WO2001057224A2 - Allenoxidcyclasegen und dessen verwendung zum herstellen von jasmonsäure - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die für eine pflanzliche Allenoxidcyclase (AOC) kodiert. Die Bereitstellung des neuen cDNA-Klons erlaubt nun erstmalig die Herstellung von Jasmonsäure in grossen Mengen und grosser Reinheit auf biotechnologischem Weg.
Description
Allenoxidcyclasegen und dessen Verwendung zum Herstellen von Jasmonsäure
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die für eine pflanzliche Alleno- xidcyclase kodiert sowie die Verwendung der Nukleinsäure zur Herstellung von Jasmonsäure auf biotechnologischem Weg.
Jasmonsäure (JA) und deren Methylester (JAME), die zusammen auch Jasmonate genannt werden, bestehen aus einem Cyclopentanonring, an den eine Essigsäure- und eine Pentenylseitenkette angefügt ist. Diese Seitenketten finden sich entweder in der cis-(3R/7S) oder der trans-Form (3R/7R). Weiterhin sind eine Vielzahl an strukturell verwandten Verbindungen beschrieben worden, die in Pflanzen weit verbreitet sind (Hamberg, M. und Gardner, H. W. (1992) Biochem. Biophys. Acta 1165, 1-18). Die erste von JA aufgefundene physiologische Funktion war 1971 das Hemmen des Pflanzenwachstums (Aldridge, D. C, et al. (1971) J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1623 1627). Von da an wurden Jasmonate als die Signale einer veränderten Genexpression in verschiedenen Pflanzen als Antwort auf biotischen und abiotischen Streß wie auch als Signal bestimmter Entwicklungsvorgänge während der Pflanzenentwicklung angesehen (Creelman, R. A. und Mullet, J. E. (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 355 - 381 ; Wasternack, C. und Parthier, B. (1997) Trends in Plant Science 2, 302 - 307). 1990 wurde von Farmer und Ryan (Farmer, E. E. und Ryan, C. A. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 7713 - 7716) gefunden, dass JA ein wesentliches Zwischenprodukt bei der wundinduzierten Signalkaskade als Folge des Angriffs von Pflanzenfressern auf Tomatenblätter ist. Für zahlreiche Abwehrmechanismen bei Pflanzen gegenüber einer Pathogeninfektion oder abiotischem Streß wurde Jasmonat als Auslöser identifiziert. Neben der Expression von Abwehrgenen, wie Proteinaseinhibitoren, sind die Synthesen von Phytoalexinen, Alkaloiden und Duftstoffen die bedeutendsten Antworten auf JA, die in den meisten Fällen durch das Hochregulieren von spezifischen Enzymen erfolgt (Ellard-Ivey, M. und Douglas C. J. (1996) Plant Physiol. 112, 183 - 192; Feussner, I. et al. (1995) Plant J. 7, 949 - 957). Die Antworten auf Jasmonat wurden charakteri-
siert mittels einer veränderten Expression spezifischer Gene, mittels Jasmonat- unempfindlichen und Jasmonat-Defektmutanten, mittels transgener Pflanzen mit Jasmonatmangel oder mittels der Erhöhung von endogenen Jasmonaten sowie mittels Hemmstudien. Erst kürzlich wurde der JA-Vorläufer 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) als ein bevorzugtes Signal einer JA-Antwort angesehen. Unter den Entwicklungsvorgängen sind die Pollenreifung und das Keimlingswachstum JA- abhängig.
Die Biosynthese von JA erfolgt über den Oxylipin-Biosyntheseweg, der mit dem durch eine Lipoxygenase katalysierten Einbau von molekularem Sauerstoff in die Position 13 von Linolensäure beginnt. Anschließend wird das entstehende Fettsäurehydroperoxid (13(S)-Hydroperoxy-9(Z),11(E),15(Z)-Oktadekatriensäure,13-HPOT) durch die Allenoxidsynthase (AOS) zu einem Alienoxid dehydriert (Hamberg, M. und Gardner, H. W. (1992) Biochem. Biophys. Acta 1165, 1-18). Dieses Allenoxid wird dann cyclisiert durch die Allenoxidcyclase (AOC) zu 9(S), 13(S)-OPDA. Nach Reduktion der Doppelbindung im Ring, katalysiert durch eine Reduktase und drei folgende Runden der ß-Oxydation, entsteht (+)-7-/'so-JA, z. B. 3(R), 7(S)-JA. Die Autoren Vick und Zimmermann haben schon 1983 einen ähnlichen Biosyntheseweg vorgeschlagen, jedoch wurde angenommen, dass die Bildung von OPDA von 13- HPOT aus von einem einzelnen Enzym, einer sog. Hydroperoxidcyclase katalysiert wird (Vick, B. A. und Zimmermann, D. C. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 111 , 470 - 477). 1988 zeigte Hamberg, dass dieser Schritt von 2 Enzymaktivitäten vollzogen wird. Eines dieser Enzyme, das eine Membran-gebundene Aktivität zeigt und später als AOS charakterisiert wurde, katalysiert die Bildung eines instabilen Allenoxids, das schnell mit einer Halbwertzeit von 25 See. durch chemische Hydrolyse zu - und γ-Ketol und razemische OPDA abgebaut wird (Figur 1). Dabei macht OPDA nur 10 - 15 % der Gesamtmenge der Degradationsprodukte aus und ist ein racemisches Gemisch, bestehend aus den c/s-lsomeren 9(S),13(S) und 9(R),13(R).
Zusätzlich können die durch Lipoxygenasen gebildeten Produkte umgewandelt werden durch eine Divinylethersynthase, eine Reduktase, ein Peroxygenase und eine
Hydroperoxidlyase (Blee, E. (1998) Prag. Lipid Res. 37, 33 - 72). Wegen dieser Reaktionsmöglichkeiten und der unspezifischen Ketolbindung durch die AOS kann die AOC als das erste Enzym angesehen werden, das die Jasmonatsynthese hochspezifisch macht.
Bisher wurden einige Formen von Lipoxygenasen, Allenoxidsythasen und OPDA- Reduktasen aus Pflanzen kloniert, biochemisch charakterisiert und ihre physiologische Bedeutung untersucht (Rosahl, S. (1996) Z. Naturforsch. 51 c, 123 - 138; Song et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 8519 - 8523; Laudert, D. und Weiler, E. W. (1998) Plant J. 15, 675 - 684).
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, Nukleinsäuren und Fragmente davon bereitzustellen, mit denen ein Verfahren zur hochspezifischen Produktion des obengenannten Stereoisomers c/'s-(+)-OPDA aus dem JA- Biosyntheseweg ermöglicht wird.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure gelöst, die für ein Protein mit der Aktivität der Allenoxidcyclase kodiert und eine Sequenz umfaßt, die aus folgenden Sequenzen ausgewählt wird:
a) Nukleinsäure, die erhältlich ist durch Screenen einer pflanzlichen Genbank mit einer Sonde und Selektion auf Allenoxidcyclase-positive Klone;
b) Nukleinsäure, die für ein Protein mit der Sequenz ausgewählt aus den SEQ-ID Nrn. 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16 kodiert;
c) Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach b) hybridisiert;
d) Nukleinsäure, die unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes mit einer Nukleinsäure nach b) hybridisieren würde;
e) Durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen erhaltener Derivate einer Nukleinsäure nach a) bis d);
f) Nukleinsäure mit mindestens 53 %, vorzugsweise mindestens 70 % Identität zum kodierenden Bereich der Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 1 ;
g) Komplementäre Nukleinsäure zu einer Nukleinsäure nach einer der Gruppen a) bis f).
Unter Nutzung der vorliegenden AOC-Klone besteht nun erstmals die Möglichkeit, intensive physiologische Studien hinsichtlich des JA-Biosyntheseweges durchzuführen, aber auch erstmals JA und seine Derivate auf biotechnologischem Wege herzustellen. Der bisher hierbei limitierende Schritt in der spezifischen Jasmonat- synthese war die fehlende spezifische Herstellbarkeit des Stereoisomers (9S)(13S)(c/s(+)) der 12-oxo-Phytodiensäure.
