DE60121219T2 - Verfahren zum Nachweis von Homo-oder Heterozygotie eines Organismus unter Verwendung markerter Primer und RFLP - Google Patents

Verfahren zum Nachweis von Homo-oder Heterozygotie eines Organismus unter Verwendung markerter Primer und RFLP Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit eines oder mehrerer Nukleotide in einer Ziel-Nukleotidsequenz. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Assay für die Gegenwart oder Abwesenheit einer bestimmten Mutation oder eines bestimmten Polymorphismus in einer Ziel-Nukleotidsequenz. Noch genauer verbindet die vorliegende Erfindung differenzielle Hybridisierung oder Restriktionsendonukleaseverdau mit entweder immobilisierter Array-Technologie oder elektrophoretischer Trennung, um die Gegenwart oder Abwesenheit einer Mutation oder eines Polymorphismus in einer Ziel-Nukleotidsequenz zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Kit zur Erleichterung der Durchführung des diagnostischen Assays sowie Mittel, und genauer Datenverarbeitungs-unterstützte Mittel, zur Automatisierung oder teilweisen Automatisierung der Durchführung des diagnostischen Assays bereit.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Durch die zunehmende Verbesserung der rekombinanten DNA-Technologie werden Forschung und Entwicklung im Bereich der Medizin, Tiermedizin, Landwirtschaft und Gartenbauindustrie wesentlich vereinfacht. Dies gilt besonders für den Bereich der Diagnostik menschlicher Erkrankungszustände.
  • Mit dem Erreichen eines besseren Verständnisses der Genetik und durch die Fertigstellung oder fast erreichte Fertigstellung der Sequenzanalyse des Genoms einer Reihe von Tieren und Säugern einschließlich Menschen und einer Reihe von Mikroorganismen ergeben sich bessere Möglichkeiten für die Entwicklung von diagnostischen Assays für eine umfangreiche Auswahl von genetisch bedingten Erkrankungen.
  • Diagnostische Techniken auf Grundlage von Nukleinsäure-Hybridisierung sind in ihrer Fähigkeit, genetisches Material bestimmter Organismen oder Gruppen von genetisch verwandten Organismen zu identifizieren und zu quantifizieren, unvergleichlich. Die Bereitstellung von DNA-Array-Techniken im Mikroformat (Mikroarray) ermöglicht heute für diese Art der genbasierten Analyse eine Geschwindigkeits- und Spezifitätszunahme um "Größenordnungen". Es kann beispielsweise auf Southern (WO 89/10977; US-Patent Nr. 6,045,270), Chee et al. (US-Patent Nr. 5,837,832), Cantor et al. (US-Patent Nr. 6,007,987) und Fodor et al. (US-Patent Nr. 5,871,928) verwiesen werden.
  • Bis vor kurzem wurden die in Nukleinsäure-Hybridisierungen verwendeten Nukleinsäuresonden hauptsächlich empirisch, durch Isolieren von Nukleinsäurefragmenten aus Ziel-Organismen oder Genen, erhalten. Heute ist es jedoch möglich, Nukleinsäuresonden unter Verwendung von Daten aus den internationalen Sequenzdatenbanken (z.B. aus den GenBank- und EMBL-Datenbanken) zu entwerfen und zu synthetisieren. Diese Datenbanken bekannter Gensequenzen haben über viele Jahre alle fünf Jahre um das Zehnfache an Umfang zugenommen und enthalten heute eine repräsentative Probe der meisten Gene und der meisten Hauptgruppen von Organismen.
  • Im Allgemeinen verwenden DNA-Mikroarrays Tupfen (Spots) von Detektor-Oligonukleotiden oder Sonden, die in Arrays auf einem festen Träger, typischerweise einem Glaswafer, angeordnet sind. Man lässt die Sonden mit Proben-Nukleinsäuren hybridisieren, welche die Ziel-Nukleinsäuren enthalten und welche Fluoreszenz-markiert wurden. Die Hybridisierung der Sonden und Ziel-Nukleinsäuren der Probe erfolgt unter Bedingungen, bei denen nur eine genaue oder fast genaue Komplementarität zwischen den Sonden und den Ziel-Nukleinsäuren detektiert wird. Wenn eine Ziel-Nukleinsäure eine bestimmte Sonde in dem Array komplementiert und mit dieser hybridisiert, so wird der Spot fluoreszieren. Die Aufzeichnung der Fluoreszenz der Spots ermöglicht es, zu beurteilen, welche Ziel-Sequenzen in dem Nukleinsäuregemisch vorhanden sind.
  • Von natürlichen RNA- oder DNA-Molekülen gewonnene Sequenzinformationen werden dazu verwendet, die Sequenz der synthetisierten Oligonukleotid-Sonden zu bestimmen und diese Informationen werden üblicherweise in Computerdatenbanken gespeichert und unter Verwendung von Software verarbeitet. Jede Sonde wird so synthetisiert, dass sie Nukleotide in einer Abfolge (Sequenz) enthält, die zu einem Teil einer bekannten natürlichen Nukleotidsequenz oder dem Gegenstück eines Teils dieser Sequenz passt. Oligonukleotid-Sonden, die in herkömmlichen Arrays verwendet werden, weisen typischerweise eine Länge von 10–25 Nukleotiden auf.
  • Gegenwärtig werden Nukleotid-Sonden am häufigsten in Mikroarrays verwendet, um die mRNA-Transkripte von Genen zu identifizieren und zu quantifizieren. Diese Mikroarrays enthalten üblicherweise Sonden, die verschiedene unterschiedliche Ziel-Sequenzen aus jeder Gensequenz repräsentieren, und diese Sonden werden üblicherweise so gewählt, dass sie zielspezifisch sind (d.h. dass sie nur mit einem Ziel-Polynukleotid hybridisieren). Diese Mikroarrays enthalten somit eine viel größere Anzahl an Sonden, als die Anzahl an Ziel-Polynukleotiden, für deren Bestimmung sie konzipiert sind.
  • WO 99/31272 beschreibt Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines SNP durch Amplifizierung und Spaltung einer Restriktionsschnittstelle. Es werden verschiedene PCR-basierte Verfahren beschrieben. WO 98/53098 beschreibt Verfahren zur Bestimmung von Mutationen unter Verwendung von Restriktionsverdau amplifizierter DNA.
  • Im Vergleich zu herkömmlichen Nukleinsäure-Analysetechniken einschließlich Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus-Analyse (RFLP) und Polymerasekettenreaktion (PCR) stellen DNA-Mikroarrays ein einfaches und schnelles Mittel zur Bestimmung und Messung der Expression verschiedener Gene bereit. Sie wurden auch verwendet, um Varianten von gut charakterisierten Nukleinsäure-Molekülen nachzuweisen (d.h. um genetische Polymorphismen und Genotypen zu bestimmen). Trotz ihrer erhofften Eignung als Werkzeug zur Diagnose von Infektionserkrankungen und genetischen Erkrankungen scheint die Entwicklung von Mikroarrays für die Routinediagnostik jedoch nur langsam zu erfolgen. Dies ist möglicherweise auf die relativ hohen Kosten für Entwurf, Entwicklung und Produktion von Mikroarrays, die eine größere Anzahl von Ziel-Polynukleotiden bestimmen könnten, zurückzuführen. Es sind daher neue Verfahren und Reagenzien notwendig, um diese Hoffnung umzusetzen, und die vorliegende Erfindung trägt dazu bei, dieses Erfordernis zu erfüllen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder ein verbessertes Assay-System entwickelt, das Veränderungen in Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz leicht identifizieren kann, und mit dem leicht bestimmt werden kann, ob die Mutation oder der Polymorphismus in homozygoter oder heterozygoter Form vorliegt. Der Assay der vorliegenden Erfindung besitzt eine breite Anwendbarkeit für eine Reihe von genetischen Untersuchungen bei Menschen, Tieren, Mikroorganismen und Pflanzen. Der vorliegende Assay ist besonders in Mikroarray-basierten Assay-Verfahren nützlich. Außerdem können viele einzelne Subjekte mit demselben Mikroarray analysiert werden, was eine genetische Untersuchung in großem Maßstab auf kostengünstige Art und Weise ermöglicht.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In dieser Beschreibung soll, sofern sich aus dem Zusammenhang nicht etwas anderes ergibt, das Wort "umfassen" oder Variationen wie "umfasst" oder "umfassend" bedeuten, dass ein angegebenes Element oder eine ganze Zahl oder Gruppen von Elementen oder ganzen Zahlen enthalten ist, dass aber beliebige andere Elemente oder ganze Zahlen oder Gruppen von Elementen oder ganzen Zahlen nicht ausgeschlossen sind.
