EP1252318A2 - Allenoxidcyclasegen und dessen verwendung zum herstellen von jasmonsäure - Google Patents

Allenoxidcyclasegen und dessen verwendung zum herstellen von jasmonsäure

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EP1252318A2
EP1252318A2 EP01902398A EP01902398A EP1252318A2 EP 1252318 A2 EP1252318 A2 EP 1252318A2 EP 01902398 A EP01902398 A EP 01902398A EP 01902398 A EP01902398 A EP 01902398A EP 1252318 A2 EP1252318 A2 EP 1252318A2
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EP
European Patent Office
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nucleic acid
plant
acid according
protein
expression
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01902398A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jörg Ziegler
Irene Stenzel
Bettina Hause
Claus Wasternack
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Institut fur Pflanzenbiochemie
Original Assignee
Institut fur Pflanzenbiochemie
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Filing date
Publication date
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid which codes for a vegetable allenoxide cyclase and the use of the nucleic acid for the production of jasmonic acid in a biotechnological way.
  • jasmonates were viewed as the signals of altered gene expression in various plants in response to biotic and abiotic stress as well as the signal of certain developmental processes during plant development (Creelman, RA and Mullet, JE (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 355-381; Wasternack, C. and Parthier, B. (1997) Trends in Plant Science 2, 302-307).
  • Farmer and Ryan Farmer, EE and Ryan, CA (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7713-7716
  • JA was an essential intermediate in the wound-induced signaling cascade as a result of attack by herbivores Is tomato leaves.
  • Jasmonate has been identified as a trigger for numerous defense mechanisms in plants against pathogen infection or abiotic stress.
  • defense genes such as proteinase inhibitors
  • the synthesis of phytoalexins, alkaloids and fragrances are the most important answers to YES, which in most cases takes place through the up-regulation of specific enzymes (Ellard-Ivey, M. and Douglas CJ (1996) Plant Physiol. 112, 183-192; Feussner, I. et al. (1995) Plant J. 7, 949-957).
  • JA is biosynthesized via the oxylipine biosynthetic pathway, which begins with the incorporation of molecular oxygen into position 13 of linolenic acid catalyzed by a lipoxygenase.
  • the resulting fatty acid hydroperoxide 13 (S) -hydroperoxy-9 (Z), 11 (E), 15 (Z) -octadecatrienoic acid, 13-HPOT
  • AOS allene oxide synthase
  • This allene oxide is then cyclized by the allene oxide cyclase (AOC) to 9 (S), 13 (S) -OPDA.
  • AOC allene oxide cyclase
  • the authors Vick and Zimmermann proposed a similar biosynthetic pathway as early as 1983, but it was assumed that the formation of OPDA from 13-HPOT is catalyzed by a single enzyme, a so-called hydroperoxide cyclase (Vick, BA and Zimmermann, DC (1983) Biochem Biophys Res. Commun.
  • the products formed by lipoxygenases can be converted by a divinyl ether synthase, a reductase, a peroxygenase and one Hydroperoxide lyase (Blee, E. (1998) Prag. Lipid Res. 37, 33-72). Because of these reaction options and the nonspecific ketol binding by the AOS, the AOC can be regarded as the first enzyme that makes the jasmonate synthesis highly specific.
  • the object of the present invention was to provide nucleic acids and fragments thereof which enable a method for the highly specific production of the above-mentioned stereoisomer c / ' s - (+) - OPDA from the JA biosynthetic pathway.
  • nucleic acid which codes for a protein with the activity of allene oxide cyclase and comprises a sequence which is selected from the following sequences:
  • nucleic acid which is obtainable by screening a plant gene bank with a probe and selection for allene oxide cyclase-positive clones;
  • nucleic acid which codes for a protein with the sequence selected from SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16;
  • nucleic acid which hybridizes with a nucleic acid according to b);
  • nucleic acid which would hybridize with a nucleic acid according to b) taking into account the degeneration of the genetic code; e) derivatives of a nucleic acid according to a) to d) obtained by substitution, addition, inversion and / or deletion of one or more bases;
  • nucleic acid with at least 53%, preferably at least 70% identity to the coding region of the nucleic acid according to SEQ ID No. 1;
  • Allen oxide cyclase means an enzyme that catalyzes the cs (+) - OPDA synthesis from the substrate 12,13-EOT as shown in FIG. 1.
  • Probe means a nucleic acid that is suitable for searching gene banks. However, the term also means agents, preferably proteins, which can indicate the presence of the expression product Allen oxide cyclase. These include anti-Allen oxide cyclase antibodies.
  • Hybridization with one of the sequences which are preferred for a protein with the sequence selected from SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, preferably the sequence according to SEQ ID No. 1 below, is preferred Conditions: Hybridization with the sequence according to SEQ ID No. 1 at 2xSSC, 0.1% SDS at 50 ° C., preferably for at least 30 min, is preferred. A slightly more stringent, also preferred Hybridization takes place at 1xSSC, 0.1% SDS at 50 ° C.
  • hybridization in which the Express Hyb TM hybridization solution from Clontech (USA) is used is particularly preferred, hybridization being carried out at 60 ° C. for 18 h and then at 30 min. with 2xSSC, 0.1% SDS at 50 ° C followed by 30 min. 1xSSC, 0.1% SDS at 50 ° C.
  • % identical refers to identity at the nucleic acid level, which according to known methods, e.g. of computer-aided sequence comparisons (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410).
  • % identity familiar to the person skilled in the art denotes the degree of relationship between two or more nucleic acid molecules, which is determined by the agreement between the sequences.
  • the percentage of “identity” results from the percentage of identical regions in two or more sequences, taking into account gaps and other sequence peculiarities.
  • the identity of related nucleic acid molecules can be determined using known methods. As a rule, special computer programs with algorithms that take account of the special requirements are used. Preferred methods for determining identity initially produce the greatest agreement between the sequences examined. Computer programs for determining identity between two sequences include, but are not limited to, the GCG program package, including GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group Univer - City of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S. et al., J. Molec Biol 215: 403/410 (1990)).
  • the BLAST X program can be obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and from other sources (BLAST Handbuch, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. 215: 403/410 (1990)).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the well-known Smith Waterman algorithm can also be used to determine identity.
  • Preferred parameters for nucleic acid sequence comparison include the following:
  • Disagreement (mismatch) 0 gap value (gap penalty): 50 gap length value: (gap length penalty): 3
  • the GAP program is also suitable for use with the above parameters.
  • the above parameters are the error parameters (default parameters) for nucleic acid sequence comparisons.
  • gap opening penalties can be used. The selection will depend on the comparison to be performed and also on whether the comparison is carried out between sequence pairs, GAP or Best Fit being preferred, or between a sequence and an extensive sequence database, with FASTA or BLAST being preferred.
  • the nucleic acid according to the invention encodes a protein with the sequence as given in one of the sequences with SEQ ID No. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, preferably in SEQ ID No. 2.
  • the specific sequence can be separated according to conventional methods by changes in the nucleic acid sequence (such as by substitution, addition, inversion or deletion). ner or more bases) produce protein variants. Whether a new protein variant still has the desired allene oxide cyclase activity can easily be demonstrated by means of appropriate enzyme tests, as detailed below.
  • the nucleic acid is a cDNA, but the genomic DNA is also suitable as the nucleic acid coding for all-oxide cyclase.
  • the following table shows a list of clones which have been isolated with the DNA according to the invention according to SEQ ID No. 1 of the method according to the invention.
  • fragments of the claimed nucleic acids according to the invention are distinguished by the fact that they can hybridize specifically with the abovementioned nucleic acid.
  • “Specific hybridization” means that the person skilled in the art can choose the hybridization conditions such that the fragment after hybridization only gives a signal with the above-mentioned nucleic acid and does not give a signal with other nucleic acids also present in the sample.
  • Such fragments can also be used for a specific amplification of the nucleic acid according to the invention by means of PCR.
  • the expression of the allene oxide cyclase can be inhibited in a host cell with the aid of the fragment, this being made possible, for example, by the fragment in an antisense orientation to a promoter.
  • the "construct" containing a nucleic acid according to the invention is a combination of the above-mentioned nucleic acid according to the invention and a further nucleic acid with which the nucleic acid according to the invention is naturally not linked.
  • the construct can encode AOC coding sequences together with e.g. regulatory sequences, vector sequences or sequences of fusion partners.
  • the sequence according to the invention is in a plasmid.
  • the host cells according to the invention containing the nucleic acid according to the invention are distinguished by the fact that they contain the nucleic acid in an amount / copy number which does not occur in the host type.
  • the host cells can also be cells whose wild type does not contain the nucleic acid according to the invention but which they have after the nucleic acid has been introduced.
  • the nucleic acids according to the invention can be introduced into any desired cells, including bacteria, as well as plant cells, animal cells, including insect cells, and human cells using conventional transformation techniques.
  • nucleic acid according to the invention into plant cells or e.g. Plant tissue or plant organs.
  • the host cell or the cell assembly contains the nucleic acid integrated into the genome.
  • the site of integration will not be the site where the wild type contains the allenic oxide cyclase gene, if present.
  • the protein is a fusion protein comprising the allene oxide cyclase or a fragment thereof and a non-alumina cyclase protein sequence.
  • Preferred fusion partners are sequences from the allen oxide synthase and reductase, as they occur in the Jamonat biosynthetic pathway.
  • the complete allene oxide cyclase is particularly preferred in connection with the complete allene oxide synthase or the OPDA reductase.
  • the skilled worker is familiar with the production of antibodies which are directed against the protein according to the invention. For this purpose, for example, the generation of antisera and the generation of polyclonal antibodies after immunization of a host organism with the protein according to the invention can be considered.
  • hybridoma technology can also be used to produce monoclonal antibodies.
  • new transgenic plants and parts of plants can now be produced for the first time by introducing the nucleic acid according to the invention into a starting plant cell and regenerating the more complex plant tissue down to the whole plant from the initially transformed plant cell. The techniques required for this are available to the person skilled in the art.
  • the nucleic acid according to the invention can also be used to influence the allene oxide cyclase activity in a plant or parts thereof.
  • the nucleic acid for example under a strong promoter, the allene oxide cyclase activity in the plant or in the plant cells can be increased. This effect can also be achieved by increasing the copy number of the sequences encoding allene oxide cyclase.
  • the nucleic acid according to the invention for example in an antisense orientation to a promoter, the endogenous expression of the alloxide cylase gene can be reduced or even completely blocked. This then leads to a reduction in the activity of all-oxide cyclase in the corresponding part of the plant.
  • the method according to the invention enables for the first time a highly selective production of the metabolite 9,13-cis - (+) - 12-oxophytodienic acid in large quantities.
  • This metabolite is the essential and crucial starting point for the production of jasmonic acid in its naturally occurring enantiomeric form in large quantities.
  • the metabolite mentioned was previously practically inaccessible because there was no possibility of selectively producing the cis - (+) - OPDA from the precursor molecule, 12,13-EOT. Only mixtures of different metabolites were accessible. These metabolite mixtures in turn prevented the synthesis of jasmonate in large quantities and high purity.
  • the nucleic acid according to the invention also enables the production of new transgenic crop plants with modified properties.
  • the new properties include increasing the pathogenic defense or pathogenic resistance of plants.
