ES2253395T3

ES2253395T3 - Uso de sulfato de celulosa y otros polisacaridos sulfatados para prevenir y tratar infecciones por virus del papiloma.

Info

Publication number: ES2253395T3
Application number: ES01947089T
Authority: ES
Inventors: Thomas C. Usher; Robert A. Anderson; Lourens J. D. Zaneveld
Original assignee: Polydex Pharmaceuticals Ltd; Rush University Medical Center
Current assignee: Polydex Pharmaceuticals Ltd; Rush University Medical Center
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2021-06-29
Also published as: US20050143342A1; US20050203055A1; ATE308329T1; US20030181415A1; DE60114620D1; EP1296691A2; AU2001268884A1; DK1296691T3; US7226914B2; CA2414320C; EP1296691B1; DE60114620T2; CA2414320A1; WO2002002189A3; US7078392B2; US7235536B2; WO2002002189A2

Abstract

Uso de una cantidad eficaz de un polisacárido sulfatado para fabricar un medicamento para tratar, inhibir o prevenir una infección por virus del papiloma en un sujeto en necesidad de tal tratamiento, inhibición o prevención, en el que el polisacárido sulfatado se selecciona del grupo constituido por sulfato de celulosa, sulfato de dextrano, dermatán sulfato, condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina, manán sulfato, carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato, chitín sulfato, heparina y heparín sulfato.

Description

Uso de sulfato de celulosa y otros polisacáridos sulfatados para prevenir y tratar infecciones por virus del papiloma.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la prevención y tratamiento de agentes infecciosos y en particular, se refiere a la actividad inhibidora del sulfato de celulosa y otros polisacáridos sulfatados contra el virus del papiloma

Antecedentes

La patente de los EE.UU. nº 4.840.941 (941 en lo que sigue) describe los efectos inhibidores de ciertos polisacáridos sulfatados sobre el virus con envuelta, virus linfotrófico de células T humanas tipo III (conocido actualmente como VIH-1 (virus de inmunodeficiencia humana-1). Tal y como se describe en la patente de los EE.UU. nº 5.288.704, los polisacáridos sulfatados son conocidos también por ser eficaces contra otros virus con cubierta diferentes y en particular, el virus del herpes simple (HSV, herpes simplex virus). Sin embargo, la patente 941 describe que las características inhibidoras de los polisacáridos sulfatados contra el VIH-1 son bastantes diferentes de las actividades de los polisacáridos sulfatados contra el virus del herpes. Ya que diferentes virus pueden tener propiedades fundamentalmente diferentes, un polisacárido sulfatado que es eficaz contra un virus puede no ser eficaz contra un virus diferente.

Aunque se ha visto que la unión de las partículas del tipo virus del papiloma humano (VLP, virus-like particles) a las células HaCaT es inhibida por heparina y sulfato de dextrano (Joyce et al. The L1 Major Capsid Protein of Human Papillomavirus Type 11 Recombinant Virus-like Particles Interacts with Heparin and Cell-surface Glycosaminoglycans on Human Keratinocytes. The Journal of Biological Chemistry, 1999, volumen 274, Nº 9, 26 de febrero, pp 5810-5822), estudios con VLP no reflejan infección por virus del papiloma y no se conoce que los polisacáridos sulfatados puedan inhibir una infección por virus del papiloma. El virus del papiloma se diferencia del HSV y del HSV en que no tiene una envuelta, y se diferencia del retrovirus, como por ejemplo el VIH, en que es un virus ADN y no depende de la enzima transcriptasa inversa para la replicación. Esta diferencia puede explicar la resistencia del virus del papiloma al nonoxinol-9, un espermicida comúnmente usado que se ha visto que inhibe VIH y HSV (Hermonat, P.L., Daniel, R. W. y Shah, K. V. The spermicide nonoxinol-9 does not inactivate papillomavirus Sex. Transm. Dis. 1992; 19:203-205).

Los virus del papiloma infectan células basales de epitelios inducen tumores del epitelio estratificado y fibroepiteliales, por ejemplo, verrugas (papilomas) y condilomata, y pueden conducir a lesiones epiteliales malignas (Tzenan Giroglou, et al. Human Papillomavirus Infection Requires Cell Surface Heparan Sulfate Journal of Virology, February 2001, p. 1565-1570). Las infecciones por virus del papiloma genital humano representan una de las más frecuentes enfermedades transmitidas por vía sexual (ETS) y la infección por virus del papiloma de la mucosa vaginal en mujeres se ha asociado con el cáncer cervical. El cáncer cervical representa la segunda causa más frecuente de muertes relacionadas con cáncer en mujeres y da cuenta de 200.000 muertes al año en todo el mundo (Pisani P., Parkin, D. M., y Ferlay, J. Estimates of the worlwide mortality from eighteen major cancers in 1985. Implications for preventions and projections of future burden, Internacional Journal of Cancer 55: 891-903, 1993).

