzündungserkrankung, wie rheumatoide Arthritis, oder einer anderen PI3K-vermittelten Störung zweckmäßig sind.
In einem anderen Aspekt sorgt die vorliegende Erfindung für Verfahren zum Behandeln eines Subjekts, das an einer PI3K-vermittelten Störung oder einem PI3K-vermittelten Zustand leidet, umfassend: Verabreichen an ein Subjekt, das an einem PI3K-vermittelten Zustand oder einer PI3K-vermittelten Störung leidet, eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung einer beliebigen der Formeln I–V und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. In bestimmten Ausführungsformen ist der PI3K- vermittelte Zustand oder die PI3K-vermittelte Störung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: rheumatoider Arthritis, Spondylarthritis, Osteoarthritis, Arthritis psoriatica, Psoriasis, Entzündungserkrankungen und Autoimmunerkrankungen. In anderen Ausführungsformen ist der PI3K-vermittelte Zustand oder die PI3K-vermittelte Störung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: kardiovaskulären Erkrankungen, Atherosklerose, Hypertonie, tiefer Venenthrombose, Schlaganfall, Myokardinfarkt, instabiler Angina, Thromboembolie, Lungenembolie, thrombolytischen Erkrankungen, akuter arterieller Ischämie, peripheren thrombotischen Okklusionen ("peripheral thrombotic occlusions") und Koronarerkrankung. In noch anderen Ausführungsformen ist der PI3K-vermittelte Zustand oder die PI3K-vermittelte Störung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Krebs, Darmkrebs, Glioblastom, Endometriumkarzinom, Leberzellkrebs, Lungenkrebs, Melanom, Nierenzellkarzinom, Thyreoideakarzinom, Zelllymphom, lymphoproliferativen Störungen, kleinzelligem Lungenkrebs, Plattenepithelkarzinom der Lunge, Gliom, Brustkrebs, Prostatakrebs, Ovarialkarzinom, Zervixkarzinom und Leukämie. In noch einer anderen Ausführungsform ist der PI3K-vermittelte Zustand oder die PI3K-vermittelte Störung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Diabetes Typ II. In noch anderen Ausführungsformen ist der PI3K-vermittelte Zustand oder die PI3K-vermittelte Störung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Atemwegserkrankungen, Bronchitis, Asthma und chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung. In bestimmten Ausführungsformen ist das Subjekt ein Mensch.
DEFINITIONEN
Wie hierin verwendet, haben die folgenden Begriffe die ihnen zugeschriebenen Bedeutungen, soweit nichts anderes angegeben ist.
Eine "PI3K-vermittelte Störung oder ein PI3K-vermittelter Zustand" ist durch die Beteiligung von einer oder mehreren PI3Ks oder einer PI3P-Phosphatase (z.B. PTEN etc.) am Beginn, der Manifestation von einem oder mehreren Symptomen oder Krankheitsmarkern, der Schwere oder dem Fortschreiten einer Störung oder eines Zustandes gekennzeichnet. PI3K-vermittelte Störungen und Zustände schließen, ohne Einschränkung darauf, Folgendes ein: rheumatoide Arthritis, Spondylarthritis, Osteoarthritis, Arthritis psoriatica, Psoriasis, Entzündungserkrankungen, Lungenfibrose, Autoimmunerkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Atherosklerose, Hypertonie, tiefe Venenthrombose, Schlaganfall, Myokardinfarkt, instabile Angina, Thromboembolie, Lungenembolie, thrombolytische Erkrankungen, akute arterielle Ischämie, periphere thrombotische Okklusionen, Koronarerkrankung, Krebs, Brustkrebs, Glioblastom, Endometriumkarzinom, Leberzellkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Melanom, Nierenzellkarzinom, Thyreoideakarzinom, kleinzelligen Lungenkrebs, Plattenepithelkarzinom der Lunge, Gliom, Prostatakrebs, Ovarialkarzinom, Zervixkarzinom, Leukämie, Zelllymphom, lymphoproliferative Störungen, Diabetes Typ II, Atemwegserkrankungen, Bronchitis, Asthma und chronisch-obstruktive Lungenerkrankung.
Eine PI3K ist ein Enzym, das befähigt ist, das 3'-OH eines Phosphoinositols zu phosphorylieren, um PI3P zu erzeugen. PI3Ks schließen, ohne Einschränkung darauf, PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kγ und PI3Kδ ein. Eine PI3K umfasst typischerweise mindestens eine katalytische Untereinheit (z.B. p110γ) und kann weiterhin eine regulatorische Untereinheit (z.B. p101 etc.) umfassen.
Der Begriff "Alkylgruppe" oder "Alkyl" schließt gerade und verzweigte Kohlenstoffkettenreste ein. Der Begriff "Alkylen" bezieht sich auf einen zweibindigen Rest bzw. ein Diradikal ("diradical") eines unsubstituierten oder substituierten Alkans. Z.B. ist ein "C₂-C₆-Alkyl" eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele für geradkettige C₂-C₆-Alkylgruppen schließen, ohne Einschränkung darauf, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl ein. Beispiele verzweigtkettiger Alkylgruppen schließen, ohne Einschränkung darauf, Isopropyl, tert.-Butyl, Isobutyl etc. ein. Beispiele für Alkylengruppen schließen, ohne Einschränkung darauf, -CH₂-, -CH₂-CH₂-, -CH₂-CH(CH₃)-CH₂- und -(CH₂)_1-3 ein. Alkylengruppen können mit Gruppen, wie unten für Alkyl dargelegt, substituiert sein.
Der Begriff Alkyl schließt sowohl "unsubstituierte Alkyle" als auch "substituierte Alkyle" ein, wobei sich das Letztere auf Alkylgruppierungen mit Substituenten bezieht, die ein Wasserstoff an einem oder mehreren Kohlenstoffen des Kohlenwasserstoffgerüstes ersetzen. Derartige Substituenten sind unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Halogen, I, Br, Cl, F, -OH, -COOH, Trifluormethyl, -NH₂, -OCF₃ und O-C₁-C₃-Alkyl.
Typische substituierte Alkylgruppen sind somit 2,3-Dichlorpentyl, 3-Hydroxy-5-carboxyhexyl, 2-Aminopropyl, Pentachlorbutyl, Trifluormethyl, Methoxyethyl, 3-Hydroxypentyl, 4-Chlorbutyl, 1,2-Dimethylpropyl und Pentafluorethyl.
"Halogen" schließt Fluor, Chlor, Brom und Iod ein. Der Begriff "C₃-C₈-Cycloalkyl" bezieht sich auf eine Cycloalkylgruppe, die 3 bis 8 Kohlenstoffatome enthält. Somit umfasst der Begriff "C₃-C₈-Cycloalkyl" monocyclische Cycloalkylgruppen, die 3 bis 8 Kohlenstoffe enthalten, und bicyclische Cycloalkylgruppen, die 7 oder 8 Kohlenstoffe enthalten. Beispiele für "C₃-C₈-Cycloalkyle" schließen, ohne Einschränkung darauf, Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl und Bicyclo[2.2.1]heptyl ein; die Cycloalkylgruppe kann gegebenenfalls ein oder zwei Doppelbindungen (d.h. ein Cycloalkylenyl) enthalten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Cyclopentenyl, Cyclohexenyl und Cycloheptenyl. Ein "C₃-C₈-Cycloalkyl" kann mit ein oder zwei Gruppen substituiert sein, unabhängig ausgewählt aus C₁-C₃-Alkyl (z.B. Methyl) und -O-C₁-C₃-Alkyl (z.B. Methoxy). Beispiele substituierter Cycloalkylgruppen schließen, ohne Einschränkung darauf, Methylcyclopropyl, Dimethylcyclohexyl, 2-Methylcyclohexyl, 3-Methylcyclohexyl, 3,5-Dimethylcyclohexyl und 4-Methylcyclohexyl ein.
Der Begriff "Adamantyl" schließt unsubstituiertes Adamantyl und Adamantyle ein, die mit 1 oder 2 Gruppen substituiert sind, unabhängig ausgewählt aus C₁-C₃-Alkyl (z.B. Methyl) und -O-C₁-C₃-Alkyl (z.B. Methoxy).
Die Phrase "5- oder 6-gliedriges Heterocycloalkyl" bedeutet eine stabile cyclische Gruppe mit Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Heteroatomen, unabhängig ausgewählt aus S, N und O, wobei, wenn zwei O-Atome oder ein O-Atom und ein S-Atom vorhanden sind, die zwei O- Atome bzw. das eine O-Atom und das eine S-Atom nicht direkt aneinander gebunden sind. Gegebenenfalls kann ein 5- oder 6-gliedriges Heterocycloalkyl ein oder zwei Kohlenstoff-Kohlenstoff- oder Kohlenstoff-Stickstoff-Doppelbindungen enthalten. Veranschaulichende Beispiele von 5- oder 6-gliedrigem Heterocycloalkyl schließen Tetrahydrofuran-3-yl, Morpholin-4-yl, Tetrahydrothiopyran-4-yl, Piperidinyl, Tetrahydropyranyl und 4-Methylpiperazin-2-yl ein.
Soweit nicht anders angegeben, können die vorhergehenden Heterocycloalkyle C-gebunden oder N-gebunden sein, wo dies möglich ist, und wobei dies in der Erzeugung einer stabilen Struktur resultiert. Z.B. kann Piperidinyl Piperidin-1-yl (N-gebunden) oder Piperidin-4-yl (C-gebunden) sein.
Umfasst innerhalb des Begriffes "5- oder 6-gliedriges Heterocycloalkyl" sind 5-gliedrige Ringe mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff- oder einer Kohlenstoff-Stickstoff-Doppelbindung im Ring (z.B. 2-Pyrrolinyl, 3-Pyrrolinyl etc.) und 6-gliedrige Ringe mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff- oder einer Kohlenstoff-Stickstoff-Doppelbindung im Ring (z.B. Dihydro-2H-pyranyl, 1,2,3,4-Tetrahydropyridin, 3,4-Dihydro-2H-[1,4]oxazin etc.).
Ein "5-gliedriges Heterocycloalkyl" ist ein stabiler 5-gliedriger, monocyclischer Cycloalkylring mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 1 O; 1 S; 1 N; 2 N; 3 N; 1 S und 1 N; 1 S und 2 N; 1 O und 1 N; und 1 O und 2 N. Veranschaulichende Beispiele stabiler 5-gliedriger Heterocycloalkyle schließen Tetrahydrofuranyl, Dihydrofuranyl, Tetrahydrothienyl, Dihydrothienyl, Imidazolidinyl, Oxazolidinyl, Imidazolinyl, Isoxazolidinyl, Pyrrolidinyl, 2-Pyrrolinyl und 3-Pyrrolinyl ein.
Ein "6-gliedriges Heterocycloalkyl" ist ein stabiler 6-gliedriger, monocyclischer Cycloalkylring mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 1 O; 2 O; 1 S; 2 S; 1 N; 2 N; 3 N; 1 S, 1 O und 1 N; 1 S und 1 N; 1 S und 2 N; 1 S und 1 O; 1 S und 2 O; 1 O und 1 N; und 1 O und 2 N. Veranschaulichende Beispiele stabiler 6-gliedriger Heterocycloalkyle schließen Tetrahydropyranyl, Dihydropyranyl, Dioxanyl, 1,3-Dioxolanyl, 1,4-Dithianyl, Hexahydropyrimidin, Morpholinyl, Piperazinyl, Piperidinyl, 2H-Pyranyl, 4H-Pyranyl, Pyrazolidinyl, Pyrazolinyl, 1,2,3,6-Tetrahydropyridinyl, Tetrahydrothiopyranyl, 1,1-Dioxohexahydro-1λ⁶-thiopyranyl, 1,1-Dioxo-1λ⁶-thiomorpholinyl, Thiomorpholinyl, Thioxanyl und Trithianyl ein.
Der Begriff "5- oder 6-gliedriges Heterocycloalkyl" schließt gesättigte und ungesättigte "5- oder 6-gliedrige Heterocycloalkyle" ein. Die "5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyle" können, wo möglich, wie jene substituiert sein, die oben für C₃-C₈-Cycloalkyle dargelegt sind.
Der Begriff "Phenyl" bezieht sich auf unsubstituierte und substituierte Phenylgruppen. Eine Phenylgruppe kann mit 1 bis 3 Substituenten substituiert sein, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: C₁-C₃-Alkyl, -O-C₁-C₃-Alkyl, -OCF₃, Halogen und einem C₅-C₆-Cycloalkyl.
Typische substituierte Phenylgruppen sind schließen, ohne Einschränkung darauf, 3-Chlorphenyl, 2,6-Dibromphenyl, 2,4,6-Tribromphenyl, 2,6-Dichlorphenyl, 4-Trifluormethyl phenyl, 3-Methylphenyl, 4-Methylphenyl, 3,5-Dimethylphenyl, 3,4,5-Trimethoxyphenyl, 3,5-Dimethoxyphenyl, 3,4-Dimethoxyphenyl, 3-Methoxyphenyl, 4-Methoxyphenyl, 3,5-Difluorphenyl, 4-Chlorphenyl, 3-Trifluormethylphenyl, 3,5-Dichlorphenyl, 2-Methoxy-5-methylphenyl, 2-Fluor-5-methylphenyl, 4-Chlor-2-trifluormethylphenyl und dergleichen ein.
Eine "Naphthylgruppe" bezieht sich auf unsubstituierte und substituierte Naphthylgruppen. Eine Naphthylgruppe kann mit 1 bis 4 Substituenten substituiert sein, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: C₁-C₃-Alkyl, -O-C₁-C₃-Alkyl, -OCF₃, Halogen und einem C₅-C₆-Cycloalkyl.
Einige der Verbindungen in der vorliegenden Erfindung können als Stereoisomere, einschließlich Enantiomere, Diastereomere, und geometrische Isomere vorliegen. Geometrische Isomere schließen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ein, die Alkenylgruppen haben, welche als Entgegen- oder Zusammen-Konformationen vorliegen können, wobei in diesem Fall alle geometrischen Formen davon, sowohl entgegen und zusammen, cis und trans als auch Gemische davon, innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegen. Einige Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben Cycloalkylgruppen, die an mehr als einem Kohlenstoffatom substituiert sein können, wobei in diesem Fall alle geometrischen Formen davon, sowohl cis und trans als auch Gemische davon, innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegen. Alle diese Formen, einschließlich (R), (S), Epimere, Diastereomere, cis, trans, syn, anti, (E), (Z), Tautomere und Gemische davon, werden als Verbindungen der vorliegenden Erfindung angedacht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. EINFÜHRUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Pyrimidine der Formeln I–V, wobei R⁴, R⁶ und Y die in der Beschreibung dafür definierten Werte aufweisen, und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, die als Mittel in der Behandlung von Erkrankungen und Zuständen, einschließlich Entzündungserkrankungen, kardiovaskulären Erkrankungen und Krebsarten, zweckmäßig sind. Ebenfalls bereitgestellt werden pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine oder mehrere Verbindungen der Formeln I–V.
