JP2010022383A - 標識化プライマー及び制限断片長多型を用いて生物がホモ接合型かヘテロ接合型かを検出する方法 - Google Patents

標識化プライマー及び制限断片長多型を用いて生物がホモ接合型かヘテロ接合型かを検出する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】生物の標的ヌクレオチドがホモ接合であるかヘテロ接合であるかを検出する方法を開発する。
【解決手段】本発明は生物が標的ヌクレオチドにおいてホモ接合であるかヘテロ接合であるかを検出する方法を提供する。この方法は二つの異なって標識されるプローブＡ及びＢの制限部位の両側へのハイブリダイゼーション、制限エンドヌクレアーゼによる消化、及び結果として得られる消化産物中の標識の検出を組み合わせる。生物がホモ接合である場合は、該標識は１：１又は１：０の比で存在し、或いは生物がヘテロ接合である場合は該標識は１：２の比で存在することになる。固定化アレイ技術又は電気泳動分離のいずれかが使用しうる。
【選択図】図１

Description

本発明は一般的に標的ヌクレオチド配列における一つ以上のヌクレオチドの存在又は非存在を検出する方法に関する。より具体的には、本発明は標的ヌクレオチド配列における特定の突然変異又は多型の存在又は非存在についての診断検定を意図する。更により具体的には、本発明はディファレンシャル・ハイブリダイゼーション又は制限エンドヌクレアーゼ消化と固定化アレイ技術又は電気泳動分離のいずれかとを組み合わせて標的ヌクレオチド配列における突然変異又は多型の存在又は非存在を検出する。本発明は更に該診断検定の実施を容易にするためのキット並びに該診断検定の実施を自動化又は半自動化するための手段、より具体的にはデータ処理補助手段を提供する。
本明細書におけるいずれの先行技術についての言及も、この先行技術がオーストラリア又は任意の他国での一般的常識の一部をなすという認識又は如何なる形式における示唆でもなく、またそのように解釈されるべきではない。
組換えＤＮＡ技術のより一層の高度化は医学、獣医学、農業及び園芸の諸産業における研究及び開発を非常に促進している。これはヒトの疾病状態についての診断の分野において特にそうである。ゲノム学のより良い理解が得られるにつれ、そしてある範囲の動物及びヒトなどの哺乳動物やある範囲の微生物についてのゲノムの配列決定の完了又はほぼ完了とともに、広範囲の遺伝子に基づく状態についての診断検定を開発する絶好の機会となるであろう。
核酸ハイブリダイゼーションに基づく診断技術は、特定の生物又は遺伝的に近縁の生物群の遺伝物質を同定し定量する能力において他に例を見ない。ＤＮＡマイクロ加工(microfabricated)アレイ（マイクロアレイ）技術の出現により、今やこの種の遺伝子に基づく分析の速度及び特異性において「１０倍」の増大が可能になっている。例えば、サザン（特許文献１）WO89/10977；米国特許第6,045,270号）、チーら（特許文献２）米国特許第5,837,832号）、カンターら（特許文献３）米国特許第6,007,987号）及びフォーダーら（特許文献４）米国特許第5,871,928号）が参照されうる。
最近まで、核酸ハイブリダイゼーションに用いられた核酸プローブは殆ど標的の生物又は遺伝子から核酸断片を単離することにより経験的に得られていた。しかしながら、現在では、国際配列データベース（例えばGenBank及びEMBLのデータベース）からのデータを用いて核酸プローブを設計し合成することが可能である。これらの既知遺伝子配列のデータベースは、長年の間５年毎に規模が十倍に増大し、今や殆どの遺伝子及び主要な生物群の代表試料を含んでいる。
一般的に、ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体上、通常ガラス・ウエハー上のアレイに配置された検出用オリゴヌクレオチド又は検出用プローブのスポットを用いる。このプローブは標的核酸を含み且つ蛍光標識されている試料核酸とハイブリダイズさせられる。該プローブと該試料の標的核酸は、該プローブと該標的核酸との正確な又はほとんど正確な相補性のみを検出する条件下でハイブリダイズさせられる。標的核酸が該アレイの特定プローブと対合しハイブリダイズする場合、該スポットは蛍光を発することになる。該スポットの蛍光を記録することにより、該核酸混合物中にどの標的配列が存在するかを判断できる。
天然のＲＮＡ又はＤＮＡの分子から得られた配列情報は合成オリゴヌクレオチド・プローブの配列を決定するために用いられ、この情報は通常コンピュータ・データベースに保存され、ソフトウェアを用いて操作される。個々のプローブは、既知の天然ヌクレオチド配列の一部又は該配列の一部の相補体(complement)と適合する任意の順序（配列）でヌクレオチドを含むように合成される。従来のアレイで用いられたオリゴヌクレオチド・プローブは通常長さが10〜25ヌクレオチドである。
現在、オリゴヌクレオチド・プローブは遺伝子から得られるｍＲＮＡ転写物を同定し定量するためにマイクロアレイで最も一般的に用いられている。これらのマイクロアレイは通常個々の遺伝子配列から得られる幾つかの異なる標的配列に相当するプローブを含み、これらのプローブは通常標的に特異的であるよう選択される（即ち、それらは唯一つの標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする）。従って、これらのマイクロアレイは、該アレイが検出するように設計された標的ポリヌクレオチドの数よりも多数のプローブを含む。
サザン，WO89/10977号公報，米国特許第6,045,270号公報 チーら，米国特許第5,837,832号公報 カンターら，米国特許第6,007,987号公報 フォーダーら，米国特許第5,871,928号公報
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む従来の核酸分析技術と比較して、ＤＮＡマイクロアレイは異なる遺伝子の発現を検出し測定する容易で迅速な手段を提供する。該マイクロアレイは十分に特性決定された核酸分子の変異型を検出するため（即ち、遺伝的多型及び遺伝子型を検出するため）にも用いられてきた。しかしながら、感染病及び遺伝障害を診断するための道具としてのその有望性にもかかわらず、日常的な診断用のマクロアレイの開発は遅れているように思われる。これはおそらく莫大な数の標的ポリヌクレオチドを検出しうるマイクロアレイを設計し、開発し、生産する経費が比較的高いことによるのであろう。従って、新規な方法及び試薬はこの有望性を実現することが要求され、本発明は該要求を満たすのに役立つ。
本発明によれば、本発明者らは、標的ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの変化並びに該突然変異又は多型がホモ接合型又はヘテロ接合型で存在するか否かを容易に同定できる改良された検定システムを開発した。本発明の検定は、ヒト、動物、微生物及び植物のある範囲の遺伝子検査に対して幅広い適用性を有する。本検定はとりわけマイクロアレイに基づく検定手法に有用性を有する。その上、多数の個々の被験者を同一のマイクロアレイ上で分析でき、該マイクロアレイは費用効率の高い方法で大規模な遺伝子検査を可能にする。
発明の概要
本明細書を通して、文脈が他の意味を要しない限り、「含む(comprise)」という単語、又は「含む(comprises)」若しくは「含む(comprising)」などの変形は、明記した要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の包含を意味するが、任意の他の要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の排除を意味するわけではないと理解されるであろう。
ヌクレオチド及びアミノ酸の配列は配列同定子番号（配列番号：）により参照される。該配列番号：は該配列同定子の＜４００＞１、＜４００＞２等と数的に対応する。配列表は請求の範囲の後に提供される。
本発明は標的配列における特定のヌクレオチド又はヌクレオチド群の存在又は非存在を検出する手段を提供する。この検定は前向き及び逆向きの増幅プライマーの選択工程又は作製工程を含み、該プライマーは一実施態様においては個々の同定可能なシグナル、即ち、互いに識別され得るシグナルを提供できるレポーター分子で任意選択的に両方とも又は片方だけ標識される。或いは、該増幅は未標識プライマーを用いて実施され、検出はその５′末端及び３′末端で異種標識 (differential labelled)されたプローブのハイブリダイゼーションにより遂行される。一つの側面では、一対のプライマーの少なくとも一つが固体支持体に固定されたセンス配列及び相補的配列を有するタグ配列を更に含む。その上、一つ又は両方のプライマーは検出しようとする突然変異の存在又は非存在に応じて該標的配列内の制限エンドヌクレアーゼ部位を導入したり、除去したりしうる。或いは、該プライマーは標的配列に異なる仕方でハイブリダイズしうる。該タグ配列（存在する場合）及びレポーター分子を組込むための増幅後、一実施態様においては、制限エンドヌクレアーゼ部位を付加又は除去するための増幅後に、増幅された産物はその部位が導入又は除去された酵素で消化され、一本鎖形は該固体支持体上で固定化条件に付される。該突然変異又は多型の存在又は非存在は該制限エンドヌクレアーゼが該標的配列を消化するか否かを決定し、これは次に個々のプライマー上のレポーター分子が捕捉された増幅産物上に存在するか否かに影響を及ぼす。該レポーター分子により生じるシグナルの性質が異なることにより、該突然変異又は多型の存在又は非存在に関する決定をすることができる。この実施態様の一つの特定形を図１に示す。別の一実施態様では、異なる制限エンドヌクレアーゼ消化が電気泳動により判断される。この実施態様では、該タグ配列は依然存在しうるが電気泳動の分離には必要でない。一つの特定の実施態様では、増幅プライマーは如何なるレポーター分子も付着させることなしに用いられる。更なる実施態様では、一つ又は両方のプライマーは化学修飾された、塩基、ヌクレオチド又はリン酸結合を含み、該鎖をエキソヌクレアーゼ消化に対して耐性にさせる。これにより、一本鎖ＤＮＡ分子が作製できる。制限エンドヌクレアーゼ部位の存在又は非存在は次いで二つの異なるレポーター分子を含むプローブ分子を想定される制限部位を含む領域にハイブリダイズさせることにより決定される。この部分的な二本鎖ＤＮＡは次に制限エンドヌクレアーゼ消化にかけられ上記の様に分析される。この特定の実施態様の一形態を図４に示す。
従って、本発明の一つの側面は標的ヌクレオチド配列内の一つ以上のヌクレオチドにおけるホモ接合的又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーの少なくとも一つが、両プライマーが標識されている場合、他のレポーター分子から識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できるレポーター分子で標識されるものであり、そして少なくとも一つのプライマー及びその相補形が固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含むものであり、そして該前向き及び逆向きプライマーの一つ以上が一以上のヌクレオチドの変化の存在下若しくは非存在下で該増幅産物内に標的部位を導入し、破壊し又はハイブリダイズするものである工程、及び
該増幅産物を検出手段にかける工程、
を含む方法を意図する。
。
本発明の別の一側面は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドにおけるホモ接合的又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーのそれぞれが、互いに識別され得る同定可能なシグナルの提供を容易にできるレポーター分子で標識されるものであり、少なくとも一つのプライマー及びその相補形が固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含むものであり、そして一つ以上の該前向き及び逆向きプライマーが一以上のヌクレオチドの変化の存在下若しくは非存在下において該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入し又は破壊するものである工程、
該増幅産物をその制限酵素部位が該増幅産物に潜在的に導入又は破壊されている制限エンドヌクレアーゼで消化し、ハイブリダイゼーションにかけられた増幅産物の一本鎖形を、少なくとも一つのプライマーにより導入された増幅配列の一部に対してセンスである又は相補的であるオリゴヌクレオチドを含む一組の固定化オリゴヌクレオチドにアニーリングできる状態に置く工程、及び
該レポーター分子によるシグナルの相対比を検出する工程であり、異なるシグナルの均等比又は唯一つのシグナルの実質的存在が該標的ヌクレオチド配列における変化のホモ接合の存在若しくは非存在を表すものであり、異なるシグナルの存在が標的ヌクレオチド配列における該変化のヘテロ接合の存在若しくは非存在を表すものである工程、
を含む方法を提供する。
別の一実施態様においては、本発明は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドにおけるホモ接合的又はヘテロ接合的変化の存在若しくは非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、一方のプライマーが、該プライマーから伸長するヌクレオチド鎖が実質的にエキソヌクレアーゼ活性に対して耐性であるように、一つ以上の化学修飾されたヌクレオチド、塩基又はホスホジエステル結合を含むものであり、他方のプライマーが固体支持体に固定されたセンス配列又はそれに相補的配列を有するヌクレオチド配列を含むものであり、一つ以上の該前向き及び逆向きプライマーが一以上のヌクレオチドにおける変化の存在下若しくは非存在下において該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入又は破壊するものである工程、
該増幅産物をエキソヌクレアーゼで消化して該エキソヌクレアーゼに耐性のヌクレオチド、塩基又はホスホジエステル結合を含む該プライマーにより増幅されない該鎖を消化し、制限エンドヌクレアーゼ部位の潜在的な存在若しくは非存在及び該固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖核酸分子を作製する工程、
導入されうる該制限部位に対する相補性を含むプローブを該一本鎖核酸分子にハイブリダイズし、部分的に二本鎖の分子を作製する工程であり、該プローブが互いに識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できる二つのレポーター分子を含むものである工程、
該部分的に二本鎖の分子をそのエンドヌクレアーゼ部位が該増幅産物に潜在的に導入又は破壊されている制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化された該分子を、少なくとも一つのプライマーにより導入された増幅配列の一部に対してセンスであり又は相補的であるオリゴヌクレオチドを含む一組の固定化オリゴヌクレオチドにアニーリングできる状態に置く工程、及び
該レポーター分子によるシグナルの相対比を検出する工程であり、異なるシグナルの均等比又は唯一つのシグナルの実質的存在が該標的ヌクレオチド配列における変化のホモ接合の存在又は非存在を表すものであり、異なるシグナルの存在が標的ヌクレオチド配列における変化のヘテロ接合の存在又は非存在を表すものである工程、
を含む方法を意図する。
本発明の別の一側面は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドにおけるホモ接合又はヘテロ接合の変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーのそれぞれが、互いに識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できるレポーター分子で標識されるものであり、一つ以上の該前向き及び逆向きプライマーが一以上のヌクレオチドの変化の存在下又は非存在下において該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入又は破壊するものである工程、及び
そのエンドヌクレアーゼ部位が該増幅産物に潜在的に導入又は破壊されている該制限エンドヌクレアーゼで該増幅産物を消化し、消化された該増幅産物を該消化産物の電気泳動分離を可能とする状態に置く工程であり、電気泳動分離のパターン及び／又はレポーター分子のシグナル発信のパターンが標的配列における該変化のホモ接合の存在若しくは破壊又はヘテロ接合の存在若しくは破壊を示すものである工程、
