DE60119901T2

DE60119901T2 - Transgene bäume mit erhöhter biomasseproduktion und xylemfaserlänge und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE60119901T2
Application number: DE60119901T
Authority: DE
Inventors: Maria Eriksson; Thomas Moritz; Maria Israelsson; Olof Olsson
Original assignee: SweTree Technologies AB
Current assignee: SweTree Technologies AB
Priority date: 2000-03-07
Filing date: 2001-03-02
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2021-03-03
Also published as: EP1261726A1; EP1261726B1; WO2001066777A1; BR0108987A; AU2001241317B2; JP2003525618A; BR0108987B1; PT1261726E; ES2264974T3; NZ521066A; ATE327338T1; DE60119901D1; CA2400986A1; CN1416468A; CA2400986C; DK1261726T3; AU4131701A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Bäume, die eine gesteigerte Biomasse-Produktion und Xylemfaser-Länge aufweisen; transgene Pflanzen, Samen, Pflanzenzellen und andere Arten von Vermehrungsmaterial, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.
Stand der Technik
Ein entscheidender Nachteil der traditionellen Züchtung von Bäumen, insbesondere von Waldbaumarten, besteht aufgrund ihrer langen Generationszeiten darin, dass ein Fortschritt nur langsam zu erzielen ist. Wenn man jedoch die Vorteile von kürzlichen Entwicklungen in der Gentechnologie nutzt, könnte die Zeit, die zum Herstellen einer neuen Varietät erforderlich ist, signifikant verkürzt werden. Außerdem könnte man mit einer biotechnologischen Vorgehensweise noch genauer auf die von der Wald- und Zellstoffindustrie als wünschenswert angesehenen Merkmale zielen.
Bisher betrafen die meisten Anwendungen der Gentechnik bei Bäumen ein Modifizieren der Lignin-Biosynthese, wodurch Bäume mit weniger Lignin oder einer modifizierten Lignin-Zusammensetzung zustande kamen, einen früheren Blühbeginn, eine Schädlingsresistenz oder eine Herbizidresistenz. Um Wachstums- und Entwicklungsprozesse in Bäumen zu verändern, wäre auch das Manipulieren der Spiegel von Pflanzenhormonen oder der Hormonsensitivität von Interesse. Jedoch gab es bisher nur wenige Beispiele für das Modifizieren der Spiegel von Pflanzenhormonen in Bäumen. Dies wurde hauptsächlich erreicht, indem die endogene IAA-Biosynthese oder die Cytokin-Biosynthese direkt verändert oder verschiedene Hormonpools indirekt modifiziert wurden, indem das rolC-Gen von Agrobacterium verwendet wird. Obwohl solche Modifikationen in allen Fällen zu Bäumen mit veränderten Wachstumscharakteristika und Holzeigenschaften führen, wurden bisher keine Verbesserungen mit einer deutlichen praktischen Anwendungsmöglichkeit erhalten.
Gibberelline (GAs) sind eine Gruppe von mehr als 100 tetracyclischen Diterpenen, von denen einige essentielle endogene Regulatoren sind, welche Wachstums- und Entwicklungsprozesse während des Lebenszyklus der Pflanze beeinflussen, z.B. Verlängerung von Sprossen, Entfaltung und Form von Blättern, Blühbeginn und Keimen von Samen. Die besten Beispiele, welche die Wichtigkeit von GAs in der Kontrolle der Verlängerung von Sprossen erläutern, sind GA-defiziente Mutanten von Arabidopsis, Mais und Erbse. Diese weisen im Vergleich zu Wildtyppflanzen reduzierte Spiegel von aktiven GA(s) auf, die aufgrund einer Reduktion der Internodiumlänge zu einem zwergwüchsigen Phänotyp führen. Der Phänotyp solcher GA-defizienten Mutanten kann durch die Anwendung eines aktiven GA vollständig wiederhergestellt werden. Es wurde gefunden, dass GAs sowohl die Zellteilung als auch die Zellverlängerung fördern.
Die Biosynthese von GAs in Pflanzen erfolgt über den Isoprenoid-Stoffwechselweg aus Mevalonsäure. Gibberellin-Spiegel werden hauptsächlich durch die Transkriptions-Kontrolle von Genen der Gibberellin-Biosynthese reguliert. Insbesondere das multifunktionelle Enzym Gibberellin-20-Oxidase (GA 20-ox) stellt ein Schlüsselenzym beim Kontrollieren der GA-Biosynthese dar (1). Es katalysiert die schrittweise Umwandlung der C-20-Gibberelline, GA₁₂, GA₅₃, durch drei aufeinanderfolgende Oxidationen zu GA₉, GA₂₀, welche die unmittelbaren Vorläufer der aktiven Gibberelline, GA₄ bzw. GA₁, sind. Die Expression des Gens der GA-20-Oxidase wird durch die Wirkung von GA_1/4 nach unten reguliert, dies legt nahe, dass an der Regulation des Gens eine direkte Endprodukt-Repression beteiligt ist. Außerdem haben einige Autoren vermutet, dass die GA-20-Oxidase auf der Transkriptionsebene fotoperiodisch reguliert wird.
Die Anwendung von Chemikalien, welche GA-Spiegel in der Pflanze verändern, ist im traditionellen Ackerbau und Gartenbau eine übliche Vorgehensweise. Inhibitoren der GA-Biosynthese werden besonders häufig als Wachstumsverzögerer in Getreidepflanzen und Zierpflanzen verwendet. Klare Vorteile, um die Verwendung dieser Chemikalien zu reduzieren, hätte eine biologische Vorgehensweise, etwa eine genetische Modifikation der endogenen GA-Biosynthese. Unter Verwendung von Arabidopsis als Modellorganismus wurde gezeigt, dass es möglich ist, GA-Spiegel durch Modifizieren der Spiegel des Enzyms GA-20-Oxidase zu verändern, und dass dies zu Pflanzen mit veränderten Wachstums- und Entwicklungsmustern führt. Ein transgener Arabidopsis, der die GA-20-Oxidase in einer Sense-Orientierung exprimiert, zeigt einen früheren Blühbeginn und höhere Stängel als die Wildtyppflanzen, wohingegen Antisense-Pflanzen die umgekehrten Eigenschaften aufweisen [Coles, J. P., et al., „Modification of gibberellin production and plant development in Arabidopsis by sense and antisense expression of gibberellin 20-oxidase genes", Plant J. 17: 547-556 (1999)].
