DE60122932T2

DE60122932T2 - Zusammensetzungen und Verfahren für die Synthese und weitere Modifikation von Uridine-5'-Diphosphosulfoquinovose (UDP-SQ)

Info

Publication number: DE60122932T2
Application number: DE60122932T
Authority: DE
Inventors: Christoph East Lansing BENNING; Lea Sherrie Macedonia SANDA; Michigan State University Bin East Lansing YU
Original assignee: Michigan State University MSU
Current assignee: Michigan State University MSU
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-07
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2021-11-08
Also published as: DE60122932D1; WO2002048706A3; US20070134778A1; JP2004535767A; JP4068964B2; US7226764B1; ATE338827T1; WO2002048706A2; AU2002243365A1; US7479387B2; EP1356072B1; EP1356072A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Synthese und anschließenden Modifikation von Uridin-5'-diphosphosulfochinovose (UDP-SQ). Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen die Verwendung rekombinanter Enzyme aus Arabidopsis thaliana, UDP-Glucose und eines Schwefeldonators zur Synthese von UDP-SQ, und die anschließende Modifikation von UDP-SQ zur Bildung von Verbindungen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, 6-Sulfo-α-D-chinovosyldiacylglycerin (SQDG) und Alkylsulfochinovosid.
HINTERGRUND
Uridin-5'-diphosphosulfochinovose (UDP-SQ) ist ein einzigartiges Zucker-Nukleotid, das eine negative Ladung an seiner Sulfonatgruppe trägt. UDP-SQ reagiert mutmaßlich mit zuckernukleotidabhängigen Glycosyltransferasen und gibt seine Sulfonatgruppe an andere Substrate ab, damit wertvolle Verbindungen erhalten werden, wie u.a., aber nicht eingeschränkt auf 6-Sulfo-α-D-chinovosyldiacylglycerin (SQDG). UDP-SQ ist wahrscheinlich die direkte Vorstufe von SQDG, an das es seine einzige Sulfonsäure-Kopfgruppe, Sulfochinovose, abgibt. Es gibt jedoch weder ein einfaches schnelles Verfahren zur Synthese von UDP-SQ, noch ein effizientes Verfahren für eine anschließende Modifikation von UDP- SQ in Verbindungen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf SQDG und Alkylsulfochinovosid.
SQDG ist ein abundantes schwefelhaltiges Nichtphosphor-Glycerolipid, das speziell mit Photosynthese-(Thylakoid-)-Membranen von höheren Pflanzen, Moosen, Farnen, Algen und den meisten photosynthetischen Bakterien assoziiert ist. SQDG ist universell mit der sauerstoffproduzierenden Photosynthese assoziiert und ist ein wichtiger Bestandteil des biologischen Schwefelzyklus.
SQDG ist Befunden zufolge ein leistungsstarker Inhibitor verschiedener Säugetier-DNA-Polymerasen und der Reversen Transkriptase 1 des Immunschwächevirus beim Menschen (HIV-RT1) und ist als solches eine wertvolle antivirale Verbindung (Ohta et al., Sulfoquinovosyldiacylglycerol, KM043, a new potent inhibitor of eukaryotic DNA polymerases and HIV-reverse transcriptase type 1 from a marine red alga, Gigartina tenella," Chem. Pharm. Bull., 46 (4): 684-86 (1999)). Darüber hinaus hat sich auch herausgestellt, dass SQDG aufgrund seiner Anti-Tumor-fördernden Eigenschaften und seiner Fähigkeit zur Steigerung der zellabtötenden Wirkungen von Anti-Krebs-Chemotherapeutika wertvoll ist. (Shirahashi et al., "Isolation and Identification of Anti-tumor-Promoting Principles from the Fresh-Water Cyanobacterium Phormidium tenue", Chem. Pharm. Bull., 41 (9): 1664-66 (1993)). Zudem wird allgemein angenommen, dass SQDG ausgezeichnete Detergenzeigenschaften aufweist. (Benson, A. A., "The Plant Sulfolipid", Adv. Lipid Res., 1: 387-94 (1963)). Somit bedarf es eines Verfahrens zur Herstellung von UDP-SQ und seiner anschließenden Modifikation in Verbindungen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf SQDG. Herkömmlicherweise wurde UDP-SQ über eine Reihe von chemischen Reaktionen synthetisiert. (Heinz et al., "Synthesis of different nu cleoside 5'-diphosphosulfoquinovoses and their use for studies on sulfolipid biosynthesis in chloroplasts", Eur. J. Biochem., 184: 445–453 (1989)). Diese chemische Produktion ist jedoch sehr aufwändig, führt zu niedrigen Ausbeuten von UDP-SQ und braucht mehrere Tage bis zum Ende. (Id.) Darüber hinaus erforderten vorhergehende Untersuchungen von SQDG eine zeitraubende Isolation und Reinigung des anionischen Sulfolipids aus photosynthetischen Organismen. (Ohta et al., "Action of a New Mammalian DNA Polymerase Inhibitor, Sulfoquinovosyldiacylglycerol", Biol. Pharm. Bull., 22 (2): 111-16 (1999); Gustafson et al., "AIDS-Antiviral Sulfolipids From Cyanobacteria (Blue-Green Algae)", J. Natl. Cancer Inst., 81: 1254-258 (1989)). Daher wird ein einfacheres, schnelles Verfahren zur Synthese von UDP-SQ und zur anschließenden Modifikation von UDP-SQ in Verbindungen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf SQDG, benötigt.
Rossak et al., "Accumulation of UDP-sulfoquinovose in a Sulfolipid-deficient Mutant of Rhodobacter sphaeroides", J. Biol. Chem. 270 (43): 25792-25797 (1995), offenbart, dass die Inaktivierung des R. sphaeroides sqdD-Gens zu einer sulfolipid-defizienten Mutante führt, und es wird angenommen, dass das Gen als UDP-Sulfochinovose:Diacylglycerin-Sulfochinovosyltransferase wirkt. Die Literaturstelle offenbart kein Verfahren, bei dem Uridin-5'-diphosphoglucose in Uridin-5'-diphosphosulfochinovose umgewandelt wird, wobei Sulfit und ein erstes Peptid verwendet wird, das von einer Nukleinsäuresequenz codiert wird, die in Seq.-ID.-Nr. 5 offenbart wird, gefolgt von der Übertragung der Sulfochinovose auf Diacylglycerin, wobei ein zweites Peptid verwendet wird, das von der in Seq.-ID.-Nr. 4 offenbarten Nukleinsäure codiert wird, so dass Sulfochinovosyldiacylglycerin erzeugt wurde.
Essigmann et al., "Prediction of the active-site structure and NAD(+) binding in SDQ1, a protein essential for sulfolipid biosynthesis in Arabidopsis", Arch. Biochem. Biophys. 369: 30-41 (1999) offenbart die Expression des rekombinanten SQD1-Proteins in E. coli, und ein dreidimensionales Atommodell des SQD1-Gens von A. thaliana, wobei die kristallographische Struktur von UDP-Glucose-4-epimerase als Matrize verwendet wird, zusammen mit einer vorhergesagten NAD⁺-Bindungsstelle. Die Literaturstelle offenbart kein Verfahren, bei dem Uridin-5'-diphosphoglucose in Uridin-5'-diphosphosulfochinovose umgewandelt wird, wobei Sulfit und ein erstes Peptid verwendet wird, das von der in Seq.-ID.-Nr. 5 offenbarten Nukleinsäuresequenz codiert wird, gefolgt von der Übertragung der Sulfochinovose auf Diacylglycerin, wobei ein zweites Peptid verwendet wird, das von der in Seq.-ID.-Nr. 4 offenbarten Nukleinsäure codiert wird, so dass Sulfochinovosyldiacylglycerin erzeugt wird.
Güler et al., "A cyanobacterial gene, sqdX, required for biosynthesis of the sulfolipid sulfoquinovosyldiacylglycerol" J. Bacteriol. 182: 543–545 (2000), offenbart, dass sqdX die Sulfolipid-Biosynthese in der Synechococcus-Mutante 7942 Δsqdx wieder herstellt. Die Literatur offenbart die Isolation und Charakterisierung der Lipid-Gen-Produkte aus dem Wild-Typ und der Mutante 7942sqdx von Synechococcus sp. PCC 7942. Die Literaturstelle offenbart kein Verfahren, bei dem Uridin-5'-diphosphoglucose in Uridin-5'-diphosphosulfochinovose mit einem Sulfit und einem ersten Peptid umgewandelt wird, das von der in Seq.-ID.-Nr. 5 offenbarten Nukleinsäuresequenz codiert wird, gefolgt von der Übertra gung der Sulfochinovose auf Diacylglycerin mit einem zweiten Peptid, das von einer in Seq.-ID.-Nr. 4 offenbarten Nukleinsäure codiert wird, so dass Sulfochinovosyldiacylglycerin erzeugt wird.
Sanda et al. "Enzymatic Action of SQD1 – A protein involved in Sulfolipid Headgroup Biosynthesis", Plant Biology, 58 (2000), Abstract 201, Annual meeting of the American Society for Plant Physiologists, legt nahe, dass das Enzym SQD1 die In-vitro-Synthese von UDP-Sulfochinovose (UDP-SQ) aus UDP-Glucose (UDP-G) katalysiert. Die Literaturstelle offenbart kein Verfahren, bei dem Uridin-5'-diphosphoglucose in Uridin-5'-diphosphosulfochinovose umgewandelt wird, wobei Sulfit und ein erstes Peptid verwendet wird, das von der in Seq.-ID.-Nr. 5 offenbarten Nukleinsäuresequenz codiert wird, gefolgt von der Übertragung der Sulfochinovose in Diacylglycerin mit einem zweiten Peptid, das von einer in Seq.-ID.-Nr. 4 offenbarten Nukleinsäure codiert wird, so dass Sulfochinovosyldiacylglycerin erzeugt wird.
Diese Literaturstellen offenbaren nicht die Poly-Nukleotidsequenz Seq.-ID.-Nr. 4, die das zweite Peptid codieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und betrifft Verfahren zur Synthese und anschließenden Modifikation von Uridin-5'-diphosphosulfochinovose (UDP-SQ). Die Synthese von UDP-SQ ist kein Teil der Ansprüche. Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen die Verwendung der rekombinanten Enzyme aus Arabidopsis thaliana, UDP-Glucose, und eines Schwefeldonators zur Synthese von UDP-SQ. Im Gegensatz zu den gängigen Verfahren zur Synthese von UDP-SQ, sind die erfindungsgemäßen Syntheseverfahren einfach und schnell. Tatsächlich kann die Produktion von UDP-SQ durch die erfindungsgemäßen Verfahren in weniger als 1 Std. beendet werden.
Die vorliegende Erfindung schlägt ein Verfahren zur Synthese von UDP-SQ vor, umfassend: a) Bereitstellung von: i) Uridin-5'-diphosphoglucose (UDP-Glc); ii) einem Schwefeldonator; und iii) einem Peptid, das die Umwandlung von UDP-Glc in Uridin-5'-diphosphosulfochinovose (UDP-SQ) katalysieren kann; und b) Umsetzen von UDP-Glc mit dem ersten Peptid und dem Schwefeldonator unter solchen Bedingungen, dass UDP-SQ erzeugt wird. Die Synthese von UDP-SQ ist keine Ausführungsform der Erfindung.
Bei einer Ausführungsform ist das erste Peptid SQD1 ein Genprodukt, das von der in Seq.-ID.-Nr. 5 offenbarten Nukleinsäuresequenz codiert wird.
Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung durch die Verwendung eines spezifischen Schwefeldonators eingeschränkt ist. Bei einer Ausführungsform ist der Schwefeldonator ausgewählt aus der Gruppe umfassend Sulfat, Sulfit, Sulfid, Thiosulfat, Sulfoglutathion, Adenosin-5'-phosphosulfat (APS) und 3'-Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat (PAPS). Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Schwefeldonator Sulfit.
Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung durch die Verwendung eines spezifischen Verfahrens zur Expression oder Produktion eines Peptids eingeschränkt ist, das die Umwandlung von UDP-Glc und einem Schwefeldonator in UDP-SQ katalysieren kann. Bei einer Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung die Klonierung der sqd1-Gen-cDNA in die Gruppe von Protein-Expressionsvektoren vor, wie pQE-9, pQE-16, pQE-31, pQE-32, pQE-40, pQE-60, pQE-70, pQE-80, pQE-81, pQE-82 oder pQE-100. Bei einer weiteren Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung die Klonierung der sqd1-Gen-cDNA in den Protein-Expressionsvektor pQE-30 vor (siehe 3).
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden geeignet in einem Reaktionsgefäß oder Behälter durchgeführt. Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf ein bestimmtes Reaktionsgefäß eingeschränkt ist. Eine Anzahl von Behältern kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf Röhrchen, Kolben und andere Glasgeräte.
Bei einer alternativen Ausführungsform schlägt die Erfindung die Umwandlung von Pflanzenzellen oder Geweben vor, so dass das sqd1-Genprodukt exprimiert wird. Bei einer Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung die Klonierung der sqd1-Gen-cDNA (Seq.-ID.-Nr. 5) in einen binären Vektor zum Einbringen in Agrobacterium tumefaciens und anschließenden Erzeugen der transgenen Pflanzenzelle über Agrobakterien-Transformation vor.
Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung durch die Verwendung von irgend einem spezifischen Verfahren zur Reinigung eines rekombinanten Peptids eingeschränkt ist, das die Umwandlung von UDP-Glc in UDP-SQ katalysieren kann. Bei einer Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung die Reinigung des Peptids durch die Verwendung der 6 His-Markierung vor, die in den Protein-Expressionsvektor eingebaut wird, der die Proteinaffinitätsreinigung über eine Chromatographiesäule auf Nickel-Nitrilessigsäure(Ni-NTA)-Agaroseharz-Basis ermöglicht.
Es ist nicht vorgesehen, dass die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von irgend einem spezifischen Verfahren zum Nachweis der UDP-SQ-Synthese eingeschränkt ist. Die vorliegende Erfindung schlägt eine Reihe von Verfahrens- oder Testformaten vor. Bei einer Ausführungsform wird ein Enzymtest zur Messung der Umwandlung von UDP-Glucose in UDP-SQ als Reflektion der Aktivität von SQD1 bereitgestellt. Bei einer weiteren Ausführungsform wird ein gekoppelter Adenosin-5'-phosphosulfat (APS)/SQD1-Test vorgeschlagen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für die anschließende Modifikation von Uridin-5-diphosphosulfochinovose (UDP-SQ) zur Synthese von Verbindungen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, 6-Sulfo-α-D-chinovoslydiacylglycerin (SQDG). Im Gegensatz zu den gängigen Verfahren zur Synthese von UDP-SQ sind die erfindungsgemäßen Syntheseverfahren schnell und einfach.
Bei einer Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese von UDP-SQ vor, umfassend: a) Bereitstellen von: i) Uridin-5'-diphosphoglucose (UDP-Glc); ii) einem Schwefeldonator; iii) einem ersten Peptid, das die Umwandlung von UDP-Glc in Uridin-5'-diphosphosulfochinovose (UDP-SQ) katalysieren kann und iv) einem zweiten Peptid, das die Sulfochinovose von UDP-SQ auf Diacylglycerin übertragen kann; b) Umsetzen des UDP-Glc mit dem ersten Peptid und dem Schwefeldonator unter solchen Bedingungen, dass UDP-SQ erzeugt wird; und c) Behandeln des UDP-SQ mit dem zweiten Peptid unter Bedingungen, dass Sulfochinovosediacylglycerin erhalten wird.
Das zweite Peptid ist ein Genprodukt, das von Arabidopsis thaliana hergeleitet ist und das durch die Nukleinsäuresequenz Seq.-ID.-Nr. 4 codiert wird.
Es ist nicht vorgesehen, dass die vorliegende Erfindung durch die Verwendung von irgend einem spezifischen Verfahren zur Expression oder Produktion eines Peptids, das Sulfochinovose von UDP-SQ auf Diacylglycerin übertragen kann, eingeschränkt wird. Bei einer an deren Ausführungsform wird das Genprodukt von der Nukleinsäuresequenz Seq.-ID.-Nr. 4 codiert.
Es ist nicht vorgesehen, dass die vorliegende Erfindung durch die Verwendung eines spezifischen Verfahrens zur Reinigung eines rekombinanten Peptids eingeschränkt wird, das Sulfochinovose von UDP-SQ auf Diacylglycerin übertragen kann. Bei einer Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung die Reinigung des Peptids durch die Verwendung der 6 His-Markierung vor, die in den Protein-Expressionsvektor eingebaut wird, der die Proteinaffinitätsreinigung über eine Chromatographiesäule auf Nickel-Nitrilessigsäure(Ni-NTA)-Agaroseharz-Basis ermöglicht.
Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung durch die Verwendung eines spezifischen Verfahrens zum Nachweis der SQDG-Synthese eingeschränkt wird. Die vorliegende Erfindung schlägt eine Reihe von Testformaten vor. Bei einer Ausführungsform wird die Synthese von SQDG mit Ioddampf sichtbar gemacht und durch Co-Chromatographie mit einem Arabidopsis thaliana Blattlipidextrakt, das bekanntermaßen SQDG enthält, identifiziert. Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Produktion von SQDG durch quantitative Analyse verifiziert, wobei die Reaktionsprodukte aus den DC-Platten isoliert werden und zur Herstellung von Fettsäuremethylestern verwendet werden. Die Methylester werden durch Gaschromatographie mittels Myristinsäure als interner Standard quantifiziert.
Es ist nicht beabsichtigt, dass die Erfindung auf die unabhängige Expression eines Peptids eingeschränkt ist, das die Umwandlung von UDP-Glc und einem Schwefeldonator in UDP-SQ in einem einzelnen Wirtsorganismus oder einer Pflanze katalysieren kann. Es ist darüber hinaus nicht vorgesehen, dass die Erfindung auf die unabhängige Expression eines zweiten Peptids einge schränkt wird, das die Sulfochinovose von UDP-SQ auf Diacylglycerin in einem einzelnen Wirtsorganismus oder einer Pflanze übertragen kann. Bei einer Ausführungsform schlägt die Erfindung die Coexpression beider vorstehend beschriebenen Peptide in einem einzelnen Wirtsorganismus vor. In einer alternativen Ausführungsform schlägt die Erfindung die Transformation von Pflanzenzellen oder Geweben vor, so dass beide Peptide coexprimiert werden.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt schematisch den biochemischen Weg für die UDP-SQ-Biosynthese. 1 ist keine erfindungsgemäße Ausführungsform.
2 ist ein Chromatogramm, das die Ergebnisse eines Tests zur Erfassung der Umwandlung von UDP-Glc durch SQD1 zeigt. Die Chromatographie-Analyse von ¹⁴C-markiertem Substrat und Reaktionsprodukten durch HPLC ist gezeigt (A-C). (A) UDP-Glc ohne SQD1-Protein, (B) UDP-Glc und SQD1-Protein, (C) UDP-Glc, SQD1-Protein und Sulfit, (D) echtes ³⁵S-markiertes UDP-SQ, isoliert aus der sqdD-Mutante des Cyanobakteriums, R. sphaeroides. U1 und U2 sind Produkte, wie im Text beschrieben. 2 ist kein Teil der Ansprüche.
