DE60114620T2

DE60114620T2 - Verwendung von Cellulosesulfat und anderen sulfatierten Polysacchariden zur Vorbeugung und Behandlung von Papilloma-Virus-Infektionen

Info

Publication number: DE60114620T2
Application number: DE60114620T
Authority: DE
Inventors: C. Thomas USHER; A. Robert ANDERSON; Lourens J. D. Zaneveld
Original assignee: Polydex Pharmaceuticals Ltd; Rush University Medical Center
Current assignee: Polydex Pharmaceuticals Ltd; Rush University Medical Center
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2021-06-30
Also published as: US20050143342A1; US7078392B2; WO2002002189A2; CA2414320C; US7226914B2; ATE308329T1; WO2002002189A3; US20050203055A1; US20030181415A1; ES2253395T3; US7235536B2; DK1296691T3; AU2001268884A1; CA2414320A1; EP1296691B1; EP1296691A2; DE60114620D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Vorbeugung und Behandlung von Infektionserregern und betrifft insbesondere die hemmende Aktivität von Cellulosesulfat und anderen sulfatierten Polysacchariden gegen Papilloma-Virus.
Hintergrund
Die US-PS 4,840,941 (941) beschreibt hemmende Wirkungen von bestimmten sulfatierten Polysacchariden auf das verkapselte Retrovirus, humanes T-Zell-lymphotrophes Virus-III (jetzt bekannt als HIV-1 (humanes Immunodefizienz-Virus-1)). Wie in der US-PS 5,288,704 beschrieben, sind sulfatierte Polysaccharide auch dafür bekannt, wirksam gegen verschiedene andere verkapselte Viren und insbesondere Herpes Simplex-Virus (HSV) zu sein. Das 941-Patent beschreibt jedoch, dass die hemmenden Eigenschaften von sulfatierten Polysacchariden gegen HIV-1 deutlich unterschiedlich von den Aktivitäten von Polysaccharidsulfaten gegen das Herpesvirus sind. Da verschiedene Viren grundsätzlich unterschiedliche Eigenschaften haben können, muss ein sulfatiertes Polysaccharid, das wirksam gegen ein Virus ist, nicht wirksam gegen ein anderes Virus sein.
Während für die Bindung von humanen Papilloma-Virus-ähnlichen Teilchen (VLPs) an HaCaT-Zellen gezeigt wurde, dass sie durch Heparin und Dextransulfat gehemmt wird (Joyce et al. The L1 Major Capsid Protein of Human Papillomavirus Type 11 Recombinant Virus-like Particles Interacts with Heparin and Cell-surface Glycosaminoglycans on Human Keratinocytes. The Journal of Biological Chemistry, 1999, Band 274, Nr. 9, 26. Februar, Seiten 5810–5822), spiegeln Studien mit VLPs keine Papilloma-Virus-Infektion wider und es ist nicht bekannt, dass sulfatierte Polysaccharide eine Papilloma-Virus-Infektion hemmen können. Der Papilloma-Virus unterscheidet sich vom HSV und HIV dadurch, dass er keine Kapsel hat, und er unterscheidet sich von Retroviren wie HIV, da es ein DNA-Virus ist und nicht auf das Enzym reverse Transkriptase zur Replikation angewiesen ist. Dieser Unterschied kann die Resistenz des Papilloma-Virus gegen Nonoxynol-9 erklären, einem allgemein verwendeten Spermizid, für das gezeigt worden ist, dass es sowohl HIV als auch HSV hemmt (Hermonat, P. L., Daniel, R. W. und Shah, K. V. The spermicide nonoxynol-9 does not inactivate papillomavirus Sex. Transm. Dis. 1992; 19: 203–205).
Papilloma-Viren infizieren basale Zellen des Epithels und induzieren schuppenartige epitheliale und fibroepitheliale Tumore, z.B. Warzen (Papillome) und Condylome, und können zu malignen epithelialen Läsionen führen (Tzenan Giroglou, et al. Human Papillomavirus Infection Requires Cell Surface Heparan Sulfate, Journal of Virology, Februar 2001, Seiten 1565–1570). Genitale humane Papilloma-Virus-Infektionen stellen eine der häufigsten durch Sexualität übertragenen Krankheiten (STDs) dar und eine Papilloma-Virus-Infektion der vaginalen Schleimhaut bei Frauen ist mit Gebärmutterhalskrebs in Verbindung gebracht worden. Gebärmutterhalskrebs stellt die zweithäufigste Ursache für Krebs-bedingte Tode bei Frauen dar und ist verantwortlich für mehr als 200 000 Todesfälle pro Jahr weltweit (Pisani, P., Parkin, D. M. und Ferlay, J. Estimates of the worldwide mortality from eighteen major cancers in 1985. Implications for prevention and projections of future burden. International Journal of Cancer 55: 891–903. 1993).