Hasta la fecha de hoy, se han descrito muy pocos reactivos con actividad microbicida contra el virus del papiloma humano (HPV, human papilloma virus). Estos incluyen reactivos específicos de HPV como por ejemplo anticuerpos monoclonales con actividad neutralizadora de virus (Christensen, N. D., N. M. Cladel, and C. A. Reed. 1995, Postattachement neutralization of papillomaviruses by monoclonal and polyclonal antibodies, Virology 207: 136-142; Christensen, N. D., J. W. Kreider, N. M. Cladel, S. D. Patrick, y P. A. Welsh. 1990. Monoclonal antibody-mediated neutralization of infectious human papillomavirus type 11, J. Virol. 64: 5678-5681) y agentes no específicos de virus, como por ejemplo el yoduro de povidona (Sokal, D. C. y P. L. Hermonat. 1995. Inactivation of papillomavirus by low concentrations of povidone-iodine. Sex. Transm. Dis. 22: 22-24) sulfatos de alquilo y monocaprina (Howett, M. K., E. B. Neely, N. D. Christensen, B. Wigdahl, F. C. Krebs, D. Malamud, S. D. Patrick, M. D. Pickel, P. A. Welsh, C. A. Reed, M. G. Ward, L. R. Budgeon y J. W. Kreider. 1999. A broad spectrum microbicide with virucidal activity against sexually transmitted viruses. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 314-321; Howett, M. K., Wigdahl, B., Malamud, D., Christensen, N. D., Wyrick, P. B., Krebs F. C. y Catalone, B. J. Alkyl sulfates: a new family of broad spectrum microbicides. XIII Conferencia Internacional contra el SIDA, 707-712. 2000. Durban, Sudáfrica, Ediciones Monduzzi). Se ha probado que varios reactivos que tienen actividad microbicida contra una amplia gama de ETS no son efectivos contra papilomavirus como por ejemplo C31G y, tal y como se menciona anteriormente, nonoxinol-9. Algunos de estos agentes inducen también una citotoxicidad celular significativa. Actualmente no hay disponible ningún tratamiento o prevención eficaz de infección por virus del papiloma.

El sulfato de celulosa, un polisacárido sulfatado, puede sintetizarse por medio de una serie de procedimientos conocidos de sulfatación de celulosa y pueden obtenerse fácilmente en el mercado fácilmente. Se ha desvelado que la celulosa sulfatada inhibe actividades VIH in vitro (Yamamoto et al., Carbohidrate Polymers 14 (1990), 53-63). La patente de los EE.UU nº 6.063.773 (773 en lo que sigue) describe los efectos inhibidores del sulfato de celulosa sobre VIH y HSV, y además describe que se puede usar para tratar o prevenir infecciones bacterianas. La patente 773 describe también que el sulfato de celulosa puede reducir el riesgo de concepción.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en parte en el hallazgo inesperado de que el sulfato de celulosa es eficaz contra la infección por virus del papiloma.

Por un lado, la presente invención se refiere a tratar, inhibir o prevenir una infección por virus del papiloma en un sujeto en necesidad de tal tratamiento, inhibición o prevención. La invención proporciona un uso de una cantidad eficaz de un polisacárido sulfatado para fabricar un medicamento para tratar, inhibir o prevenir una infección por virus del papiloma en un sujeto en necesidad de tal tratamiento, inhibición o prevención, en el que el polisacárido sulfatado se selecciona del grupo constituido por sulfato de celulosa, sulfato de dextrano, dermatán sulfato, condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina, manán sulfato, carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato, chitín sulfato, heparina y heparín sulfato. Tratar, inhibir o prevenir comprende administrar una cantidad eficaz del polisacárido sulfatado como por ejemplo sulfato de celulosa y sulfato de dextrano.

Por otro lado, la invención se refiere a prevenir o inhibir una lesión epitelial maligna, incluyendo cáncer cervical, en un sujeto en necesidad de tal prevención o inhibición. La invención proporciona un uso de una cantidad eficaz de un polisacárido sulfatado para fabricar un medicamento para prevenir o inhibir una lesión epitelial maligna, incluyendo cáncer cervical, en un sujeto en necesidad de tal prevención o inhibición, en el que el polisacárido sulfatado se selecciona del grupo constituido por sulfato de celulosa, sulfato de dextrano, dermatán sulfato, condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina, manán sulfato, carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato, chitín sulfato, heparina y heparín sulfato. Prevenir o inhibir comprende administrar una cantidad eficaz del polisacárido sulfatado como por ejemplo sulfato de celulosa y sulfato de dextrano.