  • Nukleotid- und Aminosäuresequenzen werden durch eine Sequenzidentifikationsnummer (SEQ ID NO:) bezeichnet. Die SEQ ID-Nummern entsprechen numerisch den Sequenz-Identifikatoren <400>1, <400>2, etc. Ein Sequenzprotokoll wird nach den Ansprüchen bereitgestellt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit eines bestimmten Nukleotids oder einer Gruppe von Nukleotiden in einer Ziel-Sequenz bereit. Der Assay umfasst die Auswahl oder Erzeugung von Vorwärts- und Rückwärts-Amplifikationsprimern, die in einer Ausführungsform optional beide oder einfach mit Reportermolekülen markiert sind, die im Stande sind, separate identifizierbare Signale bereitzustellen, d.h. Signale, die voneinander unterschieden werden können. Alternativ wird die Amplifikation unter Verwendung von nicht markierten Primern durchgeführt und die Bestimmung wird durch Hybridisierung einer Sonde durchgeführt, die an ihren 5'- und 3'-Enden unterschiedlich markiert ist. Gemäß einem Aspekt umfasst wenigstens eines der Paare von Primern weiterhin tag-Sequenzen, die an einem festen Träger immobilisierte sinnige und komplementäre Sequenzen aufweisen. Außerdem können ein oder beide Primer innerhalb der Ziel-Sequenz eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einfügen oder entfernen, in Abhängigkeit von der Gegenwart oder Abwesenheit einer Mutation, die bestimmt werden soll. Alternativ können die Primer unterschiedlich an eine Ziel-Sequenz hybridisieren. Im Anschluss an die Amplifikation, die dazu dient, die tag-Sequenz, falls vorhanden, und Reportermoleküle einzuführen und in einer Ausführungsform eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einzuführen oder aufzuheben, wird das amplifizierte Produkt mit dem Enzym verdaut, dessen Schnittstelle eingeführt oder aufgehoben wurde, und die einzelsträngigen Formen werden Bedingungen für eine Immobilisierung auf dem festen Träger unterzogen. Die Gegenwart oder Abwesenheit der Mutation oder des Polymorphismus bestimmt, ob die Restriktionsendonuklease die Ziel-Sequenz verdaut und dadurch wird wiederum beeinflusst, ob die Reportermoleküle an den jeweiligen Primern an den eingefangenen amplifizierten Produkten vorhanden sind oder nicht. Aufgrund der unterschiedlichen Art der durch die Reportermoleküle erzeugten Signale kann eine Bestimmung hinsichtlich der Gegenwart oder Abwesenheit der Mutation oder des Polymorphismus durchgeführt werden. Eine bestimmte Form dieser Ausführungsform ist in 1 gezeigt. In einer anderen Ausführungsform wird der differenzielle Restriktionsendonuklease-Verdau elektrophoretisch bestimmt. In dieser Ausführungsform kann die tag-Sequenz noch vorhanden sein, sie wird für die elektrophoretische Trennung jedoch nicht benötigt. In einer bestimmten Ausführungsform werden Amplifikationsprimer verwendet, an die keinerlei Reportermoleküle angebunden sind. In einer weiteren Ausführungsform umfassen einer oder beide der Primer chemisch modifizierte Basen, Nukleotide oder Phosphatverknüpfungen, welche den Strang resistent gegenüber Exonukleaseverdau machen. Dies erlaubt die Erzeugung von einzelsträngigen DNA-Molekülen. Die Gegenwart oder Abwesenheit einer Restriktionsendonuklease-Schnittstelle wird anschließend durch Hybridisierung eines Sondenmoleküls, das zwei verschiedene Reportermoleküle umfasst, an eine Region, welche die mutmaßliche Restriktionsschnittstelle umfasst, bestimmt. Diese teilweise doppelsrängige DNA wird anschließend Restriktionsendonuklease-Verdau unterzogen und wie oben analysiert. Eine Form dieser bestimmten Ausführungsform ist in 4 gezeigt.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei jeder der Primer mit einem Reportermolekül markiert ist, das im Stande ist, die Bereitstellung eines identifizierbaren Signals zu erleichtern, das vom jeweils anderen unterschieden werden kann, und wobei wenigstens ein Primer oder seine komplementäre Form eine komplementäre Sequenz zu einer Oligonukleotidsequenz umfasst, die an einem festen Träger verankert ist, und wobei einer oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Gegenwart oder Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt oder aufhebt;
    Verdau des amplifizierten Produkts mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkts potenziell eingeführt oder aufgehoben worden ist, und Hybridisierung einzelsträngiger Formen des amplifizierten und verdauten Produkts unter Bedingungen, die eine Anheftung an einen Satz der immobilisierten Oligonukleotide erlauben, die Oligonukleotide umfassen, die zu einem von mindestens einem Primer eingeführten Abschnitt der amplifizierten Sequenz sinnig oder komplementär sind; und
    Detektion der relativen Anteile der Signale der Reportermoleküle, wobei gleiche Anteile verschiedener Signale oder die substanzielle Gegenwart von nur einem Signal eine homozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz und die Gegenwart eines differenziellen Signals eine heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz bedeuten.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz, wobei das Verfahren umfasst:
    Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei ein Primer ein oder mehrere chemisch modifizierte Nukleotide, Basen oder Phosphodiesterbindungen enthält, so dass ein Nukleotidstrang, der sich von diesem Primer erstreckt, gegenüber Exonukleaseaktivität im Wesentlichen resistent ist und der andere Primer eine Nukleotidsequenz umfasst, die zu der Sequenz eines auf einem festen Träger immobilisierten Oligonukleotids identisch oder komplementär ist, und wobei einer oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Gegenwart oder Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt oder aufhebt;
    Verdau des amplifizierten Produkts mit einer Exonuklease zum Verdau des nicht von dem die Exonuklease-resistenten Nukleotide, Basen oder Phosphodiesterbindungen enthaltenden Primer amplifizierten Stranges, um ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül zu erzeugen, das die potenzielle Gegenwart oder Abwesenheit einer Restriktionsendonuklease-Schnittstelle und eine zu einer auf einem festen Träger immobilisierten Oligonukleotidsequenz komplementäre Nukleotidsequenz umfasst;
    Hybridisierung einer Sonde mit dem einzelsträngigen Nukleinsäuremolekül, die eine Komplementarität zu der Restriktionsschnittstelle aufweist, die eingeführt worden sein kann, um ein teilweise doppelsträngiges Molekül zu erzeugen, wobei die Sonde zwei Reportermoleküle umfasst, die im Stande sind, die Bereitstellung identifizierbarer Signale, die voneinander unterschieden werden können, zu erleichtern;
    Verdau des teilweise doppelsträngigen Moleküls mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potenziell eingeführt oder aufgehoben worden ist, und Hybridisierung des verdauten Moleküls unter Bedingungen, die eine Anheftung an einen Satz der immobilisierten Oligonukleotide erlauben, die Oligonukleotide umfassen, die zu einem von mindestens einem Primer eingeführten Abschnitt der amplifizierten Sequenz sinnig oder komplementär sind; und
    Detektion des relativen Anteils der Signale der Reportermoleküle, wobei gleiche Anteile verschiedener Signale oder die substanzielle Gegenwart von nur einem Signal eine homozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz und die Gegenwart eines differenziellen Signals eine heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz bedeuten.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz, wobei das Verfahren umfasst:
    Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei jeder der Primer mit einem Reportermolekül markiert ist, das im Stande ist, die Bereitstellung eines identifizierbaren Signals zu erleichtern, das vom jeweils anderen unterschieden werden kann, und wobei ein oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Gegenwart oder Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt oder aufhebt; und
    Verdau des amplifizierten Produkts mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potenziell eingeführt oder aufgehoben worden ist, und Behandeln des Moleküls, das dem Verdau unterzogen wurde, unter Bedingungen, die eine elektrophoretische Trennung der verdauten Produkte erlauben, wobei das Muster der elektrophoretischen Trennung und/oder das Muster der Reportermolekülsignalgebung ein Anzeichen für die homozygote Gegenwart oder Abwesenheit oder die heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Sequenz ist.
  • Ebenfalls offenbart ist ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz, wobei das Verfahren beispielsweise umfasst, aber nicht darauf begrenzt ist:
    Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei einer oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Gegenwart oder Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt oder aufhebt; und
    Verdau des amplifizierten Produkts mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potenziell eingeführt oder aufgehoben worden ist, und Behandlung des amplifizierten Produkts, das dem Verdau unterzogen wurde, unter Bedingungen, die eine elektrophoretische Trennung der verdauten Produkte erlauben, wobei das Muster der elektrophoretischen Trennung und/oder das Muster der Reportermolekülsignalgebung ein Anzeichen für die homozygote Gegenwart oder Abwesenheit oder die heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Sequenz ist.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei jeder der Primer mit einem Reportermolekül markiert ist, das im Stande ist, die Bereitstellung eines identifizierbaren Signals zu erleichtern, das vom jeweils anderen unterschieden werden kann, und wobei mindestens ein Primer oder seine komplementäre Form eine komplementäre Sequenz zu einer Oligonukleotidsequenz umfasst, die an einem festen Träger verankert ist, und wobei einer oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt;
    Verdau des amplifizierten Produkts mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potenziell eingeführt oder aufgehoben worden ist, und Hybridisierung einzelsträngiger Formen des amplifizierten und verdauten Produkts unter Bedingungen, die eine Anheftung an einen Satz der immobilisierten Oligonukleotide erlauben, die Oligonukleotide umfassen, die zu einem Teil mindestens einer Primersequenz oder zu deren komplementärer Sequenz komplementär sind; und
    Detektion der relativen Anteile der Signale der Reportermoleküle, wobei gleiche Anteile verschiedener Signale oder die substanzielle Gegenwart von nur einem Signal eine homozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz und die Gegenwart eines differenziellen Signals eine heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz bedeuten.
  • Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft eine Assay-Vorrichtung zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit eines Nukleotids oder einer Gruppe von Nukleotiden in einem Nukleinsäuremolekül, welche umfasst: einen Array von immobilisierten Oligonukleotiden, die jeweils komplementär zu einer Nukleotidsequenz innerhalb eines amplifizierten Produkts sind, das durch eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen verdaut worden ist, und Mittel zum Screening nach der Hybridisierung einer Ziel-Sequenz an das immobiliserte Oligonukleotid-Array.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist eine diagrammartige Darstellung des genetischen Assays zur Bestimmung der homozygoten Gegenwart oder Abwesenheit oder der Gegenwart in heterozygoter Form der 35ΔG-Mutation in dem Connexin 26-Gen.
  • 2 ist eine diagrammartige Darstellung, welche (A) die Wildtyp (WT)-Ziel-Sequenz für die genetische Untersuchung auf cystische Fibrose; (B) die WT-Sequenz, die zwei A → C-Substitutionen enthält, wodurch eine XcmI-Schnittstelle erzeugt wird; (C) eine CTT-Deletion, welche die XcmI-Schnittstelle zerstört, aber eine BstXI-Schnittstelle erzeugt, zeigt.
  • 3 ist eine photographische Darstellung, welche die elektrophoretische Trennung von amplifizierten Produkten im Anschluss an die Amplifikation von DNA zeigt, die mutmaßlich für eine ΔF508-Mutation codiert. Die Ziel-Sequenz ist in <400>2 dargestellt (Beispiel 4). X, XcmI; B, BstXI; m, Marker, N/N, homozygot normal; ΔF508/ΔF508, homozygote Mutation; N/ΔF508, heterozygote Mutation.
  • 4 ist ein Diagramm eines genetischen Assays zur Bestimmung der homozygoten Gegenwart oder Abwesenheit oder der Gegenwart in heterozygoter Form einer 35ΔG-Mutation in dem Connexin 26-Gen. Dies ist eine modifizierte Version des in 1 beschriebenen Verfahrens. Das Verfahren verwendet eine zweifach markierte Sonde, die an eine gespaltene einzelsträngige DNA angeheftet ist.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung stellt u.a. einen genetischen Assay zur Bestimmung der heterozygoten Gegenwart oder Abwesenheit eines bestimmten Nukleotids oder einer bestimmten Sequenz von Nukleotiden und zur Bestimmung, ob ein bestimmtes Nukleotid oder eine bestimmte Nukleotidsequenz in heterozygoter Form vorliegt, bereit.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei jeder der Primer mit einem Reportermolekül markiert ist, das im Stande ist, die Bereitstellung eines identifizierbaren Signals zu erleichtern, das vom jeweils anderen unterschieden werden kann, und wobei mindestens ein Primer oder seine komplementäre Form eine komplementäre Sequenz zu einer Oligonukleotidsequenz umfasst, die an einem festen Träger verankert ist, und wobei einer oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Gegenwart oder Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt oder aufhebt;
    Verdau des amplifizierten Produkts mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potenziell eingeführt oder aufgehoben worden ist, und Hybridisierung einzelsträngiger Formen des amplifizierten und verdauten Produkts unter Bedingungen, die eine Anheftung an einen Satz der immobilisierten Oligonukleotide erlauben, die Oligonukleotide umfassen, die zu einem von mindestens einem Primer eingeführten Abschnitt der amplifizierten Sequenz sinnig oder komplementär sind; und
    Detektion der relativen Anteile der Signale der Reportermoleküle, wobei gleiche Anteile verschiedener Signale oder die substanzielle Gegenwart von nur einem Signal eine homozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz und die Gegenwart eines differenziellen Signals eine heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz bedeuten.
  • Differenzieller Restriktionsendonukleaseverdau kann elektrophoretisch bestimmt werden.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz, wobei das Verfahren umfasst:
    Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei jeder der Primer mit einem Reportermolekül markiert ist, das im Stande ist, die Bereitstellung eines identifizierbaren Signals zu erleichtern, das vom jeweils anderen unterschieden werden kann, und wobei ein oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Gegenwart oder Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt oder aufhebt; und
    Verdau des amplifizierten Produkts mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potenziell eingeführt oder aufgehoben worden ist, und Behandlung des verdauten amplifizierten Produkts unter Bedingungen, die eine elektrophoretische Trennung der verdauten Produkte ermöglichen, wobei das Muster der elektrophoretischen Trennung und/oder das Muster der Reportermolekülsignalgebung ein Anzeichen für die homozygote Gegenwart oder Abwesenheit oder die heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Sequenz ist.
  • In einer verwandten Ausführungsform, bei der eine elektrophoretische Trennung durchgeführt wird, sind die Amplifikationsprimer nicht mit einem Reportermolekül und/oder einer tag-Sequenz markiert. Gemäß dieser Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz, wobei das Verfahren umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist:
    Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei einer oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Gegenwart oder Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt oder aufhebt; und
    Verdau des amplifizierten Produkts mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potenziell eingeführt oder aufgehoben worden ist und Behandlung des amplifizierten Produkts, das einem Verdau unterzogen wurde, unter Bedingungen, die eine elektrophoretische Trennung der verdauten Produkte ermöglichen, wobei das Muster der elektrophoretischen Trennung ein Anzeichen für die homozygote Gegenwart oder Abwesenheit oder die heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Sequenz ist.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst sowohl die Einführung einer Restriktionsschnittstelle als auch die Aufhebung einer Restriktionsschnittstelle, obwohl die Einführung einer Restriktionsschnittstelle, beispielsweise in eine Wildtyp- oder "nicht mutierte" Sequenz, bevorzugt ist.
  • Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei jeder der Primer mit einem Reportermolekül markiert ist, das im Stande ist, die Bereitstellung eines identifizierbaren Signals zu erleichtern, das vom jeweils anderen unterschieden werden kann, und wobei mindestens ein Primer oder seine komplementäre Form eine komplementäre Sequenz zu einer Oligonukleotidsequenz umfasst, die an einem festen Träger verankert ist, und wobei ein oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt;
    Verdau des amplifizierten Produkts mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potenziell eingeführt worden ist, und Hybridisierung einzelsträngiger Formen des amplifizierten und verdauten Produkts unter Bedingungen, die eine Anheftung an einen Satz der immobilisierten Oligonukleotide erlauben, die Oligonukleotide umfassen, die zu einem Teil jeder Primersequenz oder zu deren komplementärer Sequenz komplementär sind; und
    Detektion der relativen Anteile der Signale der Reportermoleküle, wobei gleiche Anteile verschiedener Signale oder die substanzielle Gegenwart von nur einem Signal eine homozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz und die Gegenwart eines differenziellen Signals eine heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz bedeuten.
  • Elektrophoretische Trennung kann verwendet werden, um differenziellen Restriktionsendonukleaseverdau zu bestimmen.
  • Die Restriktionsschnittstelle kann entweder durch den Vorwärtsprimer oder durch den Rückwärtsprimer eingeführt oder aufgehoben werden. In einer besonders nützlichen Ausführungsform wird der Vorwärtsprimer verwendet, um eine Restriktionsschnittstelle einzuführen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz, wobei das Verfahren umfasst:
    Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei die Primer mit einem Reportermolekül markiert sind, das im Stande ist, die Bereitstellung eines identifizierbaren Signals zu erleichtern, das vom jeweils anderen unterschieden werden kann, und wobei mindestens ein Primer oder seine komplementäre Form eine komplementäre Sequenz zu einer Oligonukleotidsequenz umfasst, die an einem festen Träger verankert ist und wobei der Vorwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt;
    Verdau des amplifizierten Produkts mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potenziell eingeführt worden ist, und Hybridisierung einzelsträngiger Formen des amplifizierten Produkts unter Bedingungen, die eine Anheftung an einen Satz der immobilisierten Oligonukleotide erlauben, die Oligonukleotide umfassen, die zu einem Teil der wenigstens einen Primersequenz oder deren komplementären Sequenz komplementär sind; und
    Detektion der relativen Anteile der Signale der Reportermoleküle, wobei gleiche Anteile verschiedene Signale oder die substanzielle Gegenwart von nur einem Signal eine homozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz und die Gegenwart eines differenziellen Signals eine heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz bedeuten.
  • Die Ziel-Sequenz kann mit einem nicht markierten Satz von Primern amplifiziert werden. Dies ist besonders nützlich für Assays, die auf einer elektrophoretischen Detektion beruhen (z.B. für cystische Fibrose). Alternativ werden wiederum unmarkierte Primer verwendet, aber einer der Primer umfasst ein oder mehrere Nukleotide, die auf Nukleotid- oder Basenebene chemisch modifiziert sind oder bei denen die Phosphodiesterbindung so modifiziert ist, dass Beständigkeit gegenüber einer Exonuklease erreicht wird. Eine "chemisch modifizierte" Base oder Nukleotid umfasst ein chemisches Analogon eines Nukleotids oder einer Base. Ein Beispiel für eine chemische Modifikation ist eine Phosphorothioat-Modifikation oder eine Propin-Modifikation. Im Wesentlichen umfasst die chemische Modifikation jede beliebige Modifikation, durch welche die Funktion einer Exonuklease im Wesentlichen gehemmt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die chemische Modifikation eine Phosphorothioat-Modifikation.
  • Die Primer werden außerdem so ausgewählt, dass der eine oder der andere der Primer wie oben beschrieben eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt oder aufhebt. Ferner trägt, wie oben, wenigstens einer der Primer eine Sequenz von Nukleotiden, die eine Sequenz aufweisen, die zu einem an einem festen Träger immobilisierten Oligonukleotid sinnig oder komplementär ist.
  • Nach der Amplifikation wird das resultierende Amplikon einem Exonukleaseverdau unterzogen. Ein DNA-Strang, der den Primer mit einem oder mehreren chemisch modifizierten Nukleotiden, Basen oder Phosphodiester-Bindungen umfasst, ist im Allgemeinen immun gegenüber Exonukleasespaltung. Entsprechend verdaut die Exonuklease nur den komplementären Strang, wobei eine einzelsträngige DNA zurückbleibt, die eine eingeführte oder aufgehobene Restriktionsschnittstelle umfasst und eine Nukleotidsequenz, die identisch oder komplementär zu der Sequenz in einem an einem festen Träger immobilisierten Oligonukleotid ist. Die einzelsträngige Nukleotidsequenz wird anschließend mit einer Nukleotidsonde in Kontakt gebracht, die eine Komplementarität zu der Restriktionsschnittstelle, die eingeführt worden sein kann, enthält. Die Sonde umfasst zwei Reportermoleküle, vorzugsweise an ihren 5'- und 3'-Enden, und hybridisiert an einen Bereich, der die eingeführte oder aufgehobene Restriktionsendonuklease-Schnittstelle beinhaltet. Diese Hybridisierung führt zu einem teilweise doppelsträngigen Molekül. Dieses Molekül wird anschließend Bedingungen für einen Verdau unterzogen. Abhängig davon, ob die Restriktionsendonuklease-Schnittstelle aufgehoben wurde oder nicht, entscheidet sich, ob die Sonde gespalten wird oder nicht. Ein Aspekt dieses Verfahrens ist in 4 beschrieben.
  • Entsprechend umfasst ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz, wobei das Verfahren umfasst:
    Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei ein Primer ein oder mehrere chemisch modifizierte Nukleotide, Basen oder Phosphodiesterbindungen umfasst, so dass ein Nukleotidstrang, der sich von dem Primer erstreckt, im Wesentlichen resistent gegenüber Exonukleaseaktivität ist, und wobei der andere Primer eine Nukleotidsequenz umfasst, die identisch oder komplementär zu der Sequenz eines an einem festen Träger immobilisierten Oligonukleotids ist und wobei ein oder mehrere Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Gegenwart oder Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt oder aufhebt;
    Verdau des amplifizierten Produkts mit einer Exonuklease, um den nicht durch den Primer, der die Exonuklease-resistenten Nukleotide, Basen oder Phosphodiesterbindungen umfasst, amplifizierten Strang zu verdauen, um ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül zu erzeugen, das die potenzielle Gegenwart oder Abwesenheit einer Restriktionsendonuklease-Schnittstelle und eine Nukleotidsequenz, die zu einer an dem festen Träger immobilisierten Oligonukleotidsequenz komplementär ist, umfasst;
    Hybridisierung des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls an eine Sonde, die eine Komplementarität zu der Restriktionsschnittstelle, die eingeführt worden sein kann, beinhaltet, um ein teilweise doppelsträngiges Molekül zu erzeugen, wobei die Sonde zwei Reportermoleküle umfasst, die im Stande sind, die Bereitstellung von identifizierbaren Signalen zu erleichtern, die voneinander unterschieden werden können;
    Verdau des doppelsträngigen Moleküls mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potenziell eingeführt oder aufgehoben worden ist, und Behandlung des verdauten Moleküls unter Bedingungen, die eine Anheftung an einen Satz der immobilisierten Oligonukleotide erlauben, die Oligonukleotide umfassen, die zu einem von mindestens einem Primer eingeführten Abschnitt der amplifizierten Sequenz sinnig oder komplementär sind; und
    Detektion der relativen Anteile der Signale der Reportermoleküle, wobei gleiche Anteile verschiedene Signale oder die substanzielle Gegenwart von nur einem Signal eine homozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz und die Gegenwart eines differenziellen Signals eine heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz bedeuten.
  • Die Ziel-Nukleotidsequenz befindet sich im Allgemeinen in einer eukaryotischen Zelle wie beispielsweise einer Säugerzelle (einschließlich einer Menschen-, Primaten-, Vieh-, Laborversuchstier- oder Haustierzelle) oder einer Pflanzenzelle. In einer besonders nützlichen Ausführungsform befindet sich die Ziel-Nukleotidsequenz in einer menschlichen Zelle. Ferner umfasst die Ziel-Nukleotidsequenz im Allgemeinen eine Nukleotidsequenz, beispielsweise eines strukturellen Gens oder eines regulatorischen Gens oder 3'- oder 5'-regulatorische Nukleotidsequenzen oder Promotorsequenzen, die mit einem bestimmten Erkrankungszustand im Zusammenhang stehen. Erkrankungszustände, die durch diesen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst werden, beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf Erkrankungszustände im Zusammenhang mit einer oder mehreren Mutationen in einem Gen oder einer genetischen Sequenz oder in mehreren bekannten Genen oder Gensequenzen. Beispiele für Erkrankungszustände, deren Detektion hierin umfasst ist, beinhalten metabolische Störungen, wie beispielsweise Adreno-Leukodystrophie, Atherosklerose, Gaucher-Syndrom, Atropia gyrata, jugendlicher Diabetes, Fettsucht, paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie, Phenylketonurie, Morbus Refsum, Tangier-Krankheit und Hämochromatose-Zustände, an denen Transporter, Kanäle und Pumpen beteiligt sind, wie beispielsweise cystische Fibrose, Taubheit, diastrophische Dysplasie, Lang-QT-Syndrom, Menkes-Syndrom, Pendred-Syndrom, polycystische Nierenerkrankung, Sichelzellanämie, Morbus Wilson und Zellweger-Syndrom, Erkrankungen, an denen eine Signaltransduktion beteiligt ist, wie beispielsweise Ataxia telangiectasia, Kahlköpfigkeit, Cockayne-Syndrom, Glaukom, tuberöse Sklerose, Waardenburg-Syndrom und Werner-Syndrom; Erkrankungen, die das Gehirn betreffen, wie beispielsweise Alzheimer-Erkrankung, amylotrophische Lateralsklerose, Angleman-Syndrom, Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, Epilepsie, essenzieller Tremor, Fragiles X-Syndrom (Martin-Bell-Syndrom), Friedreich's Ataxie, Chorea Huntington, Morbus Niemann-Pick, Morbus Parkinson, Prader-Willi-Syndrom, Rett-Syndrom, Spinozerebralatrophie und William's-Syndrom; und Erkrankungen, die das Skelett betreffen, wie beispielsweise Duchenne-Muskeldydtrophie, Ellis-van-Creveld-Syndrom, Marfan-Syndrom und myotonische Dystrophie.
  • Einige der hierin umfassten Erkrankungen stehen im Zusammenhang mit Abweichungen in mehr als einem Gen oder mehr als einer genetischen Sequenz und daher kann für einen Assay die Untersuchung mehrerer Gene auf mögliche Veränderungen in Nukleotidsequenzen, die mit einem Erkrankungszustand assoziiert sind, erforderlich sein.