を含む方法を意図する。
関連する実施態様において、本発明は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドのホモ接合的又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、一つ以上の該前向き又は逆向きプライマーが、一以上のヌクレオチドの変化の存在下又は非存在下において該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入又は破壊するものである工程、及び
そのエンドヌクレアーゼの部位が該増幅産物に潜在的に導入され又は破壊されている制限エンドヌクレアーゼで該増幅産物を消化し、消化に付された該増幅産物を該消化産物の電気泳動分離を可能とする状態に置く工程であり、電気泳動分離のパターンが標的配列における該変化のホモ接合的存在若しくは非存在又はヘテロ接合的存在若しくは非存在を示すものである工程、
を含む方法を提供するが、これに限定されない。
本発明の更なる側面は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドのホモ接合的変化又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き又は逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーのそれぞれが、互いに識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できるレポーター分子で標識されるものであり、少なくとも一つのプライマー及びその相補形が固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含むものであり、一つ以上の該前向き又は逆向きプライマーが、一以上のヌクレオチドの変化の非存在下で、該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するものである工程、
そのエンドヌクレアーゼ部位が該増幅産物に潜在的に導入されている制限エンドヌクレアーゼで該増幅産物を消化し、ハイブリダイゼーションにかけられた増幅産物の一本鎖形を、少なくとも一つのプライマー配列又はその相補的配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドを含む一組の固定化オリゴヌクレオチドにアニーリングできる状態に置く工程、及び
該レポーター分子によるシグナルの相対比を検出する工程であり、異なるシグナルの均等比又は唯一つのシグナルの実質的存在が該標的ヌクレオチド配列における変化のホモ接合的存在又は非存在を表すものであり、異なるシグナルの存在が標的ヌクレオチド配列における変化のヘテロ接合的存在又は非存在を表すものである工程、
を含む方法を提供する。
本発明の更なる別の一側面は、核酸分子における１ヌクレオチド又はヌクレオチド群の存在又は非存在を決定する検定装置であって、一つ以上の制限エンドヌクレアーゼにより消化される増幅産物内のヌクレオチド配列にそれぞれ相補的な固定化されたオリゴヌクレオチドのアレイ及び該固定化されたオリゴヌクレオチド・アレイに対する標的配列のハイブリダイゼーションについてスクリーニングする手段を含む装置を更に提供する。
本発明は、特定のヌクレオチド又はヌクレオチドの配列のホモ接合の存在又は非存在並びに特定のヌクレオチド又はヌクレオチド配列がヘテロ接合形で存在するか否かを決定するための遺伝検定をとりわけ提供する。
従って、本発明の一つの側面は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドにおけるホモ接合的変化又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーの少なくとも一つが、両プライマーが標識されている場合、別のレポーター分子から識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できるレポーター分子で標識されるものであり、少なくとも一つのプライマー及びその相補形が固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含むものであり、一つ以上の該前向き又は逆向きプライマーが一以上のヌクレオチドにおける変化の存在下又は非存在下において該増幅産物内に標的部位を導入し、破壊し又はハイブリダイズするものである工程、及び
該増幅産物を検出手段にかける工程
を含む方法を意図する。
該前向き及び逆向きプライマーは制限エンドヌクレアーゼ部位を導入又は破壊することが好ましい。
従って、本発明のこの側面は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドのホモ接合的変化又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーのそれぞれが、互いに識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できるレポーター分子で標識されるものであり、少なくとも一つのプライマー及びその相補形が固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含むものであり、一つ以上の該前向き又は逆向きプライマーが一以上のヌクレオチドにおける変化の存在下又は非存在下において該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入し又は破壊するものである工程、
そのエンドヌクレアーゼの部位が該増幅産物に潜在的に導入又は破壊されている制限エンドヌクレアーゼで該増幅産物を消化し、ハイブリダイゼーションにかけられた増幅産物の一本鎖形を、少なくとも一つのプライマーにより導入された増幅配列の一部に対してセンスである又は相補的であるオリゴヌクレオチドを含む一組の固定化オリゴヌクレオチドにアニーリングできる状態に置く工程、及び
該レポーター分子によるシグナルの相対比を検出する工程であり、異なるシグナルの均等比又は唯一つのシグナルの実質的存在が該標的ヌクレオチド配列における変化のホモ接合の存在又は非存在を表すものであり、異なるシグナルの存在が標的ヌクレオチド配列における該変化のヘテロ接合的存在又は非存在を表すものである工程、
を含む方法を提供する。
関連する実施態様において、異なる制限エンドヌクレアーゼによる消化は電気泳動で決定されうる。
従って、本発明の別の一側面は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドにおけるホモ接合的変化又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーのそれぞれが、互いに識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できるレポーター分子で標識されるものであり、一つ以上の該前向き又は逆向きプライマーが一以上のヌクレオチドの変化の存在下又は非存在下において該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入又は破壊するものである工程、及び
そのエンドヌクレアーゼの部位が該増幅産物に潜在的に導入又は除去されている制限エンドヌクレアーゼで該増幅産物を消化し、消化された増幅産物を該消化産物の電気泳動分離ができる状態に置く工程であり、電気泳動分離のパターン及び／又はレポーター分子のシグナル発信のパターンが標的配列における該変化のホモ接合の存在若しくは非存在又はヘテロ接合の存在若しくは非存在を示すものである工程、
を含む方法を意図する。
関連する実施態様において、電気泳動分離が用いられる場合、該増幅用プライマーはレポーター分子及び／又はタグ配列で標識されない。この実施態様によれば、本発明は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドにおけるホモ接合的変化又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、一つ以上の該前向き又は逆向きプライマーが、一以上のヌクレオチドの変化の存在下又は非存在下において該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入又は破壊するものである工程、及び
その制限エンドヌクレアーゼ部位が該増幅産物に潜在的に導入され又は破壊されている制限エンドヌクレアーゼで該増幅産物を消化し、消化に付された該増幅産物を該消化産物の電気泳動分離を可能とする状態に置く工程であり、電気泳動分離のパターンが標的配列におけるホモ接合の存在若しくは非存在又はヘテロ接合の存在若しくは非存在を示すものである工程、
を含む方法を意図するが、これに限定されない。
本発明は制限部位の導入又は制限部位の破壊の両方を意図するが、例えば野生型配列又は「非突然変異」配列への制限部位の導入が好ましい。
この好ましい実施態様によれば、本発明は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドにおけるホモ接合的変化又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーのそれぞれが、互いに識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できるレポーター分子で標識されるものであり、プライマー及びその相補形の少なくとも一つが固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含むものであり、該前向き又は逆向きプライマーの一つ以上が、一以上のヌクレオチドの変化が存在しない場合、該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するものである工程、
そのエンドヌクレアーゼ部位が該増幅産物に潜在的に導入されている制限エンドヌクレアーゼで該増幅産物を消化し、ハイブリダイゼーションに付された増幅産物の一本鎖形を、それぞれのプライマー配列又はその相補的配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドを含む一組の固定化オリゴヌクレオチドにアニーリングさせうる状態に置く工程、及び
該レポーター分子によるシグナルの相対比を検出する工程であり、異なるシグナルの均等比又は唯一つのシグナルの実質的存在が該標的ヌクレオチド配列の変化のホモ接合的存在又は非存在を表すものであり、異なるシグナルの存在が標的ヌクレオチド配列における該変化のヘテロ接合的存在又は非存在を表すものである工程、
を含む方法を提供する。
本発明のこの側面は制限エンドヌクレアーゼによる異なる消化を決定するための電気泳動分離まで更に及ぶ。
該制限部位は該前向き又は逆向きプライマーのいずれかにより導入又は破壊されうる。一つの特に有用な実施態様では、前向きプライマーが制限部位を導入するために用いられる。
従って、本発明の別の一側面は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドにおけるホモ接合的又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーが、互いに識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できるレポーター分子で標識されるものであり、プライマー及びその相補形の少なくとも一つが固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含むものであり、該前向きプライマーが、一以上のヌクレオチドの変化が存在しない場合、該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するものである工程、
そのエンドヌクレアーゼ部位が該増幅産物に潜在的に導入されている制限エンドヌクレアーゼで該増幅産物を消化し、ハイブリダイゼーションに付された増幅産物の一本鎖形を、少なくとも一つのプライマー配列又はその相補的配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドを含む一組の固定化オリゴヌクレオチドにアニーリングさせる状態に置く工程、及び
該レポーター分子によるシグナルの相対比を検出する工程であり、異なるシグナルの均等比又は唯一つのシグナルの実質的存在が該標的ヌクレオチド配列における変化のホモ接合の存在又は非存在を表すものであり、異なるシグナルの存在が標的ヌクレオチド配列における該変化のヘテロ接合の存在又は非存在を表すものである工程、
を含む方法に関する。
代替的実施態様において、該標的配列は一組の未標識プライマーで増幅される。これは電気泳動検出に基づく検定（例えば嚢胞性線維症について）にとりわけ有用である。或いは、再び未標識プライマーが用いられるが、該プライマーの一方はヌクレオチド又は塩基のレベルで化学修飾された一つ以上のヌクレオチドを含む又はそのホスホジエステル結合はエキソヌクレアーゼに対する耐性を与えるために修飾される。「化学修飾された」塩基又はヌクレオチドはヌクレオチド又は塩基の化学類似体を含む。化学修飾の一例はホスホロチオエート修飾又はプロピン(propyne)修飾である。本質的に、該化学修飾はエキソヌクレアーゼの機能を実質的に阻害するあらゆる修飾を包含する。特に好ましい実施態様では、該化学修飾はホスホロチオエート修飾である。
該プライマーはまた、該プライマーの一方又は他方が上述したように制限エンドヌクレアーゼ部位を導入又は破壊するように選択される。更に、上記のように、少なくとも一方の該プライマーは固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチドにおいてセンス配列又は相補的配列を有するヌクレオチド配列を保持する。
増幅後、得られるアンプリコンはエキソヌクレアーゼ消化にかけられる。一つ以上の化学修飾されたヌクレオチド塩基又はホスホジエステル結合をもつプライマーを含むＤＮＡ鎖は一般的にエキソヌクレアーゼによる切断を免れる。従って、該エキソヌクレアーゼは該相補鎖のみを消化し、固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド中に、導入又は破壊された制限部位、及びセンス配列又は相補的配列を有するヌクレオチド配列を含む一本鎖ＤＮＡを残す。該一本鎖ヌクレオチド配列は次に導入されうる該制限部位に対する相補性を含むヌクレオチド・プローブと接触させられる。このプローブは二つのレポーター分子を好ましくはその５′末端及び３′末端で含み、導入又は破壊された制限エンドヌクレアーゼ部位を包含する領域にハイブリダイズさせられる。このハイブリダイゼーションは部分的に二本鎖の分子をもたらす。この分子は次いで消化条件に付される。該制限エンドヌクレアーゼ部位が破壊されたか否かに応じて、該プローブが切断されるか否かを決定する。この方法の一側面は図４に記載する。
従って、本発明の別の一側面は標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドにおけるホモ接合的又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、一方のプライマーが、該プライマーから伸長するヌクレオチド鎖が実質的にエキソヌクレアーゼ活性に対して耐性であるように、一つ以上の化学修飾されたヌクレオチド、塩基又はホスホジエステル結合を含むものであり、他方のプライマーが固体支持体に固定されたセンス配列及び相補的配列を有するヌクレオチド配列を含むものであり、一つ以上の該前向き及び逆向きプライマーが一以上のヌクレオチドの変化の存在下又は非存在下において該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入又は破壊するものである工程、
エキソヌクレアーゼに耐性のヌクレオチド、塩基又はホスホジエステル結合を含むプライマーにより増幅されない該鎖を消化するためにエキソヌクレアーゼで該増幅産物を消化し、制限エンドヌクレアーゼ部位の潜在的な存在又は非存在及び該固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖核酸分子を作製する工程、
導入されうる該制限部位に対する相補性を含むプローブを該一本鎖核酸分子にハイブリダイズし、部分的に二本鎖の分子を作製する工程であり、該プローブが互いに識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できる二つのレポーター分子を含むものである工程、