Bis heute sind sehr wenige Reagenzien mit mikrobiozidaler Aktivität gegen humane Papilloma-Virus (HPV)-Infektionen beschrieben worden. Diese umfassen Reagenzien, die spezifisch auf HPVs abzielen, wie monoklonale Antikörper mit Virusneutralisierender Aktivität (Christensen, N. D., N. M. Cladel und C. A. Reed, 1995. Postattachment neutralization of papillomaviruses by monoclonal and polyclonal antibodies. Virology 207: 136–142; Christensen, N. D., J. W. Kreider, N. M. Cladel, S. D. Patrick und P. A. Welsh. 1990. Monoclonal antibody-mediated neutralization of infectious human papillomavirus type 11. J. Virol. 64: 5678–5681) und Virus-unspezifische Mittel wie Povidon-Iod (Sokal, D. C. und P. L. Hermonat. 1995. Inactivation of papillomavirus by low concentrations of povidone-iodine. Sex Transm. Dis. 22: 22–24), Alkylsulfate und Monocaprin (Howett, M. K., E. B. Neely, N. D. Christensen, B. Wigdahl, F. C. Krebs, D. Malamud, S. D. Patrick, M. D. Pickel, P. A. Welsh, C. A. Reed, M. G. Ward, L. R. Budgeon und J. W. Kreider. 1999. A broad-spectrum microbicide with virucidal activity against sexually transmitted viruses. Antimicrob. Agents Chemo ther. 43: 314–321; Howett, M. K., Wigdahl, B., Malamud, D., Christensen, N. D., Wyrick, P. B., Krebs, F. C. und Catalone, B. J. Alkyl sulfates: a new family of broad spectrum microbicides. XIII International AIDS Conference, 707–712. 2000. Durban, South Africa, Monduzzi Editore). Einige Reagenzien mit mikrobiozidaler Aktivität gegen eine breite Auswahl an STDs haben sich als unwirksam gegen Papilloma-Viren erwiesen, wie C31G und das vorstehend genannte Nonoxynol-9. Manche dieser Mittel rufen außerdem eine signifikante zelluläre Cytotoxizität hervor. Eine wirksame Behandlung oder Vorbeugung gegen eine Papilloma-Virus-Infektion ist momentan nicht erhältlich.
Cellulosesulfat, ein sulfatiertes Polysaccharid, kann durch verschiedene bekannte Verfahren der Sulfatierung von Cellulose synthetisiert werden und kann leicht kommerziell erhalten werden. Es wurde berichtet, dass sulfatierte Cellulose HIV-Aktivitäten in vitro hemmt (Yamamoto et al., Carbohydrate Polymers 14 (1990) 53–63). Die US-PS 6,063,773 (773) beschreibt die hemmenden Wirkungen von Cellulosesulfat auf HIV und HSV und beschreibt weiterhin, dass es zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen bakterielle Infektionen verwendet werden kann. Das 773-Patent beschreibt außerdem, dass Cellulosesulfat das Empfängnisrisiko verringern kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung basiert in Teilen auf der unerwarteten Erkenntnis, dass Cellulosesulfat wirksam gegen eine Papilloma-Virus-Infektion ist.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung die Behandlung einer, die Hemmung einer oder die Vorbeugung gegen eine Papilloma-Virus-Infektion bei einem Patienten, der eine solche Behandlung, Hemmung oder Vorbeugung benötigt. Die Erfindung stellt die Verwendung einer wirksamen Menge eines sulfatierten Polysaccharids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Hemmung oder Vorbeugung einer Papilloma-Virus-Infektion bei einem Patienten bereit, der eine solche Behandlung, Hemmung oder Vorbeugung benötigt, wobei das sulfatierte Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cellulosesulfat, Dextransulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Pentosansulfat, Fucoidin, Mannansulfat, Carrageenan, Dextrinsulfat, Curdlansulfat, Chitinsulfat, Heparin und Heparinsulfat. Die Behandlung, Hemmung oder Vorbeugung umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge des sulfatierten Polysaccharids wie Cellulosesulfat und Dextransulfat.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Vorbeugung oder Hemmung einer malignen epithelialen Läsion, einschließlich Gebärmutterhalskrebs, bei einem Patienten, der eine solche Vorbeugung oder Hemmung benötigt. Die Erfindung stellt die Verwendung einer wirksamen Menge eines sulfatierten Polysaccharids zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Hemmung einer malignen epithelialen Läsion, einschließlich Gebärmutterhalskrebs, bei einem Patienten bereit, der eine solche Vorbeugung oder Hemmung benötigt, wobei das sulfatierte Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cellulosesulfat, Dextransulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Pentosansulfat, Fucoidin, Mannansulfat, Carrageenan, Dextrinsulfat, Curdlansulfat, Chitinsulfat, Heparin und Heparinsulfat. Die Vorbeugung oder Hemmung umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge des sulfatierten Polysaccharids wie Cellulosesulfat und Dextransulfat.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Man hat festgestellt, dass Cellulosesulfat und Dextransulfat wirksam bei der Hemmung einer Papilloma-Virus-Infektion sind. Ein sulfatiertes Polysaccharid wie Cellulosesulfat und Dextransulfat kann daher zur Vorbeugung, Hemmung oder Behandlung von durch Papilloma-Virus ausgelösten Infektionen verwendet werden. Da eine Papilloma-Virus-Infektion mit malignen epithelialen Läsionen, einschließlich Gebärmutterhalskrebs, zusammenhängt, kann des weiteren ein sulfatiertes Polysaccharid wie Cellulosesulfat oder Dextransulfat durch die Vorbeugung gegen eine Papilloma-Virus-Infektion auch gegen diese Läsionen, einschließlich Gebärmutterhalskrebs, vorbeugen. Da diese Verbindungen Papilloma-Virus wirksam inaktivieren können, können sie außerdem diese Läsionen, einschließlich Gebärmutterhalskrebs, durch die Hemmung der Verbreitung des Infektionserregers hemmen.