Descripción detallada de la invención

Se ha encontrado que el sulfato de celulosa y el sulfato de dextrano son eficaces a la hora de inhibir una infección por virus del papiloma. Por lo tanto, puede usarse un polisacárido sulfatado como por ejemplo sulfato de celulosa y sulfato de dextrano para prevenir, inhibir o tratar infecciones provocadas por el virus del papiloma. Además, como la infección por virus del papiloma está asociada con lesiones epiteliales malignas, incluyendo cáncer cervical, un polisacárido sulfatado como por ejemplo sulfato de celulosa o sulfato de dextrano pueden también prevenir estas lesiones previniendo infección por virus del papiloma, incluyendo cáncer cervical. Además, como estos compuestos pueden inactivar de forma eficaz el virus del papiloma, pueden inhibir estas lesiones, incluyendo cáncer cervical, inhibiendo la expansión del agente infeccioso.

Puede usarse sulfato de celulosa de un amplio intervalo de peso molecular (Mr). En una realización puede usarse sulfato de celulosa de peso molecular medio mayor de aproximadamente 500.000 daltons. En otra realización puede usarse sulfato de celulosa de peso molecular medio de aproximadamente 1 a 2 millones de daltons. El grado de sulfatación del sulfato de celulosa está preferiblemente por encima de un 12% y de la forma más preferible aproximadamente un 17-18% que representa la sulfatación máxima. Puede usarse también sulfato de celulosa en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo sulfato sódico de celulosa. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otras, sulfato potásico, lítico y amónico de celulosa.

El sulfato de celulosa en una cantidad eficaz puede administrarse en una forma adecuada de dosificación, dependiendo del lugar de administración. Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz a unas dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico deseado, como por ejemplo prevenir o inhibir infecciones por virus del papiloma. La cantidad eficaz puede variar según una serie de factores como por ejemplo la infección que se está tratando, estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo que se está tratando. Aunque la cantidad eficaz puede determinarse fácilmente, los estudios hasta la fecha sugieren que los mejores resultados se pueden alcanzar con aproximadamente 1 a 200 mg/ml de sulfato de celulosa, preferiblemente 1 a 100 mg/ml, y más preferiblemente 50 a 100 mg/ml.

Puede administrarse una cantidad eficaz de sulfato de celulosa en el área o áreas que tienen o se espera que entren en contacto con el agente infeccioso. Por ejemplo, para prevenir, inhibir o tratar infecciones vaginales, o para prevenir o inhibir cáncer cervical, el sulfato de celulosa puede administrarse en forma de geles, espumas, supositorios, cremas o aerosoles en la cavidad vaginal usando aplicadores apropiados. El sulfato de celulosa puede administrarse también en el recto, o usando cápsulas comestibles adecuadas y agentes saborizantes, en la boca, o en la cavidad vaginal, de una o más parejas sexuales, sabiendo si están infectadas o no, para prevenir o inhibir su transmisión durante las relaciones vaginales o anales o el sexo oral. El sulfato de celulosa puede administrarse antes, durante o después del acto sexual, proporcionando una mayor flexibilidad y facilidad de uso. Si se administra después del acto sexual, los mejores resultados pueden lograrse inmediatamente después del acto sexual. Para prevenir o inhibir lesiones epiteliales malignas, el sulfato de celulosa puede aplicarse por vía tópica sobre la piel, por ejemplo en forma de crema o gel. El sulfato de celulosa puede administrarse también en forma de una dosificación oral, por ejemplo, en forma de un comprimido.

Pueden combinarse vehículos o diluyentes adecuados conocidos por los expertos en la técnica en la preparación de una forma de dosificación adecuada, y se puede seguir a los pacientes que reciben el tratamiento para ver su eficacia de la forma conocida.

En el caso de un gel, el sulfato de celulosa puede combinarse con glicerina y conservantes adecuados como por ejemplo metilparabeno y propilparabeno. Pueden añadirse también otros excipientes adecuados, por ejemplo, un agente espesante, como por ejemplo hidroxietilcelulosa. Si el sulfato de celulosa se usa sobre la piel, puede mezclarse simplemente en agua, solución salina o en una solución tampón y aplicarse en forma de gel.

El Estudio de Seguridad de la Fase I indica que el sulfato de celulosa que es no citotóxico se tolera mejor que el nonoxinol-9, un agente citotóxico frecuentemente encontrado en geles espermicidas, y tan bueno o incluso mejor que K-Y Jelly, un lubricante. El sulfato de celulosa ofrece una ventaja adicional en que la irritación por un agente citotóxico puede provocar lesiones que pueden facilitar una infección, y el uso de sulfato de celulosa no está asociado con tales riesgos de infección.

El sulfato de dextrano de un amplio intervalo de peso molecular, puede administrarse tal y como se describe para el sulfato de celulosa en formas de dosificación similares. En una realización, puede usarse sulfato de dextrano de peso molecular medio mayor de aproximadamente 500.000. En otra realización, el peso molecular puede ser de aproximadamente 1-2 millones. La cantidad eficaz puede variar según una serie de factores, incluyendo aquellos ya descritos y puede determinarse fácilmente. En una realización, puede administrarse aproximadamente 0,1 a 200 mg/ml de dextrano, preferiblemente aproximadamente 1 a 100 mg/ml y más preferiblemente, 50 a 100 mg/ml.