  • the increased expression of the AOC after introducing the nucleic acid according to the invention into the planting material leads to an increase in metabolites which are involved in the defense against pathogens. In the same way, an increased readiness to defend against Herbivore can be brought about. This effect is based on an increased induction of the wound response after introduction and expression of the nucleic acid according to the invention in the plant material.
  • the nucleic acids according to the invention allow the plant-beneficial insect-pest interaction to be optimized.
  • the expression of the nucleic acid according to the invention in the plant leads to a changed fragrance emission spectrum of the plant. Insects that contribute to the elimination of insects harmful to plants are also attracted (tritrophic interaction). Furthermore, by introducing the nucleic acid according to the invention into plant material, the biomass formation by the modified plants can be increased. This is based on an optimization of the mycorrhizability of roots in response to the expression of the nucleic acid according to the invention.
  • the carbohydrate balance of the plants can be changed by means of the nucleic acid according to the invention.
  • This is due to the fact that enzymes that are involved in the distribution of assimalate (eg invertases) are regulated by jasmonate.
  • a changed jasmonate level thus changes the activity of the enzymes mentioned. me.
  • an assimilate shift can be achieved, with an increased accumulation in the storage organs and during seed ripening being possible.
  • the nitrogen balance can be changed by means of the nucleic acid according to the invention, in particular if the nucleic acid according to the invention is expressed in the vegetative storage organs.
  • Vegetative storage proteins such as those found in soybeans, represent a form of N and protein storage. The expression of these proteins can be induced by wounds and jasmonates. As a result, increased AOC expression with increased jasmonate formation results in an increase in the protein content in vegetative storage organs.
  • UV protection of plants can be optimized with the aid of the nucleic acid according to the invention.
  • Anthocyanin formation is also inducible.
  • a targeted increase in the endogenous jasmonate level, for example in epidermal cells as a result of the increased AOC expression, can lead to an increase in the amount of anthocyanin in these cells.
  • Anthocyanins are known as UV protection agents.
  • plants with an increased anthocyanin content in epidermal tissue are less sensitive to UV stress.
  • nucleic acid according to the invention it is also possible to produce male sterility by introducing the nucleic acid according to the invention into pollen-forming tissue of the flower.
  • the nucleic acid is preferably used in an antisense orientation under a regulatory element, as a result of which the internal expression of the AOC is reduced.
  • Tissue-specific expression of the introduced nucleic acid can also be achieved by means of tissue-specific promoters.
  • ⁇ -Linolenic acid plays an important role in flower development.
  • ⁇ -Linolenic acid is the precursor of jasmonic acid in the tapetum, the pollen-forming tissue of the flower, and is the only unsaturated fatty acid there.
  • Mutants with disorders of the ⁇ - Linolenic acid formation is deficient in jasmonate.
  • These mutants are also male sterile, as are the jasmonate-insensitive mutants. It follows that male sterile lines can be produced by inhibiting jasmonate formation by lowering AOC expression. Since flowers, such as tomato flowers, have a high expression of specific invertases as well as high jasmonate contents, the properties of the flowers can be influenced by changing the jasmonate content.
  • Fig. 2 shows the nucleotide sequence of the allen oxide cyclase cDNA clone from tomato and the amino acid sequence derived therefrom.
  • Bold arrows indicate the sequences used for the RT-PCR.
  • Broken arrows indicate the sequences that were used to amplify a fragment encoding a truncated version of the allene oxide cyclase used in an overexpression assay.
  • Putative restriction interfaces for chloroplastic signal peptides which could be predicted using the computer program ChloroP V1.1, are underlined twice.
  • FIG. 3 shows the overexpression of a truncated tomato AOC protein in bacteria, the translation of which begins at the amino acid residue in position 64.
  • the corresponding partial cDNA was subcloned into the vector pJC20 and, for the purification of the protein, cloned into a vector pJC40 provided with a histidine tail.
  • the £. Was transfected. coli strain BL21 DE3 (pLysS) used. Extracts of bacteria grown with the vector pJC40 alone as well as extracts of bacteria transformed with the partial AOC cDNA (in vector pJC40) were grown either in the absence (-) or in the presence of IPTG (+) and then separated by gel electrophoresis on SDS-PAGE. The gel was stained with Coomassie Blue (A) or a corresponding blot was used an anti-AOC antibody (B). An arrow points to the AOC protein.
  • Figure 5 shows Southern blot analysis of tomato genomic DNA (A) and RFLP analysis of the AOC locus (B). The cleavage with the different restriction enzymes showed that the AOC gene is available as a single copy.
  • Figure 6 shows Northern blot analysis of AOC mRNA accumulation in wounded tomato leaves. 10 ⁇ g total RNA was loaded per lane. It originated from non-wounded (water) or wounded leaves that were harvested at different times after the start of the experiment.
  • Fig. 5A The results of the cleavages are shown in Fig. 5A. They correspond to the mapping data, according to which a locus was determined on chromosome 2 for AOC (FIG. 5B).
  • AOC is the enzyme that catalyzes the step in the biosynthesis of JA in which the "right", naturally occurring stereo
  • FIG. 6 the level of AOC mRNA in tomato leaves increases 30 min after the tomato leaves are wounded. The maximum induction could be observed after two hours and the control amount was reached again after 8 hours. This result correlates well with the amounts of JA that were measured after wounding and that also showed transient accumulation with an increase after 1 hour. This result demonstrates an important physiological function of AOC in regulating JA levels during wound response in tomato plants.
  • AOC Another very important function of the AOC seems to be the influence on the development of flower organs.
  • a high expression was found in pistil tissue, ripe flower petals, red fruits and, in smaller quantities, in stamens. In contrast, no expression was detected in young developing flower buds.
  • Mutants that are defective in the JA signal transduction chain, such as Arabidopsis coil or the fadZ-2 fad7-2 fadQ mutants, are male sterile. This shows the importance of JA in flower development. It has also been shown that AOS genes (the synthase genes) are strongly expressed in flower organs of Arabidopsis thaliana, which suggests that JA may be synthesized in flowers.
  • Tomato plants were grown for 8 weeks, the secondary leaf cut off, wounded with a standard toothed wheel and then incubated in distilled water under continuous white light (at an intensity of 120 ⁇ m • m "2 • s " 1) ). Analysis of endogenous JA and OPDA amounts
  • the AOS activity was measured in 50 mM potassium phosphate with pH 6.7 in a total volume of 1 ml. The reaction was started by the addition of the fatty acid hydroperoxide and the decrease in absorbance at 235 nm was measured. For the determination of the kinetic parameters of AOS from maize, the initial reaction rate at 14 concentrations in the range from 5 to 90 ⁇ m was determined for each substrate. The K m and v a ⁇ values were calculated directly using the Michaelis-Menten equation and plotted according to the Eadie-Hofstee diagram. ANALYSIS OF THE CYCLE PRODUCTS OF THE ALLENOXIDE
  • Fatty acid hydroperoxides (150 ⁇ m) were at 0 ° C for 10 min. with 0.5 ml of a suspension of corn seed membranes (0.5 mg protein; 28 nkat using 13 (S) -HPOT as substrate) in 0.1 m potassium phosphate buffer pH 6.7 and 2.5 ml of the AOC preparation in Ammonium sulfate / 20 mm tris-HCL buffer pH 7.5 (total assay volume: 5 ml) stirred.
  • the activities of the AOC from corn or potatoes that were added to this assay were equivalent to 178 nmol PDA or 156 nmol PDA, as measured by the method based on RP radio HPLC.
  • Controls in which the AOC solution was replaced by potassium phosphate buffer were carried out in parallel.
  • the incubations were terminated by adding 10 ml of ethanol and the reaction products were extracted with diethyl ether, methylated and subjected to TLC (using the solvent system: ethyl acetate / toluene 15:18 vol / vol.).
  • the bands were visualized under UV light after spraying with 2-6-dichlorofluorescein and the R f of the cyclopentenone band (the methyl ester of 12-oxo-PDA and its homologues and analogs) was recorded.
  • the bacterial suspension was induced by 1 mM IPTG for 4 hours, then centrifuged, subjected to two freezing and thawing cycles and then by Ultrasound lysed in 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 M NaCl, 0.1% Tween 20 and 10% glycerol. After a further centrifugation, the supernatants were used further for measuring the AOC activity.
  • the enzyme activity was measured on the one hand using a radioactive assay according to the method as specified below, and by determining the enantiomeric composition of OPDA.
  • the hybridization conditions were as follows: It was hybridized using the Expression Hyb TM hybridization solution from Clontech (USA) at 60 ° C. for 18 h and then for 30 min.
  • the recombinant protein expressed by the expression vector pJC40 was purified by affinity chromatography on a nitrilotriacetic acid agarose (NiNTA, Qiagen). The purity of the protein was checked by SDS-PAGE gel electrophoresis. The purified recombinant AOC enzyme was then used to produce a rabbit polyclonal antibody.
  • Northern blot analysis was carried out according to Maniatis et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989) with 10 ⁇ g total RNA per lane. The blots obtained were hybridized at 65 ° C. for 16 hours with a radioactively labeled sample of the tomato AOC cDNA clone, consisting of the full-length cDNA sequence (see FIG. 2). Hybridization with the sequence according to SEQ ID No. 1 at 2xSSC, 0.1% SDS at 50 ° C., preferably for at least 30 min, is preferred. A somewhat more stringent, also preferred hybridization takes place at 1xSSC, 0.1% SDS at 50 ° C.
  • Hybridization is particularly preferred who uses the Express Hyb TM hybridization solution from Clontech (USA), hybridizing at 60 ° C. for 18 h and then at 30 min. with 2xSSC, 0.1% SDS at 50 ° C followed by 30 min. IxSSC, 0.1% SDS at 50 ° C. A uniform gel loading of the samples was checked via the ethidium bromide staining of the ribosomal RNA.
  • RNA isolation Tissues in which the endogenous JA concentration accumulates due to induction were used for RNA isolation. So were sorbitol-stressed leaves from barley (Lehmann et al., Planta 197 p. 156, 1995) and wounded tomato leaves (Pena-Cortes et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, p. 4106, 1995) as the starting material for further RNA isolation. While no specific PCR products could be obtained from barley, a weak band of approximately 900 bp fragment size was amplified after RT-PCR with RNA from wounded tomato leaves.
  • This PCR product was used as a probe for the screen of the tomato cDNA library, which led to the isolation of a 1 kb cDNA clone. This size roughly corresponded to the signal size that could be detected in the Northern blot analyzes. From this it could be concluded that the isolation was a full length clone.
  • the first start codon is located at position 47 and preceded by a stop codon at position 16.
  • the protein coding region comprises 732 bp which code for a protein of 244 amino acids with a calculated molecular weight mass of 26 kDa (FIG. 2).
  • the approximately 4 kDa deviation of the derived molecular weight from the tomato protein was determined by SDS-PAGE gel electrophoresis and could, at least in part, be the result of post-translational removal of amino acids at the N-terminus of the tomato protein.
  • the AOC activity of the recombinant protein was sensitive to proteinase K digestion and could be inhibited by 12,13-epoxyoctadecenoic acid, a specific AOC inhibitor, which further supports the specificity of the recombinant protein.