該二本鎖分子をそのエンドヌクレアーゼ部位が該増幅産物に潜在的に導入又は破壊されている該制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化された分子を、少なくとも一つのプライマーにより導入された増幅配列の一部に対してセンス又は相補的であるオリゴヌクレオチドを含む一組の固定化オリゴヌクレオチドにアニーリングを可能とする状態に置く工程、及び
該レポーター分子によるシグナルの相対比を検出する工程であり、異なるシグナルの均等比又は唯一つのシグナルの実質的存在が該標的ヌクレオチド配列における変化のホモ接合的存在又は非存在を表すものであり、異なるシグナルの存在が標的ヌクレオチド配列における該変化のヘテロ接合的存在又は非存在を表すものである工程、
を含む方法を意図する。
該標的ヌクレオチド配列は、一般的に哺乳動物（ヒト、霊長類、家畜動物、実験用試験動物又は愛玩動物の細胞を含む）又は植物細胞などの真核細胞中にある。一つのとりわけ有用な実施態様では、該標的ヌクレオチド配列はヒトの細胞中にある。更に、該標的ヌクレオチド配列は一般的に、特定の疾患状態に関連する、例えば構造遺伝子又は調節遺伝子又は３′若しくは５′の調節ヌクレオチド配列又はプロモーター配列などのヌクレオチド配列を包含する。本発明のこの側面により包含される疾患状態には一つの遺伝子若しくは遺伝配列又は幾つかの既知の遺伝子若しくは遺伝配列における一つ以上の突然変異と関連する疾患状態が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で意図される検出のための疾患状態の例としては、副腎脳白質ジストロフィー，アテローム性動脈硬化，ゴーシェ病，迂曲状萎縮(gyrate atrophy)，若年発症糖尿病，肥満，発作性夜間血色素尿症，フェニルケトン尿症，レフサム病，タングラー病 (tangler disease)，及び嚢胞性線維症，難聴，変形形成異常 (diastrophic dysplasia)，ＱＴ延長症候群，メンケズ症候群，ペンドレッド症候群，多発性嚢胞腎，鎌形赤血球貧血，ウィルソン病及びツェルウェガー症候群などの輸送体，チャネル及びポンプを含むヘモクロマトーシス状態などの代謝障害；毛細血管拡張性運動失調，禿頭症，コケーン症候群，緑内障，結節硬化症，ワールデンブルヒ症候群及びヴェルナー症候群などのシグナル伝達に関与する状態；アルツハイマー病，筋萎縮性側索硬化症，アングレマン症候群(Angleman syndrome) ，シャルコー・マリー・ツース病，癲癇，本態性振戦，脆弱Ｘ症候群，フリードライヒ失調症，ハンチントン病，ニーマン−ピック病，パーキンソン病，プラーダー−ヴィリ症候群，レット症候群，脊髄小脳萎縮症 (spinocerebella atrophy) 及びウィリアムズ症候群などの脳に関与する状態；並びにデュシェンヌ型筋ジストロフィー，エリス−ファン・クレフェルト症候群，マルファン症候群及び筋強直性ジストロフィーなどの骨格に関与する状態が挙げられる。
本明細書で意図される幾つかの状態は一つ以上の遺伝子又は遺伝配列の異常に関連するため、検定は疾患状態に関連するヌクレオチド配列における潜在的な変化について幾つかの遺伝子の調査を必要としうる。
更に、本発明はある範囲の動物及び植物の細胞における突然変異及び多型を検出する工程に及ぶ。本発明は、例えば植物繁殖の組織培養段階中などの植物のゲノムにおける多型変異型についてスクリーニングする際に特に有用である。ソーマクローン変異型によるなどの植物の多型変異型を同定する能力は、好ましくない性質をもつ植物で浪費される不必要な資源を抑制するであろう。
ホモ接合又はヘテロ接合のレベルでのヌクレオチド配列の変化は該疾患の潜在的な重症度を決定し該疾患状態の潜在的な保持者を検出する際に有用である。ヌクレオチドの置換、付加又は欠失などの変化は、一個のヌクレオチドに作用することが好ましい。
該レポーター分子は同定可能なシグナルを容易に提供できる任意の分子である。適切なレポーター分子には、放射性アセテート基でアセチル化され得るクロラムフェニコール、ガラクトシダーゼにより加水分解され着色産物を生じうる無色のガラクトシド類、グルクロニダーゼにより加水分解され着色産物及び蛍光産物を生じうる無色のグルクロニド、ルシフェラーゼにより酸化され光子を放出しうるルシフェリン、並びにＵＶ光により照射され光子を放ち蛍光を発しうる緑色蛍光タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。ある範囲の他の酵素媒介性、蛍光性、化学発光性及び放射性のマーカーも用いられうる。従って、該レポーター分子は直接的又は間接的にシグナルを提供しうる。
任意の制限エンドヌクレアーゼ部位が導入されうる。適切な部位は下記の制限酵素により認識される：AatI, AatII, AauI, Acc113I, Acc16I, Acc65I, AccB1I, AccB7I, AccBSI, AccI, AccII, AccIII, AceIII, AciI, AclI, AclNI, AclWI, AcsI, AcyI, AdeI, AfaI, AfeI, AflII, AflIII, AgeI, AhaIII, AhdI, AluI, Alw21I, Alw26I, Alw44I, AlwI, AlwNI, Ama87I, AocI, Aor51HI, ApaBI, ApaI, ApaLI, ApoI, AscI, AseI, AsiAI, AsnI, Asp700I, Asp718I, AspEI, AspHI, AspI, AspLEI, AspS9I, AsuC2I, AsuHPI, AsuI, AsuII, AsuNHI, AvaI, AvaII, AvaIII, AviII, AvrII, AxyI, BaeI, BalI, BamHI, BanI, BanII, BanIII, BbeI, BbiII, BbrPI, BbsI, BbuI, Bbv12I, BbvCI, BbvI, BbvII, BccI, Bce83I, BcefI, BcgI, BciVI, BclI, BcnI, BcoI, BcuI, BetI, BfaI, BfiI, BfmI, BfrI, BglI, BglII, BinI, BlnI, BlpI, Bme18I, BmgI, BmrI, BmyI, BpiI, BplI, BpmI, Bpu10I, Bpu1102I, Bpu14I, BpuAI, Bsa29I, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaI, BsaJI, BsaMI, BsaOI, BsaWI, BsaXI, BsbI, Bsc4I, BscBI, BscCI, BscFI, BscGI, BscI, Bse118I, Bse1I, Bse21I, Bse3DI, Bse8I, BseAI, BseCI, BseDI, BseGI, BseLI, BseMII, BseNI, BsePI, BseRI, BseX3I, BsgI, Bsh1236I, Bsh1285I, Bsh1365I, BshI, BshNI, BsiBI, BsiCI, BsiEI, BsiHKAI, BsiI, BsiLI, BsiMI, BsiQI, BsiSI, BsiWI, BsiXI, BsiYI, BsiZI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BsoBI, Bsp106I, Bsp119I, Bsp120I, Bsp1286I, Bsp13I, Bsp1407I, Bsp143I, Bsp143II, Bsp1720I, Bsp19I, Bsp24I, Bsp68I, BspA2I, BspCI, BspDI, BspEI, BspGI, BspHI, BspLI, BspLU11I, BspMI, BspMII, BspTI, BspXI, BsrBI, BsrBRI, BsrDI, BsrFI, BsrGI, BsrI, BsrSI, BssAI, BssHII, BssKI, BssNAI, BssSI, BssT1I, Bst1107I, Bst2BI, Bst2UI, Bst4CI, Bst71I, Bst98I, BstACI, BstAPI, BstBAI, BstBI, BstDEI, BstDSI, BstEII, BstF5I, BstH2I, BstHPI, BstMCI, BstNI, BstNSI, BstOI, BstPI, BstSFI, BstSNI, BstUI, BstX2I, BstXI, BstYI, BstZ17I, BstZI, Bsu15I, Bsu36I, Bsu6I, BsuRI, BtgI, BtsI, Cac8I, CauII, CbiI, CciNI, CelII, CfoI, Cfr10I, Cfr13I, Cfr42I, Cfr9I, CfrI, CjeI, CjePI, ClaI, CpoI, Csp45I, Csp6I, CspI, CviJI, CviRI, CvnI, DdeI, DpnI, DpnII, DraI, DraII, DraIII, DrdI, DrdII, DsaI, DseDI, EaeI, EagI, Eam1104I, Eam1105I, EarI, EciI, Ecl136II, EclHKI, EclXI, Eco105I, Eco130I, Eco147I, Eco24I, Eco255I, Eco31I, Eco32I, Eco47I, Eco47III, Eco52I, Eco57I, Eco64I, Eco72I, Eco81I, Eco88I, Eco91I, EcoICRI, EcoNI, EcoO109I, EcoO65I, EcoRI, EcoRII, EcoRV, EcoT14I, EcoT22I, EcoT38I, EgeI, EheI, ErhI, Esp1396I, Esp3I, EspI, FauI, FauNDI, FbaI, FinI, Fnu4HI, FnuDII, FokI, FriOI, FseI, Fsp4HI, FspI, GdiII, GsuI, HaeI, HaeII, HaeIII, HaeIV, HapII, HgaI, HgiAI, HgiCI, HgiEI, HgiEII, HgiJII, HhaI, Hin1I, Hin2I, Hin4I, Hin6I, HincII, HindII, HindIII, HinfI, HinP1I, HpaI, HpaII, HphI, Hsp92I, Hsp92II, HspAI, ItaI, KasI, Kpn2I, KpnI, Ksp22I, Ksp632I, KspAI, KspI, Kzo9I, LspI, MaeI, MaeII, MaeIII, MamI, MbiI, MboI, MboII, McrI, MfeI, MflI, MlsI, MluI, MluNI, Mly113I, MmeI, MnlI, Mph1103I, MroI, MroNI, MroXI, MscI, MseI, MslI, Msp17I, MspA1I, MspCI, MspI, MspR9I, MstI, MunI, Mva1269I, MvaI, MvnI, MwoI, NaeI, NarI, NciI, NcoI, NdeI, NdeII, NgoAIV, NgoMIV（NgoMIとして以前知られる）, NheI, NlaIII, NlaIV, NotI, NruGI, NruI, NsbI, NsiI, NspBII, NspI, NspV, PacI, PaeI, PaeR7I, PagI, PalI, PauI, Pfl1108I, Pfl23II, PflFI, PflMI, PinAI, Ple19I, PleI, PmaCI, Pme55I, PmeI, PmlI, Ppu10I, PpuMI, PshAI, PshBI, Psp124BI, Psp1406I, Psp5II, PspAI, PspEI, PspLI, PspN4I, PspOMI, PspPPI, PstI, PvuI, PvuII, RcaI, RleAI, RsaI, RsrII, SacI, SacII, SalI, SanDI, SapI, Sau3AI, Sau96I, SauI, SbfI, ScaI, SchI, ScrFI, SdaI, SduI, SecI, SexAI, SfaNI, SfcI, SfeI, SfiI, SfoI, Sfr274I, Sfr303I, SfuI, SgfI, SgrAI, SimI, SinI, SmaI, SmiI, SmlI, SnaBI, SnaI, SpeI, SphI, SplI, SrfI, Sse8387I, Sse8647I, Sse9I, SseBI, SspBI, SspI, SstI, SstII, StuI, StyI, SunI, SwaI, TaiI, TaqI, TaqII, TatI, TauI, TfiI, ThaI, Tru1I, Tru9I, TscI, TseI, Tsp45I, Tsp4CI, Tsp509I, TspEI, TspRI, Tth111I, Tth111II, TthHB8I, UbaDI, UbaEI, UbaLI, UbaOI, Van91I, Vha464I, VneI, VspI, XagI, XbaI, XcmI, XhoI, XhoII, XmaCI, XmaI, XmaIII及びXmnI, Zsp2I。
該固体支持体は通常ガラス又はセルロース、セラミック材料、ニトロセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン及びその誘導体、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)、メタクリレート及びその誘導体、ポリビニルクロライド又はポリプロピレンなどのポリマーであるが、これらに限定されない。ニトロセルロースも使用しうる。ガラスが特に好ましい。固体支持体はガラス又はポリマーの基質上に支持されるニトロセルロース・フィルムなどのハイブリッドでもあってもよい。「ハイブリッド」についての言及は上に列挙した二つ以上のガラス又はポリマーの表面の層状配置についての言及を含む。該固体支持体は、膜又は管、ビーズ、円盤又はマイクロプレート、又は検定を実施するのに適した任意の他の表面の形状でありうる。該分子を固定化するための結合工程は、当分野でよく知られており、一般的に該固体基質に該分子を共有結合（例えば架橋）させる工程又は物理的に吸着させる工程から成る。
「相補的」という用語は、オリゴヌクレオチド・プローブとその標的オリゴヌクレオチド（より大きなポリヌクレオチドの一部でありうる）との相互作用面の位相上の適合能力を指す。従って、該標的及びそのプローブは相補的と記載され得る上、該接触面の特徴は互いに相補的である。相補的には、遺伝コードにおいてＡがＴ又はＵに相補的でありそしてＣがＧに相補的であるなどの塩基相補性が含まれる。しかしながら、本発明は、ある種の転移ＲＮＡ分子で同定され且つ三重らせんで存在すると仮定されたフーグスティーン型塩基対などの非伝統的な塩基対が存在する状況をも包含する。「相補的」という用語の定義の文脈において、本明細書で用いられる「適合」及び「不適合」という用語は相補的な核酸鎖における対になったヌクレオチドのハイブリダイゼーション能を指す。上述した伝統的なＡ−Ｔ及びＧ−Ｃ塩基対などの適合するヌクレオチドは効率的にハイブリダイズする。不適合は効率的にハイブリダイズしないヌクレオチドの他の組み合わせである。
