ES2253395T3 - Uso de sulfato de celulosa y otros polisacaridos sulfatados para prevenir y tratar infecciones por virus del papiloma. - Google Patents
Uso de sulfato de celulosa y otros polisacaridos sulfatados para prevenir y tratar infecciones por virus del papiloma.Info
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Abstract
Uso de una cantidad eficaz de un polisacárido sulfatado para fabricar un medicamento para tratar, inhibir o prevenir una infección por virus del papiloma en un sujeto en necesidad de tal tratamiento, inhibición o prevención, en el que el polisacárido sulfatado se selecciona del grupo constituido por sulfato de celulosa, sulfato de dextrano, dermatán sulfato, condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina, manán sulfato, carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato, chitín sulfato, heparina y heparín sulfato.
Description
Uso de sulfato de celulosa y otros polisacáridos
sulfatados para prevenir y tratar infecciones por virus del
papiloma.
Esta invención se refiere a la prevención y
tratamiento de agentes infecciosos y en particular, se refiere a la
actividad inhibidora del sulfato de celulosa y otros polisacáridos
sulfatados contra el virus del papiloma
La patente de los EE.UU. nº 4.840.941 (941 en lo
que sigue) describe los efectos inhibidores de ciertos polisacáridos
sulfatados sobre el virus con envuelta, virus linfotrófico de
células T humanas tipo III (conocido actualmente como
VIH-1 (virus de inmunodeficiencia
humana-1). Tal y como se describe en la patente de
los EE.UU. nº 5.288.704, los polisacáridos sulfatados son conocidos
también por ser eficaces contra otros virus con cubierta diferentes
y en particular, el virus del herpes simple (HSV, herpes simplex
virus). Sin embargo, la patente 941 describe que las
características inhibidoras de los polisacáridos sulfatados contra
el VIH-1 son bastantes diferentes de las
actividades de los polisacáridos sulfatados contra el virus del
herpes. Ya que diferentes virus pueden tener propiedades
fundamentalmente diferentes, un polisacárido sulfatado que es eficaz
contra un virus puede no ser eficaz contra un virus diferente.
Aunque se ha visto que la unión de las partículas
del tipo virus del papiloma humano (VLP, virus-like
particles) a las células HaCaT es inhibida por heparina y sulfato
de dextrano (Joyce et al. The L1 Major Capsid
Protein of Human Papillomavirus Type 11 Recombinant
Virus-like Particles Interacts with Heparin and
Cell-surface Glycosaminoglycans on Human
Keratinocytes. The Journal of Biological Chemistry, 1999,
volumen 274, Nº 9, 26 de febrero, pp 5810-5822),
estudios con VLP no reflejan infección por virus del papiloma y no
se conoce que los polisacáridos sulfatados puedan inhibir una
infección por virus del papiloma. El virus del papiloma se
diferencia del HSV y del HSV en que no tiene una envuelta, y se
diferencia del retrovirus, como por ejemplo el VIH, en que es un
virus ADN y no depende de la enzima transcriptasa inversa para la
replicación. Esta diferencia puede explicar la resistencia del
virus del papiloma al nonoxinol-9, un espermicida
comúnmente usado que se ha visto que inhibe VIH y HSV (Hermonat,
P.L., Daniel, R. W. y Shah, K. V. The spermicide
nonoxinol-9 does not inactivate papillomavirus
Sex. Transm. Dis. 1992; 19:203-205).
Los virus del papiloma infectan células basales
de epitelios inducen tumores del epitelio estratificado y
fibroepiteliales, por ejemplo, verrugas (papilomas) y condilomata, y
pueden conducir a lesiones epiteliales malignas (Tzenan Giroglou,
et al. Human Papillomavirus Infection Requires Cell
Surface Heparan Sulfate Journal of Virology, February 2001, p.
1565-1570). Las infecciones por virus del papiloma
genital humano representan una de las más frecuentes enfermedades
transmitidas por vía sexual (ETS) y la infección por virus del
papiloma de la mucosa vaginal en mujeres se ha asociado con el
cáncer cervical. El cáncer cervical representa la segunda causa más
frecuente de muertes relacionadas con cáncer en mujeres y da cuenta
de 200.000 muertes al año en todo el mundo (Pisani P., Parkin, D.
M., y Ferlay, J. Estimates of the worlwide mortality from
eighteen major cancers in 1985. Implications for preventions
and projections of future burden, Internacional Journal of
Cancer 55: 891-903, 1993).
Hasta la fecha de hoy, se han descrito muy pocos
reactivos con actividad microbicida contra el virus del papiloma
humano (HPV, human papilloma virus). Estos incluyen reactivos
específicos de HPV como por ejemplo anticuerpos monoclonales con
actividad neutralizadora de virus (Christensen, N. D., N. M. Cladel,
and C. A. Reed. 1995, Postattachement neutralization of
papillomaviruses by monoclonal and polyclonal antibodies,
Virology 207: 136-142; Christensen, N. D.,
J. W. Kreider, N. M. Cladel, S. D. Patrick, y P. A. Welsh.
1990. Monoclonal antibody-mediated
neutralization of infectious human papillomavirus type 11, J.