II. HERSTELLUNG DER VERBINDUNGEN
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung (z.B. Verbindungen der Formeln I–V) können durch Anwenden der im Fachgebiet bekannten Synthesemethodologie und der Synthesemethodologie, die in den unten dargelegten Schemata umrissen ist, hergestellt werden. Schema 1
In Schema 1 wird 2 (4-Chlor-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureethylester; Sigma-Aldrich Co.) mit einem geeigneten Hydroxyl-Schutzgruppenreagens PG (z.B. (4-Nitrophenyl)methanol) unter Bereitstellung von 3 (z.B. 2-Methylsulfanyl-4-(4-nitrobenzyloxy)pyrimidin-5-carbonsäureethylester) umgesetzt. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass eine breite Vielfalt an Schutzgruppen in Schema 1 als geeignete Schutzgruppe für eine Hydroxylgruppe verwendet werden kann (siehe z.B. Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Aufl., Kapitel 2 (John Wiley & Sons, Inc., 1991)). Z.B. kann 2 mit einem Alkyllithium (z.B. sek.-Butyllithium, n-Butyllithium) behandelten, substituierten oder unsubstituierten Benzylalkohol (z.B. (4-Nitrophenyl)methanol) in einem Lösungsmittel, wie THF (Tetrahydrofuran) unter Bereitstellung von 3 (z.B. 2-Methylsulfanyl-4-(4-nitrobenzyloxy)pyrimidin-5-carbonsäureethylester) umgesetzt werden.
Die Methylthiogruppe von 3 wird dann zu dem entsprechenden Methylsulfinyl-Derivat unter Verwendung eines geeigneten Oxaziridins (z.B. Davis-Oxaziridin ((1S)-(+)-(10-Camphersulfonyl)oxaziridin) oder 3-Phenyl-2-(phenylsulfonyl)-1,2-oxaziridin etc.), Dimethyldioxirans oder von mCPBA (3-Chlorperoxybenzoesäure) in einem Lösungsmittel wie Chloroform oder Dichlormethan oxidiert. Die Methylsulfinylgruppe wird dann unter Erhalt von 4 (z.B. 2- Morpholin-4-yl-4-(4-nitrobenzyloxy)pyrimidin-5-carbonsäureethylester) durch Morpholin ersetzt.
Die Hydroxylschutzgruppe an 4 wird dann unter Bereitstellung von 5 (z.B. 4-Chlor-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester) entfernt. Z.B. kann eine Nitrobenzyloxygruppe unter Bereitstellung eines Hydroxyls über eine Reduktion mit einem Palladium/Kohlenstoff-Katalysator in einem Alkohollösungsmittel, wie Ethanol, unter Wasserstoffgas bei einem geeigneten Druck abgespalten werden. In bestimmten Ausführungsformen, wenn die Schutzgruppe eine gegebenenfalls substituierte Phenyl- oder Naphthylgruppe von R⁴ ist, wird die Schutzgruppe nicht entfernt. 4 wird dann mit einer Base behandelt und mit Aminotetrazol umgesetzt, wie unten beschrieben, um 9 bereitzustellen.
5 wird mit R^b-OH (z.B. Cycloheptanol) in einer Mitsunobu-Reaktion mit DEAD (Diethylazodicarboxylat) und PPh₃ (Triphenylphosphin) in einem Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran (THF), unter Bereitstellung von 7 (z.B. 4-Cycloheptyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester) umgesetzt. R^b-OH ist eine Verbindung, die eine Verbindung der Formel HO-L-C₃-C₈-Cycloalkyl (wobei L nicht vorhanden oder vorhanden ist), Bicyclo[2.2.1]heptanol, Adamantanol, wobei L nicht vorhanden oder ein C₁-C₃-Alkylen ist, einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist. Beispiele von R^b-OH schließen, ohne Einschränkung darauf, Cyclohexylmethanol, Cyclohexanol, Phenylmethanol, Cycloheptanol und Cyclooctanol ein.
7 wird dann mit einer anorganischen Base (z.B. LiOH, NaOH etc.) in MeOH und THF, Dioxan, Dioxan und Wasser oder Methanol und Wasser unter Bereitstellung der entsprechenden Carbonsäure 8 (z.B. 4-Cycloheptyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure) verseift. Die Carbonsäure wird dann mit 5-Aminotetrazol unter Verwendung von Carbonyldiimidazol (CDI) in einem nicht-protischen Lösungsmittel, wie THF (Tetrahydrofuran), unter Bereitstellung des Carboxamids 9 (z.B. 4-Cycloheptyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid) gekuppelt. Alternativ kann 8 in wasserfreiem CH₂Cl₂ mit einer katalytischen Menge von DMF, gefolgt von Oxalylchlorid, behandelt werden. 5-Aminotetrazol und Triethylamin werden dann zu diesem Gemisch hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von Acetonitril, um 9 zu ergeben. Schema 2
In Schema 2 wird 2, um 3 zu erzeugen, mit einer R^b-OH-Verbindung umgesetzt, die mit einem Alkyllithiumreagens, wie n-Butyllithium, oder einer Hydridbase (z.B. NaH) in wasserfreiem THF behandelt wurde. 3 wird dann oxidiert und mit Morpholin unter Erhalt von 4 wie in Schema 1 umgesetzt. 4 wiederum wird mit Aminotetrazol unter Bereitstellung von 9 wie in Schema 1 umgesetzt. Schema 3
In Schema 3 wird 10 (Morpholin-4-carboxamidin) mit 11 (2-Ethoxymethylenmalonsäurediethylester) und Natriumacetat in DMF unter Bereitstellung von 5 (4-Hydroxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester) umgesetzt. Schema 4
In Schema 4 wird 5 in Dichlormethan mit Oxalylchlorid und einer katalytischen Menge DMF (Dimethylformamid) unter Erhalt von 20 (z.B. 4-Chlor-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester) umgesetzt. 20 wird mit einem Hydridbase (z.B. NaH)-behandelten Alkohol (R^c-OH) oder Thiol (R⁴-SH) unter Bereitstellung von 22 (z.B. 2-Morpholin-4-yl-4-phenoxypyrimidin-5-carbonsäureethylester) umgesetzt. R^c-OH ist eine Verbindung, die eine Verbindung der Formel HO-L-R^d (wobei L vorhanden ist und R^d eine gegebenenfalls substituierte Phenyl- oder Naphthylgruppe ist) einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist. Beispiele von R^c-OH schließen, ohne Einschränkung darauf, 4-Cyclohexylphenol und 4-Isopropylphenol ein. 22 wird dann mit Base behandelt und mit Aminotetrazol unter Bereitstellung von 24 wie in Schema 1 umgesetzt. Schema 5
In Schema 5 wird 2 in Dichlormethan oder Methylenchlorid mit einem basischen Amin, wie Triethylamin, gefolgt von R⁴-NH₂ (z.B. Cyclopentylamin, Benzylamin, Cyclohexylamin etc.), unter Erhalt von 30 (z.B. 4-Cyclopentylamino-2-methylsulfanyl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester) umgesetzt. 30 wird dann oxidiert und mit Morpholin wie in Schema 1 umgesetzt, um 32 (z.B. 4-Cyclopentylamin-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester) zu erzeugen. 32 wird dann verseift, um 34 (z.B. 4-Cyclopentylamino-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure) zu erzeugen, welches dann an 5-Aminotetrazol unter Erhalt von 36 (z.B. 4-Cyclopentylamino-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(1H-tetrazol-5-yl)amid) gekuppelt wird, wie in Schema 1 beschrieben. Schema 6
In Schema 6 wird Thioharnstoff in wasserfreiem Dichlormethan mit N,N-Dimethylacetamiddimethylacetal unter Stickstoffgas umgesetzt. Das Produkt der Reaktion wird aufgearbeitet, in wasserfreiem THF resuspendiert und mit MeI unter Stickstoffgas unter Bereitstellung von 30 (1-[1-(Dimethylamino)ethyliden]-2-methylisothioharnstoff-Hydroiodid) umgesetzt. 30 wird dann unter Stickstoffgas mit Malonylchlorid in wasserfreiem Dichlormethan oder Chloroform mit nachfolgender Zugabe einer Base, wie Triethylamin, unter Bereitstellung von 32 (Ethyl-4-hydroxy-6-methyl-2-(methylthio)-5-pyrimidincarboxylat) umgesetzt. Synthesen unter Verwendung von 32 als Ausgangsmaterial können in einer analogen Weise zu jenen durchgeführt werden, die oben in den Schemata 1–5 beschrieben sind, um für Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu sorgen, in denen R⁶ ein Methyl ist.
III. EVALUIERUNG DER VERBINDUNGEN
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung (z.B. Verbindungen der Formeln I–V und pharmazeutisch annehmbare Salze davon) können hinsichtlich ihrer Fähigkeit, PI3K zu inhibie ren, untersucht werden. Beispiele dieser Assays sind unten dargelegt und schließen in vitro- und in vivo-Assays der PI3K-Aktivität ein.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die Verbindungen jene, die selektiv eine oder mehrere PI3Ks im Vergleich zu einem oder mehreren Enzymen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, einer cyclisches Nucleotid-abhängigen Proteinkinase, PDGF, einer Tyrosinkinase, einer MAP-Kinase, einer MAP-Kinase-Kinase, einer MEKK, einer Cyclin-abhängigen Proteinkinase, inhibieren. In anderen Ausführungsformen der Erfindung sind die Verbindungen jene, die selektiv eine PI3K im Vergleich zu einer anderen PI3K inhibieren. Z.B. zeigen in bestimmten Ausführungsformen Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit, PI3Kγ selektiv im Vergleich zu PI3Kα oder PI3Kβ zu inhibieren. Eine Verbindung inhibiert selektiv ein erstes Enzym im Vergleich zu einem zweiten Enzym, wenn der IC₅₀(-Wert) der Verbindung gegenüber dem ersten Enzym geringer ist als der IC₅₀(-Wert) der Verbindung gegenüber der zweiten Verbindung. Der IC₅₀(-Wert) kann z.B. in einem in vitro-PI3K-Assay gemessen werden.
In gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen können Verbindungen der vorliegenden Erfindung hinsichtlich ihrer Fähigkeit, PI3K-Aktivität in einem in vitro- oder einem in vivo-Assay (siehe unten) zu inhibieren, beurteilt werden.
PI3K-Assays werden in Gegenwart oder Abwesenheit einer PI3K-inhibierenden Verbindung durchgeführt, und die Menge an Enzymaktivität wird für eine Bestimmung der inhibierenden Aktivität bzw. Wirksamkeit der PI3K-inhibierenden Verbindung verglichen.
Proben, die keine PI3K-inhibierende Verbindung enthalten, wird ein relativer PI3K-Aktivitätswert von 100 zugeordnet. Eine Inhibierung der PI3K-Aktivität ist erreicht, wenn die PI3K-Aktivität in Gegenwart einer PI3K-inhibierenden Verbindung geringer ist als die der Kontrollprobe (d.h. keine inhibierende Verbindung). Der IC₅₀(-Wert) einer Verbindung ist die Konzentration der Verbindung, die 50% der Aktivität der Kontrollprobe aufweist. In bestimmten Ausführungsformen haben die Verbindungen der vorliegenden Erfindung einen IC₅₀(-Wert) von weniger als etwa 100 μM. In anderen Ausführungsformen haben Verbindungen der vorliegenden Erfindung einen IC₅₀(-Wert) von etwa 1 μM oder weniger. In noch anderen Ausführungsformen haben die Verbindungen der vorliegenden Erfindung einen IC₅₀(-Wert) von etwa 200 nM oder weniger.
PI3Kγ-Assays wurden im Fachgebiet beschrieben (siehe z.B. Leopoldt et al., J. Biol. Chem., 1998, 273:7024-7029). Typischerweise wird eine Probe, die einen Komplex aus p101- und p110γ-Protein enthält, mit Gβ- und Gγ-Proteinen (z.B. G-Protein β₁/γ₂-Untereinheiten) kombiniert. Radioaktiv markiertes ATP (z.B. γ-³²P-ATP) wird dann zu diesem Gemisch zugefügt. Die Lipidsubstrate werden gebildet, indem PIP₂ erzeugt wird, das Lipidmicellen enthält. Die Reaktionen werden dann durch Zugabe der Lipid- und Enzymgemische gestartet und mittels Zugabe von H₃PO₄ gestoppt. Die Lipidprodukte werden dann auf eine Glasfaser-Filterplatte transferiert und mehrere Male mit H₃PO₄ gewaschen. Das Vorhandensein eines radioaktiven Lipidproduktes (PIP₃) kann unter Verwendung von radiometrischen Verfahren, die im Fachgebiet gut bekannt sind, gemessen werden.
Die Aktivität von Wachstumsfaktor-regulierten PI3Ks kann auch unter Verwendung eines Lipidkinase-Assays gemessen werden. Z.B. kann PI3Kα unter Verwendung von Proben, die eine regulatorische und eine katalytische Untereinheit enthalten, untersucht werden. Ein aktivierendes Peptid (z.B. pY-Peptid, SynPep Corp.) wird zu der Probe mit dem radioaktiv markierten ATP zugegeben. PIP₂-enthaltende Lipidmicellen werden dann zu der Probe zugegeben, um die Reaktion zu starten. Die Reaktionsgemische) werden aufgearbeitet und, wie für den gerade beschriebenen PI3Kγ-Assay beschrieben, analysiert. Die Assays können auch unter Verwendung von Zellextrakten (Susa et al., J. Biol. Chem., 1992; 267:22951-22956) durchgeführt werden.
IV. IN VIVO-BEURTEILUNG DER VERBINDUNGEN
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung (z.B. Verbindungen der Formeln I–V und pharmazeutisch annehmbare Salze davon) können hinsichtlich ihrer Fähigkeit, quantitative oder qualitative Marker von Prozessen, wie Entzündung, zu verringern, untersucht werden. Beispiele für Tiermodelle von Arthritis, die verwendet werden können, um die Fähigkeit einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, rheumatoide Arthritis zu behandeln, zu untersuchen, werden unten beschrieben.