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合（又は関連する構造変異型又はその合成類似体）を介して連結した複数のヌクレオチド残基（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又は関連する構造変異型又はその合成類似体）から構成されるポリマーを指す。従って、「オリゴヌクレオチド」という用語が通常該ヌクレオチド残基及びそれらの間の連結が自然に生じるヌクレオチド・ポリマーを指す一方で、該用語はペプチド核酸 (PNA)、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボ核酸などを含む（しかしこれらに限定されない）種々の類似体もその範囲内に含むことが理解されよう。該分子の正確な大きさは個別の適用に応じて変化し得る。オリゴヌクレオチドは通常長さがかなり短く、一般的に約８から５０のヌクレオチドであり、好ましくは８から３０のヌクレオチドであり、より好ましくは約１０から２０のヌクレオチドであり、更により好ましくは約１１から１７のヌクレオチドであるが、該用語は任意の長さの分子を指し得る。しかしながら、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語が通常大きなオリゴヌクレオチドに対して用いられる。オリゴヌクレオチドは、例えばナラングら(Methods Enzymol. 68: 90, 1979)による論文及び米国特許第4,356,270号公報に記載されているホスホトリエステル方法などの任意の適切な方法を用いて調製されうる。或いは、ブラウンら（Methods Enzymol. 68: 109, 1979）に記載されているホスホジエステル方法がこのような調製に用いられうる。上記方法の自動化された実施態様も用いられうる。例えば、一つのこのような自動化された実施態様において、ジエチルホスホルアミダイトが出発物質として用いられ、ビューケージら(Tetrahedron Letters 22: 1859-1862, 1981)により記載されるように合成されうる。米国特許第4,458,066号公報及び第4,500,707号公報も参照されうる。これらは改変された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する方法について言及している。生物起源（プラスミド又はファージＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化の変性鎖など）から単離されたプライマーを使用することも可能である。好ましい実施態様では、該オリゴヌクレオチドは米国特許第5,424,186号公報（フォドルら）で開示されている方法に従って合成される。この方法はリソグラフィック技術を用いて基体表面上の正確に知られた位置で複数の異なるオリゴヌクレオチドを合成する。
「アレイ」及びとりわけ「ＤＮＡアレイ」又は「オリゴヌクレオチド・アレイ」という用語は、その表面と関連する個別の既知の位置に載せられた異なる既知配列をもつオリゴヌクレオチド・プローブを有する基体を指す。例えば、該基体は米国特許第5,424,186号公報に記載されたような二次元の基体の形態であり得る。このような基体は二次元の空間的にアドレス指定されたオリゴヌクレオチド（行列）アレイを合成するために用いられうる。或いは、該基体は、その中で二次元の平板シートが巻かれて三次元の管状の構造になる管状アレイを形成する点において特徴づけられうる。該基体は、例えばWO00/39587号公報でチーらにより開示されたような光ファィバーの表面上に接続されたミクロスフェア又はビーズの形態であってもよい。オリゴヌクレオチド・アレイは少なくとも二つの異なる地点(feature)及び少なくとも400地点/cm2の密度を有する。ある種の実施態様において、該アレイは、１cm2当たり約500、少なくとも1000、少なくとも10,000、少なくとも100,000、少なくとも1,000,000又は少なくとも10,000,000個の地点の密度を有し得る。例えば、上記のように、該基体はシリコン又はガラスであってもよく、そしてガラスの顕微鏡スライド又はカバーガラススリップの厚さを持つことができ又は他の合成ポリマーから構成されうる。光が透る基体は、該基体上で検定を実施する方法が光学的検出を伴う場合に有用である。該用語はプローブ・アレイを指しそして該アレイが付着し且つウェハーの一部を形成する基体をも指す。
「プローブ」という用語は特定の標的配列又は別の核酸分子の他の部分に結合するオリゴヌクレオチド分子を指す。特に断らない限り、本発明の文脈における「プローブ」という用語は通常相補的な塩基対合を介して別のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド（しばしば「標的ポリヌクレオチド」と呼ばれる）に結合するオリゴヌクレオチド・プローブを指す。プローブはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて該プローブとの完全な配列相補性を欠く標的ポリヌクレオチドに結合し得る。
オリゴヌクレオチド・プローブは本明細書で定義されるように標的配列に対して「実質的に相補的」であるよう選択されうる。オリゴヌクレオチド・プローブの正確な長さは温度及びプローブの起源及び該方法の使用などの多数の因子に依存することになる。例えば、標的配列の複雑性に応じて、該オリゴヌクレオチド・プローブは、通常、標的配列にハイブリダイゼーションできる８から５０のヌクレオチド、好ましくは８から３０のヌクレオチド、より好ましくは約１０から２０のヌクレオチド、更により好ましくは約１１から１７のヌクレオチドを含みうるが、それはより多くの又はより少ないこのようなヌクレオチドを含みうる。
本明細書で用いられる「類似性」という用語はヌクレオチド又はアミノ酸のレベルで比較される配列の間の正確な同一性を含む。ヌクレオチドのレベルで非同一がある場合、「類似性」は、異なるアミノ酸を生じるが、それにもかかわらず構造、機能、生化学及び／又はコンフォメーションのレベルで互いに関連する配列の間の相違を含む。アミノ酸のレベルで非同一がある場合、「類似性」は、それにもかかわらず、構造、機能、生化学及び／又はコンフォメーションのレベルで互いに関連するアミノ酸を含む。特に好ましい実施態様では、ヌクレオチドの比較及び配列の比較は類似性ではなく同一性のレベルでなされる。
二つ以上のポリヌクレオチド間又はポリペプチド間の配列関係を記載するために用いられる用語には、「参照配列」、「比較窓」、「配列類似性」、「配列同一性」、「配列類似性の百分率」、「配列同一性の百分率」、「実質的に類似する」及び「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチド及びアミノ酸の残基を含み且つ少なくとも１２、だが度々１５から１８、しばしば３０モノマー単位などの少なくとも２５以上の長さである。二つのポリヌクレオチドは、(1)二つの該ポリヌクレオチド間で類似する配列（即ち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、及び(2)二つの該ポリヌクレオチド間で差異のある配列をそれぞれ含みうるため、二つ（又はそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は通常、配列類似性の局部領域を同定し比較するために「比較窓」の上で二つの該ポリヌクレオチドの配列を比較することにより実施される。「比較窓」は、参照配列と比較される通常１２個の連続する残基の概念上のセグメントを指す。該比較窓は該二つの配列の最適整列について参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較されるとき約20％以下の付加又は欠失（即ちギャップ）を含みうる。比較窓を整列するための配列の最適整列は、アルゴリズム（米国ウィスコンシン州、575サイエンス・ドライブ・マディソンのジェネティックス・コンピュータ・グループのウィスコンシン・ジェネティックス・ソフトウェア・パッケージ・リリース7.0におけるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA）のコンピュータ制御された実行により又は観察により及び選択された任意の種々の方法により作成された最良整列（即ち、該比較窓にわたって最高百分率の相同性を得る）により実施されうる。例えば、アルチュルら（Nucl. Acids Res. 25:3389.1997）により開示されたプログラムのBLASTファミリーも参照されうる。配列分析の詳細な論議はオーズベルら（「分子生物学の最新プロトコル」、ジョン・ウィレイ＆ソンズ社、1994〜1998、15章）の単元19.3に見出され得る。
本明細書で用いられる「配列類似性」及び「配列同一性」という用語は、配列が比較窓の上でヌクレオチドごとに基づいて又はアミノ酸ごとに基づいて同一である低度又は機能上若しくは構造上類似する程度を指す。従って、例えば「配列同一性の百分率」は、比較の窓の上で二つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、A, T, C, G, I）又は同一のアミノ酸残基（例えば、Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys及びMet）が両配列に存在する位置の数を決定して適合する位置の数を求め、適合する位置の数を比較の窓における位置の総数（即ち、窓の大きさ）で割り、その結果に100を乗じて配列同一性の百分率を得ることにより算出される。本発明の目的上、「配列同一性」は、該ソフトウェアに添付された参照マニュアルで用いられるような標準デフォルトを用いて DNASIS コンピュータのプログラム（ウィンドウズ（登録商標）用2.5版米国カリフォルニア州南サンフランシスコの日立ソフトウェア・エンジニアリング社から購入できる）により算出される「適合の百分率」を意味すると理解されるであろう。同様なコメントは配列類似性についても当てはまる。
本明細書中、低ストリンジェンシーについての言及は、ハイブリダイゼーションにおいて少なくとも約０から少なくとも約15％v/vのホルムアミド及び少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍの塩、並びに洗浄条件として少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍの塩を含み且つ包含する。一般的に、低ストリンジェンシーは約25〜30℃から約42℃である。該温度は変更されうる。ホルムアミドを置換するため及び／又は代替のストリンジェンシー条件を付与するためにより高い温度が用いられる。必要ならば、中ストリンジェンシー（ハイブリダイゼーションにおいて少なくとも約16％v/vから少なくとも約30％v/vのホルムアミド及び少なくとも約0.5Ｍから少なくとも約0.9Ｍの塩、並びに洗浄条件として少なくとも約0.5Ｍから少なくとも約0.9Ｍの塩を含み且つ包含する）又は高ストリンジェンシー（ハイブリダイゼーションにおいて少なくとも約31％v/vから少なくとも約50％v/vのホルムアミド及び少なくとも約0.01Ｍから少なくとも約0.15Ｍの塩、並びに洗浄条件として少なくとも約0.01Ｍから少なくとも約0.15Ｍの塩を含み且つ包含する）などの代替のストリンジェンシー条件が適用されうる。一般的に、洗浄はＴｍ＝69.3＋0.41(G+C)%（マーマーとドーティ、J. Mol. Biol. 5:109, 1962）で実施される。しかしながら、二本鎖ＤＮＡのＴｍは不適合塩基対の数が1％増加するごとに１℃ずつ低下する（ボナーとラスキー、Eur. J. Biochem. 46: 83, 1974）。ホルムアミドはこれらのハイブリダイゼーション条件において任意に選択可能である。従って、特に好ましいストリンジェンシーのレベルは下記のように定義される：低ストリンジェンシーは25〜42℃で6xSSC緩衝液、0.1%w/vSDSであり、中ストリンジェンシーは20℃から65℃の範囲の温度で2xSSC緩衝液、0.1%w/vSDSであり、高ストリンジェンシーは少なくとも65℃の温度で0.1xSSC緩衝液、0.1%w/vSDSである。
「標的ポリヌクレオチド」又は「標的配列」という用語は目的のポリヌクレオチド（例えば一つの遺伝子若しくはポリヌクレオチド）又はポリヌクレオチド群（例えばポリヌクレオチドのファミリー）を指す。該標的ポリヌクレオチドはｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを指すことができる。プローブは、標的ポリヌクレオチドが所与のプローブに対して親和性を有するか否かなどの標的ポリヌクレオチドについての情報を得るために用いられる。標的ポリヌクレオチドは天然で生じた核酸分子でも人造の核酸分子でもよい。また、標的ポリヌクレオチドはそれらの未改変状態で又は他種との凝集体として用いられ得る。標的ポリヌクレオチドは直接的に又は特定の結合基体を介してのいずれかで結合相手に共有結合又は非共有結合で結びつきうる。標的ポリヌクレオチドは、プローブの配列が該標的ポリヌクレオチドの部分配列に少なくとも部分的に相補的であるプローブにハイブリダイズし得る。
これらの用語は、多くとも300、250、200、150、100、75、50、30、25又は多くとも15ヌクレオチドの長さの選択されたヌクレオチド配列を指すためにも本明細書で用いられる。標的配列は少なくとも8、10、15、25、30、35、45、50、60、70、80、90、100、120、135、150、175、200、250及び300ヌクレオチドの長さの配列を含む。標的配列の非限定的な例としては、Alu反復配列などの反復配列、遺伝子ファミリーの保存又は非保存領域、イントロン、ホグネス・ボックス及びTATAボックスを含むプロモーター配列、シグナル配列、エンハンサー、ホメオボックス、ティモボックスなどのタンパク質結合ドメイン、多型及び保存タンパク質ドメイン又はそれらの一部が挙げられるが、これらに限定されない。
ハイブリダイゼーション及び／又はレポーター・シグナルのデータは処理され、制限エンドヌクレアーゼ部位の存在又は非存在を決定する。好ましい実施態様では、デジタル・コンピュータを用いて、該プローブが相互作用の特異性を有する標的配列のいずれかの存在と該アレイ上の特異的な位置標識とを相関させる。該位置情報はどの配列相互作用が生じたかを示すデータベースに直接変換される。ハイブリダイゼーション検定で作成されたデータはプログラム可能なデジタル・コンピュータを用いて極めて容易に分析される。該コンピュータのプログラム製品は一般的にコードを保存する読み取り可能媒体を含む。ある種のファイルは各地点の配置及び該地点で該オリゴヌクレオチド・プローブの配列を含むと知られる全ての標的配列を含むメモリに充てられる。核酸アレイからのハイブリダイゼーション・データを分析するコンピュータの方法は国際特許公報第WO97/29212号及びＥＰ公報95307476.2号で教示される。好ましい実施態様において、該プログラム可能なコンピュータは、スペシャリスト・ソフトウェア・コード及び全配列のデータベース（又は特定のプローブ・アレイに関連する全副配列のデータベースの一部を含む）から導き出されるレジスタ・データを含み、ハイブリダイゼーションのパターンから、特定の標的配列が試験されたＤＮＡ試料中に存在した確率を評価する。
該コンピュータプログラム製品は標的配列とオリゴヌクレオチド・プローブの間のハイブリダイゼーション反応から得られるハイブリダイゼーション・データを入力として受信するコードも含み得る。該コンピュータのプログラム製品は該ハイブリダイゼーション・データを処理するコードをも含み得る。
データ分析は、例えば回収された該データから基体の位置の関数として該蛍光強度を決定する工程、外れ値（予め定められた統計分布から外れるデータ）を取除く工程、及び残りのデータから標的配列の相対的な結合親和性を計算する工程を含み得る。得られるデータは光放射又は標的配列とプローブとの結合親和性に従って変化する各領域の色の着いた画像として表示され得る。
一つの実施態様において、各アドレスでの結合量はハイブリダイゼーションのオン−オフ速度を調べることにより決定する。例えば、各アドレスでの結合量は、該核酸試料が該アレイと接触した後に幾つかの時点で決定される。全ハイブリダイゼーション量は各時点での結合量に基づいた結合の速度の関数として決定され得る。
当業者は、ハイブリダイゼーション速度及び雑音に対する信号についての条件を最大にするため、温度、試料攪拌、洗浄条件（例えば、pH、溶媒の特徴、温度）へのハイブリダイゼーション速度の依存性を容易に決定し得る。
該コンピュータプログラム製品は入力としてプログラマーからの指示を受信するコードも含み得る。該コンピュータプログラム製品はまた該データを提示用のフォーマットに変換しうる。
一つの実施態様において、ハイブリダイゼーション・データを処理するためのコンピュータのプログラム製品は、それぞれの標的ポリヌクレオチドについてオリゴヌクレオチド・アレイ（アレイのプローブは該ポリヌクレオチドの特異的な検出を容易にする）の地点の組み合わせを同定するコード、該アレイにおいて試料ポリヌクレオチドと該オリゴヌクレオチド・プローブとのハイブリダイゼーション反応から得られるハイブリダイゼーションのデータを入力として受信するコード、標的配列の予め定められた組み合わせのいずれかと適合するハイブリダイゼーションパターンを検索することにより、該試料ポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドのいずれを含むか否かを決定するためにハイブリダイゼーションのデータを処理するコード、レポーター分子が媒介するシグナルの存在を同定するコード、並びに該コードを保存するコンピュータの読み取り可能媒体を含む。該アレイの各地点における個々のオリゴヌクレオチド・プローブの配列を同定することは必要ではない。この点において、該ハイブリダイゼーション分析ソフトウェアは、該アレイにおける地点のどの組み合わせが特定の標的ポリヌクレオチドに対応するかを、入力として必要とするのみである。しかしながら、好ましい実施態様では、該コンピュータプログラム製品は、オリゴヌクレオチド・アレイの各地点におけるオリゴヌクレオチド・プローブの配列を入力として受信するコード及び標的ポリヌクレオチドにおける標的配列の存在又は非存在についての情報を含むデータベースを入力として受信するコードを含む。
