ES2264974T3 - Arboles transgenicos que muestran produccion de biomasa y longitud de fibras del xilema aumentadas y procedimientos para su produccion. - Google Patents
Arboles transgenicos que muestran produccion de biomasa y longitud de fibras del xilema aumentadas y procedimientos para su produccion. Download PDFInfo
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Abstract
Un árbol transgénico que muestra una producción de biomasa y longitud de las fibras del xilema mayores, comparadas con la variedad natural de dicho árbol, caracterizado porque una secuencia de ADN que codifica la expresión de un polipéptido que muestra actividad de GA 20- oxidasa está funcionalmente insertada en el genoma del árbol.
Description
Árboles transgénicos que muestran producción de
biomasa y longitud de fibras del xilema aumentadas y procedimientos
para su producción.
La presente invención se refiere a árboles
transgénicos que muestran producción de biomasa y longitud de fibras
de xilema aumentadas; plantas, semillas, células de plantas y otros
tipos de material de propagación transgénicos, así como
procedimientos para su producción.
Una desventaja principal del cultivo tradicional
de árboles, especialmente para las especies de árboles forestales,
es el lento progreso debido a sus largos periodos de generación. Sin
embargo, aprovechando desarrollos recientes de la tecnología
génica, podría reducirse significativamente el tiempo necesario para
producir una nueva variedad. Además, una estrategia biotecnológica
permitiría acercarse más a características que las industrias
forestal y de pasta de madera consideran deseables, en especies de
árboles específicas.
Hasta la fecha, la mayoría de las aplicaciones
de la ingeniería genética de los árboles se han centrado en
modificar la biosíntesis de lignina, produciendo árboles con menos
lignina o una composición de lignina modificada, floración más
temprana, resistencia a plagas o herbicidas. Para cambiar los
procesos de crecimiento y desarrollo en los árboles, también serían
interesantes la manipulación de los niveles hormonales de las
plantas, o la sensibilidad a las hormonas. Sin embargo, hasta la
fecha sólo ha habido unos pocos ejemplos de modificación de los
niveles de hormonas vegetales en los árboles. Estos se han logrado
principalmente alterando directamente la biosíntesis endógena de
IAA o la biosíntesis de citoquininas o indirectamente modificando
diversos conjuntos de hormonas usando el gen roIC de
Agrobacterium. Aunque tales modificaciones en todos los casos
producen árboles con características de crecimiento y propiedades
de la madera alteradas, hasta la fecha, no se han obtenido mejoras
con una aplicación práctica clara.
Las giberelinas (GA) son un grupo de más de 100
diterpenos tetracíclicos, algunos de los cuales son reguladores
endógenos esenciales que influyen en los procesos de crecimiento y
desarrollo durante todo el ciclo de vida de la planta, por ejemplo,
alargamiento de los brotes, la expansión y forma de las hojas, la
floración y germinación de las semillas. Los mejores ejemplos que
ilustran la importancia de las GA en el control del alargamiento de
los brotes son los mutantes deficientes en GA de Arabidopsis,
maíz y guisante. Estos tienen niveles reducidos de GA
activa(s) comparados con las plantas naturales produciendo un
fenotipo enano debido a la reducción de la longitud internodal. El
fenotipo de tales mutantes deficientes en GA puede restaurarse
completamente mediante la aplicación de una GA activa. A nivel
celular, se ha encontrado que las GA promueven tanto la división
celular como el alargamiento de las células.
La biosíntesis de GA in planta se produce
a través de la ruta de los isoprenoides a partir del ácido
mevalónico. Los niveles de giberelinas son regulados principalmente
por el control de la transcripción de los genes de la biosíntesis
de las giberelinas. En particular, la enzima multifuncional
giberelina 20-oxidasa (GA 20-ox) es
una enzima clave en el control de la biosíntesis de GA (Fig. 1).
Cataliza la conversión en etapas de las giberelinas de
C-20, GA_{12}, GA_{53} mediante tres oxidaciones
sucesivas a GA_{9} GA_{20}, que son los precursores
intermedios de las giberelinas activas, GA_{4} y GA_{1},
respectivamente. La expresión del gen de GA
20-oxidasa está regulada a la baja por la acción de
GA_{14}, lo que sugiere que la represión directa de los productos
finales está implicada en la regulación del gen. Además, algunos
autores han sugerido que GA 20-oxidasa está regulada
fotoperiódicamente a nivel transcripcional.
La aplicación de productos químicos que alteran
los niveles de GA de la planta es una práctica común en la
agricultura y horticultura tradicionales. Los inhibidores de la
biosíntesis de GA se usan de forma especialmente común como
retardantes del crecimiento en los cereales y plantas ornamentales.
Para reducir el uso de estos productos químicos, una estrategia
biológica tal como la modificación genética de la biosíntesis
endógena de GA tendría ventajas claras. Usando Arabidopsis
como organismo modelo se ha demostrado que es posible cambiar los
niveles de GA modificando los niveles de la enzima GA
20-oxidasa y que esto produce plantas con un
crecimiento y patrones de desarrollo alterados. La
Arabidopsis transgénica que expresa la GA
20-oxidasa en una orientación codificante muestra
una floración más temprana y tallos más altos que las plantas
naturales, mientras que las plantas con orientación no codificante
tienen las propiedades inversas [Coles. J.P. y cols. Modification
of gibberellin production and plant development in
Arabidopsis by sense and antisense expression of gibberellin
20-oxidase genes. Plant J. 17,
547-556 (1999)].
La modificación de la biosíntesis de GA en
especies superiores, tales como los árboles tendrían un interés
adicional ya que esto abriría vías para modificar la madera. Los
estudios de aplicación de hormonas anteriores han demostrado que
las GA son necesarias para la diferenciación de las fibras del
xilema, y que tienen efectos pronunciados sobre la longitud de las
fibras secundarias del xilema y tanto sobre el crecimiento
longitudinal como radial en las especies de hojas caducas y en las
coníferas.