Assay auf Arthritis, die durch Streptokokken-Zellwand ("streptococcal cell wall") (SCW) induziert wird
Arthritis wird mit geringen Modifikationen induziert, wie durch Schwab et al. (1991), Infection and Immunity 59:4436-4442, beschrieben. Ratten erhalten 6 μg beschallte bzw. Ultraschall-behandelte SCW (in 10 μl Dulbeccos PBS (DPBS)) mittels einer intraartikulären Injektion in das rechte tibiotalare Gelenk am Tag 0. Am Tag 21 kann eine Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ mittels systemischer SCW mit 100 μg SCW (250 μl), i.v. verabreicht, initiiert werden. Für orale Verbindungsstudien können die Verbindungen in einem geeigneten Vehikel (z.B. 0,5% Hydroxypropylmethylcellulose/0,2% Tween 80) suspendiert, beschallt bzw. Ultraschall-behandelt und zweimal täglich (10 mg/kg Volumen) verabreicht werden, beginnend 1 Stunde vor der Initiierung der Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ durch i.v.-Injektion von SCW. Die Verbindungen werden typischerweise in Mengen zwischen 10 und 500 mg/kg Körpergewicht/Tag, wie 20, 30, 60, 100, 200 und 300 mg/kg/Tag, verabreicht. Ödemmessungen werden erhalten, indem die Basislinienvolumina der sensibilisierten Hinterpfote vor der Reaktivierung am Tag 21 bestimmt werden, und indem sie mit den Volumina bei nachfolgenden Zeitpunkten, wie Tag 22, 23, 24 und 25, verglichen werden. Quecksilber-Verdrängungsplethysmographie ("mercury displacement plethysmography") ist ein Verfahren, das verwendet werden kann, um das Pfotenvolumen eines Tieres zu untersuchen.
Um Schmerz zu messen, werden die Ratten in einer Vorrichtung platziert, die die Menge des Drucks misst, die auf jede Hinterpfote gebracht wird. Die durchschnittliche Differenz zwischen arthritischen und normalen Pfoten ist ein Verfahren, um den Schmerz zu messen. Zusätz lich können Entzündungszytokin-Spiegel in Material gemessen werden, das aus den arthritischen Gelenken eines Tiers gespült wurde, und sie können mit den Spiegeln bei einem nicht-arthritischen Gelenk oder mit den typischen Spiegeln bei einem nicht-arthritischen Gelenk verglichen werden.
Assay auf Arthritis, die durch Collagen induziert wird
Typ II-Collagen-induzierte Arthritis ("Type II collagen-induced arthritis") (CIA) bei Mausen ist ein experimentelles Modell rheumatoider Arthritis (siehe z.B. Stuart et al. (1984), Annual Rev. Immunol. 2: 199-218; Wooley (1988), Meth. Enzymol. 162: 361-373). Diese Krankheit wird typischerweise durch Immunisierung von DBA/1-Mausen mit 100 μg Typ II-Collagen ("CII") (z.B. Typ II-Collagen vom Rind oder Huhn), das intradermal an der Basis des Schwanzes in Freund'schem komplettem Adjuvans abgegeben wird, induziert.
Eine progressive und entzündliche Arthritis entwickelt sich bei der Mehrzahl der immunisierten Mause, charakterisiert durch eine Zunahme der Pfotenbreite von bis zu 100%. Eine Testverbindung kann an die Mäuse in einem Mengenbereich, wie 20, 60, 100 und 200 mg/kg Körpergewicht/Tag verabreicht werden. Die Dauer des Testes kann mehrere Wochen bis wenige Monate, wie 40, 60 oder 80 Tage, betragen. Ein klinischer Punkte-Index ("scoring index") kann verwendet werden, um die Progression der Krankheit von Erythem und Ödem (Stufe 1), Gelenkdistorsion (Stufe 2) bis zur Gelenkankylose (Stufe 3) zu beurteilen. Die Erkrankung kann eine oder alle Pfoten bei einem Tier betreffen, was in einer insgesamt möglichen Punktzahl ("score") von 12 für jede Maus resultiert. Die Histopathologie eines arthritischen Gelenks zeigt allgemein Synovitis, Pannus-Bildung und Knorpel- und Knochenerosion. Alle Mäusestämme, die für CIA anfällig sind, sind solche mit hoher Antikörperreaktion auf Typ II-Collagen ("high antibody responders to type II collagen"), und es gibt eine merkliche Zellreaktion auf CII.
Die Dosierung einer Testverbindung wird gewöhnlich entweder prophylaktisch (für 10 Wochen) oder therapeutisch (für 10 Tage, wenn die Krankheit zum ersten Mal beobachtet wird) durchgeführt. Die Mause werden typischerweise täglich hinsichtlich der Entwicklung von Arthritis untersucht, und häufig wird eine klinische Punktzahl zugeordnet. Serum kann auch von jedem Tier zu verschiedenen Zeitpunkten für Messungen von Antikörpern oder Zytokinen (wie erforderlich) gewonnen werden ("retrieved"). Am Ende der Studie können die Mause schmerzfrei getötet werden, und eine quantitative Histopathologie-Punktzahl kann zugeordnet werden.
Assay auf Arthritis, die durch monoklonale Antikörper induziert wird
Ein anderes experimentelles Modell rheumatoider Arthritis beinhaltet das Injizieren von Antikörpern gegen Typ II-Collagen-Epitope in eine Maus, um Arthritis innerhalb weniger Tage zu induzieren (siehe z.B. Burkhardt et al. (2002), Arthritis & Rheumatism 46:2339-2348; Terato et al. (1992), J. Immunol. 148:2103-2108). Mischungen bzw. Cocktails von vier Antikörpern sind kommerziell zur Verwendung in diesem Modell erhältlich (Arthrogen-CIA^® Monoclonal Antibody Cocktail, CHEMICON International, Inc., Temecula, CA). Dieses Modell erfordert keine Mause vom DBA/1-Stamm. Eine Testverbindung kann an die Mause einmal oder mehr mals in einem Mengenbereich, wie 20, 60, 100 und 200 mg/kg Körpergewicht/Tag, zu jedem Zeitpunkt während der Studie verabreicht werden. Knöchel- und Pfotenschwellung werden typischerweise quantitativ oder qualitativ als Endpunkte gemessen, wie auch die Histologie. Zusätzlich kann Serum von jedem Tier zu verschiedenen Zeitpunkten für Messungen von Antikörpern oder Zytokinen gewonnen werden.
V. PHARMAZEUTISCH ANNEHMBARE SALZE UND SOLVATE
Die Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, können in nicht-solvatisierten sowie solvatisierten Formen, einschließlich hydratisierter Formen, vorliegen. Im Allgemeinen sind die solvatisierten Formen, einschließlich der hydratisierten Formen, äquivalent zu den nicht-solvatisierten Formen, und sie sollen innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung (z.B. Verbindungen der Formeln I–V) sind befähigt, weiterhin auch pharmazeutisch annehmbare Salze, einschließlich, aber ohne Einschränkung darauf, Säureadditions- und/oder Basensalze, zu bilden. Pharmazeutisch annehmbare Salze der Verbindungen der Formel (I) schließen die Säureadditions- und Basensalze (einschließlich Disalze) davon ein. Beispiele geeigneter Salze können z.B. in Stahl und Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH, Weinheim, Deutschland (2002); und Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. of Pharmaceutical Science, 1977; 66:1-19, gefunden werden.
Pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Verbindungen der Formeln I–V schließen nicht-toxische Salze ein, die von anorganischen Säuren abgeleitet sind, wie Salz-, Salpeter-, Phosphor ("phosphoric")-, Schwefel-, Bromwasserstoff-, Iodwasserstoff-, Phosphor ("phorphorus")-(säure), und dergleichen, sowie die Salze, die von organischen Säuren abgeleitet sind, wie aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren, Phenyl-substituierte Alkansäuren, Hydroxyalkansäuren, Alkandisäuren, aromatische Säuren, aliphatische und aromatische Sulfonsäuren, etc. Derartige Salze schließen somit die Acetat-, Aspartat-, Benzoat-, Besylat (Benzolsulfonat)-, Hydrogencarbonat/Carbonat-, Hydrogensulfat-, Caprylat-, Camsylat (Camphersulfonat)-, Chlorbenzoat-, Citrat-, Edisylat (1,2-Ethandisulfonat)-, Dihydrogenphosphat-, Dinitrobenzoat-, Esylat (Ethansulfonat)-, Fumarat-, Gluceptat-, Gluconat-, Glucuronat-, Hibenzat-, Hydrochlorid/Chlorid-, Hydrobromid/Bromid-, Hydroiodid/Iodid-, Isobutyrat-, Monohydrogenphosphat-, Isethionat-, D-Lactat-, L-Lactat-, Malat-, Maleat-, Malonat-, Mandelat-, Mesylat (Methansulfonat)-, Metaphosphat-, Methylbenzoat-, Methylsulfat-, 2-Napsylat (2-Naphthalinsulfonat)-, Nicotinat-, Nitrat-, Orotat-, Oxalat-, Palmoat-, Phenylacetat-, Phosphat-, Phthalat-, Propionat-, Pyrophosphat-, Pyrosulfat-, Saccharat-, Sebacat-, Stearat-, Suberat-, Succinat-, Sulfat-, Sulfit-, D-Tartrat-, L-Tartrat-, Tosylat (Toluolsulfonat)- und die Xinafoat-Salze, und dergleichen, der Verbindungen der Formeln I–V ein. Ebenfalls in Betracht gezogen werden Salze von Aminosäuren, wie Arginat, Gluconat, Galacturonat und dergleichen.
Die Säureadditionssalze der basischen Verbindungen werden hergestellt, indem die Form der freien Base mit einer ausreichenden Menge der gewünschten Säure in Kontakt gebracht wird, um das Salz in der konventionellen Weise herzustellen. Die Form der freien Base kann durch Inkontaktbringen der Salzform mit einer Base und Isolieren der freien Base in der konventionellen Weise wiederhergestellt werden. Die Formen der freien Base unterscheiden sich von ihren entsprechenden Salzformen etwas in bestimmten physikalischen Eigenschaften, wie Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln, aber ansonsten sind die Salze für die Zwecke der vorliegenden Erfindung äquivalent zu ihrer entsprechenden freien Base.
Pharmazeutisch annehmbare Basenadditionssalze werden mit Metallen oder Aminen, wie Alkali- und Erdalkalimetallhydroxiden, oder aus organischen Aminen gebildet. Beispiele für Metalle, die als Kationen verwendet werden, sind Aluminium, Calcium, Magnesium, Kalium, Natrium und dergleichen. Beispiele geeigneter Amine schließen Arginin, Cholin, Chlorprocain, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Diethylamin, Diethanolamin, Diolamin, Ethylendiamin (Ethan-1,2-diamin), Glycin, Lysin, Meglumin, N-Methylglucamin, Ölamin, Procain (Benzathin) und Tromethamin ein.
Die Basenadditionssalze der sauren Verbindungen werden hergestellt, indem die Form der freien Säure mit einer ausreichenden Menge der gewünschten Base in Kontakt gebracht wird, um das Salz in der konventionellen Weise herzustellen. Die Form der freien Säure kann durch Inkontaktbringen der Salzform mit einer Säure und Isolieren der freien Säure in einer konventionellen Weise wiederhergestellt werden. Die Formen der freien Säure unterscheiden sich von ihren entsprechenden Salzformen etwas in bestimmten physikalischen Eigenschaften, wie der Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln, aber ansonsten sind die Salze für die Zwecke der vorliegenden Erfindung äquivalent zu ihrer entsprechenden freien Säure.
VI. PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERFAHREN ZUR VERABREICHUNG
Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formeln I–V oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipiens dafür umfassen. Die Phase "pharmazeutische Zusammensetzung" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die zur Verabreichung bei medizinischer oder veterinärmedizinischer Verwendung geeignet ist. Die Phase "therapeutisch wirksame Menge" bedeutet eine Menge einer Verbindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, die ausreichend ist, um die Störung oder den Zustand, die/der behandelt wird, zu stoppen oder eine Verbesserung zu ermöglichen, wenn sie allein oder in Verbindung mit einem anderen pharmazeutischen Mittel oder einer anderen Behandlung bei einem bestimmten Subjekt oder einer bestimmten Subjektpopulation verabreicht wird. Z.B. kann eine therapeutisch wirksame Menge bei einem Menschen oder einem anderen Säuger experimentell in einem Laboraufbau oder einer klinischen Einrichtung bestimmt werden oder sie kann die Menge sein, die durch die Richtlinien der United States Food and Drug Administration oder einer äquivalenten ausländischen Behörde für die spezielle Krankheit und das behandelte Subjekt gefordert wird.
Es sollte anerkannt werden, dass die Bestimmung geeigneter Dosierungsformen, Dosierungsmengen und Verabreichungswege innerhalb des Levels des gewöhnlichen Kenntnisstandes in dem pharmazeutischen und medizinischen Fachgebiet liegt und unten beschrieben wird.
Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung kann als pharmazeutische Zusammensetzung in Form eines Sirups, eines Elixiers, einer Suspension, eines Pulvers, eines Granulats, einer Tablette, einer Kapsel, einer Lutschtablette, einer Pastille, einer wässrigen Lösung, einer Creme, einer Salbe, einer Lotion, eines Gels, einer Emulsion etc. formuliert sein. Vorzugsweise wird eine Verbindung der vorliegenden Erfindung eine Abnahme, wie quantitativ oder qualitativ gemessen, bei den Symptomen oder einem Krankheitsanzeichen, assoziiert mit einer PI3K-vermittelten Störung, bewirken.
Zum Herstellen pharmazeutischer Zusammensetzungen aus den Verbindungen der vorliegenden Erfindung können pharmazeutisch annehmbare Träger entweder fest oder flüssig sein. Zubereitungen in fester Form schließen Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln, Cachets, Suppositorien und dispergierbare Granulate ein. Ein fester Träger kann eine oder mehrere Substanzen sein, die auch als Verdünnungsmittel, Aroma-gebende Mittel, Bindemittel, Konservierungsstoffe, Tablettenzerfallsförderungsmittel oder Verkapselungsmaterial dienen können.
In Pulvern ist der Träger ein fein zerteilter Feststoff, der sich in Mischung mit der fein zerteilten aktiven Komponente befindet. In Tabletten ist die aktive Komponente mit dem Träger mit den notwendigen Bindungseigenschaften in den geeigneten Anteilen vermischt und in der gewünschten Form und Größe verpresst.
Die Pulver und Tabletten enthalten von 1% bis 95% (G/G) der aktiven Verbindung. In bestimmten Ausführungsformen reicht die aktive Verbindung von 5% bis 70% (G/G). Geeignete Träger sind Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talkum, Zucker, Lactose, Pektin, Dextrin, Stärke, Gelatine, Traganth, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, ein niedrig schmelzendes Wachs, Kakaobutter und dergleichen. Der Begriff "Zubereitung" bzw. "Herstellung" soll die Formulierung der aktiven Verbindung mit Verkapselungsmaterial als Träger einschließen, was eine Kapsel bereitstellt, in welcher die aktive Komponente mit oder ohne andere Träger von einem Träger umgeben ist, der somit damit in Verbindung ist. In gleicher Weise sind Cachets und Lutschtabletten bzw. Pastillen eingeschlossen. Tabletten, Pulver, Kapseln, Pillen, Cachets und Lutschtabletten können als feste Dosierungsformen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, verwendet werden.