Aunque se ha descrito el uso o administración de sulfato de celulosa y sulfato de dextrano según la invención, pueden administrarse de forma similar otros polisacáridos sulfatados en formas de dosificación similares de acuerdo con la invención. Preferiblemente, el polisacárido sulfatado tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 15.000 a 3.000.000. Preferiblemente, el peso molecular es mayor de aproximadamente 500.000. El polisacárido puede ser un homo- o heteropolisacárido, preferiblemente un homopolisacárido, como son el sulfato de celulosa y el sulfato de dextrano, con unidades monoméricas constituidas por aldo-, desoxialdo-, ceto- o desoxicetopentosas, incluyendo, pero no restringido a, arabinosa, ribosa, desoxirribosa, galactosa, fructosa, sorbosa, ramnosa y mucosa, unidos por enlaces alfa o beta. El polímero puede ser lineal o ramificado, con grupos hidroxilo libres de las unidades monoméricas sulfatadas total o parcialmente. Preferiblemente, los grupos hidroxilo estás sulfatados totalmente. Las unidades monoméricas pueden modificarse adicionalmente por presencia de grupos carboxilo, amino y éster. Los polisacáridos sulfatados adecuados incluyen dermatán sulfato, condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina, manán sulfato, carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato, chitín sulfato, heparina y heparín sulfato, todos los cuales se pueden obtener comercialmente.

Se trata de que los términos, sulfato de celulosa, sulfato de dextrano dermatán dermatano, condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina, manán sulfato, carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato y chitín sulfato incluyan dentro de su alcance sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. De forma similar, el término polisacáridos sulfatados incluye dentro de su alcance sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Además, aunque se contemplan seres humanos como sujetos en necesidad de prevención, inhibición o tratamiento según la invención, otros mamíferos susceptibles de una infección similar (y lesiones en el caso de infección por virus del papiloma) son también sujetos de tal prevención, inhibición o tratamiento.

Ejemplo 1 Inhibición del virus del papiloma bovino (BPV, Bovine Papilloma Virus)

Se sometió a ensayo el sulfato de celulosa para ver su capacidad de inhibir la infección por BPV por medio de un ensayo de formación de focos de células (véase Hermonat et al. (1992) durante una descripción de este ensayo). Los resultados se muestran a continuación. El sulfato de celulosa de Dextran Products Limited (Lote 80971 en forma de sulfato sódico de celulosa, conocido como Ushercell J.) se mezcló con BPV tipo I (obtenido de fibropapilomas bovinos) antes de añadir el virus a células de la línea C127 de fibroblasto de ratón, o se mezcló con estas primeras células huésped antes de añadir el virus. En un estudio de pesos moleculares, el intervalo de pesos moleculares de sulfato de celulosa fue de aproximadamente 750 a 20,3 millones, con un peso molecular medio de aproximadamente 1,01 millones. El peso molecular máximo tal y como se ve en HPLC fue de aproximadamente 2,77 millones. En otro estudio, el peso molecular medio se determinó que era de aproximadamente 1,9 millones con un peso molecular máximo de aproximadamente 2,3 millones. A menos que se especifique de otra manera, el peso molecular es en daltons.

TABLA A

Inhibición del papilomavirus bovino tipo I por sulfato de celulosa
[Sulfato de celulosa] \mug/ml	Procedimiento de exposición del compuesto
	Preincubado con virus antes de la	Preincubado con células huésped
	adición a células huésped	antes de la adición a virus
	Focos inducidos por virus por cultivo	Focos inducidos por virus por cultivo
0	450	450
	450	450
5,0	121	72
	97	60
50	37	10
	32	12
500	0^{A}	0^{A}
	0	0
5000	0^{B}	0^{B}
	0	0
^{A}Ligera alteración de la monocapa
^{B}Monocapa a aproximadamente un 80% de confluencia; alterada

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Los resultados indican una respuesta a dosis y la formación de focos oncogénicos por el virus está completamente inhibida a 500 \mug/ml cuando el sulfato de celulosa se mezcla con el virus o con las células huésped.

El ensayo se repitió usando diferentes concentraciones de sulfato de celulosa y los resultados se muestran a continuación.

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TABLA B

Inhibición del papilomavirus bovino tipo I por sulfato de celulosa
[Sulfato de celulosa] \mug/ml	Procedimiento de exposición del compuesto
	Preincubado con virus antes de la	Preincubado con células huésped
	adición a células huésped	antes de la adición a virus
	Focos inducidos por virus por cultivo	Focos inducidos por virus por cultivo
0	240	240
	196	196
1,6	196	53
	168	13

TABLA B (continuación)

[Sulfato de celulosa] \mug/ml	Procedimiento de exposición del compuesto
	Preincubado con virus antes de la	Preincubado con células huésped
	adición a células huésped	antes de la adición a virus
	Focos inducidos por virus por cultivo	Focos inducidos por virus por cultivo
8,0	60	5
	124	3
40	116	0
	104	0
200	34	0
	42	0

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Se observó inhibición completa a 40 \mug/ml solamente cuando el sulfato de celulosa se incubó previamente con células huésped, aunque se observó inhibición parcial a ese nivel de dosis cuando se mezcló primero con el virus. A 200 \mug/ml se obtuvo la inhibición casi completa de la infección cuando el sulfato de celulosa se incubó previamente con el virus antes de la adición a las células huésped. Estos resultados muestran que el sulfato de celulosa inhibe la infección cuando se añade primero al virus o cuando se añade primero a las células huésped, aunque tiende de algún modo a ser más eficaz cuando se añade primero a las células huésped.