Cellulosesulfat mit einem weiten Molekulargewichtsbereich (Mr) kann verwendet werden. In einer Ausführungsform kann Cellulosesulfat mit einem durchschnittlichen Mr-Wert größer als etwa 500 000 Dalton verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform kann Cellulosesulfat mit einem durchschnittlichen Mr-Wert von etwa 1–2 Millionen Dalton verwendet werden. Der Grad der Sulfatierung des Cellulosesulfats liegt vorzugsweise über 12% und am meisten bevorzugt bei etwa 17–18%, was einer maximalen Sulfatierung entspricht. Cellulosesulfat in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes, z.B. Natriumcellulosesulfat, kann auch verwendet werden. Andere pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen unter anderem Kalium-, Lithium- und Ammoniumcellulosesulfat.
Cellulosesulfat in einer wirksamen Menge kann in einer geeigneten Dosierungsform abhängig von der Verabreichungsstelle verabreicht werden. Eine "wirksame Menge" bezeichnet eine Menge, die wirksam bei Dosierungen und für Zeitspannen ist, die nötig sind, um das erwünschte therapeutische Ergebnis zu erhalten, wie die Vorbeugung oder Hemmung von Papilloma-Virus-Infektionen. Die wirksame Menge kann abhängig von verschiedenen Faktoren wie der zu behandelnden Infektion und dem Krankheitszustand, dem Alter, dem Geschlecht und dem Gewicht des zu behandelnden Individuums variieren. Während die wirksame Menge leicht bestimmt werden kann, empfehlen die Studien bisher, dass die besten Ergebnisse mit etwa 0,1 bis 200 mg/ml Cellulosesulfat, vorzugsweise 1 bis 100 mg/ml und mehr bevorzugt 50 bis 100 mg/ml erreicht werden können.
Eine wirksame Menge an Cellulosesulfat kann an den Bereich oder die Bereiche verabreicht werden, die mit dem Infektionserreger in Kontakt gekommen sind oder von denen dies erwartet wird. Zum Beispiel kann Cellulosesulfat zur Vorbeugung, Hemmung oder Behandlung von vaginalen Infektionen oder zur Vorbeugung oder Hemmung von Gebärmutterhalskrebs als Gele, Schaume, Suppositorien, Creme oder Aerosole in die Vaginalhöhle unter Verwendung von geeigneten Applikatoren verabreicht werden. Cellulosesulfat kann auch in das Rektum oder unter Verwendung von geeignetem verzehrbaren Kapseln und Aromastoffen in den Mund oder in die Vaginalhöhle von einem oder mehreren Sexualpartnern verabreicht werden, ungeachtet, ob eine Infektion bekannt ist oder nicht, um die Übertragung während vaginalem oder analem Geschlechtsverkehr oder Oralsex vorzubeugen oder zu hemmen. Cellulosesulfat kann vor, während oder nach der sexuellen Aktivität verabreicht werden, was eine weitere Flexibilität und leichte Verwendung bietet. Wenn es nach der sexuellen Aktivität verabreicht wird, können die besten Ergebnisse unmittelbar nach der sexuellen Aktivität erhalten werden. Zur Vorbeugung oder Hemmung von malignen epithelialen Läsionen kann Cellulosesulfat topisch auf die Haut z.B. als Creme oder Gel aufgetragen werden. Cellulosesulfat kann auch als eine orale Dosierungsform, z.B. in Form einer Tablette, verabreicht werden.
Geeignete dem Fachmann bekannte Träger oder Verdünnungsmittel können bei der Herstellung einer geeigneten Dosierungsform kombiniert werden und Patienten, die die Behandlung erhalten, können in bekannter Weise auf deren Wirksamkeit hin beobachtet werden.
Im Falle eines Gels kann Cellulosesulfat mit Glycerin und geeigneten Konservierungsstoffen wie Methylparaben und Propylparaben kombiniert werden. Andere geeignete Exzipienzien können auch zugegeben werden, z.B. ein Dickungsmittel wie Hydroxyethylcellulose. Wenn Cellulosesulfat auf der Haut verwendet wird, kann es einfach mit Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einer Pufferlösung gemischt und als Gel aufgetragen werden.