3 zeigt schematisch die Vektorkarten, einschließlich der Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen der Protein-Expressionsvektoren pQE-30, pQE-31 und pQE-32. Die Nukleotidsequenz für den Polylinkerbereich von pQE-30 ist in der Seq.-ID.-Nr. 22 gegeben. Die Nukleotidsequenz für den Polylinkerbereich von pQE-31 ist in der seq.-ID-Nr. 23 gegeben. Die Nukleotidsequenz für den Polylinkerbereich von pQE-32 ist in der Seq.-ID.-Nr. 24 gegeben.
4 ist ein Foto eines Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese(SDS-PAGE)-Gels, das die Ergebnisse der Reinigung von rekombinantem SQD1 zeigt. Die SDS-PAGE-Analyse von (A) rohem E. coli-Zellkulturextrakt, das SQD1-Protein exprimiert, und Ni-NTA-Säulenreinigung von (B) SQD1 und (C) Thr145Ala-Mutante (jeweils 4 μg). 4 ist keine Ausführungsform der Erfindung.
5 zeigt schematisch den biochemischen Weg für die SQDG-Biosynthse, die die Übertragung von Sulfochinovose auf Diacylglycerin (DAG) beinhaltet.
6 zeigt schematisch die Vektorkarte, einschließlich der Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen des Protein-Expressionsvektors pA-CYC184. Dieses Plasmid ist ein kleiner E. coli-Klonierungsvektor mit niedriger Kopienzahl, der 4244 Basenpaare lang ist und Tetracyclin- (Basennummern 1580-2770) und Chloramphenicol-Resistenzgene (Basennummern 219-3804) trägt. Die Karte zeigt die Stellen für Restriktionsenzyme, die das Molekül ein- oder zweimal spalten; einzigartige Stellen sind fettgedruckt. Die Koordinaten betreffen die Base an der Position 5' in jeder Erkennungssequenz. Das Nukleotid Nummer 1 des Vektors ist das erste "G" der einzigen EcoRI-Stelle, "GAATTC". Die Karte zeigt auch die relativen Positionen der Antbiotika-Resistenzgene und den DNA-Replikationsursprung (ORI) an den Basennummern 845-847.
7 zeigt schematisch eine Ausführungsform für die chemische Modifikation von UDP-SQ mit kurz- und langkettigen Alkoholen, und einem Säurekatalysator, zur Herstellung von Alkylsulfochinovosid. 7 macht keine Ausführungsform der Erfindung aus.
8 ist ein Chromatogramm, das die Ergebnisse eines gekoppelten APS-Reduktase/SQD1-Tests zeigt. Das HPLC-Chromatogramm der Reaktionsprodukte und Standards sind gezeigt (A) ³⁵S-markiertes Substrat APS ohne Enzyme; (B) ³⁵S-markierte Reaktionsprodukte nach der Inkuba tion mit APS-Reduktase allein oder (C) in der Anwesenheit von APS-Reduktase und SQD1; (D) ¹⁴C-markiertes UDP-SQ (U2) aus dem Standard-SQD1-Test.
9 zeigt die DC-Ergebnisse eines Tests der Sulfolipid-Synthase, die mit Thylakoidmembranen einhergeht, und die spezifisch UDP-SQ und Diacylglycerin in SQDG umwandelt. (A) Dünnschicht-Chromatographie von Lipiden nach der Inkubation von Spinat-Thylakoidmembranen mit markiertem Reaktionsprodukt U2 oder, für Kontrollzwecke, ¹⁴C-markiertes UDP-Gal, das Substrat für die Galactolipid-Biosynthese. Die Lipide wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. (B) Iod-Färbung der U2-Spur. DGDG (Digalactosyldiacylglycerin); MGDG (Monogalactosyldiacylglycerin); PC (Phosphatidylcholin); PG (Phosphatidylglycerin); SQDG (Sulfochinovosyldiacylglycerin).
10 zeigt die Nukleinsäuresequenz des Cyanobakterien-sqdX-Gens (Seq.-ID.-Nr. 1) (vorgelegt bei der GenBank-Datenbank und mit der zugeordneten Zugangsnummer U45308, Nukleotidnummer 1800-2933). Die Start- und Stopp-Codons sind hervorgehoben.
11 zeigt die genomische Nukleinsäuresequenz von Arabidopsis thaliana, das das AtSQDX-1-Gen enthält (Seq.-ID.-Nr. 3) (vorgelegt bei der GenBank-Datenbank und mit der zugeordneten Zugangs-nummer AL137189, Nukleotidnummer 82324-85302).
10 macht keine Ausführungsform der Erfindung aus.
12 zeigt die Nukleinsäuresequenz der Arabidopsis thaliana SQD2-Gen-cDNA (Seq.-ID.-Nr. 4).
13 zeigt die Nukleinsäuresequenz der Arabidopsis thaliana SQD1-Gen-cDNA (Seq.-ID.-Nr. 5) (vorgelegt bei der GenBank-Datenbank und mit der zugeordneten Zugangsnummer AF022082). Die Start- und Stopp-Codons sind zur Betonung hervorgehoben.
14 zeigt die Nukleinsäuresequenz, die das Cyanobakterien-sqdB-Genprodukt (entsprechend den Nukleotiden Nr. 576-1784 von Seq.-ID.-Nr. 8, vorgelegt bei der GenBank-Datenbank und mit der zugeordneten Zugangsnummer U45308) codiert. Die Start- und Stopp-Codons sind hervorgehoben.
15 zeigt die Aminosäuresequenz des Arabidopsis thaliana SQD1-Gen-cDNA-Produktes (codiert von Seq.-ID.-Nr. 6) (vorgelegt bei der Genbank-Datenbank und mit der zugeordneten Zugangsnummer AF022082), Nukleotidnummer 170-1600.
16 zeigt die Aminosäuresequenz des Cyanobakterien-sqdX-Genproduktes (Seq.-ID.-Nr. 2) (vorgelegt bei der GenBank-Datenbank und mit der zugeordneten Zugangsnummer U45308).
17 zeigt die Aminosäuresequenz des Cyanobakterien-sqdB-Genproduktes (codiert von Seq.-ID.-Nr. 8) (vorgelegt bei der GenBank-Datenbank und mit der zugeordneten Zugangsnummer U45308), Nukleotidnummer 576-1784.
14, 16 und 17 machen keine Ausführungsform der Erfindung aus.
DEFINITIONEN
Die Erfindung lässt sich leichter anhand der nachstehend definierten Begriffe verstehen:
"Zugehöriges Peptid", wie es hier verwendet wird, betrifft Peptide, die direkt oder indirekt an andere Peptide gebunden sind. Zugehörige Peptide, die indirekt gebunden sind, können ein oder mehrere andere Peptide aufweisen, die zwischen den beiden assoziierten Peptiden gebunden sind. Peptide können über Peptidbindungen, kovalente Bindungen und nicht-kovalente Bindungen gebunden sein.
"In funktionsfähiger Kombination", "in funktionsfähiger Reihenfolge" und "funktionsfähig verknüpft", wie sie hier verwendet werden, betreffen die derartige Bindung der Nukleinsäuresequenzen, dass ein Nukleinsäuremolekül, das die Transkription eines gegebenen Gens und/oder die Synthese des gewünschten Proteinmoleküls steuert, produziert wird. Der Begriff betrifft auch die derartige Bindung der Aminosäuresequenzen, dass ein funktionelles Protein hergestellt wird.
"Expressionskonstrukt", "Expressionsvektor" und "Plasmid", wie sie hier verwendet werden, betreffen ein oder mehrere rekombinante DNA- oder RNA-Sequenzen, die eine gewünschte Codierungssequenz enthalten, die funktionsfähig mit Sequenzen verknüpft ist, die für die Expression der codierenden Sequenz in einer Zelle oder in einem Wirtsorganismus (beispielsweise Säugetier) nötig ist. Die Sequenz kann einzel- oder doppelsträngig sein.
"Reporterkonstrukt", "Reportergen" und "Reporterprotein", wie sie hier verwendet werden, betreffen DNA- oder Aminosäuresequenzen, wie geeignet, die bei Expression in einer Wirtszelle oder Organismus nachgewiesen, gemessen oder quantifiziert werden können.
Der Begriff "gereinigt" oder "reinigen", wie er hier verwendet wird, betrifft die Entfernung von einer oder mehreren (ungewünschten) Komponenten aus einer Probe. Werden beispielsweise rekombinante Polypeptide in Bakterien-Wirtszellen exprimiert, werden die Polypeptide durch die Entfernung von Wirtszellproteinen gereinigt, was den Prozentsatz der rekombinanten Polypeptide in der Probe steigert.
Wie hier verwendet betrifft der Begriff "partiell gereinigt" die Entfernung von Verunreinigungen einer Probe in dem Maße, dass die interessierende Substanz durch Techniken, die dem Fachmann geläufig sind (beispielsweise Färben, Blotten, usw.), erkennbar ist, was eine messbare Menge (beispielsweise Picogramm, Nanogramm, Mikrogramm, usw.) in dem Gemisch beweist.
Wie hier verwendet bedeutet der Begriff "im Wesentlichen gereinigt" Moleküle, (beispielsweise Nuklein- oder Aminosäuresequenzen), die aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt, isoliert oder getrennt werden, und die zu mindestens 60%, vorzugsweise 75% und stärker bevorzugt 90% frei von anderen Komponenten sind, mit denen sie natürlicherweise assoziiert sind.
Wenn eine Lösung durch die feste Trägermatrix gelangt, umfasst dies wie hier verwendet den "Durchfluss". Nicht bindendes Material gelangt, wenn zugegen, mit der Lösung durch die Matrix in den Durchfluss. Zur Beseitigung sämtlicher nicht-spezifischer Bindung wird die Matrix mit einer oder mehreren Waschlösungen "gewaschen", die nach dem Gelangen durch die Matrix ein oder mehrere "Ausflüsse" umfasst. "Elutionsmittel" ist eine chemische Lösung, die Material dissoziieren kann, das an die Matrix (sofern überhaupt) gebunden ist; dieses dissoziierte Material gelangt durch die Matrix und umfasst ein "Eluat".
"Antikörper", wie es hier verwendet wird, betrifft die Definition eines Glycoproteins, das durch B-Zellen und Plasmazellen produziert wird, die mit hoher Spezifität an ein Antigen binden (gewöhnlich, aber nicht immer ein Peptid) oder ein strukturell ähnliches Antigen, dessen Produktion erzeugt wird. Antikörper können durch bekannte Verfahren erzeugt werden und können entweder polyklonal oder monoklonal sein.
"Färbung" wie es hier verwendet wird, betrifft eine beliebige Zahl von Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet (der gewöhnlich Farbstoffe verwendet) bekannt sind, und die zum Sichtbarmachen einer oder mehrerer spezifischer Komponenten und/oder Eigenschaften einer Zelle oder von Zellen verwendet werden.
"Alkohol", wie es hier verwendet wird, betrifft Verbindungen, die hydroxylfunktionelle Gruppen haben, die an gesättigte, sp³-hybridisierte Kohlenstoffatome gebunden sind. Der Begriff "kurzkettiger Alkohol", wie er hier vrwendet wird, betrifft Alkohole, die weniger als 10 Kohlenstoffatome enthalten. Beispiele für solche kurzkettigen Alkohole umfassen Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Pentanol, Hexanol, Heptanol, Octanol, Nonanol, einschließlich deren Isomere. Der Begriff "langkettiger Alkohol", wie er hier verwendet wird, betrifft Fettalkohole, insbesondere die höheren aliphatischen primären Alkohole, die 10 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, vorzugsweise gesättigter und vorzugsweise geradkettiger Alkohol des Typs, der durch die industrielle Hydrierung nativer Fettsäuren erhältlich ist. Übliche Vertreter der höheren aliphatischen Alkohole, beispielsweise die Verbindungen n-Dodecylalkohol, n-Tetradecylalkohol, n-Hexadecylalkohol, n-Octadecylalkohol, n-Octylalkohol, n-Decylalkohol, Undecylalkohol, Tridecylalkohol.
"Schwefeldonator", wie es hier verwendet wird, betrifft eine beliebige Verbindung auf Schwefelbasis, die eine Sulfonsäuregruppe bei der Bildung von Uridin-5-diphosphosulfochinovose (UDP-SQ) bereitstellen kann. Beispiele für solche Schwefeldonatoren umfassen Sulfat, Sulfit, Sulfid, Thiosulfat, Sulfoglutathion, Adenosin-5'-phosphosulfat (APS) und 3'-Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat (PAPS).
"Säurekatalysator", wie es hier verwendet wird, betrifft beliebige saure Verbindungen, einschließlich der sogenannten Lewis-Säuren, die die Acetalisierungsreaktion zwischen Fettalkohol und einem Zuckermolekül katalysieren. Beispiele für Säuren, die für diesen Zweck in Industrieverfahren verwendet werden, umfassen Mineralsäuren, wie H₂SO₄, HCl, H₃PO₄ oder BF₃, oder Sul fonsäuren oder ihre Salze. Beispiele für Sulfonsäuren umfassen ortho-, meta- und para-Toluolsulfonsäuren, Alkylbenzolsulfonsäuren, sekundäre Alkylsulfonsäuren, Sulfonsäureharze, Alkylsulfate, Alkylbenzolsulfonate, Alkylsulfonate und Sulfobernsteinsäure.
"Alkylsulfochinovosid", wie es hier verwendet wird, betrifft eine Gurppe von Substanzen, bestehend aus aus einer Glycosideinheit, die an der C-6-Position sulfoniert ist und an der C-1-Position mit einem Alkohol acetalisiert ist. Im Zusammenhang mit der Erfindung verstehen sich Alkylsulfochinovoside als Reaktionsprodukte von UDP-Sulfochinovose und Fettalkoholen. Im breitesten Sinne soll der Begriff "Alkyl" in Alkylsulfochinovosiden den Rückstand eines aliphatischen C8-C18-Alkohols umfassen, der aus natürlichen Fetten erhältlich ist, d.h. gesättigte und ungesättigte Reste und ebenfalls Gemische davon, einschließlich derer, die verschiedene Kettenlängen aufweisen. Die Begriffe Alkyloligosulfochinovoside, Alkylpolysulfochinovoside gelten für alkylierte Sulfochinovoside des Typs, bei dem ein Alkylrest in der Form des Acetals an mehr als einen Sulfochinovosid-Rest gebunden ist, d.h. an einen Polysulfochinovosid- oder Oligosulfochinovosid-Rest; diese Begriffe gelten als synonym zueinander. Folglich ist Alkylmonosulfochinovosid das Acetal eines Monosulfochinovosids. Da die Reaktionsprodukte der Zucker und Fettalkohole gewöhnlich Gemische sind, soll der Begriff Alkylsulfochinovosid sowohl Alkylmonosulfochinovoside als auch Alkylpoly(oligo)sulfochinovoside umfassen, macht aber keine Ausführungsform der Erfindung aus.
"Nukleinsäuresequenz", "Nukleotidsequenz" und "Polynukleotidsequenz", wie hier verwendet, betreffen ein Oligonukleotid oder Polynukleotid, und Fragmente oder Portionen davon und DNA oder RNA von genomischem oder synthetischem Ursprung, die einzel- oder doppelsträngig sein kann, und veranschaulichen den Sense- oder Antisense-Strang.
Wie hier verwendet betreffen die Begriffe "Oligonukleotide" und "Oligomere" eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 10 Nukleotiden und sogar etwa 100 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden und stärker bevorzugt etwa 20 bis 25 Nukleotiden, die als Sonde oder Amplimer verwendet werden können.
Der Begriff "interessierende Nukleotidsequenz" betrifft eine beliebige Nukleotidsequenz, deren Manipulation vom Fachmann aus beliebigem Grund als wünschenswert angesehen wird. Solche Nukleotidsequenzen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf codierende Sequenzen von Strukturgenen (beispielsweise enzymcodierende Gene, Reportergene, Selektionsmarkergene, Onkogene, Medikamentenresistenzgene, Wachstumsfaktoren, usw.) und nicht-codierende regulatorische Sequenzen, die eine mRNA oder ein Proteinprodukt nicht codieren (beispielsweise Promotorsequenz, Enhancersequenz, Polyadenylierungssequenz, Terminationssequenz, usw.)
"Aminosäuresequenz", "Polypeptidsequenz", "Peptidsequenz" und "Peptid" sind hier untereinander austauschbar und betreffen eine Sequenz von Aminosäuren.
Der Begriff "Teil", wenn er in Bezug auf eine Nukleotidsequenz verwendet wird, betrifft Fragmente dieser Nukleotidsequenz. Die Größe der Fragmente reicht von 5 Nukleotidresten bis zur gesamten Nukleotidsequenz minus einen Nukleinsäurerest. Der Begriff "Teil", wenn er in Bezug auf eine Aminosäuresequenz verwendet wird, betrifft Fragmente der Aminosäuresequenz. Die Größe der Fragmente reicht von 3 Aminosäuren bis zur gesamten Aminosäuresequenz minus einen Aminosäurerest.
Eine Oligonukleotidsequenz, die ein "Homolog" einer ersten Nukleotidsequenz ist, ist hier definiert als eine Oligonukleotidsequenz, die größer gleich 50% Iden tität und stärker bevorzugt größer gleich 70% Identität zur ersten Nukleotidsequenz aufweist, wenn Sequenzen mit einer Länge von 10 bp oder mehr verglichen werden.
DNA-Moleküle sollen "5'-Enden" und "3'-Enden" aufweisen, weil die Mononukleotide umgesetzt werden, dass Oligonukleotide derart hergestellt werden, dass das 5'-Phosphat eines Mononukleotid-Pentoserings über eine Phosphodiester-Bindung am 3'-Sauerstoff seines Nachbarn in einer Richtung befestigt ist. Daher wird ein Ende eines Oligonukleotids als das "5'-Ende" bezeichnet, wenn sein '5'-Phosphat nicht an den 3'-Sauerstoff eines Mononukleotid-Pentoserings gebunden ist. Ein Ende eines Oligonukleotids wird als das "3'-Ende" bezeichnet, wenn sein 3'-Sauerstoff nicht an ein 5'-Phosphat eines anderen Mononukleotid-Pentoserings gebunden ist. Eine Nukleinsäuresequenz, wie hier verwendet, kann selbst wenn sie in einem größeren Oligonukleotid zugegen ist, ebenfalls 5'- und 3'-Enden aufweisen. Bei einem linearen oder zirkulären DNA-Molekül werden bestimmte Elemente als "stromaufwärts gelegene" oder 5' der "stromabwärts gelegenen" oder 3'-Elemente bezeichnet. Diese Terminologie spiegelt wieder, dass die Transkription in einer 5'- nach 3'-Richtung entlang des DNA-Strangs verläuft. Die Promotor- und Enhancer-Elemente, die die Transkription eines verknüpften Gens steuern, sind gewöhnlich 5' oder stromaufwärts des codierenden Bereichs lokalisiert. Enhancer-Elemente können jedoch ihre Wirkung sogar dann ausüben, wenn sie sich 3' des Promotorelementes und des codierenden Bereichs befinden. Die Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignale sind 3' oder stromabwärts des codierenden Bereichs lokalisiert.