Zur Herstellung von Suppositorien wird ein niedrig schmelzendes Wachs, wie ein Gemisch aus Fettsäureglyceriden oder Kakaobutter, zuerst geschmolzen, und die aktive Komponente wird darin, wie mittels Rühren, homogen dispergiert. Das geschmolzene homogene Gemisch wird dann in Formen mit zweckmäßiger Größe gegossen, abkühlen gelassen und dadurch verfestigen gelassen.
Zubereitungen in flüssiger Form schließen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, z.B. Wasser- oder Wasser/Propylenglykollösungen, ein. Zur parenteralen Injektion können flüssige Zubereitungen in Lösung in wässriger Polyethylenglykollösung formuliert sein.
Wässrige Lösungen, die zur oralen Verwendung geeignet sind, können durch Auflösen der aktiven Komponente in Wasser und Zugeben geeigneter färbender Mittel, Aroma-gebender Mittel, Stabilisatoren und Verdickungsmittel, wie gewünscht, hergestellt werden. Wässrige Suspensionen, die zur oralen Verwendung geeignet sind, können durch Dispergieren der fein zerteilten aktiven Komponente in Wasser mit viskosem Material, wie natürliche oder synthetische Gummen, Harze, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und andere gut bekannte Suspendiermittel, hergestellt werden.
Ebenfalls eingeschlossen sind Zubereitungen in fester Form, die kurz vor der Verwendung in Zubereitungen in flüssiger Form für die orale Verabreichung umgewandelt werden sollen. Derartige flüssige Formen schließen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Diese Zubereitungen können zusätzlich zu der aktiven Komponente färbende Mittel, Aroma-gebende Mittel, Stabilisatoren, Puffer, künstliche und natürliche Süßungsmittel, Dispergiermittel, Verdickungsmittel, solubilisierende Mittel und dergleichen enthalten.
Die pharmazeutische Zubereitung ist vorzugsweise in Einheitsdosierungsform ("unit dosage form"). In einer derartigen Form wird die Zubereitung in Einheitsdosen unterteilt, die geeignete Mengen der aktiven Komponente enthalten. Die Einheitsdosierungsform kann eine abgepackte Zubereitung sein, wobei die Packung getrennte Mengen der Zubereitung enthält, wie abgepackte Tabletten, Kapseln und Pulver in Fläschchen oder Ampullen. Ebenso kann die Einheitsdosierungsform eine Kapsel, Tablette, ein Cachet oder eine Lutschtablette selbst sein, oder sie kann die geeignete Anzahl eines Beliebigen davon in abgepackter Form sein.
Die Menge an aktiver Komponente in einer Einheitsdosiszubereitung kann von 0,1 mg bis 1000 mg, vorzugsweise 1,0 mg bis 100 mg, oder von 1% bis 95% (G/G) einer Einheitsdosis gemäß der speziellen Applikation und der Wirksamkeit der aktiven Komponente variiert oder angepasst werden. Die Zusammensetzung kann, falls gewünscht, auch andere kompatible therapeutische Mittel enthalten.
Pharmazeutisch annehmbare Träger werden teilweise durch die spezielle Zusammensetzung, die verabreicht wird, sowie durch das spezielle Verfahren, das zum Verabreichen der Zusammensetzung verwendet wird, festgelegt. Demgemäß gibt es eine breite Vielfalt geeigneter Formulierungen von pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (siehe z.B. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20. Aufl., Gennaro et al., Hrsg., Lippincott Williams and Wilkins, 2000).
Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, allein oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten, kann in Aerosolformulierungen (d.h., sie können "vernebelt" werden), die über Inhalation verabreicht werden sollen, eingearbeitet werden. Aerosolformulierungen können in unter Druck stehende annehmbare Treibmittel, wie Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff, und dergleichen, eingebracht werden.
Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung, wie z.B. über intravenöse, intramuskuläre, intradermale und subkutane Wege, geeignet sind, schließen wässrige und nichtwässrige, isotonische sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen, und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel, Solubilisierungsmittel, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsstoffe einschließen, ein. In der Praxis dieser Erfindung können die Zusammensetzungen z.B. mittels intravenöser Infusion, oral, topisch, intraperitoneal, intravesikal oder intrathekal verabreicht werden. Die Verbindungsformulierungen können in verschlossenen Behältern mit Einheitsdosis oder mehreren Dosen, wie Ampullen und Fläschchen, vorgelegt werden. Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Die an ein Subjekt verabreichte Dosis sollte im Kontext der vorliegenden Erfindung ausreichend sein, um eine günstige therapeutische Reaktion in dem Subjekt über die Zeit zu bewirken. Der Begriff "Subjekt" bezieht sich auf ein Mitglied der Klasse Mammalia. Beispiele für Säuger schließen, ohne Einschränkung, Menschen, Primaten, Schimpansen, Nager, Mause, Ratten, Kaninchen, Pferde, Vieh, Hunde, Katzen, Schafe und Kühe ein.
Die Dosis wird durch die Wirksamkeit der speziellen Verbindung, die eingesetzt wird, und den Zustand des Subjekts, sowie das Körpergewicht oder die Oberfläche des Subjekts, das behandelt werden soll, bestimmt. Die Größe der Dosis wird auch durch das Vorhandensein, die Beschaffenheit und das Ausmaß jeglicher nachteiliger Nebenwirkungen bestimmt, die die Verabreichung einer speziellen Verbindung bei einem speziellen Subjekt begleiten. Beim Bestimmen der wirksamen Menge der Verbindung, die in der Behandlung oder Prophylaxe der behandelten Störung verabreicht werden soll, kann der Arzt Faktoren wie die Plasmaspiegel der Verbindung im Kreislauf ("circulating plasma levels of the compound"), die Verbindungstoxizitäten und/oder das Fortschreiten der Krankheit etc. beurteilen. Im Allgemeinen beträgt das Dosisäquivalent einer Verbindung von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg für ein typisches Subjekt. Viele verschiedene Verabreichungsverfahren sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Zur Verabreichung können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einer Rate bzw. Geschwindigkeit verabreicht werden, die durch Faktoren bestimmt wird, die, ohne Einschränkung darauf, den LD₅₀(-Wert) der Verbindung, das pharmakokinetische Profil der Verbindung, kontraindizierte Wirkstoffe und Nebenwirkungen der Verbindung bei verschiedenen Konzentrationen, wie auf das Gewicht und den Gesamtgesundheitszustand des Subjektes zutreffend, einschließen können. Die Verabreichung kann über einzelne oder geteilte Dosen ausgeführt werden.

Beispiele einer typischen Tabletten-, parenteralen und Pflasterformulierung schließen das Folgende ein: TABLETTENFORMULIERUNGSBEISPIEL 1

Tablettenformulierung
Inhaltsstoff	Menge
Verbindung der Formeln I–V	50 mg
Lactose	80 mg
Getreide- bzw. Maisstärke (zum Mischen)	10 mg
Getreide- bzw. Maisstärke (für Paste)	8 mg
Magnesiumstearat (1%)	2 mg
	150 mg

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung (z.B. eine Verbindung der Formeln I–V oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon) können mit der Lactose und der Getreide- bzw. Maisstärke (zum Mischen) gemischt werden und bis zur Gleichmäßigkeit bis zu einem Pulver vermischt werden. Die Getreide- bzw. Maisstärke (für Paste) wird in 6 ml Wasser suspendiert und unter Rühren erhitzt, um eine Paste zu bilden. Die Paste wird zu dem vermischten Pulver zugegeben, und das Gemisch wird granuliert. Die feuchten Granulate bzw. Körnchen werden durch ein starres Sieb Nr. 8 ("No. 8 hard screen") geführt und bei 50°C getrocknet. Das Gemisch wird mit 1% Magnesiumstearat als Schmiermittel versehen ("lubricated") und in eine Tablette verpresst. Die Tabletten werden an einen Patienten mit einer Rate von 1 bis 4 jeden Tag für die Behandlung einer PI3K-vermittelten Störung oder eines PI3K-vermittelten Zustandes verabreicht.
PARENTERALE LÖSUNGSFORMULIERUNG – BEISPIEL 1
In eine Lösung von 700 ml Propylenglykol und 200 ml Wasser zur Injektion können 20,0 g einer Verbindung der vorliegenden Erfindung zugegeben werden. Das Gemisch wird gerührt, und der pH wird mit Salzsäure auf 5,5 eingestellt. Das Volumen wird mit Wasser zur Injektion auf 1000 ml eingestellt. Die Lösung wird sterilisiert, in 5,0 ml-Ampullen gefüllt, von denen jede 2,0 ml (40 mg der erfindungsgemäßen Verbindung) enthält, und es wird unter Stickstoff verschlossen. Die Lösung wird mittels Injektion an ein Subjekt verabreicht, das an einer PI3K-vermittelten Störung oder einem PI3K-vermittelten Zustand leidet und einer Behandlung bedarf.
PFLASTERFORMULIERUNGSBEISPIEL 1
Zehn Milligramm einer Verbindung der vorliegenden Erfindung können mit 1 ml Propylenglykol und 2 mg Acryl-basiertem Polymerklebstoff, enthaltend ein harzartiges Vernetzungsmittel, gemischt werden. Das Gemisch wird auf einen undurchlässigen Träger (30 cm²) aufge bracht, und dies wird auf dem oberen Rücken eines Patienten für eine Behandlung mit verzögerter Freisetzung ("sustained release") einer PI3K-vermittelten Störung oder eines PI3K-vermittelten Zustandes appliziert.
VII. VERFAHREN ZUM BEHANDELN VON PI3K-VERMITTELTEN STÖRUNGEN UND PI3K-VERMITTELTEN ZUSTÄNDEN
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung und pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, können an ein Subjekt verabreicht werden, das an einer PI3K-vermittelten Störung oder einem PI3K-vermittelten Zustand leidet. PI3K-vermittelte Störungen und PI3K-vermittelte Zustande können prophylaktisch, akut und chronisch unter Verwendung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Störung oder des Zustandes behandelt werden. Typischerweise ist der Wirt oder das Subjekt in jedem dieser Verfahren ein Mensch, obwohl andere Säuger ebenfalls Nutzen aus der Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung ziehen können.
In therapeutischen Applikationen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer breiten Vielfalt oraler und parenteraler Dosierungsformen hergestellt und verabreicht werden. Der Begriff "verabreichen" bezieht sich auf das Verfahren des Inkontaktbringens einer Verbindung mit einem Subjekt. Somit können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mittels Injektion, d.h. intravenös, intramuskulär, intrakutan, subkutan, intraduodenal, parenteral ("parentally") oder intraperitoneal, verabreicht werden. Die hierin beschriebenen Verbindungen können auch mittels Inhalation, z.B. intranasal, verabreicht werden. Zusätzlich können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung transdermal, topisch und über Implantate verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung oral abgegeben. Die Verbindungen können auch rektal, bukkal, intravaginal, Okular, andial ("andially") oder durch Insufflation abgegeben werden.
Die in dem pharmazeutischen Verfahren der Erfindung eingesetzten Verbindungen können in einer Anfangsdosierung von etwa 0,001 mg/kg bis etwa 100 mg/kg täglich verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen beträgt der tägliche Dosierungsbereich von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 10 mg/kg. Die Dosierungen können jedoch in Abhängigkeit von den Bedürfnissen des Subjekts, der Schwere des behandelten Zustandes und der eingesetzten Verbindung variiert werden. Die Bestimmung der geeigneten Dosierung für eine spezielle Situation liegt innerhalb der Fähigkeit des Fachmanns bzw. Arztes. Allgemein wird eine Behandlung mit kleineren Dosierungen begonnen, welche geringer sind als die optimale Dosis der Verbindung. Danach wird die Dosierung in kleinen Schrittgrößen erhöht, bis die optimale Wirkung unter den Umständen erreicht wird. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit kann die tägliche Gesamtdosierung geteilt und in Portionen während des Tages, falls gewünscht, verabreicht werden. Der Begriff "Behandlung" schließt die akute, chronische oder prophylaktische Verringerung oder Linderung von mindestens einem Symptom oder Charakteristikum ein, das mit der behandelten Störung assoziiert ist oder durch diese verursacht wird. Z.B. kann die Behandlung die Verringerung einiger Symptome einer Störung, die Inhibierung der pathologischen Progression einer Störung oder die vollständige Beseitigung einer Störung einschließen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können an ein Subjekt co-verabreicht werden. Der Begriff "co-verabreicht" bedeutet die Verabreichung von zwei oder mehreren verschiedenen pharmazeutischen Mitteln oder Behandlungen (z.B. Strahlenbehandlung), die an ein Subjekt verabreicht werden, durch Kombination in derselben pharmazeutischen Zusammensetzung oder in getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen. Somit involviert die Co-Verabreichung die Verabreichung zur gleichen Zeit einer einzelnen pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend zwei oder mehr pharmazeutische Mittel, oder die Verabreichung von zwei oder mehreren verschiedenen Zusammensetzungen an dasselbe Subjekt zur gleichen Zeit oder zu verschiedenen Zeiten. Z.B. wurde einem Subjekt, dem eine erste Dosierung, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst, um 8 Uhr verabreicht wird, und dem anschließend 142 Stunden später am selben Tag, z.B. 18 Uhr, CELEBREX^® verabreicht wird, eine Verbindung der vorliegenden Erfindung mit CELEBREX^® co-verabreicht. Alternativ könnte z.B. einem Subjekt eine einzelne Dosierung, umfassend eine Verbindung der vorliegenden Erfindung und CELEBREX^®, um 8 Uhr verabreicht werden, wodurch ihm eine Verbindung der vorliegenden Erfindung und CELEBREX^® co-verabreicht wurden.
Somit können die Verbindungen der Erfindung auch mit Verbindungen co-verabreicht werden, die für die Behandlung von Krebs zweckmäßig sind (z.B. cytotoxische Wirkstoffe, wie TAXOL^®, Taxoter, GLEEVEC^® (Imatinib-Mesylat), Adriamycin, Daunomycin, Cisplatin, Etoposid, ein Vincaalkaloid, Vinblastin, Vincristin, Methotrexat oder Adriamycin, Daunomycin, Cisplatinum, Etoposid und Alkaloide, wie Vincristin, Farnesyltransferase-Inhibitoren, Endostatin und Angiostatin, VEGF-Inhibitoren und Antimetabolite, wie Methotrexat. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit einem Taxan-Derivat, einem Platinkoordinationskomplex, einem Nucleosidanalogon, einem Anthracyclin, einem Topoisomerase-Inhibitor oder einem Aromatase-Inhibitor verwendet werden. Strahlenbehandlungen können auch mit einer Verbindung der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Krebsarten co-verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch mit Verbindungen co-verabreicht werden, die für die Behandlung einer thrombolytischen Erkrankung, Herzerkrankung, eines Schlaganfalls etc., zweckmäßig sind (z.B. Aspirin, Streptokinase, Gewebeplasminogenaktivator, Urokinase, Antikoagulantien, antithrombozytäre Wirkstoffe ("antiplatelet drugs") (z.B. PLAVIX^®, Clopidogrel-Eisulfat), ein Statin (z.B. LIPITOR^® (Atorvastatin-Calcium), ZOCOR^® (Simvastatin), CRESTOR^® (Rosuvastatin) etc.), ein Betablocker (z.B. Atenolol), NORVASC^® (Amlodipin-Besylat) und ein ACE-Hemmer (z.B. Accupril^® (Quinapril-Hydrochlorid), Lisinopril etc.)