  • Außerdem erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf die Bestimmung von Mutationen und Polymorphismen in einer Reihe von tierischen und pflanzlichen Zellen. Die vorliegende Erfindung ist beispielsweise besonders nützlich beim Screening nach polymorphen Varianten in dem Genom von Pflanzen, wie beispielsweise während der Gewebekulturstadien des Fortpflanzung von Pflanzen. Durch die Möglichkeit, polymorphe Varianten in Pflanzen, wie beispielsweise solche aufgrund von somaclonaler Variation, zu identifizieren, wird verhindert, dass unnötigerweise Ressourcen an Pflanzen mit unerwünschten Eigenschaften verschwendet werden.
  • Eine Veränderung der Nukleotidsequenz auf homozygoter oder heterozygoter Ebene ist nützlich für die Bestimmung der möglichen Schwere der Erkrankung und bei der Detektion potenzieller Träger des Erkrankungszustandes. Bevorzugt betrifft die Veränderung ein einzelnes Nukleotid, wie beispielsweise eine Nukleotid-Substitution, Addition oder Deletion.
  • Das Reportermolekül ist ein beliebiges Molekül, das im Stande ist, die Bereitstellung eines identifizierbaren Signals zu erleichtern. Geeignete Reportermoleküle beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf Chloramphenicol, das mit radioaktiven Acetatgruppen acetyliert werden kann, farblose Galactosidasen, die durch Galactosidasen unter Bildung von farbigen Produkten hydrolysiert werden können, farblose Glucuronide, die durch Glucuronide unter Bildung von farbigen und fluoreszenten Produkten hydrolysiert werden können, Luciferin, welches durch Luciferase unter Freisetzung von Photonen oxidiert werden kann und grünes Fluoreszenz-Protein, welches durch UV-Licht zur Emission von Photonen und zur Fluoreszenz angeregt werden kann. Eine Reihe von weiteren Enzym-vermittelten, fluoreszierenden, chemilumineszierenden und radioaktiven Markern kann ebenfalls verwendet werden. Das Reportermolekül kann folglich direkt oder indirekt ein Signal bereitstellen.
  • Es kann eine beliebige Restriktionsendonuklease-Schnittstelle eingeführt werden. Geeignete Schnittstellen werden durch die folgenden Restriktionsenzyme erkannt: AatI, AatII, AauI, AccI131, Acc16I, Acc65I, AccB1I, AccB7I, AccBSI, AccI, AccII, AccIII, AceIII, AciI, AclI, AclNI, AclWI, AcsI, AcyI, AdeI, AfaI, AfeI, AflII, AflIII, AgeI, AhaIII, AhdI, AluI, Alw21I, Alw26I, Alw44I, AlwI, AlwNI, Ama87I, AocI, Aor51HI, ApaBI, ApaI, ApaLI, ApoI, AscI, AseI, AsiAI, AsnI, Asp700I, Asp718I, AspEI, AspHI, AspI, AspLEI, AspS9I, AsuC2I, AsuHPI, AsuI, AsuII, AsuNHI, AvaI, AvaII, AvaIII, AviII, AvrII, AxyI, BaeI, BalI, BamHI, BanI, BanII, BanIII, BbeI, BbiII, BbrPI, BbsI, BbuI, Bbv12I, BbvCI, BbvI, BbvII, BccI, Bce83I, BcefI, BcgI, BciVI, BclI, BcnI, BcoI, BcuI, BetI, BfaI, BfiI, BfmI, BfrI, BglI, BglII, BinI, BlnI, BlpI, Bme18I, BmgI, BmrI, BmyI, BpiI, BplI, BpmI, Bpu10I, Bpu1102I, Bpu14I, BpuAI, Bsa29I, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaI, BsaJI, BsaMI, BsaOI, BsaWI, BsaXI, BsbI, Bsc4I, BscBI, BscCI, BscFI, BscGI, BscI, Bse118I, BseII, Bse21I, Bse3DI, Bse8I, BseAI, BseCI, BseDI, BseGI, BseLI, BseMII, BseNI, BsePI, BseRI, BseX3I, BsgI, Bsh12361, Bsh1285I, Bsh1365I, BshI, BshNI, BsiBI, BsiCI, BsiEI, BsiHKAI, BsiI, BsiLI, BsiMI, BsiQI, BsiSI, BsiWI, BsiXI, BsiYI, BsiZI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BsoBI, Bsp106I, Bsp119I, Bsp120I, Bsp1286I, Bsp13I, Bsp1407I, Bsp143I, Bsp143II, Bsp1720I, Bsp19I, Bsp24I, Bsp68I, BspA2I, BspCI, BspDI, BspEI, BspGI, BspHI, BspLI, BspLU11I, BspMI, BspMII, BspTI, BspXI, BsrBI, BsrBRI, BsrDI, BsrFI, BsrGI, BsrI, BsrSI, BssAI, BssHII, BssKI, BssNAI, BssSI, BssT1I, Bst1107I, Bst2BI, Bst2UI, Bst4CI, Bst71I, Bst98I, BstACI, BstAPI, BstBAI, BstBI, BstDEI, BstDSI, BstEII, BstF5I, BstH2I, BstHPI, BstMCI, BstNI, BstNSI, BstOI, BstPI, BstSFI, BstSNI, BstUI, BstX2I, BstXI, BstYI, BstZ17I, BstZI, Bsu15I, Bsu36I, Bsu6I, BsuRI, BtgI, BtsI, Cac8I, CauII, CbiI, CciNI, CelII, CfoI, Cfr10I, Cfr13I, Cfr42I, Cfr9I, CfrI, CjeI, CjePI, ClaI, CpoI, Csp45I, Csp6I, CspI, CviJI, CviRI, CvnI, DdeI, DpnI, DpnII, DraI, DraII, DraIII, DrdI, DrdII, DsaI, DseDI, EaeI, EagI, Eam11041, Eam1105I, EarI, EciI, Ecl136II, EclHKI, EclXI, Eco105I, Eco130I, Eco147I, Eco24I, Eco255I, Eco31I, Eco32I, Eco47I, Eco47III, Eco52I, Eco57I, Eco64I, Eco72I, Eco81I, Eco88I, Eco91I, EcoICRI, EcoNI, EcoO109I, EcoO65I, EcoRI, EcoRII, EcoRV, EcoT14I, EcoT22I, EcoT38I, EgeI, EheI, ErhI, Esp1396I, Esp3I, EspI, FauI, FauNDI, FbaI, FinI, Fnu4HI, FnuDII, FokI, FriOI, FseI, Fsp4HI, FspI, GdiII, GsuI, HaeI, HaeII, HaeIII, HaeIV, HapII, HgaI, HgiAI, HgiCI, HgiEI, HgiEII, HgiJII, HhaI, HinII, Hin2I, Hin4I, Hin6I, HincII, HindII, HindIII, HinfI, HinP1I, HpaI, HpaII, HphI, Hsp92I, Hsp921I, HspAI, ItaI, KasI, Kpn2I, KpnI, Ksp22I, Ksp632I, KspAI, KspI, Kzo9I, LspI, MaeI, MaeII, MaeIII, MamI, MbiI, MboI, MboII, McrI, MfeI, MflI, MlsI, MluI, MluNI, Mly113I, MmeI, MnlI, Mph1103I, MroI, MroNI, MroXI, MscI, MseI, MslI, Msp17I, MspA1I, MspCI, MspI, MspR9I, MsfI, MunI, Mva1269I, MvaI, MvnI, MwoI, NaeI, NarI, NciI, NcoI, NdeI, NdeII, NgoAIV, NgoMIV (früher bekannt als NgoMI), NheI, NlaIII, NlaIV, NotI, NruGI, NruI, NsbI, NsiI, NspBII, NspI, NspV, PacI, PaeI, PaeR7I, PagI, PalI, PauI, Pfl1108I, Pfl23II, PflFI, PflMI, PinAI, Ple19I, PleI, PmaCI, Pme55I, PmeI, PmlI, Ppu10I, PpuMI, PshAI, PshBI, Psp124BI, Psp1406I, Psp5II, PspAI, PspEI, PspLI, PspN4I, PspOMI, PspPPI, PstI, PvuI, PvuII, RcaI, RleAI, RsaI, RsrII, SacI, SacII, SalI, SanDI, SapI, Sau3AI, Sau96I, SauI, SbfI, ScaI, SchI, ScrFI, SdaI, SduI, SecI, SexAI, SfaNI, SfcI, SfeI, SfiI, SfoI, Sfr274I, Sfr303I, SfuI, SgfI, SgrAI, SimI, SinI, SmaI, SmiI, SmlI, SnaBI, SnaI, SpeI, SphI, SplI, SrfI, Sse8387I, Sse8647I, Sse9I, SseBI, SspBI, SspI, SstI, SstII, StuI, StyI, SunI, SwaI, TaiI, TaqI, TaqII, TatI, TauI, TfiI, ThaI, Tru1I, Tru9I, TscI, TseI, Tsp45I, Tsp4CI, Tsp509I, TspEI, TspRI, Tth111I, Tth111II, TthHB8I, UbaDI, UbaEI, UbaLI, UbaOI, Van91I, Yha464I, VneI, VspI, XagI, XbaI, XcmI, XhoI, XhoII, XmaCI, XmaI, XmaIII und XmnI, Zsp2I.
  • Der feste Träger ist typischerweise Glas oder ein Polymer, wie beispielsweise, aber nicht begrenzt auf Cellulose, Keramikmaterial, Nitrocellulose, Polyacrylamid, Nylon, Polystyrol und dessen Derivate, Polyvinylidendifluorid (PVDF), Methacrylat und dessen Derivate, Polyvinylchlorid oder Polypropylen. Nitrocellulose kann ebenfalls verwendet werden. Glas ist besonders bevorzugt. Ein fester Träger kann auch ein Hybrid, wie beispielsweise ein auf einer Glas- oder Polymermatrix angeordneter Nitrocellulosefilm sein. Die Bezugnahme auf ein "Hybrid" schließt die Bezugnahme auf eine schichtartige Anordnung von zwei oder mehreren Glas- oder Polymeroberflächen, wie oben aufgelistet, ein. Der feste Träger kann in Form einer Membran oder von Röhren, Kügelchen, Scheiben oder Mikroplatten oder in Form einer beliebigen anderen Oberfläche vorliegen, die für die Durchführung eines Assays geeignet ist. Bindungsverfahren zur Immobilisierung der Moleküle sind im Fachbereich gut bekannt und bestehen im Allgemeinen in einer kovalenten Anbindung (z.B. Quervernetzung) oder einer physikalischen Adsorption der Moleküle auf dem festen Substrat.
  • Die Bezeichnung "komplementär" bezieht sich auf die topologische Eignung oder das Zusammenpassen von miteinander wechselwirkenden Oberflächen einer Oligonukleotid-Sonde und ihres Ziel-Ooligonukleotids, das Teil eines größeren Polynukleotids sein kann. Somit können das Ziel und seine Sonde als komplementär beschrieben werden und außerdem sind die Merkmale der Kontaktoberfläche komplementär zueinander. Komplementär schließt die Komplementarität von Basen ein, wie beispielsweise im genetischen Code A komplementär zu T oder U ist und C komplementär zu G ist. Diese Erfindung umfasst jedoch auch Situationen, in denen eine nicht traditionelle Basenpaarung, wie beispielsweise eine Hoogsteen-Basenpaarung vorliegt, die in bestimmten Transfer-RNA-Molekülen identifiziert worden ist und von der angenommen wird, dass sie in einer Triple-Helix vorliegt. Im Zusammenhang der Definition der Bezeichnung "komplementär" werden die Bezeichnungen "passend" (match) und "nicht-passend" (mismatch) hierin verwendet, um das Hybridisierungspotenzial gepaarter Nukleotide in komplementären Nukleinsäuresträngen zu bezeichnen. Passende Nukleotide hybridisieren effizient, wie beispielsweise die oben erwähnten klassischen Basenpaare A-T und G-C. Nicht-passend sind andere Kombinationen von Nukleotiden, die weniger effizient hybridisieren.