Der Begriff "Klonierung", wie er hier verwendet wird, betrifft das Verfahren zur Isolation einer Nukleotidsequenz aus einer Nukleotidbank, Zelle oder einem Organismus zur Replikation durch Rekombinationstechniken.
Der Begriff "rekombinantes DNA-Molekül", wie es hier verwendet wird, betrifft ein DNA-Molekül, das DNA-Segmente umfasst, die mittels molekularbiologischer Techniken miteinander verknüpft sind.
Der Begriff "rekombinantes Protein" oder "rekombinantes Polypeptid" wie er hier verwendet wird, betrifft ein Proteinmolekül, das unter Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls exprimiert wird.
Die Begriffe "Vektor" und "Vehikel" sind untereinander austauschbar verwendet in Bezug auf Nukleinsäuremoleküle, die ein oder mehrere DNA-Segmente von einer Zelle zur nächsten übertragen.
Die Begriffe "komplementär" oder "Komplementarität", wie sie hier verwendet werden, werden in Bezug auf "Polynukleotide" und "Oligonukleotide" verwendet (welche austauschbare Begriffe sind, die eine Sequenz von Nukleotiden betreffen), bezogen auf die Basenpaarungsregeln. Die Sequenz "5'-CAGT-3"' ist beispielsweise zur Sequenz "5'-ACTG-3"' komplementär. Komplementarität kann "partiell" oder "vollständig" sein. "Partielle" Komplementarität liegt vor, wenn eine oder mehrere Nukleinsäurebasen nicht gemäß den Basenpaarungsregeln zueinander passen. "Totale" oder "vollständige" Komplementarität zwischen Nukleinsäuren liegt vor, wenn eine jede Nukleinsäurebase unter Basenpaarungsregeln zu einer anderen Base passt. Der Grad der Komplementarität zwischen Nukleinsäuresträngen kann signifikante Auswirkungen auf die Effizienz und die Stärke der Hybridisierung zwischen Nukleinsäuresträngen haben. Dies kann bei Amplifikationsreaktionen, sowie bei Nachweisverfahren, die von der Bindung zwischen Nukleinsäuren abhängen, besonders wichtig sein.
Die Begriffe "Homologie" und "homolog", wie sie hier in Bezug auf Nukleotidsequenzen verwendet werden, betreffen einen Grad an Komplementarität mit anderen Nukleotidsequenzen. Es kann eine partielle oder vollständige Homologie (d.h. Identität) vorliegen. Eine zu einer Nukleinsäuresequenz partiell komplementäre (d.h. im wesentlichen homologe) Nukleotidsequenz verhindert zumindest partiell, dass eine vollständig komplementäre Sequenz an eine Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert. Die Hemmung der Hybridisierung der vollständig komplementären Sequenz an die Zielsequenz kann unter Bedingungen niedriger Stringenz mit einem Hybridisierungstest (Southern- oder Northern-Blot, Lösungs-Hybridisierung und dergleichen) untersucht werden. Eine im wesentlichen homologe Sequenz oder Sonde konkurriert um und hemmt die Bindung (d.h. die Hybridisierung) einer vollständig homologen Sequnz an eine Zielsequenz unter Bedingungen niedriger Stringenz. Es ist nicht zu sagen, dass die niedrigen Stringenzbedingungen derart sind, dass eine nichtspezifische Bindung erlaubt ist; niedrige Stringenzbedingungen erfordern, dass die Bindung von zwei Sequenzen aneinander eine spezifische (d. h. selektive) Wechselwirkung ist. Das Fehlen von nicht-spezifischer Bindung kann durch Verwendung einer zweiten Zielsequenz untersucht werden, der sogar ein partieller Grad an Komplementarität fehlt (beispielsweise weniger als etwa 30% Identität); bei Fehlen der nicht-spezifischen Bindung hybridisiert die Sonde nicht an das zweite nicht-komplementäre Ziel.
Wie hier verwendet wird der Begriff "Stringenz" in Bezug auf Bedingungen von Temperatur, Ionenstärke und die Anwesenheit anderer Verbindungen, wie organischer Lösungsmittel verwendet, unter denen die Nukleinsäure-Hybridisierungen durchgeführt werden. "Stringenz" erfolgt gewöhnlich im Bereich von etwa T_m°C bis zu etwa 20°C bis 25°C unter T_m. Der Fachmann ist sich darüber bewusst, dass eine stringente Hybridisierung zur Identifizierung oder Erfassung identischer Polynukleotidsequenzen oder zur Identifizierung oder Erfassung ähnlicher oder verwandter Polynukleotidsequenzen verwendet werden kann. Unter "stringenten Bedingungen" hybridisieren die Nukleotidsequenzen Seq.-ID.-Nr. 3, Seq.-ID.-Nr. 4 und Seq.-ID.-Nr. 5 oder Teile davon an ihre genau komplementären Gegenstücke und nah verwandten Sequenzen.
Niedrige Stringenzbedingungen umfassen Bedingungen, die äquivalent zur Bindung oder Hybridisierung bei 68°C in einer Lösung sind, bestehend aus 5X SSPE (43,8 g/l NaCl, 6,9 g/l NaH₂PO₄·H₂O und 1,85 g/l EDTA, pH-Wert eingestellt auf 7,4 mit NaOH), 0,1% SDS, 5X Denhardt's Reagenz (50X Denhardt's Lösung enthält pro 500 ml: 5 g Ficoll (Typ 400, Pharmacia), 5 g BSA (Fraktion V; Sigma)) und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA, gefolgt von Waschen in einer Lösung, die 2,0X SSPE, 0,1% SDS umfasst, bei Raumtemperatur, wenn eine Sonde von etwa 100 bis etwa 1000 Nukleotiden Länge eingesetzt wird.
Im Fachgebiet ist bekannt, dass zahlreiche äquivalente Bedingungen eingesetzt werden können, damit man niedrige Stringenzbedingungen erhält; Faktoren, wie die Länge und die Beschaffenheit (DNA, RNA, Basen-Zusammensetzung) der Sonde und die Beschaffenheit des Ziels (DNA, RNA, Basen-Zusammensetzung, vorhanden in Lösung oder immobilisiert usw.) und die Konzentration der Salze und anderen Komponenten (beispielsweise das Vorhandensein oder Fehlen von Formamid, Dextransulfat, Polyethylenglykol), und zudem die Komponenten der Hybridisierungslösung können variiert werden, so dass Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz erzeugt werden, die sich von den oben aufgeführten Bedingungen unterscheiden, jedoch äquivalent dazu sind. Zudem sind Bedingungen, die die Hybridisierung unter Bedingungen hoher Stringenz fördern (beispielsweise Erhöhen der Temperatur der Hybridisierung und/oder Waschschritte, die Verwendung von Formamid in der Hybridisierungslösung usw.), im Fachgebiet bekannt. Hohe Stringenzbedingungen umfassen bei Gebrauch in Bezug auf die Nukleinsäurehybridisierung Bedingungen, die zur Bindung oder Hybridisierung bei 68°C in einer Lösung aus 5X SSPE, 1% SDS, 5X Denhardt's Reagenz und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA, gefolgt von Waschen in einer Lösung aus 0,1X SSPE und 0,1% SDS bei 68°C, äquivalent sind, wenn eine Sonde von etwa 100 bis etwa 1000 Nukleotiden Länge eingesetzt wird.
Bei Gebrauch in Zusammenhang mit einer doppelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie cDNA oder einem genomischen Klon, betrifft der Begriff "im Wesentlichen homolog" eine Sonde, die entweder partiell oder vollständig an einen oder beide Stränge der doppelsträngigen Nukleinsäuresequenz unter Bedingungen niedriger Stringenz wie beschrieben hybridisieren kann.
Bei Gebrauch in Zusammenhang mit einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz betrifft der Begriff "im Wesentlichen homolog" eine beliebige Sonde, die an die einzelsträngige Nukleinsäuresequenz unter Bedingungen niedriger Stringenz wie oben beschrieben hybridisieren kann.
Wie hier verwendet, wird der Begriff "Hybridisierung" in Bezug auf die Paarung komplementärer Nukleinsäuren mit einem Verfahren verwendet, durch das ein Nukleinsäurestrang über Basenpaarung an einen komplementären Strang bindet, so dass man einen Hybridisierungskomplex erhält. Die Hybridisierung und die Hybridisierungsstärke (d.h. die Stärke der Assoziation zwischen den Nukleinsäuren) wird durch solche Faktoren be einträchtigt, wie den Grad der Komplementarität zwischen den Nukleinsäuren, die Stringenz der beteiligten Bedingungen, die T_m des entstandenen Hybrids und das G:C-Verhältnis in den Nukleinsäuren.
Wie hier verwendet betrifft der Begriff "Hybridisierungskomplex" einen Komplex, der zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen aufgrund der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären G- und C-Basen und zwischen komplementären A- und T-Basen gebildet wird; diese Wasserstoffbrückenbindungen können durch Basenstapel-Wechselwirkungen weiter stabilisiert werden. Die beiden komplementären Nukleinsäuresequenzen bilden in antiparalleler Konfiguration Wasserstoffbrückenbindungen. Ein Hybridisierungskomplex kann in Lösung gebildet werden (beispielsweise C₀t- oder R₀t-Analyse) oder zwischen einer Nukleinsäuresequenz, die in Lösung vorhanden ist, und einer anderen Nukleinsäuresequenz, die an einem festen Träger immobilisiert ist (beispielsweise an einer Nylonmembran oder einem Nitrocellulosefilter, wie sie beim Southern- und Northern-Blotting, Dot-Blotting eingesetzt werden, oder einem Glas-Objektträger, wie er bei der In-situ-Hybridisierung eingesetzt wird, einschließlich FISH (Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung)).
Wie hier verwendet wird der Begriff "T_m" in Bezug auf die "Schmelztemperatur" verwendet. Die Schmelztemperatur ist diejenige Temperatur, bei der eine Population doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle zur Hälfte in Einzelstränge dissoziiert. Die Gleichung für die Berechnung der T_m von Nukleinsäuren ist Stand der Technik. Wie durch Standard-Literaturstellen angegeben, kann eine einfache Abschätzung des T_m-Wertes berechnet werden durch die Gleichung: T_m = 81,5 + 0,41 (% G + C), wenn eine Nukleinsäure in einer wässrigen Lösung bei 1 M NaCl ist (siehe Anderson und Young, Quantitative Filter Hybridi zation in Nucleic Acid Hybridization [1985]). Andere Literaturstellen umfassen fortschrittlichere Computerberechnungen, die strukturelle und Sequenzeigenschaften für die Berechnung von T_m berücksichtigen.
"Amplifikation" ist hier definiert als die Produktion zusätzlicher Kopien einer Nukleinsäuresequenz und wird gewöhnlich mit Polymerasekettenreaktions-Techniken des Standes der Technik durchgeführt (siehe beispielsweise Dieffenbach und Dveksler, PCR-Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY [1995]). Wie hier verwendet betrifft der Begriff "Polymerasekettenreaktion" ("PCR") Verfahren der US-Patente Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,965,188, die ein Verfahren zum Steigern der Konzentration eines Segmentes einer Zielsequenz in einem Gemisch aus genomischer DNA ohne Klonierung oder Reinigung beschreiben. Die Länge des amplifizierten Segmentes der gewünschten Zielsequenz wird durch die relativen Positionen von zwei Oligonukleotid-Primern in Bezug zueinander bestimmt. Aufgrund des wiederholenden Aspektes des Verfahrens wird das Verfahren als "Polymerasekettenreaktion" (nachstehend "PCR") bezeichnet. Weil die gewünschten amplifizierten Segmente der Zielsequenz zu den Hauptsequenzen (hinsichtlich der Konzentration) in dem Gemisch werden, sagt man auch, dass sie "PCR-amplifiziert" sind.
Mit der PCR kann man eine einzelne Kopie einer spezifischen Zielsequenz in genomischer DNA auf einen Gehalt amplifizieren, der durch mehrere verschiedene Verfahren erfasst werden kann (beispielsweise Hybridisierung mit einer markierten Sonde, Einbau von biotinylierten Primern, gefolgt von einer Avidin-Konjugat-Erfassung, Einbau von ³²P-markierten Desoxynukleotid-Triphosphaten, wie dCTP oder dATP, in das amplifizierte Segment). Neben genomischer DNA kann eine beliebige Oligonukleotidsequenz mit dem geeigneten Satz von Pri mer-Molekülen amplifiziert werden. Insbesondere die amplifizierten Segmente, die durch das PCR-Verfahren selbst erzeugt wurden, sind selbst effiziente Matrizen für die nachfolgenden PCR-Amplifikationen.
Die Begriffe "Reverse-Transkriptions-Polymerasekettenreaktion" und "RT-PCR" betreffen ein Verfahren zur reversen Transkription einer RNA-Sequenz, so dass man ein Gemisch von cDNA-Sequenzen erhält, gefolgt von Steigern der Konzentration eines gewünschten Segmentes der transkribierten cDNA-Sequenzen in dem Gemisch ohne Klonierung oder Reinigung. RNA wird mit einem einzelnen Primer (beispielsweise einem Oligo-dT-Primer) vor der PCR-Amplifikation des gewünschten Segmentes der transkribierten DNA mit zwei Primern revers transkribiert.
Wie hier verwendet betrifft der Begriff "Primer" ein Oligonukleotid, unabhängig davon, ob es natürlich vorkommt, wie in einer gereinigten Restriktionsspaltung, oder synthetisch produziert wird, und es kann als Startpunkt der Synthese wirken, wenn es unter Bedingungen gestellt wird, die die Synthese eines Primerextensionsproduktes, das komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, induzieren (d.h. in der Anwesenheit von Nukleotiden und von einem Induktionsmittel, wie DNA-Polymerase und bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH-Wert). Der Primer ist für eine maximale Effizienz der Amplifikation vorzugsweise einzelsträngig, aber er kann alternativ auch doppelsträngig sein. Ist er doppelsträngig, wird der Primer zuerst so behandelt, dass er seine Stränge auftrennt, bevor er zur Herstellung der Extensionsprodukte verwendet wird. Der Primer ist vorzugsweise ein Oligodesoxyribonukleotid. Der Primer muss so lang sein, dass er die Synthese der Extensionsprodukte in Anwesenheit des Induktionsmittels induziert. Die genaue Länge der Primer hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich Temperatur, Primerquelle und der Verwendung des Verfahrens.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Sonde" ein Oligonukleotid (d.h. eine Sequenz von Nukleotiden), unabhängig davon, ob es natürlich vorkommt, wie bei einer gereinigten Restriktionsspaltung, oder synthetisch produziert wird, rekombinant oder durch PCR-Amplifikation, und das an ein anderes interessierendes Oligonukleotid hybridisieren kann. Eine Sonde kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Sonden eignen sich zur Erfassung, Identifikation und Isolation bestimmter Gensequenzen. Es wird vorgeschlagen, dass eine beliebige Sonde, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, mit einem "Reportermolekül" markiert wird, so dass sie sich in einem Nachweissystem nachweisen lässt, wie u.a., aber nicht eingeschränkt auf Enzymbeispielsweise ELISA sowie histochemische Assays auf Enzymbasis), Fluoreszenz-, Radioaktivitäts- und Lumineszenzsysteme. Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf ein bestimmtes Nachweissystem oder eine bestimmte Markierung eingeschränkt ist.
Wie hier verwendet, betreffen die Begriffe "Restriktionsendonukleasen" und "Restriktionsenzyme" bakterielle Enzyme, die jeweils doppel- oder einzelsträngige DNA an oder nahe einer spezifischen Nukleotidsequenz spalten.
Wie hier verwendet betrifft der Begriff "ein Oligonukleotid mit einer ein Gen codierenden Nukleotidsequenz" eine Nukleinsäuresequenz, die den codierenden Bereich eines Gens umfasst, d.h. die Nukleinsäuresequenz, die ein Genprodukt codiert. Der codierende Bereich kann entweder in einer cDNA-, genomischen DNA- oder RNA-Form zugegen sein. In einer DNA-Form kann das Oligonukleotid einzelsträngig (d.h. der Sense-Strang) oder doppelsträngig sein. Geeignete Steuerelemente, wie Enhancer, Promotoren, Spleißstellen, Polyadenylierungssignale, usw. können in enge Nachbarschaft zum codierenden Bereich des Gens gebracht werden, wenn es nötig ist, damit eine korrekte Initiation der Transkription und/oder korrekte Prozessierung des primären RNA-Transkriptes ermöglicht wird. Alternativ kann der codierende Bereich, der in erfindungsgemäßen Expressionsvektoren verwendet wird, endogene Enhancer, Spleißstellen, intervenierende Sequenzen, Polyadenylierungssignale usw. oder eine Kombination von endogenen und exogenen Kontrollelementen enthalten.
Der Begriff "Promotor", "Promotorelement", oder "Promotorsequenz", wie hier verwendet, betrifft eine DNA-Sequenz, die bei Unterbringung am 5'-Ende (d.h. vorläuft) einer Oligonukleotidsequenz die Transkription der Oligonukleotidsequenz in mRNA steuern kann. Ein Promotor befindet sich gewöhnlich 5' (d.h. stromaufwärts) einer Oligonukleotidsequenz, deren Transkription in mRNA er steuert, und er stellt eine Stelle für eine spezifische Bindung durch RNA-Polymerase und zur Initiation der Transkription bereit.
Wie hier verwendet, betreffen die Begriffe "Nukleinsäuremolekül, codierend" "Nukleotid, codierend", "DNA-Sequenz, codierend" und "DNA, codierend" die Reihenfolge oder Sequenz von Desoxyribonukleotiden entlang eines Strangs von Desoxyribonukleinsäure. Die Reihenfolge dieser Desoxyribonukleotide bestimmt die Reihenfolge der Aminosäuren entlang der Polypeptid-(Protein)-Kette. Die DNA-Sequenz codiert somit eine Aminosäuresequenz.