Die Verbindungen der Erfindung können auch zur Behandlung von Hypertonie mit Verbindungen, wie ACE-Hemmern, lipidsenkenden Mitteln, wie Statine, LIPITOR^® (Atorvastatin-Calcium), Calciumkanalblockern, wie NORVASC^® (Amlodipin-Besylat), co-verabreicht werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit Fibraten, Betablockern, NEPI-Inhibitoren, Angiotensin-2-Rezeptor-Antagonisten und Thrombozytenaggregationshemmern verwendet werden.
Zur Behandlung von Entzündungserkrankungen, einschließlich rheumatoider Arthritis, können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit Mitteln wie TNF-α-Inhibitoren, wie monoklonale Anti-TNF-α-Antikörper (wie REMICADE^® CDP-870 und HUMIRA^TM (Adalimumab), und TNF-Rezeptor-Immunglobulin-Fusionsmolekülen (wie ENBREL^®), IL-1-Inhibitoren, Rezeptor-Antagonisten oder löslichem IL-1Rα (z.B. KINERET^TM oder ICE-Inhibitoren), nicht-steroidalen Antirheumatika (NSARs), Piroxicam, Diclofenac, Naproxen, Flurbiprofen, Fenoprofen, Ketoprofen, Ibuprofen, Fenamaten, Mefenaminsäure, Indomethacin, Sulindac, "Apazone", Pyrazolone, Phenylbutazon, Aspirin, Cox-2-Inhibitoren (wie CELEBREX^® (Celecoxib), VIOXX^® (Rofecoxib), BEXTRA^® (Valdecoxib) und Etoricoxib), Metalloprotease-Inhibitoren (vorzugsweise MMP-13-selektive Inhibitoren), NEUROTIN^®, Pregabalin, Sulfasalazin, Methotrexat geringer Dosis, Leflunomid, Hydroxychloroquin, D-Penicillamin, Auranofin oder parenteralem oder oralem Gold co-verabreicht werden.
Die Verbindungen der Erfindung können mit bestehenden therapeutischen Mitteln für die Behandlung von Osteoarthritis co-verabreicht werden. Geeignete Mittel, die in Kombination verwendet werden sollen, schließen standardmäßige nicht-steroidale Antirheumatika (hierin nachstehend NSARs), wie Piroxicam, Diclofenac, Propionsäuren, wie Naproxen, Flurbiprofen, Fenoprofen, Ketoprofen und Ibuprofen, Fenamate, wie Mefenaminsäure, Indomethacin, Sulindac, "Apazone", Pyrazolone, wie Phenylbutazon, Salicylate, wie Aspirin, Cox-2-Inhibitoren, wie Celecoxib, Valdecoxib, Rofecoxib und Etoricoxib, Analgetika, und intraartikuläre Therapien, wie Corticosteroide und Hyaluronsäuren, wie Hyalgan und Synvisc, ein.
Die Verbindungen der Erfindung können auch mit antiviralen Mitteln, wie Viracept, AZT, Aciclovir und Famciclovir, und antiseptischen Verbindungen, wie "Valant", co-verabreicht werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können weiterhin mit ZNS-Mitteln, wie Antidepressiva (wie Sertralin), Anti-Parkinson-Wirkstoffen (wie Deprenyl, L-Dopa, Requip, Mirapex, MAOS-Inhibitoren, wie Selegin und Rasagilin, comP-Inhibitoren ("comP inhibitors"), wie Tasmar, A-2-Inhibitoren, Dopamin-Wiederaufnahme-Inhibitoren, NMDA-Antagonisten, Nicotin-Agonisten, Dopamin-Agonisten und Inhibitoren der neuronalen Stickoxidsynthase), NEURONTIN^®, Pregabalin, und Wirkstoffe gegen Alzheimer, wie ARICEPT^®, Tacrin, Propentofyllin oder Metrifonat, co-verabreicht werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zusätzlich mit Osteoporosemitteln, wie EVISTA^® (Raloxifen-Hydrochlorid), Droloxifen, Lasofoxifen oder FOSAMAX^® , und immunsuppressiven Mitteln, wie FK-506 und Rapamycin, co-verabreicht werden. BEISPIELE

^a MS: M + 1 APCI, soweit nichts anderes angegeben. ^b DMSO, 400 MHz, δ-Werte angegeben.

Intermediat 1.
2-Methylsulfanyl-4-(4-nitrobenzyloxy)pyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Zu einer gerührten ("stirring") Lösung von 4-Nitrobenzylalkohol (16,7 g, 109 mmol) in wasserfreiem THF (120 ml) bei –78°C wurde nBuLi (1,6M in Hexanen, 75 ml, 120 mmol) über eine Spritze zugegeben. Das Reaktionsgemisch) wurde bei –78°C 10 Minuten lang gerührt, und dann wurde das Kältebad entfernt, und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Die Nitrobenzylalkoxidlösung wurde in eine gerührte Lösung von Ethyl-4-Chlor-2-methylthio-5-pyrimidincarboxylat (25,0 g, 107,3 mmol) in wasserfreiem THF (120 ml) gegossen. Das Reaktion(sgemisch) wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang gerührt. Das Gemisch wurde mit H₂O verdünnt und wurde mehrere Male mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, dekantiert und unter Erhalt eines Feststoffs konzentriert. Der Feststoff wurde in einem Minimum an Dichlormethan aufgeschlämmt und filtriert. Der Feststoff wurde gesammelt und über Nacht in dem Vakuumofen getrocknet, um das gewünschte Titelprodukt (19,4 g, 51,8% Ausbeute) als Feststoff zu ergeben. MS: M + 1 = 350,1.
Intermediat 2.
2-Methansulfinyl-4-(4-nitrobenzyloxy)pyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Zu einer gerührten Lösung von Intermediat 1 (19,4 g, 55,6 mmol) in Chloroform (185 ml) wurde mCPBA (13,8 g, 61,2 mmol) portionsweise zugegeben. Die exotherme Reaktion wurde mit einem Eiswasser-Bad gemäßigt, um die Reaktionstemperatur nahe Raumtemperatur zu halten. Das Reaktionsgemisch) wurde dann bei Raumtemperatur 25 Minuten lang gerührt. Das Gemisch wurde mit gesättigter wässriger NaHCO₃(-Lösung) gequencht und mit Wasser verdünnt. Die Verdünnung wurde mehrere Male mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, durch Celite filtriert und unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (18,84 g, 92,8% Ausbeute) als orangefarbener Feststoff konzentriert. Das Produkt wurde ohne weitere Aufreinigung weitergeführt. MS: M + 1 = 366,1 (APCI).
Intermediat 3.
2-Morpholin-4-yl-4-(4-nitrobenzyloxy)pyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Intermediat 2 (35,4 g, 97,0 mmol) wurde in Morpholin (16,9 ml) bei 100°C fünfzehn Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch) wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und dann mit Toluol (~100 ml) verdünnt. Das Verdünnungsgemisch wurde in vacuo konzentriert. Der verbleibende Rückstand wurde in EtOAc (~300 ml) zum Sieden erhitzt und dann filtriert. Die Flüssigkeiten wurden in vacuo konzentriert. Der verbleibende Feststoff wurde in einem Minimum an Dichlormethan aufgeschlämmt und filtriert. Der Feststoff wurde gesammelt und über Nacht in einem Vakuumofen unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (12,8 g, 34,0% Ausbeute) als weißer Feststoff getrocknet. MS: M + 1 = 389,1 (APCI). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) 8.79 (s, 1H), 8.24 (m, 2H), 7.68 (m, 2H), 5.54 (s, 2H), 4.33 (q, J = 7,2Hz, 2H), 3.99 (m, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.74 (m, 2H), 3.23 (m, 2H), 1.36 (t, J = 7,2Hz, 3H).
Intermediat 4.
4-Hydroxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Intermediat 3 (4,00 g, 10,3 mmol) wurde mit Pd/C 20% (0,400 g) in Ethanol (52 ml) bei Raumtemperatur unter einem Wasserstoffballon 16 Stunden lang gerührt. Eine zusätzliche Portion Pd/C 20% (0,400 g) wurde zugegeben, und Wasserstoff wurde durch das Reaktionsgemisch zehn Minuten lang hindurchperlen gelassen. Das Reaktion(sgemisch) wurde unter einem Wasserstoffballon bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde durch Celite filtriert. Der Filterkuchen wurde mit EtOAc und Dichlormethan gespült. Die Flüssigkeiten wurden unter Erhalt eines Feststoffs konzentriert. Der Feststoff wurde in einem Minimum an Diethylether bei Raumtemperatur 2 Stunden lang aufgeschlemmt und dann filtriert. Der Feststoff wurde gesammelt und über Nacht in einem Vakuumofen unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (2,49 g, 95,6% Ausbeute) als gebrochen weißer Feststoff getrocknet. MS: M + 1 = 254,1 (APCI). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) 8.67 (s, 1H), 4.38 (q, J = 7,1Hz, 2H), 3.93 (m, 4H), 3.74 (m, 4H), 1.39 (t, J = 7,1Hz, 3H).
Intermediat 5.
4-Cycloheptyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Intermediat 4 (10,00 g, 39,49 mmol) wurde mit Cycloheptanon (7,134 ml, 59,23 mmol), DEAD (8,25 g, 47,4 mmol) und Triphenylphosphin (12,4 g, 47,4 mmol) in THF (150 ml) kombiniert. Die Reaktion wurde 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. HPLC-Analyse zeigte ein neues Produkt zusammen mit überschüssigem Triphenylphosphin und Triphenylphosphinoxid an. Das Reaktionsgemisch wurde in vacuo konzentriert. Das Konzentrat wurde mittels Silicagelchromatographie (0–30% EtOAc-Hexane-Gradientenelution, DC in 20% EtOAc-Hexane) unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (10,84 g, 78,57% Ausbeute) als hellpinkfarbenes Öl gereinigt. MS: M + 1 = 350,3 (APCI). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) ppm 1.33 (t, J = 7,20Hz, 3H), 1.54 (m, 5H), 1.75 (m, 2H), 1.94 (m, 5H), 3.74 (m, 1H), 3.92 (m, 4H), 4.28 (q, J = 7,08Hz, 2H), 5.35 (m, 1H), 8.70 (m, 1H).
Intermediat 6.
4-Cycloheptyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure.
Intermediat 5 (10,84 g, 31,02 mmol) wurde mit Dioxan (60 ml) und 1N LiOH (40 ml) in einem Rundkolben bei 80°C zwei Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen lassen, und es wurde dann langsam und vorsichtig mit 1N HCl bis zu einem pH von etwa 1 angesäuert. Ein weißer Feststoff präzipitierte. Das Gemisch wurde mit mehr H₂O verdünnt und dann filtriert. Der Filterkuchen wurde mit H₂O gespült, gesammelt und über Nacht in dem Vakuumofen unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (5,70 g, 57,2% Ausbeute) als hellgelber Feststoff getrocknet. MS: M + 1 = 322,2 (APCI). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) ppm 1.4-1.7 (m, 8H), 1.89 (s, 2H), 2.09 (m, 2H), 3.76 (m, 4H), 3.89 (m, 4H), 5.45 (m, 1H), 8.86 (s, 1H).
Beispiel 1.
4-Cycloheptyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Intermediat 6 (5,70 g, 17,7 mmol) wurde mit wasserfreiem Dichlormethan (50 ml) gemischt, löste sich darin aber nicht. Etwa 5 Tropfen DMF wurden zugegeben. Oxalylchlorid (1,70 ml, 19,5 mmol) wurde über eine Spritze zugegeben. Das Gemisch blubberte und wurde langsam homogen. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gerührt. HPLC-Analyse eines Aliquots, gequencht in MeOH/K₂CO₃, zeigte einen vollständigen Verbrauch der Ausgangssäure und die Bildung eines neuen, weniger polaren Produktes an. 5-Aminotetrazol (3,17 g, 37,2 mmol), Triethylamin (5,19 ml, 37,3 mmol) und schließlich Acetonitril (50 ml) wurden zugegeben. Die Reaktion wurde bei 80°C 60 Minuten lang gerührt. HPLC-Analyse eines Aliquots, gequencht in MeOH/K₂CO₃, zeigte ein neues Produkt. Das Reaktionsgefäß wurde geöffnet und nahezu bis zur Trockene sieden gelassen. Das Ölbad wurde entfernt, und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Der zurückbleibende Teer ("tar") wurde in einem Minimum an Acetonitril (~15 ml) aufgenommen. Das Gemisch wurde mit Wasser (~100 ml) verdünnt und mit 1N HCl angesäuert, bis ein flockiger weißer Feststoff präzipitierte. Der Feststoff wurde abfiltriert und mit H₂O gewaschen. Der Filterkuchen wurde gesammelt und in einem Minimum an MeOH 30 Minuten lang aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde mit einem Minimum an MeOH gespült. Der Feststoff wurde über Nacht in einem Vakuumofen unter Erhalt des gewünschten Titelproduktes (4,832 g, 70,14% Ausbeute) als kleine, hellgelbe, nadelförmige Kristalle getrocknet. Schmelzpunkt: 287,1–287,4°C (bestimmt mit einem Buchi-Schmelzpunkt B-545-Apparat).
Die Titelverbindungen der Beispiele 2–15 wurden in einer Weise synthetisiert, die analog zu Beispiel 1 ist, indem Cycloheptanol durch einen geeigneten Alkohol (z.B. Cyclopentanol) ersetzt wurde.
Beispiel 2.
4-Cyclopentyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 3.
4-Isopropoxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 4.
4-Cyclohexyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 5.
4-Cyclooctyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 6.
4-(2-Cyclohexylethoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 7.
4-Cyclohexylmethoxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 8.
4-(2-Methoxyethoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 9.
4-(3,3-Dimethylcyclohexyloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 10.
2-Morpholin-4-y1-4-(tetrahydropyran-4-yloxy)-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 11.
4-(Adamantan-2-yloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 12.
4-(Bicyclo[2.2.1]hept-2-yloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 13.
4-(2,2-Dimethylpropoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 14.