En un estudio similar usando el ensayo de formación de focos por BPV-1, se sometió a ensayo el efecto del sulfato de celulosa y del sulfato de dextrano sobre BPV. En este estudio, el sulfato de celulosa sometido a ensayo fue tal y como se describe anteriormente. El sulfato de dextrano usado era de Dextran Products Limited (Lote DSM-122) preparado usando dextrano de peso molecular medio de aproximadamente 500.000 (en base a su viscosidad) y se estima que tiene un peso molecular medio final mayor de aproximadamente 500.000 y puede ser aproximadamente de 1 a 1,1 millones.

La actividad microbicida de los compuestos se sometió a ensayo usando el ensayo de formación de focos por BPV-1 perfectamente caracterizado (Dvoretzky, I., R. Shober, S. K. Chattopadhyay, and D. R. Lowy. 1980. A quantitative in vitro focus assay for bovine papilloma virus. Virology. 103: 369-375), con modificaciones para ensayos microbicidas (Hermonat, P. L., (1992) supra; Howett, M. K., et al, (1999) supra). Cuando se usan los términos inhibir o actividad microbicida tratan de referirse de forma amplia a infección microbicida y/o efecto de inactivación de micro-
bios.

Se preincubaron alícuotas de BPV-1 que contenían aproximadamente 100-200 unidades formadoras de focos con diluciones de compuestos durante 10 minutos a 37ºC antes de la adición a los cultivos de células C127 de ratón. Los cultivos de células C127 se dispusieron en matraces de cultivo de tejidos T25 (Coming, Nueva York), conteniendo 3 x 10^{5} células por matraz. Las mezclas virus-compuesto en un total de 50 \mul se añadieron luego a los matraces en 1 ml de medios, y se añadieron 3 ml adicionales de medios después de 24 horas de cultivo. Los medios se cambiaron cada 3-4 días durante un período de 2 semanas. Los focos se contabilizaron después de la tinción de la monocapa con violeta de cristal y haciendo un recuento de focos teñidos microscópicamente. Cada concentración de compuestos se ensayó por duplicado, y la media \pm desviación típica del número de focos para la concentración de virus-fármaco en la preincubación para cada compuesto se muestra a continuación como Tabla C.

TABLA C

Efecto inhibidor de sulfato de celulosa y sulfato de dextrano cuando se mezclan con el virus del papiloma bovino
antes de la adición de la mezcla a las células huésped
Concentración (\mug/ml)	Media \pm desviación típica (% de control)
	Sulfato de celulosa	Sulfato de dextrano
	Línea celular C127	Clon C127-D10	Línea celular C127	Clon C127-D10
0 (control)	100	100	100	100
0,01	80 \pm 12	73 \pm 31	81 \pm 3	64 \pm 8,0
0,1	76 \pm 9	80 \pm 16	102 \pm 10	83 \pm 16
1	73 \pm 5	33 \pm 3	97 \pm 7	69 \pm 7
10	42 \pm 3	3 \pm 3	113 \pm 2	3 \pm 3
100	10 \pm 2	2 \pm 3	43 \pm 7	3 \pm 3
1.000	0	0	6 \pm 3	0
10.000	0	0	0	0

También se sometió a ensayo la actividad microbicida de los compuestos por pre-incubación de células con compuestos seguida de la adición de virus a células C127 recubiertas de compuesto. En estos experimentos, se añadieron diluciones de compuestos a cultivos de células C127, se incubaron durante 1 hora a 37ºC, se lavaron 3 veces con medios para retirar el compuesto no unido, antes de la adición de aproximadamente 100 unidades formadoras de focos de BPV-1. Los cultivos se incubaron durante 1 hora adicional, se lavaron tres veces para retirar el virus no unido, después se continuó con la incubación durante dos semanas con cambios de medios cada 3-4 días y se hizo un recuento de focos tal y como se describe anteriormente. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla D.