Der Begriff "isoliert", wenn er in Bezug auf eine Nukleinsäure verwendet wird, wie bei "ein isoliertes Oligonukleotid" betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die von mindestens einer kontaminierenden Nukleinsäure getrennt wird, mit der sie gewöhnlich in ihrer ntürlichen Umgebung einhergeht. Isolierte Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die in einer Form oder einer Umgebung vorkommt, die sich von derjenigen unterscheidet, in der man sie in der Natur vorfindet. Nicht-isolierte Nukleinsäuren sind dagegen Nukleinsäuren, wie DNA und RNA, die man in dem Zustand vorfindet, in dem sie in der Natur vorkommen. Eine gegebene DNA-Sequenz (beispielsweise ein Gen) wird auf dem Wirtszell-Chromosom in der Nähe der Nachbargene gefunden; RNA-Sequenzen, wie eine spezifische mRNA-Sequenz, die ein spezifisches Protein codiert, werden in der Zelle als Gemisch mit zahlreichen anderen mRNAs gefunden, die eine Vielzahl von Proteinen codieren. Isolierte Nukleinsäuren, die ein interessierendes Polypeptid codieren, umfassen dagegen beispielsweise eine solche Nukleinsäure in Zellen, die das interessierende Polypeptid gewöhnlich exprimieren, wobei die Nukleinsäure in einer chromosomalen oder extrachromosomalen Umgebung ist, die sich von der der natürlichen Zellen unterscheidet, oder ansonsten von einer anderen Nukleinsäuresequenz flankiert ist, als man in der Natur vorfindet. Die isolierte Nukleinsäure oder das Oligonukleotid können in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form vorkommen. Isolierte Nukleinsäure kann durch eine Anzahl von Techniken (beispielsweise Hybridisierung, Dot-Blotting usw.) leicht identifiziert (wenn gewünscht) werden. Soll eine isolierte Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid zur Expression eines Proteins verwendet werden, enthält das Oligonukleotid mindestens den Sense- oder codierenden Strang (d.h. das Oligonukleotid kann einzel strängig sein). Alternativ Kann es sowohl Sense- als auch Anti-Sense-Stränge enthalten (d.h. das Oligonukleotid kann doppel strängig sein).
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "codierender Bereich", wenn er in Bezug auf ein Strukturgen verwendet wird, die Nukleotidsequenzen, die die Aminosäuren codieren, die man in dem entstehenden Polypeptid vorfindet, als Folge der Translation eines mRNA-Moleküls. Der codierende Bereich ist in Eukrayoten auf der 5'-Seite von dem Nukleotid-Triplett "ATG", das das Initiator-Methionin codiert, und auf der 3'-Seite von einem der drei Tripletts, welche Stopp-Codons spezifizieren (d.h. TAA, TAG, TGA), begrenzt.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Gen" die Desoxyribonukleotidsequenzen, umfassend den codierenden Bereich eines Strukturgens. Ein "Gen" kann ebenfalls nichttranslatierte Sequenzen umfassen, die sich nahe dem codierenden Bereich an den 5'- und 3'-Enden befinden, so dass das Gen der Länge der Volllängen-mRNA entspricht. Die Sequenzen, die sich 5' des codierenden Bereichs befinden, und die auf der mRNA zugegen sind, werden als 5'-untranslatierte Sequenzen bezeichnet. Die Sequenzen, die sich 3' oder stromabwärts des codierenden Bereichs befinden, und die auf der mRNA zugegen sind, werden als 3'-untranslatierte Sequenzen bezeichnet. Der Begriff "Gen" umfasst cDNA und genomische Formen eines Gens. Eine genomische Form oder ein Klon eines Gens enthält den codierenden Bereich, der durch nichtcodierende Sequenzen unterbrochen ist, die als "Introns" oder "intervenierende Bereiche" oder "intervenierende Sequenzen" bezeichnet werden. Introns sind Segmente eines Gens, die in heterogene Kern-RNA (hnRNA) transkribiert werden; Introns können regulatorische Elemente, wie Enhancer, enthalten. Introns werden aus dem nuklearen oder primären Transkript entfernt oder "ausgespleißt"; Introns fehlen daher in dem Boten-RNA-(mRNA)-Transkript. Die mRNA spezifiziert während der Translation die Sequenz oder Reihenfolge der Aminosäuren in einem entstehenden Polypeptid.
Neben den Introns, können genomische Formen eines Gens auch Sequenzen enthalten, die sich am 5'-Ende und am 3'-Ende der Sequenzen befinden, die auf dem RNA-Transkript zugegen sind. Diese Sequenzen werden als "flankierende" Sequenzen oder Bereiche bezeichnet (diese flankierenden Sequenzen befinden sich 5' oder 3' der untranslatierten Sequenzen auf dem mRNA-Transkript). Der 5'-flankierende Bereich kann regulatorische Sequenzen, wie Promotoren und Enhancer enthalten, die die Transkription des Gens steuern oder beeinflussen. Der 3'-flankierende Bereich kann Sequenzen enthalten, die die Termination der Transkription, die posttranskriptionelle Spaltung und Polyadenylierung steuern.
Der Begriff "transgen", wenn er in Bezug auf eine Zelle verwendet wird, betrifft eine Zelle, die ein Transgen enthält, oder deren Genom durch die Einbringung eines Transgens verändert wurde. Der Begriff "transgen", wenn er in Bezug auf ein Gewebe bzw. eine Pflanze verwendet wird, betrifft ein Gewebe oder eine Pflanze, die eine oder mehrere Zellen umfasst, die ein Transgen enthalten, oder deren Genom durch Einbringen eines Transgens verändert wurde. Transgene Zellen, Gewebe oder Pflanzen können durch verschiedene Verfahren produziert werden, einschließlich der Einbringung eines "Transgens", das eine Nukleinsäure (gewöhnlich DNA) umfasst, in eine Zielzelle oder Integration des Transgens in ein Chromosom einer Zielzelle aufgrund eines menschlichen Eingriffs, wie durch die hier beschriebenen Verfahren.
Der Begriff "Transgen", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die durch experimentelle Manipulation in das Genom einer Zelle eingebracht wurde. Ein Transgen kann eine "endogene DNA-Sequenz" oder eine "heterologe DNA-Sequenz" (d.h. "Fremd-DNA") sein. Der Begriff "endogene DNA-Sequenz" betrifft eine Nukleotidsequenz, die man natürlicherweise in der Zelle findet, in die sie eingebracht wurde, so lange sie nicht eine gewisse Modifikation enthält (beispielsweise eine Punktmutation, die Anwesenheit eines Markergens usw.) in Bezug auf die natürlich vorkommende Sequenz. Der Begriff "heterologe DNA-Sequenz" betrifft eine Nukleotidsequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz an die sie von Natur aus nicht ligiert ist, oder an die sie von Natur aus an einer anderen Stelle ligiert ist, ligiert wird, oder so manipuliert wird, dass sie daran ligiert wird. Heterologe DNA ist nicht endogen in der Zelle, in die sie eingebracht wird, wurde aber aus einer anderen Zelle erhalten. Heterologe DNA enthält auch eine endogene DNA-Sequenz, die eine gewisse Modifikation enthält. Gewöhnlich, jedoch nicht ausschließlich, codiert heterologe DNA RNA und Proteine, die gewöhnlich nicht von der Zelle produziert werden, in die sie exprimiert wird. Beispiele für heterologe DNA beinhalten Reportergene, Transkriptions- und Translations-Regulationssequenzen, selektierbare Markerproteine (beispielsweise Proteine, die eine Medikamentenresistenz verleihen), usw.
Der Begriff "Fremdgen", betrifft eine beliebige Nukleinsäure (beispielsweise Gensequenz), die in das Genom einer Zelle durch experimentelle Manipulationen eingebracht werden kann, und die Gensequenzen umfassen kann, die in dieser Zelle gefunden werden, so lange das eingebrachte Gen eine gewise Modifikation beinhaltet (beispielsweise Punktmutation, die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens usw.) in Bezug auf das natürlich vorkommende Gen.
Der Begriff "Transformation", wie er hier verwendet wird, betrifft das Einbringen eines Transgens in eine Zelle. Die Transformation einer Zelle kann stabil oder transient sein. Der Begriff "transiente Transfor mation" oder "transient transformiert" betrifft die Einbringung von einem oder mehreren Transgenen in eine Zelle bei Fehlen der Integration des Transgens in das Wirtszellgenom. Eine transiente Transformation kann beispielsweise erfasst werden durch Enzymimmunassay (ELISA), der die Anwesenheit eines Polypeptids erfasst, das von einem oder mehreren Transgenen codiert wird. Alternativ kann eine transiente Transformation erfasst werden durch Nachweisen der Aktivität des Proteins (beispielsweise β-Glucuronidase), das von dem Transgen (beispielsweise dem uid A-Gen) codiert wird wie es hier gezeigt ist [beispielsweise der histochemische Test der GUS-Enzymaktivität durch Färben mit X-gluc, was einen blauen Niederschlag in der Anwesenheit des GUS-Enzyms ergibt; und ein Chemilumineszenz-Test der GUS-Enzymaktivität mit dem GUS-Light-Kit (Tropix)]. Der Begriff "transiente Transformante" betrifft eine Zelle, bei der transient ein oder mehrere Transgene eingebaut sind. Der Begriff "stabile Transformation" oder "stabil transformiert" betrifft dagegen die Einbringung und Integration von einem oder mehreren Transgenen in das Genom einer Zelle. Stabile Transformation einer Zelle kann durch Southern-Blot-Hybridisierung von genomischer DNA der Zelle mit Nukleinsäuresequenzen erfasst werden, die an ein oder mehrere Transgene binden können. Alternativ kann eine stabile Transformation einer Zelle ebenfalls durch Polymerasekettenreaktion von genomischer DNA der Zelle zur Amplifikation transgener Sequenzen erfasst werden. Der Begriff "stabile Transformante" betrifft eine Zelle, in der ein oder mehrere Transgene stabil in die genomische DNA integriert sind. Somit wird eine stabile Transformante eindeutig dahingehend von einer transienten Transformante unterschieden, dass genomische DNA aus der stabilen Transformante zwar ein oder mehrere Transgene enthält, genomische DNA aus der transienten Transformante kein Transgen enthält.
Eine "transformierte Zelle" ist eine Zelle oder Zelllinie, die die Fähigkeit zum Wachstum in einer Zellkultur für viele mehrfache Generationen, die Fähigkeit zum Wachstum in Weichagar und die Fähigkeit, kein durch Zell-Zell-Kontakt gehemmtes Zellwachstum zu haben, erworben hat. Diesbezüglich betrifft Transformation die Einbringung von fremdem Genmaterial in eine Zelle oder in einen Organismus. Transformation kann durch ein beliebiges bekanntes Verfahren erzielt werden, das die erfolgreiche Einbringung von Nukleinsäuren in die Zellen ermöglicht und das zur Expression der eingebrachten Nukleinsäure führt. "Transformations-"Verfahren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, solche Verfahren wie Mikroinjektion, Elektroporation und DNA-Teilchen-"Beschuss". Die Transformation kann durch die Verwendung eines Expressionsvektors bewerkstelligt werden. Die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens zum Einbringen von Fremd-Nukleinsäure in Pflanzenzellen wird zum Beispiel vorgeschlagen. Zudem betrifft Transformation Zellen, die natürlich transformiert wurden, gewöhnlich durch genetische Mutation.
Der Begriff "Agrobacterium" betrifft ein aus dem Boden hervorgehendes gramnegatives stäbchenförmiges phytopathogenes Bakterium, das Wurzelhalsgallen hervorruft. Der Begriff "Agrobacterium" umfasst, ist aber nicht eingeschränkt auf, die Stämme Agrobacterium tumefaciens (der gewöhnlich Wurzelhalsgallen in infizierten Pflanzen hervorruft) und Agrobacterium rhizogens (der haarige Wurzelerkrankung in infizierten Wirtspflanzen hervorruft). Die Infektion einer Pflanzenzelle mit Agrobacterium führt gewöhnlich zur Produktion von Opinen (beispielsweise Nopalin, Agropin, Octopin, usw.) durch die infizierte Zelle. Somit werden Agrobacterium- Stämme, die die Produktion von Nopalin bewirken (beispielsweise Stamm LBA4301, C58, A208) als Agrobacterien vom "Nopalin-Typ" bezeichnet; Agrobacteriem-Stämme, die die Produktion von Octopin (beispielsweise der Stamm LBA4404, Ach5, B6) verursachen, werden als Agrobacterien vom "Octopin-Typ" bezeichnet; und Agrobacterium-Stämme, die die Produktion von Agropin verursachen (beispielsweise Stamm EHA105, EHA101, A281) werden als Agrobacterien vom "Agropin-Typ" bezeichnet.
Die Begriffe "Bombardierung", "Beschuss" und "biolistischer Beschuss" betreffen das Verfahren zum Beschleunigen von Teilchen in Richtung einer biologischen Zielprobe (beispielsweise Zelle, Gewebe usw.), so dass die Verwundung der Zellmembran einer Zelle in dem biologischen Zielgewebe und/oder der Eintritt der Teilchen in die biologische Zielprobe verursacht wird. Verfahren zum biolistischen Beschuss sind Stand der Technik (beispielsweise US-Patent Nr. 5,584,807) und sind kommerziell erhältlich (beispielsweise der mit Heliumgas betriebene Mikroprojektil-Beschleuniger (PDS-1000/He) (BioRad).
Der Begriff "Mikroverwundung", wenn er in Bezug auf ein Pflanzengewebe gebraucht wird, betrifft das Einbringen einer mikroskopischen Wunde in dieses Gewebe. Die Mikroverwundung kann beispielsweise durch Teilchenbeschuss erzielt werden, wie hier beschrieben.
Der Begriff "Pflanze", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Vielzahl von Pflanzenzellen, die zum Großteil differenziert sind in eine Struktur, die in jeder Stufe einer Pflanzenentwicklung vorhanden ist. Solche Strukturen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, eine Frucht, einen Sprössling, Stengel, ein Blatt, Blütenblatt, usw. Der Begriff "Pflanzengewebe" umfasst differenzierte und undifferenzierte Gewebe von Pflanzen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf Wurzeln, Sprösslinge, Blätter, Pollen, Samen, Tumorgewebe und verschiedene Arten von Zellen in Kultur (beispielsweise Einzelzellen, Protoplasten, Embryos, Kallus, protokormusartige Körper usw.) Pflanzengewebe kann in Pflanzen, in Organkultur, Gewebekultur oder Zellkultur zugegen sein.
Der Begriff "embryogene Zelle", wie er hier in Bezug auf eine Pflanzenzelle verwendet wird, betrifft eine oder mehr Pflanzenzellen (unabhängig davon, ob sie differenziert oder undifferenziert sind), die zur Differenzierung in ein Pflanzengewebe oder eine Pflanze befähigt sind. Embryogene Zellen umfassen ohne Einschränkung Protoplasten, wie diejenigen, die hergeleitet sind von den Gattungen Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciohorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum und Datura. Ebenfalls enthalten sind Embryos (wie diejenigen von Sorghum, Mais, Banane), embryogene Meristeme (wie diejenigen von Sojabohnen), embryogener Kallus (wie von Zuckerrohr), protokormusartige Körper (wie von Ananas) und embryogene Zellen, wie beispielsweise solche von Knoblauch. Die Fähigkeit einer embryogenen Zelle zur Differenzierung in eine Pflanze wird durch Verfahren des Standes der Technik bestimmt. Die Differenzierung von Ananas-protokormusartigen Körpern zu Sprösslingen kann durch Anzucht der protokormusartigen Körper auf mit Agar verfestigtem, hormonfreiem Murashige & Skoog (MS)-Medium oder auf einem mit Agar verfestigtem PM2-Medium (US-Patent Nr. 6,091,003) er folgen. Die Differenzierung zu Ananas-Wurzeln kann durch Anzucht von protokormusartigen Körpern in flüssigem modifiziertem MS-Medium erfolgen, das 1 mg/l NAA enthält.
Der Begriff "Konjugation", wie er hier verwendet wird, betrifft das Verfahren, bei dem genetisches Material von einem Mikroorganismus in einen anderen überführt wird, wobei eine physikalische Verbindung oder Einheit zwischen den beiden Zellen beteiligt ist. Dieses Verfahren erfolgt bekanntlich gemeinhin in Bakterien, Protozoen, und bestimmten Algen und Pilzen.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und betrifft Verfahren zur Synthese und anschließenden Modifikation von Uridin-5'-diphosphosulfochinovose (UDP-SQ).
1. Verfahren zur Biosynthese von Uridin-5'-diphosphosulfochinovose (nicht Teil der Ansprüche).
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen die Verwendung von rekombinanten Enzymen aus Arabidopsis thaliana, UDP-Glucose, und eines Schwefeldonators zur Synthese von UDP-SQ. Obwohl die vorliegende Erfindung nicht durch einen spezifischen Reaktionsmechanismus eingeschränkt ist, wird bei einer Ausführungsform die Produktion von UDP-SQ aus einem Reaktionsgemisch vorgeschlagen, das UDP-Glucose, rekombinantes SQD1-Enzym-Protein aus Arabidopsis thaliana und Sulfit umfasst (siehe 1).
Biosynthese von Uridin-5'-diphosphosulfochinovose (UDP-SQ)
Rekombinantes SQD1-Enzymprotein aus Arabidopsis thaliana katalysiert die Bildung der Sulfonsäure- Vorstufe, UDP-SQ, aus UDP-Glucose und einem Schwefeldonator. Bei einer Ausführungsform erfolgt die UDP-SQ-Produktionsreaktion in einem Puffer, der gereinigtes SQD1-Protein, Na₂SO₃, radioaktiv markierte UDP-Glucose und Tris umfasst, für 40 min bei 37°C. Das Reaktionsgemisch wird dann hitzedenaturiert, so dass das rekombinante Enzym inaktiviert wird, und 5 min bei 10.000 × g zentrifugiert. Die Produktion von UDP-SQ als Reflektierung der SQD1-Aktivität wird wie nachstehend beschrieben nachgewiesen.
Die Biosynthese von UDP-SQ wie es erfindungsgemäß vorgeschlagen wird, ist nicht auf einen bestimmten pH-Wert eingeschränkt. Bei einer Ausführungsform ist der pH-Wert zwischen 7,0 und 9,5. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der pH-Wert der Reaktion 7,5.
Die vorliegende Erfindung ist zwar nicht auf den Einsatz eines spezifischen Schwefeldonators eingeschränkt, bei einer Ausführungsform ist der Schwefeldonator jedoch aus der Gruppe ausgewählt, die Sulfat, Sulfid, Thiosulfat, Sulfoglutathion, Adenosin-5'-phosphosulfat (APS) und 3'-Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat (PAPS) umfasst. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Schwefeldonator Sulfat (siehe auch Beispiel 1).
Nachweis von Uridin-5'-diphosphosulfochinovose (UDP-SQ), hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren.
Die vorliegende Erfindung ist nicht durch ein spezifisches Mittel zum Nachweisen von UDP-SQ als Endprodukt des vorstehend beschriebenen Biosyntheseverfahrens eingeschränkt. Bei einer Ausführungsform umfasst das Mittel zum Nachweisen von UDP-SQ Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wie folgt. Das hitzedenaturierte Reaktionsgemisch wird z.B. einer HPLC-Analyse unterworfen (Waters Corp., Milford, MA), wobei eine bei 42°C gehaltene Beckman (Fullerton, CA) Ultrasphere ODS-Säule (4,6 mm × 25 cm, Teilchengröße 5 μM) verwendet wurde. Die Substrate und Produkte werden durch Anlegen eines linearen Gradienten von 30 mM KH₂PO₄, 2 mM Tetrabutylammoniumhydroxid (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), mit KOH auf pH-Wert 6,0 eingestellt, auf Acetonitril mit HPLC-Qualität (EM Science, Gibbstown, NJ) mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml pro min über 45 min getrennt. In dem vorstehend beschriebenen HPLC-System cochromatographierte die durch die Reaktion produzierte Hauptverbindung mit tatsächlichem UDP-SQ, was zeigt, dass diese Verbindung UDP-SQ war, und dass das gereinigte SQD1 die Synthese des in dem Test produzierten UDP-SQ katalysierte.