  • a specific property of the AOC reaction is the competing reaction between the chemical splitting of the unstable allen oxide substrate, resulting in a racemic mixture of OPDA, and the enzymatic conversion to enantiomeric OPDA.
  • a protein can therefore ultimately only be identified as AOC if the specific enantiomer 9 (S), 13 (S) -OPDA has been formed and detected.
  • AOS from flax (Song et al., Proc. Natl. Acad. Sei 90, S 8519, 1993) and Arabidopsis (Laudert et al., Plant. Mol. Biol., 31, p. 323, 1996) also showed possible ones chloroplastic signal peptides and, like the AOS, were purified from barley together with chloroplasts. Enzyme activities of LOX, hydroperoxide lyase and AOS could be demonstrated by biochemical data in the outer envelope membrane of chloroplasts (Blee and Joyard, Plant Physiol. 110, p. 445, 1996). In the case of AOS and LOX, their chloroplastic localization could also be confirmed immunocytochemically.
  • the amounts of OPDA and linolenic acid rose to 187 ng / g (90-fold) and 1813 ng / g (9-fold) within 30 and 180 min. after mechanical tissue wound.
  • Steric analysis of wound-induced OPDA showed exclusive formation (> 99%) to the 9 (S), 13 (S) stereoisomer. It could be concluded that the AOS and AOC are either localized in the chloroplast or are loosely associated in the chloroplast.
  • the reaction mixture consisted of the 100,000 g pellet of the tissue homogenate investigated with an AOS activity of 7 nkat and the sample to be investigated, resuspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5). The volume was made up to 625 ⁇ l with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) and the enzyme reaction was started by adding 2.6 ⁇ l 10 mM [1- 1 C] 13 (S) -HPOT (final concentration 41 ⁇ M; 0 , 83 kBq [0.022 ⁇ Ci]). The mixture was incubated on ice for 10 min.
  • the reaction was stopped by adding 750 ⁇ l of MeOH, the reaction mixture was acidified with 2N HCl and the products were extracted with 4 ml of diethyl ether. The organic phase was evaporated and the residue was taken up in 110 ⁇ l acetonitrile / H 2 O / HOAc (55/45 / 0.02 v / v / v).
  • the HPLC separation of the reaction products was carried out isocratically (acetonitrile / H 2 O / HOAc 55/45 / 0.02 vol./vol./vol.) On a Eurospher 100 C18 column (5 ⁇ m, 200 ⁇ 4.6 mm; Knauer Berlin) at a flow rate of 1 ml / min.
  • the products were quantified by measuring the radioactivity using a flow cell filled with a solid scintillator (yttrium silicate 0.4 ml, RSM 100 radioactivity monitor analyzer, Raytest Isotopenmeßtechnik GmbH, Strubenhardt).
  • the amount of OPDA was compared on the one hand with the peak area of the ⁇ -ketol and on the other hand with the sum of all peak areas appearing on the chromatogram and the AOC activity was calculated as follows:
  • the AOC enzyme test was carried out with non-radioactive labeled 13 (S) -HPOT.
  • S non-radioactive labeled 13
  • the methylated reaction products were separated by GC on an SPB-1 column (30 m, 0.25 mm, 0.25 ⁇ m view; Supleco, Deisenhofen) , The injection temperature was 100 ° C, which was increased to 175 ° C at 15 ° C / min. After 2 min at 175 ° C, the temperature was raised to 230 ° C at 2.5 ° C / min.
  • the extracted reaction products were first heated at 190 ° C. for 10 min and converted into the methyl ester by adding 1 ml of ethereal diazomethane.
  • the separation of the methylation products was carried out on an HP 6890 GC system (Hewlett Packard) on a Megadex-5 GC column (12 m, 0.25 mm, coating thickness 0.25 ⁇ m) with a helium flow of 2 ml / min.
  • the temperature during the injection was 150 ° C., which remained constant for the first 15 minutes and was subsequently increased to 200 ° C. at 1 ° C./min.
  • Table 1 AOC activity and composition of the OPDA as obtained using the recombinant AOC

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die für eine pflanzliche Allenoxidcyclase (AOC) kodiert. Die Bereitstellung des neuen cDNA-Klons erlaubt nun erstmalig die Herstellung von Jasmonsäure in grossen Mengen und grosser Reinheit auf biotechnologischem Weg.

Description

Allenoxidcyclasegen und dessen Verwendung zum Herstellen von Jasmonsäure
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die für eine pflanzliche Alleno- xidcyclase kodiert sowie die Verwendung der Nukleinsäure zur Herstellung von Jasmonsäure auf biotechnologischem Weg.
Jasmonsäure (JA) und deren Methylester (JAME), die zusammen auch Jasmonate genannt werden, bestehen aus einem Cyclopentanonring, an den eine Essigsäure- und eine Pentenylseitenkette angefügt ist. Diese Seitenketten finden sich entweder in der cis-(3R/7S) oder der trans-Form (3R/7R). Weiterhin sind eine Vielzahl an strukturell verwandten Verbindungen beschrieben worden, die in Pflanzen weit verbreitet sind (Hamberg, M. und Gardner, H. W. (1992) Biochem. Biophys. Acta 1165, 1-18). Die erste von JA aufgefundene physiologische Funktion war 1971 das Hemmen des Pflanzenwachstums (Aldridge, D. C, et al. (1971) J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1623 1627). Von da an wurden Jasmonate als die Signale einer veränderten Genexpression in verschiedenen Pflanzen als Antwort auf biotischen und abiotischen Streß wie auch als Signal bestimmter Entwicklungsvorgänge während der Pflanzenentwicklung angesehen (Creelman, R. A. und Mullet, J. E. (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 355 - 381 ; Wasternack, C. und Parthier, B. (1997) Trends in Plant Science 2, 302 - 307). 1990 wurde von Farmer und Ryan (Farmer, E. E. und Ryan, C. A. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 7713 - 7716) gefunden, dass JA ein wesentliches Zwischenprodukt bei der wundinduzierten Signalkaskade als Folge des Angriffs von Pflanzenfressern auf Tomatenblätter ist. Für zahlreiche Abwehrmechanismen bei Pflanzen gegenüber einer Pathogeninfektion oder abiotischem Streß wurde Jasmonat als Auslöser identifiziert. Neben der Expression von Abwehrgenen, wie Proteinaseinhibitoren, sind die Synthesen von Phytoalexinen, Alkaloiden und Duftstoffen die bedeutendsten Antworten auf JA, die in den meisten Fällen durch das Hochregulieren von spezifischen Enzymen erfolgt (Ellard-Ivey, M. und Douglas C. J. (1996) Plant Physiol. 112, 183 - 192; Feussner, I. et al. (1995) Plant J. 7, 949 - 957). Die Antworten auf Jasmonat wurden charakteri- siert mittels einer veränderten Expression spezifischer Gene, mittels Jasmonat- unempfindlichen und Jasmonat-Defektmutanten, mittels transgener Pflanzen mit Jasmonatmangel oder mittels der Erhöhung von endogenen Jasmonaten sowie mittels Hemmstudien. Erst kürzlich wurde der JA-Vorläufer 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) als ein bevorzugtes Signal einer JA-Antwort angesehen. Unter den Entwicklungsvorgängen sind die Pollenreifung und das Keimlingswachstum JA- abhängig.
Die Biosynthese von JA erfolgt über den Oxylipin-Biosyntheseweg, der mit dem durch eine Lipoxygenase katalysierten Einbau von molekularem Sauerstoff in die Position 13 von Linolensäure beginnt. Anschließend wird das entstehende Fettsäurehydroperoxid (13(S)-Hydroperoxy-9(Z),11(E),15(Z)-Oktadekatriensäure,13-HPOT) durch die Allenoxidsynthase (AOS) zu einem Alienoxid dehydriert (Hamberg, M. und Gardner, H. W. (1992) Biochem. Biophys. Acta 1165, 1-18). Dieses Allenoxid wird dann cyclisiert durch die Allenoxidcyclase (AOC) zu 9(S), 13(S)-OPDA. Nach Reduktion der Doppelbindung im Ring, katalysiert durch eine Reduktase und drei folgende Runden der ß-Oxydation, entsteht (+)-7-/'so-JA, z. B. 3(R), 7(S)-JA. Die Autoren Vick und Zimmermann haben schon 1983 einen ähnlichen Biosyntheseweg vorgeschlagen, jedoch wurde angenommen, dass die Bildung von OPDA von 13- HPOT aus von einem einzelnen Enzym, einer sog. Hydroperoxidcyclase katalysiert wird (Vick, B. A. und Zimmermann, D. C. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 111 , 470 - 477). 1988 zeigte Hamberg, dass dieser Schritt von 2 Enzymaktivitäten vollzogen wird. Eines dieser Enzyme, das eine Membran-gebundene Aktivität zeigt und später als AOS charakterisiert wurde, katalysiert die Bildung eines instabilen Allenoxids, das schnell mit einer Halbwertzeit von 25 See. durch chemische Hydrolyse zu - und γ-Ketol und razemische OPDA abgebaut wird (Figur 1). Dabei macht OPDA nur 10 - 15 % der Gesamtmenge der Degradationsprodukte aus und ist ein racemisches Gemisch, bestehend aus den c/s-lsomeren 9(S),13(S) und 9(R),13(R).
Zusätzlich können die durch Lipoxygenasen gebildeten Produkte umgewandelt werden durch eine Divinylethersynthase, eine Reduktase, ein Peroxygenase und eine Hydroperoxidlyase (Blee, E. (1998) Prag. Lipid Res. 37, 33 - 72). Wegen dieser Reaktionsmöglichkeiten und der unspezifischen Ketolbindung durch die AOS kann die AOC als das erste Enzym angesehen werden, das die Jasmonatsynthese hochspezifisch macht.
Bisher wurden einige Formen von Lipoxygenasen, Allenoxidsythasen und OPDA- Reduktasen aus Pflanzen kloniert, biochemisch charakterisiert und ihre physiologische Bedeutung untersucht (Rosahl, S. (1996) Z. Naturforsch. 51 c, 123 - 138; Song et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 8519 - 8523; Laudert, D. und Weiler, E. W. (1998) Plant J. 15, 675 - 684).
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, Nukleinsäuren und Fragmente davon bereitzustellen, mit denen ein Verfahren zur hochspezifischen Produktion des obengenannten Stereoisomers c/'s-(+)-OPDA aus dem JA- Biosyntheseweg ermöglicht wird.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure gelöst, die für ein Protein mit der Aktivität der Allenoxidcyclase kodiert und eine Sequenz umfaßt, die aus folgenden Sequenzen ausgewählt wird:
a) Nukleinsäure, die erhältlich ist durch Screenen einer pflanzlichen Genbank mit einer Sonde und Selektion auf Allenoxidcyclase-positive Klone;
b) Nukleinsäure, die für ein Protein mit der Sequenz ausgewählt aus den SEQ-ID Nrn. 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16 kodiert;
c) Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach b) hybridisiert;
d) Nukleinsäure, die unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes mit einer Nukleinsäure nach b) hybridisieren würde; e) Durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen erhaltener Derivate einer Nukleinsäure nach a) bis d);
f) Nukleinsäure mit mindestens 53 %, vorzugsweise mindestens 70 % Identität zum kodierenden Bereich der Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 1 ;
g) Komplementäre Nukleinsäure zu einer Nukleinsäure nach einer der Gruppen a) bis f).