TABLA D

Efecto inhibidor de sulfato de celulosa y sulfato de dextrano cuando se mezclan con células diana, seguido de la
adición del lavado de células y adición del virus del papiloma bovino
Concentración (\mug/ml)	Media \pm desviación típica (focos/pocillo)
	Sulfato de celulosa	Sulfato de dextrano
0	88 \pm 15,6	115 (n = 1)
10	103 \pm 6,3	31 \pm 16,9
100	120 \pm 8,4	15 \pm 4,6
1.000	87 \pm 45,1	4 \pm 2,6
10.000	2 \pm 1,3	0

Los resultados de la Tabla C demostraron que ambos compuestos mostraban actividad microbicida contra BPV-1. De 10 a 100 \mug/ml el sulfato de celulosa mostró inhibición moderada a alta de la capacidad de infección por virus del papiloma usando la línea celular C127, con una inhibición completa a 1 mg/ml. El sulfato de dextrano mostró inhibición moderada a 100 \mug/ml y una inhibición muy alta a 1 mg/ml. Los clones derivaban de la línea celular parenteral C127 como consecuencia de los continuos problemas de BPV-1 para inducir focos después de varios pases celulares de la línea celular parenteral no clonada. Un clon, denominado C127-D10, que produjo focos tras infección por BPV-1, se eligió para un ensayo de repetición de los compuestos. Cuando se sometió a ensayo a este clon para ver la actividad microbicida, se requirió menos compuesto para lograr una considerable reducción en los focos inducidos por BPV-1 cuando se compara con las células parenterales C127 no clonadas.

Se realizó una pre-incubación de células C127-D10 con compuestos antes de la adición de BPV-1 para determinar si los efectos microbicidas del sulfato de celulosa y de sulfato de dextrano se extendían hasta un bloqueo de la interacción del virus con las superficies de las células. En estos experimentos, se añadieron dosificaciones de compuestos a los cultivos celulares seguido de la retirada por lavado del reactivo no unido antes de la adición del virus. Después de una incubación de 1 hora con virus, se retiró el virus no unido por lavado y se siguieron los cultivos para ver los focos después de dos semanas.

Los resultados (Tabla D) indicaron que estos reactivos mostraban algún interferencia del virus con las superficies de las células huésped tal y como evidenciaba una reducción dependiente de la dosis de focos inducidos por BPV-1. El sulfato de dextrano mostró una interferencia más acusada con una reducción sustancial en focos a dosis de 10 \mug/ml. Por el contrario, el sulfato de dextrano solamente mostró débiles efectos microbicidas cuando las células C127-D10 se trataron previamente con este compuesto, excepto a una concentración de 10 \mug/ml. La diferencia en los resultados vistos con el estudio anterior es probablemente debida al hecho de que en el primer estudio no se retiró por lavado el sulfato de celulosa no unido antes de la adición del virus. Aunque el sulfato de celulosa u otros polisacáridos sulfatados tras su administración, por ejemplo, por vía vaginal, deberían permanecer en la cavidad vaginal, los resultados anteriores más probables representan efectos in vivo y se espera que el compuesto in vivo inactive el virus del papiloma por asociación directa e interfiriendo con la unión del virus a las células.

Ejemplo 2 Inhibición del virus del papiloma humano (HPV, Human Papilloma Virus)

El sulfato de celulosa y el sulfato de dextrano se prepararon cada uno en forma de una solución de 2 mg/ml en NaCl al 0,9% y se sometieron a ensayo para ver su actividad microbicida usando en ensayo in vitro de infección transitoria por HPV descrito originalmente por Smith y colegas (Smith, L. H., C. Foster, M. E. Hitchcock y R. Isseroff. 1993. In vitro HPV-11 infection of human foreskin. J. Invest. Dermatol. 101: 292-295) con algunas modificaciones (Ludmerer, S. W., W. L. McClements, X. M. Wang, J. C. Ling, K. U. Jansen y N. D. Christensen. 2000. HPV11 mutant virus-like particles elicit immune responses that neutralize virus and delineate a novel neutralizing domain. Virology 266: 237-245). También se usó una lectura en base a un ELISA de unos datos de Densidad Óptica (D.O.) usando ruptura por fosfatasa alcalina del sustrato fosfato de p-nitrofenilo para medir la infección por HPV tal y como se describe anteriormente.