" Allenoxidcyclase" bedeutet ein Enzym, das die cs(+)-OPDA-Synthese aus dem Substrat 12,13-EOT, wie in Fig. 1 gezeigt, katalysiert.
"Sonde" bedeutet eine Nukleinsäure, die zum Absuchen von Genbanken geeignet ist. Unter dem Begriff werden jedoch auch Mittel, vorzugsweise Proteine, verstanden, die die Anwesenheit des Expressionsprodukts Allenoxidcyclase anzeigen können. Hierzu zählen unter anderem Anti-Allenoxidcyclase-Antikörper.
Das Ermitteln der Bedingungen zum spezifischen "Hybridisieren" zwischen vorgegebenen Nukleinsäuren liegt im Bereich des fachmännischen Könnens. Bevorzugt ist eine Hybridisierung mit einer der Sequenzen, die für ein Protein mit der Sequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nrn. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, vorzugsweise der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 unter folgenden Bedingungen: Bevorzugt ist eine Hybridisierung mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 bei 2xSSC, 0,1 % SDS bei 50°C, vorzugsweise für mindestens 30 min. Eine etwas stringentere, ebenfalls bevorzugte
Hybridisierung erfolgt bei 1xSSC, 0,1% SDS bei 50°C. Besonders bevorzugt ist eine Hybridisierung, bei der die Express Hyb™ Hybridisierungslösung von Clontech (USA) eingesetzt wird, wobei für 18 h bei 60°C hybridisiert wird und anschließend bei 30 min. mit 2xSSC, 0,1 % SDS bei 50°C gefolgt von 30 min. 1xSSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen wird.
Erfindungsgemäß bezieht sich der Ausdruck "% identisch" auf Identität auf Nuklein- säure-Ebene, die gemäß bekannter Verfahren, z.B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) bestimmt werden kann.
Der dem Fachmann vertraute Ausdruck "% Identität" bezeichnet den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehreren Nukleinsäuremolekülen, der durch die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen bestimmt wird. Der Prozentsatz der "Identität" ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken und anderen Sequenzbesonderheiten.
Die Identität miteinander verwandter Nukleinsäuremoleküle kann mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt werden. In der Regel werden spezielle Computerprogramme mit den besonderen Anforderungen Rechnung tragenden Algorithmen eingesetzt. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung der Identität zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, das GCG-Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(12):387 (1984); Genetics Computer Group Univer- sity of Wisconsin, Madison, (Wl)); BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al., J. Molec Biol 215:403/410 (1990)). Das BLAST X Programm kann vom National Centre for Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894;
Altschul, S., et al., J. Mol. 215:403/410 (1990)). Auch der bekannte Smith Water- man-Algorithmus kann zur Bestimmung von Identität verwendet werden.
Bevorzugte Parameter für den Nukleinsäuresequenz-Vergleich umfassen die nachstehenden:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48:443-453 (1970)
Vergleichsmatrix: Übereinstimmung (matches) = + 10,
Nichtübereinstimmung (mismatch) = 0 Lücken-Wert (Gap Penalty): 50 Lückenlängen-Wert: (Gap Length Penalty): 3
Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default Parameters) für Nukleinsäuresequenz-Vergleiche.
Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die erfindungsgemäße Nukleinsäure ein Protein mit der Sequenz wie in einer der Sequenzen mit der SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, vorzugsweise in SEQ ID Nr. 2 angegeben. Von der spezifischen Sequenz lassen sich nach herkömmlichen Verfahren durch Änderungen in der Nukleinsäuresequenz (wie durch Substitution, Addition, Inversion oder Deletion ei-
ner oder mehrerer Basen) Proteinvarianten herstellen. Ob eine neue Proteinvariante noch die gewünschte Allenoxidcyclaseaktivität aufweist, läßt sich leicht anhand entsprechender Enzymtests nachweisen, wie sie unten näher ausgeführt werden.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nukleinsäure um eine cDNA, jedoch ist auch die genomische DNA als Allenoxidcyclase kodierenden Nukleinsäure geeignet.
Die folgende Tabelle zeigt eine Auflistung von Klonen, die mit der erfindungsgemäßen DNA gemäß SEQ ID Nr. 1 des erfingungsgemäßen Verfahrens isoliert worden sind.
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Die erfindungsgemäßen Fragmente der beanspruchten Nukleinsäuren zeichnen sich dadurch aus, dass sie spezifisch mit der obengenannten Nukleinsäure hybridisieren können. "Spezifische Hybridisierung" bedeutet dabei, dass der Fachmann die Hybridisierungsbedingungen so wählen kann, dass das Fragment nach Hybridisierung lediglich ein Signal mit der obengenannten Nukleinsäure ergibt und mit anderen ebenfalls in der Probe vorliegenden Nukleinsäuren kein Signal ergibt. Solche Fragmente lassen sich auch zu einer spezifischen Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mittels PCR einsetzen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann mit Hilfe des Fragments die Expression der Allenoxidcyclase in einer Wirtszelle gehemmt werden, wobei dies beispielsweise durch das Fragment in Antisinnorientierung zu einem Promotor ermöglicht wird. Eine Hemmung der Expression der Allenoxidcyclase durch ein Fragment in Sinnorientierung ist jedoch auch möglich. Das "Konstrukt" enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure ist eine Kombination aus der obenerwähnten erfindungsgemäßen Nukleinsäure und einer weiteren Nukleinsäure, mit der die erfindungsgemäße Nukleinsäure natürlicherweise nicht verknüpft ist. Somit kann das Konstrukt AOC-kodierende Sequenzen zusammen mit z.B. regulatorischen Sequenzen, Vektorsequenzen oder Sequenzen von Fusionspartnern umfassen. Bei besonders bevorzugten Konstrukten liegt die erfindungsgemäße Sequenz in einem Plasmid vor.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäure zeichnen sich dadurch aus, dass sie die Nukleinsäure in einer Menge/Kopienzahl enthalten, die in dem Wirtstyp so nicht vorkommt. Alternativ kann es sich bei den Wirtszellen auch um Zellen handeln, deren Wildtyp die erfindungsgemäße Nukleinsäure nicht enthält sondern diese es nach Einbringen der Nukleinsäure aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können mit üblichen Transformationstechniken in beliebige Zellen, einschließlich Bakterien, wie auch Pflanzenzellen, tierische Zellen, einschließlich Insektenzellen, sowie humane Zellen eingebracht werden.
Besonders bevorzugt ist das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in pflanzliche Zellen oder z.B. Pflanzengewebe oder Pflanzenorgane.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Wirtszelle oder der Zellverband die Nukleinsäure integriert in das Genom. In der Regel wird der Integrationsort nicht der Ort sein, in dem der Wildtyp das Allenoxidcyclasegen, sofern vorhanden, enthält.
Das Einbringen der erfindungsgemäßen Sequenzen unter der Kontrolle geeigneter Elemente, die die Expression der Nukleinsäure kontrollieren, welche dem Fachmann geläufig sind, läßt sich AOC in großer Menge und großer Reinheit darstellen. Die Techniken zur Expression und Isolierung von Protein aus den Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Protein ein Fusionsprotein umfassend die Allenoxidcyclase oder ein Fragment davon sowie eine Nichtalleno- xidcyclaseproteinsequenz. Bevorzugte Fusionspartner sind Sequenzen aus der Al- lenoxidsynthase und Reduktase, wie sie im Jamonatbiosyntheseweg vorkommen. Besonders bevorzugt ist die vollständige Allenoxidcyclase in Verbindung mit der vollständigen Allenoxidsynthase bzw. der OPDA-Reduktase. Die Herstellung von Antikörpern, die gegen das erfindungsgemäße Protein gerichtet sind, ist dem Fachmann geläufig. Hierzu kommen beispielsweise die Gewinnung von Antiseren und das Erzeugen polyklonaler Antikörper nach Immunisierung eines Wirtsorganismus mit dem erfindungsgemäßen Protein in Betracht. Alternativ läßt sich jedoch auch die Hybridomtechnologie zum Herstellen monoklonaler Antikörper benutzen.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren lassen sich jetzt erstmalig neue transgene Pflanzen und Pflanzenteile herstellen, indem die erfindungsgemäße Nukleinsäure in eine Ausgangspflanzenzelle eingebracht wird und das komplexere Pflanzengewebe bis hin zur ganzen Pflanze aus der anfänglich transformierten Pflanzenzelle regeneriert wird. Die hierfür erforderlichen Techniken stehen dem Fachmann zur Verfügung.