Unter Nutzung der vorliegenden AOC-Klone besteht nun erstmals die Möglichkeit, intensive physiologische Studien hinsichtlich des JA-Biosyntheseweges durchzuführen, aber auch erstmals JA und seine Derivate auf biotechnologischem Wege herzustellen. Der bisher hierbei limitierende Schritt in der spezifischen Jasmonat- synthese war die fehlende spezifische Herstellbarkeit des Stereoisomers (9S)(13S)(c/s(+)) der 12-oxo-Phytodiensäure.
" Allenoxidcyclase" bedeutet ein Enzym, das die cs(+)-OPDA-Synthese aus dem Substrat 12,13-EOT, wie in Fig. 1 gezeigt, katalysiert.
"Sonde" bedeutet eine Nukleinsäure, die zum Absuchen von Genbanken geeignet ist. Unter dem Begriff werden jedoch auch Mittel, vorzugsweise Proteine, verstanden, die die Anwesenheit des Expressionsprodukts Allenoxidcyclase anzeigen können. Hierzu zählen unter anderem Anti-Allenoxidcyclase-Antikörper.
Das Ermitteln der Bedingungen zum spezifischen "Hybridisieren" zwischen vorgegebenen Nukleinsäuren liegt im Bereich des fachmännischen Könnens. Bevorzugt ist eine Hybridisierung mit einer der Sequenzen, die für ein Protein mit der Sequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nrn. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, vorzugsweise der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 unter folgenden Bedingungen: Bevorzugt ist eine Hybridisierung mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 bei 2xSSC, 0,1 % SDS bei 50°C, vorzugsweise für mindestens 30 min. Eine etwas stringentere, ebenfalls bevorzugte Hybridisierung erfolgt bei 1xSSC, 0,1% SDS bei 50°C. Besonders bevorzugt ist eine Hybridisierung, bei der die Express Hyb™ Hybridisierungslösung von Clontech (USA) eingesetzt wird, wobei für 18 h bei 60°C hybridisiert wird und anschließend bei 30 min. mit 2xSSC, 0,1 % SDS bei 50°C gefolgt von 30 min. 1xSSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen wird.
Erfindungsgemäß bezieht sich der Ausdruck "% identisch" auf Identität auf Nuklein- säure-Ebene, die gemäß bekannter Verfahren, z.B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) bestimmt werden kann.
Der dem Fachmann vertraute Ausdruck "% Identität" bezeichnet den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehreren Nukleinsäuremolekülen, der durch die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen bestimmt wird. Der Prozentsatz der "Identität" ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken und anderen Sequenzbesonderheiten.
Die Identität miteinander verwandter Nukleinsäuremoleküle kann mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt werden. In der Regel werden spezielle Computerprogramme mit den besonderen Anforderungen Rechnung tragenden Algorithmen eingesetzt. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung der Identität zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, das GCG-Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(12):387 (1984); Genetics Computer Group Univer- sity of Wisconsin, Madison, (Wl)); BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al., J. Molec Biol 215:403/410 (1990)). Das BLAST X Programm kann vom National Centre for Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. 215:403/410 (1990)). Auch der bekannte Smith Water- man-Algorithmus kann zur Bestimmung von Identität verwendet werden.
Bevorzugte Parameter für den Nukleinsäuresequenz-Vergleich umfassen die nachstehenden:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48:443-453 (1970)
Vergleichsmatrix: Übereinstimmung (matches) = + 10,
Nichtübereinstimmung (mismatch) = 0 Lücken-Wert (Gap Penalty): 50 Lückenlängen-Wert: (Gap Length Penalty): 3
Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default Parameters) für Nukleinsäuresequenz-Vergleiche.
Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die erfindungsgemäße Nukleinsäure ein Protein mit der Sequenz wie in einer der Sequenzen mit der SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, vorzugsweise in SEQ ID Nr. 2 angegeben. Von der spezifischen Sequenz lassen sich nach herkömmlichen Verfahren durch Änderungen in der Nukleinsäuresequenz (wie durch Substitution, Addition, Inversion oder Deletion ei- ner oder mehrerer Basen) Proteinvarianten herstellen. Ob eine neue Proteinvariante noch die gewünschte Allenoxidcyclaseaktivität aufweist, läßt sich leicht anhand entsprechender Enzymtests nachweisen, wie sie unten näher ausgeführt werden.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nukleinsäure um eine cDNA, jedoch ist auch die genomische DNA als Allenoxidcyclase kodierenden Nukleinsäure geeignet.
Die folgende Tabelle zeigt eine Auflistung von Klonen, die mit der erfindungsgemäßen DNA gemäß SEQ ID Nr. 1 des erfingungsgemäßen Verfahrens isoliert worden sind.
oo
Die erfindungsgemäßen Fragmente der beanspruchten Nukleinsäuren zeichnen sich dadurch aus, dass sie spezifisch mit der obengenannten Nukleinsäure hybridisieren können. "Spezifische Hybridisierung" bedeutet dabei, dass der Fachmann die Hybridisierungsbedingungen so wählen kann, dass das Fragment nach Hybridisierung lediglich ein Signal mit der obengenannten Nukleinsäure ergibt und mit anderen ebenfalls in der Probe vorliegenden Nukleinsäuren kein Signal ergibt. Solche Fragmente lassen sich auch zu einer spezifischen Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mittels PCR einsetzen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann mit Hilfe des Fragments die Expression der Allenoxidcyclase in einer Wirtszelle gehemmt werden, wobei dies beispielsweise durch das Fragment in Antisinnorientierung zu einem Promotor ermöglicht wird. Eine Hemmung der Expression der Allenoxidcyclase durch ein Fragment in Sinnorientierung ist jedoch auch möglich. Das "Konstrukt" enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure ist eine Kombination aus der obenerwähnten erfindungsgemäßen Nukleinsäure und einer weiteren Nukleinsäure, mit der die erfindungsgemäße Nukleinsäure natürlicherweise nicht verknüpft ist. Somit kann das Konstrukt AOC-kodierende Sequenzen zusammen mit z.B. regulatorischen Sequenzen, Vektorsequenzen oder Sequenzen von Fusionspartnern umfassen. Bei besonders bevorzugten Konstrukten liegt die erfindungsgemäße Sequenz in einem Plasmid vor.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäure zeichnen sich dadurch aus, dass sie die Nukleinsäure in einer Menge/Kopienzahl enthalten, die in dem Wirtstyp so nicht vorkommt. Alternativ kann es sich bei den Wirtszellen auch um Zellen handeln, deren Wildtyp die erfindungsgemäße Nukleinsäure nicht enthält sondern diese es nach Einbringen der Nukleinsäure aufweisen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können mit üblichen Transformationstechniken in beliebige Zellen, einschließlich Bakterien, wie auch Pflanzenzellen, tierische Zellen, einschließlich Insektenzellen, sowie humane Zellen eingebracht werden.
Besonders bevorzugt ist das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in pflanzliche Zellen oder z.B. Pflanzengewebe oder Pflanzenorgane.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Wirtszelle oder der Zellverband die Nukleinsäure integriert in das Genom. In der Regel wird der Integrationsort nicht der Ort sein, in dem der Wildtyp das Allenoxidcyclasegen, sofern vorhanden, enthält.
Das Einbringen der erfindungsgemäßen Sequenzen unter der Kontrolle geeigneter Elemente, die die Expression der Nukleinsäure kontrollieren, welche dem Fachmann geläufig sind, läßt sich AOC in großer Menge und großer Reinheit darstellen. Die Techniken zur Expression und Isolierung von Protein aus den Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Protein ein Fusionsprotein umfassend die Allenoxidcyclase oder ein Fragment davon sowie eine Nichtalleno- xidcyclaseproteinsequenz. Bevorzugte Fusionspartner sind Sequenzen aus der Al- lenoxidsynthase und Reduktase, wie sie im Jamonatbiosyntheseweg vorkommen. Besonders bevorzugt ist die vollständige Allenoxidcyclase in Verbindung mit der vollständigen Allenoxidsynthase bzw. der OPDA-Reduktase. Die Herstellung von Antikörpern, die gegen das erfindungsgemäße Protein gerichtet sind, ist dem Fachmann geläufig. Hierzu kommen beispielsweise die Gewinnung von Antiseren und das Erzeugen polyklonaler Antikörper nach Immunisierung eines Wirtsorganismus mit dem erfindungsgemäßen Protein in Betracht. Alternativ läßt sich jedoch auch die Hybridomtechnologie zum Herstellen monoklonaler Antikörper benutzen. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren lassen sich jetzt erstmalig neue transgene Pflanzen und Pflanzenteile herstellen, indem die erfindungsgemäße Nukleinsäure in eine Ausgangspflanzenzelle eingebracht wird und das komplexere Pflanzengewebe bis hin zur ganzen Pflanze aus der anfänglich transformierten Pflanzenzelle regeneriert wird. Die hierfür erforderlichen Techniken stehen dem Fachmann zur Verfügung.
Mittels der erfindungsgemäßen Nukleinsäure läßt sich ebenfalls die Allenoxidcyclaseaktivität in einer Pflanze bzw. deren Teile beeinflussen. Durch Einbringen der Nukleinsäure beispielsweise unter einem starken Promotor läßt sich die Allenoxidcyclaseaktivität in der Pflanze bzw. in den Pflanzenzellen erhöhen. Dieser Effekt kann auch durch Erhöhen der Kopienzahl der Allenoxidcyclase kodierenden Sequenzen erzielt werden. Andererseits läßt sich durch Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, beispielsweise in Antisinnorientierung zu einem Promotor die endogene Expression des Allenoxidcylasegens erniedrigen oder gar vollständig blockieren. Dies führt dann zu einer Erniedrigung der Allenoxidcyclaseaktivität in dem entsprechenden Pflanzenteil.
Schließlich ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren erstmals eine hochselektive Herstellung des Metaboliten 9,13-cis-(+)-12-Oxophytodiensäure in großer Menge. Dieser Metabolit ist die wesentliche und entscheidende Ausgangsstufe für das Herstellen der Jasmonsäure in seiner natürlich vorkommenden enantiomeren Form in großen Mengen. Der genannte Metabolit war vormals praktisch nicht zugänglich, da es keine Möglichkeit gab aus dem Vorläufermolekül, 12,13-EOT, die cis-(+)- OPDA selektiv herzustellen. Es waren lediglich Gemische verschiedener Metaboliten zugänglich. Diese Metaboliten-Gemische wiederum verhinderten die Synthese von Jasmonat in großen Mengen und hoher Reinheit.