Modifikationen der GA-Biosynthese in einer höheren Art, z.B. in Bäumen, wären von zusätzlichem Interesse, da dies Wege eröffnen würde, um Holz modifizieren zu können. Frühere Studien über die Verwendung von Hormonen haben gezeigt, dass GAs für die Differenzierung von Xylemfasern erforderlich sind und dass sie ausgeprägte Effekte auf die Länge von sekundären Xylemfasern und auf sowohl Längen- als auch Radialzuwachs in Hartholz-Arten und Nadelhölzern ausüben.
Offensichtlich besteht immer noch ein Bedarf für verbesserte Verfahren zum Modifizieren der Wachstumseigenschaften von Bäumen, insbesondere von Eigenschaften von technischem und wirtschaftlichem Interesse, wie Wachstumsgeschwindigkeit, Biomasse-Zunahme und Faserlänge. Genauso bleibt immer noch ein Bedarf für transgene Bäume bestehen, die verbesserte Eigenschaften, wie gesteigerte/s Wachstumsgeschwindigkeit, Stammvolumen und Länge der Xylemfasern, zeigen. Folglich besteht das Ziel der vorliegenden Erfindung darin, solche verbesserten Verfahren und transgene Bäume bereitzustellen. Ein weiteres Ziel besteht darin, die Verwendung von Wachstums-beeinflussenden Chemikalien in der Forstwirtschaft zu reduzieren oder ganz überflüssig zu machen.
Bisheriger Stand der Technik
Es wurde gezeigt (Huang, S., et al., „Overexpression of 20-Oxidase confers a gibberellin-overproduction phenotype in Arabidopsis", Plant Physiol. 1998, Bd. 118, S. 773-781), dass die Spiegel von aktiven GAs nach einer Überexpression von GA-20-Oxidase in Arabidopsis thaliana erhöht waren. Diese Erkenntnis lässt sich jedoch nicht direkt auf die vorliegende Erfindung übertragen.
Die meisten Zweikeimblättrigen und alle Nacktsamer durchlaufen ein gewisses Ausmaß von sekundärem Dickenwachstum. Das Ausmaß des Dickenwachstums hängt davon ab, ob die reife Pflanze eine krautige oder eine holzige (baumartige) Pflanze ist. Z.B. wird eine Arabidopsis-Pflanze nur unter bestimmten Bedingungen ein sekundäres Dickenwachstum erzeugen, während eine holzige Art, z.B. Populus, ein hohes Ausmaß an sekundärem Wachstum durchlaufen wird. Aufgrund des geringen Ausmaßes eines sekundären Dickenwachstums bei krautigen Pflanzen wird es auch sehr schwierig sein vorauszrsagen, inwieweit spezifische genetische Änderungen in krautigen Arten denjenigen in holzigen Arten hinsichtlich Änderungen in der Holzbildung entsprechen.
Als Beispiel kann durch Überexprimieren der GA-20-Oxidase in Arabidopsis thaliana der Spiegel von aktiven GAs in der Pflanze erhöht werden, wie durch Huang et al. (vorstehend) gezeigt wurde. Der Phänotyp der transgenen Pflanze schloss eine dramatische Zellverlängerung in allen Geweben ein. Die Blattstiele, Blütenstandsstängel und Blätter zeigten alle eine Zellverlängerung. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass die erhöhten Gibberellin-Spiegel eine Wirkung auf die Zellverlängerung aus der Keimung haben. Jedoch ist es nicht möglich, aus diesen Ergebnissen vorauszusagen, welche Wirkung die Überexpression der GA-20-Oxidase in einer holzigen Pflanze haben würde. Die Zellteilung im Kambiummeristem in einer holzigen Pflanze steht unter der Kontrolle von mehreren verschiedenen Hormonen und physikalischen Zwängen, die in einer Einjahrespflanze, wie Arabidopsis thaliana, nicht vorliegen.
Deshalb war es erstaunlich, dass eine gesteigerte Zellverlängerung von aus dem Kambium stammenden Zellen (Fasern) vorliegen würde und dass eine Zunahme in der Biomasse auftreten würde, die durch eine erhöhten Zellteilung im Kambium verursacht ist. Für den Fachmann wäre es nicht offensichtlich, die GA-20-Oxidase zu überexprimieren, um die Holz-Biomasse und die Verlängerung von Fasern zu steigern.
Eine Zunahme im Durchmesser von Baumstämmen findet hauptsächlich aufgrund einer meristematischen Aktivität im vaskulären Kambium statt, einem zylindrischen lateralen Meristem, das zwischen dem Xylem und dem Phloem des Stamms, der Äste und der holzigen Wurzeln liegt. Zwei Arten von Zellteilung treten im Kambium auf: die additive und die multiplikative. Die additive Teilung umfasst die perikline Teilung von spindelförmigen Kambium-Initialzellen, wodurch Xylem- und Phloem-Mutterzellen gebildet werden, die sich ihrerseits teilen, so dass Xylem- und Phloemzellen erzeugt werden. Die multiplikative Teilung umfasst eine antikline Teilung von spindelförmigen Initialzellen, wodurch eine Dickenzunahme des Kambiums bereitgestellt wird. Nachdem Xylem- und Phloemzellen durch die Kambium-Mutterzellen abgesondert wurden, differenzieren sie sich in einer geordneten Folge von Ereignissen, einschließlich Zellvergrößerung, sekundärer Zellwandbildung, Verholzung und Verlust von Protoplasten. Diese Ereignisse laufen nicht schrittweise, sondern eher als überlappende Phasen ab.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, transgene Pflanzen, Samen und Pflanzenzellen bereitzustellen, die verbesserte Wachstumsparameter und insbesondere Biomasse-Produktion und Xylemfaser-Länge zeigen. Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Herstellen und Vermehren der transgenen Pflanzen bereitzustellen. Die vorstehenden Aufgaben und andere, die nicht explizit erwähnt sind, werden durch eine transgene holzige Pflanze erfüllt, bei der eine DNA-Sequenz, welche die Expression eines Polypeptids codiert, das eine GA-20-Oxidase-Aktvität zeigt, in das Genom der Pflanze funktionell eingefügt ist. Weitere Ausführungsformen entsprechen der Definition in den beigelegten abhängigen und unabhängigen Patentansprüchen, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der/den folgenden nichteinschränkenden Beschreibung und Beispielen sowie aus den Patentansprüchen ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird nachstehend, in der Beschreibung und den beigefügten Beispielen und Zeichnungen, noch ausführlicher beschrieben, in denen
1 die Biosynthesewege zeigt, in denen GA₁₂ und GA₅₃ zu den biologisch aktiven Produkten GA₄ und GA₁ und ihren inaktivierten Stoffwechselprodukten GA₃₄ und GA₈ umgewandelt werden. Die GA-20-Oxidase katalysiert die Oxidation am C-20-Kohlenstoffatom.