Mittels der erfindungsgemäßen Nukleinsäure läßt sich ebenfalls die Allenoxidcyclaseaktivität in einer Pflanze bzw. deren Teile beeinflussen. Durch Einbringen der Nukleinsäure beispielsweise unter einem starken Promotor läßt sich die Allenoxidcyclaseaktivität in der Pflanze bzw. in den Pflanzenzellen erhöhen. Dieser Effekt kann auch durch Erhöhen der Kopienzahl der Allenoxidcyclase kodierenden Sequenzen erzielt werden. Andererseits läßt sich durch Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, beispielsweise in Antisinnorientierung zu einem Promotor die endogene Expression des Allenoxidcylasegens erniedrigen oder gar vollständig blockieren. Dies führt dann zu einer Erniedrigung der Allenoxidcyclaseaktivität in dem entsprechenden Pflanzenteil.
Schließlich ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren erstmals eine hochselektive Herstellung des Metaboliten 9,13-cis-(+)-12-Oxophytodiensäure in großer Menge. Dieser Metabolit ist die wesentliche und entscheidende Ausgangsstufe für das Herstellen der Jasmonsäure in seiner natürlich vorkommenden enantiomeren Form in großen Mengen. Der genannte Metabolit war vormals praktisch nicht zugänglich, da es keine Möglichkeit gab aus dem Vorläufermolekül, 12,13-EOT, die cis-(+)- OPDA selektiv herzustellen. Es waren lediglich Gemische verschiedener Metaboliten zugänglich. Diese Metaboliten-Gemische wiederum verhinderten die Synthese von Jasmonat in großen Mengen und hoher Reinheit.
Mit der zur Verfügungstellung des AOC kodierenden Gens stehen jetzt dem Fachmann alle Mittel zur Verfügung um beispielsweise ausgehend von α-Linolensäure, Jasmonsäure in großen Mengen und großer Reinheit herzustellen. Dabei ist der
vollständige Biosyntheseweg jetzt mittels rekombinanter DNA-Techniken vollständig in einem Wirtsorganismus etablierbar. Ein entscheidender Schritt, der die biotechnologische Herstellung von Jasmonsäure in großen Mengen jetzt ermöglicht, war das Bereitstellen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure. Sie hat es erstmalig ermöglicht, die c7s-(+)-OPDA in großer Reinheit und großen Mengen als Ausgangsmaterial für die weitere Jasmonsäurebiosynthese zur Verfügung zu stellen.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure ermöglicht ferner die Herstellung neuer trans- gener Nutzpflanzen mit veränderten Eigenschaften. Zu den neuen Eigenschaften zählen die Erhöhung der pathogenen Abwehr bzw. pathogenen Resistenz von Pflanzen. Durch die erhöhte Expression der AOC nach Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das Pflanzmaterial kommt es zur Erhöhung von Metabo- liten, welche an der Pathogenabwehr beteiligt sind. Auf dem gleichen Weg läßt sich auch eine erhöhte Abwehrbereitschaft gegen Herbivore herbeiführen. Dieser Effekt beruht auf einer verstärkten Induktion der Wundantwort nach Einbringen und Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das Pflanzenmaterial. Ferner erlauben die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren das Optimieren der Pflanzen- Nutzinsekt-Schädling-Interaktion. Dies beruht darauf, das die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in der Pflanze zu einem veränderten Duftemissionsspektrum der Pflanze führt. Dabei werden insbesondere auch solche Insekten angelockt, die zur Beseitigung von pflanzenschädlichen Insekten beitragen (tritrophe Interaktion). Ferner läßt sich durch Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in Pflanzenmaterial die Biomassebildung durch die veränderten Pflanzen erhöhen. Dies geht auf eine Optimierung der Mykorrhizierungsfähigkeit von Wurzeln als Antwort auf die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure zurück.
Ferner läßt sich der Kohlenhydrathaushalt der Pflanzen mittels der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verändern. Dies geht darauf zurück, dass Enzyme, die an der Assimalatverteilung beteiligt sind (z.B. Invertasen) durch Jasmonat reguliert werden. Ein veränderter Jasmonatspiegel verändert somit die Aktivität der genannten Enzy-
me. Auf diese Weise läßt sich eine Assimilatverschiebung erreichen, wobei eine erhöhte Akkumulation in Speicherorganen sowie bei der Samenreifung möglich ist.
Schließlich läßt sich der Stickstoffhaushalt mittels der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verändern, insbesondere wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure in den vegetativen Speicherorganen exprimiert wird. Vegetative Speicherproteine, wie sie etwa bei der Sojabohne vorkommen, stellen eine Form der N- und Proteinspeiche- rung dar. Die Expression dieser Proteine ist Wund- und Jasmonat-induzierbar. Demzufolge hat eine erhöhte AOC-Expression mit erhöhter Jasmonatbildung einen Anstieg des Proteingehalts in vegetativen Speicherorganen zur Folge.
Ferner läßt sich der UV-Schutz von Pflanzen mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäure optimieren. Auch die Anthocyan-Bildung ist Jasmonat-induzierbar. Eine gezielte Erhöhung des endogenen Jasmonatspiegels, etwa in epidermalen Zellen in Folge der erhöhten AOC-Expression, kann zur Erhöhung der Anthocyan- Menge in diesen Zellen führen. Anthocyane wiederum sind als UV-Schutzmittel bekannt. Somit sind Pflanzen mit einem erhöhten Anthocyangehalt in epidermalem Gewebe weniger empfindlich gegenüber UV-Streß.
Ferner ist die Erzeugung männlicher Sterilität durch Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in pollenbildendes Gewebe der Blüte möglich. Dabei wird die Nukleinsäure vorzugsweise in Antisinnorientierung unter einem regulatorischen E- lement verwendet, wodurch die interne Expression der AOC erniedrigt wird. Die gewebespezifische Expression der eingebrachten Nukleinsäure läßt sich ferner mittels gewebespezifischer Promotoren erreichen.
Schließlich lassen sich auch Entwicklungsprozesse der Pflanzen, insbesondere die Blütenentwicklung, mittels der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verändern. Bei der Blütenentwicklung spielt α-Linolensäure eine wichtige Rolle. α-Linolensäure ist der Vorläufer von Jasmonsäure im Tapetum, dem Pollen-bildenden Gewebe der Blüte, und stellt dort die einzige ungesättigte Fettsäure dar. Mutanten mit Störungen der α-
Linolensäurebildung sind Jasmonat-defizient. Diese Mutanten sind ferner männlich steril ebenso wie die Jasmonat-insensitiven Mutanten. Daraus folgt, dass sich durch Hemmen der Jasmonatbildung mittels der Erniedrigung der AOC-Expression männlich sterile Linien herstellen lassen. Da Blüten, wie beispielsweise Tomatenblüten, eine hohe Expression spezifischer Invertasen wie auch hohe Jasmonatgehalte aufweisen, läßt sich über einen geänderten Jasmonatgehalt die Eigenschaften der Blüten beeinflussen.
Fig. 1 zeigt ein Schema der Jasmonat-Biosynthese
Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz des Allenoxidcyclase-cDNA-Klons aus Tomate und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. Dick gedruckte Pfeile geben die Sequenzen an, die für die RT-PCR verwendet wurden. Unterbrochene Pfeile geben die Sequenzen an, die zur Amplifizierung eines Fragmentes verwendet wurden, das für eine trunkierte Version der Allenoxidcyclase kodiert, verwendet in einem Überexpressionsassay. Doppelt unterstrichen sind putative Restriktionsschnittstellen für chloroplastidäre Signal- peptide die unter Verwendung des Computerprogrammes ChloroP V1.1 vorhergesagt werden konnten.