Produktion von rekombinantem SQD1-Enzymprotein aus Arabidopsis thaliana
Essingman et al. "Phosphate Availability Affects the Thylakoid Lipid Composition and Expression of SQD1, a Gene required for Sulfolipid Biosynthesis in Arabidopsis thaliana", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1950-955 (1998) offenbart die Produktion eines rekombinanten SQD1-Proteins aus A. thaliana in Escherichia coli mit einer Strategie auf PCR-Basis und spekuliert, dass SQD1 an der Biosynthese von UDP-SQ aus UDP-Glucose beteiligt ist.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein bestimmtes Verfahren zur Produktion des rekombinanten SQD1-Enzyms eingeschränkt, das bei der Produktion von UDP-SQ verwendet wird. Bei einer Ausführungsform ist eine Maßnahme zur Produktion von rekombinantem SQD1-Enzymprotein aus Arabidopsis thaliana mit der in Seq.-ID.-Nr. 6 aufgeführten Aminosäuresequenz wie folgt:
Zur Isolation von A. thaliana-Genen, die Enzyme codieren, welche an der Kopfgruppen-Biosynthese der Thylakoid-Membranen beteiligt sind, wurde die dbEST-Datenbank von exprimierten Sequenzmarkierungen mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz der bakteriellen sqdB-Gene mittels TBLASTN durchsucht. Im Verlauf dieser Suche wurde eine partielle Reis-cDNA (EST D46477) gefunden, die ein mutmaßliches Protein mit hoher Sequenzähnlichkeit zum bakteriellen sqdB-Genprodukt codiert (siehe 17). Ein Fragment der partiellen Reis-cDNA wurde als Sonde zur Durchmusterung einer PRL2-cDNA-Bank aus A. thaliana durch heterologe DNA-Hybridisierung verwendet. Die vorliegende Erfindung ist zwar nicht auf spezifische Hybridisierungsbedingungen oder Membranen eingeschränkt, jedoch wurden bei einer Ausführungsform Hybond N+(Amersham)-Membranen verwendet, und die Hybridisierung erfolgte bei 53°C in Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,2), der SDS, EDTA, und BSA enthielt. Nach der Hybridisierung wurde die Membran zweimal für 20 min in einer SSPE, SDS-Lösung bei 53°C gewaschen. Mehrere cDNA-Klone wurden isoliert, einschließlich eines Klons mit einem Insert von 1799 Basenpaaren, der sequenziert wurde (GenBank Zugangsnummer AF022082) (siehe 13: Seq.-ID.-Nr. 5). Der entsprechende Locus von A. thaliana wurde mit SQD1 bezeichnet, und das Plasmid mit der cDNA mit dem 1799 bp Insert erhielt die Bezeichnung pSQD1. (Siehe auch Beispiel 2.a).
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein spezifisches Mittel zur Expression von rekombinantem SQD1-Protein eingeschränkt. Bei einer Ausführungsform wurde zur Expression von rekombinantem SQD1-Protein in Escherichia coli ein Fragment von pSQD1 in den His-Tag-Expressionsvektor pQE-30 (QIAGEN, Inc., Valencia, CA: Kat.# 32149) (siehe 3) mit einer Strategie auf PCR-Basis kloniert. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung eines spezifischen Protein-Expressionsvektors oder -systems eingeschränkt. Bei ei ner Ausführungsform wird der Protein-Expressionsvektor ausgewählt aus der Gruppe, umfassend pQE-9, pQE-16, pQE-31, pQE-32, pQE-40, pQE-60, pQE-70, pQE-80, pQE-81, pQE-82, pQE-100 (die jeweils von QIAGEN, Inc., Valencia, CA erhältlich sind). Bei einer weiteren Ausführungsform ist der Protein-Expressionsvektor pACYC184 (New England Biolabs, Beverly, MA: Kat.# E4152S) (siehe 6). Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Protein-Expressionsvektor pQE-30 (siehe 3).
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf eine spezifische Maßnahme zur Reinigung des rekombinanten SQD1-Proteins eingeschränkt. Bei einer Ausführungsform, ermöglichte das resultierende Plasmid-Konstrukt pSQD1-TP die Expression des rekombinanten SQD1-Proteins in E. coli und die Reinigung des Proteins aufgrund der selektiven Bindung der sechs N-terminalen Histidin-Reste des Plasmid-Konstruktes an Nickel-Nitrilessigsäure-(Ni-NTA)-Agaroseharz, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden (QIAGEN, Inc., Valencia, CA: Kat.# 30210). Das rekombinante Protein wurde in einem Puffer, der Glycerin, NaCl, und NaH₂PO₄ (pH-Wert 7,5) enthielt, eluiert und bei –20°C aufbewahrt. Das SQD1-Protein war schätzungsweise zu etwa 95% rein durch SDS-PAGE-Gelanalyse (siehe 4).
Assay zum Messen der SQD1-Aktivität
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein spezifisches Mittel zur Messung der Aktivität des erfindungsgemäß hergestellten rekombinanten SQD1-Proteins eingeschränkt. Bei einer Ausführungsform wurde ein Enzymassay zum Messen der Umwandlung der UDP-Glucose in UDP-SQ als Reflektierung der SQD1-Aktivität entwickelt. Grundlegende Aktivitätsassays erfolgten für 40 min bei 37°C in einem Reaktionsgemisch, das gereinigtes SQD1-Protein, Na₂SO₃, radioaktiv markierte UDP-Glucose und Tris (pH-Wert 7,5) in einem Gesamtvolumen von 100 μl enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 min inkubiert, hitzedenaturiert, zentrifugiert und durch HPLC analysiert. Die Substrate und Produkte wurden durch Anlegen eines linearen Gradienten von KH₂PO₄, Tetrabutylammoniumhydroxid (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), mit KOH auf pH-Wert 6,0 eingestellt, auf Acetonitril mit HPLC-Qualität (EM-Science; Gibbstown, NJ) getrennt.
Die Inkubation des SQD1-Proteins mit markierter UDP-Glucose wie vorstehend beschrieben führte zur Bildung von zwei Verbindungen mit einzigartigen Retentionszeiten, verglichen mit UDP-Glucose, wie es durch HPLC analysiert wurde. In dem vorstehend beschriebenen HPLC-System cochromatographierte eine Verbindung mit echtem UDP-SQ, was zeigt, dass diese Verbindung UDP-SQ war, und dass das gereinigte SQD1 die Synthese des in diesem Assay produzierten UDP-SQ katalysierte (siehe auch Beispiel 1 & 2b).
2. Biosynthese von 6-Sulfo-α-D-chinovosyldiacylglycerin (SQDG)
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen zudem die anschließende Modifikation von UDP-SQ zur Bildung von Verbindungen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, 6-Sulfo-α-D-chinovosyldiacylglycerin (SQDG). Die vorliegende Erfindung ist zwar nicht durch einen spezifischen Reaktionsmechanismus eingeschränkt, in einer Ausführungsform wird jedoch die Produktion von SQDG aus einem Reaktionsgemisch, umfassend UDP-SQ, Diacylglycerin und ein rekombinantes Peptid, das Sulfochinovose von UDP-SQ auf Diacylglycerin übertragen kann, wie folgt vorgeschlagen (siehe 5).
Bei einer Ausführungsform wird SQDG in einer Reaktion, die Mittel zur Umsetzung von 100 μM UDP-SQ, 100 μM Diacylglycerin und 10 μg eines im Wesentlichen gereinigten Peptids, enthält, das ein Genprodukt ist, welches von der in Seq.-ID.-Nr. 1 codierten Nukleinsäuresequenz codiert wird, in einem 100 μl-Reaktionsvolumen bei 37°C für 40 min produziert. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Peptid ein Genprodukt, das von der in Seq.-ID.-Nr. 3 offenbarten Nukleinsäuresequenz codiert wird. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Peptid ein Genprodukt, das von der in Seq.-ID.-Nr. 4 offenbarten Nukleinsäuresequenz codiert wird.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein spezifisches Mittel zur Verifikation der Produktion von SQDG durch das vorstehend beschriebene Verfahren eingeschränkt. Bei einer Ausführungsform wird die Produktion von SQDG durch die folgenden Mittel verifiziert. Aliquots der vorstehenden Reaktion werden durch Dünnschichtchromatographie (DC) auf mit aktiviertem Ammoniumsulfat imprägnierten Silicagel-DC-Platten mit einem Lösungsmittel-System analysiert, das Aceton-Toluol-Wasser (91:30:8, Vol./Vol./Vol.) enthielt. Die Produkte der vorstehenden Reaktion werden dann mit Ioddampf sichtbar gemacht und durch Co-Chromatographie mit einem Arabidopsis thaliana Blattlipidextrakt, der bekanntermaßen SQDG enthält, identifiziert (siehe 9). Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Produktion von SQDG durch quantitative Analyse verifiziert, wobei die Reaktionsprodukte aus den DC-Platten isoliert werden und zur Herstellung von Fettsäuremethylestern verwendet werden. Die Methylester werden durch Gaschromatographie mit Myristinsäure als interner Standard wie nachstehend beschrieben quantifiziert.
Nachweis der SQDG-Produktion durch Dünnschichtchromatographie (DC)
Statistisch ausgewählte Kolonien von einer mutagenisierten Population von R. sphaeroides-Zellen, die bekanntlich das Lipid SQDG produzieren, werden als kleine Flecken (0,5 × 0,5 cm) auf frischen Z-Brühe-Platten ausgestrichen. Die Lipide werden aus diesen Flecken isoliert, indem die Zellen auf dem breiten Ende eines flachen Zahnstochers aufgesammelt werden und das Material in 75 μl Chloroform-Methanol (1:1, Vol./Vol), das in Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen enthalten war, zentrifugiert wurde. Nach der Zugabe von 25 μl 1 N KCl-0,2 M H₃PO₄, wurden die Röhrchen mit dem Vortexer aufgewirbelt und zentrifugiert, um die organischen und wässrigen Phasen voneinander zu trennen. Ein 10 μl-Aliquot wird aus der lipidhaltigen unteren Phase abgezogen und direkt auf eine mit aktiviertem Ammoniumsulfat imprägnierte Silicagel-Dünnschichtchromatographie-(DC)-Platte punktförmig aufgetragen. Zu diesem Zweck werden Baker Si250 Silicaplatten mit einer Voradsorptionsmittelschicht durch Tränken in 0,15 M Ammoniumsulfat für 30 sec, gefolgt von Trocknen an der Luft bis zur vollständigen Trockne, hergestellt. Direkt vor dem Gebrauch werden die Platten für 2,5 Std. bei 120°C aktiviert. Die Aktivierung der ammoniumsulfatbehandelten Platten bei 120°C produziert Schwefelsäure, die Phosphatidylglycerin protoniert, so dass es weniger polar ist. Ein Aceton-Benzol-Wasser-Gemisch (91:30:8, Vol./Vol./Vol.) wurde als Lösungsmittel-System eingesetzt. Die Lipide wurden durch Besprühen der Platten mit 50% Schwefelsäure, gefolgt von Erwärmen bei 160°C für 10 bis 15 min zum Verkohlen der Lipide, sichtbar gemacht.
Quantitative Lipid-Analyse zur Verifikation der Produktion von SQDG
Für jeden Strang wurden drei 50-ml-Kulturen in Sistrom's Medium unter Schütteln bei 32°C im Dunkeln aerob gezüchtet. Die Zellen werden zentrifugiert, in 0,5 ml Wasser suspendiert, und durch Aufwirbeln mit dem Vortexer mit 4 ml Chloroform-Methanol (1:1, Vol./Vol.) extrahiert. Die Zugabe von 1,3 ml 1 M KCl-0,2 M H₃PO₄, Aufwirbeln mit dem Vortexer und Zentrifugation führt zur Phasentrennung der Lipide in die untere Chloroformphase. Die Chloroformphase wird entnommen und durch Verdampfen unter N₂-Strom auf 0,2 ml eingeengt. Die Probe wird aufgeteilt, und das Material wird punktförmig auf aktivierte (30 min bei 110°C) Silicagel-DC-Platten (Si250; Baker) aufgetragen. Die Platten werden in zwei Dimensionen entwickelt, zuerst mit Chloroform-Methanol-Wasser (65:25:4, Vol./Vol./Vol.) und dann mit Chloroform-Aceton-Methanol-Essigsäure-Wasser (50:20:10:10:5, bezogen auf das Volumen).
Die Lipide werden mit Ioddampf sichtbar gemacht, und nach der Desorption von Iod wurden die Punkte einzeln in 8 ml-Schraubdeckel-Röhrchen überführt. Zu den Proben wurde 5 μg Myristinsäuremethylester in 0,1 ml Hexan als interner Standard zugegeben, da nur vernachlässigbare Mengen endogener Myristinsäure in den bakteriellen Lipiden gefunden wurden. Fettsäuremethylester werden durch Zugabe von 1 ml wasserfreier 1 N methanolischer HCl (Supelco), gefolgt von Inkubation bei 80°C für 1 Std. hergestellt. Nach der Zugabe von 1 ml 0,95 (Gew./Vol.) KCl wurden die Fettsäuremethylester in 1 ml Hexan extrahiert und dann in einem Volumen von 0,1 ml getrocknet.
Proben (jeweils 2 μl) werden auf einen Gaschromatographen injiziert (Varian 2000), der mit einer 2,4 m Säule (2 mm Innendurchmesser), gepackt mit 3% SP-2310 und 2% SP-2300 auf 100/120 Chromosorb WAW (Supelco), ausgerüstet war. Die Fließgeschwindigkeit des Trägerga ses (N₂) wurde auf 20 ml/min eingestellt, und die Säulentemperatur wurde auf 2 min bei 180°C eingestellt, über 10 min auf 200°C, und 4 min auf 200°C erhöht. Die Fettsäuremethylester wurden durch einen Flammenionisationsdetektor erfasst, und die Daten wurden durch einen Spectra Physics Integrator integriert. Zur Berechnung der relativen Mengen der acht polaren Lipide, die in der Analyse enthalten waren, wurde die Menge der Fettsäuren berechnet, die in jedem Lipid enthalten waren. Die Validität der Berechnung beruhte auf der Annahme, dass die Lipide, einschließlich der nicht identifizierten Lipide, jeweils zwei Fettsäuren je Molekül enthielten, und dass die unterschiedlichen Lipide ähnliche Fettsäure-Zusammensetzung aufwiesen.
Produktion und Reinigung eines rekombinanten Peptids, das Sulfochinovose von UDP-SQ auf Diacylglycerin übertragen kann
a. Arabidopsis-Peptid – Cyanobacterien-sqdX-Homologa
Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Produktion eines im Wesentlichen gereinigten rekombinanten Peptids aus Arabidopsis thaliana vorgeschlagen, das Sulfochinovose von UDP-SQ auf Diacylglycerin übertragen kann. Bei einer Ausführungsform werden Mittel zur Produktion eines sqdX-Homologs von Arabidopsis thaliana beschrieben, das von der in Seq.-ID.-Nr. 3 offenbarten Nukleinsäuresequenz codiert wird. Ein BLAST-Vergleich des Cyanobacterien-sqdX-Gen mit genomischer Sequenz von Arabidopsis thaliana ergab verschiedene potentielle Homologa. Bei einer Ausführungsform wird AtSQDX-1, ein Homolog mit 37% Aminosäureidentität zum Cyanobacterien-sqdX-Gen und einer Nukleinsäuresequenz wie in Seq.-ID.-Nr. 3, vorgeschlagen.
Obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf die Expression eines beliebigen spezifischen Arabidopsisthaliana sqdX-Homologs eingeschränkt ist, wird bei einer Ausführungsform AtSQDX-1 folgendermaßen kloniert und exprimiert.
Gesamt-RNA aus Blättern von 2 Wochen alten Arabidopsis Wild-Typ-Pflanzen werden gemäß Logemann et al., "Improved Method for the Isolation of RNA from Plant Tissues", Anal. Biochem., 163: 16-20 (1987) wie nachstehend beschrieben isoliert. Bei einer Ausführungsform werden die Arabidopsis-Blätter an Phosphat verarmt, so dass SQDX-Sequenzen angereichert werden. Die isolierte Gesamt-RNA wird dann auf Poly A+-mRNA mit dem Oligotex-mRNA-Mini-Kit (QIAGEN Kat. Nr. 70022) angereichert, wobei die Herstelleranweisungen wie nachstehend beschrieben befolgt wurden. Die mRNA wird einer cDNA-Biosynthese mit dem ProSTAR HF Einzelröhrchen-RT-PCR-System (Stratagene, LaJolla, CA: Kat. Nr. 600164) gemäß den Herstelleranweisungen (wie nachstehend beschrieben) unterworfen, damit eine cDNA-produziert wird, die den offenen Leserahmen von AtSQDX-1 enthält. Die Primer auf der Basis der verfügbaren genomischen Sequenz von AtSQDX-1 (Seq.-ID.-Nr. 3) (GenBank Zugangs-Nr. AL137189) werden erstellt, so dass eine Klonierung im Raster in den Protein-Expressionsvektor pQE-30 ermöglicht wird.
Bei einer Ausführungsform wurde zur Expression von rekombinantem AtSQDX-1-Protein in Escherichia coli ein 1410 Basenpaarfragment von pSYB, das zumindest einen Teil der in Seq.-ID.-Nr. 3 offenbarten Nukleinsäuresequenz (GenBank Zugangs-Nr.CAB69850) umfasste, in den His-Tag-Expressionsvektor pQE-30 (QIAGEN, Inc., Valencia, CA: Kat.# 32149) mit einer Strategie auf PCR-Basis kloniert. Zu diesem Zweck wurden ein Vorwärts-Primer mit der Nukleotidsequenz 5'-CGG GAT CCA TGA CGA CTC TTT CTT CTA TA-3' (Seq.-ID.-Nr. 13) und ein Rückwärts-Primer mit der Nukleotidsequenz 5'-AAG GAT CCC TAC ACG TTA CCT TCC GGT A-3' (Seq.-ID.-Nr. 14) verwendet, so dass eine BamHI-Stelle zum Klonieren in pQE-30 erhalten wurde.
Die vorliegende Erfindung ist in Bezug auf spezifische Primer, die zur Erzeugung eines Arabidopsis thaliana sqdX-Homologs verwendet werden, nicht eingeschränkt. Bei einer weiteren Ausführungsform produzieren die Primer 5'-AAG GTA CCC TRC ACG TTA CCT TCC GGT A-3' (Seq.-ID.-Nr. 16), und der Rückwärts-Primer 5'-CGG GAT CCC CAT GAC GAC TCT TTC TTC TAT A-3' (Seq.-ID.-Nr. 15) die cDNA für das SQD2-Gen (siehe Beispiel 5).