Mit der zur Verfügungstellung des AOC kodierenden Gens stehen jetzt dem Fachmann alle Mittel zur Verfügung um beispielsweise ausgehend von α-Linolensäure, Jasmonsäure in großen Mengen und großer Reinheit herzustellen. Dabei ist der vollständige Biosyntheseweg jetzt mittels rekombinanter DNA-Techniken vollständig in einem Wirtsorganismus etablierbar. Ein entscheidender Schritt, der die biotechnologische Herstellung von Jasmonsäure in großen Mengen jetzt ermöglicht, war das Bereitstellen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure. Sie hat es erstmalig ermöglicht, die c7s-(+)-OPDA in großer Reinheit und großen Mengen als Ausgangsmaterial für die weitere Jasmonsäurebiosynthese zur Verfügung zu stellen.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure ermöglicht ferner die Herstellung neuer trans- gener Nutzpflanzen mit veränderten Eigenschaften. Zu den neuen Eigenschaften zählen die Erhöhung der pathogenen Abwehr bzw. pathogenen Resistenz von Pflanzen. Durch die erhöhte Expression der AOC nach Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das Pflanzmaterial kommt es zur Erhöhung von Metabo- liten, welche an der Pathogenabwehr beteiligt sind. Auf dem gleichen Weg läßt sich auch eine erhöhte Abwehrbereitschaft gegen Herbivore herbeiführen. Dieser Effekt beruht auf einer verstärkten Induktion der Wundantwort nach Einbringen und Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das Pflanzenmaterial. Ferner erlauben die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren das Optimieren der Pflanzen- Nutzinsekt-Schädling-Interaktion. Dies beruht darauf, das die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in der Pflanze zu einem veränderten Duftemissionsspektrum der Pflanze führt. Dabei werden insbesondere auch solche Insekten angelockt, die zur Beseitigung von pflanzenschädlichen Insekten beitragen (tritrophe Interaktion). Ferner läßt sich durch Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in Pflanzenmaterial die Biomassebildung durch die veränderten Pflanzen erhöhen. Dies geht auf eine Optimierung der Mykorrhizierungsfähigkeit von Wurzeln als Antwort auf die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure zurück.
Ferner läßt sich der Kohlenhydrathaushalt der Pflanzen mittels der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verändern. Dies geht darauf zurück, dass Enzyme, die an der Assimalatverteilung beteiligt sind (z.B. Invertasen) durch Jasmonat reguliert werden. Ein veränderter Jasmonatspiegel verändert somit die Aktivität der genannten Enzy- me. Auf diese Weise läßt sich eine Assimilatverschiebung erreichen, wobei eine erhöhte Akkumulation in Speicherorganen sowie bei der Samenreifung möglich ist.
Schließlich läßt sich der Stickstoffhaushalt mittels der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verändern, insbesondere wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure in den vegetativen Speicherorganen exprimiert wird. Vegetative Speicherproteine, wie sie etwa bei der Sojabohne vorkommen, stellen eine Form der N- und Proteinspeiche- rung dar. Die Expression dieser Proteine ist Wund- und Jasmonat-induzierbar. Demzufolge hat eine erhöhte AOC-Expression mit erhöhter Jasmonatbildung einen Anstieg des Proteingehalts in vegetativen Speicherorganen zur Folge.
Ferner läßt sich der UV-Schutz von Pflanzen mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäure optimieren. Auch die Anthocyan-Bildung ist Jasmonat-induzierbar. Eine gezielte Erhöhung des endogenen Jasmonatspiegels, etwa in epidermalen Zellen in Folge der erhöhten AOC-Expression, kann zur Erhöhung der Anthocyan- Menge in diesen Zellen führen. Anthocyane wiederum sind als UV-Schutzmittel bekannt. Somit sind Pflanzen mit einem erhöhten Anthocyangehalt in epidermalem Gewebe weniger empfindlich gegenüber UV-Streß.
Ferner ist die Erzeugung männlicher Sterilität durch Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in pollenbildendes Gewebe der Blüte möglich. Dabei wird die Nukleinsäure vorzugsweise in Antisinnorientierung unter einem regulatorischen E- lement verwendet, wodurch die interne Expression der AOC erniedrigt wird. Die gewebespezifische Expression der eingebrachten Nukleinsäure läßt sich ferner mittels gewebespezifischer Promotoren erreichen.
Schließlich lassen sich auch Entwicklungsprozesse der Pflanzen, insbesondere die Blütenentwicklung, mittels der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verändern. Bei der Blütenentwicklung spielt α-Linolensäure eine wichtige Rolle. α-Linolensäure ist der Vorläufer von Jasmonsäure im Tapetum, dem Pollen-bildenden Gewebe der Blüte, und stellt dort die einzige ungesättigte Fettsäure dar. Mutanten mit Störungen der α- Linolensäurebildung sind Jasmonat-defizient. Diese Mutanten sind ferner männlich steril ebenso wie die Jasmonat-insensitiven Mutanten. Daraus folgt, dass sich durch Hemmen der Jasmonatbildung mittels der Erniedrigung der AOC-Expression männlich sterile Linien herstellen lassen. Da Blüten, wie beispielsweise Tomatenblüten, eine hohe Expression spezifischer Invertasen wie auch hohe Jasmonatgehalte aufweisen, läßt sich über einen geänderten Jasmonatgehalt die Eigenschaften der Blüten beeinflussen.
Fig. 1 zeigt ein Schema der Jasmonat-Biosynthese
Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz des Allenoxidcyclase-cDNA-Klons aus Tomate und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. Dick gedruckte Pfeile geben die Sequenzen an, die für die RT-PCR verwendet wurden. Unterbrochene Pfeile geben die Sequenzen an, die zur Amplifizierung eines Fragmentes verwendet wurden, das für eine trunkierte Version der Allenoxidcyclase kodiert, verwendet in einem Überexpressionsassay. Doppelt unterstrichen sind putative Restriktionsschnittstellen für chloroplastidäre Signal- peptide die unter Verwendung des Computerprogrammes ChloroP V1.1 vorhergesagt werden konnten.
Fig. 3 zeigt die Überexpression eines trunkierten Tomaten-AOC-Proteins in Bakterien, dessen Translation am Aminosäurerest in Position 64 beginnt. Die dazu korrespondierende partielle cDNA wurde in den Vektor pJC20 subklo- niert und für die Reinigung des Proteins in einen mit einem Histidinschwanz versehenden Vektor pJC40 kloniert. Zur Transfektion wurde der £. coli- Stamm BL21 DE3(pLysS) verwendet. Es wurden sowohl Extrakte von Bakterien, die mit dem Vektor pJC40 allein als auch Extrakte von Bakterien, die mit der partiellen AOC-cDNA (in Vektor pJC40) transformiert worden waren, entweder in Abwesenheit (-) oder in Anwesenheit von IPTG (+) angezogen und anschließend über SDS-PAGE gelelektrophorethisch getrennt. Das Gel wurde mit Coomassie Blue (A) gefärbt bzw. ein korrespondierender Blot mit einem anti-AOC-Antikörper geprobt (B). Auf das AOC-Protein weist ein Pfeil hin.
Fig. 4 zeigt die Lokalisierung des AOC-Proteins in Tomatenblättern nach immu- nocytochemischer Identifizierung. Blattquerschnitte, die für 24 Stunden in 50 μmol JAME inkubiert worden waren wurden entweder mit Prä-Immunserum (A) oder mit anti-AOC-Antikörper, der gegen das gereinigte rekombi- nante AOC-Protein aus Tomate gerichtet ist (B), behandelt, gefolgt von einer zweiten Behandlung mit einem zweiten Antikörper, welcher BODIPY- markiert war. Im Gegensatz zu der gelbbraunen Autofluoreszenz nach Behandlung mit dem Prä-Immunserum zeigte eine deutliche Fluoreszenzmarkierung in den Chloroplasten in B die Präsenz des AOC-Proteins. Stärkekörner in den Chloroplasten, die in B als nicht-fluoreszierende Bereiche zu sehen waren, wurden sichtbar gemacht über differenziellen Interferenzkontrast®. Der Maßstab ist in μm angegeben.
Fig. 5 zeigt die Southern Blot-Analyse von genomischer DNA aus Tomate (A) und die RFLP-Analyse des AOC-Locus (B). Die Spaltung mit den unterschiedlichen Restriktionsenzymen zeigte, dass das AOC-Gen als Einzelkopie vorliegt.
Fig. 6 zeigt die Northern Blot-Analyse der Akkumulierung von AOC-mRNA in verwundeten Tomatenblättern. Pro Spur wurden 10 μg Gesamt-RNA geladen. Sie entstammte aus nichtverwundeten (Wasser) bzw. verwundeten Blättern, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Versuchsbeginn geerntet wurden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Genomische Analyse der AOC-Gene
Für die Southern Blot-Analyse wurde genomische DNA aus Tomate mit den Restriktionsenzymen ßamHI, BglW, Pst\, Hind\\\, EcoRI, EcoRV und EcoRII (Fig. 5A) verdaut. Nach Spaltung mit den ersten beiden Enzymen konnten drei Banden detek- tiert werden. Da diese Enzyme in dem Insert zwei Schnittstellen aufwiesen, kann angenommen werden, dass die AOC im Tomatengenom als sogenanntes "Single Copy"-Gen vorliegt. Diese Annahme ist weiterhin unterstützt durch das Bandenmuster, das durch Restriktion mit den anderen Enzymen erhalten wurde. Bei Spaltung mit Pst\ und Hind W wurden zwei Banden detektiert, wobei diese Enzyme jeweils einmal im cDNA-lnsert Schnittstellen aufwiesen, während nur eine Bande bei den drei letzten Enzymen detektiert werden konnte, die im cDNA-lnsert keine Restriktionsschnittstellen aufwiesen. Die Ergebnisse der Spaltungen sind in Fig. 5A aufgeführt. Sie entsprechen den Kartierungsdaten, nach denen für AOC ein Genort auf Chromosom 2 bestimmt wurde (Fig. 5B).
Physiologie der AOC-Expression
Es konnte vielfach nachgewiesen werden, dass die Akkumulierung von JA einen wichtigen Teil der Signaltransduktionskette in der Wundantwort ausmacht. In der Tomate wird die chloroplastidäre Lipoxygenase hochreguliert, wenn die Pflanze verwundet wird, während /Araό/cfops/s-Pflanzen, die durch Cosuppression mit einer spezifischen chloroplastidären Lipoxygenase inhibiert sind, nach Verwundung keinen Anstieg an JA-Konzentrationen als Wundantwort verzeichneten. Außerdem, unterstreicht die strikte räumliche und zeitliche Regulierung des zweiten Enzymes des Biosyntheseweges, der AOS, die Bedeutung der Aktivierung entsprechender Enzyme der JA-Biosynthese in der Akkumulierung von JA während der Wundantwort in Arabidopsis. Da die AOC das Enzym ist, welches jenen Schritt in der Biosynthese von JA katalysiert, bei dem die „richtige", natürlich vorkommende stereoi- somere Form gebildet wird, war es interessant zu wissen, ob die Expression der AOC zu einem Anstieg der JA-Konzentrationen nach Verwundung beitrug. Wie in Fig. 6 gezeigt, steigt in Tomatenblättern der Spiegel an AOC mRNA 30 min nach Verwundung der Tomatenblätter. Die maximale Induktion konnte nach zwei Stunden beobachtet werden, und nach 8 Stunden war die Kontrollmenge erneut erreicht. Dieses Ergebnis korreliert gut mit den JA-Mengen, die nach Verwundung gemessen wurden und die ebenso eine transiente Akkumulierung mit einem Anstieg nach 1 Stunde aufwiesen. Dieses Ergebnis beweist eine wichtige physiologische Funktion der AOC in der Regulierung der JA-Konzentrationen während der Wundantwort in Tomatenpflanzen.