Fig. 3 zeigt die Überexpression eines trunkierten Tomaten-AOC-Proteins in Bakterien, dessen Translation am Aminosäurerest in Position 64 beginnt. Die dazu korrespondierende partielle cDNA wurde in den Vektor pJC20 subklo- niert und für die Reinigung des Proteins in einen mit einem Histidinschwanz versehenden Vektor pJC40 kloniert. Zur Transfektion wurde der £. coli- Stamm BL21 DE3(pLysS) verwendet. Es wurden sowohl Extrakte von Bakterien, die mit dem Vektor pJC40 allein als auch Extrakte von Bakterien, die mit der partiellen AOC-cDNA (in Vektor pJC40) transformiert worden waren, entweder in Abwesenheit (-) oder in Anwesenheit von IPTG (+) angezogen und anschließend über SDS-PAGE gelelektrophorethisch getrennt. Das Gel wurde mit Coomassie Blue (A) gefärbt bzw. ein korrespondierender Blot mit
einem anti-AOC-Antikörper geprobt (B). Auf das AOC-Protein weist ein Pfeil hin.
Fig. 4 zeigt die Lokalisierung des AOC-Proteins in Tomatenblättern nach immu- nocytochemischer Identifizierung. Blattquerschnitte, die für 24 Stunden in 50 μmol JAME inkubiert worden waren wurden entweder mit Prä-Immunserum (A) oder mit anti-AOC-Antikörper, der gegen das gereinigte rekombi- nante AOC-Protein aus Tomate gerichtet ist (B), behandelt, gefolgt von einer zweiten Behandlung mit einem zweiten Antikörper, welcher BODIPY- markiert war. Im Gegensatz zu der gelbbraunen Autofluoreszenz nach Behandlung mit dem Prä-Immunserum zeigte eine deutliche Fluoreszenzmarkierung in den Chloroplasten in B die Präsenz des AOC-Proteins. Stärkekörner in den Chloroplasten, die in B als nicht-fluoreszierende Bereiche zu sehen waren, wurden sichtbar gemacht über differenziellen Interferenzkontrast®. Der Maßstab ist in μm angegeben.
Fig. 5 zeigt die Southern Blot-Analyse von genomischer DNA aus Tomate (A) und die RFLP-Analyse des AOC-Locus (B). Die Spaltung mit den unterschiedlichen Restriktionsenzymen zeigte, dass das AOC-Gen als Einzelkopie vorliegt.
Fig. 6 zeigt die Northern Blot-Analyse der Akkumulierung von AOC-mRNA in verwundeten Tomatenblättern. Pro Spur wurden 10 μg Gesamt-RNA geladen. Sie entstammte aus nichtverwundeten (Wasser) bzw. verwundeten Blättern, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Versuchsbeginn geerntet wurden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Genomische Analyse der AOC-Gene
Für die Southern Blot-Analyse wurde genomische DNA aus Tomate mit den Restriktionsenzymen ßamHI, BglW, Pst\, Hind\\\, EcoRI, EcoRV und EcoRII (Fig. 5A) verdaut. Nach Spaltung mit den ersten beiden Enzymen konnten drei Banden detek- tiert werden. Da diese Enzyme in dem Insert zwei Schnittstellen aufwiesen, kann angenommen werden, dass die AOC im Tomatengenom als sogenanntes "Single Copy"-Gen vorliegt. Diese Annahme ist weiterhin unterstützt durch das Bandenmuster, das durch Restriktion mit den anderen Enzymen erhalten wurde. Bei Spaltung mit Pst\ und Hind W wurden zwei Banden detektiert, wobei diese Enzyme jeweils einmal im cDNA-lnsert Schnittstellen aufwiesen, während nur eine Bande bei den drei letzten Enzymen detektiert werden konnte, die im cDNA-lnsert keine Restriktionsschnittstellen aufwiesen. Die Ergebnisse der Spaltungen sind in Fig. 5A aufgeführt. Sie entsprechen den Kartierungsdaten, nach denen für AOC ein Genort auf Chromosom 2 bestimmt wurde (Fig. 5B).
Physiologie der AOC-Expression
Es konnte vielfach nachgewiesen werden, dass die Akkumulierung von JA einen wichtigen Teil der Signaltransduktionskette in der Wundantwort ausmacht. In der Tomate wird die chloroplastidäre Lipoxygenase hochreguliert, wenn die Pflanze verwundet wird, während /Araό/cfops/s-Pflanzen, die durch Cosuppression mit einer spezifischen chloroplastidären Lipoxygenase inhibiert sind, nach Verwundung keinen Anstieg an JA-Konzentrationen als Wundantwort verzeichneten. Außerdem, unterstreicht die strikte räumliche und zeitliche Regulierung des zweiten Enzymes des Biosyntheseweges, der AOS, die Bedeutung der Aktivierung entsprechender Enzyme der JA-Biosynthese in der Akkumulierung von JA während der Wundantwort in Arabidopsis. Da die AOC das Enzym ist, welches jenen Schritt in der Biosynthese von JA katalysiert, bei dem die „richtige", natürlich vorkommende stereoi-
somere Form gebildet wird, war es interessant zu wissen, ob die Expression der AOC zu einem Anstieg der JA-Konzentrationen nach Verwundung beitrug. Wie in Fig. 6 gezeigt, steigt in Tomatenblättern der Spiegel an AOC mRNA 30 min nach Verwundung der Tomatenblätter. Die maximale Induktion konnte nach zwei Stunden beobachtet werden, und nach 8 Stunden war die Kontrollmenge erneut erreicht. Dieses Ergebnis korreliert gut mit den JA-Mengen, die nach Verwundung gemessen wurden und die ebenso eine transiente Akkumulierung mit einem Anstieg nach 1 Stunde aufwiesen. Dieses Ergebnis beweist eine wichtige physiologische Funktion der AOC in der Regulierung der JA-Konzentrationen während der Wundantwort in Tomatenpflanzen.
Eine weitere höchst wichtige Funktion der AOC scheint in dem Einfluß auf die Entwicklung von Blütenorganen zu liegen. Eine hohe Expression konnte in Stempelgewebe, reifen Blütenpetalen, roten Früchten und, in geringerer Menge, in Staubgefäßen nachgewiesen werden. Hingegen wurde in jungen sich entwickelnden Blütenknospen keine Expression detektiert. Mutanten, die in der JA-Signaltrans- duktionskette defekt sind, wie z.B. Arabidopsis coil oder die fadZ-2 fad7-2 fadQ Mutanten, sind männlich steril. Dies zeigt die Bedeutung von JA in der Blütenentwicklung. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass AOS-Gene (die Synthasegene) stark in Blütenorganen von Arabidopsis thaliana exprimiert werden, was nahelegt, dass JA möglicherweise in Blüten synthetisiert wird. Es konnte auch die gewebespezifische Expression des AOC-Gens in Leitbündeln, und, um so erstaunlicher, in Samenanlagen junger Tomatenblüten durch immunocytochemische Analyse gezeigt werden. Die Rolle der AOC und JA in der Blütenentwicklung beruht im wesentlichen auf der strikten Korrelation der AOC-Expression und dem Anstieg der JA-Mengen. Durch die Ergebnisse von Vick und Zimmermann sowie von Hamberg (Vick, B. A. & Zimmermann, D. C. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 111 , 470-477; Hamberg, M. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 543-550) wurden die weiteren an der JA-Biosynthese beteiligten Enzyme identifiziert. In den letzten zehn Jahren haben die Charakterisierung und die Klonierung dieser Enzyme gute Fortschritte gemacht, und es stehen jetzt Klone von LOX (Rosahl, S. (1996) Z. Naturforsch. 51c,
123-138), AOS (Song, W. C. & Brash, A. R. (1991) Science 253, 781-784; Laudert, D., Pfannschmidt, U., Lottspeich, F., Holländer-Czytko, H. & Weiler, EW. (1996) Plant Mol. Biol. 31 , 323-335) und OPDA-Reduktasen (Schaller, F. & Weiler, E. W. (1997) J. Biol. Chem. 272: 28066-28072; Biesgen, C. & Weiler, E. W. (1999) Planta 208: 155-163) zur Verfügung. Mit der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Isolierung eines cDNA-Klons, der für die AOC kodiert, sind nun alle Enzyme, die zu dem ersten physiologisch aktiven Cyclopentenon, OPDA, führen, kloniert. Zusätzlich erscheint dieses Enzym von besonderer Bedeutung, weil es maßgeblich die Stereochemie der Cyclopentanone bestimmt und eine entscheidende Rolle in der Steuerung eines der möglichen Oxylipin-Biosynthesewege, die zur Biosynthese von Jas- monaten führen, spielt. Unter Nutzung dieses AOC-Klones sowie der anderen Enzyme sind nun intensive physiologische Studien möglich, wie auch biotechnologische Anwendungen hinsichtlich des Jasmonat-Biosyntheseweges.