Obviamente, sigue existiendo una necesidad de
procedimientos mejorados para modificar las propiedades de
crecimiento de los árboles, en particular propiedades de interés
técnico y económico, tales como velocidad de crecimiento, aumento
de la biomasa y longitud de las fibras. Del mismo modo, sigue
existiendo una necesidad de árboles transgénicos, que muestren
propiedades mejoradas, tales como velocidad crecimiento, volumen de
los troncos y longitud de las fibras del xilema aumentados. En
consecuencia, el objetivo de la presente invención es proporcionar
tales procedimientos mejorados y árboles transgénicos. Otro objetivo
es reducir o eliminar el uso de productos químicos que influyen en
el crecimiento en la silvicultura.
Se ha demostrado (Huang, S. y cols.
Overexpression of 20-Oxidase confers a
gibberellin-overproduction phenotype in
Arabidopsis. Plant Physiol., 1998, volumen 118, páginas
773-781) que el nivel de GA activas aumentó tras la
sobreexpresión de GA 20-oxidasa en Arabidopsis
thaliana. Este hallazgo sin embargo no puede transferirse
directamente a la presente invención.
La mayoría de las dicotiledóneas y todas las
gimnospermas sufren algún grado de engrosamiento secundario. La
cantidad de engrosamiento depende de si la planta madura es una
planta herbácea o una planta leñosa (arborescente). Por ejemplo,
una planta de Arabidopsis sólo producirá un engrosamiento
secundario en condiciones especiales, mientras que una especie
leñosa, por ejemplo Populus, sufrirá un grado elevado de
crecimiento secundario. El bajo grado de engrosamiento secundario
en las especies herbáceas también hará muy difícil predecir qué
correspondencia existe entre los cambios genéticos específicos de
las especies herbáceas y las especies leñosas en lo referente a los
cambios en la formación de madera.
Como ejemplo, al sobreexpresar GA
20-oxidasa en Arabidopsis thaliana, puede
aumentarse el nivel de GA activas en la planta, tal como
demostraron Huang y cols. (referencia anterior). El fenotipo de la
planta transgénica incluyó un alargamiento celular espectacular en
todos los tejidos. Los peciolos, los tallos de las inflorescencias
y las hojas mostraron todos alargamiento celular. A partir de estos
resultados está claro que los niveles potenciados de giberelinas
tienen un efecto sobre el alargamiento celular desde la germinación.
Sin embargo, a partir de estos resultados es imposible predecir
cual sería el efecto de la sobreexpresión de GA
20-oxidasa en una planta leñosa. La división
celular en el meristemo cambial en una planta leñosa está controlada
por varias hormonas diferentes y restricciones físicas que no se
encuentran en una planta anual tal como Arabidopsis
thaliana.
Por lo tanto fue sorprendente que se produjera
un alargamiento celular aumentado en células (fibras) de origen
cambial, y que se produjera un aumento de la biomasa producido por
una división celular cambial aumentada. No sería obvio para una
persona de experiencia en la técnica sobreexpresar GA
20-oxidasa para aumentar la biomasa leñosa y el
alargamiento de las fibras.
El aumento del diámetro de los troncos arbóreos
se produce principalmente a partir de la actividad meristemática
del cámbium vascular, un meristemo lateral cilíndrico que se
localiza entre el xilema y el floema del tronco, ramas y raíces
leñosas. En el cámbium se producen dos tipos de división celular:
aditiva y multiplicativa. La división aditiva implica la división
periclinal de las células iniciales cambiales fusiformes para
producir células madre de xilema y floema que a su vez se dividen
produciendo células de xilema y floema. La división multiplicativa
implica la división anticlinal de las células iniciales fusiformes
que hacen posible la expansión en circunferencia del cámbium.
Después de que las células de xilema y floema son aisladas por las
células madre cambiales, se diferencian en una secuencia ordenada
de eventos que incluye agrandamiento celular, formación de paredes
secundarias, lignificación y pérdida de protoplastos. Estos eventos
no se producen en fases progresivas, sino en fases que se
solapan.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar plantas, semillas y células vegetales transgénicas que
muestran parámetros de crecimiento mejorados y, en particular,
producción de biomasa y longitud de las fibras del xilema. Otro
objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para la
producción y proliferación de dichas plantas transgénicas. Los
objetos anteriores y otros que no se mencionan explícitamente, se
consiguen mediante una planta leñosa transgénica que tiene una
secuencia de ADN que codifica la expresión de un polipéptido que
muestra actividad de GA 20-oxidasa insertada
funcionalmente en el genoma de la planta. Realizaciones adicionales
son tal como se definen en las reivindicaciones dependientes e
independientes adjuntas, que se incorporan a la presente memoria por
referencia.
Otras características y ventajas de la invención
serán obvias a partir de la siguiente descripción y ejemplos no
limitantes, y a partir de las reivindicaciones.
La invención se describirá en más detalle a
continuación, en la descripción y ejemplos y dibujos que se
acompañan, en los que
La Figura 1 muestra las rutas biosintéticas que
convierten GA_{12} y GA_{53} en los productos biológicamente
activos GA_{4} y GA_{1}, y sus catabolitos desactivados
GA_{34} y GA_{8}. GA 20-oxidasa cataliza la
oxidación en el carbono C-20.
La Figura 2 muestra un análisis Northern de diez
líneas que sobreexpresan GA 20-oxidasa (números 1 a
15) y el control no transformado (C). Se cargaron 18 \mug de ARN
total de cada muestra, y se sondaron con un fragmento marcado
aislado de ADNc de giberelina 20-oxidasa de
Arabidopsis (AtGA20ox1) o de una secuencia EST de
ubiquitina endógena (UBQ) (pttUBQ).