4-(1,2-Dimethylpropoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 15.
4-(1-Methylcyclopropylmethoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Intermediat 7.
4-(3,5-Dimethylcyclohexyloxy)-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Zu einer Lösung bei –78°C von 3,5-Dimethylcyclohexanol (6,18 ml, 43,1 mmol) in wasserfreiem THF (100 ml) wurde nBuLi (1,6M in Hexanen, 26,9 ml, 43,1 mmol) über eine Spritze zugegeben. Das Kältebad wurde entfernt, und die Reaktion wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde dann in eine gerührte Lösung von Ethyl-4-chlor-2-methylthio-5-pyrimidincarboxylat (10,0 g, 43,1 mmol) in wasserfreiem THF (100 ml) gegossen. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde mit H₂O verdünnt und mehrere Male mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, dekantiert und konzentriert. Das Konzentrat wurde mit Silicagelchromatographie (0–12% EtOAc-Hexane-Gradientenelution, DC in 10% EtOAc-Hexane) unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (5,95 g, 42,6% Ausbeute) als farbloses Öl gereinigt. MS: M + 1 = 325,3 (APCI).
Intermediat 8.
4-(3,5-Dimethylcyclohexyloxy)-2-methansulfinylpyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Zu einer gerührten Lösung von Intermediat 8 (5,89 g, 18,2 mmol) in Chloroform (60 ml) wurde mCPBA (4,90 g, 21,8 mmol) portionsweise zugegeben. Die exotherme Reaktion wurde mit einem Eiswasser-Bad gemäßigt, um die Reaktionstemperatur nahe Raumtemperatur zu halten. Das Reaktion(sgemisch) wurde dann bei Raumtemperatur 25 Minuten lang gerührt. Das Gemisch wurde mit gesättigter wässriger NaHCO₃(-Lösung) gequencht und mit Wasser verdünnt. Die Verdünnung wurde mehrere Male mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, durch Celite filtriert und unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts in quantitativer Ausbeute konzentriert. Das Produkt wurde ohne weitere Aufreinigung weitergeführt. MS: M + 1 = 341,1 (APCI).
Intermediat 9.
4-(3,5-Dimethylcyclohexyloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Intermediat 8 (7,13 g, 21,0 mmol) wurde in Morpholin (9,14 ml) bei 100°C 1 Stunde lang gerührt. Das Reaktion(sgemisch) wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Das gesamte Reaktionsgemisch wurde mittels Silicagelchromatographie (0–16% EtOAc-Hexane-Gradientenelution, DC in 20% EtOAc-Hexane) unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (2,68 g, 35,2% Ausbeute) als farbloses Öl gereinigt. MS: M + 1 = 364,7 (APCI).
Intermediat 10.
4-(3,5-Dimethylcyclohexyloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure.
Intermediat 9 (2,48 g, 6,83 mmol) wurde mit Dioxan (19,2 ml) und 1N LiOH (12,8 ml) in einem Rundkolben bei 80°C 90 Minuten lang gerührt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, und es wurde dann langsam und vorsichtig mit 1N HCl bis zu einem pH von etwa 1 angesäuert. Ein weißer Feststoff präzipitierte. Das Gemisch wurde mit mehr H₂O verdünnt und dann filtriert. Der Filterkuchen wurde mit H₂O gespült, gesammelt und über Nacht in den Vakuumofen unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (1,43 g, 62,2% Ausbeute) als weißer Feststoff getrocknet. MS: N + 1 = 336,2 (APCI). Mikroanalyse: Berechnet C-60,88%, H-7,51%, N-12,53%; gefunden C-60,87%, H-7,67%, N-12,24%.
Beispiel 16.
4-(3,5-Dimethylcyclohexyloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Intermediat 10 (0,750 g, 2,24 mmol) wurde mit wasserfreiem Dichlormethan (11 ml) gemischt, löste sich darin aber nicht. Etwa 3 Tropfen DMF wurden zugegeben. Oxalylchlorid (0,213 ml, 2,46 mmol) wurde mittels einer Spritze zugegeben. Das Gemisch blubberte und wurde langsam homogen. Das Reaktions(gemisch) wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gerührt. HPLC-Analyse eines Aliquots, gequencht in MeOH/K₂CO₃, zeigte einen vollständigen Verbrauch der Ausgangssäure und die Bildung eines neuen, weniger polaren Produktes. 5-Aminotetrazol (0,400 g, 4,70 mmol), Triethylamin (0,654 ml, 4,70 mmol) und schließlich Acetonitril (11 ml) wurden zugegeben. Das Reaktion(sgemisch) wurde bei 80°C 60 Minuten lang gerührt. HPLC-Analyse eines Aliquots, gequencht in MeOH/K₂CO₃, zeigte ein neues Produkt. Das Reaktionsgefäß wurde geöffnet und nahezu bis zur Trockene sieden gelassen. Das Ölbad wurde entfernt, und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Der verbleibende Teer ("tar") wurde in einem Minimum an Acetonitril (~15 ml) aufgenommen. Das Gemisch wurde mit H₂O (~100 ml) verdünnt und mit 1N HCl angesäuert, bis ein flockiger weißer Feststoff präzipitierte. Der Feststoff wurde abfiltriert und mit H₂O gespült. Der Filterkuchen wurde gesammelt und in einem Minimum an MeOH 30 Minuten lang aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde mit einem Minimum an MeOH gespült. Der Feststoff wurde über Nacht in einem Vakuumofen unter Erhalt des gewünschten Titelproduktes (0,699 g, 77,6% Ausbeute) als weißer Feststoff getrocknet.

Intermediat 11.
4-(4-Isopropylphenoxy)-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Zu einer gerührten Lösung von 4-Isopropylphenol (5,86 g, 43,1 mmol) in wasserfreiem THF (100 ml) wurde Natriumhydrid (1,03 g, 43,1 mmol) langsam und vorsichtig zugegeben. Das Reaktion(sgemisch) wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt. Die Phenoxidlösung wurde dann in eine gerührte Lösung von Ethyl-4-chlor-2-thiomethyl-5-pyrimidincarboxylat (10,0 g, 43,1 mmol) in wasserfreiem THF (100 ml) gegossen. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch) wurde mit H₂O verdünnt und mehrere Male mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden kombiniert, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, dekantiert und konzentriert. Das Konzentrat wurde mittels Silicagelchromatographie (0–20% EtOAc-Hexane-Gradientenelution, DC in 10% EtOAc-Hexane) unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (9,88 g, 69,0% Ausbeute) als hellgelbes Öl gereinigt. MS: M + 1 = 333,5 (APCI).
Intermediat 12.
4-(4-Isopropylphenoxy)-2-methansulfinylpyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Zu einer gerührten Lösung von Intermediat 11 (9,03 g, 27,2 mmol) in Chloroform (91 ml) wurde mCPBA (7,32 g, 32,6 mmol) portionsweise zugegeben. Die exotherme Reaktion wurde mit einem Eiswasser-Bad gemäßigt, um die Reaktionstemperatur nahe Raumtemperatur zu halten. Das Reaktion(sgemisch) wurde dann bei Raumtemperatur 25 Minuten lang gerührt. Das Gemisch wurde mit gesättigter wässriger NaHCO₃(-Lösung) gequencht und mit Wasser verdünnt. Die Verdünnung wurde mehrere Male mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, durch Celite filtriert und unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts als farbloses Öl in quantitativer Ausbeute konzentriert. MS: M + 1 = 349,1 (APCI).
Intermediat 13.
4-(4-Isopropylphenoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Intermediat 12 (9,82 g, 28,2 mmol) wurde in Morpholin (12,3 ml) bei 100°C eine Stunde lang gerührt. Das Reaktion(sgemisch) wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde mittels Silicagelchromatographie (0–30% EtOAc-Hexane-Gradientenelution, DC in 20% EtOAc-Hexane) unter Erhalt des gewünschte Titelprodukts (2,56 g, 24,4% Ausbeute) als hellgelbes Öl gereinigt. MS: M + 1 = 372,5 (APCI).
Intermediat 14.
4-(4-Isopropylphenoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure.
Intermediat 13 (2,36 g, 6,36 mmol) wurde mit Dioxan (19,2 ml) und 1N LiOH (12,8 ml) in einem Rundkolben bei 80°C 90 Minuten lang gerührt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und dann langsam und vorsichtig mit 1N HCl auf einen pH von etwa 2–3 angesäuert. Ein weißer Feststoff präzipitierte. Das Gemisch wurde mit mehr H₂O ver dünnt und dann filtriert. Der Filterkuchen wurde mit H₂O gespült, gesammelt und über Nacht in dem Vakuumofen unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (1,81 g, 82,9% Ausbeute) als weißer Feststoff getrocknet. MS: M + 1 = 344,2 (APCI). Mikroanalyse: Berechnet: C-62,96%, H-6,16%, N-12,24%; gefunden C-62,95%, H-6,20%, N-12,18%.
Beispiel 17.
4-(4-Isopropylphenoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Intermediat 14 (0,800 g, 2,33 mmol) wurde mit wasserfreiem Dichlormethan (11 ml) gemischt, löste sich darin aber nicht. Etwa fünf Tropfen DMF wurden zugegeben. Oxalylchlorid (0,222 ml, 2,56 mmol) wurde mittels einer Spritze zugegeben. Das Gemisch blubberte und wurde langsam homogen. Das Reaktionsgemisch) wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gerührt. HPLC-Analyse eines Aliquots, gequencht in MeOH/K₂CO₃, zeigte einen vollständigen Verbrauch der Ausgangssäure und die Bildung eines neuen, weniger polaren Produktes. 5-Aminotetrazol (0,416 g, 4,89 mmol), Triethylamin (0,680 ml, 4,89 mmol) und schließlich Acetonitril (11 ml) wurden zugegeben. Das Reaktion(sgemisch) wurde bei 80°C 60 Minuten lang gerührt. HPLC-Analyse eines Aliquots, gequencht in MeOH/K₂CO₃, zeigte ein neues Produkt. Das Reaktionsgefäß wurde geöffnet und nahezu bis zur Trockne sieden gelassen. Das Ölbad wurde entfernt, und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Der verbleibende Teer ("tar") wurde in einem Minimum an Acetonitril (~1 ml) aufgenommen. Das Gemisch wurde mit H₂O (~15 ml) verdünnt und mit IN HCl angesäuert, bis ein flockiger weißer Feststoff präzipitierte. Der Feststoff wurde abfiltriert und mit H₂O gespült. Der Filterkuchen wurde gesammelt und in einem Minimum an MeOH 30 Minuten lang aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde mit einem Minimum an MeOH gespült. Der Feststoff wurde über Nacht in einem Vakuumofen unter Erhalt des gewünschten Titelproduktes (0,739 g, 77,4% Ausbeute) als weißer Feststoff getrocknet.
Intermediat 15.
4-Chlor-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Zu einer Raumtemperatur-Lösung von Intermediat 4 (3,46 g, 13,7 mmol) und DMF (~5 Tropfen) in wasserfreiem Dichlormethan (70 ml) wurde Oxalylchlorid (1,31 ml, 15,0 mmol) tropfenweise mittels einer Spritze zugegeben. Das Reaktion(sgemisch) schäumte. Das Reaktionsgemisch) wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. HPLC-Analyse eines Aliquots zeigte einen kompletten Verbrauch des Ausgangspyrimidins und die Bildung eines neuen, weniger polaren Produkts. Das Reaktion(sgemisch) wurde mit gesättigter wässriger NaHCO₃(-Lösung) verdünnt. Die Verdünnung wurde dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, durch Celite filtriert und unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (1,056 g, 96,5% Ausbeute) als hellgelber Feststoff konzentriert. MS: M + 1 = 272,1 (APCI). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) ppm 1.37 (t, J = 7,08Hz, 3H), 3.75 (m, 4H), 3.90 (m, 4H), 4.34 (q, J = 7,08Hz, 2H), 8.81 (s, 1H).
Intermediat 16.
4-(4-Cyclohexylphenoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Zu einer gerührten Lösung von 4-Cyclohexylphenol (0,290 g, 1,62 mmol) in wasserfreiem THF (5 ml) wurde Natriumhydrid (0,040 g, 1,62 mmol) langsam und vorsichtig zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt. Die Phenoxidlösung wurde dann in eine gerührte Lösung von Intermediat 15 (0,440 g, 1,62 mmol) in wasserfreiem THF (5 ml) gegossen. Das Reaktion(sgemisch) wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang gerührt. Das Reaktion(sgemisch) wurde mit H₂O verdünnt und mehrere Male mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, durch Celite filtriert und konzentriert. Das Konzentrat wurde mittels Silicagelchromatogaphie (0–30% EtOAc-Hexane-Gradientenelution) unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (0,445 g, 66,9% Ausbeute) als hellgelbes Öl gereinigt. MS: M + 1 = 412,3 (APCI).
Intermediat 17.
4-(4-Cyclohexylphenoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure.
Intermediat 16 (0,445 g, 1,08 mmol) wurde mit Dioxan (3,0 ml) und 1N LiOH (2,25 ml) in einem Rundkolben bei 80°C 15 Minuten lang gerührt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und dann langsam und vorsichtig mit 1N HCl auf einen pH von etwa 2–3 angesäuert. Ein weißer Feststoff präzipitierte. Das Gemisch wurde mit mehr H₂O verdünnt und dann filtriert. Der Filterkuchen wurde mit H₂O gespült, gesammelt und über Nacht in einem Vakuumofen unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (0,369 g, 88,9% Ausbeute) als weißer Feststoff getrocknet. MS: M + 1 = 384,2 (APCI).
Beispiel 18.
4-(4-Cyclohexylphenoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Intermediat 17 (0,369 g, 0,960 mmol) wurde mit wasserfreiem Dichlormethan (5 ml) gemischt, löste sich darin aber nicht. Etwa drei Tropfen DMF wurden zugegeben. Oxalylchlorid (0,093 ml, 1,06 mmol) wurde mittels einer Spritze zugegeben. Das Gemisch blubberte und wurde langsam homogen. Das Reaktions(gemisch) wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gerührt. HPLC-Analyse eines Aliquots, gequencht in MeOH/K₂CO₃, zeigte einen vollständigen Verbrauch der Ausgangssäure und die Bildung eines neuen, weniger polaren Produktes. 5-Aminotetrazol (0,204 g, 2,40 mmol), Triethylamin (0,330 ml, 2,4 mmol) und schließlich Acetonitril (5 ml) wurden zugegeben. Das Reaktion(sgemisch) wurde bei 80°C 60 Minuten lang gerührt. HPLC-Analyse eines Aliquots, gequencht in MeOH/K₂CO₃, zeigte ein neues Produkt. Das Reaktionsgefäß wurde geöffnet und nahezu bis zur Trockne sieden gelassen. Das Ölbad wurde entfernt, und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Der verbleibende Teer ("tar") wurde in einem Minimum an Acetonitril (~1 ml) aufgenommen. Das Gemisch wurde mit H₂O (~15 ml) verdünnt und mit 1N HCl angesäuert, bis ein flockiger weißer Feststoff präzipitierte. Der Feststoff wurde filtriert und mit H₂O gespült. Der Filterkuchen wurde gesammelt und in einem Minimum an MeOH 30 Minuten lang aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde mit einem Minimum an MeOH gespült. Der Feststoff wurde über Nacht in einem Vakuumofen unter Erhalt des gewünschten Titelproduktes (0,246 g, 56,9% Ausbeute) als weißer Feststoff getrocknet.