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Klonierung einer spezifischen Nukleotidsequenz in einen Protein-Expressionsvektor zur Produktion eines rekombinanten A. thaliana-Peptids eingeschränkt, das Sulfochinovose von UDP-SQ auf Diacylglycerin übertragen kann. Bei einer Ausführungsform wird ein Fragment des SQD2-Gens, das zumindest einen Teil der Nukleinsäuresequenz wie in Seq.-ID.-Nr. 4 offenbart enthält, in pQE-30 kloniert.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung eines spezifischen Protein-Expressionsvektors oder -systems eingeschränkt. Bei einer Ausführungsform ist der Protein-Expressionsvektor ausgewählt aus der Gruppe pQE-9, pQE-16, pQE-31, pQE-32, pQE-40, pQE-60, pQE-70, pQE-80, pQE-81, pQE-82 oder pQE-100 (die jeweils von QIAGEN, Inc., Valencia, CA erhältlich sind). Bei einer weiteren Ausführungsform ist der Protein-Expressionsvektor pACYC184 (siehe 6). Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Protein-Expressionsvektor pQE-30 (siehe 3).
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein bestimmtes Mittel zur Reinigung eines rekombinanten Ara bidopsis thaliana-Peptids eingeschränkt, das Sulfochinovose von UDP-SQ auf das rekombinante Diacylglycerin-Protein übertragen kann. Bei einer Ausführungsform ermöglichte das resultierende Plasmidkonstrukt die Expression des rekombinanten AtSQDX-1-Proteins in E. coli und die Reinigung des Proteins aufgrund der selektiven Bindung der sechs N-terminalen Histidin-Reste des Plasmid-Konstruktes an Ni-NTA-Agarose-Harz gemäß den Herstelleranweisungen (QIAGEN, Inc., Valencia, CA: Kat.# 30210). Das rekombinante Protein wurde mit 200 mM Imidazol eluiert, das anschließend durch Verwendung eines Millipore-Ultrafree 4-Konzentrators (Millipore, Inc., Bedford, MA) entfernt wurde. Das Protein wurde in 20% Glycerin, 300 mM NaCl und 25 mM NaH₂PO₄ (pH-Wert 7,5) bei –20°C aufbewahrt.
Bei einer anderen Ausführungsform wird die Reinigung eines SQD2-Genproduktes vorgeschlagen, das Sulfochinovose von UDP-SQ auf Diacylglycerin übertragen kann.
Isolation von Gesamt-RNA aus Arabidopsisthaliana-Geweben
Es ist nicht beabsichtigt, dass die Erfindung auf ein spezifisches Verfahren zur Isolation von Gesamt-RNA aus A. thaliana-Geweben eingeschränkt ist. Bei einer Ausführungsform wird die Gesamt-RNA aus den Geweben durch Guanidinhydrochlorid-Extraktion folgendermaßen isoliert. Die Gewebe werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und mit einem Waring-Blender zu einem feinen Pulver homogenisiert. Für kleine Gewebemengen (weniger als 0,5 g) wird ein rotierender Stift in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen zur Homogenisation des Gewebes verwendet. Der Extrakt wird weiter bei Raumtemperatur durch Zugabe von 2 Volumina Guanidin-Puffer mit 8 M Guanidinhydrochlorid, 20 mM MES (4- Morpholinethansulfonsäure), 20 mM EDTA und 50 mM 2-Mercaptoethanol bei pH-Wert 7,0 homogenisiert.
Der Guanidinhydrochloridextrakt wird in einer vorgekühlten (4°C) Zentrifuge für 10 min bei 10.000 U/min zentrifugiert. Anschließend wird der RNA-haltige Überstand durch eine Schicht Tuch filtriert, so dass man die schwimmenden Teilchen beseitigt. Es werden mindestens 0,2-1,0 Vol. Phenol/Chloroform/IAA zur Extraktion der Proteine zugegeben. Nach der Extraktion wird das Gemisch 45 min bei 10.000 U/min bei Raumtemperatur zentrifugiert, so dass die Phasen getrennt werden. Die RNA-haltige wässrige Phase wird gesammelt und mit vorgekühlten 0,7 Volumina Ethanol und 0,2 Volumina 1 M Essigsäure zum Fällen der RNA gemischt, wobei die DNA und restliches Protein im Überstand bleiben. Es wird eine Inkubation über Nacht bei –20°C oder für 1 Std. bei –70°C empfohlen.
Die präzipitierte RNA wird bei 10.000 U/min für 10 min pelletiert und zweimal mit sterilem 3 M Natriumacetat bei pH-Wert 5,2 und Raumtemperatur gewaschen. Niedermolekulare RNAs und verunreinigende Polysaccharide lösen sich, wohingegen intakte RNA nach der Zentrifugation für 5 min bei 10.000 U/min als Pellet verbleibt. Das Salz wird durch eine letzte Wäsche mit 70% Ethanol entfernt, und das RNA-Pellet wird anschließend in sterilem Wasser gelöst und bis zum Gebrauch bei 20°C aufbewahrt.
Poly A+-mRNA-Isolation aus Arabidopsis thaliana-Gesamt-RNA
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein spezifisches Mittel zur Isolation von Poly A+-mRNA aus der Gesamt-RNA von Arabidopsis thaliana-Blättern eingeschränkt. Bei einer Ausführungsform wurde die Poly A+-mRNA aus A. thaliana-Blatt-Gesamt-RNA mit dem Oligotex- mRNA-Mini-Kit (QIAGEN Kat. Nr. 70022) nach den Herstelleranweisung wie folgt isoliert.
Die Oligotex-Suspension wird auf 37°C in einem Heizblock erhitzt, durch Aufwirbeln im Vortexer gemischt und bei Raumtemperatur untergebracht. Eine Probe mit 0,25 mg A. thaliana Blatt-Gesamt-RNA wird in ein RNase-freies 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen pipettiert, und das Volumen der Reaktion wird mit RNase-freiem Wasser auf 0,25 ml eingestellt. Ein Volumen von 0,25 ml Puffer OBB und 0,015 ml Oligotex-Suspension wird zur Reaktion gegeben. Der Inhalt wird sorgfältig durch Pipettieren gemischt. Die Probe inkubierte für 3 min bei 70°C in einem Wasserbad oder einem Heizblock zum Aufbrechen der Sekundärstruktur der RNA. Die Probe wird aus dem Heizblock entnommen, und bei Raumtemperatur (20°C bis 30°C) für 10 min untergebracht, um eine Hybridisierung zwischen Oligo-dT30 des Oligotex-Teilchens und dem Poly-A-Schwanz der mRNA zu ermöglichen. Der Oligotex:mRNA-Komplex wird durch Zentrifugation für 2 min bei maximaler Geschwindigkeit (14.000-18.000 × g) pelletiert, und der Überstand wird durch Pipettieren entfernt.
Das Oligotex:mRNA-Pellet wird in 400 μl Puffer OW2 durch Vortexen resuspendiert, und auf eine kleine Zentrifugiersäule pipettiert, die mit dem Kit mitgeliefert wird. Die Zentrifugiersäule wird 1 min bei Maximalgeschwindigkeit (14.000-18.000 × g) zentrifugiert. Die Zentrifugiersäule wird in ein neues RNase-freies 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen überführt und 400 μl Puffer OW2 wird auf die Säule aufgetragen. Die Zentrifugiersäule wird 1 min bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert, und die Durchflussfraktion wird verworfen.
Die Zentrifugiersäule wird in ein anderes 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen überführt. Ein Volumen von 20-100 μl heißem (70°C) Puffer OEB wird auf die Säule pipettiert. Das Harz wird durch drei- oder viermaliges Auf- und Ab-Pipettieren resuspendiert, so dass die Elution der mRNA ermöglicht wird, und für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit zur Pelletierung der Suspension zentrifugiert. Die Durchflussfraktion, die die isolierte Poly A+-mRNA enthält, wird bei –20°C bis zum Gebrauch aufbewahrt.
Biosynthese von Arabidopsis thaliana-cDNA
Die vorliegende Erfindung ist zwar nicht auf ein spezifisches Verfahren zur Biosynthese von Arabidopsis thaliana cDNA eingeschränkt, in einer Ausführungsform wurde die cDNA aber mit dem ProSTAR HF-Einzelröhrchen-RT-PCR-System (Stratagene, LaJolla, CA: Kat.-Nr. 600164) wie folgt biosynthetisiert.
Kontroll- und experimentelle Reaktionen werden durch nacheinander erfolgende Zugabe der folgenden Komponenten zu getrennten sterilen 0,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen hergestellt:
Kontrollreaktion

40,5 μl RNase-freies Wasser (nicht DEPC-behandeltes Wasser)
5,0 μl 10 × HF RT-PCR-Puffer
1,0 μl Kontroll-Primer-Satz (200 ng/μl)
1,0 μl dNTP-Mix (40 mM)
1,0 μl Kontroll-mRNA

Experimentelle Reaktion

39,5 μl RNase-freies Wasser (nicht DEPC-behandeltes Wasser)
5,0 μl 10 × HF RT-PCR-Puffer
s1,0 μl Vorwärts-Primer (100 ng)
1,0 μl Rückwärts-Primer (100 ng)
1,0 μl dNTP-Mix (40 mM)
1,0 μl (0,1-10 ng) isolierte Poly A+-mRNA.

Unmittelbar vor dem Gebrauch wurden 0,5 μl StrataScript RT (20 U/μl) mit 6,7 μl RNase-freiem Wasser und 0,8 μl 10 × HF RT-PCR-Puffer auf ein 8,0 μl Endvolumen verdünnt. Ein Volumen von 1,0 μl von verdünntem StrataScript RT wird zu jeder Reaktion gegeben. Ein Volumen von 0,5 μl TaqPlus Precision DNA-Polymerase-Mischung wird dann zu jeder Reaktion gegeben. Die Reaktion wird vorsichtig ohne Blasenbildung im Vortexer aufgewirbelt. Die Kontroll- und Experiment-Reaktionen werden in einem GeneAmp PCR-System 9600 Thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA: Kat.# N801-0001) untergebracht. Die Reaktion wird dann dem folgenden Thermocycler-Programm unterworfen, um Erststrang-cDNA aus der mRNA-Matrize zu synthetisieren und die cDNA über PCR zu amplifizieren: 1 Zyklus bei 42°C für 30 min; 1 Zyklus bei 95°C für 1 min; 40 Zyklen umfassten 95°C für 30 sec, 60°C für 30 sec, und 68°C für 2 min; und 1 Zyklus bei 68°C für 10 min.
Nach Beendigung des Thermocycler-Programms werden die RT-PCR-Produkte durch 1,0% (Gew./Vol.) Agarosegelelektrophorese analysiert. RT-PCR-Amplifikation der Kontrollreaktion, die die Kontroll-mRNA und den Kontroll-Primer-Satz enthält, ergibt ein 500 Basenpaar-Produkt. Die Reaktionsprodukte werden durch UV-Durchleuchtung des mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels leicht sichtbar. Die Produkte, die die cDNA enthalten, die durch die vorstehende Reaktion erzeugt wird, wird bis zum Gebrauch bei –20°C aufbewahrt.
Coexpression von rekombinanten Arabidopsis thaliana Peptiden
Es ist nicht beabsichtigt, dass die Erfindung auf die unabhängige Expression eines Peptids eingeschränkt ist, das die Umwandlung von UDP-Glc und eines Schwefel donators in UDP-SQ in einem einzelnen Wirtsorganismus oder einer Pflanze katalysieren kann. Darüber hinaus ist es außerdem nicht beabsichtigt, dass die Erfindung auf die unabhängige Expression eines zweiten Peptids eingeschränkt ist, das Sulfochinovose von UDP-SQ auf Diacylglycerin in einem einzigen Wirtsorganismus oder einer Pflanze übertragen kann. Bei einer Ausführungsform schlägt die Erfindung die Coexpression beider vorstehend beschriebener Peptide in einem einzigen Wirtsorganismus oder einer Pflanze vor. Bei einer Ausführungsform wird die Coexpression der Peptide SQD1 und SQDX (beispielsweise in gesonderten Protein-Expressionsvektoren) in E. coli folgendermaßen vorgeschlagen, so dass der Sulfolipid-Biosynthese-Weg wiederhergestellt wird.
Zur Expression der beiden Proteine in E. coli werden zwei kompatible Plasmide mit der Fähigkeit zur Proteinexpression, eins für SQD1 und eins für SQDX, verwendet. Jedes Plasmid muss eine andere Antibiotikaresistenz aufweisen, damit auf Transformanten mit der korrekten Kombination von Plasmiden selektiert wird. Das Plasmid pQE-30 verleiht eine Ampicillin-Resistenz, wohingegen das Plasmid pACYC184 eine Chloramphenicol-Resistenz verleiht. Der SQD1-codierende Bereich zusammen mit der Protein-Expressionscassette von pQE-30 wird aus diesem Plasmid entfernt, wobei die Restriktionsenzyme XhoI und PvuII verwendet werden, und in das mit SalI und EcoRV gespaltene pACYC184-Plasmid (New England Biolabs, Beverly, MA: Kat.# E4152S) (siehe 6) ligiert. Die M15-Zelllinie (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) wird mit einem pQE-30/SQDX-Protein-Expressionskonstrukt (wie oben beschrieben) transformiert. Das SQD1/pACYC184-Expressionskonstrukt wird in die M15-Zelllinie transformiert, die den pQE-30/SQDX-Expressionsvektor enthält. Bei der Induktion der Ex pression mit 1-5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ: Kat.# 27-3054-03) werden beide Proteine exprimiert.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung eines spezifischen Protein-Expressionsvektors eingeschränkt, so dass die Co-Expression der beiden rekombinanten Peptide hervorgerufen wird. Bei einer Ausführungsform wird der Protein-Expressionsvektor ausgewählt aus der Gruppe, umfassend pBK-CMV (Stratagene, LaJolla, CA: Kat.# 212209), pGEX-6P-1 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ: Kat.# 27-4597-01) oder pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA: Kat.# N3041S).
Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Coexpression der Peptide SQD1 und SQD2 (beispielsweise, in getrennten Protein-Expressionsvektoren) in E. coli, so dass der Sulfolipid-Biosyntheseweg wiederhergestellt wird, wie in Beispiel 5c vorgeschlagen.
Expression von rekombinanten Arabidopsis thaliana-Peptiden in transgenen Pflanzen
Die Übertragung und Expression der Transgene in Pflanzenzellen sind nun routinemäßige Praxis für den Fachmann. Ein Hauptwerkzeug wurde die Durchführung von Genexpressionsuntersuchungen und der Versuch der Gewinnung verbesserter Pflanzenvarietäten von landwirtschaftlichem oder kommerziellem Interesse. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Expression eines ersten Peptids eingeschränkt, das die Umwandlung von UDP-Glc und einem Schwefeldonator in UDP-SQ in einem einzigen Wirtsorganismus katalysieren kann, oder eines zweiten Peptids, das Sulfochinovose aus UDP-SQ auf Diacylglycerin in Bakterienzellen übertragen kann. Die Erfindung schlägt die Expression von rekombinanten Arabidopsis thaliana-Peptiden in transgenen Pflanzen vor, wie beschrieben von S. Clough und A. Bent, "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana" Plant J. 16: 735-43 (1998) (siehe Beispiel 3).
Bei einer Ausführungsform wird das allgemeine Verfahren zum Manipulieren von Genen, die in das Genom von Pflanzenzellen überführt werden sollen, so dass die Expression eines rekombinanten Peptids erhalten wird, in zwei Phasen ausgeführt. Erstens werden sämtliche Klonierungs- und DNA-Modifikationsschritte in E. coli durchgeführt, und das Plasmid, das das interessierende Genkonstrukt enthält, wird durch Konjugation in Agrobacterium überführt. Zweitens wird der resultierende Agrobacterium-Stamm zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Für einen verallgemeinerten Pflanzenexpressionsvektor enthält das Plasmid somit einen Replikationsursprung, der es ermöglicht, dass es in Agrobacterium repliziert, und einen Replikationsursprung mit hoher Kopienzahl, der in E. coli funktionell ist. Dies ermöglicht eine leichte Produktion und Untersuchung von Transgenen in E. coli vor der Übertragung auf Agrobacterium für eine anschließende Einbringung in Pflanzen. Auf dem Vektor können sich Resistenzgene befinden, und zwar eins für die Selektion in Bakterien (beispielsweise Streptomycin) und ein weiteres, das in Pflanzen exprimiert wird (beispielsweise ein Gen, das eine Kanamycin-Resistenz codiert, oder ein Gen, das eine Resistenz gegen ein Herbizid, wie Hygromycin, codiert). Ebenfalls vorhanden sind Restriktionsendonukleasestellen für die Zugabe von einem oder mehreren Transgenen, die funktionsfähig mit geeigneten regulatorischen Sequenzen verknüpft sind, und direktionale T-DNA-Grenz-Sequenzen, die bei Erkennung durch die Übertragungsfunktionen von Agrobacterium den Bereich abgrenzen, der auf die Pflanze übertragen wird.
Bei einer anderen Ausführungsform können die Pflanzenzellen durch Beschießen der Zelle mit Wolfram-Mikroprojektilen, auf denen klonierte DNA gefällt ist, transformiert werden. (Siehe beispielsweise Gordon-Kamm et al., Plant-Cell 2: 603 (1990)). Bei einer Ausführungsform wird ein Biolistic-Gerät (Bio-Rad, Hercules, Kalif.) zum Beschießen mit einer Schießpulver-Ladung (Kaliber 22, Power Piston Tool Charge) oder einem Luftdruck-Schuss, der ein Kunststoffprojektil durch einen Gewehrlauf treibt, verwendet. Ein Aliquot einer Suspension von Wolframteilchen, auf denen DNA gefällt wurde, wird auf der Vorderseite des Kunststoff-Makroprojektils untergebracht. Letzteres wird auf eine Acryl-Stopperplatte abgefeuert, welche ein Loch aufweist, das zu klein ist, als dass das Makroprojektil durchpasst. Demnach prallt das Kunststoff-Makroprojektil gegen die Stopperplatte und die Wolfram-Mikroprojektile durchqueren weiter das Loch in der Platte bis zum Ziel. Für die vorliegende Erfindung kann das Ziel eine beliebige Pflanzenzelle, Gewebe, Samen oder Embryo sein. Die in die Zelle eingebrachte DNA auf den Mikroprojektilen wird entweder in den Kern oder den Chloroplast eingebaut.
Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf eine bestimmte Weise eingeschränkt ist, auf die die Expression eines spezifischen rekombinanten A. thaliana-Peptids in Pflanzen erzielt wird. Bei einer Ausführungsform wird ein Peptid, codiert von den Nukleinsäuresequenzen, wie sie in der Seq.-ID.-Nr. 5 offenbart sind, in Pflanzen exprimiert. Bei einer weiteren Ausführungsform wird ein Peptid, codiert von der in Seq.-ID.-Nr. 3 oder Seq.-ID.-Nr. 4 offenbarten Nukleinsäuresequenz, in Pflanzen exprimiert. Bei einer weiteren Ausführungsform werden zwei rekombinante A. thaliana-Peptide, codiert von der Gruppe der Nukleinsäurese quenzen, die die Seq.-ID.-Nr. 3, Seq.-ID.-Nr. 4 und Seq.-ID.-Nr. 5 umfassen, in Pflanzen coexprimiert.
Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung durch einen bestimmten Pflanzenzelltyp eingeschränkt wird, in dem die Expression der rekombinanten Arabidopsis thaliana-Peptide erzeugt werden soll. Bei einer Ausführungsform stammt die Pflanzenzelle von einer monokotyledonen Pflanze. Bei einer alternativen Ausführungsform stammt die Pflanzenzelle von einer dikotyledonen Pflanze. Bei einer weiteren Ausführungsform stammt die Pflanzenzelle von einer Gruppe, umfassend die Gattungen Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Cufea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, und Zea. Bei einer bevorzugten Ausführungsform stammt die Pflanzenzelle von Arabidopsis thaliana.
Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert. Die Beispiele, die den Erfindungsgegenstand über die Ansprüche hinaus offenbaren, erläutern lediglich den technischen Hintergrund.
EXPERIMENTE
Beispiel 1
Bei diesem Beispiel wird ein Mittel zur Produktion von UDP-SQ aus einem Reaktionsgemisch beschrieben, das UDP-Glucose, rekombinantes Arabidopsis thaliana-SQD1-Enzymprotein und Sulfit, enthält. Bei einer Ausführungsform wird die UDP-SQ-Produktionsreaktion bei 37°C in einem Puffer, der 10 μg gereinigtes SQD1-Protein, 100 μM Na₂SO₃, 2, 2 mM UDP-Glucose [¹⁴C(U)-Glucose] (69 Bq/nmol) und 50 mM Tris (pH-Wert 7,5) in einem Gesamtvolumen von 100 μl enthielt, für 40 min durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird dann 5 min bei 95°C zur Inaktivierung des rekombinanten Enzyms hitzedenaturiert, bei 10.000 × g für 5 min zentrifugiert und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) (Waters Corp., Milford, MA) analysiert, wobei eine Beckman (Fullerton, CA) Ultrasphere ODS-Säule (4,6 mm × 25 cm, Teilchengröße 5 μM) eingesetzt wurde, die konstant bei 42°C gehalten wurde. Substrate und Produkte wurden durch Anlegen eines linearen Gradienten von 30 mM KH₂PO₄, 2 mM Tetrabutylammoniumhydroxid (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), mit KOH auf pH-Wert 6,0 eingestellt, an Acetonitril mit HPLC-Qualität (EM Science, Gibbstown, NJ) mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml pro min über 45 min getrennt.
Die Inkubation des SQD1-Proteins mit markierter UDP-Glucose, wie oben beschrieben, führte zur Bildung der beiden Verbindungen (U₁ und U₂) mit einzigartigen Retentionszeiten gegenüber UDP-Glucose (siehe 2A & B), wie es durch HPLC analysiert wurde. Die Filtration des Reaktionsgemischs mittels Amicon-Filter (Molekulargewichts-Ausschlussgrenze 10.000; Millipore Co., Bedford, MA) ohne Denaturierung ergab, dass 77% der Verbindung U₂ (siehe 2B) frei in Lösung war, verglichen mit 35% Verbindung U₁. Die Zugabe von Sulfit zum Reaktionsgemisch eliminierte die Verbindung U₁ vollständig, und stimulierte die Bildung der Verbindung U₂ (siehe 2C). Die Verbindung U₂ cochromatographierte in dem vorstehend beschriebenen HPLC-System mit [³⁵S]-UDP-SQ, was zeigt, dass die in dem Reaktionsgemisch erzeugte Verbindung UDP-SQ war (siehe 2D). Die markier ten Verbindungen wurden mit einem β-Ram-Modell 2-Durchflussmonitor (INUS-Systems, Tampa, FL) erfasst.
Beispiel 2
Bei diesem Beispiel wird eine Maßnahme für die Produktion von rekombinantem SQD1-Enzymprotein aus Arabidopsis thaliana, wie es in dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren verwendet wird und durch die in der Seq.-ID.-Nr. 5 offenbarte Nukleinsäuresequenz codiert wird, beschrieben.

a. Zur Isolation von A. thaliana-Genen, die Enzyme codieren, die an der Kopfgruppen-Biosynthese der Thylakoidmembranen beteiligt sind, wurde die dbEST-Datenbank der exprimierten Sequenz-Tags mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz der bakteriellen sqdB-Gene mittels TBLASTN durchsucht. Im Verlauf dieser Suche wurde eine partielle Reis-cDNA (EST D46477) gefunden, die ein mutmaßliches Protein mit hoher Sequenzähnlichkeit zu den bakteriellen sqdB-Genprodukten codiert. Ein 400 Basenpaar Xho-I-EcoRV-Fragment der partiellen Reis-cDNA wurde als Sonde zur Durchmusterung von 2,4 Millionen plaquebildenden Einheiten (pfu) einer A. thaliana PRL2-cDNA-Bank (einer Bank auf Lambda-ZipLox-Basis, erhältlich von Arabidopsis Biological Resource Center an der Universität des Staates Ohio, Columbus, OH) durch heterologe DNA-Hybridisierung verwendet. Es wurden Hybond N+(Amersham)-Membranen verwendet, und die Hybridisierung erfolgte bei 53°C in 0,25 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,2), der 7% (Gew./Vol.) SDS, 1 mM EDTA und 1% (Gew./Vol.) BSA enthielt. Nach der Hybridisierung wurde die Membran zweimal für 20 min in einer Lösung aus 2 × SSPE, 0,1% (Gew./Vol.) SDS bei 53°C gewaschen.

Es wurden mehrere cDNA-Klone isoliert, einschließlich einem mit einem Insert von 1799 Basenpaaren, der sequenziert wurde (GenBank Zugangs-Nr. AF022082). Das offene Leseraster (ORF), das bei Nukleotid 170 beginnt, codiert ein putatives Protein mit einer berechneten Molekülmasse von 53,1 kDa. Eine Aminosäure-Vergleichsanalyse des sqdB-Gens von Synechococcus sp. PCC7942 und der abgeleiteten Aminosäuresequenz der A. thaliana-cDNA ergab eine Sequenzidentität von 42%. Der entsprechende Locus von A. thaliana wurde als SQD1 bezeichnet, und das Plasmid, das die cDNA mit dem 1799 bp Insert enthielt, wurde mit pSQD1 bezeichnet. Auf dem Aminosäure-Niveau war die partielle Reis-cDNA-Sequenz zur SQD1-Sequenz von A. thaliana zu 86% identisch.
Zur Produktion von rekombinantem SQD1-Protein in Escherichia coli wurde ein 1199 Basenpaar-Fragment von pSQD1 (Nukleotidnummern 425-1603 von GenBank Zugangs-Nr. AF022082) in den His-tag-Expresssionsvektor, pQE-30 (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) mit einer Strategie auf PCR-Basis kloniert. Zu diesem Zweck wurde ein Vorwärts-Primer mit der Nukleotidsequenz 5'-AAA GGA TCC CGT GTT ATG GTC ATT GG-3' (Seq.-ID.-Nr. 9), und ein Rückwärts-Primer mit der Nukleotidsequenz 5'-GTC GGA TCC TTA TGT GGT CAT GGA CT-3' (Seq.-ID.-Nr. 10) verwendet, so dass eine BamHI-Stelle zum Klonieren in pQE-30 erhalten wurde, und dass die N-terminalen 85 Aminosäuren, die das mutmaßliche Signalpeptid enthielten, entfernt wurden. Das resultierende Plasmid-Konstrukt pSQD1-TP ermöglichte die Expression des rekombinanten SQD1-Proteins in E. coli und die Reinigung des Proteins aufgrund der selektiven Bindung der sechs N-terminalen Histidin-Reste des Plasmid-Konstrukts an Ni-NTA-Agarose nach den Herstelleranweisungen (QIAGEN, Inc., Valencia, CA). Das rekombinante Protein wurde mit 200 mM Imidazol eluiert, das anschließend durch Verwendung eines Millipore Ultrafree 4 Konzentrators (Millipore, Inc., Bedford, MA) entfernt wurde. Das Protein wurde in 20% Glycerin, 300 mM NaCl, und 25 mM NaH₂PO₄ (pH-Wert 7,5) bei –20°C aufbewahrt. Das SQD1-Protein war schätzungsweise zu etwa 95% rein durch SDS-PAGE-Gelanalyse (siehe 4).

b. Ein Enzymassay wurde zum Messen der Umwandlung von UDP-Glucose in UDP-SQ wie für die SQD1-Aktivität vorhergesagt entwickelt. Die grundlegenden Aktivitätsassays wurden für 40 min bei 37°C in einem Puffer durchgeführt, der 10 μg gereinigtes SQD1-Protein, 100 μM Na₂SO₃, 500 μM UDP-Glucose [¹⁴C(U)-Glucose] (89 Bq/nmol) und 50 mM Tris (pH-Wert 7,5) in einem Gesamtvolumen von 100 μl enthielt. Ein weiterer alternativer Test, der gekoppeltes Adenosin-5'-phosphosulfat (APS) (Sigma, St. Louis, MO)/SQD1-Assay, enthielt 50 mM Tris (pH-Wert 8,5), 10 mM Dithiothreitol (DTT), 25 μM [³⁵S]APS (500 Bq/nmol), 250 mM Na₂SO₄, 1 mM EDTA, 500 μM UDP-Glucose, 66 μg gereinigtes SQD1-Protein und 12 μg APR1 aus A. thaliana (siehe 8). In beiden Tests wurde die Reaktion für 10 min bei 30°C inkubiert. Die Proben wurden für 5 min bei 95°C hitzedenaturiert, für 5 min bei 10.000 × g zentrifugiert und durch HPLC (Waters Corp., Milford, MA) analysiert, wobei eine Beckman (Fullerton, CA) Ultrasphere ODS-Säule (4,6 mm × 25 cm Teilchengröße 5 μM) eingesetzt wurde, die konstant bei 42°C gehalten wurde. Substrate und Produkte wurden durch HPLC aufgetrennt und analysiert, wie oben in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 3
In diesem Beispiel wird ein Mittel für die vereinfachte Transformation von Arabidopsis hier beschrieben und es folgt den Verfahren von S. Clough und A. Bent, "Floral dip: a simplified method for Agrobacteriummediated transformation of Arabidopsis thaliana", Plant J. 16:735-43 (1998).

a. Ein Agrobacterium tumefaciens-Stamm, der das interessierende Gen SQD1 auf einem binären Vektor trägt, wird folgendermaßen hergestellt. Die gesamte SQD1-codierende Sequenz (siehe Seq.-ID.-Nr. 6) einschließlich eines Transitpeptids, aber ohne DNA-5-Prime des Gens, wird in pBluescript II (Stratagene, LaJolla, CA) mit einer Strategie auf PCR-Basis kloniert. Zu diesem Zweck wurde die SQD1-Sequenz durch PCR mit einem Vorwärts-Primer mit der Nukleotidsequenz 5'-CTA GGT ACC AAA TGG CGC ATC TAC TT-3' (Seq.-ID.-Nr. 19) und einem Rückwärts-Primer mit der Nukleotidsequenz 5'-GTC GGA TCC TTA TGT GGT CAT GGA CT-3' (Seq.-ID.-Nr. 10) amplifiziert. Die Primer wurden derart konstruiert, dass Kpn I und BamHI-Stellen zum Klonieren des SQD1-cDNA-Fragmentes in pBluescript II bereitgestellt wurden. Das SQDI-cDNA-Fragment wird dann aus pBluescript II mit den vorstehend genannten Restriktionsendonukleasen ausgeschnitten, und dann in die entsprechenden Restriktionsstellen auf dem binären Vektor pBINAR-Hyg subkloniert. Dieser Vektor ist von pBIB-Hyg (Becker, D., Nucleic Acids Res. 18: 203 (1990)) durch Einbringen des HindIII-EcoRI-Fragmentes aus dem Mittelteil von pA7 (von Schaewen, A. Doktorarbeit, Freie Universität Berlin (1989)) hergeleitet. Dieses Konstrukt wird in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm C58C1 eingebracht und zur Transformation von Arabidopsis thaliana Col-2-Pflanzen, wie nachstehend beschrieben verwendet.
b. Arabidopsis-Pflanzen werden unter Langtagbedingungen in Blumentöpfen mit Erden gezüchtet, welche mit Gaze, Fensterglas oder Tuch abgedeckt wurden, bis sie blühten. Die ersten Blütentriebe wurden abgeschnitten, so dass die Proliferation vieler Sekundärtriebe angeregt wurde, so dass die Pflanzen ungefähr 4 bis 6 Tage nach dem Beschneiden fertig waren. Die optimalen Pflan zen haben viele unreife Blüten-Cluster und nicht viele gereifte Schoten, obschon ein Bereich von Pflanzenstadien erfolgreich transformiert werden kann.

Der Agrobacterium tumefaciens-Stamm, der das interessierende Gen auf einem binären Vektor trägt, wird in einer großen Flüssigkultur bei 28°C in LB (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, und 5 g NaCl pro Liter Wasser) mit 25 μg/ml Hygromycin B (Calbiochem) gezüchtet, so dass auf das binäre Plasmid selektiert wird. Die Agrobacteriumkultur wird durch Zentrifugation bei 5500 × g für 20 min pelletiert, und auf OD₆₀₀ = 0,8 in einer sterilen 5% Saccharose-Lösung resuspendiert.
Bevor die oberirdischen Teile einer Arabidopsis-Pflanze in die resuspendierte Agrobacterium/Saccharose-Lösung getaucht werden, wird Silwet L-77 (OSi Specialties, Inc., Danbury, CT) in einer Konzentration von 0,05% (500 μl/l) dazu gegeben und gut gemischt. Die oberirdischen Teile einer Arabidopsis-Pflanze werden in die Agrobacterium-Lösung für 2 bis 3 sec unter vorsichtigem Rühren getaucht. Die eingetauchten Pflanzen werden unter einer Kuppel oder einer Abdeckung 16 bis 24 Std. zur Erhaltung einer hohen Feuchtigkeit untergebracht. Die eingetauchten Pflanzen werden keinem übermäßigen Sonnenlicht ausgesetzt, da sich die Luft unter der Kuppel erhitzen kann.
Die Pflanzen werden für weitere 3 bis 5 Wochen gezüchtet und normal gegossen, wobei lockere Blütentriebe mit Wachspapier, Klebeband, Stangen, Haargummis oder anderen Vorrichtungen hochgebunden wurden. Das Gießen wird unterbrochen, wenn die Pflanzensamen reifen. Sobald die trockenen Samen reif sind, werden sie geerntet, indem Gruppen von Blütenblättern (d.h. Blüten-Cluster) durch die Finger über ein sauberes Blatt Papier gezogen werden. Der Grossteil von Stängel- und Schotenmaterial wird vom Papier entfernt und die Samen werden unter Trocknung bei 4°C aufbewahrt.
Erfolgreiche Transformanten, die ein rekombinantes A. thaliana-Peptid exprimieren können, werden durch Verwendung eines Antibiotika- oder Herbizidselektierbaren Markers selektiert. In diesem Beispiel werden 2000 geerntete Samen (resuspendiert in 4 ml 0,1% Agarose) in der Dampfphase sterilisiert und auf Selektionsplatten mit 50 μg/ml Hygromycin B plattiert, 2 Tage lang kältebehandelt und dann unter Dauerlichtbedingungen (50 bis 100 μEinstein) 7 bis 10 Tage behandelt. Die Selektionsplatten des Beispiels bestehen zudem aus 0,5 × Murashige-Skoog-Medium (Sigma Chem. Kat.# M-5519) und 0,8% Gewebekultur-Agar (Sigma Chem. Kat.# A-1296). Erfolgreiche Transformanten werden identifiziert als Hygromycin-resistente Setzlinge, die grüne Blätter hervorbringen und gut ausgebildete Wurzeln im Selektionsmedium aufweisen.
Eine Probe von erfolgreichen Transformanten wird bis zur Reife durch Umtopfen in schwer angefeuchtete Pflanzerde gezüchtet. Blätter der Transformanten werden entfernt und einer DNA-Extraktion unterworfen, so dass die genomische DNA der Pflanze isoliert wird. Die extrahierte genomische DNA wird anschließend einer Restriktionsendonukleasespaltung und Southern-Blotting unterworfen, so dass der Einbau des interessierenden Gens in das Pflanzengenom bestätigt wird. Das Beispiel 4 macht keine Ausführungsform der Erfindung aus.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wird ein Mittel zur Expression eines Peptids SQDX (Seq.-ID.-Nr. 1), wie es im vorstehenden Beispiel vorgeschlagen ist, beschrieben. Das gesamte Insert des Plasmids pSYB, das das sqdB-Gen von Synechococcus trägt, wurde sequenziert (GenBank Zu gangs-Nr. AF155063), so dass ein neues ORF (offenes Leseraster) direkt 3' von sqdB identifiziert wurde. Das Plasmid pSYB ist von dem Plasmid pBluescript II-SK+ (Stratagene, LaJolla, CA, Kat.# 212205) hergeleitet und enthält die gesamte Sequenz der sqdB-Gen-cDNA, die in die KpnI- und BamHI-Stellen des Plasmids kloniert ist. Dieses ORF codiert ein mutmaßliches Protein mit 377 Aminosäuren ohne Sequenzähnlichkeit zu irgendeinem der beschriebenen sqd-Genprodukte von R. sphaeroides. Im Gegensatz zum vorhergehenden sqdB-ORF, das mit GTG beginnt, beginnt das zweite ORF mit ATG 15 bp vom 3'-Ende des sqdB-Gens. Dieses ORF wurde als sqdX bezeichnet. Die Analyse der hergeleiteten Aminosäuresequenz von sqdX (16: Seq.-ID.-Nr. 2) unter Einsatz von Pfam (Protein families database of alignments) offenbarte eine Glycosyltransferase-Gruppe-I-Domäne zwischen den Resten 228 und 347.