La Figura 3 muestra el crecimiento potenciado
del álamo híbrido transgénico: el alargamiento acumulado de los
brotes (diagrama superior) y el crecimiento acumulado en diámetro
(diagrama inferior) de diversas líneas que sobreexpresan GA
20-oxidasa transgénica, tras la generación a partir
de cultivo tisular, introducción en macetas y cultivo en una cámara
de cultivo durante siete semanas (en tiempo cero).
La Figura 4 es una fotografía que muestra
plantas de control y transgénicas (línea 11) después de 12 semanas
en la cámara de cultivo.
La Figura 5 ilustra los efectos de la
sobreexpresión de GA 20-oxidasa en (A) longitudes
celulares, (B) números de células por internodo, (C) número de
fibras de xilema y (D) longitud de las fibras del xilema. Las
longitudes celulares y los números de células se midieron en
internodos completamente alargados de plantas con crecimiento
activo al igual que el número de fibras de xilema. Los datos para
las líneas que sobreexpresaban GA 20-oxidasa son
las medias de nueve líneas generadas de forma independiente,
respectivamente. Los valores de la longitud de las fibras para las
plantas que no estaban en proceso de alargamiento representan las
medias de tres líneas generadas independientemente. Las barras
verticales representan el ET.
La Figura 6 muestra que existe una potenciación
del crecimiento en diámetro del álamo híbrido transgénico también
en la segunda estación de crecimiento. El crecimiento en diámetro
acumulado del control (WT) y de las líneas 4 y 13 se determinó
durante un periodo de 2,5 meses, iniciado después de terminar el
periodo de inactividad.
Los presentes inventores han demostrado
sorprendentemente que la sobreexpresión ectópica de un gen de GA
20-oxidasa en los árboles, ejemplificados en la
presente memoria por un árbol de hoja caduca de zona templada,
produce cambios significativos de la velocidad de crecimiento,
volumen del tronco, y longitud de las fibras del xilema. Se usó una
secuencia de ADNc (SEC. ID. N.º 1) homóloga a la secuencia de GA
20-oxidasa de Arabidopsis thaliana X83379
(número de acceso de EMBL) que codifica un polipéptido que muestra
actividad de GA 20-oxidasa. Así, los resultados
obtenidos por los presentes inventores muestran que la modificación
genética de los niveles de GA en los árboles puede usarse para
modificar características que son muy importantes para las
industrias forestal, de pasta de madera y de papel.
Los resultados muestran que el incremento
endógeno de las giberelinas GA_{1} y GA_{4} biológicamente
activas, en los árboles acelerará el crecimiento. Esto se demostró
mediante la expresión del gen AtGA20ox1 de Arabidopsis en el
álamo híbrido, Populus tremula x tremuloides, produciendo
árboles con un crecimiento más rápido en altura y diámetro, hojas
mayores, fibras del xilema más largas y mayor biomasa. Este fenotipo
recuerda en parte a las características observadas anteriormente en
plantas de Arabidopsis transgénicas que sobreexpresan la
misma GA 20-oxidasa [Coles. J.P. y cols.
Modification of gibberellin production and plant development in
Arabidopsis by sense and antisense expression of gibberellin
20-oxidase genes. Plant J. 17,
547-556 (1999)]. Tales plantas tenían
hipocotiledones más largos, hojas en roseta mayores, peciolos más
largos y floración acelerada comparadas con las plantas
naturales.
Sin embargo, no se han reseñado estudios
respecto al aumento de biomasa y cambios anatómicos en
Arabidopsis transgénica. Es muy dudoso si podría lograrse una
biomasa aumentada en Arabidopsis transgénica.
Se ha sugerido que GA 20-oxidasa
es una enzima clave en la regulación del crecimiento controlado por
GA [Hedden, P. y Kamiya, Y., Gibberellin biosynthesis: Enzimes,
genes and their regulation. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.
Biol. 48, 431-460 (1997)]. El hecho de
que la transcripción del gen de GA 20-oxidasa está
regulada por retroalimentación mediante la acción de GA, sugiere
que la sobreexpresión constitutiva del gen de GA
20-oxidasa alterará la regulación endógena de la
homeostasis de GA. Aquí, la sobreexpresión de GA
20-oxidasa en el álamo produjo un aumento de GA de
C_{19} implicadas tanto en el inicio de la ruta de
13-hidroxilación como en la ruta distinta de la
13-hidroxilación (Fig. 1). Así, no se produjo una
diferencia consistente en los niveles entre GA_{1} y GA_{4},
que son ambas biológicamente activas en Populus. Los
presentes resultados, por lo tanto, son acordes a las mediciones
anteriores de GA en plantas transgénicas de Arabidopsis con
superproducción de GA 20-oxidasa. Además, tanto en
el álamo híbrido como en Arabidopsis se produjo un aumento
espectacular de los niveles del producto final desactivado, GA.
(Tabla 1).
Se ha sugerido que esto es debido a un recambio
más lento de GA_{8} que de GA_{1}. Los niveles relativamente
bajos del otro producto final GA_{34}, formado por la ruta
distinta de la 13-hidroxilación puede explicarse
por un recambio más rápido de este compuesto que de GA_{8}. Al
contrario que las GA de C_{19}, se ha observado un descenso de
los niveles de las GA de C_{20} en las plantas transgénicas. Esto
es consistente con el hecho de que las GA de C_{20} son por
definición sustratos para la GA 20-oxidasa (Tabla
1).