Pflanzenmaterial
Um Gene zu identifizieren, die für die AOC kodieren, wurde unterschiedliches Material herangezogen. Pflanzenmaterial von Gerste (Hordeum vulgäre L.cv. Salome) und Tomate (Lycopersicon esculentum Mil. cv. Moneymaker) wurde in Erde unter Gewächshausbedingungen mit 16 Stunden Licht (mit einer minimalen Intensität von 130 μmol • m"2 • s"1) bei 25°C angezogen. Primärblätter der Gerstepflanzen wurden 7 Tage nach Keimung geerntet, in 5 cm lange Segmente geschnitten, gemessen von 1 cm unterhalb der Blattspitze. Diese Blattstücke wurden in Petrischalen in einer 1 molaren Sorbitlösung inkubiert. Tomatenpflanzen wurden für 8 Wochen angezogen, das Sekundärblatt abgeschnitten, mit einem fabriküblichen Zahnrädchen verwundet und anschließend in destilliertem Wasser unter kontinuierlichem weißen Licht (bei einer Intensität von 120 μm • m"2 • s"1)) inkubiert.
Analyse endogener JA- und OPDA-Mengen
Um die Konzentration von nichtveresterter 12-oxo-PDA und Linolensäure sowie die sterische Analyse von 12-oxo-PDA quantitativ zu bestimmen, wurden nichtverwundete Blätter von Tomatenpflanzen (15 bis 20 g) bzw. Blätter (3-5g), die zuvor verwundet wurden, als Ausgangsmaterial verwendet. Das Gewebe wurde schockgefroren in flüssigem Stickstoff und anschließend mit Ethanol extrahiert. Es wurde Deuterium-markierte 12-oxo-PDA ([2H5]-12-oxo-PDA) und Deuterium-markierte Linolensäure ([2H5]-Linolensäure) zu kleinen Portionen des Extrakts zugegeben. Anschließend wurden die Mengen der 12-oxo-PDA und Linolensäure über massen- spektrometrische Methoden bestimmt. Verbleibende Portionen des Extrakts, die nicht mit den markierten Substanzen versetzt wurden, wurden einer Festphasenextraktion unterzogen und über RP-HPLC aufgetrennt. Die so isolierte 12-oxo-PDA wurde einer sterischen Analyse, unterzogen. Die JA-Mengen wurde bestimmt gemäß der Methode wie bei Kramell et al. FEBS Lett. 414, S. 197, (1997) beschrieben.
ENZYMASSAY
Die AOS-Aktivität wurde in 50 mM Kaliumphosphat mit pH 6,7 in einem Gesamtvolumen von 1 ml gemessen. Die Reaktion wurde durch den Zusatz des Fettsäurehydroperoxids gestartet, und die Abnahme der Absorption bei 235 nm wurde gemessen. Für die Bestimmung der kinetischen Parameter der AOS aus Mais wurde die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit bei 14 Konzentrationen in dem Bereich von 5 bis 90 μm für jedes Substrat bestimmt. Die Km und v aχ-Werte wurden mit Hilfe der Michaelis-Menten Gleichung direkt berechnet und gemäß dem Diagramm von Eadie-Hofstee aufgetragen.
ANALYSE DER ZYKLISIERUNGSPRODUKTE DER ALLENOXIDE
Fettsäurehydroperoxide (150 μm) wurden bei 0°C für 10 min. mit 0,5 ml einer Suspension aus Maissamenmembranen (0,5 mg Protein; 28 nkat unter Verwendung von 13 (S)-HPOT als Substrat) in 0,1 m Kaliumphosphatpuffer pH 6,7 und 2,5 ml der AOC-Präparation in Ammoniumsulfat/20 mm tris-HCL-Puffer pH 7,5 (Gesam- tassay volumen: 5 ml) gerührt. Die Aktivitäten der AOC aus Mais bzw. Kartoffeln, die diesen Assay zugesetzt wurden, waren äquivalent zu 178 nmol PDA bzw. 156 nmol PDA, wie mittels der auf RP-Radio-HPLC basierenden Methode gemessen. Kontrollen, bei denen die AOC-Lösung durch Kaliumphosphatpuffer ersetzt wurde, wurden parallel durchgeführt. Die Inkubationen wurden durch den Zusatz von 10 ml Ethanol beendet und die Reaktionsprodukte wurden mit Diethylether extrahiert, methyliert und der TLC (mit dem Lösungsmittelsystem: Ethylacetat/Toluol 15:18 vol/vol.) unterzogen. Die Banden wurden unter UV-Licht sichtbar gemacht nach Besprühen mit 2-6-Dichlorflureszein, und der Rf-Wert der Zyklopentenonbande (der Methylester der 12-Oxo-PDA und seine Homologe und Analoge) wurde aufgezeichnet. Eine breite Zone des Silikatgels enthaltend Banden auf Grund des Methylesters von Zyklopentenon, Hydroxyfettsäure und α-Ketol wurde abgekratzt und mit Ethyl- acetat verdünnt. Ein Aliquot des Materials wurde trimethylsilyliert und einer Analyse mittels GLC und GC-MS unterzogen. Der verbleibende Teil des Materials wurde für sterische Analysen der Zyklopentenone verwendet, (vergl. Hamberg, M. und Fahlstadius, P. in Arch. Biochem. Biophys. 276, Seiten 518 bis 526 von 1990 und Hamberg, M. et al., in Lipids 23, Seiten 521 bis 524 von 1988).
UBEREXPRESSION DER ALLENOXIDCYCLASE
Sowohl die gesamte kodierende Region inklusive des Startcodons wie auch eine 5'-deletierte Version des Klons, startend mit Nukleotid 235 (Fig. 2), wurden via PCR amplifiziert, mit 5'Nde\- bzw. 3'£coRI-Restriktionsschnittstellen versehen und in die Expressionsvektoren pJC20 bzw. pJC40 (Clos und Brandau Protein. Expr. Purif. 5,
S. 133, 1994) kloniert. Die erhaltenen Plasmide wurden in den Bakterienstamm BL21DE3(pLysS) transformiert. Die Anzucht der Bakterien erfolgte in LB-Medium bis zu einem Wert von 0,5, gemessen bei einer OD von 600 nm. Die Bakteriensuspension wurde durch 1 mM IPTG für 4 Stunden induziert, dann zentrifugiert, zwei Gefrier- und Tauzyklen unterworfen und anschließend durch Ultraschall in 20 mM Tris-HCI pH 7,5, 0,5 M NaCI, 0,1% Tween 20 und 10% Glycerol lysiert. Nach einer weiteren Zentrifugation wurden die Überstände für eine Messung der AOC-Aktivität weiter verwendet. Die Enzymaktivität wurde einerseits gemessen über einen radioaktiven Assay gemäß der Methode, wie unten näher angegeben, sowie durch Bestimmung der enantiomeren Zusammensetzung von OPDA. Die Hybridisierungsbe- dingungen waren wie folgt: Es wurde unter Verwendung der Expression Hyb™ Hybridisierungslösung von Clontech (USA) bei 60°C für 18 h hybridisiert und anschließend 30 min. mit 2xSSC, 0,1% SDS bei 50°C gefolgt von 30 min. 1xSSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen. Das durch den Expressionsvektor pJC40 expri- mierte rekombinante Protein wurde über Affinitätschromatographie auf einer Ni- Nitrilotriessigsäure-Agarose (NiNTA, Qiagen) gereinigt. Die Reinheit des Proteins wurde über SDS-PAGE-Gelelektrophorese kontrolliert. Anschließend wurde das gereinigte rekombinante AOC-Enzym zur Herstellung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers verwendet.