Eine weitere höchst wichtige Funktion der AOC scheint in dem Einfluß auf die Entwicklung von Blütenorganen zu liegen. Eine hohe Expression konnte in Stempelgewebe, reifen Blütenpetalen, roten Früchten und, in geringerer Menge, in Staubgefäßen nachgewiesen werden. Hingegen wurde in jungen sich entwickelnden Blütenknospen keine Expression detektiert. Mutanten, die in der JA-Signaltrans- duktionskette defekt sind, wie z.B. Arabidopsis coil oder die fadZ-2 fad7-2 fadQ Mutanten, sind männlich steril. Dies zeigt die Bedeutung von JA in der Blütenentwicklung. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass AOS-Gene (die Synthasegene) stark in Blütenorganen von Arabidopsis thaliana exprimiert werden, was nahelegt, dass JA möglicherweise in Blüten synthetisiert wird. Es konnte auch die gewebespezifische Expression des AOC-Gens in Leitbündeln, und, um so erstaunlicher, in Samenanlagen junger Tomatenblüten durch immunocytochemische Analyse gezeigt werden. Die Rolle der AOC und JA in der Blütenentwicklung beruht im wesentlichen auf der strikten Korrelation der AOC-Expression und dem Anstieg der JA-Mengen. Durch die Ergebnisse von Vick und Zimmermann sowie von Hamberg (Vick, B. A. & Zimmermann, D. C. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 111 , 470-477; Hamberg, M. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 543-550) wurden die weiteren an der JA-Biosynthese beteiligten Enzyme identifiziert. In den letzten zehn Jahren haben die Charakterisierung und die Klonierung dieser Enzyme gute Fortschritte gemacht, und es stehen jetzt Klone von LOX (Rosahl, S. (1996) Z. Naturforsch. 51c, 123-138), AOS (Song, W. C. & Brash, A. R. (1991) Science 253, 781-784; Laudert, D., Pfannschmidt, U., Lottspeich, F., Holländer-Czytko, H. & Weiler, EW. (1996) Plant Mol. Biol. 31 , 323-335) und OPDA-Reduktasen (Schaller, F. & Weiler, E. W. (1997) J. Biol. Chem. 272: 28066-28072; Biesgen, C. & Weiler, E. W. (1999) Planta 208: 155-163) zur Verfügung. Mit der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Isolierung eines cDNA-Klons, der für die AOC kodiert, sind nun alle Enzyme, die zu dem ersten physiologisch aktiven Cyclopentenon, OPDA, führen, kloniert. Zusätzlich erscheint dieses Enzym von besonderer Bedeutung, weil es maßgeblich die Stereochemie der Cyclopentanone bestimmt und eine entscheidende Rolle in der Steuerung eines der möglichen Oxylipin-Biosynthesewege, die zur Biosynthese von Jas- monaten führen, spielt. Unter Nutzung dieses AOC-Klones sowie der anderen Enzyme sind nun intensive physiologische Studien möglich, wie auch biotechnologische Anwendungen hinsichtlich des Jasmonat-Biosyntheseweges.
Pflanzenmaterial
Um Gene zu identifizieren, die für die AOC kodieren, wurde unterschiedliches Material herangezogen. Pflanzenmaterial von Gerste (Hordeum vulgäre L.cv. Salome) und Tomate (Lycopersicon esculentum Mil. cv. Moneymaker) wurde in Erde unter Gewächshausbedingungen mit 16 Stunden Licht (mit einer minimalen Intensität von 130 μmol • m"2 • s"1) bei 25°C angezogen. Primärblätter der Gerstepflanzen wurden 7 Tage nach Keimung geerntet, in 5 cm lange Segmente geschnitten, gemessen von 1 cm unterhalb der Blattspitze. Diese Blattstücke wurden in Petrischalen in einer 1 molaren Sorbitlösung inkubiert. Tomatenpflanzen wurden für 8 Wochen angezogen, das Sekundärblatt abgeschnitten, mit einem fabriküblichen Zahnrädchen verwundet und anschließend in destilliertem Wasser unter kontinuierlichem weißen Licht (bei einer Intensität von 120 μm • m"2 • s"1)) inkubiert. Analyse endogener JA- und OPDA-Mengen
Um die Konzentration von nichtveresterter 12-oxo-PDA und Linolensäure sowie die sterische Analyse von 12-oxo-PDA quantitativ zu bestimmen, wurden nichtverwundete Blätter von Tomatenpflanzen (15 bis 20 g) bzw. Blätter (3-5g), die zuvor verwundet wurden, als Ausgangsmaterial verwendet. Das Gewebe wurde schockgefroren in flüssigem Stickstoff und anschließend mit Ethanol extrahiert. Es wurde Deuterium-markierte 12-oxo-PDA ([2H5]-12-oxo-PDA) und Deuterium-markierte Linolensäure ([2H5]-Linolensäure) zu kleinen Portionen des Extrakts zugegeben. Anschließend wurden die Mengen der 12-oxo-PDA und Linolensäure über massen- spektrometrische Methoden bestimmt. Verbleibende Portionen des Extrakts, die nicht mit den markierten Substanzen versetzt wurden, wurden einer Festphasenextraktion unterzogen und über RP-HPLC aufgetrennt. Die so isolierte 12-oxo-PDA wurde einer sterischen Analyse, unterzogen. Die JA-Mengen wurde bestimmt gemäß der Methode wie bei Kramell et al. FEBS Lett. 414, S. 197, (1997) beschrieben.
ENZYMASSAY
Die AOS-Aktivität wurde in 50 mM Kaliumphosphat mit pH 6,7 in einem Gesamtvolumen von 1 ml gemessen. Die Reaktion wurde durch den Zusatz des Fettsäurehydroperoxids gestartet, und die Abnahme der Absorption bei 235 nm wurde gemessen. Für die Bestimmung der kinetischen Parameter der AOS aus Mais wurde die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit bei 14 Konzentrationen in dem Bereich von 5 bis 90 μm für jedes Substrat bestimmt. Die Km und v aχ-Werte wurden mit Hilfe der Michaelis-Menten Gleichung direkt berechnet und gemäß dem Diagramm von Eadie-Hofstee aufgetragen. ANALYSE DER ZYKLISIERUNGSPRODUKTE DER ALLENOXIDE
Fettsäurehydroperoxide (150 μm) wurden bei 0°C für 10 min. mit 0,5 ml einer Suspension aus Maissamenmembranen (0,5 mg Protein; 28 nkat unter Verwendung von 13 (S)-HPOT als Substrat) in 0,1 m Kaliumphosphatpuffer pH 6,7 und 2,5 ml der AOC-Präparation in Ammoniumsulfat/20 mm tris-HCL-Puffer pH 7,5 (Gesam- tassay volumen: 5 ml) gerührt. Die Aktivitäten der AOC aus Mais bzw. Kartoffeln, die diesen Assay zugesetzt wurden, waren äquivalent zu 178 nmol PDA bzw. 156 nmol PDA, wie mittels der auf RP-Radio-HPLC basierenden Methode gemessen. Kontrollen, bei denen die AOC-Lösung durch Kaliumphosphatpuffer ersetzt wurde, wurden parallel durchgeführt. Die Inkubationen wurden durch den Zusatz von 10 ml Ethanol beendet und die Reaktionsprodukte wurden mit Diethylether extrahiert, methyliert und der TLC (mit dem Lösungsmittelsystem: Ethylacetat/Toluol 15:18 vol/vol.) unterzogen. Die Banden wurden unter UV-Licht sichtbar gemacht nach Besprühen mit 2-6-Dichlorflureszein, und der Rf-Wert der Zyklopentenonbande (der Methylester der 12-Oxo-PDA und seine Homologe und Analoge) wurde aufgezeichnet. Eine breite Zone des Silikatgels enthaltend Banden auf Grund des Methylesters von Zyklopentenon, Hydroxyfettsäure und α-Ketol wurde abgekratzt und mit Ethyl- acetat verdünnt. Ein Aliquot des Materials wurde trimethylsilyliert und einer Analyse mittels GLC und GC-MS unterzogen. Der verbleibende Teil des Materials wurde für sterische Analysen der Zyklopentenone verwendet, (vergl. Hamberg, M. und Fahlstadius, P. in Arch. Biochem. Biophys. 276, Seiten 518 bis 526 von 1990 und Hamberg, M. et al., in Lipids 23, Seiten 521 bis 524 von 1988).
UBEREXPRESSION DER ALLENOXIDCYCLASE
Sowohl die gesamte kodierende Region inklusive des Startcodons wie auch eine 5'-deletierte Version des Klons, startend mit Nukleotid 235 (Fig. 2), wurden via PCR amplifiziert, mit 5'Nde\- bzw. 3'£coRI-Restriktionsschnittstellen versehen und in die Expressionsvektoren pJC20 bzw. pJC40 (Clos und Brandau Protein. Expr. Purif. 5, S. 133, 1994) kloniert. Die erhaltenen Plasmide wurden in den Bakterienstamm BL21DE3(pLysS) transformiert. Die Anzucht der Bakterien erfolgte in LB-Medium bis zu einem Wert von 0,5, gemessen bei einer OD von 600 nm. Die Bakteriensuspension wurde durch 1 mM IPTG für 4 Stunden induziert, dann zentrifugiert, zwei Gefrier- und Tauzyklen unterworfen und anschließend durch Ultraschall in 20 mM Tris-HCI pH 7,5, 0,5 M NaCI, 0,1% Tween 20 und 10% Glycerol lysiert. Nach einer weiteren Zentrifugation wurden die Überstände für eine Messung der AOC-Aktivität weiter verwendet. Die Enzymaktivität wurde einerseits gemessen über einen radioaktiven Assay gemäß der Methode, wie unten näher angegeben, sowie durch Bestimmung der enantiomeren Zusammensetzung von OPDA. Die Hybridisierungsbe- dingungen waren wie folgt: Es wurde unter Verwendung der Expression Hyb™ Hybridisierungslösung von Clontech (USA) bei 60°C für 18 h hybridisiert und anschließend 30 min. mit 2xSSC, 0,1% SDS bei 50°C gefolgt von 30 min. 1xSSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen. Das durch den Expressionsvektor pJC40 expri- mierte rekombinante Protein wurde über Affinitätschromatographie auf einer Ni- Nitrilotriessigsäure-Agarose (NiNTA, Qiagen) gereinigt. Die Reinheit des Proteins wurde über SDS-PAGE-Gelelektrophorese kontrolliert. Anschließend wurde das gereinigte rekombinante AOC-Enzym zur Herstellung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers verwendet.
NORTHERN UND SOUTHERN BLOT-ANALYSE
Die Northern Blot-Analyse erfolgte nach Maniatis et al. Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual, Cold Spring Harbour (1989) mit 10 μg Gesamt-RNA pro Spur. Die erhaltenen Blots wurden bei 65°C für 16 Stunden mit einer radioaktiv markierten Probe des Tomaten-AOC-cDNA-Klons, bestehend aus der Vollängen-cDNA- Sequenz (siehe Fig. 2), hybridisiert. Bevorzugt ist eine Hybridisierung mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 bei 2xSSC, 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise für mindestens 30 min. Eine etwas stringentere, ebenfalls bevorzugte Hybridisierung erfolgt bei 1xSSC, 0,1 % SDS bei 50°C. Besonders bevorzugt ist eine Hybridisierung, bei der die Express Hyb™ Hybridisierungslösung von Clontech (USA) eingesetzt wird, wobei für 18 h bei 60°C hybridisiert wird und anschließend bei 30 min. mit 2xSSC, 0,1% SDS bei 50°C gefolgt von 30 min. IxSSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen wird. Eine gleichmäßige Gelbeladung der Proben wurde über die Ethidiumbromid- Färbung der ribosomalen RNA kontrolliert.