Intermediat 18.
4-Cyclopentylamino-2-methylsulfanylpryrimidin-5-carbonsäureethylester.
Zu einer gerührten Lösung von Ethyl-4-chlor-2-methylthio-5-pyrimidincarboxylat (2,00 g, 8,59 mmol) in Methylenchlorid wurde Triethylamin (3,60 ml, 25,8 mmol), gefolgt von Cyclopentylamin (1,0 ml, 10,12 mmol), zugegeben. Die Reaktionslösung wurde 45 Minuten lang unter Rückfluss erhitzt. HPLC-Analyse eines Aliquots zeigte einen vollständigen Verbrauch des Ausgangspyrimidins und die Bildung eines neuen Produkts. Das Reaktionsgemisch) wurde in 1M HCl gegossen und mit Methylenchlorid verdünnt. Die organische Schicht wurde Wasser, Salzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und zu einem beigefarbenen Feststoff konzentriert (2,3614 g, 97%).
Intermediat 19.
4-Cyclopentylamino-2-methansulfinylpyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Intermediat 19 wurde in einer Weise, die derjenigen von Intermediat 8 ähnlich ist, unter Verwendung von Intermediat 18 (2,36 g, 8,39 mmol) und mCPBA (2,14 g, 1,14 mmol) unter Erhalt eines blassgelben Öls (2,456 g, 98%) hergestellt.
Intermediat 20.
4-Cyclopentylamino-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Intermediat 20 wurde in einer Weise, die derjenigen von Intermediat 9 ähnlich ist, unter Verwendung von Intermediat 19 (2,45 g, 8,24 mmol) und Morpholin (20 ml, 229,3 mmol) unter Bereitstellung eines rohen, gebrochen weißen Feststoffs hergestellt. Dieser wurde mittels Silicagelchromatographie (25% Ether/Hexane) unter Bereitstellung eines flockigweißen Feststoffes (2,52 g, 95%) gereinigt.
Intermediat 21.
4-Cyclopentylamino-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure.
Intermediat 21 wurde in einer Weise, die derjenigen von Intermediat 10 ähnlich ist, unter Verwendung von Intermediat 20 (0,971 g, 3,03 mmol) und von 6,2 ml 1M LiOH unter Bereitstellung eines weißen Feststoffs (0,700 g, 79%) hergestellt.
Beispiel 19.
4-Cyclopentylamino-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(1H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 19 wurde in einer Weise, die derjenigen von Beispiel 15 ähnlich ist, unter Verwendung von Intermediat 21 (0,129 g, 0,441 mmol) unter Bereitstellung des Titelprodukts als weißer Feststoff (0,125 g, 79%) hergestellt. MS: M + 1 = 360,3 (APCI). ¹H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 1.37-1.45 (m, 2H), 1.53-1.70 (m, 4H), 1.96-2.04 (m, 2H), 3.61-3.63 (m, 4H), 3.75-3.78 (m, 4H), 7.28-4.34 (m, 1H), 8.55 (d, J = 6.83Hz), 8.76 (s, 1H).
Die Titelverbindungen der Beispiele 20 und 21 wurden in einer zu Beispiel 19 analogen Weise synthetisiert, indem Cyclopentylamin durch Benzylamin bzw. Cyclohexylamin ersetzt wurde.
Beispiel 20.
Benzylamino-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(1H-tetrazol-5-yl)amid.
Beispiel 21.
4-Cyclohexylamino-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(1H-tetrazol-5-yl)amid.

Intermediat 22.
1-[1-(Dimethylamino)ethyliden]-2-methylisothioharnstoff-Hydroiodid.
Ein 5 1-Dreihals-Rundkolben, an dem ein Überkopfrührer ("overhead stirrer"), Rückflusskühler, Stickstoffeinlass und Heizmantel befestigt waren, wurde mit Thioharnstoff (162,8 g, 2,14 mol) und wasserfreiem Dichlormethan (2,4 1) beschickt. N,N-Dimethylacetamiddimethylacetal (399,9 g, 3 mol, 1,4 Äq.) wurde zu dem Kolben zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss unter Stickstoff 2 Stunden lang erhitzt und dann von der Heizung ("heat") getrennt und unter Erhalt eines orangefarbenen Feststoffes bis zur Trockne konzentriert. Der orangefarbene Feststoff wurde in wasserfreiem THF (1,5 1) suspendiert und in einem 5 1-Dreihals-Rundkolben, an dem ein Überkopfrührer, eine Temperatursonde und ein Tropftrichter mit einem N₂-Einlass befestigt war, überführt. Zu dieser gerührten Suspension wurde MeI (1668 ml) langsam in Portionen zugegeben. Die erste Portion (80 ml) resultierte in einer exothermen (Reaktion), und die Lösungstemperatur erhöhte sich von 23 auf 26°C. Das Reaktionsgemisch wurde extern mit Eiswasser gekühlt, und eine weitere Portion MeI (20 ml) wurde zugegeben. Während die Zugabe von MeI fortgesetzt wurde, fiel die Temperatur, und eine weitere Portion MeI (780 ml) wurde ohne eine beobachtete exotherme (Reaktion) zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt, und die letzte Portion MeI (788 ml) wurde ohne eine beobachtete exotherme (Reaktion) zugegeben. Nachdem die Zugabe vollständig war, wurde das Reaktionsgemisch unter N₂ über Nacht gerührt und dann für 72 Stunden in den Gefrierschrank (~20°C) überführt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, filtriert, und der Feststoff wurde mit Et₂O (2 × 500 ml) gewaschen, wobei das Produkt als gelbbrauner Feststoff bereitgestellt wurde. Die Feststoffe wurden unter Vakuum bei Raumtemperatur über Nacht unter Erhalt des gewünschten Produkts (556,6 g, 91,0%) als gelbbrauner Feststoff getrocknet.
Intermediat 23.
Ethyl-4-hydroxy-6-methyl-2-(methylthio)-5-pyrimidincarboxylat.
Ein 12 1-Dreihals-Rundkolben, an dem ein Überkopfrührer, ein Tropftrichter mit N₂-Einlass und ein Thermometer befestigt waren, wurde mit Intermediat 22 (556,6 g, 1,94 mmol) und wasserfreiem Dichlormethan (5 l) beschickt. Das Reaktionsgemisch wurde auf ~2°C (Eisbad) gekühlt, während es unter N₂ gerührt wurde, und Ethylmalonylchlorid (350 g, 2,33 mol) wurde zugegeben. Nach der Zugabe wurde die Reaktion weitere 1,5 Stunden bei ~2°C gerührt. Zu dieser Suspension wurde Triethylamin (648 ml, 4,66 mol) tropfenweise zugegeben, wobei die Reaktion(stemperatur) während der Zugabe (2,5 h) unter 5°C gehalten wurde. Bei Vervollständigung der Zugabe wurde die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, wie sie auch über Nacht unter N₂ gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde auf pH ~4 durch Zugeben von 525 ml 10%iger wässriger HCl-Lösung angesäuert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit Salzlösung (1 × 1050 ml) gewaschen. Weitere 750 ml Salzlösung wurden zu der organischen Schicht zugegeben, und der pH der Salzlösungsschicht wurde von 5~5 auf etwa 7 durch Zugeben gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (~225 ml), in Portionen, eingestellt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über MgSO₄ 1,5 Stunden lang getrocknet, filtriert und mittels eines Rotationsverdampfers ("rotovap") unter Bereitstellung eines gummiartigen orangefarbenen Feststoffs konzentriert, welcher bei Raumtemperatur über Nacht unter Hochvakuum getrocknet wurde. Der gummiartige feuchte Rückstand (579,5 g) wurde mit 1,2 1 Hexane:EtOAc (1:1) 3 Stunden lang verrieben. Das Gemisch wurde unter Bereitstellung eines gummiartigen gelben Feststoffs filtriert, welcher unter Hochvakuum über Nacht getrocknet wurde. Der gelbe Feststoff (~400 g) wurde in 2,8 1 Dichlormethan aufgenommen, und die resultierende heterogene Suspension wurde filtriert. Die klare Dichlormethanlösung wurde über SiO₂ mit 0–10% EtOAc-Dichlormethan chromatographiert. Die produktreichen Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und erneut mit 0–10% EtOAc-Dichlormethan chromatographiert. Die produktreichen Fraktionen wurden konzentriert, mit 800 ml Hexane:EtOAc (1:1) über Nacht verrieben und filtriert. Der gelbe Feststoff wurde unter Hochvakuum über Nacht unter Erhalt des gewünschten Produkts (113,6 g, 26%) als blassgelber Feststoff getrocknet.
Intermediat 24.
4-Cycloheptyloxy-6-methyl-2-methylsulfanylpyrimidin-5-carbonsäureetbylester.
Intermediat 23 (3,00 g, 13,2 mmol) wurde mit Cycloheptanol (1,75 ml, 14,5 mmol), DEAD (3,12 ml, 19,8 mmol) und Triphenylphosphin (5,19 g, 19,8 mmol) in THF (60 ml) kombiniert. Das Reaktion(sgemisch) wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. HPLC-Analyse zeigte ein neues Produkt zusammen mit überschüssigem Triphenylphosphin und Triphenylphosphinoxid. Das Reaktionsgemisch wurde in vacuo konzentriert. Das Konzentrat wurde mittels Silicagelchromatographie (0–17% EtOAc-Hexane-Gradientenelution, DC in 10% EtOAc-Hexane) unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (3,64 g, 85% Ausbeute) als hellpinkfarbenes Öl gereinigt. MS: M + 1 = 325,1 (APCI).
Intermediat 25.
4-Cycloheptyloxy-2-methansulfinyl-6-methylpyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Zu einer gerührten Lösung von Intermediat 24 (3,252 g, 10,04 mmol) in Chloroform (50 ml) wurde mCPBA (2,71 g, 12,1 mmol) portionsweise zugegeben. Die Reaktion wurde dann 40 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Eine weitere Portion mCPBA (350 mg) wurde zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit gesättigter wässriger NaHCO₃(-Lösung) gequencht und mit Wasser verdünnt. Die Verdünnung wurde mehrere Male mit Dichlormethan extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, durch Celite filtriert und unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (3,57 g) als farbloses Öl konzentriert. Das Produkt wurde ohne weitere Aufreinigung weitergeführt. MS: M + 1 = 341,1 (APCI).
Intermediat 26.
4-Cycloheptyloxy-6-methyl-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester.
Intermediat 25 (0,298 g, 0,876 mmol) wurde in Morpholin (0,381 ml) bei 100°C eine Stunde lang gerührt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde mittels Silicagelchromatographie (0–50% EtOAc-Hexane-Gradientenelution, DC in 20% EtOAc-Hexane) unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (0,274 g, 86,2% Ausbeute) als farbloses Öl gereinigt. MS: M + 1 = 364,1 (APCI). Mikroanalyse: Berechnet C-62,79%, H-8,04%, N-11,56%; gefunden C-62,42%, H-8,13%, N-11,59%.
Intermediat 27.
4-Cycloheptyloxy-6-methyl-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure.
Intermediat 6 (0,237 g, 0,653 mmol) wurde mit Dioxan (3 ml) und 1N LiOH (2 ml) in einem Rundkolben bei 80°C 6 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und dann langsam und vorsichtig mit 1N HCl bis auf pH ~1 angesäuert. Das Säure-Gemisch wurde mehrere Male mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden kombiniert, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, durch Celite filtriert und unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (0,218 g, 100% Ausbeute) als Öl, das sich beim Stehenlassen verfestigte, konzentriert. MS: M + 1 = 336,1 (APCI).
Beispiel 22.
4-Cycloheptyloxy-6-methyl-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Intermediat 27 (0,131 g, 0,391 mmol) wurde mit wasserfreiem Dichlormethan (2,5 ml) gemischt, löste sich aber nicht darin. Ein Tropfen DMF wurde zugegeben. Oxalylchlorid (0,0406 ml, 0,469 mmol) wurde über eine Spritze zugegeben. Das Gemisch blubberte und wurde langsam homogen. Das Reaktion(sgemisch) wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gerührt. HPLC-Analyse eines Aliquots, gequencht in MeOH/K₂CO₃, zeigte einen vollständigen Verbrauch der Ausgangssäure und die Bildung eines neuen, weniger polaren Produktes. 5-Aminotetrazol (0,0565 g, 0,665 mmol), Triethylamin (0,114 ml, 0,821 mmol) und schließlich Acetonitril (2,5 ml) wurden zugegeben. Das Reaktion(sgemisch) wurde bei 80°C 30 Minuten lang gerührt. HPLC-Analyse eines Aliquots, gequencht in MeOH/K₂CO₃, zeigte ein neues Produkt. Das Ölbad wurde entfernt, und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Das Gemisch wurde mit 1N HCl angesäuert, mit H₂O verdünnt und mehrere Male mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden kombiniert, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, durch Celite filtriert und konzentriert. Das Rohprodukt wurde mittels Umkehrphasen-HPLC in präparativem Maßstab unter Erhalt des gewünschten Titelprodukts (0,040 g, 24,4%) als weißer Feststoff gereinigt.
Intermediat 4 wurde ebenfalls gemäß der folgenden Vorgehensweise hergestellt: Morpholinoformamidin-Hydrobromid (10,00 g, 77,42 mmol) wurde mit Diethylethoxymethylenmalonat (23,5 ml, 116 mmol) und Natriumacetat (14,0 g, 2,20 mmol) in DMF (240 ml) bei 110°C 18 Stunden lang gerührt. Das Reaktion(sgemisch) färbte sich langsam von hellgelb zu rot während der ersten Stunden. HPLC-Analyse zeigte die Bildung des gewünschten Produktes. Das Reaktionsgemisch wurde in vacuo konzentriert. Der verbleibende Rückstand wurde in H₂O (~150 ml) bei Raumtemperatur für eine Stunde unter Erhalt eines beigefarbenen Präzipitats aufgeschlämmt. Der Feststoff wurde abfiltriert, mit H₂O gespült und in dem Vakuumofen getrocknet. Der getrocknete Filterkuchen wurde dann in Et₂O (~70 ml) bei Raumtemperatur für 20 Minuten aufgeschlämmt. Das Gemisch wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde mit einem Minimum an Et₂O gespült. Der Feststoff wurde gesammelt und über Nacht unter Vakuum unter Erhalt des gewünschten Produkts, 4-Hydroxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäureethylester (Intermediat 4, 7,251 g, 59,9% Ausbeute) als flockiger beigefarbener Feststoff getrocknet.