Es sorprendente que la elevada expresión de GA
20-oxidasa tenga efectos tan marcados en Populus
tremula x tremuloides. Esto sugiere que la sobreexpresión
constitutiva del gen de GA 20-oxidasa altera la
regulación endógena de la homeostasis de las GA.
En el presente estudio, los inventores
encontraron diferencias en los niveles de las GA entre los tejidos
de las hojas y de los troncos: siendo los aumentos de los niveles de
las GA_{1} y GA_{4} activas más altos en el tejido del tronco.
Esto podría haberse debido a que el gen AtGA20ox1 se expresa
con más fuerza en el tronco. En el álamo híbrido, sin embargo, el
promotor CaMV 35S generalmente es ligeramente más activo en las
hojas que en el tronco, aunque se sabe que se dan excepciones. Por
lo tanto, los niveles más altos de GA_{1} y GA_{4} del tronco,
son debidos más probablemente a diferencias en el transporte de las
GA o de la biosíntesis de los precursores de GA. Sin embargo, no
puede descartarse que pueda existir una diferencia en la actividad
de GA 3\beta-hidroxilasa o GA
2\beta-hidroxilasa en las hojas. En
Arabidopsis se ha demostrado que la
2\beta-hidroxilación es activada en el nivel de
transcripción por las GA activas.
El aumento del crecimiento en altura observado
(Figura 3) en los árboles Populus transgénicos para GA
20-oxidasa, aparentemente no fue consecuencia de un
mayor alargamiento de las células, ya que no se encontraron cambios
significativos en las longitudes de las células (Figura 5A). Sin
embargo, las diferencias que se observaron en los números de
células por cada internodo completamente alargado indican claramente
que los niveles elevados de GA afectan a las divisiones celulares
del tejido del tronco (Figura 5). Este es un aspecto interesante de
la presente invención, que abre muchas posibilidades de influenciar
la producción de materia prima fibrosa y biomasa para fines
diferentes.
Aunque se ha encontrado que las GA afectan al
alargamiento celular, también es sabido que las GA pueden inducir
una actividad mitótica en la región subapical del tronco. Debe
hacerse énfasis sin embargo, en que aunque se tomaron muestras para
las mediciones de la longitud de las células de la misma posición
tanto para las plantas de control como para las transgénicas
(definida por el número de internodos desde el ápice), no puede
descartarse que las células de las plantas transgénicas podrían
haber estado en una fase de desarrollo más temprana que las plantas
naturales, y todavía podrían haber estado alargándose. También se ha
sugerido que la acción de las GA en los tejidos del meristemo
extiende la zona de alargamiento del órgano que se esté
formando.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los estudios que implican la aplicación de
hormonas vegetales han demostrado que las GA pueden aumentar la
actividad cambial en los árboles, especialmente junto con IAA. Aquí,
el aumento por ingeniería de los niveles de GA produjo un
crecimiento más rápido del diámetro del tronco (Fig. 4). También se
observó un efecto de los niveles de GA elevados en el crecimiento
secundario con el aumento del número de células de fibras del
xilema y la longitud de las fibras del xilema (Fig. 5C, D). El
aumento de la longitud medido en los experimentos es
aproximadamente 8% que debe mantenerse que es un aumento
significativo que tiene consecuencias para las propiedades de las
fibras y así para los usos potenciales para la materia prima
fibrosa.
Esto es consistente con los estudios de
aplicación tanto con las GA como con los inhibidores de la
biosíntesis de GA. En Populus, las longitudes de las fibras y
los vasos aumentan en la zona de transición entre la madera juvenil
y madura. Por lo tanto, el tiempo que tarda una célula en madurar en
la región cambial, es decir, el tiempo que pasa en las diferentes
zonas de diferenciación, determinará finalmente su tamaño y grosor
de la pared celular. Si la acción de GA tales como GA_{1} y/o
GA_{4} extiende su tiempo de transición, esto explicaría tanto la
mayor longitud de las fibras en las partes maduras de la planta
transgénica como la falta de diferencias en la longitud de las
fibras del xilema entre las plantas transgénicas y de control en el
tejido de los troncos jóvenes.
El aumento en el tamaño de las hojas en las
plantas transgénicas se produjo como resultado de un aumento del
alargamiento tanto radial como longitudinal (Tabla 2). En etapas más
tempranas, el crecimiento longitudinal fue más pronunciado,
produciendo hojas largas y estrechas. Sin embargo, en etapas
posteriores, la morfología de las hojas se hizo similar a la de las
plantas de control con una proporción similar entre la anchura y la
longitud de las hojas. Se ha demostrado que las GA promueven el
alargamiento de las hojas, por ejemplo, en el guisante. Las hojas
muy largas y estrechas que se observan en los mutantes de las
señales de GA constitutivas, tales como los mutantes s/n de
la cebada y los mutantes spy de Arabidopsis, indican
también que las GA promueven el alargamiento de las hojas. Sin
embargo, se conoce poco de los papeles reguladores más específicos
de las GA en el desarrollo de las hojas. En Arabidopsis, la
expansión de los limbos de las hojas está regulada al menos por dos
procesos independientes y polarizados: el desarrollo en longitud y
en anchura, donde los genes ROTUNDIFOLIA y
ANGUSTIFOLIA desempeñan papeles específicos. No se sabe si
las GA modulan las respuestas celulares a estos genes. Sin embargo,
es digno de atención que los fenotipos de las hojas en el álamo
transgénico para GA 20-oxidasa cambian durante el
desarrollo, lo que sugiere que los dos procesos separados desde el
punto de vista del desarrollo del crecimiento de la longitud y
anchura de las hojas son afectados por las GA, pero en etapas
diferentes.
diferentes.
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Para todos los análisis estadísticos, se usó un
ANOVA para comparar las plantas con respecto al genotipo. Las
diferencias estadísticamente significativas se indican con niveles
de probabilidad del 1% (*) y 5% (**) (DMSP de Fisher).