Eine Phase I-Sicherheitsstudie zeigt, dass Cellulosesulfat, das nicht cytotoxisch ist, besser als Nonoxynol-9, ein cytotoxisches Mittel, das häufig in spermiziden Gelen gefunden wird, und so gut wie oder sogar besser als K-Y Jelly, ein Gleitmittel, vertragen wird. Cellulosesulfat bietet einen weiteren Vorteil dadurch, dass Irritationen durch ein cytotoxisches Mittel Läsionen bewirken kann, die eine Infektion fördern können, und das die Verwendung von Cellulosesulfat nicht mit solchen Infektionsrisiken verbunden ist.
Dextransulfat mit einem breiten Mr-Bereich kann wie für Cellulosesulfat beschrieben in ähnlichen Dosierungsformen verabreicht werden. In einer Ausführungsform kann Dextransulfat mit einem durchschnittlichen Mr-Wert größer als etwa 500 000 verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform kann der Mr-Wert bei etwa 1 bis 2 Millionen liegen. Die wirksame Menge kann abhängig von verschiedenen Faktoren, einschließlich den bereits beschriebenen, variieren und kann leicht bestimmt werden. In einer Ausführungsform können etwa 0,1 bis 200 mg/ml Dextran, bevorzugt etwa 1 bis 100 mg/ml und mehr bevorzugt 50 bis 100 mg/ml verabreicht werden.
Während die erfindungsgemäße Verwendung oder Verabreichung von Cellulosesulfat und Dextransulfat beschrieben worden ist, können andere sulfatierte Polysaccharide in ähnlicher Weise in ähnlichen Dosierungsformen entsprechend der Erfindung verabreicht werden. Vorzugsweise hat das sulfatierte Polysaccharid einen Mr-Wert von etwa 15 000 bis 3 Millionen. Vorzugsweise ist der Mr-Wert größer als etwa 500 000. Das Polysaccharid kann ein Homo- oder Heteropolysaccharid, vorzugsweise ein Homopolysaccharid wie Cellulosesulfat und Dextransulfat, mit monomeren Einheiten sein, die aus entweder Aldo-, Desoxyaldo-, Keto- oder Desoxyketopentosen bestehen, einschließlich in nicht beschränkender Weise Arabinose, Ribose, Desoxyribose, Galactose, Fructose, Sorbose, Rhamnose und Fucose, verbunden durch entweder alpha- oder beta-Bindungen. Das Polymer kann linear oder verzweigt sein und die freien Hydroxylgruppen der monomeren Einheiten können ma ximal oder teilweise sulfatiert sein. Vorzugsweise sind die Hydroxylgruppen maximal sulfatiert. Die monomeren Einheiten können ferner durch die Anwesenheit von Carboxyl-, Amino- und Estergruppen modifiziert sein. Geeignete sulfatierte Polysaccharide umfassen Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Pentosansulfat, Fucoidin, Mannansulfat, Carrageenan, Dextrinsulfat, Curdlansulfat, Chitinsulfat, Heparin und Heparinsulfat, die alle käuflich erworben werden können.
Die Ausdrücke Cellulosesulfat, Dextransulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Pentosansulfat, Fucoidin, Mannansulfat, Carrageenan, Dextrinsulfat, Curdlansulfat und Chitinsulfat sollen in ihrem Umfang pharmazeutisch verträgliche Salze davon beinhalten. In gleicher Weise beinhaltet der Ausdruck sulfatierte Polysaccharide in seinem Umfang pharmazeutisch verträgliche Salze davon. Während menschliche Patienten als Personen betrachtet werden, die eine erfindungsgemäße Vorbeugung, Hemmung oder Behandlung benötigen, sind außerdem andere Säuger, die anfällig für eine ähnliche Infektion (und Läsionen im Falle einer Papilloma-Virus-Infektion) sind, auch Patienten für solche Vorbeugung, Hemmung oder Behandlung.
BEISPIEL 1
Hemmung von Rinder-Papilloma-Virus (BPV)
Cellulosesulfat wurde mittels eines Zellfokusbildungstests auf seine Fähigkeit getestet, BPV-Infektionen zu hemmen (siehe Hermonat et al. (1992) für eine Beschreibung dieses Tests). Die Ergebnisse sind nachstehend gezeigt. Cellulosesulfat von Dextran Products Limited (hot 80971 in Form von Natriumcellulosesulfat, bekannt als Ushercell J.) wurde mit BPV Typ I (erhalten von Rinder-Fibropapillomen) vor Zugabe des Virus zu der Maus-Fibroblastenzelllinie C127 gemischt oder wurde zuerst mit diesen Wirtszellen vor Zugabe des Virus gemischt. In einer Molekulargewichtsuntersuchung lag der Mr-Bereich des Cellulosesulfats bei etwa 750 bis 20,3 Millionen mit einem durchschnittlichen Mr-Wert von etwa 1,01 Millionen. Der bei der HPLC sichtbare Mr-Peak lag etwa bei 2,77 Millionen. In einer weiteren Untersuchung wurde das durchschnittliche Molekulargewicht mit etwa 1,9 Millionen mit einem Mr-Peak bei etwa 2,3 Millionen bestimmt. Soweit nicht anders gekennzeichnet, wird der Mr-Wert in Dalton angegeben. TABELLE A

^A Geringe Monolayer-Unterbrechung
^B Monolayer mit etwa 80%iger Konfluenz; unterbrochen

Die Ergebnisse zeigen eine Dosis-abhängige Antwort und die Bildung von onkogenen Foci durch das Virus wird bei 500 μg/ml vollständig gehemmt, wenn Cellulosesulfat mit dem Virus oder mit den Wirtszellen gemischt wird.