Für die Southern Blot-Analyse wurden 10μg genomische DNA mit den angezeigten Restriktionsenzymen verdaut und mittels Gelelektrophrese aufgetrennt. Nach Vakuumtransfer auf eine Nylonmembran erfolgte die Hybridisierung wie oben für den Northern-Blot beschrieben.
IMMUNOCYTOCHEMIE
Es wurden kleine Stücke junger Blätter nach Huse et al (1996) Plant Cell Physiol. 37 641 - 649 fixiert, in PEG eingebettet und geschnitten. Schnitte, die 2 μm dick waren, wurden mit einem Kaninchen-anti-AOC-Antikörper (in der Verdünnung 1:2000) behandelt. Es folgte eine weitere Inkubation mit einem Ziegen-anti-Kaninchen-lgG- Antikörper, konjugiert mit BODIPY (Molecular Probes, Eugene, OR). Nach der Immunmarkierung wurden die Schnitte in Citifluor/Glycerol inkubiert. Es wurden Kontrollexperimente mit dem prä-lmmunserum durchgeführt. Die Fluoreszenz des Immuno-markierten AOC-Enzyms wurde mit einem Zeiss "Axioskop" Epifluoreszenz- Mikroskop sichtbar gemacht unter Einsatz der entsprechenden Filterkombination.
KLONIERUNG DER AOC
Zur RNA-Isolierung wurden Gewebe eingesetzt, in denen die endogene JA-Konzen- tration aufgrund von Induktion akkumuliert. So wurden Sorbit-gestreßte Blätter aus Gerste (Lehmann et al., Planta 197 S. 156, 1995) sowie verwundete Tomatenblätter (Pena-Cortes et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, S. 4106, 1995) als Ausgangsmaterial zur weiteren RNA-Isolierung eingesetzt. Während bei Gerste keine spezifischen PCR-Produkte erhalten werden konnten, wurde nach RT-PCR mit RNA von verwundeten Tomatenblättern eine schwache Bande von etwa 900 bp Fragmentgröße amplifiziert. Dieses PCR-Produkt wurde als Sonde für den Screen der Tomaten- cDNA-Bank eingesetzt, der zur Isolierung eines 1 kb großen cDNA-Klones führte. Diese Größe korrespondierte in etwa mit der Signalgröße, die in den Northern Blot- Analysen detektiert werden konnte. Hieraus konnte gefolgert werden, dass es sich bei der Isolierung um einen Vollängen-Klon handelte. Das erste Startcodon ist an Position 47 lokalisiert, und es geht ihm ein Stopcodon in Position 16 voraus. Die Protein-kodierende Region umfaßt 732 bp, die für ein Protein von 244 Aminosäuren mit einer kalkulierten Molekulargewichtsmasse von 26 kDa kodieren (Fig. 2). Die Abweichung von etwa 4 kDa des abgeleiteten Molekulargewichts von dem Protein aus Tomate wurde bestimmt durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese und könnte, zumindest teilweise, das Resultat von posttranslationalem Entfernen von Aminosäuren am N-Terminus des Tomatenproteins sein.
UBEREXPRESSION DER AOC
Um das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Protein, kodiert durch die beschriebene Nukleinsäure, als ein AOC-Protein zu identifizieren, wurden Überexpressionsversuche zur AOC-Aktivitätsmessung durchgeführt. Zunächst wurde die gesamte kodierende Region ohne das Startcodon für Methionin in den Expressionsvektor pJC20 kloniert und zur weiteren Aufreinigung in den mit einem Histidin- schwanz versehenen Vektor pJC40 eingebracht. Das fehlende Methionin wurde über eine 5'Λ/cfel-Restriktionsschnittstelle ergänzt. Nach Induktion mittels IPTG konnte lediglich eine schwache Expression des rekombinanten Proteins auf einem SDS-PAGE-Gel beobachtet werden. Jedoch konnte nach säulenchromatographi- scher Reinigung (NiNTA) des mit einem Histidinschwanz versehenen Proteins eine Bande von etwa 26 kDa detektiert werden. Jedoch zeigten weder der Rohextrakt der Bakterien noch das aufgereinigte Protein AOC-Aktivität. Das Fehlen der enzymatischen Aktivität im Vollänge-Klon aus Tomate könnte ein Resultat aus der falschen posttranslationalen Modifizierung in den Bakterien sein. Um diese Möglichkeit näher zu untersuchen, wurde ein Fragment der Tomatensequenz amplifiziert, welches für ein trunkiertes Protein kodiert, das am Aminosäurerest 64 beginnt. Auch hier wurde das Startcodon über eine Λ/cfel-Restriktionsschnittstelle ergänzt. Nach entsprechender Induktion der Bakterien wurde eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese durchgeführt und ergab eine deutliche Bande bei 22 kDa, die nicht in den Kontrollbakterien, welche nur mit einem leeren Vektor transformiert worden waren, detektiert werden konnte (Fig. 3). Die gleiche Bande wurde ebenso in nichtinduzierten Bakterien festgestellt, was an einer nicht ausreichenden Repression des bakteriellen Expressionssystems in Abwesenheit von Induktionsmolekülen liegen könnte. Alle Bakerienextrakte wurden anschließend auf AOC-Aktivität hin untersucht. Wie in Tabelle 1 , siehe unten, gezeigt, konnte in den Kontrollbakterien keine Aktivität nachgewiesen werden, während in den induzierten transformierten Bakterien eine hohe spezifische Aktivität von etwa 15000 nMol OPDA/mg Protein detektiert werden konnte. Wie vom Proteinmuster des SDS-PAGE-Gels erwartet, zeigten auch die nichtinduzierten Bakterien AOC-Aktivität, jedoch war diese etwa 10fach geringer als bei den induzierten Bakterien zu messen war. Die AOC-Aktivität des rekombinanten Proteins war sensitiv gegen Proteinase-K- Verdau und konnte durch 12,13- Epoxyoctadecensäure, einem spezifischen AOC-lnhibitor, gehemmt werden, was weiterhin die Spezifität des rekombinanten Proteins unterstützt. Eine spezifische Eigenschaft der AOC-Reaktion ist die konkurrierende Reaktion zwischen der chemischen Aufspaltung des instabilen Allenoxidsubstrats, resultierend in einem racemi- schen Gemisch von OPDA, und der enzymatischen Umwandlung zu enantiomerer OPDA. Daher kann ein Protein letztendlich nur als AOC identifiziert werden, wenn das spezifische Enantiomer 9(S),13(S)-OPDA gebildet und nachgewiesen wurde.
Die sterische Analyse der Reaktionsprodukte ergab, dass das rekombinante Protein nahezu ausschließlich besagtes 9(S),13(S)-Enantiomer der OPDA gebildet hatte. Die Durchführung eines Proteinase-K-Verdaus und die Zugabe von 12,13- Epoxyoctadecensäure verringerten die Konzentration dieses OPDA-Enantiomers hin zu einer Konzentration, die auch nach chemischer Aufspaltung des instabilen Allenoxids beobachtet werden konnte. Alles in allem zeigten die Ergebnisse der AOC-Aktivitätsmessungen, dass der isolierte Klon aus Tomate für eine AOC kodiert. Interessanterweise war die spezifische Aktivität des N-terminalen mit einem Histi- dinschwanz versehenden Proteins etwa 20fach geringer als die eines vergleichsweise untersuchten Proteins ohne Histidinschwanz. Zusammen mit der Beobachtung, dass nur das trunkierte Protein hohe Aktivität zeigte, scheint es wahrscheinlich, dass zusätzliche Aminosäuren im N-Terminus die Bildung des Proteindimers möglicherweise stören könnten.
Intrazelluläre Lokalisierung der AOC
Es wurde berichtet, dass die meisten Enzyme des Oxylipinbiosynthesewegs im Chloroplasten lokalisiert sind. Eine N-terminale Aminosäuresequenzanalyse der klonierten LOXs aus Gerste (Vörös et al., Eur. J. Biochem. 251 , S. 36, 1998), Arabidopsis (Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, S. 8675, 1995) und Tomate (Heitz et al., Plant Physiol 114, S. 1085, 1997) wie auch teilweise durchgeführte Importstudien in Chloroplasten zeigten sowohl das Vorhandensein als auch die Funktion von putativen chloroplastidären Signalpeptiden. Auch die AOS aus Flachs (Song et al., Proc. Natl. Acad. Sei 90, S 8519, 1993) und Arabidopsis (Laudert et al., Plant. Mol. Biol., 31, S. 323, 1996) wiesen mögliche chloroplastidäre Signalpeptide auf und konnten genau wie die AOS aus Gerste zusammen mit Chloroplasten aufgereinigt werden. Enzymaktivitäten von LOX, Hydroperoxidlyase und AOS konnten durch biochemische Daten in der äußeren Hüllmembran von Chloroplasten nachgewiesen werden (Blee und Joyard, Plant Physiol. 110, S. 445, 1996). Im Falle der AOS und LOX konnte deren chloroplastidäre Lokalisierung auch immunocytochemisch bestätigt werden. Die Untersuchung der N-terminalen Region der AOC aus Tomate erbrachte zudem weitere strukturelle Daten für ein chloroplastidäres Signalpeptid. Dieses ist reich an Serinresten (26 % in den ersten 50 Aminosäuren), dem Startcodon für Methionin folgt ein Alaninrest, und die ersten zehn Aminosäuren besitzen keinen geladenen Aminosäurerest. Eine Computeranalyse der ersten 100 Aminosäuren unter Verwendung des Chlorop V1.1-Programmes erbrachte eine mögliche chloroplastidäre Lokalisierung des Proteins mit einer putativen Schnittstelle zwischen Position 93 und 94. Diese putative Schnittstelle ist aus verschiedenen Gründen allerdings höchst unwahrscheinlich. Andere abgeleitete mögliche Schnittstellen könnten Aminosäurereste in den Positionen 41, 53 und 60 darstellen. Um die Lokalisierung der AOC experimentell nachzuweisen, wurde ein immunocy- tologischer Versuch mit dem Antikörper gegen die rekombinante AOC durchgeführt. Querschnitte aus Tomatenblättern wurden hierzu mit diesem Antikörper inkubiert und zeigten eine signifikante Fluoreszenz in den Chloroplasten (Fig. 4). Die Autofluoreszenz der Chloroplasten wurde durch Gewebequerschnitte gezeigt, die ohne den ersten Antikörper behandelt wurden. Dies bestätigt die Daten der Sequenzanalyse, die andeuteten, dass die AOC ein chloroplastidäres Protein sei. Im Gegensatz zur AOS, die in der äußeren Hüllmembran von Chloroplasten lokalisiert ist, ist die AOC ein lösliches Protein. Da das Substrat höchst instabil ist, scheint es nahezuliegen, dass die AOC in Nähe zur AOS vorliegt, um eine effiziente Substratumwandlung zu 9(S),13(S)-OPDA zu gewährleisten. Zudem konnten bisher weder Ketole noch racemische OPDA in Pflanzen detektiert werden, was nahelegt, dass der chemische Abbau des Allenoxids nicht in vivo passiert. Um diesen Punkt näher zu untersuchen, wurden Mengen und Stereokonfiguration von endogener 12-oxo-PDA in Tomatenblättern bestimmt. In einem repräsentativen Experiment mit unverwundeten Blättern wurden Konzentrationen der nichtveresterten 12-oxo-PDA und Linolensäure von 2 ng/g bzw. 206 ng/g Frischgewicht gemessen. Die sterische Analyse erbrachte, dass die Mengen an OPDA nahezu komplett (>99 %) aus dem natürlich vorkommenden 9(S),13(S)-Enantiomer gebildet wurde. Die Mengen an OPDA und Linolensäure stiegen auf 187 ng/g (90fach) bzw. 1813 ng/g (9fach) innerhalb 30 bzw. 180 min. nach mechanischer Gewebeverwundung. Die sterische Analyse von wundinduzierter OPDA zeigte die ausschließliche Bildung (>99 %) zu dem 9(S),13(S)-Stereoisomer. Daraus könnte gefolgert werden, dass die AOS und AOC entweder räumlich sehr benachbart im Chloroplasten lokalisiert sind oder sogar lose assoziiert im Chloroplasten vorliegen.