  • Die Bezeichnung "Oligonukleotid" bezeichnet, wie hierin verwendet, ein Polymer, das aus einer Mehrzahl von Nukleotidresten zusammengesetzt ist (Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide oder verwandte strukturelle Varianten oder synthetische Analoga davon), die über Phosphodiesterbindungen (oder verwandte strukturelle Varianten oder synthetische Analoga davon) verknüpft sind. Während also die Bezeichnung "Oligonukleotid" typischerweise ein Nukleotidpolymer bezeichnet, in dem die Nukleotidreste und die Verknüpfungen zwischen ihnen natürlich auftreten, so schließt die Bezeichnung in ihrer Bedeutung auch verschiedene Analoga ein einschließlich, aber nicht beschränkt auf peptidische Nukleinsäuren (PNAs), Phosphoramidate, Phosphorothioate, Methylphosphonate, 2-O-Methylribonukleinsäuren und dergleichen. Die genaue Größe des Moleküls kann abhängig von der bestimmten Anwendung variieren. Ein Oligonukleotid ist typischerweise relativ kurz, im Allgemeinen ist es etwa 8 bis 50 Nukleotide lang, bevorzugt 8 bis 30 Nukleotide, weiter bevorzugt von etwa 10 bis 20 Nukleotide und noch weiter bevorzugt von etwa 11 bis 17 Nukleotide, aber der Begriff kann auch Moleküle beliebiger Länge bezeichnen, obwohl für relativ große Oligonukleotide typischerweise die Bezeichnung "Polynukleotid" oder "Nukleinsäure" verwendet wird. Oligonukleotide können unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens hergestellt werden, wie beispielsweise durch das Phosphotriester-Verfahren, das in einem Artikel von Narang et al. (Methods Enzymol. 68: 90, 1979) und in US-Patent Nr. 4,356,270 beschrieben ist. Alternativ kann das in Brown et al. (Methods Enzymol. 68: 109, 1979) beschriebene Phosphodiester-Verfahren für eine solche Herstellung verwendet werden. Automatisierte Ausführungsformen der obigen Verfahren können ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise werden in einer solchen automatisierten Ausführungsform Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterialien verwendet und diese können, wie von Beaucage et al. (Tetrahedron Letters 22: 1859–1862, 1981) beschrieben, synthetisiert werden. Es wird außerdem auf die US-Patente Nr. 4,458,066 und 4,500,707 Bezug genommen, die Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden auf einem modifizierten festen Träger betreffen. Es ist auch möglich, einen Primer zu verwenden, der aus einer biologischen Quelle isoliert wurde (wie beispielsweise aus einem denaturierten Strang eines Restriktionsendonukleaseverdaus von Plasmid- oder Phagen-DNA). In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Oligonukleotid nach dem in US-Patent Nr. 5,424,186 (Fodor et al.) offenbarten Verfahren synthetisiert. Bei diesem Verfahren werden lithographische Techniken verwendet, um eine Vielzahl unterschiedlicher Oligonukleotide an genau bekannten Stellen auf einer Substratoberfläche zu synthetisieren.
  • Die Bezeichnungen "Array" und insbesondere "DNA-Array" oder "Oligonukleotid-Array" beziehen sich auf ein Substrat, bei dem Oligonukleotid-Sonden mit unterschiedlichen bekannten Sequenzen an diskreten bekannten Stellen, die mit dessen Oberfläche assoziiert sind, angeordnet sind. Beispielsweise kann das Substrat in Form eines zweidimensionalen Substrats vorliegen, wie in US-Patent Nr. 5,424,186 beschrieben. Ein solches Substrat kann verwendet werden, um zweidimensionale räumlich adressierte Oligonukleotid (Matrix)-Arrays zu synthetisieren. Alternativ kann das Substrat dadurch gekennzeichnet sein, dass es eine röhrenförmige Anordnung bildet, in der eine zweidimensionale planare Schicht zu einer dreidimensionalen röhrenförmigen Konfiguration gerollt ist. Das Substrat kann auch in Form einer Mikrosphere oder eines Kügelchens vorliegen, das mit der Oberfläche einer optischen Faser verbunden ist, wie beispielsweise von Chee et al. in WO 00/39587 offenbart. Oligonukleotid-Arrays besitzen mindestens zwei unterschiedliche Merkmale und eine Dichte von wenigsten 400 Merkmalen pro cm2. In bestimmten Ausführungsformen können die Arrays eine Dichte von etwa 500, wenigstens 1.000, wenigstens 10.000, wenigstens 100.000, wenigstens 1 Million oder wenigstens 10 Millionen Merkmale pro cm2 aufweisen. Beispielsweise kann das Substrat wie oben erwähnt Silicium oder Glas sein und es kann die Dicke eines Glasmikroskopträgers oder eines Abdeckglases aufweisen oder es kann aus anderen synthetischen Polymeren zusammengesetzt sein. Substrate, die für Licht transparent sind, sind nützlich, wenn das Verfahren zur Durchführung eines Assays auf dem Substrat eine optische Detektion einschließt. Die Bezeichnung bezieht sich auch auf einen Sonden-Array und das Substrat, an das er angebunden ist, die Teil eines Wafers bilden.
  • Die Bezeichnung "Sonde" bezieht sich auf ein Oligonukleotid-Molekül, das an eine spezifische Ziel-Sequenz oder eine andere Gruppe eines anderen Nukleinsäuremoleküls bindet. Wenn nicht anders angegeben, bezieht sich die Bezeichnung "Sonde" im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung typischerweise auf eine Oligonukleotid-Sonde, die durch komplementäre Basenpaarung an ein anderes Oligonukleotid oder Polynukleotid, häufig als "Ziel-Polynukleotid" bezeichnet, bindet. Sonden können abhängig von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen Ziel-Polynukleotide binden, die keine vollständige Sequenz-Komplementarität mit der Sonde aufweisen.
  • Oligonukleotid-Sonden können so ausgewählt werden, dass sie "im Wesentlichen komplementär" zu einer hierin definierten Ziel-Sequenz sind. Die genaue Länge der Oligonukleotid-Sonde wird von vielen Faktoren abhängen, einschließlich Temperatur und Quelle der Sonde und Verwendung des Verfahrens. Beispielsweise kann die Oligonukleotid-Sonde in Abhängigkeit von der Komplexität der Ziel-Sequenz typischerweise 8–50 Nukleotide, bevorzugt 8–30 Nukleotide, weiter bevorzugt etwa 10–20 Nukleotide und noch weiter bevorzugt etwa 11–17 Nukleotide enthalten, die im Stande sind, an eine Ziel-Sequenz zu hybridisieren, obwohl die Sonde auch mehr oder weniger solche Nukleotide enthalten kann.
  • Die Bezeichnung "Gleichartigkeit" schließt, wie hierin verwendet, eine exakte Identität zwischen den verglichenen Sequenzen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene ein. Wenn Nicht-Identität auf Nukleinsäureebene vorliegt, so schließt "Gleichartigkeit" Unterschiede zwischen Sequenzen ein, die zu unterschiedlichen Aminiosäuren führen, die dennoch auf struktureller, funktioneller, biochemischer und/oder konformativer Ebene miteinander verwandt sind. Wenn Nicht-Identität auf Aminosäureebene vorliegt, so schließt "Gleichartigkeit" Aminosäuren ein, die dennoch auf struktureller, funktioneller, biochemischer und/oder konformativer Ebene miteinander verwandt sind. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Nukleotid- und Sequenzvergleiche eher auf der Ebene der Identität als der Gleichartigkeit durchgeführt.
  • Die verwendeten Bezeichungen zur Beschreibung von Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Polynukleotiden oder Polypeptiden schließen "Referenzsequenz", "Vergleichsfenster", "Sequenz-Gleichartigkeit", "Sequenz-Identität", "Prozentsatz der Sequenz-Gleichartigkeit", "Prozentsatz der Sequenz-Identität", "im Wesentlichen gleichartig" und "im Wesentlichen identisch" ein. Eine "Referenz-Sequenz" weist eine Länge von mindestens 12, häufig aber 15–18 und oft mindestens 25 oder mehr, wie beispielsweise 30 Monomer-Einheiten auf, einschließlich Nukleotide und Aminosäurereste. Da zwei Polynukleotide jeweils (1) eine Sequenz (d.h. nur einen Teil der vollständigen Polynukleotidsequenz), die bei den beiden Polynukleotiden gleichartig ist und (2) eine Sequenz, die bei den beiden Polynukleotiden divergent ist, umfassen können, werden Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehr) Polynukleotiden typischerweise durchgeführt, indem Sequenzen der beiden Polynukleotide in einem "Vergleichsfenster" verglichen werden, um lokale Regionen der Sequenz-Gleichartigkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein "Vergleichsfenster" bezeichnet ein konzeptionelles Segment mit typischerweise 12 zusammenhängenden Resten, das mit einer Referenzsequenz verglichen wird. Das Vergleichsfenster kann für eine optimale Anordnung der beiden Sequenzen Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) von etwa 20% oder weniger im Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) aufweisen. Eine optimale Anordnung von Sequenzen zur Anordnung eines Vergleichsfensters kann durch computergesteuerte Anwendungen von Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) oder durch Inspektion durchgeführt werden, und indem die beste Anordnung (d.h. diejenige, bei der sich die höchste prozentuale Homologie in dem Vergleichsfenster ergibt), die durch irgendeines der verschiedenen Verfahren erzeugt wird, ausgewählt wird. Es kann auch auf die Programme der BLAST-Gruppe verwiesen werden, wie beispielsweise von Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389. 1997) offenbart. Eine ausführliche Erörterung der Sequenzanalyse ist in Band 19.3 von Ausubel et al. ("Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc., 1994–1998, Kapitel 15) zu finden.
  • Die Bezeichnungen "Sequenz-Gleichartigkeit" und "Sequenz-Identität" beziehen sich, wie hierin verwendet, auf das Ausmaß, zu dem die Sequenzen identisch oder funktionell oder strukturell gleichartig sind, auf Basis eines Nukleotid-zu-Nukleotid-Vergleichs oder eines Aminosäure-zu-Aminosäure-Vergleichs in einem Vergleichsfenster. Somit wird ein "Prozentsatz der Sequenz-Identität" beispielsweise berechnet, indem zwei optimal angeordnete Sequenzen in dem Vergleichsfenster verglichen werden, die Anzahl der Positionen, an denen in beiden Sequenzen die identische Nukleinsäurebase (z.B. A, T, C, G, I) oder der identischen Aminosäurerest (z.B. Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys und Met) vorkommt, bestimmt wird, um die Anzahl der passenden Positionen zu erhalten, die Anzahl der passenden Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen in dem Vergleichsfenster (d.h. durch die Fenstergröße) geteilt wird und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, um den Prozentsatz der Sequenz-Identität zu erhalten. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet "Sequenz-Identität" den "Match Prozentsatz", berechnet durch das DNASIS-Computerprogramm (Version 2.5 für Windows, erhältlich von Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USA) unter Verwendung von Standardfehlerwerten gemäß der Bedienungsanleitung zu der Software. Dieselben Anmerkungen gelten bezüglich der Sequenz-Gleichartigkeit.