Der Test wurde unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen an Cellulosesulfat wiederholt und die Ergebnisse sind nachstehend gezeigt.
TABELLE B
Eine vollständige Hemmung wurde nur bei 40 μg/ml gesehen, wenn das Cellulosesulfat mit den Wirtszellen vorinkubiert wurde, obwohl eine teilweise Hemmung bei diesem Dosierungsgrad beobachtet wurde, wenn es zuerst mit dem Virus gemischt wurde. Bei 200 μg/ml wurde eine fast vollständige Hemmung der Infektion erhalten, wenn Cellulosesulfat mit dem Virus vor der Zugabe zu den Wirtszellen vorinkubiert wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cellulosesulfat eine Infektion hemmt, sowohl wenn es zuerst zu dem Virus gegeben wird, als auch wenn es zuerst zu den Wirtszellen gegeben wird, obwohl es dazu neigt, etwas wirksamer zu sein, wenn es zuerst zu den Wirtszellen gegeben wird.
Bei einer ähnlichen Untersuchung unter Verwendung des BPV-1-Fokus-bildenden Tests wurde die Wirkung von Cellulosesulfat und Dextransulfat auf BPV getestet. Bei dieser Untersuchung war das getestete Cellulosesulfat wie vorstehend beschrieben. Das verwendete Dextransulfat war von Dextran Products Limited (Lot DSM – 122), hergestellt unter Verwendung von Dextran mit einem durchschnittlichen Mr-Wert von etwa 500 000 (basierend auf der Viskosität), und es wurde geschätzt, dass es einen endgültigen durchschnittlichen Mr-Wert größer als etwa 500 000 hat, der bei etwa 1 bis 1,1 Millionen liegen kann.
Die mikrobiozidale Aktivität der Verbindungen wurde unter Verwendung des gutcharakterisierten BPV-1-Fokus-bildenden Tests (Dvoretzky, I., R. Shober, S. K. Chattopadhyay und D. R. Lowy. 1980. A quantitative in vitro focus assay for bovine papilloma virus. Virology 103: 369–375) mit Modifikationen des Mikrobiozidtests (Hermonat, P. L. (1992) supra; Howett, M. K. et al (1999) supra) getestet. Die Ausdrücke hemmende oder mikrobiozidale Aktivität, wenn verwendet, sollen sich allgemein auf eine Mikroben-Infektions- und/oder eine Mikroben-inaktivierende Wirkung beziehen.
Aliquote von BPV-1 mit etwa 100–200 Fokus-bildenden Einheiten wurden 10 Minuten mit Verdünnungen der Verbindungen bei 37°C vor der Zugabe zu den Kulturen von Maus C127-Zellen vorinkubiert. Kulturen an C127-Zellen wurden in T25-Gewebekulturflaschen (Corning, New York) mit 3 × 10⁵ Zellen pro Flasche angesetzt. Virus-Verbindungsgemische von insgesamt 50 μl wurden dann in 1 ml Medium zu den Flaschen gegeben und zusätzlich wurden 3 ml Medium nach 24 Stunden Kultivierung zugegeben. Das Medium wurde alle 3 bis 4 Tage in einer Zeitspanne von 2 Wochen ausgetauscht. Foci wurden nach Anfärbung der Monolayer mit Kristallviolett und mikroskopischer Zählung der gefärbten Foci ausgezählt. Jede Verbindungskonzentration wurde doppelt getestet und die durchschnittliche ±SD (Standardabweichung) der Foci-Zahl für die vorinkubierte Virus-Medikament-Konzentration für jede Verbindung ist nachstehend als Tabelle C gezeigt.
TABELLE C Hemmende Wirkung von Cellulosesulfat und Dextransulfat bei Mischen mit dem Rinder-Papilloma-Virus vor Zugabe des Gemisches zu Wirtszellen
Die mikrobiozidale Aktivität der Verbindungen wurde auch durch Vorinkubation der Zellen mit den Verbindungen gefolgt von der Zugabe von Virus zu den Verbindungs-beschichteten C127-Zellen getestet. Bei diesen Experimenten wurden Verdünnungen der Verbindungen zu Kulturen von C127-Zellen gegeben, dieses wurden für eine Stunde bei 37°C inkubiert und dreimal mit Medium zur Entfernung der ungebundenen Verbindung vor der Zugabe von etwa 100 Fokus-bildenden Einheiten an BPV-1 gewaschen. Die Kulturen wurden für eine weitere Stunde inkubiert und dreimal zur Entfernung des ungebundenen Virus gewaschen, dann wurde die Inkubation für zwei Wochen mit Mediumwechsel alle drei bis vier Tage fortgeführt und die Foci wurden wie vorstehend beschrieben, gezählt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle D gezeigt.