該コンピュータプログラム製品は検出されたハイブリダイゼーションのパターンが標的ポリヌクレオチドの存在を示す確率を推理するコードをさらに含むことが好ましい。
標的配列のデータベースは定期的に更新され、各マイクロアレイを形成するプローブの各特定セットに関連するその一部も本発明の特定の商用アプリケーションを用いてそれらについて更新されるであろう。
本発明の方法はまた一つの特定の制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するが別の一部位を破壊するように改変されうる。これはより正確性を増加させ且つ偽陰性又は偽陽性の可能性を減少させる。その上、プライマーが制限エンドヌクレアーゼ部位を導入しなければならない必要はない。特定の部位は標的配列において天然に存在しうる。
本発明は核酸分子における１個のヌクレオチド又はヌクレオチド群の存在又は非存在を決定する検定装置であって、一つ以上の制限エンドヌクレアーゼにより消化された増幅産物内のヌクレオチド配列にそれぞれ相補的な固定化されたオリゴヌクレオチドのアレイ、及び固定化された該オリゴヌクレオチド・アレイに対する標的配列のハイブリダイゼーションについてスクリーニングする手段を含む装置を更に提供する。該検定装置はまた販売用に包装され、使用のための取扱い説明書を含みうる。
本発明は下記の非限定的な実施例により更に説明される。
図１は、コンネキシン２６遺伝子におけるホモ接合の存在若しくは非存在又は３５ΔＧ突然変異のヘテロ接合形の存在を決定する遺伝検定の図式表示である。 図２は、(A)嚢胞性線維症の遺伝子検査のための野生型(WT)標的配列、(B)二つのＡ→Ｃ置換をもちXcmI部位を創り出すＷＴ配列、(C)XcmI部位を破壊するがBstXI部位を創り出すＣＴＴ欠失を示す図式表示である。 図３は、ΔＦ５０８突然変異をコードすると推定されるＤＮＡを増幅した後、増幅産物の電気泳動分離を示す写真である。該標的配列は＜４００＞２に記載する（実施例４）。ＸはXcmI、ＢはBstXI、ｍはマーカー、Ｎ/Ｎはホモ接合の正常、ΔＦ５０８/ΔＦ５０８はホモ接合の突然変異、Ｎ/ΔＦ５０８はヘテロ接合的突然変異。 図４は、コンネキシン２６遺伝子におけるホモ接合の存在若しくは非存在又は３５ΔＧ突然変異のヘテロ接合形の存在を決定するための遺伝検定の図である。これは図１に記載された方法の改変版である。この方法はそれらが切断されたとき一本鎖ＤＮＡにアニールする二重標識されたプローブを用いる。
遺伝的デフネス検定の開発：EcoRII検定
この検定では、コンネキシン26遺伝子における35番目のヌクレオチドでの突然変異がホモ接合状態又はヘテロ接合状態のいずれかであることが同定される。該突然変異は35番目の位置でのグアニンの欠失である。この突然変異は「35ΔＧ」と呼ばれる。
それぞれ異なるレポーター分子で標識され、その少なくとも一つが固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に適合し相補的なヌクレオチド配列を含むものである二つのプライマーが開発された。該プライマー上のこの配列は「タグ」配列と呼ばれる。便宜上、一例においては、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）がＧｅｎＦｌｅｘ（商標）タグ・アレイを合体させる際に用いられる。従って、該プライマーはレポーター分子を単独で又は（固体支持体に固定された適合配列及び相補的配列を有する）タグ配列に連結させてレポーター分子を含む。この例において、一つのプライマーは前向きプライマーの35ΔＧ領域の両側に隣接する領域及び逆向きプライマーのこの位置の下流にある領域に相補的なヌクレオチド配列と連結したタグ配列を含む。一例において、該逆向きプライマーは野生型配列に塩基の変化を導入することにより、EcoRII部位を創出する。該標的配列が35ΔＧ突然変異を含む場合、該EcoRII部位は失われる。これはEcoRIIがＷがＡ又はＴである５′ＣＣＷＧＧ３′というヌクレオチド配列を認識するためである。コンネキシン26遺伝子では、EcoRIIにより認識されるヌクレオチド配列は５′ＣＣＴＧＧ３′である。しかしながら、35ΔＧ突然変異は３′位置で該Ｇを除去するので、35ΔＧ試料から得られる増幅産物は消化されないが野生型配列は消化される。増幅及びEcoRIIでの消化の後、増幅産物の一本鎖形は固体支持体上で固定化されたオリゴヌクレオチドに曝される。この検定は図１に示す。
観察され得るように、該標的配列がホモ接合の野生型である場合、全ての増幅産物が消化されるため、該逆向きプライマーと結びついたレポーター分子は取除かれる。固定化された相補的な（アンチセンス）オリゴヌクレオチド（＋）は該前向きプライマーと結びついたタグの捕捉を可能にする。固定化された適合（センス）オリゴヌクレオチド（−）はＰＣＲの間に逆向きプライマーの伸長により作製されたタグに相補的な配列（即ち、前向きプライマーの伸長により作製された鎖に対して相補的な鎖）の捕捉を可能にする。制限酵素の消化にもかかわらず、該前向きプライマーと結びついたレポーター分子は該前向きプライマーと結びついたタグに特異的で且つ固定化されたオリゴヌクレオチド対の（＋）地点で常に検出される。該逆向きプライマーと結びついたレポーター分子はEcoRII消化により切り離されたため、レポーター分子は固定化されたオリゴヌクレオチド対の（−）地点では検出されない。即ち、前向きプライマーからのシグナルの逆向きプライマーからのシグナルの比は１：０のオーダーである。
該35ΔＧ突然変異がホモ接合の状態で存在する場合、いずれの増幅産物の消化もなく、両プライマー上の両レポーター分子は等しく即ち約１：１の比で表示される。
該35ΔＧ突然変異がヘテロ接合の状態である場合、該突然変異を持つヌクレオチド配列から得られる増幅産物は切断されないが、該突然変異を持たないヌクレオチド配列から得られる増幅産物では切断が生じる。そのため、全増幅における約半分の分子が切断される。従って、前向きプライマーからのシグナルの逆向きプライマーからのシグナルに対する比は約１：0.5である。
遺伝的デフネス検定の開発：DdeI検定
この検定では、実施例１で採用されたものと同じアプローチであるが該35ΔＧ配列にDdeI部位を創出させるために突然変異が導入される。従って、標的の変異型はDdeIにより切断されるであろうが、その野生型配列は切断されないであろう。
遺伝的デフネス検定の開発：BclI検定
この検定の目的はシトシンからアデニンに変更することにより、Cx26遺伝子中にBclI部位を創出するためにプライマーを用いることである。該標的ヌクレオチド配列は下記の通りである。
ＣＧＣ ＡＴＴ ＡＴＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＧＴＴ ＧＴＧ（配列番号：１）
逆向きプライマーは、該ＴＧＡＴＣＣ配列がBclIの認識配列であるＴＧＡＴＣＡになるような不適合を創出する。この改変された配列に基づく野生型の増幅産物はBclIにより消化可能である。遺伝的デフネスをもたらすＡＴＧコドンの突然変異はＡＣＧへのコドン変化（即ちＴ→Ｃの置換）を結果として生ずる。これはＭ３４Ｔ置換に相当する。BclI部位、即ちＴＧＡＴＣＡはＣＧＡＴＣＡになるため、この突然変異をもつ増幅産物はもはやBclIにより消化され得ない。
嚢胞性線維症についての検定の開発
この検定はXcmI及びBstXIの酵素認識配列に基礎を置いている。嚢胞性線維症遺伝子は下記の標的配列を含む。
５′ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＴＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＣＣ ＴＡ（配列番号：２）
嚢胞性線維症の潜在的な発症を生じる突然変異は508番目の位置でのフェニルアラニン残基の欠失即ちΔＦ508 を含む。これはＣＴＴコドンの欠失に起因する。
第一工程は逆向きプライマーを用いて二つのＡ→Ｃ置換を導入しXcmI部位：ＣＣＡ(Ｎ)9ＴＧＧを創出させることである。
その結果、野生型の増幅産物はXcmIにより消化される。該ＣＴＴコドンが欠失している場合（図２を参照）は、XcmIは増幅された該ＤＮＡを消化しない。
BstXIはＣＣＡ（Ｎ）6ＴＧＧという認識配列を有する。BstXIは該野生型配列を消化しない（図２）。ＣＴＴの欠失及びＡ→Ｃの置換はBstXI部位を創出する。従って、該ＣＴＴ欠失が生じた場合、該増幅産物はXcmI-ve/BstXI+veである一方、該野生型はXcmI+ve/BstXI-veである。
この検定は実施例１〜３の場合のように固体アレイ技術を用いて実施するか又は電気泳動分離と組み合わせて使用しうる。該増幅プライマーの配列はレポーター分子及び／又はタグ配列で標識される必要はない。電気泳動分離の１例は図３に示す。ホモ接合の正常(N/N)、ホモ接合の異常(ΔＦ508/ΔＦ508) 及びヘテロ接合の正常(N/ΔＦ508) の間で異なる制限パターンが観察され得る。
嚢胞性線維症についての組み合わせ検定
組み合わせ検定は生化学的試験及び遺伝的試験を用いて実施される。
組み合わせ検定では、全乳児が嚢胞性線維症についての生化学的試験にかけられる。突然変異の生化学的徴候がない場合、その乳児は非危険性の範疇におかれる。該生化学的試験が突然変異の存在を示唆する場合、実施例４で概述したように遺伝子検査が行われる。ゲル電気泳動（ポリアクリルアミド又はアガロースのゲル電気泳動）はXcmI及び／又はBstXIのいずれか若しくは両方を用いて実施され、又はアレイ技術が用いられうる。
チップ技術の開発
表１はＰＣＲオリゴと併せて用いられる15個のタグの一覧を提供する。表２はチップ・プローブの一覧である。これらは該アレイに固定されるセンス及びアンチセンスの捕捉プローブである。
Figure 2010022383
Figure 2010022383
二重標識プローブを伴う検定の開発
図４は二重標識オリゴヌクレオチド・プライマーを用いる改変された検定の図式表示である。この二重標識プライマーは一本鎖ＤＮＡに連結し、次いで切断される。
当業者は、本明細書に記載された本発明が詳細に記載されたもの以外の変形及び修飾を受け易いことを理解するであろう。本発明はこのようなあらゆる変形及び修飾を包含することが理解されるべきである。本発明は、この明細書中で言及し又は示した工程、特徴、組成物及び化合物の全ても個別に又は集合的に包含し、そして任意の二つ以上の該工程若しくは特徴の任意の組合わせ及びあらゆる組合わせも包含する。

Claims (48)

  1. 標的ヌクレオチド配列内における一以上のヌクレオチドのホモ接合的変化又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
    前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーの少なくとも一つが、両プライマーが標識されている場合、他のレポーター分子から識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できるレポーター分子で標識されるものであり、そして少なくとも一つのプライマー及びその相補形が固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含むものであり、そして該前向き及び逆向きプライマーの一つ以上が一以上のヌクレオチドの変化の存在下若しくは非存在下で該増幅産物内に標的部位を導入し、破壊し又はハイブリダイズするものである工程、及び
    該増幅産物を検出手段にかける工程、
    を含む方法
  2. 該検出手段がレポーター分子によるシグナルの相対比又はシグナルの欠如を検出する工程であって、異種シグナルの均等比又は唯一つのシグナルの実質的存在が該標的ヌクレオチド配列における変化のホモ接合的存在又は非存在を表すものであり、異種シグナルの存在が該標的ヌクレオチド配列における該変化のヘテロ接合的存在又は非存在を表すものである工程を含むものである、請求項１記載の方法。
  3. 該増幅産物内の標的部位が制限エンドヌクレアーゼ部位であり、該増幅産物がその部位が該増幅産物中に潜在的に導入され若しくは破壊された制限エンドヌクレアーゼで消化されるものであり、ハイブリダイゼーションに付された該増幅産物の一本鎖形を、少なくとも一つのプライマーにより導入された増幅配列の一部にセンスである又は相補的であるオリゴヌクレオチドを含む該固定化オリゴヌクレオチドの組にアニーリングさせる条件に付するものである、請求項１記載の方法。
  4. 該前向き又は逆向きプライマーの一つ以上が増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するものである、請求項３記載の方法。
  5. 該固体支持体がガラス、及びセルロース、ニトロセルロース、セラミック材料、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン及びその誘導体、ポリビニリデンジフルオリド、メタクリレート及びその誘導体、ポリビニルクロリド、及びポリプロピレンなどのポリマーを構成するリストから選択されるものである、請求項１〜請求項４いずれか１項に記載の方法。
  6. 該固体支持体がガラスである、請求項５記載の方法。
  7. ２以上のオリゴヌクレオチド配列がアレイの形状で固体支持体に固定されているものである、請求項１〜請求項６いずれか１項に記載の方法。
  8. 制限エンドヌクレアーゼ部位が、AatI, AatII, AauI, Acc113I, Acc16I, Acc65I, AccB1I, AccB7I, AccBSI, AccI, AccII, AccIII, AceIII, AciI, AclI, AclNI, AclWI, AcsI, AcyI, AdeI, AfaI, AfeI, AflII, AflIII, AgeI, AhaIII, AhdI, AluI, Alw21I, Alw26I, Alw44I, AlwI, AlwNI, Ama87I, AocI, Aor51HI, ApaBI, ApaI, ApaLI, ApoI, AscI, AseI, AsiAI, AsnI, Asp700I, Asp718I, AspEI, AspHI, AspI, AspLEI, AspS9I, AsuC2I, AsuHPI, AsuI, AsuII, AsuNHI, AvaI, AvaII, AvaIII, AviII, AvrII, AxyI, BaeI, BalI, BamHI, BanI, BanII, BanIII, BbeI, BbiII, BbrPI, BbsI, BbuI, Bbv12I, BbvCI, BbvI, BbvII, BccI, Bce83I, BcefI, BcgI, BciVI, BclI, BcnI, BcoI, BcuI, BetI, BfaI, BfiI, BfmI, BfrI, BglI, BglII, BinI, BlnI, BlpI, Bme18I, BmgI, BmrI, BmyI, BpiI, BplI, BpmI, Bpu10I, Bpu1102I, Bpu14I, BpuAI, Bsa29I, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaI, BsaJI, BsaMI, BsaOI, BsaWI, BsaXI, BsbI, Bsc4I, BscBI, BscCI, BscFI, BscGI, BscI, Bse118I, Bse1I, Bse21I, Bse3DI, Bse8I, BseAI, BseCI, BseDI, BseGI, BseLI, BseMII, BseNI, BsePI, BseRI, BseX3I, BsgI, Bsh1236I, Bsh1285I, Bsh1365I, BshI, BshNI, BsiBI, BsiCI, BsiEI, BsiHKAI, BsiI, BsiLI, BsiMI, BsiQI, BsiSI, BsiWI, BsiXI, BsiYI, BsiZI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BsoBI, Bsp106I, Bsp119I, Bsp120I, Bsp1286