  • Die Bezugnahme hierin auf eine niedrige Stringenz schließt ein und umfasst von wenigstens etwa 0 bis zu wenigstens etwa 15% v/v Formamid und von wenigstens etwa 1 M bis zu wenigstens etwa 2 M Salz für die Hybridisierung und wenigstens etwa 1 M bis wenigstens etwa 2 M Salz für die Wasch-Bedingungen. Im Allgemeinen liegt eine niedrige Stringenz bei etwa 25–30°C bis etwa 42°C vor. Die Temperatur kann verändert werden und es können höhere Temperaturen verwendet werden, um Formamid zu ersetzen und/oder um andere Stringenzbedingungen zu erhalten. Andere Stringenzbedingungen können, wenn erforderlich, angewendet werden, beispielsweise mittlere Stringenz, was von wenigstens etwa 16% v/v bis zu wenigstens etwa 30% v/v Formamid und von wenigstens etwa 0,5 M bis zu wenigstens etwa 0,9 M Salz für die Hybridisierung und wenigstens etwa 0,5 M bis zu wenigstens etwa 0,9 M Salz für die Wasch-Bedingungen einschließt und umfasst, oder hohe Stringenz, was von wenigstens etwa 31% v/v bis zu wenigstens etwa 50% v/v Formamid und von wenigstens etwa 0,01 M bis zu wenigstens etwa 0,15 M Salz für die Hybridisierung und wenigstens etwa 0,01 M bis zu wenigstens etwa 0,15 M Salz für die Wasch-Bedingungen einschließt und umfasst. Im Allgemeinen wird das Waschen bei Tm = 69,3 + 0,41 (G + C)% durchgeführt (Marmur und Doty, J. Mol. Biol. 5: 109, 1962). Der Tm-Wert einer Duplex-DNA verringert sich jedoch um jeweils 1°C, wenn die Anzahl der nicht passenden Basenpaare um jeweils 1% ansteigt (Bonner und Laskey, Eur. J. Biochem. 46: 83, 1974). Formamid ist unter diesen Hybridisierungsbedingungen optimal. Dementsprechend sind besonders bevorzugte Stringenzwerte wie folgt definiert: Niedrige Stringenz: 6 × SSC-Puffer, 0,1% w/v SDS bei 25–42°C; moderate Stringenz: 2 × SSC-Puffer, 0,1% w/v SDS bei einer Temperatur im Bereich von 20°C bis 65°C; hohe Stringenz: 0,1 × SSC-Puffer, 0,1% w/v SDS bei einer Temperatur von mindestens 65°C.
  • Die Bezeichnungen "Ziel-Polynukleotid" oder "Ziel-Sequenz" beziehen sich auf ein Polynukleotid von Interesse (z.B. ein einzelnes Gen oder Polynukleotid) oder auf eine Gruppe von Polynukleotiden (z.B. eine Familie von Polynukleotiden). Das Ziel-Polynukleotid kann mRNA, RNA, cRNA, cDNA oder DNA bezeichnen. Die Sonde wird verwendet, um Informationen über das Ziel-Polynukleotid zu erhalten: ob das Ziel-Polynukleotid eine Affinität für eine bestimmte Sonde aufweist. Ziel-Polynukleotide können natürlich auftretende oder künstlich hergestellte Nukleinsäure-Moleküle sein. Außerdem können sie in ihrem unveränderten Zustand oder als Aggregate mit anderen Typen eingesetzt werden. Ziel-Polynukleotide können kovalent oder nicht kovalent mit einem Bindungselement verbunden sein, entweder direkt oder über eine spezifische Bindungssubstanz. Ein Ziel-Polynukleotid kann mit einer Sonde hybridisieren, deren Sequenz zumindest teilweise komplementär zu einer Untersequenz in dem Ziel-Polynukleotid ist.
  • Diese Bezeichnungen werden hierin auch verwendet, um eine ausgewählte Nukleotidsequenz mit einer Länge von höchstens 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 30, 25 oder höchstens 15 Nukleotiden zu bezeichnen. Ziel-Sequenzen schließen Sequenzen mit einer Länge von mindestens 8, 10, 15, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 135, 150, 175, 200, 250 und 300 Nukleotiden ein. Nicht limitierende Beispiele für Ziel-Sequenzen schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Repeat-Sequenzen, wie beispielsweise Alu-Repeat-Sequenzen, konservierte oder nicht konservierte Regionen von Genfamilien, Introns, Promotorsequenzen einschließlich der Hogness-Box und der TATA-Box, Signalsequenzen, Enhancer, Proteinbindungsdomänen, wie beispielsweise eine Homeobox, Tymobox, Polymorphismen und konservierte Proteindomänen oder Teile davon.
  • Hybridisierungs- und/oder Reportersignaldaten werden verarbeitet, um die Gegenwart oder Abwesenheit einer Restriktionsendonuklease-Schnittstelle zu bestimmen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein digitaler Rechner eingesetzt, um spezifische Positionsmarkierungen auf dem Array mit der Gegenwart von Ziel-Sequenzen zu korrelieren, für welche die Sonden eine spezifische Wechselwirkung aufweisen. Die Positionsinformation wird direkt zu einer Datenbank verarbeitet, die angibt, welche Sequenz-Wechselwirkungen aufgetreten sind. In Hybridisierungsassays erzeugte Daten werden am einfachsten unter Verwendung eines programmierbaren Digitalrechners analysiert. Das Computerprogrammprodukt enthält im Allgemeinen ein lesbares Medium, das die Codes speichert. Bestimmte Dateien dienen als Speicher, in dem die Position jedes Features und alle Ziel-Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie die Sequenz der Oligonukleotid-Sonde bei diesem Feature aufweisen, enthalten sind. Ein Computerverfahren zur Analyse von Hybridisierungsdaten aus Nukleinsäure-Arrays ist in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 97/29212 und in der EP-Veröffentlichung 95 307 476.2 erläutert. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der programmierbare Rechner einen speziellen Software-Code und erfasst Daten, die aus der gesamten Sequenzdatenbank stammen, oder er enthält den Teil der gesamten Untersequenzdatenbank, der für den bestimmten Sonden-Array relevant ist, und aus dem Hybridisierungsmuster bestimmt der Rechner die Wahrscheinlichkeit, dass bestimmte Ziel-Sequenzen in der untersuchten DNA-Probe vorhanden sind.
  • Das Computerprogrammprodukt kann auch einen Code enthalten, der als Eingabe Hybridisierungsdaten aus einer Hybridisierungsreaktion zwischen einer Ziel-Sequenz und einer Oligonukleotid-Sonde erhält. Das Computerprogrammprodukt kann auch einen Code enthalten, der die Hybridisierungsdaten verarbeitet. Die Datenanalyse kann die folgenden Schritte enthalten: Bestimmung, beispielsweise der Fluoreszenzintensität, als Funktion der Substratposition der gesammelten Daten, Entfernung von "Ausreißern" (Daten, die von einer vorbestimmten statistischen Verteilung abweichen) und Berechnen der relativen Bindungsaffinität der Ziel-Sequenzen aus den verbleibenden Daten. Die verbleibenden Daten können als Bild angezeigt werden, bei dem die Farbe in jedem Bereich entsprechend der Lichtemission oder Bindungsaffinität zwischen Ziel-Sequenzen und Sonden variiert.
  • In einer Ausführungsform wird die Menge der Bindung an jeder Adresse bestimmt, indem die An-Aus-Geschwindigkeiten der Hybridisierung bestimmt werden. Beispielsweise wird die Menge der Bindung an jeder Adresse zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt, nachdem die Nukleinsäureprobe mit dem Array in Kontakt gebracht wurde. Die Gesamtmenge der Hybridisierung kann als Funktion der Bindungskinetik auf Grundlage der Bindungsmenge zu jedem Zeitpunkt bestimmt werden.
  • Ein Fachmann kann die Abhängigkeit der Hybridisierungsgeschwindigkeit von der Temperatur, der Probenbewegung, den Wasch-Bedingungen (z.B. pH, Wert, Lösungsmittelmerkmale, Temperatur) leicht bestimmen, um die Bedingungen für die Hybridisierungsgeschwindigkeit und das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu optimieren.
  • Das Computerprogrammprodukt kann auch einen Code enthalten, der Anweisungen von einem Programmierer als Eingabe erhält. Das Computerprogrammprodukt kann die Daten auch in ein Format für die Präsentation umwandeln.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Computerprogrammprodukt zur Verarbeitung von Hybridisierungsdaten einen Code, der für jedes Ziel-Polynukleotid eine Kombination von Features in einem Oligonukleotid-Array, dessen Sonden die spezifische Detektion dieses Polynukleotids ermöglichen, identifiziert; einen Code, der als Eingabe Hybridisierungsdaten aus Hybridisierungsreaktionen zwischen Proben-Polynukleotiden und den Oligonukleotid-Sonden in dem Array erhält; einen Code, der die Hybridisierungsdaten verarbeitet, um zu bestimmen, ob die Proben-Polynukleotide irgendwelche der Ziel-Polynukleotide enthalten, indem nach Hybridisierungsmustern gesucht wird, die zu irgendwelchen der vorbestimmten Kombinationen von Ziel-Sequenzen passen; Codes, die die Gegenwart eines durch ein Reportermolekül vermittelten Signals identifizieren; und ein computerlesbares Medium, auf dem die Codes gespeichert sind. Es ist nicht notwendig, die Sequenz der jeweiligen Oligonukleotid-Sonden in jedem Feature des Arrays zu identifizieren. In dieser Hinsicht erfordert die Hybridisierungsanalytik-Software als Eingabe nur die Information, welche Kombination von Features in dem Array einem bestimmten Ziel-Polynukleotid entspricht. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Computerprogrammprodukt jedoch einen Code, der als Eingabe die Sequenz einer Oligonukleotid-Sonde in jedem Feature eines Oligonukleotid-Arrays erhält und einen Code, der als Eingabe eine Datenbank erhält, die Informationen über die Gegenwart oder Abwesenheit von Ziel-Sequenzen in Ziel-Polynukleotiden enthält.
  • Bevorzugt umfasst das Computerprogrammprodukt ferner einen Code, der die Wahrscheinlichkeit berechnet, dass das detektierte Hybridisierungsmuster die Gegenwart eines Ziel-Polynukleotids anzeigt.
  • Die Datenbank der Ziel-Sequenzen würde regelmäßig aktualisiert und der Teil davon, der für jeden bestimmten Satz von Sonden, die jeden Mikroarray bilden, relevant ist, würde für diese ebenfalls aktualisiert, unter Verwendung bestimmter kommerzieller erfindungsgemäßer Anwendungen.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch modifiziert werden, um eine bestimmte Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einzufügen, aber eine andere aufzuheben. Dies ermöglicht eine noch bessere Genauigkeit und eine verringerte Wahrscheinlichkeit eines falsch negativen oder falsch positiven Ergebnisses. Außerdem ist es nicht erforderlich, durch einen Primer eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einzufügen. Eine bestimmte Schnittstelle kann in einer Ziel-Sequenz natürlich enthalten sein.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ferner eine Assay-Vorrichtung zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit eines Nukleotids oder einer Gruppe von Nukleotiden in einem Nukleinsäuremolekül, umfassend einen Array von immobilisierten Oligonukleotiden, die jeweils komplementär zu einer Nukleotidsequenz innerhalb eines amplifizierten Produkts sind, das durch ein oder mehrere Restriktionsendonukleasen verdaut worden ist, und Mittel zum Screening nach der Hybridisierung einer Ziel-Sequenz an den immobilisierten Oligonukleotid-Array. Die Assay-Vorrichtung kann außerdem für den Verkauf verpackt sein und Anweisungen für die Anwendung enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden nicht begrenzenden Beispiele weiter beschrieben.
  • BEISPIEL 1
  • Entwicklung eines genetischen Taubheits-Assays: EcoRII-Assay
  • In diesem Assay wird eine Mutation an dem Nukleotid 35 im Connexin 26-Gen identifiziert, entweder in homozygotem oder heterozygotem Zustand. Die Mutation ist eine Deletion eines Guanins an Position 35. Diese Mutation wird als "35ΔG" bezeichnet.