Bestimmen der Enzymaktivität der AOC
Der Reaktionsansatz bestand aus dem in 50 mM Tris-HCI (pH 7,5) resuspendierten 100.000 g Pellet des untersuchten Gewebehomogenats mit einer AOS-Aktivität von 7 nkat und der zu untersuchenden Probe. Das Volumen wurde auf 625 μl mit 50 mM Tris-HCI (pH 7,5) aufgefüllt und die Enzymreaktion durch Zugabe von 2,6 μl 10 mM [1-1 C]13(S)-HPOT gestartet (Endkonzentration 41 μM; 0,83 kBq [0,022 μCi]). Der Ansatz wurde 10 Min auf Eis inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 750 μl MeOH gestoppt, das Reaktionsgemisch mit 2 N HCI angesäuert und die Produkte mit 4 ml Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde eingedampft und der Rückstand in 110 μl Acetonitril/H2O/HOAc (55/45/0,02 Vol./Vol./Vol.) aufgenommen. Die HPLC-Trennung der Reaktionsprodukte erfolgte isokratisch (Aceto- nitril/H2O/HOAc 55/45/0,02 Vol./Vol./Vol.) an einer Eurospher 100 C18-Säule (5 μm, 200 x 4,6 mm; Knauer Berlin) bei einer Flußrate von 1 ml/min. Die Quantifizierung der Produkte erfolgte durch die Messung der Radioaktivität mittels einer mit Festszintillator gefüllten Durchflußzelle (Yttriumsilikat 0,4 ml, RSM 100 Radioactivity Monitor Analyer, Raytest Isotopenmeßgeräte GmbH, Strubenhardt). Die Menge an OPDA wurde zum einem mit der Peakfläche des α-Ketols und zum anderen mit der Summe aller auf dem Chromatogramm erscheinenden Peakflächen ins Verhältnis gesetzt und die AOC-Aktivität wie folgt berechnet:
(rM<~ ) -_ WLpDA / total X
PDA I a_Ketol wobei "X" die Menge an Hydroperoxid (in mmol) ist, die in den Test eingesetzt wurde und "total" die Summe aller auf dem Chromatogramm erscheinenden Peaks darstellt. Als Ergebnis dieser Gleichung erhält man die Menge an OPDA, die enzyma- tisch entstand und damit den Wert für die AOC-Aktivität mit der Einheit [nmol OPDA].
Um die isomere und enantiomere Zusammensetzung der OPDA zu bestimmen, wurde der AOC-Enzymtest mit nichtradioaktiv markierter 13(S)-HPOT durchgeführt. Zur Bestimmung des c.s-/?ra/7s-lsomerenverhältnisses der OPDA wurden die methy- lierten Reaktionsprodukte über GC an einer SPB-1 Säule (30 m, 0,25 mm, Besich- tung 0,25 μm; Supleco, Deisenhofen) getrennt. Die Injektionstemperatur betrug 100°C, die bei 15°C/min auf 175°C erhöht wurde. Nach 2 min bei 175°C wurde die Temperatur bei 2,5°C/min auf 230°C erhöht.
Zur Bestimmung des Enantiomerenverhältnisses der OPDA wurden die extrahierten Reaktionsprodukte zunächst für 10 min bei 190°C erhitzt und durch Zugabe von 1 ml etherischem Diazomethan in die Methylester überführt. Die Trennung der Methylierungsprodukte erfolgte an einem HP 6890 GC-System (Hewlett Packard) an einer Megadex-5 GC-Säule (12 m, 0,25 mm, Beschichtungsdicke 0,25 μm) bei einem Heliumfluß von 2 ml/min. Die Temperatur bei der Injektion betrug 150°C, die für die ersten 15 min konstant blieb und nachfolgend bei 1 °C/min auf 200°C erhöht wurde. Tabelle 1: AOC-Aktivität und Zusammensetzung der OPDA, wie sie mittels der rekombinanten AOC erhalten wurde

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäure, die für ein Protein mit der Aktivität der Allenoxidcyclase aus der Jasmonatbiosynthese kodiert, ausgewählt aus
a) Nukleinsäure, die erhältlich ist durch Screenen einer pflanzlichen Genbank mit einer Sonde und Selektion auf Allenoxidcyclase-positive Klone;
b) Nukleinsäure, die für ein Protein mit der Sequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nrn. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 kodiert;
c) Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach b) hybridisiert;
d) Nukleinsäure, die unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes mit einer Nukleinsäure nach b) hybridisieren würde;
e) Durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen erhaltener Derivate einer Nukleinsäure nach a) bis d);
f) Nukleinsäure mit mindestens 53 %, vorzugsweise mindestens 70 % Identität zum kodierenden Bereich der Nukleinsäure gemäß SEQID Nr.;
g) Komplementäre Nukleinsäure zu einer Nukleinsäure nach einer der Gruppen a) bis f).
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie die kodierende Sequenz gemäß einer der Sequenzen ausgewählt aus einer der SEQ ID Nrn. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 umfasst oder davon durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen abgeleitetes Derivat.
3. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie für eine Proteinsequenz ausgewählt aus einer der SEQ ID Nrn. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 kodiert.
4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine DNA, vorzugsweise eine cDNA, ist.
5. Fragment einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens 10 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 50 Nukleotide, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 Nukleotide umfasst.
6. Fragment nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es in Anti- sinnorientierung zu einem Promotor die Expression einer Allenoxidcyclase in einer Wirtszelle hemmen kann.
7. Konstrukt enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder ein Fragment nach einem der Ansprüche 5 oder 6 unter der Kontrolle von die Expression regulierenden Elementen, vorzugsweise eines Promotors.
8. Konstrukt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Nukleinsäure bzw. das Fragment in Antisinnorientierung zu dem regulatorischen Element befindet.
9. Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es als Plasmid vorliegt.
10. Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder ein Fragment nach einem der Ansprüche 5 oder 6 und/oder ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 9.
11. Wirtszelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählt wird aus Bakterien, Hefezellen, Pflanzenzellen, Tierzellen und/oder humanen Zellen.
12. Pflanzenzelle und/oder Pflanzengewebe und/oder Pflanzenorgan und/oder Samen und/oder Pflanze enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder ein Fragment nach einem der Ansprüche 5 o- der6 und/oder ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 9.
13. Wirtszelle und/oder Samen und/oder Pflanzenzelle und/oder Pflanzengewebe und/oder Pflanzenorgan und/oder transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure bzw. das Fragment bzw. das Konstrukt in einer Stelle des Genoms integriert ist, die nicht seiner natürlichen Position im Wildtyp entspricht.
14. Protein erhältlich durch Expression einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einer Wirtszelle.
15. Fusionsprotein, umfassend das Protein nach Anspruch 14.
16. Fusionsprotein nach Anspruch 15, wobei der Fusionspartner des Proteins nach Anspruch 15 aus dem Jasmonat-Biosyntheseweg ausgewählt werden aus:
a) Allenoxidsynthasen und b) Reduktasen
17. Antikörper, der mit einem Protein nach einem der Ansprüche 14-16 reagiert.
18. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze und/oder Pflanzenzelle und/oder Pflanzengewebes und/oder Pflanzenorgans umfassend die folgenden Schritte:
- Einbringen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder eines Fragments nach einem der Ansprüche 5 oder 6 in eine Pflanzenzelle; und
- Regenerieren einer Pflanze und/oder Pflanzenzelle und/oder Pflanzengewebes und/oder Pflanzenorgans aus der transformierten Pflanzenzelle.
19. Verfahren zum Beeinflussen der Allenoxidcyclaseaktivität einer Pflanzenzelle, von Samen und/oder eines Pflanzengewebes und/oder Pflanzenorgans und/oder einer Pflanze umfassend den Schritt:
- Einbringen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder eines Fragments nach einem der Ansprüche 5 oder 6 in eine Pflanzenzelle und/oder in einen Samen und/oder in ein Pflanzengewebe und/oder Pflanzenorgan und/oder in eine Pflanze.
20. Verfahren zur selektiven Herstellung von 9S/13S (c7s(+))-12- Oxophytodiensäure in der Jasmonsäurebiosynthese umfassend die folgenden Schritte:
- Einbringen und Expression einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine geeignete Wirtszelle. - Einbringen und Expression einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zusammen mit Nukleinsäuren, kodierend für Lipoxy- genasen und Allenoxidsynthasen, in eine geeignete Wirtszelle.
21. Verfahren zur Herstellung von Jasmonsäure umfassend den Schritt:
- Herstellen des Vorläufermoleküls 9S/13S (c/s(+))-12-Oxophytodien- äure nach Anspruch 20.
22. Verwendung einer Pflanzenzelle nach Anspruch 11 zur Herstellung ganzer Pflanzen.
23. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur I- solierung homologer Sequenzen aus Pflanzen.
24. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Expression einer Allenoxidcyclase in pro- und/oder eukaryotischen Zellen.
25. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 unter der Kontrolle eines regulatorischen Elements in Antisinnorientierung zum Hemmen der Expression einer Allenoxidcyclase in pro- und/oder eukaryotischen Zellen.
26. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung transgener Nutzpflanzen mit veränderten Eigenschaften, wobei die veränderten Eigenschaften insbesondere ausgewählt werden aus:
a) Erhöhte Pathogenabwehr;
b) Erhöhte Abwehr gegen Herbivore; c) Optimierte Pflanze-Nutzinsekt-Schädling-Interaktion;
d) Erhöhte Biomassebildung;
e) Veränderter Kohlenhydrathaushalt;
f) Veränderter Stickstoffhaushalt;
g) Erhöhte Bildung sekundärer Naturstoffe, insbesondere Alkaloide und/oder Phytoalexine;
h) Optimierter UV-Schutz;
i) Veränderte männliche Sterilität;
I) Veränderte Entwicklungsprozesse, insbesondere in der Blütenentwicklung und/oder der Samenbildung und/oder der Keimung.
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