En el ensayo convencional de PCR-TI (PCR con transcripción inversa, Ludmerer, S. W., et al, supra; Smith L. H. et al, supra; Smith L. H., C. Foster, M. E. Hitchcock, G. S. Leiserowitz, K. Hall, R. Isseroff, N. D. Christensen y J. W. Kreider. 1995. Titration of HPV-11 infectivity and antibody neutralization can be measured in vitro. J. Invest. Dermatol. 105: 438-444) para la detección de infección por HPV-11, se pre-incubaron alícuotas de HPV-11 (10 \mul) con diluciones de compuestos (40 \mul) durante 30 minutos a 37ºC añadiéndose después las mezclas a los cultivos de células A431 humanas. Los cultivos réplica de células A431 se establecieron colocando en placas 5 x 10^{5} células (en 1 ml de medio de cultivo de tejidos) por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos. Se añadieron mezclas virus-compuesto a cultivos individuales de A431 y los cultivos se incubaron durante otros 4 días (después de incubación durante una noche, se añadieron otros 2 ml de medio de cultivo a cada cultivo). Las células se recuperaron en 1 ml de Trizol (GIBCO/BRL), después se preparó la totalidad del ARN para transcripción inversa y producción de ADNc viral a partir de transcritos víricos empalmados abarcando un mayor sitio de ayuste entre E1 y E4 (Ludmerer, S. W. et al, supra; Smith, L. H. et al, supra). Se llevaron a cabo dos ciclos de amplificación por PCR usando cebadores anidados preparados a partir de la secuencia publicada para la detección del transcrito vírico ayustado, y los productos de la PCR se detectaron como bandas teñidas con etidio sobre geles de azarosa (Ludmerer, S. W. et al, supra; Smith, L. H. et al, supra). Los productos de la PCR se clonaron y secuenciaron para confirmar el origen vírico del producto de la PCR. La presencia del producto vírico de tamaño correcto de PCR se usó para confirmar el éxito de la infección por HPV-11, así como la incapacidad para inactivar y/o bloquear el virus por el compuesto de ensayo. Por otro lado, la falta de un producto vírico de PCR se interpretó como que indicaba inactivación del virus, y/o una incapacidad del virus para infectar células A431. Los transcritos amplificados de \beta-actina (Smith, L. H. et al, supra) se usaron como control para establecer la integridad de aislamiento de ARN y de los procedimientos de PCR-TI para células no infectadas y para cultivos en los que se logró la inactivación de HPV-11.

El ensayo de PCR-TI para detectar infección por HPV-40 se diseñó de forma similar para la detección de infección por HPV-11 tal y como se describe anteriormente.

También se incluyó una modificación del ensayo de PCR-TI que incorporaba una lectura en base a un ELISA (Boehringer-Mannheim) para determinar la actividad microbicida. Se infectaron réplicas de cultivos celulares de células A431 con una alícuota de viriones de HPV infecciosos tal y como se describe anteriormente. Después de 4 días de cultivo, se recuperaron las células y se extrajo el ARN. El ARN se sometió a transcripción inversa usando cebadores anti-sentido (inversos) corriente abajo para HPV-11 o HPV-40 y \beta-actina (como control/transcrito celular de expresión general en todas las células) para iniciar la síntesis de ADNc. El ADNc se procesó a través de dos tandas de 30 ciclos de amplificación por PCR usando cebadores anidados: la segunda tanda de ciclos usando digoxigenina (DIG)-dUTP para marcar los productos de PCR con DIG. Los productos de PCR marcados con DIG se desnaturalizaron y después se renaturalizaron junto con un oligonucleótido biotinilado específico para el producto de PCR diana. Los productos biotinilados se detectaron en ELISA con placas recubiertas con estreptavidina (para capturar el producto de PCR biotinilado diana), después anticuerpos anti-DIG y sustrato. Los productos de PCR marcados se añadieron directamente a las placas de ELISA, o se valoraron en diluciones de 10 veces por duplicado para cada cultivo celular para cada dilución vírica.

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TABLA E

Detección de PCR-TI en ELISA de infección transitoria de HPV-11 y HPV-40
Condiciones de cultivo celular^{a}	Concentración de productos de PCR^{b}	Media (desviación típica) de lecturas de
		D.O. de ELISA
		Sonda de HPV-11	Sonda de HPV-40
Infección por HPV-11	10	1,827 (0,174)	-0,013 (0,000)
	1	1,540 (0,034)	NE^{c}
	0,1	0,845 (0,039)	NE

Infección por HPV-40	10	0,012 (0,002)	2,000 (0,000)
	1	NE	1,842 (0,080)
	0,1	NE	1,027 (0,028)
^{a} Cultivos de A431 infectados con HPV-11 y HPV-40
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm} Volumen (\mu l) de productos de reacción a partir de la segunda tanda de productos de amplificación por PCR añadidos a los pocillos de ELISA.\end{minipage}
^{c} No ensayado.

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TABLA F

ELISA de PCR-TI para la detección de infección transitoria de células A431 humanas con HPV-11 o HPV-40^{a}
Compuesto (\mug/ml a dosis de pretratamiento vírico)	Media (desviación típica) de lectura de D.O. para
	ELISA de PCR-TI
	Sonda de HPV-11	Sonda de \beta-actina
Experimento #1^{b}
Solo células	0,043 (0,004)	1,645 (0,052)
Sólo HPV-11	1,417 (0,063)	1,564 (0,051)
1000 \mug/ml de sulfato de celulosa (no virus)	0,028 (0,004)	1,427 (0,013)
1000 \mug/ml de sulfato de dextrano (no virus)	0,000 (0,000)	1,470 (0,001)
1000 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c}	0,038 (0,001)	1,518 (0,020)
100 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c}	0,049 (0,001)	1,532 (0,025)
10 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c}	1,485 (0,045)	1,576 (0,021)
100 \mug/ml de sulfato de dextrano^{c}	0,035 (0,000)	1,583 (0,022)
10 \mug/ml de sulfato de dextrano^{c}	0,023 (0,000)	1,636 (0,105)