I, Bsp13I, Bsp1407I, Bsp143I, Bsp143II, Bsp1720I, Bsp19I, Bsp24I, Bsp68I, BspA2I, BspCI, BspDI, BspEI, BspGI, BspHI, BspLI, BspLU11I, BspMI, BspMII, BspTI, BspXI, BsrBI, BsrBRI, BsrDI, BsrFI, BsrGI, BsrI, BsrSI, BssAI, BssHII, BssKI, BssNAI, BssSI, BssT1I, Bst1107I, Bst2BI, Bst2UI, Bst4CI, Bst71I, Bst98I, BstACI, BstAPI, BstBAI, BstBI, BstDEI, BstDSI, BstEII, BstF5I, BstH2I, BstHPI, BstMCI, BstNI, BstNSI, BstOI, BstPI, BstSFI, BstSNI, BstUI, BstX2I, BstXI, BstYI, BstZ17I, BstZI, Bsu15I, Bsu36I, Bsu6I, BsuRI, BtgI, BtsI, Cac8I, CauII, CbiI, CciNI, CelII, CfoI, Cfr10I, Cfr13I, Cfr42I, Cfr9I, CfrI, CjeI, CjePI, ClaI, CpoI, Csp45I, Csp6I, CspI, CviJI, CviRI, CvnI, DdeI, DpnI, DpnII, DraI, DraII, DraIII, DrdI, DrdII, DsaI, DseDI, EaeI, EagI, Eam1104I, Eam1105I, EarI, EciI, Ecl136II, EclHKI, EclXI, Eco105I, Eco130I, Eco147I, Eco24I, Eco255I, Eco31I, Eco32I, Eco47I, Eco47III, Eco52I, Eco57I, Eco64I, Eco72I, Eco81I, Eco88I, Eco91I, EcoICRI, EcoNI, EcoO109I, EcoO65I, EcoRI, EcoRII, EcoRV, EcoT14I, EcoT22I, EcoT38I, EgeI, EheI, ErhI, Esp1396I, Esp3I, EspI, FauI, FauNDI, FbaI, FinI, Fnu4HI, FnuDII, FokI, FriOI, FseI, Fsp4HI, FspI, GdiII, GsuI, HaeI, HaeII, HaeIII, HaeIV, HapII, HgaI, HgiAI, HgiCI, HgiEI, HgiEII, HgiJII, HhaI, Hin1I, Hin2I, Hin4I, Hin6I, HincII, HindII, HindIII, HinfI, HinP1I, HpaI, HpaII, HphI, Hsp92I, Hsp92II, HspAI, ItaI, KasI, Kpn2I, KpnI, Ksp22I, Ksp632I, KspAI, KspI, Kzo9I, LspI, MaeI, MaeII, MaeIII, MamI, MbiI, MboI, MboII, McrI, MfeI, MflI, MlsI, MluI, MluNI, Mly113I, MmeI, MnlI, Mph1103I, MroI, MroNI, MroXI, MscI, MseI, MslI, Msp17I, MspA1I, MspCI, MspI, MspR9I, MstI, MunI, Mva1269I, MvaI, MvnI, MwoI, NaeI, NarI, NciI, NcoI, NdeI, NdeII, NgoAIV, NgoMIV（NgoMIとして以前知られる），NheI, NlaIII, NlaIV, NotI, NruGI, NruI, NsbI, NsiI, NspBII, NspI, NspV, PacI, PaeI, PaeR7I, PagI, PalI, PauI, Pfl1108I, Pfl23II, PflFI, PflMI, PinAI, Ple19I, PleI, PmaCI, Pme55I, PmeI, PmlI, Ppu10I, PpuMI, PshAI, PshBI, Psp124BI, Psp1406I, Psp5II, PspAI, PspEI, PspLI, PspN4I, PspOMI, PspPPI, PstI, PvuI, PvuII, RcaI, RleAI, RsaI, RsrII, SacI, SacII, SalI, SanDI, SapI, Sau3AI, Sau96I, SauI, SbfI, ScaI, SchI, ScrFI, SdaI, SduI, SecI, SexAI, SfaNI, SfcI, SfeI, SfiI, SfoI, Sfr274I, Sfr303I, SfuI, SgfI, SgrAI, SimI, SinI, SmaI, SmiI, SmlI, SnaBI, SnaI, SpeI, SphI, SplI, SrfI, Sse8387I, Sse8647I, Sse9I, SseBI, SspBI, SspI, SstI, SstII, StuI, StyI, SunI, SwaI, TaiI, TaqI, TaqII, TatI, TauI, TfiI, ThaI, Tru1I, Tru9I, TscI, TseI, Tsp45I, Tsp4CI, Tsp509I, TspEI, TspRI, Tth111I, Tth111II, TthHB8I, UbaDI, UbaEI, UbaLI, UbaOI, Van91I, Vha464I, VneI, VspI, XagI, XbaI, XcmI, XhoI, XhoII, XmaCI, XmaI, XmaIII及びXmnI, Zsp2Iを含むリストから選択される制限酵素により認識されるものである、請求項３〜請求項７いずれか１項に記載の方法。
  9. 該レポーター分子が、クロラムフェニコール、無色のガラクトシド（galactosidase)、無色のグルクロニド、ルシフェリン、及び緑色蛍光タンパク質を含むリストから選択されるものである、請求項１〜請求項８いずれか１項に記載の方法。
  10. 該標的ヌクレオチド配列が哺乳動物細胞又は植物細胞などの真核細胞中にあるものである、請求項３〜請求項９いずれか１項に記載の方法。
  11. 該細胞が植物細胞である、請求項１０記載の方法。
  12. 該細胞が哺乳動物細胞であり且つ該標的配列が一以上の既知の遺伝的突然変異を含む疾病状態と関連するものである、請求項１０記載の方法。
  13. 該哺乳動物細胞がヒト細胞であり且つ該疾病状態が副腎脳白質ジストロフィー，アテローム性動脈硬化，ゴーシェ病，迂曲状萎縮(gyrate atrophy)，若年発症糖尿病，肥満，発作性夜間血色素尿症，フェニルケトン尿症，レフサム病，タングラー病 (tangler disease)，及び嚢胞性線維症，難聴，変形形成異常 (diastrophic dysplasia)，ＱＴ延長症候群，メンケズ症候群，ペンドレッド症候群，多発性嚢胞腎，鎌形赤血球貧血，ウィルソン病及びツェルウェガー症候群などの輸送体，チャネル及びポンプを含むヘモクロマトーシス状態；毛細血管拡張性運動失調，禿頭症，コケーン症候群，緑内障，結節硬化症，ワールデンブルヒ症候群及びヴェルナー症候群などのシグナル伝達に関与する状態；アルツハイマー病，筋萎縮性側索硬化症，アングレマン症候群(Angleman syndrome) ，シャルコー・マリー・ツース病，癲癇，本態性振戦，脆弱Ｘ症候群，フリードライヒ失調症，ハンチントン病，ニーマン−ピック病，パーキンソン病，プラーダー−ヴィリ症候群，レット症候群，脊髄小脳萎縮症 (spinocerebella atrophy) 及びウィリアムズ症候群などの脳に関与する状態；並びにデュシェンヌ型筋ジストロフィー，エリス−ファン・クレフェルト症候群，マルファン症候群及び筋強直性ジストロフィーなどの骨格に関与する状態を含むリストから選択されるものである、請求項１２記載の方法。
  14. 標的ヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドにおけるホモ接合的又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
    前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーのそれぞれが、互いに識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できるレポーター分子で標識されるものであり、プライマー及びその相補形の少なくとも一つが固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含むものであり、該前向き又は逆向きプライマーの一つ以上が、一以上のヌクレオチドの変化の存在下又は非存在下で、該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入又は破壊するものである工程、
    そのエンドヌクレアーゼ部位が該増幅産物に潜在的に導入され又は破壊されている制限エンドヌクレアーゼで該増幅産物を消化し、ハイブリダイゼーションにかけられた増幅産物の一本鎖形を、少なくとも一つのプライマーにより導入された増幅産物の一部にセンス又は相補的であるオリゴヌクレオチドを含む該固定化オリゴヌクレオチドの一組にアニーリングさせる条件に付す工程、及び
    該レポーター分子によるシグナルの相対比を検出する工程であり、異なるシグナルの均等比又は唯一つのシグナルの実質的存在が該標的ヌクレオチド配列における変化のホモ接合的存在又は非存在を表すものであり、異なるシグナルの存在が標的ヌクレオチド配列における該変化のヘテロ接合的存在又は非存在を表すものである工程、
    を含む方法。
  15. 該前向き又は逆向きプライマーの一つ以上が増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するものである、請求項１４記載の方法。
  16. 該固体支持体が、ガラス、セルロース、ニトロセルロース、セラミック材料、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン及びその誘導体、ポリビニリデン・ジフルオライド、メタクリレート及びその誘導体、ポリビニルクロリド及びポリプロピレンを含むリストから選択されるものである、請求項１４又は請求項１５記載の方法。
  17. 該固体支持体がガラスである、請求項１６記載の方法。
  18. 二以上のオリゴヌクレオチド配列がアレイの形状で固体支持体に固定されているものである、請求項１４〜請求項１７いずれか１項に記載の方法。
  19. 該制限エンドヌクレアーゼ部位が、AatI, AatII, AauI, Acc113I, Acc16I, Acc65I, AccB1I, AccB7I, AccBSI, AccI, AccII, AccIII, AceIII, AciI, AclI, AclNI, AclWI, AcsI, AcyI, AdeI, AfaI, AfeI, AflII, AflIII, AgeI, AhaIII, AhdI, AluI, Alw21I, Alw26I, Alw44I, AlwI, AlwNI, Ama87I, AocI, Aor51HI, ApaBI, ApaI, ApaLI, ApoI, AscI, AseI, AsiAI, AsnI, Asp700I, Asp718I, AspEI, AspHI, AspI, AspLEI, AspS9I, AsuC2I, AsuHPI, AsuI, AsuII, AsuNHI, AvaI, AvaII, AvaIII, AviII, AvrII, AxyI, BaeI, BalI, BamHI, BanI, BanII, BanIII, BbeI, BbiII, BbrPI, BbsI, BbuI, Bbv12I, BbvCI, BbvI, BbvII, BccI, Bce83I, BcefI, BcgI, BciVI, BclI, BcnI, BcoI, BcuI, BetI, BfaI, BfiI, BfmI, BfrI, BglI, BglII, BinI, BlnI, BlpI, Bme18I, BmgI, BmrI, BmyI, BpiI, BplI, BpmI, Bpu10I, Bpu1102I, Bpu14I, BpuAI, Bsa29I, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaI, BsaJI, BsaMI, BsaOI, BsaWI, BsaXI, BsbI, Bsc4I, BscBI, BscCI, BscFI, BscGI, BscI, Bse118I, Bse1I, Bse21I, Bse3DI, Bse8I, BseAI, BseCI, BseDI, BseGI, BseLI, BseMII, BseNI, BsePI, BseRI, BseX3I, BsgI, Bsh1236I, Bsh1285I, Bsh1365I, BshI, BshNI, BsiBI, BsiCI, BsiEI, BsiHKAI, BsiI, BsiLI, BsiMI, BsiQI, BsiSI, BsiWI, BsiXI, BsiYI, BsiZI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BsoBI, Bsp106I, Bsp119I, Bsp120I, Bsp1286I, Bsp13I, Bsp1407I, Bsp143I, Bsp143II, Bsp1720I, Bsp19I, Bsp24I, Bsp68I, BspA2I, BspCI, BspDI, BspEI, BspGI, BspHI, BspLI, BspLU11I, BspMI, BspMII, BspTI, BspXI, BsrBI, BsrBRI, BsrDI, BsrFI, BsrGI, BsrI, BsrSI, BssAI, BssHII, BssKI, BssNAI, BssSI, BssT1I, Bst1107I, Bst2BI, Bst2UI, Bst4CI, Bst71I, Bst98I, BstACI, BstAPI, BstBAI, BstBI, BstDEI, BstDSI, BstEII, BstF5I, BstH2I, BstHPI, BstMCI, BstNI, BstNSI, BstOI, BstPI, BstSFI, BstSNI, BstUI, BstX2I, BstXI, BstYI, BstZ17I, BstZI, Bsu15I, Bsu36I, Bsu6I, BsuRI, BtgI, BtsI, Cac8I, CauII, CbiI, CciNI, CelII, CfoI, Cfr10I, Cfr13I, Cfr42I, Cfr9I, CfrI, CjeI, CjePI, ClaI, CpoI, Csp45I, Csp6I, CspI, CviJI, CviRI, CvnI, DdeI, DpnI, DpnII, DraI, DraII, DraIII, DrdI, DrdII, DsaI, DseDI, EaeI, EagI, Eam1104I, Eam1105I, EarI, EciI, Ecl136II, EclHKI, EclXI, Eco105I, Eco130I, Eco147I, Eco24I, Eco255I, Eco31I, Eco32I, Eco47I, Eco47III, Eco52I, Eco57I, Eco64I, Eco72I, Eco81I, Eco88I, Eco91I, EcoICRI, EcoNI, EcoO109I, EcoO65I, EcoRI, EcoRII, EcoRV, EcoT14I, EcoT22I, EcoT38I, EgeI, EheI, ErhI, Esp1396I, Esp3I, EspI, FauI, FauNDI, FbaI, FinI, Fnu4HI, FnuDII, FokI, FriOI, FseI, Fsp4HI, FspI, GdiII, GsuI, HaeI, HaeII, HaeIII, HaeIV, HapII, HgaI, HgiAI, HgiCI, HgiEI, HgiEII, HgiJII, HhaI, Hin1I, Hin2I, Hin4I, Hin6I, HincII, HindII, HindIII, HinfI, HinP1I, HpaI, HpaII, HphI, Hsp92I, Hsp92II, HspAI, ItaI, KasI, Kpn2I, KpnI, Ksp22I, Ksp632I, KspAI, KspI, Kzo9I, LspI, MaeI, MaeII, MaeIII, MamI, MbiI, MboI, MboII, McrI, MfeI, MflI, MlsI, MluI, MluNI, Mly113I, MmeI, MnlI, Mph1103I, MroI, MroNI, MroXI, MscI, MseI, MslI, Msp17I, MspA1I, MspCI, MspI, MspR9I, MstI, MunI, Mva1269I, MvaI, MvnI, MwoI, NaeI, NarI, NciI, NcoI, NdeI, NdeII, NgoAIV, NgoMIV（NgoMIとして以前知られる）, NheI, NlaIII, NlaIV, NotI, NruGI, NruI, NsbI, NsiI, NspBII, NspI, NspV, PacI, PaeI, PaeR7I, PagI, PalI, PauI, Pfl1108I, Pfl23II, PflFI, PflMI, PinAI, Ple19I, PleI, PmaCI, Pme55I, PmeI, PmlI, Ppu10I, PpuMI, PshAI, PshBI, Psp124BI, Psp1406I, Psp5II, PspAI, PspEI, PspLI, PspN4I, PspOMI, PspPPI, PstI, PvuI, PvuII, RcaI, RleAI, RsaI, RsrII, SacI, SacII, SalI, SanDI, SapI, Sau3AI, Sau96I, SauI, SbfI, ScaI, SchI, ScrFI, SdaI, SduI, SecI, SexAI, SfaNI, SfcI, SfeI, SfiI, SfoI, Sfr274I, Sfr303I, SfuI, SgfI, SgrAI, SimI, SinI, SmaI, SmiI, SmlI, SnaBI, SnaI, SpeI, SphI, SplI, SrfI, Sse8387I, Sse8647I, Sse9I, SseBI, SspBI, SspI, SstI, SstII, StuI, StyI, SunI, SwaI, TaiI, TaqI, TaqII, TatI, TauI, TfiI, ThaI, Tru1I, Tru9I, TscI, TseI, Tsp45I, Tsp4CI, Tsp509I, TspEI, TspRI, Tth111I, Tth111II, TthHB8I, UbaDI, UbaEI, UbaLI, UbaOI, Van91I, Vha464I, VneI, VspI, XagI, XbaI, XcmI, XhoI, XhoII, XmaCI, XmaI, XmaIII及びXmnI, Zsp2Iを含むリストから選択される制限酵素により認識されるものである請求項１４〜請求項１８いずれか１項に記載の方法。
  20. 該レポーター分子がクロラムフェニコール、無色のガラクトシド（galactosidase)、無色のグルクロニド、ルシフェリン、及び緑色蛍光タンパク質を含むリストから選択されるものである、請求項１４〜請求項２０いずれか１項に記載の方法。
  21. 該標的ヌクレオチド配列が哺乳動物細胞又は植物細胞などの真核細胞の中に存在するものである、請求項１４〜請求項２０いずれか１項に記載の方法。
  22. 該細胞が植物細胞である、請求項２１記載の方法。
  23. 該細胞が哺乳動物細胞であり且つ該標的配列が一以上の既知の遺伝的突然変異を含む疾病状態と関連するものである、請求項２１記載の方法。
  24. 該哺乳動物細胞がヒト細胞であり且つ該疾病状態が副腎脳白質ジストロフィー，アテローム性動脈硬化，ゴーシェ病，迂曲状萎縮(gyrate atrophy)，若年発症糖尿病，肥満，発作性夜間血色素尿症，フェニルケトン尿症，レフサム病，タングラー病 (tangler disease)，及び嚢胞性線維症，難聴，変形形成異常 (diastrophic dysplasia)，ＱＴ延長症候群，メンケズ症候群，ペンドレッド症候群，多発性嚢胞腎，鎌形赤血球貧血，ウィルソン病及びツェルウェガー症候群などの輸送体，チャネル及びポンプを含むヘモクロマトーシス状態；毛細血管拡張性運動失調，禿頭症，コケーン症候群，緑内障，結節硬化症，ワールデンブルヒ症候群及びヴェルナー症候群などのシグナル伝達に関与する状態；アルツハイマー病，筋萎縮性側索硬化症，アングレマン症候群(Angleman syndrome) ，シャルコー・マリー・ツース病，癲癇，本態性振戦，脆弱Ｘ症候群，フリードライヒ失調症，ハンチントン病，ニーマン−ピック病，パーキンソン病，プラーダー−ヴィリ症候群，レット症候群，脊髄小脳萎縮症 (spinocerebella atrophy) 及びウィリアムズ症候群などの脳に関与する状態；並びにデュシェンヌ型筋ジストロフィー，エリス−ファン・クレフェルト症候群，マルファン症候群及び筋強直性ジストロフィーなどの骨格に関与する状態を含むリストから選択されるものである、請求項２３記載の方法。
  25. 標的ヌクレオチド配列内における一以上のヌクレオチドのホモ接合的変化又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
    前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、該プライマーのそれぞれが、互いに識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できるレポーター分子で標識されるものであり、該前向き又は逆向きプライマーの一つ以上が一以上のヌクレオチドの変化の存在下又は非存在下において該増幅産物内で制限エンドヌクレアーゼ部位を導入又は破壊するものである工程、及び
    そのエンドヌクレアーゼの部位が該増幅産物に潜在的に導入又は破壊されている制限エンドヌクレアーゼで該増幅産物を消化し、消化された増幅産物を電気泳動分離ができる状態に置く工程であり、電気泳動分離のパターン及び／又はレポーター分子のシグナル発信のパターンが標的配列における該変化のホモ接合的存在若しくは非存在又はヘテロ接合的存在若しくは非存在を示すものである工程、
    を含む方法。
  26. 該前向き又は逆向きプライマーの一つ以上が増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するものである、請求項２５記載の方法。
  27. 該制限エンドヌクレアーゼ部位が、AatI, AatII, AauI, Acc113I, Acc16I, Acc65I, AccB1I, AccB7I, AccBSI, AccI, AccII, AccIII, AceIII, AciI, AclI, AclNI, AclWI, AcsI, AcyI, AdeI, AfaI, AfeI, AflII, AflIII, AgeI, AhaIII, AhdI, AluI, Alw21I, Alw26I, Alw44I, AlwI, AlwNI, Ama87I, AocI, Aor51HI, ApaBI, ApaI, ApaLI, ApoI, AscI, AseI, AsiAI, AsnI, Asp700I, Asp718I, AspEI, AspHI, AspI, AspLEI, AspS9I, AsuC2I, AsuHPI, AsuI, AsuII, AsuNHI, AvaI, AvaII, AvaIII, AviII, AvrII, AxyI, BaeI, BalI, BamHI, BanI, BanII, BanIII, BbeI, BbiII, BbrPI, BbsI, BbuI, Bbv12I, BbvCI, BbvI, BbvII, BccI, Bce83I, BcefI, BcgI, BciVI, BclI, BcnI, BcoI, BcuI, BetI, BfaI, BfiI, BfmI, BfrI, BglI, BglII, BinI, BlnI, BlpI, Bme18I, BmgI, BmrI, BmyI, BpiI, BplI, BpmI, Bpu10I, Bpu1102I, Bpu14I, BpuAI, Bsa29I, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaI, BsaJI, BsaMI, BsaOI, BsaWI, BsaXI, BsbI, Bsc4I, BscBI, BscCI, BscFI, BscGI, BscI, Bse118I, Bse1I, Bse21I, Bse3DI, Bse8I, BseAI, BseCI, BseDI, BseGI, BseLI, BseMII, BseNI, BsePI, BseRI, BseX3I, BsgI, Bsh1236I, Bsh1285I, Bsh1365I, BshI, BshNI, BsiBI, BsiCI, BsiEI, BsiHKAI, BsiI, BsiLI, BsiMI, BsiQI, BsiSI, BsiWI, BsiXI, BsiYI, BsiZI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BsoBI, Bsp106I, Bsp119I, Bsp120I, Bsp1286I, Bsp13I, Bsp1407I, Bsp143I, Bsp143II, Bsp1720I, Bsp19I, Bsp24I, Bsp68I, BspA2I, BspCI, BspDI, BspEI, BspGI, BspHI, BspLI, BspLU11I, BspMI, BspMII, BspTI, BspXI, BsrBI, BsrBRI, BsrDI, BsrFI, BsrGI, BsrI, BsrSI, BssAI, BssHII, BssKI, BssNAI, BssSI, BssT1I, Bst1107I, Bst2BI, Bst2UI, Bst4CI, Bst71I, Bst98I, BstACI, BstAPI, BstBAI, BstBI, BstDEI, BstDSI, BstEII, BstF5I, BstH2I, BstHPI, BstMCI, BstNI, BstNSI, BstOI, BstPI, BstSFI, BstSNI, BstUI, BstX2I, BstXI, BstYI, BstZ17I, BstZI, Bsu15I, Bsu36I, Bsu6I, BsuRI, BtgI, BtsI, Cac8I, CauII, CbiI, CciNI, CelII, CfoI, Cfr10I, Cfr13I, Cfr42I, Cfr9I, CfrI, CjeI, CjePI, ClaI, CpoI, Csp45I, Csp6I, CspI, CviJI, CviRI, CvnI, DdeI, DpnI, DpnII, DraI, DraII, DraIII, DrdI, DrdII, DsaI, DseDI, EaeI, EagI, Eam1104I, Eam1105I, EarI, EciI, Ecl136II, EclHKI, EclXI, Eco105I, Eco130I, Eco147I, Eco24I, Eco255I, Eco31I, Eco32I, Eco47I, Eco47III, Eco52I, Eco57I, Eco64I, Eco72I, Eco81I, Eco88I, Eco91I, EcoICRI, EcoNI, EcoO109I, EcoO65I, EcoRI, EcoRII, EcoRV, EcoT14I, EcoT22I, EcoT38I, EgeI, EheI, ErhI, Esp1396I, Esp3I, EspI, FauI, FauNDI, FbaI, FinI, Fnu4HI, FnuDII, FokI, FriOI, FseI, Fsp4HI, FspI, GdiII, GsuI, HaeI, HaeII, HaeIII, HaeIV, HapII, HgaI, HgiAI, HgiCI, HgiEI, HgiEII, HgiJII, HhaI, Hin1I, Hin2I, Hin4I, Hin6I, HincII, HindII, HindIII, HinfI, HinP1I, HpaI, HpaII, HphI, Hsp92I, Hsp92II, HspAI, ItaI, KasI, Kpn2I, KpnI, Ksp22I, Ksp632I, KspAI, KspI, Kzo9I, LspI, MaeI, MaeII, MaeIII, MamI, MbiI, MboI, MboII, McrI, MfeI, MflI, MlsI, MluI, MluNI, Mly113I, MmeI, MnlI, Mph1103I, MroI, MroNI, MroXI, MscI, MseI, MslI, Msp17I, MspA1I, MspCI, MspI, MspR9I, MstI, MunI, Mva1269I, MvaI, MvnI, MwoI, NaeI, NarI, NciI, NcoI, NdeI, NdeII, NgoAIV, NgoMIV（NgoMIとして以前知られる）, NheI, NlaIII, NlaIV, NotI, NruGI, NruI, NsbI, NsiI, NspBII, NspI, NspV, PacI, PaeI, PaeR7I, PagI, PalI, PauI, Pfl1108I, Pfl23II, PflFI, PflMI, PinAI, Ple19I, PleI, PmaCI, Pme55I, PmeI, PmlI, Ppu10I, PpuMI, PshAI, PshBI, Psp124BI, Psp1406I, Psp5II, PspAI, PspEI, PspLI, PspN4I, PspOMI, PspPPI, PstI, PvuI, PvuII, RcaI, RleAI, RsaI, RsrII, SacI, SacII, SalI, SanDI, SapI, Sau3AI, Sau96I, SauI, SbfI, ScaI, SchI, ScrFI, SdaI, SduI, SecI, SexAI, SfaNI, SfcI, SfeI, SfiI, SfoI, Sfr274I, Sfr303I, SfuI, SgfI, SgrAI, SimI, SinI, SmaI, SmiI, SmlI, SnaBI, SnaI, SpeI, SphI, SplI, SrfI, Sse8387I, Sse8647I, Sse9I, SseBI, SspBI, SspI, SstI, SstII, StuI, StyI, SunI, SwaI, TaiI, TaqI, TaqII, TatI, TauI, TfiI, ThaI, Tru1I, Tru9I, TscI, TseI, Tsp45I, Tsp4CI, Tsp509I, TspEI, TspRI, Tth111I, Tth111II, TthHB8I, UbaDI, UbaEI, UbaLI, UbaOI, Van91I, Vha464I, VneI, VspI, XagI, XbaI, XcmI, XhoI, XhoII, XmaCI, XmaI, XmaIII及びXmnI, Zsp2Iを含むリストから選択される制限酵素により認識されるものである、請求項２５又は請求項２６記載の方法。
  28. 該レポーター分子がクロラムフェニコール、無色のガラクトシド（galactosidase)、無色のグルクロニド、ルシフェリン、及び緑色蛍光タンパク質を含むリストから選択されるものである、請求項２４〜請求項２７いずれか１項に記載の方法。
  29. 該標的ヌクレオチド配列が哺乳動物細胞又は植物細胞などの真核細胞の中に存在するものである、請求項２４〜請求項２８いずれか１項に記載の方法。
  30. 該細胞が植物細胞である、請求項２９記載の方法。
  31. 該細胞が哺乳動物細胞であり且つ該標的配列が一以上の既知の遺伝的突然変異を含む疾病状態と関連するものである、請求項２９記載の方法。