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| Genotipo | |||
| Control | Línea 2 | Línea 11 | |
| Longitud internodal (cm \pm ET) | 2,19 \pm 0,05 | 3,06 \pm 0,09* | 3,07 \pm 0,09* |
| Longitud y anchura de las hojas (cm \pm ET) | |||
| Longitud de la hoja 10 | 8,34 \pm 0,36* | 9,52 \pm 0,38** | 9,17 \pm 0,28 |
| Anchura de la hoja 10 | 7,25 \pm 0,41 | 6,28 \pm 0,20 | 5,85 \pm 0,24** |
| Longitud de la hoja 14 | 9,52 \pm 0,45 | 11,18 \pm 0,60** | 10,78 \pm 0,41 |
| Anchura de la hoja 14 | 8,00 \pm 0,38 | 8,35 \pm 0,39 | 8,52 \pm 0,25 |
| Longitud de la hoja 18 | 9,90 \pm 0,79 | 11,06 \pm 1,00 | 11,68 \pm 0,56 |
| Anchura de la hoja 18 | 7,48 \pm 0,64 | 8,80 \pm 0,47 | 8,88 \pm 0,43 |
| Longitud de la hoja 20 | 7,75 \pm 0,34 | 11,94 \pm 0,44* | 11,25 \pm 0,48* |
| Anchura de la hoja 20 | 6,07 \pm 0,46 | 9,44 \pm 0,41* | 8,85 \pm 0,41* |
| Biomasa del peso seco (g) | Control | Línea 2,11 | Transgenes |
| Hoja | 5,45 \pm 0,51 | 6,38 \pm 0,58 | 6,14 \pm 0,28 |
| Tronco | 4,58 \pm 0,43 | 10,42 \pm 1,01* | 10,34 \pm 0,49* |
| Raíz | 43,05 \pm 4,71 | 38,36 \pm 2,63 | 37,81 \pm 2,06 |
| Biomasa del peso fresco (g) | |||
| Hoja | 17,10 \pm 1,63 | 23,10 \pm 2,01** | 22,05 \pm 0,91** |
| Tronco | 12,04 \pm 1,19 | 31,39 \pm 2,88* | 30,58 \pm 1,28* |
Las mediciones de la biomasa en las plantas
transgénicas y naturales revelaron que un aumento de la actividad
de GA 20-oxidasa provoca un aumento general del
crecimiento. Este efecto era especialmente pronunciado en el
tronco, lo que indica que las GA tienen un efecto potente sobre el
crecimiento del tronco. Los experimentos de pulverización con
diversas GA han mostrado anteriormente que estas hormonas tienden a
aumentar la biomasa de los brotes en Populus a costa del
crecimiento de las raíces. Anteriormente se ha demostrado una
reducción de la formación de las raíces debida a los niveles
aumentados de GA en las raíces de los árboles. En este estudio, el
problema principal para la supervivencia de las plantas transgénicas
para GA 20-oxidasa fue una iniciación deficiente
de las raíces en el cultivo tisular y al plantar en tierra. En
etapas de desarrollo posteriores, el desarrollo de las raíces
todavía estaba afectado, pero en un grado menor (Tabla 2). También
se ha demostrado que el efecto de las GA sobre el enraizamiento
varía dependiendo de la etapa de desarrollo de las raíces.
En conclusión, los presentes inventores han
demostrado el importante papel de la actividad de GA
20-oxidasa en el crecimiento controlado por GA en
Populus. Es sorprendente que los efectos, que hasta la fecha
sólo se habían logrado, y en algunos casos sólo se habían logrado
parcialmente, mediante la aplicación externa, por ejemplo, por
pulverización, pueden lograrse mediante la expresión endógena.
También es sorprendente que el procedimiento de la invención puede
aplicarse a especies superiores, representadas en la presente
memoria por el álamo híbrido, Populus tremula x P.
tremuloides. Así, una ventaja importante de la presente
invención es que puede posibilitar la reducción o eliminación del
uso de los compuestos químicos que influyen en el crecimiento en la
silvicultura.
La presente invención abre vías para la
modificación por ingeniería genética de los árboles para que crezcan
más rápido y produzcan más biomasa simplemente aumentando los
niveles endógenos de GA. De forma interesante, las longitudes de
las fibras también aumentan como resultado de la sobreexpresión de
las GA. Estos resultados tienen implicaciones tanto prácticas
(ayuda a la producción de árboles modificados de interés para las
industrias de la pasta, papel y forestal), como de importancia
científica, al permitir estudios anteriormente imposibles sobre los
mecanismos por los que las GA controlan el crecimiento y desarrollo
de los árboles.
La construcción de ADNc de GA
20-oxidasa de Arabidopsis clonada en
bluescript pAt2301 [Phillips, A.L. y cols. Isolation and expression
of three gibberellin 20-oxidase cDNA clones from
Arabidopsis. Plant Physiol. 108,
1049-1057 (1995)], recientemente cambiado de nombre
a AtGA20ox1 [Coles. J.P. y cols. Modification of gibberellin
production and plant development in Arabidopsis by sense and
antisense expression of gibberellin 20-oxidase
genes. Plant J. 17, 547-556 (1999)],
se obtuvo como regalo de P. Hedden.