NORTHERN UND SOUTHERN BLOT-ANALYSE
Die Northern Blot-Analyse erfolgte nach Maniatis et al. Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual, Cold Spring Harbour (1989) mit 10 μg Gesamt-RNA pro Spur. Die erhaltenen Blots wurden bei 65°C für 16 Stunden mit einer radioaktiv markierten Probe des Tomaten-AOC-cDNA-Klons, bestehend aus der Vollängen-cDNA- Sequenz (siehe Fig. 2), hybridisiert. Bevorzugt ist eine Hybridisierung mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 bei 2xSSC, 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise für mindestens 30 min. Eine etwas stringentere, ebenfalls bevorzugte Hybridisierung erfolgt bei 1xSSC, 0,1 % SDS bei 50°C. Besonders bevorzugt ist eine Hybridisierung, bei
der die Express Hyb™ Hybridisierungslösung von Clontech (USA) eingesetzt wird, wobei für 18 h bei 60°C hybridisiert wird und anschließend bei 30 min. mit 2xSSC, 0,1% SDS bei 50°C gefolgt von 30 min. IxSSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen wird. Eine gleichmäßige Gelbeladung der Proben wurde über die Ethidiumbromid- Färbung der ribosomalen RNA kontrolliert.
Für die Southern Blot-Analyse wurden 10μg genomische DNA mit den angezeigten Restriktionsenzymen verdaut und mittels Gelelektrophrese aufgetrennt. Nach Vakuumtransfer auf eine Nylonmembran erfolgte die Hybridisierung wie oben für den Northern-Blot beschrieben.
IMMUNOCYTOCHEMIE
Es wurden kleine Stücke junger Blätter nach Huse et al (1996) Plant Cell Physiol. 37 641 - 649 fixiert, in PEG eingebettet und geschnitten. Schnitte, die 2 μm dick waren, wurden mit einem Kaninchen-anti-AOC-Antikörper (in der Verdünnung 1:2000) behandelt. Es folgte eine weitere Inkubation mit einem Ziegen-anti-Kaninchen-lgG- Antikörper, konjugiert mit BODIPY (Molecular Probes, Eugene, OR). Nach der Immunmarkierung wurden die Schnitte in Citifluor/Glycerol inkubiert. Es wurden Kontrollexperimente mit dem prä-lmmunserum durchgeführt. Die Fluoreszenz des Immuno-markierten AOC-Enzyms wurde mit einem Zeiss "Axioskop" Epifluoreszenz- Mikroskop sichtbar gemacht unter Einsatz der entsprechenden Filterkombination.
KLONIERUNG DER AOC
Zur RNA-Isolierung wurden Gewebe eingesetzt, in denen die endogene JA-Konzen- tration aufgrund von Induktion akkumuliert. So wurden Sorbit-gestreßte Blätter aus Gerste (Lehmann et al., Planta 197 S. 156, 1995) sowie verwundete Tomatenblätter
(Pena-Cortes et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, S. 4106, 1995) als Ausgangsmaterial zur weiteren RNA-Isolierung eingesetzt. Während bei Gerste keine spezifischen PCR-Produkte erhalten werden konnten, wurde nach RT-PCR mit RNA von verwundeten Tomatenblättern eine schwache Bande von etwa 900 bp Fragmentgröße amplifiziert. Dieses PCR-Produkt wurde als Sonde für den Screen der Tomaten- cDNA-Bank eingesetzt, der zur Isolierung eines 1 kb großen cDNA-Klones führte. Diese Größe korrespondierte in etwa mit der Signalgröße, die in den Northern Blot- Analysen detektiert werden konnte. Hieraus konnte gefolgert werden, dass es sich bei der Isolierung um einen Vollängen-Klon handelte. Das erste Startcodon ist an Position 47 lokalisiert, und es geht ihm ein Stopcodon in Position 16 voraus. Die Protein-kodierende Region umfaßt 732 bp, die für ein Protein von 244 Aminosäuren mit einer kalkulierten Molekulargewichtsmasse von 26 kDa kodieren (Fig. 2). Die Abweichung von etwa 4 kDa des abgeleiteten Molekulargewichts von dem Protein aus Tomate wurde bestimmt durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese und könnte, zumindest teilweise, das Resultat von posttranslationalem Entfernen von Aminosäuren am N-Terminus des Tomatenproteins sein.
UBEREXPRESSION DER AOC
Um das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Protein, kodiert durch die beschriebene Nukleinsäure, als ein AOC-Protein zu identifizieren, wurden Überexpressionsversuche zur AOC-Aktivitätsmessung durchgeführt. Zunächst wurde die gesamte kodierende Region ohne das Startcodon für Methionin in den Expressionsvektor pJC20 kloniert und zur weiteren Aufreinigung in den mit einem Histidin- schwanz versehenen Vektor pJC40 eingebracht. Das fehlende Methionin wurde über eine 5'Λ/cfel-Restriktionsschnittstelle ergänzt. Nach Induktion mittels IPTG konnte lediglich eine schwache Expression des rekombinanten Proteins auf einem SDS-PAGE-Gel beobachtet werden. Jedoch konnte nach säulenchromatographi- scher Reinigung (NiNTA) des mit einem Histidinschwanz versehenen Proteins eine
Bande von etwa 26 kDa detektiert werden. Jedoch zeigten weder der Rohextrakt der Bakterien noch das aufgereinigte Protein AOC-Aktivität. Das Fehlen der enzymatischen Aktivität im Vollänge-Klon aus Tomate könnte ein Resultat aus der falschen posttranslationalen Modifizierung in den Bakterien sein. Um diese Möglichkeit näher zu untersuchen, wurde ein Fragment der Tomatensequenz amplifiziert, welches für ein trunkiertes Protein kodiert, das am Aminosäurerest 64 beginnt. Auch hier wurde das Startcodon über eine Λ/cfel-Restriktionsschnittstelle ergänzt. Nach entsprechender Induktion der Bakterien wurde eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese durchgeführt und ergab eine deutliche Bande bei 22 kDa, die nicht in den Kontrollbakterien, welche nur mit einem leeren Vektor transformiert worden waren, detektiert werden konnte (Fig. 3). Die gleiche Bande wurde ebenso in nichtinduzierten Bakterien festgestellt, was an einer nicht ausreichenden Repression des bakteriellen Expressionssystems in Abwesenheit von Induktionsmolekülen liegen könnte. Alle Bakerienextrakte wurden anschließend auf AOC-Aktivität hin untersucht. Wie in Tabelle 1 , siehe unten, gezeigt, konnte in den Kontrollbakterien keine Aktivität nachgewiesen werden, während in den induzierten transformierten Bakterien eine hohe spezifische Aktivität von etwa 15000 nMol OPDA/mg Protein detektiert werden konnte. Wie vom Proteinmuster des SDS-PAGE-Gels erwartet, zeigten auch die nichtinduzierten Bakterien AOC-Aktivität, jedoch war diese etwa 10fach geringer als bei den induzierten Bakterien zu messen war. Die AOC-Aktivität des rekombinanten Proteins war sensitiv gegen Proteinase-K- Verdau und konnte durch 12,13- Epoxyoctadecensäure, einem spezifischen AOC-lnhibitor, gehemmt werden, was weiterhin die Spezifität des rekombinanten Proteins unterstützt. Eine spezifische Eigenschaft der AOC-Reaktion ist die konkurrierende Reaktion zwischen der chemischen Aufspaltung des instabilen Allenoxidsubstrats, resultierend in einem racemi- schen Gemisch von OPDA, und der enzymatischen Umwandlung zu enantiomerer OPDA. Daher kann ein Protein letztendlich nur als AOC identifiziert werden, wenn das spezifische Enantiomer 9(S),13(S)-OPDA gebildet und nachgewiesen wurde.