2 zeigt eine Northern-Blot-Analyse von zehn GA-20-Oxidaseüberexprimierenden Linien (die Nummern 1 bis 15) und der nicht-transformierten Kontrolle (C). 18 μg Gesamt-RNA wurden von jeder Probe aufgetragen und mit einem markierten Fragment als Sonde getestet, das aus cDNA der Arabidopsis-Gibberellin-20-Oxidase (AtGA20ox1) oder aus einer endogenen Ubiquitin- (UBQ-) EST-Sequenz (pttUBQ) isoliert wurde.
3 zeigt das gesteigerte Wachstum einer transgenen hybriden Espe: die kumulative Sprossverlängerung (oberes Diagramm) und das Durchmesserwachstum (unteres Diagramm) von verschiedenen transgenen GA-20-Oxidaseüberexprimierenden Linien, nach Erzeugen aus Gewebekultur, Einpflanzen und Züchten in einer Wachstumskammer für sieben Wochen (zum Zeitpunkt Null).
4 ist ein Foto, das Kontrollpflanzen und transgene (Linie 11) Pflanzen nach 12 Wochen in der Wachstumskammer zeigt.
5 erläutert die Effekte einer Überexpression der GA-20-Oxidase auf (A) Zelllängen, (B) Zellzahl pro Internodium, (C) Zahl der Xylemfasern und (D) Länge der Xylemfasern. Die Länge und Anzahl der Zellen wurden in vollständig verlängerten Internodien von aktiv wachsenden Pflanzen gemessen, wie dies auch bei der Zahl der Xylemfasern der Fall war. Die Werte für die GA-20-Oxidase-überexprimierenden Linien sind jeweils Mittelwerte für neun unabhängig erzeugte Linien. Die Werte der Faserlänge für nicht-verlängerte Pflanzen stellen Mittelwerte für drei unabhängig erzeugte Linien dar. Die senkrechten Balken stellen SE dar.
6 zeigt, dass ein gesteigertes Durchmesser-Wachstum von transgenen hybriden Espen auch in der zweiten Wachstumsperiode vorliegt. Das kumulative Durchmesser-Wachstum von Kontrolle (WT) und von Linie 4 und 13 wurde in einem Intervall von 2,5 Monaten bestimmt, beginnend nach dem Brechen der Winterruhe.
Beschreibung der Erfindung
Die hier genannten Erfinder haben überraschenderweise gezeigt, dass eine ektopische Überexpression eines GA-20-Oxidase-Gens in Bäumen, hier anhand des Beispiels eines Laubbaums der gemäßigten Zone dargestellt, zu signifikanten Änderungen in Wachstumsrate, Stammvolumen und Xylemfaserlänge führt. Eine cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1) wurde verwendet, die zu der Arabidopsis thaliana-GA-20-Oxidase-Sequenz X83379 (EMBL-Hinterlegungsnummer) homolog ist, welche ein Polypeptid codiert, das eine GA-20-Oxidase-Aktvität aufweist. Somit zeigen die durch die hier genannten Erfinder erhaltenen Ergebnisse, dass eine genetische Modifikation von GA- Spiegeln in Bäumen verwendet werden kann, um Merkmale zu modifizieren, die für die Forst-, Zellstoff- und Papierindustrien extrem wichtig sind.
Die Ergebnisse zeigen, dass eine endogene Steigerung der biologisch aktiven Gibberelline GA₁ und GA₄ in Bäumen dazu führt, dass das Wachstum beschleunigt wird. Dies wurde deutlich gemacht, indem das AtGA20ox1-Gen von Arabidopsis in einer hybriden Espe, Populus tremula x tremuloides, exprimiert wurde, wodurch Bäume mit einem schnelleren Höhen- und Durchmesser-Wachstum, größeren Blättern, längeren Xylemfasern und einer erhöhten Biomasse zustande kamen. Dieser Phänotyp erinnert z.B. an Merkmale, die früher in transgenen Arabidopsis-Pflanzen festgestellt worden waren, welche die gleiche GA-20-Oxidase überexprimierten [Coles, J. P., et al., „Modification of gibberellin production and plant development in Arabidopsis by sense and antisense expression of gibberellin 20-Oxidase genes", Plant J. 17: 547-556 (1999)]. Solche Pflanzen hatten im Vergleich zu Wildtyppflanzen längere Keimachsen, größere Rosettenblätter, längere Blattstiele und einen früheren Blühbeginn.
Jedoch wurden keine Untersuchungen beschrieben, in denen eine Zunahme der Biomasse und anatomische Veränderungen in transgenen Arabidopsis untersucht wurden. Es ist sehr zweifelhaft, ob es in transgenen Arabidopsis zu einer erhöhten Biomasse kommen würde.
Es gab Hinweise, dass die GA-20-Oxidase ein Schlüsselenzym in der Regulation des GA-kontrollierten Wachstums ist [Hedden, P., und Kamiya, Y., „Gibberellin biosynthesis: Enzymes, genes and their regulation", Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 431-460 (1997)]. Die Tatsache, dass die Transkription des GA-20-Oxidase-Gens durch die Wirkung von GAs über Rückkopplung reguliert wird, legt nahe, dass eine konstitutive Überexpression des GA-20-Oxidase-Gens die endogene Regulation der GA-Homöostase stören wird. Hier führte eine Überexpression der GA-20-Oxidase in einer hybriden Espe zu einem Anstieg von C₁₉-GAs, und zwar sowohl von solchen, die an dem frühen 13-Hydroxylierungs-Stoffwechselweg beteiligt sind, als auch von solchen, die an dem Nicht-13-Hydroxylierungs-Stoffwechselweg beteiligt sind (1). Somit lag kein einheitlicher Unterschied in den Spiegeln zwischen GA₁ und GA₄ vor, die beide in Populus biologisch aktiv sind. Die vorliegenden Ergebnisse stimmen also mit früheren GA-Messungen an transgenen GA-20-Oxidase-überproduzierenden Arabidopsis-Pflanzen überein. Außerdem lag sowohl in der hybriden Espe als auch in Arabidopsis eine dramatische Zunahme in den Spiegeln des inaktivierten Endprodukts GA₈ vor (Tabelle 1).