TABLA F (continuación)

Compuesto (\mug/ml a dosis de pretratamiento vírico)	Media (desviación típica) de lectura de D.O. para
	ELISA de PCR-TI
	Sonda de HPV-40	Sonda de \beta-actina
Experimento #2^{d}
1000 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c}	0,037 (0,004)	N.D.^{e}
100 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c}	0,128 (0,008)	N.D.
10 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c}	0,397 (0,050)	N.D.
1000 \mug/ml de sulfato de dextrano^{c}	0,006 (0,007)	N.D
100 \mug/ml de sulfato de dextrano^{c}	0,375 (0,073)	N.D.
10 \mug/ml de sulfato de dextrano^{c}	0,042 (0,007)	N.D.
Solamente HPV-40	1,320 (0,074)	N.D.
^{a} Dos experimentos adicionales que dan resultados similares.
^{b} Infectado con HPV-11.
^{c} Con virus.
^{d} Infectado con HPV-40
^{e} No determinado

La actividad microbicida se determinó como la detección de productos teñidos de PCR o como lectura en base aun ELISA tal y como se describe anteriormente. La inactivación de los virus o la falta de infección por virus quedó en evidencia por la incapacidad para detectar productos víricos ayustados de PCR-TI (los resultados no se muestran) y/o la falta de antecedentes anteriores a los valores de ELISA cuando se usa el ensayo ELISA para detectar productos marcados de PCR. Se llevó a cabo un experimento inicial para probar la especificidad del ensayo de PCR-TI en base a un ELISA usando infección por HPV-11 y HPV-40 de células A431 (Tabla E). Se observó una detección altamente específica de HPV-11 y HPV-40 por la presencia de valores altos de D.O. para ELISA para la sonda de HPV-11 a partir de cultivos infectados por HPV-11 pero no infectados por HPV-40 y viceversa.

Ambos compuestos demostraron una importante actividad microbicida contra HPV-11 y HPV-40 en ambos ensayos y se resumen experimentos representativos usando ELISA de PCR-TI en la Tabla F. Los resultados mostraron que los productos de PCR-TI a partir de células solas o a partir de cultivos no infectados tratados con compuestos demostraron de forma consistente bajas lecturas de D.O. en el ensayo ELISA para los productos de HPV y elevadas lecturas de D.O. para el producto de \beta-actinina. Tras infección por HPV-11 y/o HPV-40, los cultivos mostraron elevados niveles de productos víricos detectables por ELISA, y la adición de microbicidas disminuyó la señal hasta señal de ruido (no infectados). Para el sulfato de celulosa, esto ocurrió a 100 y 1000 \mug/ml, y para el sulfato de dextrano a 10 y 100 \mug/ml cuando se sometieron a ensayo para ver la actividad microbicida contra HPV-11. En los ensayos para la infectividad por HPV-40, el sulfato de celulosa fue microbicida a 100 y 1000 \mug/ml y el sulfato de dextrano a 100 y 1000 \mug/ml. No hubo citotoxicidad celular para ninguna de las dosis de compuestos tal y como se determinó por examen microscópico de los cultivos celulares.

Claims

1. Uso de una cantidad eficaz de un polisacárido sulfatado para fabricar un medicamento para tratar, inhibir o prevenir una infección por virus del papiloma en un sujeto en necesidad de tal tratamiento, inhibición o prevención,

en el que el polisacárido sulfatado se selecciona del grupo constituido por sulfato de celulosa, sulfato de dextrano, dermatán sulfato, condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina, manán sulfato, carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato, chitín sulfato, heparina y heparín sulfato.

2. Uso de una cantidad eficaz de un polisacárido sulfatado para fabricar un medicamento para prevenir o inhibir una lesión epitelial maligna en un sujeto en necesidad de tal prevención o inhibición,

3. El uso según la reivindicación 2, en el que la lesión maligna es cáncer cervical.

4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polisacárido sulfatado es sulfato de celulosa.

5. El uso según la reivindicación 4, en el que la sulfatación del sulfato de celulosa es de al menos un 12%.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que el sulfato de celulosa está completamente sulfatado.

7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el sulfato de celulosa tiene un peso molecular medio de aproximadamente 1-2 millones.

8. El uso según cualquier una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polisacárido sulfatado es sulfato de dextrano.

9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o reivindicación 8, en el que el polisacárido sulfatado tiene un peso molecular medio mayor de aproximadamente 500.000.

10. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que la cantidad eficaz es de aproximadamente 0,1 a 200 mg/ml.

11. El uso según la reivindicación 10, en el que la cantidad eficaz es de aproximadamente 1 a 100 mg/ml.

12. El uso según la reivindicación 11, en el que la cantidad eficaz es de aproximadamente 50 a 100 mg/ml.

13. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sujeto es un paciente humano.