BIOLOGISCHES BEISPIEL 1
PI3Kγ-Proteinexpressions- und -aufreinigungsprotokoll
Spodoptera frugiperda ("Spodtera frugiperda")-Zellen, gewachsen in ESF921-Medien, wurden mit Baculovirus, der p101 mit Glu-Anhang ("glu-tagged") exprimiert, und Baculovirus, der p110γ mit HA-Anhang ("HA-tagged") exprimiert, in einem 3:1-Verhältnis von p101-Baculovirus zu p110γ-Bacμlovirus coinfiziert. Sf9-Zellen wurden bis zu 1 × 10⁷ Gesamtzellzahl ("total cells")/ml in 10 1-Bioreaktoren wachsen gelassen und 48–72 Stunden nach der Infektion geerntet. Proben infizierter Zellen wurden auf Expression von p101/p110γ-PI3-Kinase mittels Immunpräzipitations- und Western Blot-Analyseverfahren (siehe unten) getestet.
Um PI3Kγ zu reinigen, wurden 4 Volumina von hypotonem Lysepuffer bei Raumtemperatur (1 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 5 mM EDTA, 1 mM Pefabloc, 0,5 μM Aprotinin, 5 μM Leupeptin, 5 μM Pepstatin, 5 μM E64, pH 8) pro Gramm Zellpaste unter Rühren auf gefrorene Zellpellets gegossen, dann wurde in einer Stickstoff-"Bombe" bei 400 psi (599HC T316, Parr Instrument Co, Moline, IL) lysiert. NaCl wurde bis zu 150 mM zugegeben, und Natriumcholat wurde bis 1% zugegeben, und es wurde für weitere 45 Minuten gemischt. Die Lysate wurden mittels Zentrifugation bei 14.000 UpM für 25 Minuten geklärt. Die Lysate wurden dann unter Verwendung von 20 ml Harz/50 g Zellpaste auf Anti-Glu-verknüpfte Protein-G-Sepharose-Kügelchen ("anti-glu-linked Protein-G Sepaharose beads") (Covance Research Products, Richmond, CA) aufgegeben. Die Säule wurde mit 15 Volumina Waschpuffer (1 mM DTT, 0,2 mM EGTA, 1 mM Pefabloc, 0,5 μM Aprotinin, 5 μM Leupeptin, 2 μM Pepstatin, 5 μM E64, 150 mM NaCl, 1% Natriumcholat, pH 8) gewaschen. PI3Kγ wurde mit 6 Säulenvolumina Waschpuffer, der 100 μg/ml eines Peptides enthält, das mit dem Glu-Anhang bzw. Glu-Tag um die Bindung konkurriert, eluiert. Die Säulenfraktionen mit dem eluierten Protein (bestimmt durch Aufnehmen von OD₂₈₀-Ablesungen) wurden gesammelt und in 0,2 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 5 μM Leupeptin, 0,5% Natriumcholat, 150 mM NaCl und 50% Glycerin, pH 8, dialysiert. Die Fraktionen wurden bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.
BIOLOGISCHES BEISPIEL 2
G-Protein-Untereinheiten-Expression
Spodoptera frugiperda ("Spodtera frugiperda")-Zellen wurden mit Baculovirus, der G-Protein-β₁ mit Glu-Anhang exprimiert, und Baculovirus, der G-Protein-β₂ exprimiert, in einem 1:1-Verhältnis von G-Protein-β₁ mit Glu-Anhang-Baculovirus zu G-Protein-β₂-Baculovirus coinfiziert. Sf9-Zellen wurden in 10 1-Bioreaktoren wachsen gelassen und 48–72 Stunden nach der Infektion geerntet. Proben der infizierten Zellen wurden auf G-Protein-β₁/β₂-Expression mittels Western Blot-Analyse, wie unten beschrieben, getestet. Zelllysate wurden homogenisiert und auf eine Säule mit Kügelchen mit Glu-Anhang wie in Biologisches Beispiel 1 aufgegeben und mit einem Glu-Peptid aus der Säule verdrängt und wie in Biologisches Beispiel 1 beschrieben verarbeitet.
BIOLOGISCHES BEISPIEL 3
Western Blot-Analyse
Proteinproben wurden in einem 8% Tris-Glycin-Gel laufen gelassen und auf eine 45 μM-Nitrocellulosemembran übertragen. Die Blots wurden dann mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) und 5% Ovalbumin in TEST (50 mM Tris, 200 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,4) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur geblockt und über Nacht bei 4°C mit primärem Antikörper, verdünnt 1:1000 in TEST mit 0,5% BSA, inkubiert. Die primären Antikörper für die p110γ-, p110α-, p110β-, p85α-, G-Protein-β₁- und G-Protein-γ₂-Untereinheiten wurden von Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, erworben. Die p101-Untereinheit-Antikörper wurden bei Reserch Genetics, Inc., Huntsville, AL, basierend auf einem p101-Peptid-Antigen, entwickelt.
Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper wurden die Blots in TEST gewaschen und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit Ziege-anti-Kaninchen-HRP-Konjugat ("goat-antirabbit HRP conjugate") (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Produkt-Nr. 170-6515), verdünnt 1:10.000 in TEST mit 0,5% BSA, inkubiert. Die Antikörper wurden mit ECL^TM-Detektionsreagenzien (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, New Jersey) detektiert und mit einem Kodak ISO400E-Scanner quantifiziert.
BIOLOGISCHES BEISPIEL 4
Immunpräzipitation
100 μl Zellpaste aus Biologisches Beispiel 1 oder 2 wurde aufgetaut und auf Eis mit 400 μl hypotonem Lysepuffer (25 mM Tris, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM Pefabloc, 5 μM Leupeptin, 5 μM E-64 (Roche), 1% Nonidet P40, pH 7,5–8) lysiert. Das Lysat wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit Kügelchen mit Glu-Anhang (Covance Research Products, Cambridge, England, Produkt-Nr. AFC-115P) inkubiert. Die Kügelchen wurden dreimal in Waschpuffer (20 mM Tris, pH 7,8–8, 150 mM NaCl, 0,5% NP40) gewaschen, und das Protein eluierte von den Kügelchen durch Erhitzen in zweifachem Probenpuffer (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Produkt Nr. LC 1676).
BIOLOGISCHES BEISPIEL 5
PI3Kγ-in-vitro-Kinase-Assay
Die inhibierenden Eigenschaften der Verbindungen in Tabelle 1 wurden in einem in vitro-P13K-Assay untersucht. In einer 96-Well-Polypropylenplatte wurden in jedem Well 2 μl des 50-Fachen der gewünschten Endkonzentration einer Verbindung in DMSO platziert ("spotted"). Gereinigte/s rekombinante/s p101/p110γ-Protein (0,03 μg, ~2,7 nM) und G-Protein-β₁/γ₂-Untereinheiten (0,09 μg, ~57,7 nM) wurden für jede Reaktion in dem Assaypuffer (30 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA und 1 mM DTT) kombiniert. ATP und [γ³²P-ATP] (0,09 μCi) wurden zu diesem Gemisch zugegeben, so dass die ATP-Endkonzentration in dem Reaktion(sgemisch) 20 μM betrug. Lipidmicellen wurden mittels zehnminütiger Ultraschallanwendung bzw. Beschallen von Phosphatidylinositol-4,5-diphosphat (PIP₂), Phosphatidylethanolamin (PE) und Na-Cholat in dem Assaypuffer gebildet, wobei MgCl₂ zugegeben wurde und 20 Minuten lang auf Eis inkubiert wurde, um Endkonzentrationen von 25 μM PIP₂, 300 μM PE, 0,02% Na-Cholat und 10 mM MgCl₂ in dem Reaktionsgemisch) zu erhalten. Die Reaktionen wurden durch Zugeben gleicher Volumina an Lipid- und Enzymgemisch in einem Gesamtvolumen von 50 μl gestartet, sie wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur laufen gelassen und mit 100 μl 75 mM H₃PO₄ abgestoppt. Das Lipidprodukt wurde auf eine Glasfaser-Filterplatte übertragen und mit 75 mM H₃PO₄ mehrere Male gewaschen. Das Vorhandensein eines radioaktiven Lipidproduktes (PIP₃) wurde mittels Zugabe von Wallac Optiphase-Gemisch zu jedem Well und Auszählen in einem Wallac 1450 Trilux-Plattenlesegerät (Perkin Elmer Life Sciences Inc., Boston, MA 02118) gemessen. Der IC₅₀(-Wert) für jede getestete Verbindung ist in μM in den obigen Tabellen angegeben.
BIOLOGISCHES BEISPIEL 6
Arthritis, die durch Mause-Collagen induziert wird
Typ II-Collagen vom Rind (University of Utah) wurde mit 0,01N Essigsäure bis zu einer Konzentration von 2 mg/ml verdünnt und mit einem gleichen Volumen an Freund'schem komplettem Adjuvans (Difco, Detroit, Michigan), supplementiert mit 1 mg/ml Mycobacterium tuberculosis Hra37, emulgiert. Weibliche DBA/1 LacJ-Mause (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) in passendem Alter (8–12 Wochen) wurden mit 100 μl Emulsion (100 μg Collagen) intradermal an der Basis des Schwanzes immunisiert. Am Tag 28 nach der Immunisierung wurden den Mäusen 50 μg Lipopolysaccharid (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri) intraperitoneal (IP) in 100 μl Saline gegeben. Die Verbindung aus Beispiel 1 (4-Cycloheptyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid) wurde zu 30 mg/kg q.d. mittels oraler Sondengabe ("oral gavage") für zwei Wochen, beginnend am Tag 27, dosiert. Die Entwicklung von Arthritis wurde an den Tagen 27, 31, 34, 37 und 41 beurteilt. Eine klinische Punktzahl wurde für jede Gliedmaße unter Verwendung der folgenden Skala vergeben: (0) normal, (1) Erythem und Ödem, (2) Gelenkdistortion, (3) Gelenkankylose. Ödemmessungen an den Vorderpfoten, Hinterpfoten und Knöcheln wurden unter Verwendung von Messschiebern mit konstanter Federkraft ("constant tension calipers") (Dyer, Lancaster, Pennsylvania) durchgeführt. Die Verbindung aus Beispiel 1 inhibierte das Pfotenödem in diesem Modell bei 30 mg/kg q.d. um 52% und die klinische Punktzahl um 35%.
BIOLOGISCHES BEISPIEL 7
Pfotenödem, das durch Streptokokken-Zellwand ("Streptococcal Cell Wall") – SCW induziert wird
Weibliche Lewis-Ratten (~150 g) erhielten 6 μg SCW in 10 μl Dulbeccos PBS mittels intraartikulärer Injektion in das rechte tibiotalare Gelenk am Tag 0. Am Tag 21 wurde die Wiederholungsreaktion mit 100 μg SCW (250 μl, i.v.) initiiert. Ein Vehikel (0,5% Hydroxypropylmethylcellulose/0,2% Tween 80) oder die Verbindung aus Beispiel 1 (4-Cycloheptyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid) wurde oral (10 ml/kg Volumen), q.d., 1 Stunde vor der SCW, i.v., und an den folgenden Tagen gegeben. Basislinienvolumina der sensibilisierten Hinterpfote wurden mittels eines Quecksilber-Verdrängungsplethysmometers ("mercury displacement plethysmometer") vor der Initiierung der Erkrankung am Tag 21 gemessen und von den nachfolgenden Bewertungen (durchgeführt 24 h nach jeder Dosis) subtrahiert, um den Δ-Wert (die Differenz zwischen dem Pfotenvolumen vor der Initiierung der Krankheit am Tag 21 und dem Pfotenvolumen 24 Stunden nach jeder Dosis) zu bestimmen. Die Verbindung aus Beispiel 1 wurde zu 10, 30 und 100 mg/kg q.d. mittels oraler Sondengabe für 4 Tage, beginnend am Tag 21, dosiert. Die Verbindung aus Beispiel 1 inhibierte das Pfotenödem in diesem Modell mit einem ID₅₀(-Wert) von 16,3 mg/kg.
Es wird verstanden, dass die hierin beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur zu Veranschaulichungszwecken sind.

Claims

Verbindung der Formel I:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon; worin: R⁶ Wasserstoff oder Methyl ist; Y O, NH oder S ist; R⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: einem C₂-C₆-Alkyl, einem -L-C₃-C₈-Cycloalkyl, einem Adamantyl, einem 5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyl und -J-R^c; worin R^c eine Phenylgruppe oder eine Naphthylgruppe ist, worin L nicht vorhanden oder ein C₁-C₃-Alkylen ist, und worin J nicht vorhanden oder ein C₁-C₄-Alkylen ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Y O ist, R⁶ Wasserstoff ist und R⁴ ein C₃-C₈-Cycloalkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Verbindung ist: 4-Cycloheptyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-Cyclopentyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-Cyclohexyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-Cyclooctyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-(2-Cyclohexylethoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-Cyclohexylmethoxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-(3,3-Dimethylcyclohexyloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; und 4-(3,5-Dimethylcyclohexyloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: 4-(Adamantan-2-yloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; und 4-(Bicyclo[2.2.1]hept-2-yloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Y O ist, R⁶ Wasserstoff ist und R⁴ ein C₃-C₈-Cycloalkyl oder ein C₁-C₃-Alkylen-C₃-C₈-cycloalkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Y O ist, R⁶ Wasserstoff ist und R⁴ ein 5- oder 6-gliedriges Heterocycloalkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R⁴ Tetrahydropyranyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Y O ist, R⁶ Wasserstoff ist und R⁴ eine Phenylgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: 4-(4-Isopropylphenoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; und 4-(4-Cyclohexylphenoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Y NH ist und R⁶ Wasserstoff ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, zur Behandlung einer Krankheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: rheumatoider Arthritis, Spondylarthritis, Osteoarthritis, Arthritis psoriatica, Psoriasis, Entzündungserkrankungen und Autoimmunerkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Verbindung eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1–10 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1–10 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 4-Cycloheptyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-Cyclopentyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-Cyclohexyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-Cyclooctyloxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-(2-Cyolohexylethoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-Cyolohexylmethoxy-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-(3,3-Dimethylcyclohexyloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-(3,5-Dimethylcyclohexyloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-(Adamantan-2--yloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-(Bicyclo[2.2.1]hept-2-yloxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; 4-(4-Isopropylphenoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid; und 4-(4-Cyclohexylphenoxy)-2-morpholin-4-yl-pyrimidin-5-carbonsäure(2H-tetrazol-5-yl)amid.