Man nahm an, dass dies auf einen langsameren Turnover von GA₈ gegenüber GA₁ zurückzuführen war. Die relativ niedrigen Spiegel des anderen Endprodukts, GA₃₄, das durch den Nicht-13-Hydroxylierungs-Stoffwechselweg gebildet wird, kann durch einen schnelleren Turnover dieser Verbindung im Vergleich zu GA₈ erklärt werden. Im Gegensatz zu den C₁₉-GAs wurde in den transgenen Pflanzen eine Abnahme in Spiegeln von C₂₀-GAs festgestellt. Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass C₂₀-GAs per Definition Substrate für die GA-20-Oxidase sind (Tabelle 1).
Es ist überraschend, dass die erhöhte GA-20-Expression in Populus tremula x tremuloides solche deutlichen Effekte hat. Dies legt nahe, dass eine konstitutive Überexpression des GA-20-Oxidase-Gens die endogene Regulation der GA-Homöostase stört.
In der vorliegenden Studie fanden die Erfinder Unterschiede in GA-Spiegeln zwischen Blatt- und Stammgeweben, wobei die Anstiege der Spiegel der aktiven GA₁ und GA₄ im Stammgewebe am höchsten waren. Dies könnte auf dem AtGA20ox1-Gen beruhen, das im Stamm am stärksten exprimiert wird. In der hybriden Espe dagegen ist der CaMV-35S-Promotor im Allgemeinen in den Blättern etwas aktiver als im Stamm, wobei jedoch bekannt ist, dass auch Ausnahmen vorkommen. Deshalb ist es wahrscheinlicher, dass die höheren GA₁- und GA₄-Spiegel im Stamm auf Unterschiede im Transport von GAs oder in der Biosynthese von GA-Vorläufern zurückzuführen sind. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass es möglicherweise einen Unterschied in der Aktivität der GA-3ß-Hydroxylase oder GA-2ß-Hydroxylase in den Blättern gibt. In Arabidopsis wurde gezeigt, dass die 2ß-Hydroxylierung durch aktive GAs auf der Transkriptionsebene aktiviert wird.
Die festgestellte Zunahme im Längenwachstum (3) in den transgenen GA-20-Oxidase-Populus-Bäumen war offensichtlich nicht eine Folge einer gesteigerten Zellverlängerung, da keine signifikanten Änderungen in den Zelllängen gefunden wurden (5A). Jedoch zeigen die festgestellten Unterschiede in der Anzahl der Zellen pro vollständig verlängertem Internodium deutlich, dass erhöhte GA-Spiegel die Zellteilungen im Stammgewebe beeinflussen (5). Dies ist ein interessanter Aspekt der vorliegenden Erfindung, der zahlreiche Möglichkeiten eröffnet, auf die Produktion von faserartigem Rohmaterial und Biomasse für unterschiedliche Zwecke Einfluss zu nehmen.
Zwar wurde gefunden, dass GAs die Zellverlängerung beeinflussen, jedoch ist auch bekannt, dass GAs die mitotische Aktvität in der subapikalen Region des Stamms induzieren können. Es muss aber betont werden, dass, obwohl die Proben für die Messungen der Zelllängen sowohl für die Kontrolle als auch für die transgenen Pflanzen jeweils aus der gleichen Position entnommen wurden (die durch die Anzahl von Internodien vom Apex aus definiert war), nicht ausgeschlossen werden kann, dass sich die Zellen in den transgenen Pflanzen in einem früheren Entwicklungsstadium befunden haben könnten als in den Wildtyppflanzen und dass sie noch dabei gewesen sein könnten, sich zu verlängern. Außerdem wurde vermutet, dass die Wirkung von GAs in meristematischen Geweben die Verlängerungszone des Organs, das gebildet wird, ausweitet.
Tabelle 1
Konzentration (ng g^–1 Frischgewicht) von GAs in Stamm-/Blattgewebe aus den Internodien 7 und 8 (vgl. Einzelheiten im Text) von einer transgenen hybriden Espe, die das AtGA20ox1-Gen exprimiert. Mittelwerte von drei unabhängigen Messungen. n.d. = nicht nachweisbar.
Studien, welche die Anwendung von Pflanzenhormonen umfassen, haben gezeigt, dass GAs die Kambiumaktivität in Bäumen, insbesondere in Verbindung mit IAA, steigern können. Hier führte der gentechnisch bewirkte Anstieg von GA-Spiegeln zu einem schnelleren Wachstum des Stammdurchmessers (4). Außerdem wurde eine Wirkung von erhöhten GA-Spiegeln auf das sekundäre Wachstum mit der Zunahme der Zahl von Xylemfaserzellen und der Xylemfaserlänge festgestellt (5C, D). Die in den Experimenten gemessene Längenzunahme beträgt etwa 8 %, dies muss man als eine signifikante Zunahme ansehen, welche Konsequenzen für die Fasereigenschaften und somit für die Verwendungsmöglichkeiten des Faserrohstoffs hat.
Dies stimmt mit Anwendungsstudien sowohl mit GAs als auch mit Inhibitoren der GA-Biosynthese überein. In Populus nehmen die Faser- und Gefäßlängen in der Übergangszone zwischen jugendlichem und reifem Holz zu. Deshalb wird die Zeit, die erforderlich ist, dass eine Zelle innerhalb der Kambiumregion reift, d.h. die Zeit, die sie in den verschiedenen Differenzierungszonen verbringt, schließlich ihre Größe und Zellwanddicke bestimmen. Wenn die Wirkung von GAs, wie GA₁ und/oder GA₄, diese Übergangszeit verlängert, würde dies sowohl die gesteigerte Faserlänge in den reifen Teilen der transgenen Pflanze als auch das Fehlen von Unterschieden in der Xylemfaserlänge zwischen transgenen und Kontrollpflanzen in jungem Stammgewebe erklären.