TABELLE D Hemmende Wirkung von Cellulosesulfat und Dextransulfat bei Mischen mit Zielzellen gefolgt von Waschen der Zellen und Zugabe des Rinder-Papilloma-Virus
Die Ergebnisse von Tabelle C zeigten, dass beide Verbindungen mikrobiozidale Aktivität gegen BPV-1 zeigen. 10 bis 100 μg/ml CS zeigten mittlere bis hohe Hemmung der Papilloma-Virus-Infektiosität bei Verwendung der C127-Zelllinie mit vollständiger Hemmung bei 1 mg/ml. DS zeigte mittlere Hemmung bei 100 μg/ml und sehr hohe Hemmung bei 1 mg/ml. Klone wurden von der parentalen C127-Zelllinie wegen dem anhaltenden Unvermögen von BPV-1, nach einigen Zellpassagen der unklonierten parentalen Zelllinie Foci zu induzieren, abgeleitet. Ein Klon, genannt C127-D10, der nach BPV-1-Infektion Foci produzierte, wurde für einen Wiederholungstest der Verbindungen ausgewählt. Als dieser Klon für mikrobiozidale Aktivität getestet wurde, wurde weniger Verbindung zum Erreichen einer hohen Verringerung der durch BPV-1 hervorgerufenen Foci verglichen mit den unklonierten parentalen C127-Zellen benötigt.
Vorinkubation von C127-D10-Zellen mit Verbindungen vor der Zugabe von BPV-1 wurde getestet, um zu bestimmen, ob sich die mikrobiozidalen Wirkungen von CS und DS auf eine Blockade der Virus-Interaktion mit den Zelloberflächen erstreckten. Bei diesen Experimenten wurden Titrationen der Verbindungen zu Zellkulturen gegeben, gefolgt von Wegwaschen des ungebundenen Reagenzes vor der Zugabe des Virus. Nach einstündiger Inkubation mit Virus wurde das ungebundene Virus durch Waschen entfernt und die Kulturen wurden nach zwei Wochen auf Fokusbildung untersucht.
Diese Ergebnisse (Tabelle D) zeigten, dass diese Reagenzien etwas Behinderung des Virus mit den Wirtszelloberflächen zeigten, wie bewiesen durch eine Dosis-abhängige Verringerung der durch BPV-1 hervorgerufenen Foci. DS zeigte eine stärkere Behinderung mit erheblicher Verringerung der Foci bei Dosen von 10 μg/ml. Im Gegensatz dazu zeigte CS nur schwache mikrobiozidale Wirkungen, wenn C127-D10-Zellen mit dieser Verbindung vorbehandelt wurden, außer bei einer Konzentration von 10 mg/ml. Der Unterschied dieser Ergebnisse im Vergleich zu der früheren Untersuchung ist wahrscheinlich auf die Tatsache begründet, dass in der früheren Untersuchung ungebundenes Cellulosesulfat nicht vor der Zugabe des Virus weggewaschen wurde. Da Cellulosesulfat oder ein anderes sulfatiertes Polysaccharid bei der, z.B. vaginalen, Verabreichung in der Vaginalhöhle verbleiben sollte, stellen die früheren Ergebnisse eher die in vivo-Wirkungen dar und es wird erwartet, dass die Verbindung in vivo einen Papillomavirus sowohl durch direkte Assoziation als auch durch Behinderung der Virusanhaftung an Zellen inaktiviert.
BEISPIEL 2
Hemmung von humanem Papilloma-Virus (HPV)
Cellulosesulfat und Dextransulfat wurden jeweils als eine 2 mg/ml-Lösung in 0,9% NaCl hergestellt und auf mikrobiozidale Aktivität unter Verwendung des in vitro HPV-Testes für transiente Infektion ursprünglich beschrieben von Smith und Kollegen (Smith, L. H., C. Foster, M. E. Hitchcock und R. Isseroff. 1993. In vitro HPV-11 infection of human foreskin, J. Invest. Dermatol. 101: 292–295) mit einigen Modifikationen (Ludmerer, S. W., W. L. McClements, X. M. Wang, J. C. Ling, K. U. Jansen und N. D. Christensen. 2000. HPV11 mutant virus-like particles elicit immune responses that neutralize virus and delineate a novel neutralizing domain. Virology 266: 237–245) getestet. Eine ELISA-basierte Ausgabe von optische Dichte (OD)-Werten unter Verwendung der Spaltung des Substrates p-Nitrophenylphosphat durch alkalische Phosphatase wurde auch verwendet, um eine HPV-Infektion zu messen wie nachstehend beschrieben.