  • Zwei Primer werden entwickelt, die jeweils mit einem unterschiedlichen Reportermolekül markiert sind und von denen mindestens einer eine Nukleotidsequenz umfasst, die zu an einem festen Träger immobilisierten Oligonukleotid-Sequenzen passen und zu diesen komplementär sind. Diese Sequenz an dem Primer wird als "tag"-Sequenz bezeichnet. Günstigerweise wird in einem Beispiel der GeneChip (eingetragene Handelsmarke) verwendet, der einen GenFlex (Handelsmarke) Tag-Array beinhaltet. Die Primer umfassen daher ein Reportermolekül allein oder gebunden an eine tag-Sequenz (die zu an einem festen Träger immobilisierten Sequenzen passen und zu diesen komplementär sind). In diesem Beispiel umfasst ein Primer eine tag-Sequenz, die an eine Nukleotidsequenz gebunden ist, die komplementär ist zu einer Region, welche die 35ΔG-Region für den Vorwärtsprimer flankiert und zu einer Region, die sich stromabwärts dieser Stelle befindet für den Rückwärtsprimer.
  • In einem Beispiel fügt der Rückwärtsprimer in der Wildtyp-Sequenz eine Basenveränderung ein, so dass eine EcoRII-Stelle erzeugt wird. Wenn die Ziel-Sequenz eine 35ΔG-Mutation umfasst, so geht die EcoRII-Stelle verloren. Ursache dafür ist, dass EcoRII die Nukleotidsequenz 5'CCWGG3' erkennt, in der W A oder T ist. In dem Connexin 26-Gen ist die von EcoRII erkannte Nukleotidsequenz 5'CCTGG3'. Durch eine 35ΔG-Mutation wird jedoch das G an der 3'-Position entfernt und daher wird das Amplifikationsprodukt einer 35ΔG-Probe nicht verdaut, während eine Wildtypsequenz verdaut wird. Nach Amplifikation und Verdau mit EcoRII sind einzelsträngige Formen des amplifizierten Produkts den auf dem festen Träger immobilisierten Oligonukleotiden ausgesetzt. Dieser Assay ist in 1 gezeigt.
  • Wie zu beobachten ist wird dann, wenn die Ziel-Sequenz der homozygote Wildtyp ist, das gesamte Amplifikationsprodukt verdaut, sodass das mit dem Rückwärtsprimer assoziierte Reportermolekül entfernt wird. Das komplementäre (Antisense) immobilisierte Oligonukleotid (+) erlaubt den Einfang des mit dem Vorwärtsprimer assoziierten tag. Das passende (sinnige) immobilisierte Oligonukleotid (–) erlaubt den Einfang der zu dem tag komplementären Sequenz, die durch Verlängerung des Rückwärtsprimers während der PCR erzeugt wurde (d.h. der zu dem durch Verlängerung des Vorwärtsprimers erzeugten Strang komplementäre Strang). Ungeachtet des Restriktionsenzymverdaus wird das mit dem Vorwärtsprimer assoziierte Reportermolekül an dem (+)-Feature des immobilisierten Oligonukleotidpaars, das für das mit dem Vorwärtsprimer assoziierte tag spezifisch ist, immer erkannt. Da das mit dem Rückwärtsprimer assoziierte Reportermolekül durch EcoRII-Verdau abgespalten wurde, wird an dem (–)-Feature des immobilisierten Oligonukleotidpaars kein Reportermolekül nachgewiesen, d.h. das Verhältnis der Signale von Vorwärts- zu Rückwärtsprimer wäre in der Größenordnung von 1:0.
  • Wenn die 35ΔG-Mutation in einem homozygoten Zustand vorliegt, so erfolgt keinerlei Verdau eines Amplifikationsprodukts und beide Reportermoleküle an beiden Primern werden gleichmäßig vorhanden sein, d.h. in einem Verhältnis von etwa 1:1.
  • Wenn die 35ΔG-Mutation in dem heterozygoten Zustand vorliegt, so wird das Amplifikationsprodukt der Nukleotidsequenz, welche die Mutation trägt, nicht gespalten, aber in dem Amplifikationsprodukt der Nukleotidsequenz, welche die Mutation nicht enthält, wird eine Spaltung auftreten. Daher wird etwa die Hälfte der Moleküle in der gesamten Amplifikation gespalten. Dementsprechend wird das Verhältnis der Signale von Vorwärts- zu Rückwärtsprimer etwa 1:0,5 betragen.
  • BEISPIEL 2
  • Entwicklung eines genetischen Taubheits-Assays: DdeI-Assay
  • In diesem Assay wird derselbe Ansatz wie in Beispiel 1 angewendet, es wird aber eine Mutation eingefügt, um in der 35ΔG-Sequenz eine DdeI-Schnittstelle zu erzeugen. Eine Ziel-Variante würde daher durch DdeI gespalten werden, wohingegen die Wildtyp-Sequenz nicht gespalten würde.
  • BEISPIEL 3
  • Entwicklung eines genetischen Taubheits-Assays: BclI-Assay
  • Das Ziel dieses Assays besteht darin, einen Primer zu verwenden, um ein Cytosin gegen ein Adenin auszutauschen, um somit eine BclI-Schnittstelle in dem Cx26-Gen zu erzeugen. Die Ziel-Nukleotidsequenz ist wie folgt:
    CGC ATT ATG ATC CTC GTT GTG (SEQ ID NO: 1)
  • Ein Rückwärtsprimer erzeugt einen Mismatch, so dass die TGATCC-Sequenz zu TGATCA wird, was die Erkennungssequenz für BclI ist. Das Wildtyp-Amplifikationsprodukt auf Grundlage dieser modifizierten Sequenz ist durch BclI verdaubar. Eine Mutation in dem ATG-Codon, die zu genetischer Taubheit führt, hat zur Folge, dass das Codon zu ACG verändert wird (d.h. eine T → C Substitution). Dies entspricht einer M34T-Substitution. Die BclI-Schnittstelle, d.h. TGATCA, wird zu CGATCA und somit ist das Amplifikationsprodukt, das diese Mutation trägt, nicht mehr durch BclI verdaubar.
  • BEISPIEL 4
  • Entwicklung eines Assays für cystische Fibrose
  • Dieser Assay beruht auf Enzymerkennungssequenzen für XcmI und BstXI. Das cystische Fibrose-Gen umfasst die folgende Ziel-Sequenz:
    5'AAA GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC TA (SEQ ID NO: 2)
  • Mutationen, die zu einer möglichen Entwicklung von cystischer Fibrose führen, schließen eine Deletion eines Phenylalaninrestes an Position 508 ein, d.h. ΔF508. Dies ist auf eine Deletion eines CTT-Codons zurückzuführen.
  • Der erste Schritt besteht darin, einen Rückwärtsprimer zu verwenden, um zwei A → C-Substitutionen einzuführen, um die XcmI-Stelle: CCA(N)9TGG zu erzeugen.
  • Als Ergebnis wird das Wildtyp-Amplifikationsprodukt durch XcmI verdaut. Wenn das CTT-Codon deletiert ist (siehe 2), dann verdaut XcmI die amplifizierte DNA nicht.
  • BstX1 weist die Erkennungssequenz CCA(N)6TGG auf. BstX1 verdaut die Wildtyp-Sequenz nicht (2). Eine CTT-Deletion und die A → C Substitutionen erzeugen eine BstXI-Schnittstelle. Dementsprechend ist dort, wo die CTT-Deletion aufgetreten ist, das Amplifikationsprodukt XcmI–ve/BstXI+ve, wohingegen der Wildtyp XcmI+ve/BstXI–ve ist.
  • Dieser Assay kann unter Verwendung der festen Array-Technologie durchgeführt werden, wie in den Beispielen 1–3 oder er kann in Verbindung mit einer elektrophoretischen Trennung verwendet werden. Es ist nicht notwendig, die Amplifikationsprimer-Sequenzen mit einem Reportermolekül und/oder einer tag-Sequenz zu markieren. Ein Beispiel einer elektrophoretischen Trennung ist in 3 gezeigt. Das differenzielle Restriktionsmuster kann zwischen homozygot normal (N/N), homozygot abnormal (ΔF508/ΔF508) und heterozygot normal (N/ΔF508) gesehen werden.
  • BEISPIEL 5
  • Kombinations-Assay für cystische Fibrose
  • Ein Kombinations-Assay wird unter Verwendung von biochemischen und genetischen Tests durchgeführt.
  • In dem Kombinations-Assay werden alle Babys einem biochemischen Test auf cystische Fibrose unterzogen. Wenn keine biochemischen Hinweise auf eine Mutation vorliegen, so wird das Baby in eine kein-Risiko Kategorie eingeteilt. Wenn der biochemische Test anzeigt, dass eine Mutation vorhanden ist, so wird ein genetischer Test durchgeführt, wie in Beispiel 4 erläutert. Die Gelelektrophorese (wie beispielsweise Polyacrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese) wird unter Verwendung von XcmI und/oder BstXI durchgeführt, oder es kann eine Array-Technologie eingesetzt werden.
  • BEISPIEL 6
  • Entwicklung von Chip-Technology
  • Tabelle 1 stellt eine Liste von 15 tags bereit, die in Verbindung mit PCR-Oligos verwendet werden. Tabelle 2 ist eine Liste von Chip-Sonden. Dabei handelt es sich um Sense- und Antisense-Einfangsonden, die an dem Array immobilisiert sind.
  • TABELLE 1 Chip TAG Liste
    Figure 00410001
  • TABELLE 2 Chip Sonden-Sätze 5' → 3'
    Figure 00410002
  • Figure 00420001
  • BEISPIEL 7
  • Entwicklung eines Assays mit zweifach markierten Sonden
  • 4 ist eine diagrammartige Darstellung eines modifizierten Assays mit einem zweifach markierten Oligonukleotid-Primer. Der zweifach markierte Primer wird mit einer einzelsträngigen DNA verbunden und anschließend gespalten.
  • Ein Fachmann wird erkennen, dass die hierin beschriebene Erfindung Variationen und Modifikationen aufweisen kann, die sich von den hierin beschriebenen unterscheiden. Die Erfindung beinhaltet alle derartigen Variationen und Modifikationen. Die Erfindung beinhaltet auch alle Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, auf die hierin Bezug genommen wird oder auf die in dieser Beschreibung einzeln oder kollektiv hingewiesen wird, und beliebige und sämtliche Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr dieser Schritte oder Merkmale.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001

Claims (14)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz, umfassend: Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei jeder der Primer mit einem Reportermolekül markiert ist, das imstande ist, die Bereitstellung eines identifizierbaren Signals zu erleichtern, das vom jeweils anderen unterschieden werden kann, und wobei mindestens ein Primer oder seine komplementäre Form eine komplementäre Sequenz zu einer Oligonukleotidsequenz umfasst, die an einem festen Träger verankert ist, und wobei einer oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Gegenwart oder Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt oder aufhebt; Verdau des amplifizierten Produkts mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potenziell eingeführt oder aufgehoben worden ist, und Hybridisierung einzelsträngiger Formen des amplifizierten und verdauten Produkts unter Bedingungen, die eine Anheftung an einen Satz der immobilisierten Oligonukleotide erlauben, die Oligonukleotide umfassen, die zu einem von mindestens einem Primer eingeführten Abschnitt der amplifizierten Sequenz sinnig oder komplementär sind; und Detektion der relativen Anteile der Signale der Reportermoleküle, wobei gleiche Anteile verschiedener Signale oder die substanzielle Gegenwart von nur einem Signal eine homozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz und die Gegenwart eines differenziellen Signals eine heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz bedeuten.