Die Zunahme der Blattgröße in den transgenen Pflanzen war ein Ergebnis einer Zunahme sowohl der radialen als auch der longitudinalen Verlängerung (Tabelle 2). In früheren Stadien war das Längenwachstum stärker ausgeprägt, dies führte zu langen schmalen Blättern. In späteren Stadien jedoch wurde die Blattmorphologie derjenigen der Kontrollpflanzen ähnlich, wobei ein ähnliches Verhältnis von Breite zu Länge des Blatts vorlag. Es wurde gezeigt, dass GAs die Blattverlängerung fördern, z.B. bei der Gartenerbse. Die sehr langen und schmalen Blätter, die bei konstitutiven GA-Signalmutanten, wie s/n-Mutanten von Gerste und spy-Mutanten von Arabidopsis, festgestellt wurden, zeigen auch, dass GAs die Blattverlängerung fördern. Jedoch ist wenig über die spezifischeren regulatorischen Rollen von GAs in der Blattentwicklung bekannt. In Arabidopsis wird die Entfaltung der Blattspreite durch mindestens zwei unabhängige und polarisierte Prozesse reguliert: die Längen- und die Breitenentwicklung, wobei RO-TUNDIFOLIA- und ANGUSTIFOLIA-Gene bestimmte Rollen spielen. Es ist nicht bekannt, ob GAs die zellulären Antworten auf diese Gene modulieren. Jedoch ist anzumerken, dass sich die Blattphänotypen bei der transgenen GA-20-Oxidase-Espe während der Entwicklung ändern, dies legt nahe, dass die zwei entwicklungsmäßig getrennten Prozesse von Blattlängen- und Breitenwachstum beide durch GAs beeinflusst werden, jedoch in unterschiedlichen Stadien.
Tabelle 2
Morphologische Charakterisierung einer Wildtyp- und transgenen hybriden Espe, die das AtGA20ox1-Gen exprimiert. Die Zahl der Pflanzen, die für die Messungen verwendet wurden, war 10, 5 und 6 für die Kontrolle, für Linie 2 bzw. Linie 11. Beim Bestimmen der Biomasse war die Zahl der als Proben genommenen Pflanzen 7, 2, 3 und 23 für die Kontrolle, für Linie 2, Linie 11 bzw. alle vereinigten als Probe genommenen transgenen Pflanzen.
Für alle statistischen Analysen wurde ANOVA verwendet, um die Pflanzen hinsichtlich des Genotyps zu vergleichen. Statistisch signifikante Unterschiede sind mit den Wahrscheinlichkeitswerten (Fischer-PLSD) von 1 % (*) und 5 % (**) angegeben.
Genotyp
Messungen der Biomasse in transgenen und Wildtyppflanzen zeigten, dass ein Anstieg der GA-20-Oxidase-Aktivität zu einem allgemeinen Anstieg beim Wachstum führt. Dieser Effekt war im Stamm besonders stark ausgeprägt, dies macht deutlich, dass GAs eine starke Wirkung auf das Stammwachstum haben. Sprühexperimente mit verschiedenen GAs haben früher gezeigt, dass diese Hormone dazu neigen, bei Populus die Biomasse von Sprossen auf Kosten des Wurzelwachstums zu steigern. Schon früher wurde bei Bäumen eine Reduktion der Wurzelbildung aufgrund von erhöhten GA-Spiegeln in Wurzeln gezeigt. In dieser Studie war eine schwache Wurzelinitiation das Hauptproblem für das Überleben der transgenen GA-20-Oxidase-Pflanzen in Gewebekultur und nach dem Einpflanzen in Erde. In späteren Entwicklungsstadien war die Wurzelentwicklung immer noch beeinflusst, jedoch in einem geringeren Ausmaß (Tabelle 2). Außerdem wurde gezeigt, dass die Wirkung von GAs auf die Wurzelbildung je nach Stadium der Wurzelentwicklung unterschiedlich ist.
Abschließend kann gesagt werden, dass die hier genannten Erfinder hier die wichtige Rolle der GA-20-Oxidase-Aktivität in dem GA-kontrollierten Wachstum bei Populus deutlich gemacht haben. Es ist überraschend, dass die Effekte, die bisher nur, und in einigen Fällen nur teilweise, durch äußerliche Anwendung, z.B. durch Sprühen, erreicht wurden, durch eine endogene Expression erreicht werden können. Außerdem ist überraschend, dass das erfindungsgemäße Verfahren bei einer höheren Art angewendet werden kann, die hier durch die hybride Espe Populus tremula x P. tremuloides repräsentiert wird. Ein wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, dass es dadurch vermutlich möglich wird, die Verwendung von Wachstumsbeeinflussenden Chemikalien in der Forstwirtschaft zu reduzieren oder ganz überflüssig zu machen.
Die vorliegende Erfindung eröffnet Wege, um Bäume gentechnisch zu verändern, so dass sie schneller wachsen und mehr Biomasse produzieren, indem einfach die endogenen GA-Spiegel erhöht werden. Interessanterweise nehmen auch die Faserlängen als Folge der Überexpression der GAs zu. Diese Ergebnisse sind sowohl für die Praxis von Bedeutung (wobei sie zur Produktion von modifizierten Bäumen beitragen, die für die Zellstoff-, Papier- und Forstindustrie von Interesse sind) als auch für die Wissenschaft wichtig, indem sie vorher undurchführbare Studien über die Mechanismen, durch welche die GAs das Wachstum und die Entwicklung in Bäumen kontrollieren, möglich machen.
Beispiele
Versuchsprotokoll
Konstruktion eines Pflanzenvektors
Das Arabidopsis-GA-20-Oxidase-cDNA-Konstrukt, cloniert in Bluescript pAt2301 [Phillips, A. L., et al., „Isolation and expression of three gibberellin 20-oxidase cDNA clones from Arabidopsis", Plant Physiol. 108: 1049-1057 (1995)), kürzlich neu bezeichnet als AtGA20ox1 [Coles, J. P., et al., „Modification of gibberellin production and plant development in Arabidopsis by sense and antisense expression of gibberellin 20-oxidase genes", Plant J. 17: 547-556 (1999)], wurde als Geschenk von P. Hedden enthalten.