Se eliminó una secuencia ATG aguas arriba, que
precedía el inicio de la traducción de la enzima GA
20-oxidasa, mediante mutagénesis in vitro. En
una reacción de PCR se usaron un cebador directo que era
complementario al extremo 5' del gen de GA
20-oxidasa, pero que carecía del ATG adicional y que
portaba un sitio Bam HI y Xba I, y un cebador inverso
que abarcaba un sitio Hind III interno en el gen GA
20-oxidasa. Usando AtGA20ox1 como molde, se
obtuvo un producto de la PCR y se subclonó en el vector pOK12,
generando el plásmido pOK12-GA20ox5'. Después se
reconstituyó un ADNc de GA 20-oxidasa completa que
carecía del ATG adicional, digiriendo AtGA20ox1, aislando un
fragmento que contenía el extremo 3' del gen de GA
20-oxidasa y ligando este fragmento en
pOK12-GA20ox5', dando el plásmido
pOK12-AtGA20ox1. El ADNc de GA
20-oxidasa se aisló después de
pOK12-AtGA20ox1, mediante digestión con Bam
HI, y se ligó en orientación codificante en el sitio Bam
HI del vector binario pPCV702.kana [Walden, R., Koncz, C. y
Schell, J. Methods Mol. Cell Biol., 1, 175-194
(1990). The use of gene vectors in plant molecular biology,
Methods Mol. Cell Biol. 1, 175-194 (1990)],
sometiéndolo al control del promotor CaMV 35S.
El clon T89 de álamo híbrido Populus tremula
L. x P. tremuloides Michx se transformó y regeneró esencialmente
tal como se describe anteriormente [Nilsson., O. y cols., Spatial
pattern of cauliflower mosaic virus 35S
promoter-luciferase expression in transgenic hybrid
aspen trees monitored by enzymatic assay and
non-destructive imaging. Transgenic Research
1, 209-220 (1992)]. De 14 líneas independientes, se
seleccionaron 10 y se multiplicaron por cultivo de brotes in
vitro en medio MS de media potencia que contenía minerales y
vitaminas [Murashige, T. y Skoog, F. A revised medium for rapid
growth and bio-assay with tobacco tissue cultures.
Physiologia Plantarum 15, 473-479
(1962)].
Tras la iniciación de las raíces, las plantas se
introdujeron en polvo de enraizamiento Weibufix (Svalöf Weibull AB.
Hammenhög, Suecia), y se plantaron en macetas en una mezcla de
turba:perlite fertilizada (5:1) y se mantuvieron en una cámara de
cultivo a 18ºC con un fotoperiodo de 18 horas y una humedad relativa
de 90%. La densidad de flujo de fotones del periodo de luz principal
(10 h) era de 175 \mumol m^{-2} s^{-1} a
400-750 nm (Lámparas Osram Power Staw
HQI-TS 400 WD. Osram, Alemania) y se administraron
extensiones de la duración del día usando luz de baja intensidad (20
\mumol^{-2} s^{-1}). Las plantas se regaron a diario, y se
replantaron y se fertilizaron con una solución de nutrientes
completa (SuperbaS, Supra Hydro AB, Landskrona, Suecia) cuando era
necesario. Después de 108 días, algunas plantas se transfirieron a
condiciones de fotoperiodo corto (10 h) para inducir el cese del
crecimiento. Estas plantas después se aclimataron al frío y se
mantuvieron inactivas a 8ºC durante 4 semanas, momento en el cual se
tomaron muestras para las mediciones de la longitud de las
fibras.
A las siete semanas de edad, las plantas se
marcaron en un internodo con crecimiento activo aproximadamente en
la misma posición para todas las plantas. Esto se usó como punto de
referencia para las mediciones de crecimiento en diámetro y para el
recuento de los internodos. El diámetro, altura y número de
internodos de las plantas se midieron cada 3 a 4 días. El número de
internodos se contó desde la parte superior al punto de referencia:
definiéndose el primer internodo como el de debajo de la hoja más
alta que tenga al menos 1 cm de largo. Las plantas que crecieron en
los días largos se recolectaron después de 100 días, usando siete
plantas de control y 25 plantas que representaban nueve líneas
transgénicas individuales (la línea 6 se excluyó). Se tomaron
muestras de los internodos 7 y 8 incluyendo las hojas superiores,
para realizar los análisis de GA y las hojas de los nodos 9 y 10
para el análisis Northern. Todos los tejidos se congelaron en
N_{2} líquido inmediatamente después de tomar las muestras. Para
los estudios anatómicos, se midieron las longitudes de los
internodos 15 y 16, después se cortaron y se fijaron inmediatamente
en FAA. Todas las partes que quedaban después de tomar las muestras
se separaron en fracciones de hojas, troncos y raíces y se usaron
para las determinaciones de la biomasa de peso fresco. El peso seco
se determinó tras secar las muestras a 55ºC durante 5 días. Se
tomaron muestras de las plantas inactivas constituidas por tres
controles y cinco transgénicas (que representaban las líneas 2, 11
y 14) en los internodos 1, 10 y 20, contando a partir del punto de
referencia. Estas muestras se usaron para maceración y subsiguientes
mediciones de la longitud de las fibras.
Siguiendo los procedimientos de fijación química
convencionales, las muestras se embebieron en LR White [Regan, S.,
Bourquin, V., Touminen, H. y Sundber, B. Accurate and high
resolution in situ hybridization analysis of gene expression
in secondary stem tissues. Plant J. 19,
363-369 (1999)]. Se obtuvieron secciones
longitudinales para los recuentos celulares (internodo 15 y 16) y
secciones transversales para el recuento de fibras (internodo 30),
de 2 \mum de grosor y se tiñeron con azul de toluidina. Se
determinaron los números de células epidérmicas y medulares en 1 mm
de las secciones longitudinales para 3 secciones por internodo. La
longitud de las células y el número de células por internodo se
calcularon como las medias encontradas en los internodos 15 y 16.
El número de fibras de xilema se contó en tres filas radiales
separadas (de la médula al cámbium) por individuo y se calculó la
media para cada genotipo (línea 4, 11, 13 y control).