Zur Bestätigung, dass das sqdX-Gen in dem Cyanobakterium Synechococcus funktionell homologe Proteine codiert, wurde das offene sqdX-Leseraster von Synechococcus hinter den tac-Promotor in das mobilisierbare Plasmid mit breitem Wirtsbereich pRL59EH (Black et al., "Analysis of a Het-Mutation in Anabaena sp. PCC7120 implicates a secondary Metabolite in the regulation of heterocyst spacing", J. Bacteriol., 174: 2282-2292 (1994)) eingebracht, und die Konstrukte durch Konjugation in die Synechococcus-Mutante 7942ΔsqdX überführt, wie beschrieben in Wolk et al., "Construction of shuttle vectors capable of conjugative transfer from Escherichia coli to nitrogen-fixing filamentous cyanobacteria", Proc. Natl. Acad. Sci USA, 81: 1561-565 (1984). Sequenzen 5' des mutmaßlichen ATG bis zum ersten Stoppcodon im Raster (Position 2385912-2387168 der Genomsequenz) waren enthalten. Das sqdX-Gen von Synechococcus wurde aus dem Plasmid pSYB mit den Primern 5'-AAG GAT CCT GCG CTA AAG TCG CAC TC-3' (Seq.-ID.-Nr. 20) und 5'-ATA AGC TTC GAG CTC AGG CCG CT-3' (Seq.-ID.-Nr. 12) in die HindIII/BamHI-Stellen von pRL59EH PCR-kloniert. Eine Ω-Kassette von dem Plasmid pHP45Ω (wie beschrieben in Prentki, P. und Krisch, H.M., "In vitro insertional mutagenesis with a selectable DNA-Fragment", Gene, 29: 303-313 (1984)), die eine Spectinomycin- und Streptomycin-Resistenz enthält, wurde in die HindIII-Stellen dieser Plasmide eingeführt, so dass ein geeigneter selektierbarer Marker erhalten wurde. Das resultierende Plasmid, das sqdX von Synechococcus enthielt, wurde als pSQDX-7942 bezeichnet. Exkonjuganten wurden auf BG11-Medium selektiert, das 25 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Spectinomycin und 1 μg/ml Streptomycin enthielt, und wurden durch DNA/DNA-Hybridisierung analysiert, so dass die Anwesenheit des richtigen Plasmid-Konstrukts bestätigt wurde. Die Insertion des sqdX-Konstruktes stellte die Sulfolipid-Biosyntheseaktivität in der Synechococcus-Mutante 7942ΔsqdX wie durch DC-Lipidanalyse gezeigt, wieder her. Auf der Basis der beobachteten genetischen Erwägung wird geschlossen, dass das Cyanobacterien-sqdX-Gen ein Protein codiert, das an der Sulfolipid-Biosynthese beteiligt ist.
Beispiel 5
In diesem Beispiel wird ein Mittel zur Produktion des sqdX-Gen-Homologs von Arabidopsis thaliana SQD2, codiert von der in Seq.-ID.-Nr. 4 offenbarten Nukleinsäuresequenz beschrieben.
a. Klonierung der SQD2-cDNA
Das offene SQD2-Leseraster, das dem Protein entspricht (GeneBank Zugangs-Nr. CAB69850), und das vom BAC-Locus F7J8 200 (GenBank Zugangs-Nr. AL137189) vorhergesagt wurde, wurde durch RT-PCR mit den Primern 5'-CGG GAT CCC CAT GAC GAC TCT TTC TTC TAT A-3' (Seq.-ID.-Nr. 15) und 5'-AAG GTA CCC TAC ACG TTA CCT TCC GGT A-3' (Seq.-ID.-Nr. 16) kloniert. Gesamt-Blatt-RNA wurde aus etwa 20 Tage alten Pflanzen (Col-2) gemäß dem oben beschriebenen Verfahren von Logemann et al., isoliert. Poly A+-mRNA wurde mit einem Oligotex-Kit von QIAGEN, Inc. (Valencia, CA) wie vorstehend beschrieben gereinigt. RT-PCR-Reaktionen wurden mit dem ProSTAR-HF Einzelröhrchen RT-PCR-System von Stratagene (LaJolla, CA) wie oben beschrieben durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde in den ligationsfertigen Stratagene-Vektor pPCR-Script Amp SK+ kloniert, was den pPCR-SQD2-Vektor ergab. Das Insert wurde sequenziert, und die Sequenz erwies sich als identisch zu der zusammengebauten codierenden Sequenz, die für F7J8 200 (Zugangs-Nr. AL137189) vorhergesagt wurde.
b. Northern-Blot-Analyse
Gesamt-RNA, isoliert wie vorstehend beschrieben, wurde durch Agarosegelelektrophorese getrennt und auf Hybond N+(Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ)-Membranen geblottet, wobei Standardverfahren (Sambrook et al., 1989) verwendet wurden. Die Vorhybridisierung erfolgte in 15 ml Puffer, der 250 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4, 7% SDS, 1 mM EDTA, 1% BSA und 0,1 mg/ml denaturierte Heringssperma-DNA enthielt, für 5 Std. bei 65°C. Die Sonde wurde für 16 Std. in dem gleichen Puffer bei der gleichen Temperatur hybridisiert. Der Filter wurde bei der Hybridisierungstemperatur dreimal in 2 × SSC (Sambrook et al., 1989), einmal für 5 min und zweimal für 20 min gewaschen, gefolgt von einer Wäsche in 1 × SSC, 0,1% SDS für 10 min.
c. Expression von SQD1 und SQD2 in E. coli
Zum direkten Nachweis, dass SQD2 die Sulfolipid-Synthase codiert und zur Untersuchung, ob die beiden Proteine SQD1 und SQD2 von Arabidopsis die Biosynthesemaschinerie veranschaulichen, die für die Sulfolipid-Biosynthese in Pflanzen spezifisch ist, wurden diese beiden Gene in E. coli coexprimiert. Dieses Bakterium enthält gewöhnlich kein Sulfolipid. Eine verkürzte Version des SQD1-Proteins, dem das Chloroplast-Transit-Peptid fehlt, wurde vorher in E. coli exprimiert, und das gereinigte rekombinante Protein katalysierte die Bildung von UDP-Sulfochinovose aus UDP-Glucose, Sulfit und Diacylglycerin in vitro (Sanda et al., "Recombinant Arabidopsis SQD1 converts UDP-glucose and sulfite to the sulfolipid head precursor UDP-sulfoquinovose in vitro", J. Biol. Chem. 270: 25792-25797 (2001)). Zur Expression beider Proteine wurde eine ähnliche Strategie verfolgt, wie bei der Rekonstitution der Pflanzen-Galactolipid-Biosynthese in E. coli, (Dörmann et al., "Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1", Science 284: 2181-2184 (1999)). Folglich wurde das SQD2-Protein von einem zweiten Plasmid (pSQD2) exprimiert, das mit dem Plasmid kompatibel war, das das SQD1-Gen exprimierte (pSQD1).
Zur Expression von SQD2 wurde das BamHI/KpnI-Fragment von pPCR-SQD2 mit der transitpeptidcodierenden Sequenz im Raster in den Expressionsvektor pQE-32 von QIAGEN, Inc. (Valencia, CA) kloniert, so dass pSQD2 erhalten wurde. Die Expressionskassette, die das SQD1-Protein codiert, dem das N-terminale Transitpeptid mit 84 Aminosäuren fehlt, wurde mit XhoI/PvuII aus pSQD1-TP gespalten (Essigmann et al., 1998), und wurde in mit SalI/EcoRV gespaltenen pACYC-184 (Chang & Cohen "Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryp tic miniplasmid", J. Bacteriol., 134: 1141-1156 (1978)) ligiert, so dass pSQD1 erhalten wurde, das mit pSQD2 in E. coli kompatibel war. Beide Plasmide wurden in E. coli-Wirt XL1-Blue (Stratagene, LaJolla, CA) überführt und in der Anwesenheit von 100 μg/ml Ampicillin und 34 μg/ml Chloramphenicol selektiert. Eine 3 ml-Übernachtkultur (LB-Medium mit Antibiotika) wurde zentrifugiert, und die Zellen wurden in 10 ml des gleichen Mediums, jedoch mit 150 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Chloramphenicol gewaschen und resuspendiert. Die Kultur wurde für 2 Std. bei 37°C inkubiert. Die Expression aus den Plasmiden wurde durch Zugabe von Isopropyl-thio-β-D-galactosid, gefolgt von 3 Std. Inkubation bei 28°C vor der Analyse induziert.
d. Komplementations-Analyse
Das Insert von pPCR-SQD2 mit der codierenden Volllängen-Sequenz, einschließlich des Transitpeptids, wurde durch PCR mit den Primern 5'-AAG GTA CCA TGA CGA CTC TTT CTT CTA TA-3' (Seq.-ID.-Nr. 17) und 5'-AAT CTA GAC TAC ACG TTA CCT TCC GGT A-3' (Seq.-ID.-Nr. 18) amplifiziert. Dieses Fragment wurde in den binären Vektor pBI-NAR-Hyg (Becker, 1990; Essigmann et al., 1998) mit den KpnI- und XbaI-Stellen kloniert. Das resultierende Plasmid pBINAR-Hyg/SQD2 wurde zum Transformieren der sqd2-Mutante durch Vakuuminfiltration wie in Bechtold und Pelletier "In Plant Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration" in Arabidopsis Protocols, J. Martinez-Zapater & J. Salinas, Hrsg. (Humana Press: Totowa, NJ), S. 259-266 (1998) beschrieben verwendet. Transgene Pflanzen wurden in Gegenwart von Kanamycin (60 μg/ml) und Hygromycin B (25 μg/ml) auf MS-Medium ohne Saccharose selektiert.
e. Lipid- und Fettsäure-Analyse
Geerntete Blätter wurden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren, und die Lipide wurden wie vorstehend beschrieben extrahiert. (Siehe ebenfalls, Dörmann et al., "Isolation and characterization of an Arabidopsis mutant deficient in thylakoid lipid digalactosyldiacylglycerol", Plant Cell., 7: 1801-10 (1995)). Pelletierte E. coli-Zellen wurden auf die gleiche Weise extrahiert. Lipidextrakte wurden auf mit aktiviertem Ammoniumsulfat imprägnierten Silicagel-DC-Platten analysiert, wobei ein Lösungsmittel-System aus Aceton/Toluol/Wasser (91:30:6, Vol./Vol./Vol.) verwendet wurde. Die Lipide wurden mit Ioddampf oder mit zuckerempfindlichem α-Naphthol-Reagenz (Gage et al., "Comparison of sulfoquinovosyl diacylglycerol from spinach and the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides by fast atom bombardment tandem mass spectrometry", Lipids 27: 632-36 (1992)) sichtbar gemacht und durch Co-Chromatographie mit Lipidextrakten bekannter Zusammensetzung identifiziert. Für die quantitative Analyse wurden einzelne Lipide aus DC-Platten isoliert und zur Herstellung von Fettsäuremethylestern verwendet. Die Methylester wurden durch GLC mittels Myristinsäure als interner Standard quantifiziert (Rossak et al., "Accumulation of sulfoquinovosyl-1-O-dihydroxyacetone in a sulfolipid-deficient mutant of Rhodobacter sphaeroides inactivated in sqdC", Arch. Biochem. Biophys., 340: 219-30 (1997)). Für die Analyse von ³⁵S-markierten Lipiden wurden vier Blätter von 3 Wochen alten Pflanzen inmitten durch den Blattstiel geschnitten und der Blattstiel sofort nach unten in ein Polypropylen-Mikrozentrifugen-Röhrchen mit 100 μl einer wässrigen Lösung von trägerfreiem ³⁵S-Sulfat (3,7 MBq/ml; NEN Life Science Products, Boston, MA) überführt.
Die Lipide wurden nach 1 Std. Inkubation wie oben beschrieben extrahiert. Die Lipide wurden durch zweidimensionale DC wie vorstehend beschrieben (siehe ebenfalls Benning et al., 1995) getrennt und markierte Verbindungen wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Auf die gleiche Weise wurde E. coli, gezüchtet in M9-Medium (Sambrook et al., 1989) nur mit radioaktivem Sulfat, markiert und die Lipide wurden analysiert. Messungen über Massenspektroskopie mittels schnellem Atombeschuss (FAB-MS) von Sulfolipid erfolgten wie von Gage et al., 1992, beschrieben.
Beispiel 6
Bei diesem Beispiel wird ein Mittel für die anschließende Modifikation von UDP-SQ zur Produktion eines Alkylsulfochinovosids beschrieben. Die Synthese von Alkylsulfochinovosiden beginnt bei der hydrolytischen Spaltung von UDP-SQ. Sulfochinovose wird dann mit dem sauren Katalysator, Paratoluolsulfonsäure, in der Gegenwart des kurzkettigen Alkohols Butanol unter Rückfluss gehalten, so dass ein kurzkettiges Butylsulfochinovosid erhalten wird. Die Rückflusstemperatur ist 118°C. Mit der Bildung des niedersiedenden Butanol/Wassergemischs wird eine Dampftemperatur von 95 bis 110°C errichtet. Die Acetalisierung mit dem Butanol erfolgt unter leichtem Vakuum, d.h. unter einem Druck von 800 bis 950 mbar. Eine azeotrope Menge Butanol wird mit dem Wasser in dem Destillationsverfahren entfernt.
Das Butylsulfochinovosid wird anschließend unter Vakuum mit dem langkettigen Alkohol, n-Hexadecylalkohol, in der Gegenwart des sauren Katalysators behandelt, so dass ein langkettiges Sulfochinovosid erhalten wird. Zur Gewinnung eines geringen Gehalts an Butylsulfochinovosid wird die Entfernung von Butanol durch Destillation unter reduziertem Druck von unter 10 mbar und die Neutralisation des Katalysators vorzugsweise durch eine Zwischenzeit von bis zu etwa 1 Std. getrennt, in der das Reaktionsgemisch unter normalem Druck bei Temperaturen von 100 bis 115°C gerührt wird.
Im nächsten Schritt wird das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur unter 95°C gekühlt. Der saure Katalysator wird durch die Zugabe der Base NaOH und dann durch Einstellen des pH-Werts des neutralisierten Reaktionsgemischs auf einen pH-Wert von 8,5 neutralisiert. Nach dem Filtrieren des Reaktionsgemischs bei einer Temperatur von 80 bis 90°C wird überschüssiger Fettalkohol durch Destillation auf einen Gehalt unter 5 Gew.-% entfernt. Bei der Verwendung solcher Techniken muss die sogenannte Sumpftemperatur in einer Höhe gehalten werden, bei der das Alkylsulfochinovosid thermisch stabil ist (d.h. die Sumpftemperatur sollte einen Wert von 160°C nicht überschreiten). Das erhaltene Produkt hat einen hohen Gehalt an langkettigem Alkylsulfochinovosid und einen niedrigen Gehalt an Butylsulfochinovosid, Alkylmonosulfochinovosiden und ebenfalls Alyklpoly(oligo)sulfochinovosiden.
Das Beispiel 6 macht keine erfindungsgemäße Ausführungsform aus.
Beispiel 7
Klonierung und Sequenzierung des AtSQDX-Homologs
Ein Verständnis des Mechanismus ist zur Verwendung der vorliegenden Erfindung zwar nicht nötig, jedoch beschreibt dieses Beispiel Experimente, die dazu ausgelegt sind, AtSQDX-Homologa zu isolieren und die Aminosäure- und Nukleotidsequenzen zu bestimmen. Die bekannte genomische Sequenz, die das AtSQDX-Gen enthält, wird zur Erzeugung von Oligonukleotid-Sonden zur Klonierung des AtSQDX codierenden Gens verwendet (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, S. 16.7-16.8 (1989)). Die Sequenz wird isoliert und durch PCR amplifiziert (siehe beispielsweise Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY (1995) und U. S. Pat. Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,965,188). Nach der Reinigung wird die isolierte Sequenz in einen Expressionsvektor zur Transfektion in ein zellfreies prokaryotisches oder eukaryotisches Expressionssystem kloniert (siehe Ausubel, et al., Hrsg., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1992)). Nach der Expression wird das Protein isoliert und gereinigt. Das Protein kann dann zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden (siehe im Allgemeinen, Howard und Bethell, beispielsweise, Basic Methods in Antibody Production and Characterization, CRC Press, (2000)).
Alternativ werden präparative Reagenzien zur Isolation des spezifischen Ziels durch konjugierende Antikörper erzeugt, die aus Expression von Fragmenten der genomischen Sequenzen erzeugt werden, die bekanntlich die gewünschte Sequenz enthalten. Die Antikörper werden durch dem Fachmann bekannte Verfahren erzeugt (siehe im Allgemeinen, Howard und Bethell, beispielsweise, Basic Methods in Antibody Production and Characterization, CRC Press, (2000)), so dass anti-AtSQDX-Antikörper erzeugt werden. Die Antikörper werden an Agarosekügelchen konjugiert. Zudem wird ein paralleles Konjugat von Agarosekügelchen an ein Kontroll-Immunglobulin erstellt. Ultrazentrifugierte Zelllysate aus der gewünschten Zelllinie werden den Kontroll-Nicht-Immun-Ikonjugierten Kügelchen ausgesetzt, um nichtspezifisch bindende Proteine zu entfernen. Das ungebundene Lysat wird gewonnen und wird dann den AntiAtSQDX-Antikörper konjugierten Agarosekügelchen für eine direkte Affinitätsreinigung ausgesetzt. Der Anti-AtSQDX-Antikörper/AtSQDX-Komplex wird mit 2,5 M KCl gewaschen, um nicht-spezifisch gebundene Materialien zu entfernen, und das AtSQDX wird dann aus den Agarosekügelchen mit 0,1 M Glycin-HCl in der Gegenwart von 0,5 M NaCl eluiert. Das eluierte Material aus der Säule wird mit 1 M Tris pH-Wert 8,0 neutralisiert, ausgiebig dialysiert, so dass die Salzkonzentration auf 150 mM reduziert wurde und dann wieder auf konzentriert. Das wieder aufkonzentrierte Material wird auf SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen für eine endgültige Reinigung auf der Basis der Molekülgröße untergebracht. Dieses Material wird auf eine Membran für Elektrospray-Tandem-Massenspektroskopie-Analyse der Aminosäuresequenz überführt. Diese letztere Sequenz wird zur Herstellung von Oligonukleotid-Sonden zur Klonierung des Gens verwendet, das AtSQDX codiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Produktion von Sulfochinovosyldiacylglycerin, umfassend: a. das Bereitstellen: i. eines ersten Expressionsvektors, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, wobei diese die durch A 170 bis A 1603 in der SEQ ID NO:5 definierte Sequenz umfasst; ii. eines zweiten Expressionsvektors, umfassend die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 4; sowie iii. einer Wirtszelle; b. das Transfizieren der Wirtszelle mit dem ersten und dem zweiten Vektor, wodurch eine transformierte Wirtszelle erzeugt wird, wobei die transformierte Wirtszelle unter solchen Bedingungen kultiviert wird, dass diese Sulfochinovosyldiacylglycerin produziert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Wirtszelle um eine Bakterienwirtszelle handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei der Bakterienwirtszelle um E. coli handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem ersten und dem zweiten Vektor um Plasmide handelt, die der transformierten Wirtszelle eine unterschiedliche Antibiotikaresistenz verleihen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Wirtszelle um eine pflanzliche Wirtszelle handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die pflanzliche Wirtszelle aus einer monokotyledonen Pflanze stammt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die pflanzliche Wirtszelle aus einer dikotyledonen Pflanze stammt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die pflanzliche Wirtszelle Teil eines Pflanzengewebes ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Pflanzengewebe ausgewählt ist aus der Gruppe Wurzeln, Schößlinge, Blätter, Pollen, Samen und Tumorgewebe.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die pflanzliche Wirtszelle in Gewebekultur vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei der pflanzlichen Wirtszelle um eine Embryonalzelle handelt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Embryonalzelle um einen Protoplasten handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Protoplast aus einem Genus, ausgewählt aus der Gruppe Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciohorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Herecocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum und Datura, stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Transfizieren die Verwendung von Agrobacterium umfasst.
Transformierte Wirtszelle, umfassend einen die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID No: 4 umfassenden Expressionsvektor.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 15, ferner umfassend einen weiteren, die durch A 170 bis A 1603 in der SEQ ID NO: 5 definierte Nukleinsäuresequenz umfassenden Expressionsvektor.