Die sterische Analyse der Reaktionsprodukte ergab, dass das rekombinante Protein nahezu ausschließlich besagtes 9(S),13(S)-Enantiomer der OPDA gebildet hatte.
Die Durchführung eines Proteinase-K-Verdaus und die Zugabe von 12,13- Epoxyoctadecensäure verringerten die Konzentration dieses OPDA-Enantiomers hin zu einer Konzentration, die auch nach chemischer Aufspaltung des instabilen Allenoxids beobachtet werden konnte. Alles in allem zeigten die Ergebnisse der AOC-Aktivitätsmessungen, dass der isolierte Klon aus Tomate für eine AOC kodiert. Interessanterweise war die spezifische Aktivität des N-terminalen mit einem Histi- dinschwanz versehenden Proteins etwa 20fach geringer als die eines vergleichsweise untersuchten Proteins ohne Histidinschwanz. Zusammen mit der Beobachtung, dass nur das trunkierte Protein hohe Aktivität zeigte, scheint es wahrscheinlich, dass zusätzliche Aminosäuren im N-Terminus die Bildung des Proteindimers möglicherweise stören könnten.
Intrazelluläre Lokalisierung der AOC
Es wurde berichtet, dass die meisten Enzyme des Oxylipinbiosynthesewegs im Chloroplasten lokalisiert sind. Eine N-terminale Aminosäuresequenzanalyse der klonierten LOXs aus Gerste (Vörös et al., Eur. J. Biochem. 251 , S. 36, 1998), Arabidopsis (Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, S. 8675, 1995) und Tomate (Heitz et al., Plant Physiol 114, S. 1085, 1997) wie auch teilweise durchgeführte Importstudien in Chloroplasten zeigten sowohl das Vorhandensein als auch die Funktion von putativen chloroplastidären Signalpeptiden. Auch die AOS aus Flachs (Song et al., Proc. Natl. Acad. Sei 90, S 8519, 1993) und Arabidopsis (Laudert et al., Plant. Mol. Biol., 31, S. 323, 1996) wiesen mögliche chloroplastidäre Signalpeptide auf und konnten genau wie die AOS aus Gerste zusammen mit Chloroplasten aufgereinigt werden. Enzymaktivitäten von LOX, Hydroperoxidlyase und AOS konnten durch biochemische Daten in der äußeren Hüllmembran von Chloroplasten nachgewiesen werden (Blee und Joyard, Plant Physiol. 110, S. 445, 1996). Im Falle der AOS und LOX konnte deren chloroplastidäre Lokalisierung auch immunocytochemisch bestätigt werden. Die Untersuchung der N-terminalen Region der AOC aus Tomate erbrachte zudem weitere strukturelle Daten für ein chloroplastidäres Signalpeptid.
Dieses ist reich an Serinresten (26 % in den ersten 50 Aminosäuren), dem Startcodon für Methionin folgt ein Alaninrest, und die ersten zehn Aminosäuren besitzen keinen geladenen Aminosäurerest. Eine Computeranalyse der ersten 100 Aminosäuren unter Verwendung des Chlorop V1.1-Programmes erbrachte eine mögliche chloroplastidäre Lokalisierung des Proteins mit einer putativen Schnittstelle zwischen Position 93 und 94. Diese putative Schnittstelle ist aus verschiedenen Gründen allerdings höchst unwahrscheinlich. Andere abgeleitete mögliche Schnittstellen könnten Aminosäurereste in den Positionen 41, 53 und 60 darstellen. Um die Lokalisierung der AOC experimentell nachzuweisen, wurde ein immunocy- tologischer Versuch mit dem Antikörper gegen die rekombinante AOC durchgeführt. Querschnitte aus Tomatenblättern wurden hierzu mit diesem Antikörper inkubiert und zeigten eine signifikante Fluoreszenz in den Chloroplasten (Fig. 4). Die Autofluoreszenz der Chloroplasten wurde durch Gewebequerschnitte gezeigt, die ohne den ersten Antikörper behandelt wurden. Dies bestätigt die Daten der Sequenzanalyse, die andeuteten, dass die AOC ein chloroplastidäres Protein sei. Im Gegensatz zur AOS, die in der äußeren Hüllmembran von Chloroplasten lokalisiert ist, ist die AOC ein lösliches Protein. Da das Substrat höchst instabil ist, scheint es nahezuliegen, dass die AOC in Nähe zur AOS vorliegt, um eine effiziente Substratumwandlung zu 9(S),13(S)-OPDA zu gewährleisten. Zudem konnten bisher weder Ketole noch racemische OPDA in Pflanzen detektiert werden, was nahelegt, dass der chemische Abbau des Allenoxids nicht in vivo passiert. Um diesen Punkt näher zu untersuchen, wurden Mengen und Stereokonfiguration von endogener 12-oxo-PDA in Tomatenblättern bestimmt. In einem repräsentativen Experiment mit unverwundeten Blättern wurden Konzentrationen der nichtveresterten 12-oxo-PDA und Linolensäure von 2 ng/g bzw. 206 ng/g Frischgewicht gemessen. Die sterische Analyse erbrachte, dass die Mengen an OPDA nahezu komplett (>99 %) aus dem natürlich vorkommenden 9(S),13(S)-Enantiomer gebildet wurde. Die Mengen an OPDA und Linolensäure stiegen auf 187 ng/g (90fach) bzw. 1813 ng/g (9fach) innerhalb 30 bzw. 180 min. nach mechanischer Gewebeverwundung. Die sterische Analyse von wundinduzierter OPDA zeigte die ausschließliche Bildung (>99 %) zu dem 9(S),13(S)-Stereoisomer. Daraus könnte gefolgert werden, dass die AOS und AOC
entweder räumlich sehr benachbart im Chloroplasten lokalisiert sind oder sogar lose assoziiert im Chloroplasten vorliegen.
Bestimmen der Enzymaktivität der AOC
Der Reaktionsansatz bestand aus dem in 50 mM Tris-HCI (pH 7,5) resuspendierten 100.000 g Pellet des untersuchten Gewebehomogenats mit einer AOS-Aktivität von 7 nkat und der zu untersuchenden Probe. Das Volumen wurde auf 625 μl mit 50 mM Tris-HCI (pH 7,5) aufgefüllt und die Enzymreaktion durch Zugabe von 2,6 μl 10 mM [1-1 C]13(S)-HPOT gestartet (Endkonzentration 41 μM; 0,83 kBq [0,022 μCi]). Der Ansatz wurde 10 Min auf Eis inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 750 μl MeOH gestoppt, das Reaktionsgemisch mit 2 N HCI angesäuert und die Produkte mit 4 ml Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde eingedampft und der Rückstand in 110 μl Acetonitril/H2O/HOAc (55/45/0,02 Vol./Vol./Vol.) aufgenommen. Die HPLC-Trennung der Reaktionsprodukte erfolgte isokratisch (Aceto- nitril/H2O/HOAc 55/45/0,02 Vol./Vol./Vol.) an einer Eurospher 100 C18-Säule (5 μm, 200 x 4,6 mm; Knauer Berlin) bei einer Flußrate von 1 ml/min. Die Quantifizierung der Produkte erfolgte durch die Messung der Radioaktivität mittels einer mit Festszintillator gefüllten Durchflußzelle (Yttriumsilikat 0,4 ml, RSM 100 Radioactivity Monitor Analyer, Raytest Isotopenmeßgeräte GmbH, Strubenhardt). Die Menge an OPDA wurde zum einem mit der Peakfläche des α-Ketols und zum anderen mit der Summe aller auf dem Chromatogramm erscheinenden Peakflächen ins Verhältnis gesetzt und die AOC-Aktivität wie folgt berechnet:
(rM<~ ) -_ WLpDA / total X
PDA I a_Ketol
wobei "X" die Menge an Hydroperoxid (in mmol) ist, die in den Test eingesetzt wurde und "total" die Summe aller auf dem Chromatogramm erscheinenden Peaks darstellt. Als Ergebnis dieser Gleichung erhält man die Menge an OPDA, die enzyma- tisch entstand und damit den Wert für die AOC-Aktivität mit der Einheit [nmol OPDA].