Eine stromaufwärts liegende ATG-Sequenz, die vor dem Translations-Start des GA-20-Oxidase-Enzyms lag, wurde durch in vitro-Mutagenese entfernt. Ein Vorwärts-Primer, der mit dem 5'-Ende des GA-20-Oxidase-Gens übereinstimmte, dem jedoch das zusätzliche ATG fehlte und der eine BamHI- und Xbal-Stelle enthielt, und ein Rückwärts-Primer, der eine innere HindIII-Stelle in dem GA-20-Oxidase-Gen überspannte, wurden in einer PCR-Reaktion eingesetzt. Unter Verwendung von AtGA20ox1 als Matrize wurde ein PCR-Produkt erhalten und in den Vektor pOK12 subcloniert, wodurch das Plasmid pOK12.GA20ox5' erzeugt wurde. Sodann wurde eine vollständige GA-20-Oxidase-cDNA, der das zusätzliche ATG fehlte, rekonstituiert, indem AtGA20ox1 gespalten, ein Fragment, welches das 3'-Ende des GA-20-Oxidase-Gens enthielt, isoliert und dieses Fragment in pOK12.GA20ox5' ligiert wurde, wodurch das Plasmid pOK12 AtGA20ox1 erhalten wurde. Anschließend wurde die GA-20-Oxidase-cDNA aus pOK12 AtGA20ox1 durch Spaltung mit BamHI isoliert und in Sense-Orientierung in die BamHI-Stelle des binären Vektors pPCV702.kana ligiert [Walden, R., Koncz, C., und Schell, J., Methods Mol. Cell Biol. 1: 175-194 (1990); „The use of gene vectors in plant molecular biology", Methods Mol. Cell Biol. 1: 175-194 (1990)], wodurch sie unter die Kontrolle des CaMV-35S-Promotors gestellt wurde.
Transformations- und Wachstumsbedingungen für Pflanzen
Die hybride Espe Populus tremula L x P. tremuloides Michx. Clon T89 wurde im Wesentlichen wie früher beschrieben transformiert und regeneriert [Nilsson, O., et al., „Spatial pattern of cauliflower mosaic virus 35S promoter-luceferase expression in transgenic hybrid aspen trees monitored by enzymatic assay and non-destructive imaging", Transgenic Research 1: 209-220 (1992)]. Aus 14 unabhängigen Linien wurden zehn ausgewählt und durch in vitro-Kultur von Sprossen auf MS-Medium der halben Stärke, enthaltend Mineralien und Vitamine, vermehrt [Murashige, T, und Skoog, F. A., „Revised Medium for rapid growth and bio-assay with tobacco tissue cultures", Physiologia Plantarum 15: 473-479 (1962)].
Nach der Wurzelinitiation wurden die Pflanzen in Weibufix Rooting Powder (Svalöf Weibull AB, Hammerhög, Schweden) getaucht und in ein gedüngtes Peat:Perlit-Gemisch (5:1) eingetopft und in einer Wachstumskammer bei 18°C unter einer Fotoperiode von 18 Stunden und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 90 % gehalten. Die Photonenflux-Dichte der Hauptlichtperiode (zehn Stunden) betrug 175 μMol m^–2 s^–1 bei 400 bis 750 nm (Osram Power Staw HQI-TS 400 W D-Lampen, Osram, Deutschland), und Tageslänge-Verlängerungen erfolgten unter Verwendung von Licht mit geringer Intensität (20 μMol^–2 s^–1). Die Pflanzen wurden täglich gegossen, und bei Bedarf wurden sie umgetopft und mit einer kompletten Nährlösung (SuperbaS, Supra Hydro AB, Landskrona, Schweden) gedüngt. Nach 108 Tagen wurden einige Pflanzen in Bedingungen mit kurzen Fotoperioden (zehn Stunden) überführt, um die Beendigung des Wachstums zu induzieren. Diese Pflanzen wurden sodann an die Kälte akklimatisiert und vier Wochen bei 8°C im Ruhezustand gehalten, und zu diesem Zeitpunkt wurden dann Proben für die Messungen der Faserlängen entnommen.
Wachstumsmessungen und Probennahme
Im Alter von sieben Wochen wurden die Pflanzen an einem aktiv wachsenden Internodium bei allen Pflanzen an etwa der gleichen Position markiert. Diese Markierung diente als ein Referenzpunkt für die Messungen des Durchmesser-Wachstums und für das Zählen der Internodien. Der Durchmesser, die Höhe und die Zahl von Internodien der Pflanzen wurden jeden 3. bis 4. Tag gemessen. Die Zahl der Internodien wurde von der Spitze bis zum Referenzpunkt gezählt: wobei das erste Internodium als dasjenige definiert war, das unter dem obersten Blatt mit einer Länge von mindestens 1 cm lag. Pflanzen, die unter langen Tagen gezüchtet wurden, wurden nach 100 Tagen geerntet, wobei sieben Kontrollpflanzen und 25 Pflanzen, welche neun verschiedene transgene Linien repräsentierten (Linie 6 wurde ausgeschlossen), verwendet wurden. Die Internodien 7 und 8, einschließlich der oberen Blätter, wurden als Proben für die GA-Analyse genommen, und die Blätter von den Knoten 9 und 10 wurden als Proben für die Northern-Analyse genommen. Alle Gewebe wurden unmittelbar nach der Probennahme in flüssigem Stichstoff eingefroren. Für anatomische Untersuchungen wurden die Längen der Internodien 15 und 16 gemessen, danach ausgeschnitten und unmittelbar darauf in FAA fixiert. Alle Teile, die nach der Probennahme übrig blieben, wurden in Blatt-, Stamm- und Wurzelanteile aufgetrennt und für Bestimmungen der Frischgewicht-Biomasse verwendet. Das Trockengewicht wurde bestimmt, nachdem die Proben fünf Tage bei 55°C getrocknet worden waren. Von den im Ruhezustand vorliegenden Pflanzen, die aus drei Kontrollen und fünf transgenen Pflanzen (welche die Linien 2, 11 und 14 repräsentierten) bestanden, wurden an den Internodien 1, 10 und 20, gezählt vom Referenzpunkt aus, Proben genommen. Diese Proben wurden für die Mazeration und die anschließenden Messungen der Faserlänge verwendet.
Anatomische Charakterisierung
Die Proben wurden gemäß herkömmlicher chemischer Fixierungsverfahren in LR White eingebettet [Regan, S., Bourquin, V., Tuominen, H., und Sundberg, B, „Accurate and high resolution in situ hybridization analysis of gene expression in secondary stem tissues", Plant J. 19: 363-369 (1999)]. Längsschnitte für das Zählen der Zellen (Internodium 15 und 16) und Querschnitte für das Zählen der Fasern (Internodium 30), 2 μm dick, wurden zubereitet und mit Toluidinblau gefärbt. Die Anzahl der epidermalen Zellen und der Markzellen in 1 mm der Längsschnitte wurde jeweils für drei Schnitte pro Internodium bestimmt. Die Zelllänge und die Zellzahl pro Internodium wurden als die in den Internodien 15 und 16 gefundenen Durchschnittswerte berechnet. Die Anzahl der Xylemfasern wurde in drei getrennten Querschnitten (vom Mark zum Kambium) pro Individuum gezählt und der Durchschnitt für jeden Genotyp (Linie 4, 11, 13 und Kontrolle) berechnet.