Bei dem Standard-RT-PCR-Test (Ludmerer, S. W. et al., supra; Smith, L. H. et al supra; Smith, L. H., C. Foster, M. E. Hitchcock, G. S. Leiserowith, K. Hall, R. Isseroff, N. D. Christensen und J. W. Kreider, 1995. Titration of HPV-11 infectivity and antibody neutralization can be measured in vitro. J. Invest. Dermatol. 105: 438–444) zur Detektion einer HPV-11-Infektion, wurden Aliquote an HPV-11 (10 μl) mit Verdünnungen von Verbindungen (40 μl) für 30 Minuten bei 37°C vorinkubiert und dann wurden die Gemische zu Kulturen von humanen A431-Zellen gegeben. Replizierte Kulturen von A431-Zellen wurden durch Ausplattieren von 5 × 10⁵ Zellen (in 1 ml Gewebekulturmedium) pro Well in 6-Well-Kulturplatten angesetzt. Virus-Verbindungsgemische wurden zu einzelnen A431-Kulturen zugegeben und die Kulturen wurden für weitere vier Tage inkubiert (nach Übernachtinkubation wurden zusätzlich 2 ml des Kulturmediums zu jeder Kultur zugegeben). Zellen wurden in 1 ml Trizol (GIBCO/BRL) geerntet und dann wurde die Gesamt-RNA für die RT und zur Herstellung von viraler cDNA aus gespleißten viralen Transkripten, die eine Hauptspleißstelle zwischen E1 und E4 überspannen, hergestellt (Ludmerer, S. W. et al., supra; Smith, L. H. et al. supra). Zwei Durchgänge einer PCR-Amplifikation unter Verwendung von verschachtelten Primern, die nach der veröffentlichten Sequenz hergestellt wurden, wurden zur Detektion des gespleißten viralen Transkriptes durchgeführt und die PCR-Produkte wurden auf Agarose-Gelen als Ethidium-gefärbte Banden detektiert (Ludmerer S. W. et al., supra; Smith, L. H. et al., supra). Die PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert, um die virale Herkunft des PCR-Produkts zu bestätigen. Die Anwesenheit des viralen PCR-Produkts mit der korrekten Größe wurde verwendet, um sowohl eine erfolgreiche Infektion durch HPV-11 als auch das Scheitern der Inaktivierung und/oder Blockade des Virus durch die Testverbindung zu bestätigen. Im Gegensatz dazu wurde das Fehlen eines viralen PCR-Produktes als Hinweis auf eine Virusinaktivierung und/oder ein Scheitern des Virus, A431-Zellen zu infizieren, interpretiert. Amplifizierte β-Actin-Transkripte (Smith, L. H., et al., supra) wurden als Kontrolle verwendet, um die Vollständigkeit der RNA-Isolation und der RT-PCR-Verfahren für nicht infizierte Zellen und für Kulturen zu begründen, in denen HPV-11-Inaktivierung erreicht wurde.
Der RT-PCR-Test zur Detektion einer HPV-40-Infektion wurde in gleicher Weise wie für die Detektion einer HPV-11-Infektion wie vorstehend beschrieben gestaltet.
Eine Modifikation des RT-PCR-Tests, die eine ELISA-basierte Ausgabe einbaut (Boehringer-Mannheim), war auch beinhaltet, um die mikrobiozidale Aktivität zu beurteilen. Replizierte Zellkulturen von A431-Zellen wurden mit einem Aliquot infektioser HPV-Virione wie vorstehend beschrieben infiziert. Nach vier Tagen Kultivierung wurden die Zellen geerntet und RNA extrahiert. Mit der RNA wurde eine RT unter Verwendung von Downstream-Antisense- (rückwärtsgerichteten) -Primern für HPV-11 oder HPV-40 und β-Actin (als ein Kontroll-/zelluläres Haushaltungstranskript) zum Einleiten der cDNA-Synthese durchgeführt. Die cDNA wurde durch zwei Sätze mit 30 Zyklen PCR-Amplifikation unter Verwendung von verschachtelten Pri mern prozessiert: der zweite Satz Zyklen verwendete Digoxygenin-(DIG)-dUTP zur Markierung der PCR-Produkte mit DIG. DIG-markierte PCR-Produkte wurden denaturiert und danach zusammen mit einem biotinylierten Oligonukleotid renaturiert, das spezifisch für das Ziel-PCR-Produkt war. Die biotinylierten Produkte wurden im ELISA mit Platten, die mit Streptavidin (zum Einfangen des biotinylierten Ziel-PCR-Produkts) beschichtet waren, sodann durch Anti-DIG-Antikörper und Substrat detektiert. Markierte PCR-Produkte wurden direkt zu den ELISA-Platten gegeben oder mit 10-facher Verdünnung als Duplikat für jede Zellkultur für jede Virus-Verdünnung titriert. TABELLE E. ELISA-RT-PCR-Detektion einer transienten Infektion von HPV-11 und HPV-40.