Um die isomere und enantiomere Zusammensetzung der OPDA zu bestimmen, wurde der AOC-Enzymtest mit nichtradioaktiv markierter 13(S)-HPOT durchgeführt. Zur Bestimmung des c.s-/?ra/7s-lsomerenverhältnisses der OPDA wurden die methy- lierten Reaktionsprodukte über GC an einer SPB-1 Säule (30 m, 0,25 mm, Besich- tung 0,25 μm; Supleco, Deisenhofen) getrennt. Die Injektionstemperatur betrug 100°C, die bei 15°C/min auf 175°C erhöht wurde. Nach 2 min bei 175°C wurde die Temperatur bei 2,5°C/min auf 230°C erhöht.
Zur Bestimmung des Enantiomerenverhältnisses der OPDA wurden die extrahierten Reaktionsprodukte zunächst für 10 min bei 190°C erhitzt und durch Zugabe von 1 ml etherischem Diazomethan in die Methylester überführt. Die Trennung der Methylierungsprodukte erfolgte an einem HP 6890 GC-System (Hewlett Packard) an einer Megadex-5 GC-Säule (12 m, 0,25 mm, Beschichtungsdicke 0,25 μm) bei einem Heliumfluß von 2 ml/min. Die Temperatur bei der Injektion betrug 150°C, die für die ersten 15 min konstant blieb und nachfolgend bei 1 °C/min auf 200°C erhöht wurde.
Tabelle 1: AOC-Aktivität und Zusammensetzung der OPDA, wie sie mittels der rekombinanten AOC erhalten wurde
Claims
1. Nukleinsäure, die für ein Protein mit der Aktivität der Allenoxidcyclase aus der Jasmonatbiosynthese kodiert, ausgewählt aus
a) Nukleinsäure, die erhältlich ist durch Screenen einer pflanzlichen Genbank mit einer Sonde und Selektion auf Allenoxidcyclase-positive Klone;
b) Nukleinsäure, die für ein Protein mit der Sequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nrn. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 kodiert;
c) Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach b) hybridisiert;
d) Nukleinsäure, die unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes mit einer Nukleinsäure nach b) hybridisieren würde;
e) Durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen erhaltener Derivate einer Nukleinsäure nach a) bis d);
f) Nukleinsäure mit mindestens 53 %, vorzugsweise mindestens 70 % Identität zum kodierenden Bereich der Nukleinsäure gemäß SEQID Nr.;
g) Komplementäre Nukleinsäure zu einer Nukleinsäure nach einer der Gruppen a) bis f).
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie die kodierende Sequenz gemäß einer der Sequenzen ausgewählt aus einer der SEQ ID Nrn. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 umfasst oder davon durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen abgeleitetes Derivat.
3. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie für eine Proteinsequenz ausgewählt aus einer der SEQ ID Nrn. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 kodiert.
4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine DNA, vorzugsweise eine cDNA, ist.
5. Fragment einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens 10 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 50 Nukleotide, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 Nukleotide umfasst.
6. Fragment nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es in Anti- sinnorientierung zu einem Promotor die Expression einer Allenoxidcyclase in einer Wirtszelle hemmen kann.
7. Konstrukt enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder ein Fragment nach einem der Ansprüche 5 oder 6 unter der Kontrolle von die Expression regulierenden Elementen, vorzugsweise eines Promotors.
8. Konstrukt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Nukleinsäure bzw. das Fragment in Antisinnorientierung zu dem regulatorischen Element befindet.
9. Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es als Plasmid vorliegt.
10. Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder ein Fragment nach einem der Ansprüche 5 oder 6 und/oder ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 9.
11. Wirtszelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählt wird aus Bakterien, Hefezellen, Pflanzenzellen, Tierzellen und/oder humanen Zellen.
12. Pflanzenzelle und/oder Pflanzengewebe und/oder Pflanzenorgan und/oder Samen und/oder Pflanze enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder ein Fragment nach einem der Ansprüche 5 o- der6 und/oder ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 9.
13. Wirtszelle und/oder Samen und/oder Pflanzenzelle und/oder Pflanzengewebe und/oder Pflanzenorgan und/oder transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure bzw. das Fragment bzw. das Konstrukt in einer Stelle des Genoms integriert ist, die nicht seiner natürlichen Position im Wildtyp entspricht.
14. Protein erhältlich durch Expression einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einer Wirtszelle.
15. Fusionsprotein, umfassend das Protein nach Anspruch 14.
16. Fusionsprotein nach Anspruch 15, wobei der Fusionspartner des Proteins nach Anspruch 15 aus dem Jasmonat-Biosyntheseweg ausgewählt werden aus:
a) Allenoxidsynthasen und b) Reduktasen
17. Antikörper, der mit einem Protein nach einem der Ansprüche 14-16 reagiert.
18. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze und/oder Pflanzenzelle und/oder Pflanzengewebes und/oder Pflanzenorgans umfassend die folgenden Schritte:
- Einbringen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder eines Fragments nach einem der Ansprüche 5 oder 6 in eine Pflanzenzelle; und
- Regenerieren einer Pflanze und/oder Pflanzenzelle und/oder Pflanzengewebes und/oder Pflanzenorgans aus der transformierten Pflanzenzelle.
19. Verfahren zum Beeinflussen der Allenoxidcyclaseaktivität einer Pflanzenzelle, von Samen und/oder eines Pflanzengewebes und/oder Pflanzenorgans und/oder einer Pflanze umfassend den Schritt:
- Einbringen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder eines Fragments nach einem der Ansprüche 5 oder 6 in eine Pflanzenzelle und/oder in einen Samen und/oder in ein Pflanzengewebe und/oder Pflanzenorgan und/oder in eine Pflanze.
20. Verfahren zur selektiven Herstellung von 9S/13S (c7s(+))-12- Oxophytodiensäure in der Jasmonsäurebiosynthese umfassend die folgenden Schritte:
- Einbringen und Expression einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine geeignete Wirtszelle. - Einbringen und Expression einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zusammen mit Nukleinsäuren, kodierend für Lipoxy- genasen und Allenoxidsynthasen, in eine geeignete Wirtszelle.
21. Verfahren zur Herstellung von Jasmonsäure umfassend den Schritt:
- Herstellen des Vorläufermoleküls 9S/13S (c/s(+))-12-Oxophytodien- äure nach Anspruch 20.
22. Verwendung einer Pflanzenzelle nach Anspruch 11 zur Herstellung ganzer Pflanzen.
23. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur I- solierung homologer Sequenzen aus Pflanzen.
24. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Expression einer Allenoxidcyclase in pro- und/oder eukaryotischen Zellen.
25. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 unter der Kontrolle eines regulatorischen Elements in Antisinnorientierung zum Hemmen der Expression einer Allenoxidcyclase in pro- und/oder eukaryotischen Zellen.
26. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung transgener Nutzpflanzen mit veränderten Eigenschaften, wobei die veränderten Eigenschaften insbesondere ausgewählt werden aus:
a) Erhöhte Pathogenabwehr;
b) Erhöhte Abwehr gegen Herbivore; c) Optimierte Pflanze-Nutzinsekt-Schädling-Interaktion;
d) Erhöhte Biomassebildung;
e) Veränderter Kohlenhydrathaushalt;
f) Veränderter Stickstoffhaushalt;
g) Erhöhte Bildung sekundärer Naturstoffe, insbesondere Alkaloide und/oder Phytoalexine;
h) Optimierter UV-Schutz;
i) Veränderte männliche Sterilität;
I) Veränderte Entwicklungsprozesse, insbesondere in der Blütenentwicklung und/oder der Samenbildung und/oder der Keimung.
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