Messungen der Faserlänge
Zum Bestimmen der Faserlänge wurden zurechtgestutzte Stücke des äußeren Xylems aus den ausgewählten Internodien hergestellt. Die Proben wurden durch Kochen in einer Lösung von 10 % Wasserstoffperoxid und 50 % Eisessig für vier bis sechs Stunden mazeriert. Wenn sie vollständig gebleicht waren, wurden sie dreimal mit destilliertem Wasser gespült, mit Natriumcarbonat neutralisiert und wieder in Wasser gewaschen. Schließlich wurden die Fasern durch Schütteln in Wasser voneinander getrennt und unter Verwendung eines Faseranalysators (KAJAANI FiberLab, Valmet Automation Kajaani Ltd. Kajaani, Finnland) gemessen. Im Durchschnitt wurden die Längen von 30 800 Fasern pro Probe gemessen.
Northern-Analyse
Die Gesamt-RNA wurde aus Blättern unter Verwendung eines auf Chloroform und Hexadecyltrimethylammoniumbromid basierenden Verfahrens gemäß Chang et al. extrahiert (Chang, S., Puryear, J., und Cairney, J., „A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees", Plant Mol. Biol. Rep. 11: 113-116 (1993)]. Etwa 18 μg Gesamt-RNA pro Probe wurden in einem Formaldehyd-Agarose-Gel gemäß Sambrook et al. aufgetrennt [Sambrook, J., Fritsch, E., und Maniatis, T., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989] und auf eine Nylon-Hybond-N-Membran (Amersham, Little Chalfont, UK) gemäß den Anweisungen des Herstellers geblottet. Ein aus pOK12 AtGA20ox1 gewonnenes BamHl/Xhol-Fragment und ein Ubiquitin-ähnlicher exprimierter Sequenzabschnitt („Expressed Sequence Tag", EST A046p57), erhalten in dem Populus-Sequenzierungsprojekt [Sterky, F., et al., „Gene discovery in the wood-forming tissues of poplar: Analysis of 5.692 expressed sequence tags", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335 (1998)], wurden als Sonden für die Analyse der Expression des ektopischen AtGA20ox1 bzw. des Referenzgens eingesetzt. Die Hybridisierung erfolgte in Church-Puffer [Church, G.M., und Gilbert, W., „Genomic sequencing", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (1984)] bei 65°C über Nacht. Die Membran wurde bei 65°C zweimal für drei Minuten in jeder der folgenden Lösungen gewaschen: 2 × SSPE, 0,1 % SDS; 1 × SSPE, 0,1 % SDS; 0,5 × SSPE, 0,1 % SDS; und 0,1 × SSPE, 0,1 % SDS. Die Expressionsmuster wurden sichtbar gemacht, indem die Membran über Nacht einem Phosphor Imager (Molecular (mager GS-525, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ausgesetzt wurde.
Quantitative Bestimmung von Gibberellinen
Proben von 200 bis 300 mg wurden in flüssigem Stickstoff zu einem homogenen Pulver zerkleinert, und die GAs wurden wie früher von Peng et al. beschrieben [Peng, J. R., Richards, D. E., Moritz, T., CanoDelgado, A., und Harberd, N. P., „Extragenic suppressors of the Arabidopsis gai mutation alter the dose-response relationship of diverse gibberellin responses", Plant Physiol. 119: 1199-1207 (1999)] mit einigen wenigen Modifikationen analysiert. Die Volumina der Lösungsmittel, die zum Extrahieren und zum Auftrennen verwendet wurden, und dasjenige der Anionenaustauscher-Säule wurden verkleinert. Weiterhin wurden die Proben vor dem HPLC-Schritt methyliert, und schließlich wurden sie durch GC/MS-selektiertes Reaktions-Monitoring (SRM) unter Verwendung eines JEOL SX SX 102A Viersektoren-Massenspektrometers (JEOL, Tokyo, Japan) analysiert. [²H₂]-GAs wurden als innere Standards verwendet.
Ergebnisse
Erzeugen einer transgenen GA-20-Oxidase-Hybrid-Espe
Aus 14 unabhängig transformierten Linien wurden zehn regeneriert und für die weitere Analyse ausgewählt. Die Southern-Analyse zeigte, dass alle ausgewählten transgenen Linien eine bis drei Kopien des AtGA20ox1-Gens, eingefügt in ihren Genomen, aufwiesen, eine Ausnahme bildete Linie 6, die mindestens vier Kopien aufwies (Daten nicht dargestellt). Die Northern-Analyse der aus Blattgewebe isolierten RNA zeigte, dass die stärkste Expression des AtGA20ox1-Gens in den Linien 2, 7, 9, 14 und 15 vorlag. Die Expression in den Linien 1, 4, 11 und 13 war etwas geringer, während die Expression in Linie 6 fast nicht nachweisbar war (2). Im Allgemeinen zeigten die transgenen Linien eine schwächere Wurzelbildung als die Kontrollpflanzen, und zwar sowohl unter Gewebekulturbedingungen als auch dann, wenn sie in Erde eingepflanzt waren. Wenn sie eingepflanzt waren, überlebten z.B. 100 % der Kontrollpflanzen, im Vergleich zu nur 32 % der transgenen Pflanzen.
GA-Spiegel
Der GA-Gehalt wurde sowohl in Blättern als auch in Internodien von aktiv wachsendem Gewebe bestimmt. Transgene Pflanzen zeigten sowohl im Stamm als auch in den Blättern hohe Spiegel der 13-hydroxylierten C₁₉-GAs (GA₂₀, GA₁ und GA₈) und der nicht-13-hydroxylierten C₁₉-GAs (GA₉, GA₄ und GA₃₄) (Tabelle 1). Die Zunahme gegenüber den Wildtyp-Spiegeln war in Stammgewebe stärker ausgeprägt als in Blattgewebe. Die Spiegel der biologisch aktiven GA₁ und GA₄ in Stammgeweben der Linien 7 waren 22- bzw. 24-fach höher als in der Kontrolle. Außerdem zeigten alle transgenen Linien niedrigere Spiegel der Substrate für die GA-20-Oxidase. Z.B. machten die GA₁₂- und GA₅₃-Spiegel in Stammgeweben der Linie 7 17 % bzw. 9 % des Gehalts in der Kontrolle aus.