  32. 該哺乳動物細胞がヒト細胞であり且つ該疾病状態が副腎脳白質ジストロフィー, アテローム性動脈硬化，ゴーシェ病，迂曲状萎縮(gyrate atrophy)，若年発症糖尿病，肥満，発作性夜間血色素尿症，フェニルケトン尿症，レフサム病，タングラー病 (tangler disease)，及び嚢胞性線維症，難聴，変形形成異常 (diastrophic dysplasia)，ＱＴ延長症候群，メンケズ症候群，ペンドレッド症候群，多発性嚢胞腎，鎌形赤血球貧血，ウィルソン病及びツェルウェガー症候群などの輸送体，チャネル及びポンプを含むヘモクロマトーシス状態；毛細血管拡張性運動失調，禿頭症，コケーン症候群，緑内障，結節硬化症，ワールデンブルヒ症候群及びヴェルナー症候群などのシグナル伝達に関与する状態；アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症，アングレマン症候群(Angleman syndrome) ，シャルコー・マリー・ツース病，癲癇，本態性振戦，脆弱Ｘ症候群，フリードライヒ失調症，ハンチントン病，ニーマン−ピック病，パーキンソン病，プラーダー−ヴィリ症候群，レット症候群，脊髄小脳萎縮症 (spinocerebella atrophy) 及びウィリアムズ症候群などの脳に関与する状態；並びにデュシェンヌ型筋ジストロフィー，エリス−ファン・クレフェルト症候群，マルファン症候群及び筋強直性ジストロフィーなどの骨格に関与する状態を含むリストから選択されるものである、請求項３１記載の方法。
  33. 標的ヌクレオチド配列内における一以上のヌクレオチドのホモ接合的変化又はヘテロ接合的変化の存在又は非存在を決定する方法であって、
    前向き及び逆向きプライマーを用いて該標的ヌクレオチド配列を増幅し増幅産物を生産する工程であり、一方のプライマーが、該プライマーから伸長するヌクレオチド鎖が実質的にエキソヌクレアーゼ活性に対して耐性であるように、一つ以上の化学修飾されたヌクレオチド、塩基又はホスホジエステル結合を含むものであり、他方のプライマーが固体支持体に固定化されたセンス配列及びそれに相補的配列を有するヌクレオチド配列を含むものであり、該前向き及び逆向きプライマーの一つ以上が一以上のヌクレオチドの変化の存在下若しくは非存在下において該増幅産物内に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入又は破壊するものである工程、
    該増幅産物をエキソヌクレアーゼで消化して該エキソヌクレアーゼに耐性のヌクレオチド、塩基又はホスホジエステル結合を含む該プライマーにより増幅されない鎖を消化し、制限エンドヌクレアーゼ部位の潜在的な存在若しくは非存在を含み且つ該固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖核酸分子を作製する工程、
    導入された該制限部位に対する相補性を含むプローブを該一本鎖核酸分子にハイブリダイズし、部分的な二本鎖の分子を作製する工程であり、該プローブが互いに識別され得る同定可能なシグナルを容易に提供できる二つのレポーター分子を含むものである工程、
    該部分的な二本鎖分子をそのエンドヌクレアーゼ部位が該増幅産物に潜在的に導入又は破壊されている制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化された該分子を、少なくとも一つのプライマーにより導入された該増幅配列の一部に対してセンスであり又は相補的であるオリゴヌクレオチドを含む一組の該固定化オリゴヌクレオチドにアニーリングできる状態に置く工程、及び
    該レポーター分子によるシグナルの相対比を検出する工程であり、異なるシグナルの均等比又は唯一つのシグナルの実質的存在が該標的ヌクレオチド配列における変化のホモ接合的存在又は非存在を表すものであり、異なるシグナルの存在が標的ヌクレオチド配列における該変化のヘテロ接合的存在又は非存在を表すものである工程、
    を含む方法。
  34. 該前向き又は逆向きプライマーの一つ以上が該増幅産物内の制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するものである、請求項３３記載の方法。
  35. 該固体支持体が、ガラス、及びセルロース、ニトロセルロース、セラミック材料、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン及びその誘導体、ポリビニリデン・ジフルオライド、メタクリレート及びその誘導体、ポリビニルクロリド及びポリプロピレンなどのポリマーを含むリストから選択されるものである、請求項３３又は請求項３４記載の方法。
  36. 該固体支持体がガラスである、請求項３５記載の方法。
  37. 二以上のオリゴヌクレオチド配列がアレイの形状で固体支持体に固定されているものである、請求項３３〜請求項３６いずれか１項に記載の方法。
  38. 該制限エンドヌクレアーゼ部位が、AatI, AatII, AauI, Acc113I, Acc16I, Acc65I, AccB1I, AccB7I, AccBSI, AccI, AccII, AccIII, AceIII, AciI, AclI, AclNI, AclWI, AcsI, AcyI, AdeI, AfaI, AfeI, AflII, AflIII, AgeI, AhaIII, AhdI, AluI, Alw21I, Alw26I, Alw44I, AlwI, AlwNI, Ama87I, AocI, Aor51HI, ApaBI, ApaI, ApaLI, ApoI, AscI, AseI, AsiAI, AsnI, Asp700I, Asp718I, AspEI, AspHI, AspI, AspLEI, AspS9I, AsuC2I, AsuHPI, AsuI, AsuII, AsuNHI, AvaI, AvaII, AvaIII, AviII, AvrII, AxyI, BaeI, BalI, BamHI, BanI, BanII, BanIII, BbeI, BbiII, BbrPI, BbsI, BbuI, Bbv12I, BbvCI, BbvI, BbvII, BccI, Bce83I, BcefI, BcgI, BciVI, BclI, BcnI, BcoI, BcuI, BetI, BfaI, BfiI, BfmI, BfrI, BglI, BglII, BinI, BlnI, BlpI, Bme18I, BmgI, BmrI, BmyI, BpiI, BplI, BpmI, Bpu10I, Bpu1102I, Bpu14I, BpuAI, Bsa29I, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaI, BsaJI, BsaMI, BsaOI, BsaWI, BsaXI, BsbI, Bsc4I, BscBI, BscCI, BscFI, BscGI, BscI, Bse118I, Bse1I, Bse21I, Bse3DI, Bse8I, BseAI, BseCI, BseDI, BseGI, BseLI, BseMII, BseNI, BsePI, BseRI, BseX3I, BsgI, Bsh1236I, Bsh1285I, Bsh1365I, BshI, BshNI, BsiBI, BsiCI, BsiEI, BsiHKAI, BsiI, BsiLI, BsiMI, BsiQI, BsiSI, BsiWI, BsiXI, BsiYI, BsiZI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BsoBI, Bsp106I, Bsp119I, Bsp120I, Bsp1286I, Bsp13I, Bsp1407I, Bsp143I, Bsp143II, Bsp1720I, Bsp19I, Bsp24I, Bsp68I, BspA2I, BspCI, BspDI, BspEI, BspGI, BspHI, BspLI, BspLU11I, BspMI, BspMII, BspTI, BspXI, BsrBI, BsrBRI, BsrDI, BsrFI, BsrGI, BsrI, BsrSI, BssAI, BssHII, BssKI, BssNAI, BssSI, BssT1I, Bst1107I, Bst2BI, Bst2UI, Bst4CI, Bst71I, Bst98I, BstACI, BstAPI, BstBAI, BstBI, BstDEI, BstDSI, BstEII, BstF5I, BstH2I, BstHPI, BstMCI, BstNI, BstNSI, BstOI, BstPI, BstSFI, BstSNI, BstUI, BstX2I, BstXI, BstYI, BstZ17I, BstZI, Bsu15I, Bsu36I, Bsu6I, BsuRI, BtgI, BtsI, Cac8I, CauII, CbiI, CciNI, CelII, CfoI, Cfr10I, Cfr13I, Cfr42I, Cfr9I, CfrI, CjeI, CjePI, ClaI, CpoI, Csp45I, Csp6I, CspI, CviJI, CviRI, CvnI, DdeI, DpnI, DpnII, DraI, DraII, DraIII, DrdI, DrdII, DsaI, DseDI, EaeI, EagI, Eam1104I, Eam1105I, EarI, EciI, Ecl136II, EclHKI, EclXI, Eco105I, Eco130I, Eco147I, Eco24I, Eco255I, Eco31I, Eco32I, Eco47I, Eco47III, Eco52I, Eco57I, Eco64I, Eco72I, Eco81I, Eco88I, Eco91I, EcoICRI, EcoNI, EcoO109I, EcoO65I, EcoRI, EcoRII, EcoRV, EcoT14I, EcoT22I, EcoT38I, EgeI, EheI, ErhI, Esp1396I, Esp3I, EspI, FauI, FauNDI, FbaI, FinI, Fnu4HI, FnuDII, FokI, FriOI, FseI, Fsp4HI, FspI, GdiII, GsuI, HaeI, HaeII, HaeIII, HaeIV, HapII, HgaI, HgiAI, HgiCI, HgiEI, HgiEII, HgiJII, HhaI, Hin1I, Hin2I, Hin4I, Hin6I, HincII, HindII, HindIII, HinfI, HinP1I, HpaI, HpaII, HphI, Hsp92I, Hsp92II, HspAI, ItaI, KasI, Kpn2I, KpnI, Ksp22I, Ksp632I, KspAI, KspI, Kzo9I, LspI, MaeI, MaeII, MaeIII, MamI, MbiI, MboI, MboII, McrI, MfeI, MflI, MlsI, MluI, MluNI, Mly113I, MmeI, MnlI, Mph1103I, MroI, MroNI, MroXI, MscI, MseI, MslI, Msp17I, MspA1I, MspCI, MspI, MspR9I, MstI, MunI, Mva1269I, MvaI, MvnI, MwoI, NaeI, NarI, NciI, NcoI, NdeI, NdeII, NgoAIV, NgoMIV（NgoMIとして以前知られる）, NheI, NlaIII, NlaIV, NotI, NruGI, NruI, NsbI, NsiI, NspBII, NspI, NspV, PacI, PaeI, PaeR7I, PagI, PalI, PauI, Pfl1108I, Pfl23II, PflFI, PflMI, PinAI, Ple19I, PleI, PmaCI, Pme55I, PmeI, PmlI, Ppu10I, PpuMI, PshAI, PshBI, Psp124BI, Psp1406I, Psp5II, PspAI, PspEI, PspLI, PspN4I, PspOMI, PspPPI, PstI, PvuI, PvuII, RcaI, RleAI, RsaI, RsrII, SacI, SacII, SalI, SanDI, SapI, Sau3AI, Sau96I, SauI, SbfI, ScaI, SchI, ScrFI, SdaI, SduI, SecI, SexAI, SfaNI, SfcI, SfeI, SfiI, SfoI, Sfr274I, Sfr303I, SfuI, SgfI, SgrAI, SimI, SinI, SmaI, SmiI, SmlI, SnaBI, SnaI, SpeI, SphI, SplI, SrfI, Sse8387I, Sse8647I, Sse9I, SseBI, SspBI, SspI, SstI, SstII, StuI, StyI, SunI, SwaI, TaiI, TaqI, TaqII, TatI, TauI, TfiI, ThaI, Tru1I, Tru9I, TscI, TseI, Tsp45I, Tsp4CI, Tsp509I, TspEI, TspRI, Tth111I, Tth111II, TthHB8I, UbaDI, UbaEI, UbaLI, UbaOI, Van91I, Vha464I, VneI, VspI, XagI, XbaI, XcmI, XhoI, XhoII, XmaCI, XmaI, XmaIII及びXmnI, Zsp2Iを含むリストから選択される制限酵素により認識されるものである、請求項３３〜請求項３７いずれか１項に記載の方法。
  39. 該レポーター分子がクロラムフェニコール、無色のガラクトシド（galactosidase)、無色のグルクロニド、ルシフェリン及び緑色蛍光タンパク質を含むリストから選択されるものであるものである、請求項３３〜請求項３８いずれか１項に記載の方法。
  40. 該標的ヌクレオチド配列が哺乳動物細胞又は植物細胞などの真核細胞の中に存在するものである、請求項３３〜請求項３９いずれか１項に記載の方法。
  41. 該細胞が植物細胞である、請求項４０記載の方法。
  42. 該細胞が哺乳動物細胞であり且つ該標的配列が一以上の既知の遺伝的突然変異を含む疾病状態と関連するものである、請求項４０記載の方法。
  43. 該哺乳動物細胞がヒト細胞であり且つ該疾病状態が副腎脳白質ジストロフィー，アテローム性動脈硬化，ゴーシェ病，迂曲状萎縮(gyrate atrophy)，若年発症糖尿病，肥満，発作性夜間血色素尿症，フェニルケトン尿症，レフサム病，タングラー病 (tangler disease)，及び嚢胞性線維症，難聴，変形形成異常 (diastrophic dysplasia)，ＱＴ延長症候群，メンケズ症候群，ペンドレッド症候群，多発性嚢胞腎，鎌形赤血球貧血，ウィルソン病及びツェルウェガー症候群などの輸送体，チャネル及びポンプを含むヘモクロマトーシス状態；毛細血管拡張性運動失調，禿頭症，コケーン症候群，緑内障，結節硬化症，ワールデンブルヒ症候群及びヴェルナー症候群などのシグナル伝達に関与する状態；アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症，アングレマン症候群(Angleman syndrome) ，シャルコー・マリー・ツース病，癲癇，本態性振戦，脆弱Ｘ症候群，フリードライヒ失調症，ハンチントン病，ニーマン−ピック病，パーキンソン病，プラーダー−ヴィリ症候群，レット症候群，脊髄小脳萎縮症 (spinocerebella atrophy) 及びウィリアムズ症候群などの脳に関与する状態；並びにデュシェンヌ型筋ジストロフィー，エリス−ファン・クレフェルト症候群，マルファン症候群及び筋強直性ジストロフィーなどの骨格に関与する状態を含むリストから選択されるものである、請求項４２記載の方法。
  44. 核酸分子中の１個のヌクレオチド又はヌクレオチド群の存在又は非存在を決定するための検定装置であって、
    一つ以上の制限エンドヌクレアーゼにより消化される増幅産物内のヌクレオチド配列にそれぞれ相補的な固定化されたオリゴヌクレオチドのアレイ、及び
    該固定化されたオリゴヌクレオチド・アレイに対する標的配列のハイブリダイゼーションについてスクリーニングする手段、
    を含む検定装置。
  45. 固定化されたオリゴヌクレオチドの該アレイが固体支持体に付着されているものである、請求項４４記載の検定装置。
  46. 該固体支持体が、ガラス、セルロース、ニトロセルロース、セラミック材料、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン及びその誘導体、ポリビニリデン・ジフルオライド、メタクリレート及びその誘導体、ポリビニルクロリド、及びポリプロピレンを含むリストから選択されるものである、請求項４５記載の検定装置。
  47. 該固体支持体がガラスである、請求項４６記載の検定装置。
  48. 該装置が販売用に包装されており、使用のための説明書を含むものである、請求項４４〜請求項４７いずれか１項に記載の検定装置。
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