^a A431-Kulturen infiziert mit entweder HPV-11 oder HPV-40.
^b Volumen (μl) der Reaktionsprodukte aus dem zweiten Satz an PCR-Amplifikationsprodukten, die zu den ELISA-Wells gegeben wurden.
^c Nicht getestet.

^a

^a Zwei zusätzliche Experimente lieferten ähnliche Ergebnisse.
^b Infiziert mit HPV-11.
^c Mit Virus.
^d Infiziert mit HPV-40.
^e Nicht bestimmt.

Die mikrobiozidale Aktivität wurde entweder mittels der Detektion der Ethidium-gefärbten PCR-Produkte oder mittels einer ELISA-basierten Ausgabe wie vorstehend beschrieben beurteilt. Virus-Inaktivierung oder Fehlen einer Virus-Infektion wurde durch das Scheitern der Detektion viraler gespleißter RT-PCR-Produkte (Ergebnisse sind nicht gezeigt) und/oder das Fehlen von ELISA-Werten über dem Hintergrund bei der Verwendung des ELISA-Tests zur Detektion markierter PCR-Produkte gezeigt. Ein erstes Experiment wurde durchgeführt, um die Spezifität des ELISA-basierten RT-PCR-Tests unter Verwendung einer HPV-11- und einer HPV-40-Infektion von A431-Zellen zu testen (Tabelle E). Hochspezifische Detektion von entweder HPV-11 oder HPV-40 wurde durch die Anwesenheit von hohen ELISA-O.D.-Werten für die HPV-11-Sonde bei HPV-11-infizierten aber nicht bei HPV-40-infizierten Kulturen und umgekehrt beobachtet.
Beide Verbindungen zeigten eine starke mikrobiozidale Aktivität gegen sowohl HPV-11 als auch HPV-40 in beiden Tests und repräsentative Experimente unter Verwendung von RT-PCR-ELISA sind in Tabelle F zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigten, dass RT-PCR-Produkte aus Zellen alleine oder aus nicht-infizierten Kulturen, die mit Verbindungen behandelt worden sind, durchgehend geringe O.D.-Ausgaben bei dem ELISA-Test für die HPV-Produkte und hohe O.D.-Ausgaben für das β-Actin-Produkt zeigten. Bei HPV-11- und/oder HPV-40-Infektionen zeigten Kulturen hohe Level an ELISA-detektierbaren viralen Produkten und Zugabe von Mikrobioziden verringerten das Signal auf Hintergrund- (nicht infizierte) -Level. Für CS geschah dies bei 100 und 1000 μg/ml und für DS bei 10 und 100 μg/ml, wenn diese auf mikrobiozidale Aktivität gegen HPV-11 getestet wurden. In Tests für HPV-40-Infektiosität war CS mikrobiozidal bei 100 und 1000 μg/ml und DS bei 10 und 1000 μg/ml. Es lag keine zelluläre Cytotoxizität für jegliche dieser Dosierungen der Verbindungen vor, wie durch mikroskopische Untersuchung der Zellkulturen bestimmt wurde.

Claims

Verwendung einer wirksamen Menge eines sulfatierten Polysaccharids zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln, Hemmen oder Verhindern einer Papilloma-Virus-Infektion in einem Patienten, der eine solche Behandlung, Hemmung oder Verhinderung benötigt, wobei das sulfatierte Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cellulosesulfat, Dextransulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Pentosansulfat, Fucoidin, Mannansulfat, Carrageenan, Dextrinsulfat, Curdlansulfat, Chitinsulfat, Heparin und Heparinsulfat.
Verwendung einer wirksamen Menge eines sulfatierten Polysaccharids zur Herstellung eines Medikaments zum Verhindern oder Hemmen einer malignen Epithelläsion in einem Patienten, der eine solche Verhinderung oder Hemmung benötigt, wobei das sulfatierte Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cellulosesulfat, Dextransulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat, Pentosansulfat, Fucoidin, Mannansulfat, Carrageenan, Dextrinsulfat, Curdlansulfat, Chitinsulfat, Heparin und Heparinsulfat.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei die maligne Läsion Cervixkrebs ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das sulfatierte Polysaccharid Cellulosesulfat ist.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die Sulfatierung von Cellulosesulfat mindestens 12% beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das Cellulosesulfat maximal sulfatiert ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Cellulosesulfat einen durchschnittlichen Mr-Wert von etwa 1–2 Millionen aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das sulfatierte Polysaccharid Dextransulfat ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 oder Anspruch 8, wobei das sulfatierte Polysaccharid einen durchschnittlichen Mr-Wert von mehr als etwa 500 000 aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 9, wobei die wirksame Menge etwa 0,1 bis 200 mg/ml beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die wirksame Menge etwa 1 bis 100 mg/ml beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei die wirksame Menge etwa 50 bis 100 mg/ml beträgt.
Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Patient ein menschlicher Patient ist.