Wachstum und Morphologie der Sprosse
Alle transgenen Linien zeigten schneller als der Wildtyp ein Höhen- und Durchmesser-Wachstum (3), wodurch die Bäume einen charakteristischen Phänotyp erhielten (4). Obwohl die Spiegel der GA-20-Oxidase-mRNA zwischen den transgenen Linien variierten (2), bestand kein exakter Zusammenhang zwischen den Ex pressionsspiegeln und dem Wachstum. Eine ausführliche Untersuchung von zwei der transgenen Linien (Tabelle 2) zeigte, dass der Unterschied im Höhenwachstum hauptsächlich auf Unterschieden in den Internodienlängen beruhte. Keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Zahl der Knoten (Blätter) wurden festgestellt (Ergebnisse nicht dargestellt). Jedoch war die Blattentwicklung in den transgenen Linien anders. Junge, sich entfaltende Blätter hatten eine andere Morphologie und eine höheres Verhältnis von Blattlänge zu Blattbreite als die Blätter von Kontrollpflanzen (Tabelle 2). Hinter Knoten 14, d.h. in den vollständig entfalteten Blättern, bestand in diesem morphologischen Verhältnis kein signifikanter Unterschied, wobei jedoch zwischen den Kontrollpflanzen und den transgenen Pflanzen immer noch ein klarer Unterschied in der Blattgröße vorlag. Die transgenen Pflanzen hatten längere und breitere Blätter und folglich höhere durchschnittliche Blatt-Frischgewichte (Tabelle 2). Weiterhin waren die Blattstiele in den transgenen Linien länger als in den Kontrollen (Daten nicht dargestellt).
Es bestand ein signifikanter Unterschied in der Spross-Biomasse zwischen transgenen Pflanzen und Kontrollpflanzen, wenn sie entweder auf der Basis von Frischgewicht oder von Trockengewicht gemessen wurde (Tabelle 2). Die transgenen Pflanzen hatten im Durchschnitt ein um 64 % höheres Spross-Trockengewicht als die Kontrollpflanzen. Dieser Unterschied war im Stamm besonders stark ausgeprägt, wo die transgenen Pflanzen ein um 126 % höheres Trockengewicht aufwiesen als die Kontrollpflanzen. Folglich hatten die transgenen Pflanzen auch ein verändertes Verhältnis von Wurzel- zu Sprossgewicht von nur etwa 2:1 im Vergleich zu 4:1 bei Kontrollpflanzen. Obwohl in den transgenen Pflanzen die anfängliche Wurzelbildungskapazität niedriger war, bestand zwischen transgenen Pflanzen und Kontrollpflanzen kein signifikanter Unterschied im Trockengewicht der Wurzeln (Tabelle 2).
Zelllänge und Zellzahl in transgenen Pflanzen
Die Expression des AtGA20ox1-Gens hatte keinen Einfluss auf die Längen von epidermalen Zellen und von Markzellen in vermutlich vollständig verlängerten Internodien (die Definition findet sich im Versuchsprotokoll) in den aktiv wachsenden transgenen Linien (5A). Jedoch waren die Zahl der epidermalen Zellen und die der Markzellen in diesen verlängerten Internodien um etwa 55 % höher als in der Wildtyp-Kontrolle ( 5B).
Außerdem wurde die Kambiumaktivität bestimmt, indem die Zahl von Xylemfaserzellen in Querschnitten gezählt wurde (5C). Die transgenen Linien zeigen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen eine Zunahme von 71 % in der Zahl von Xylemfaserzellen. Die Xylemfasern wurden in Pflanzen, die sich im Ruhezustand befanden, an drei verschiedenen Positionen entnommen, und ihre Längen wurden gemessen. Keine Unterschiede in der Faserlänge aus verschiedenen Höhen in den Bäumen wurden nach gewiesen (Daten nicht dargestellt), jedoch waren die Xylemfasern in den transgenen Linien um etwa 8 % länger als in den Kontrollpflanzen (5C).
Sequenzprotokoll

Claims

Transgener Baum, der im Vergleich zum Wildtyp dieses Baums eine gesteigerte Biomasse-Produktion und Xylemfaser-Länge aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass eine DNA-Sequenz, welche für die Expression eines Polypeptids codiert, das eine GA-20-Oxidase-Aktivität zeigt, in das Genom des Baums funktionell eingefügt ist.
Transgener Baum nach Anspruch 1, wobei der Baum zu einer Hartholz-Art gehört.
Transgener Baum nach Anspruch 2, wobei der Baum zur Gattung Populus gehört.
Transgener Populus sp. nach Anspruch 3, wobei der Baum die Hybride Populus tremula x P. tremuloides ist.
Samen eines transgenen Baums nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Samen eine in ihr Genom funktionell eingefügte DNA-Sequenz aufweisen, welche für die Expression eines Polypeptids codiert, das eine GA-20-Oxidase-Aktivität zeigt.
Zellen eines transgenen Baums nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zellen eine in ihr Genom funktionell eingefügte DNA-Sequenz aufweisen, welche für die Expression eines Polypeptids codiert, das eine GA-20-Oxidase-Aktivität zeigt.
Fortpflanzungsmaterial eines transgenen Baums nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fortpflanzungsmaterial eine in sein Genom funktionell eingefügte DNA-Sequenz aufweist, welche für die Expression eines Polypeptids codiert, das eine GA-20-Oxidase-Aktivität zeigt.
Transgener Baum nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz, welche für die Expression eines Polypeptids codiert, das eine GA-20-Oxidase-Aktivität zeigt, SEQ ID NO: 1 ist.
Samen eines transgenen Baums nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz, welche für die Expression eines Polypeptids codiert, das eine GA-20-Oxidase-Aktivität zeigt, SEQ ID NO: 1 ist.
Zellen eines transgenen Baums nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz, welche für die Expression eines Polypeptids codiert, das eine GA-20-Oxidase-Aktivität zeigt, SEQ ID NO: 1 ist.
Fortpflanzungsmaterial eines transgenen Baums nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz, welche für die Expression eines Polypeptids codiert, das eine GA-20-Oxidase-Aktivität zeigt, SEQ ID NO: 1 ist.