Para la determinación de la longitud de las
fibras, se prepararon trozos recortados de xilema externo de los
internodos seleccionados. Las muestras se maceraron hirviendo en una
solución de peróxido de hidrógeno al 10% y ácido acético glacial al
50% durante 4-6 horas. Cuando se blanquearon
totalmente, se enjuagaron con agua destilada tres veces, se
neutralizaron con carbonato sódico y se lavaron otra vez en agua.
Finalmente, las fibras se separaron las unas de las otras agitando
en agua y se midieron usando un analizador de fibras (KAJAANI
FiberLab, Valmet Automation Kajaani Ltd., Kajaani, Finlandia). De
media, se midieron las longitudes de 30 800 fibras por muestra.
El ARN total se extrajo de las hojas usando un
procedimiento con base de cloroformo y bromuro de
hexadeciltrimetilamonio de acuerdo con Chang y cols. [Chang, S.,
Puryear, J. y Cairney, J. A simple and efficient method for
isolating RNA from pine trees. Plant Mol. Biol. Rep. 11,
113-116 (1993)]. Se separaron aproximadamente 18
\mug de ARN total por muestra en un gel de agarosa con
formaldehído de acuerdo con Sambrook y cols. [Sambrook, J.,
Fritsch, E y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Nueva York, 1989] y
se transfirieron sobre una membrana de nylon
Hybond-N (Amersham, Little Chalfont, Reino Unido) de
acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usaron un fragmento
Bam HI/Xho I recuperado de pOK12-AtGA20ox1 y
una secuencia marcadora expresada tipo ubiquitina (EST A046p57)
obtenida del proyecto de secuenciación del Populus [Sterky,
F. y cols. Gene discovery in the wood-forming
tissues of poplar: Analysis of 5,692 expressed sequence tags.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335
(1998)] como sondas para el análisis de expresión de
AtGA20ox1 ectópico y expresión de genes de referencia
respectivamente. La hibridación se realizó en un tampón de Church
[Church, G.M. y Gilbert W., Genomic sequencing. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81: 1991-1995 (1984)] a 65ºC hasta la
mañana siguiente. La membrana se lavó a 65ºC, dos veces, tres
minutos en cada una de las soluciones: 2 x SSPE, SDS al 0,1%; 1 x
SSPE, SDS al 0,1%; 0,5 x SSPE, SDS al 0,1% y 0,1 x SSPE, SDS al
0,1%. Para visualizar los patrones de expresión, la membrana se
expuso a un aparato de obtención de imágenes fosforescentes
(Molecular Imager GS-525. Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) hasta la mañana siguiente.
Se molieron muestras de 200-300
mg en nitrógeno líquido hasta un polvo homogéneo, y las GA se
analizaron tal como ha sido descrito anteriormente por Peng y cols.
[Peng, J.R., Richards, D. E., Moritz, T., CanoDelgado, A. y
Harberd, N.P., Extragenic suppressors of the Arabidopsis gai
mutation alter the dose-response relationship of
diverse gibberellin responses. Plant Physiol. 119,
1199-1207 (1999)] con unas pocas modificaciones. Se
redujeron los volúmenes de los disolventes usados para la extracción
y reparto y el de la columna de intercambio aniónico. Además, las
muestras se metilaron antes de la etapa de HPLC, y finalmente se
analizaron por CG/EM-SRM (control de reacción
seleccionada) usando un espectrómetro de masas de cuatro sectores
JEOL SX, SX102A (JEOL, Tokio, Japón). Se usaron
[^{2}H_{2}]-GA como patrones internos.
De las 14 líneas transformadas
independientemente, 10 se regeneraron y se seleccionaron para
análisis ulteriores. El análisis Southern mostró que todas las
líneas transgénicas seleccionadas tienen de una a tres copias del
gen AtGA20ox1 insertadas en sus genomas, excepto la línea 6,
que tiene al menos 4 copias (no se muestran datos). El análisis
Northern del ARN aislado de tejido de hojas demostró que la
expresión más fuerte del gen AtGA20ox1 se daba en las líneas
2, 7, 9, 14 y 15. La expresión era algo menor en las líneas 1, 4, 11
y 13, mientras que la expresión era casi indetectable en la línea 6
(Fig. 2). En general, las líneas transgénicas mostraron un
enraizamiento más deficiente que las plantas de control, tanto en
condiciones de cultivo tisular como cuando se plantaron en tierra.
Cuando se plantaron, por ejemplo, 100% de las plantas de control
sobrevivieron, comparado con sólo 32% de las plantas
transgénicas.
El contenido en GA se determinó tanto en las
hojas como en los internodos de tejido con crecimiento activo. Las
plantas transgénicas demostraron niveles altos de las GA de
C_{19}13-hidroxiladas (GA_{20}, GA_{1} y
GA_{8}) y las GA de C_{19} no 13-hidroxiladas
(GA_{9}, GA_{4} y GA_{34}) tanto en el tronco como en las
hojas (Tabla 1). El aumento comparado con los niveles naturales fue
más pronunciado en el tejido del tronco que en el tejido de las
hojas. Los niveles de GA_{1} y GA_{4} biológicamente activas en
los tejidos del tronco de la línea 7 fueron 22 y 24 veces mayores,
respectivamente, que en el control. Además, todas las líneas
transgénicas mostraron niveles más bajos de los sustratos para la GA
20-oxidasa. Por ejemplo los niveles de GA_{12} y
GA_{53} en los tejidos del tronco de la línea 7 fueron un 17% y un
9% del contenido del control, respectivamente.
Todas las líneas transgénicas mostraron un
crecimiento en altura y diámetro más rápido que las naturales (Fig.