  2. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer homozygoten oder heterozygoten Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb einer Ziel-Nukleotidsequenz, umfassend: Amplifikation der Ziel-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern zur Herstellung eines amplifizierten Produkts, wobei der eine Primer ein oder mehrere chemisch modifizierte Nukleotide, Basen oder Phosphodiesterbindungen enthält, so dass ein Nukleotidstrang, der von diesem Primer ausgeht, gegenüber Exonukleaseaktivität im Wesentlichen resistent ist, und der andere Primer eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit der Sequenz eines auf einem festen Träger immobilisierten Oligonukleotids identisch oder dazu komplementär ist, und wobei einer oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts in Gegenwart oder Abwesenheit einer Veränderung in einem oder mehreren Nukleotiden eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführt oder aufhebt; Verdau des amplifizierten Produkts mit einer Exonuklease zum Verdau des nicht von dem die exonukleaseresistenten Nukleotide, Basen oder Phosphodiesterbindungen enthaltenden Primer amplifizierten Stranges, um ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül zu erzeugen, das die potenzielle Gegenwart oder Abwesenheit einer Restriktionsendonuklease-Schnittstelle und eine zu einer auf dem festen Träger immobilisierten Oligonukleotidsequenz komplementäre Nukleotidsequenz umfasst; Hybridisierung einer Sonde mit dem einzelsträngigen Nukleinsäuremolekül, die eine Komplementarität zu der Restriktionsschnittstelle aufweist, die eingeführt worden sein kann, um ein teilweise doppelsträngiges Molekül zu erzeugen, wobei die Sonde zwei Reportermoleküle umfasst, die imstande sind, die Bereitstellung identifizierbarer Signale, die voneinander unterschieden werden können, zu erleichtern; Verdau des partiell doppelsträngigen Moleküls mit der Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle in dem amplifizierten Produkt potentiell eingeführt oder aufgehoben worden ist, und Hybridisierung des verdauten Moleküls unter Bedingungen, die eine Anheftung an einen Satz der immobilisierten Oligonukleotide erlauben, die Oligonukleotide umfassen, die zu einem von mindestens einem Primer eingeführten Abschnitt der amplifizierten Sequenz sinnig oder komplementär sind; und Detektion des relativen Anteils der Signale der Reportermoleküle, wobei gleiche Anteile verschiedener Signale oder die substanzielle Gegenwart von nur einem Signal eine homozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz und die Gegenwart eines differenziellen Signals eine heterozygote Gegenwart oder Abwesenheit der Veränderung in der Ziel-Nukleotidsequenz bedeuten.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der eine oder mehrere der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer innerhalb des amplifizierten Produkts eine Restriktionsendonuklease-Schnittstelle einführen.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der feste Träger ausgewählt ist unter Glas, einem Polymer, keramischem Material, Polyacrylamid, Nylon, Polystyrol und seinen Derivaten, Polyvinylidendifluorid, Methacrylat und seinen Derivaten, Polyvinylchlorid und Polypropylen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Polymer Cellulose oder Nitrocellulose ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der feste Träger Glas ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei zwei oder mehr Oligonukleotidsequenzen in der Form eines Arrays an dem festen Träger verankert sind.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Restriktionsendonuklease-Schnittstelle von einem Restriktionsenzym erkannt wird, das ausgewählt ist unter: AatI, AatII, AauI, Acc113I, Acc16I, Acc65I, AccB1I, AccB7I, AccBSI, AccI, AccII, AccIII, AceIII, AciI, AclI, AclNI, AclWI, AcsI, AcyI, AdeI, AfaI, AfeI, AflII, AflIII, AgeI, AhaIII, AhdI, AluI, Alw21I, Alw26I, Alw44I, AlwI, AlwNI, Ama87I, AocI, Aor51HI, ApaBI, ApaI, ApaLI, ApoI, AscI, AseI, AsiAI, AsnI, Asp700I, Asp718I, AspEI, AspHI, AspI, AspLEI, AspS9I, AsuC2I, AsuHPI, AsuI, AsuII, AsuNHI, AvaI, AvaII, AvaIII, AviII, AvrII, AxyI, BaeI, BalI, BamHI, BanI, BanII, BanIII, BbeI, BbiII, BbrPI, BbsI, BbuI, Bbv12I, BbvCI, BbvI, BbvII, BccI, Bce83I, BcefI, BcgI, BciVI, BclI, BcnI, BcoI, BcuI, BetI, BfaI, BfiI, BfmI, BfrI, BglI, BglII, BinI, BlnI, BlpI, Bme18I, BmgI, BmrI, BmyI, BpiI, BplI, BpmI, Bpu10I, Bpu1102I, Bpu14I, BpuAI, Bsa29I, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaI, BsaJI, BsaMI, BsaOI, BsaWI, BsaXI, BsbI, Bsc4I, BscBI, BscCI, BscFI, BscGI, BscI, Bse118I, Bse1I, Bse21I, Bse3DI, Bse8I, BseAI, BseCI, BseDI, BseGI, BseLI, BseMII, BseNI, BsePI, BseRI, BseX3I, BsgI, Bsh1236I, Bsh1285I, Bsh1365I, BshI, BshNI, BsiBI, BsiCI, BsiEI, BsiHKAI, BsiI, BsiLI, BsiMI, BsiQI, BsiSI, BsiWI, BsiXI, BsiYI, BsiZI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BsoBI, Bsp106I, Bsp119I, Bsp120I, Bsp1286I, Bsp13I, Bsp1407I, Bsp143I, Bsp143II, Bsp1720I, Bsp19I, Bsp24I, Bsp68I, BspA2I, BspCI, BspDI, BspEI, BspGI, BspHI, BspLI, BspLU11I, BspMI, BspMII, BspTI, BspXI, BsrBI, BsrBRI, BsrDI, BsrFI, BsrGI, BsrI, BsrSI, BssAI, BssHII, BssKI, BssNAI, BssSI, BssT1I, Bst1107I, Bst2BI, Bst2UI, Bst4CI, Bst71I, Bst98I, BstACI, BstAPI, BstBAI, BstBI, BstDEI, BstDSI, BstEII, BstF5I, BstH2I, BstHPI, BstMCI, BstNI, BstNSI, BstOI, BstPI, BstSFI, BstSNI, BstUI, BstX2I, BstXI, BstYI, BstZ17I, BstZI, Bsu15I, Bsu36I, Bsu6I, BsuRI, BtgI, BtsI, Cac8I, CauII, CbiI, CciNI, CelII, CfoI, Cfr10I, Cfr13I, Cfr42I, Cfr9I, CfrI, CjeI, CjePI, ClaI, CpoI, Csp45I, Csp6I, CspI, CviJI, CviRI, CvnI, DdeI, DpnI, DpnII, DraI, DraII, DraIII, DrdI, DrdII, DsaI, DseDI, EaeI, EagI, Eam1104I, Eam1105I, EarI, EciI, Ecl136II, EclHKI, EclXI, Eco105I, Eco130I, Eco147I, Eco24I, Eco255I, Eco31I, Eco32I, Eco47I, Eco47III, Eco52I, Eco57I, Eco64I, Eco72I, Eco81I, Eco88I, Eco91I, EcoICRI, EcoNI, EcoO109I, EcoO65I, EcoRI, EcoRII, EcoRV, EcoT14I, EcoT22I, EcoT38I, EgeI, EheI, ErhI, Esp1396I, Esp3I, EspI, FauI, FauNDI, FbaI, FinI, Fnu4HI, FnuDII, FokI, FriOI, FseI, Fsp4HI, FspI, GdiII, GsuI, HaeI, HaeII, HaeIII, HaeIV, HapII, HgaI, HgiAI, HgiCI, HgiEI, HgiEII, HgiJII, HhaI, Hin1I, Hin2I, Hin4I, Hin6I, HincII, HindII, HindIII, HinfI, HinP1I, HpaI, HpaII, HphI, Hsp92I, Hsp92II, HspAI, ItaI, KasI, Kpn2I, KpnI, Ksp22I, Ksp632I, KspAI, KspI, Kzo9I, LspI, MaeI, MaeII, MaeIII, MamI, MbiI, MboI, MboII, McrI, MfeI, MflI, MlsI, MluI, MluNI, Mly113I, MmeI, MnlI, Mph1103I, MroI, MroNI, MroXI, MscI, MseI, MslI, Msp17I, MspA1I, MspCI, MspI, MspR9I, MstI, MunI, Mva1269I, MvaI, MvnI, MwoI, NaeI, NarI, NciI, NcoI, NdeI, NdeII, NgoAIV, NgoMIV (früher bekannt als NgoMI), NheI, NlaIII, NlaIV, NotI, NruGI, NruI, NsbI, NsiI, NspBII, NspI, NspV, PacI, PaeI, PaeR7I, PagI, PalI, PauI, Pfl1108I, Pfl23II, PflFI, PflMI, PinAI, Ple19I, PleI, PmaCI, Pme55I, PmeI, PmlI, Ppu10I, PpuMI, PshAI, PshBI, Psp124BI, Psp1406I, Psp5II, PspAI, PspEI, PspLI, PspN4I, PspOMI, PspPPI, PstI, PvuI, PvuII, RcaI, RleAI, RsaI, RsrII, SacI, SacII, SalI, SanDI, SapI, Sau3AI, Sau96I, SauI, SbfI, ScaI, SchI, ScrFI, SdaI, SduI, SecI, SexAI, SfaNI, SfcI, SfeI, SfiI, SfoI, Sfr274I, Sfr303I, SfuI, SgfI, SgrAI, SimI, SinI, SmaI, SmiI, SmlI, SnaBI, SnaI, SpeI, SphI, SplI, SrfI, Sse8387I, Sse8647I, Sse9I, SseBI, SspBI, SspI, SstI, SstII, StuI, StyI, SunI, SwaI, TaiI, TaqI, TaqII, TatI, TauI, TfiI, ThaI, Tru1I, Tru9I, TscI, TseI, Tsp45I, Tsp4CI, Tsp509I, TspEI, TspRI, Tth111I, Tth111II, TthHB8I, UbaDI, UbaEI, UbaLI, UbaOI, Van91I, Vha464I, VneI, VspI, XagI, XbaI, XcmI, XhoI, XhoII, XmaCI, XmaI, XmaIII und XmnI, Zsp2I.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reportermolekül ausgewählt ist unter Chloramphenicol, einer farblosen Galactosidase, einem farblosen Glucuronid, Luciferin und grünem Fluoreszenzprotein.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Ziel-Nukleotidsequenz in einer eukaryontischen Zeile ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die eukaryontische Zelle eine Säugerzelle oder eine Pflanzenzelle ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Zeile eine Pflanzenzelle ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist und die Zielsequenz mit einem Krankheitszustand assoziiert ist, der eine oder mehrere bekannte genetische Mutationen umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Säugerzelle eine menschliche Zelle ist und der Krankheitszustand ausgewählt ist unter Adreno-Leukodystrophie, Atherosklerose, Gaucher-Syndrom, Atrophia gyrata, jugendlichem Diabetes, Fettsucht, paroxysmaler nächtlicher Hämoglubinurie, Phenylketonurie, Morbus Refsum, Tangier-Krankheit, zystischer Fibrose, Taubheit, diastrophischer Dysplasie, Lang-QT-Syndrom, Menkes-Syndrom, Pendred-Syndrom, polycystischer Nierenerkrankung, Sichelzellanämie, Morbus Wilson, Zellweger-Syndrom, Ataxia telangiectasia, Kahlköpfigkeit, Cockayne-Syndrom, Glaukom, tuberöser Sklerose, Waardenburg-Syndrom, Werner-Syndrom, Morbus Alzheimer, amylotrophischer Lateralsklerose, Angleman-Syndrom, Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, Epilepsie, essentiellem Tremor, Fragile-X-Syndrom (Martin-Bell-Syndrom), Friedreichs Ataxie, Chorea Huntington, Morbus Niemann-Pick, Morbus Parkinson, Prader-Willi-Syndrom, Rett-Syndrom, Spinozerebellaratrophie, Williams-Syndrom, Duchenne-Muskeldystrophie, Ellis-van Crefeld-Syndrom, Marfan-Syndrom und myotonischer Dystrophie.
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