3), dando a los árboles un fenotipo característico (Fig. 4). Aunque
los niveles de ARNm de GA 20-oxidasa variaban
entre las líneas transgénicas (Fig. 2), no había una correlación
estricta entre los niveles de expresión y el crecimiento. Un
estudio detallado de dos de las líneas transgénicas (Tabla 2) reveló
que la diferencia en el crecimiento en altura se debía
principalmente a diferencias entre las longitudes internodales. No
se observaron diferencias estadísticamente significativas entre el
número de nodos (hojas) (no se muestran datos). Sin embargo, el
desarrollo de las hojas era diferente en las líneas transgénicas.
Las hojas jóvenes en expansión tenían una morfología diferente y
una relación entre la longitud y la anchura mayor que las hojas de
las plantas de control (Tabla 2). Después del nodo 14, es decir, en
las hojas completamente expandidas, no existía una diferencia
significativa en esta proporción morfológica, pero todavía había una
diferencia clara en el tamaño de las hojas entre las plantas de
control y las transgénicas. Las transgénicas tenían hojas más largas
y más anchas y, en consecuencia, unos pesos frescos de hojas medios
más elevados (Tabla 2). Además, los peciolos eran más largos en las
líneas transgénicas que en los controles (no se muestran datos).
Existía una diferencia significativa en la
biomasa de los brotes entre las plantas transgénicas y de control
medida en base al peso fresco o seco (Tabla 2). Las plantas
transgénicas tenían un peso seco de los brotes un 64% mayor de
media, que las plantas de control. Esta diferencia era especialmente
pronunciada en el tronco, donde las plantas transgénicas tenían un
peso seco 126% mayor que las plantas de control. En consecuencia,
las plantas transgénicas también tenían una relación alterada del
peso entre las raíces y los brotes, de sólo aproximadamente 2:1
comparada con 4:1 para las plantas de control. Aunque la capacidad
de enraizamiento inicial era más baja en las líneas transgénicas,
no había
una diferencia significativa en el peso seco de las raíces entre las plantas transgénicas y las de control (Tabla 2).
una diferencia significativa en el peso seco de las raíces entre las plantas transgénicas y las de control (Tabla 2).
La expresión del gen AtGA20ox1 no afectó
a las longitudes de las células epidérmicas ni medulares de los
internodos que presumiblemente estaban completamente alargados
(véase el Protocolo experimental para la definición) en las líneas
transgénicas con crecimiento activo (Figura 5A). Sin embargo, los
números de células epidérmicas y medulares de estos internodos
alargados eran aproximadamente 55% más elevados que en el control
natural (Figura 5B).
La actividad cambial se determinó también
contando los números de células de fibras del xilema en secciones
transversales (Fig. 5C). Las líneas transgénicas muestran un aumento
del 71% en el número de células de las fibras del xilema comparadas
con las plantas de control. Las muestras de las fibras del xilema se
tomaron en tres posiciones diferentes en plantas inactivas y se
midieron sus longitudes. No se detectaron diferencias en la
longitud de las fibras a diferentes alturas en los árboles (no se
muestran datos), pero las fibras del xilema eran aproximadamente 8%
más largas en las líneas transgénicas que en las plantas de control
(Fig. 5C).
<110> Swetree Genomics AB
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Árboles transgénicos y
procedimientos para su producción
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MH42953
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1259
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: construcción de ADNc de GA 20-oxidasa de
Arabidopsis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 377
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: construcción de ADNc de GA 20-oxidasa de
Arabidopsis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (11)
1. Un árbol transgénico que muestra una
producción de biomasa y longitud de las fibras del xilema mayores,
comparadas con la variedad natural de dicho árbol,
caracterizado porque una secuencia de ADN que codifica la
expresión de un polipéptido que muestra actividad de GA
20-oxidasa está funcionalmente insertada en el
genoma del árbol.
2. Un árbol transgénico de acuerdo con la
reivindicación 1, perteneciendo dicho árbol a una especie de hojas
caducas.
3. Un árbol transgénico de acuerdo con la
reivindicación 2, perteneciendo dicho árbol al género
Populus.
4. Un Populus sp. transgénico de acuerdo
con la reivindicación 3, siendo dicho árbol el híbrido Populus
tremula x P. tremuloides.
5. Semillas de un árbol transgénico de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, teniendo dichas
semillas una secuencia de ADN que codifica la expresión de un
polipéptido que muestra actividad de GA 20-oxidasa
funcionalmente insertada en su genoma.
6. Células de un árbol transgénico de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, teniendo dichas
células una secuencia de ADN que codifica la expresión de un
polipéptido que muestra actividad de GA 20-oxidasa
funcionalmente insertada en su genoma.
7. Material de propagación de un árbol
transgénico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
- 4, teniendo dicho material de propagación una secuencia de ADN que
codifica la expresión de un polipéptido que muestra actividad de GA
20-oxidasa funcionalmente insertada en su
genoma.
8. Un árbol transgénico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, caracterizado
porque la secuencia de ADN que codifica la expresión de un
polipéptido que muestra actividad de GA 20-oxidasa
es la SEC. ID. N.º 1.
9. Semillas de un árbol transgénico de acuerdo
con la reivindicación 5, caracterizadas porque la secuencia
de ADN que codifica la expresión de un polipéptido que muestra
actividad de GA 20-oxidasa es la SEC. ID. N.º 1.
10. Células de un árbol transgénico de acuerdo
con la reivindicación 6, caracterizadas porque la secuencia
de ADN que codifica la expresión de un polipéptido que muestra
actividad de GA 20-oxidasa es la SEC. ID. N.º 1.
11. Material de propagación de un árbol
transgénico de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado
porque la secuencia de ADN que codifica la expresión de un
polipéptido que muestra actividad de GA 20-oxidasa
es la SEC. ID. N.º 1.
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