Virol. 64: 5678-5681) y agentes no
específicos de virus, como por ejemplo el yoduro de povidona (Sokal,
D. C. y P. L. Hermonat. 1995. Inactivation of papillomavirus by
low concentrations of povidone-iodine. Sex.
Transm. Dis. 22: 22-24) sulfatos de alquilo
y monocaprina (Howett, M. K., E. B. Neely, N. D. Christensen, B.
Wigdahl, F. C. Krebs, D. Malamud, S. D. Patrick, M. D. Pickel, P.
A. Welsh, C. A. Reed, M. G. Ward, L. R. Budgeon y J. W. Kreider.
1999. A broad spectrum microbicide with virucidal activity
against sexually transmitted viruses. Antimicrob. Agents
Chemother. 43: 314-321; Howett, M. K.,
Wigdahl, B., Malamud, D., Christensen, N. D., Wyrick, P. B., Krebs
F. C. y Catalone, B. J. Alkyl sulfates: a new family of broad
spectrum microbicides. XIII Conferencia Internacional contra el
SIDA, 707-712. 2000. Durban, Sudáfrica, Ediciones
Monduzzi). Se ha probado que varios reactivos que tienen actividad
microbicida contra una amplia gama de ETS no son efectivos contra
papilomavirus como por ejemplo C31G y, tal y como se menciona
anteriormente, nonoxinol-9. Algunos de estos
agentes inducen también una citotoxicidad celular significativa.
Actualmente no hay disponible ningún tratamiento o prevención
eficaz de infección por virus del papiloma.
El sulfato de celulosa, un polisacárido
sulfatado, puede sintetizarse por medio de una serie de
procedimientos conocidos de sulfatación de celulosa y pueden
obtenerse fácilmente en el mercado fácilmente. Se ha desvelado que
la celulosa sulfatada inhibe actividades VIH in vitro
(Yamamoto et al., Carbohidrate Polymers 14 (1990),
53-63). La patente de los EE.UU nº 6.063.773 (773 en
lo que sigue) describe los efectos inhibidores del sulfato de
celulosa sobre VIH y HSV, y además describe que se puede usar para
tratar o prevenir infecciones bacterianas. La patente 773 describe
también que el sulfato de celulosa puede reducir el riesgo de
concepción.
La presente invención se basa en parte en el
hallazgo inesperado de que el sulfato de celulosa es eficaz contra
la infección por virus del papiloma.
Por un lado, la presente invención se refiere a
tratar, inhibir o prevenir una infección por virus del papiloma en
un sujeto en necesidad de tal tratamiento, inhibición o prevención.
La invención proporciona un uso de una cantidad eficaz de un
polisacárido sulfatado para fabricar un medicamento para tratar,
inhibir o prevenir una infección por virus del papiloma en un
sujeto en necesidad de tal tratamiento, inhibición o prevención, en
el que el polisacárido sulfatado se selecciona del grupo constituido
por sulfato de celulosa, sulfato de dextrano, dermatán sulfato,
condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina, manán sulfato,
carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato, chitín sulfato,
heparina y heparín sulfato. Tratar, inhibir o prevenir comprende
administrar una cantidad eficaz del polisacárido sulfatado como por
ejemplo sulfato de celulosa y sulfato de dextrano.
Por otro lado, la invención se refiere a prevenir
o inhibir una lesión epitelial maligna, incluyendo cáncer cervical,
en un sujeto en necesidad de tal prevención o inhibición. La
invención proporciona un uso de una cantidad eficaz de un
polisacárido sulfatado para fabricar un medicamento para prevenir o
inhibir una lesión epitelial maligna, incluyendo cáncer cervical,
en un sujeto en necesidad de tal prevención o inhibición, en el que
el polisacárido sulfatado se selecciona del grupo constituido por
sulfato de celulosa, sulfato de dextrano, dermatán sulfato,
condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina, manán sulfato,
carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato, chitín sulfato,
heparina y heparín sulfato. Prevenir o inhibir comprende administrar
una cantidad eficaz del polisacárido sulfatado como por ejemplo
sulfato de celulosa y sulfato de dextrano.
Se ha encontrado que el sulfato de celulosa y el
sulfato de dextrano son eficaces a la hora de inhibir una infección
por virus del papiloma. Por lo tanto, puede usarse un polisacárido
sulfatado como por ejemplo sulfato de celulosa y sulfato de
dextrano para prevenir, inhibir o tratar infecciones provocadas por
el virus del papiloma. Además, como la infección por virus del
papiloma está asociada con lesiones epiteliales malignas,
incluyendo cáncer cervical, un polisacárido sulfatado como por
ejemplo sulfato de celulosa o sulfato de dextrano pueden también
prevenir estas lesiones previniendo infección por virus del
papiloma, incluyendo cáncer cervical. Además, como estos compuestos
pueden inactivar de forma eficaz el virus del papiloma, pueden
inhibir estas lesiones, incluyendo cáncer cervical, inhibiendo la
expansión del agente infeccioso.
Puede usarse sulfato de celulosa de un amplio
intervalo de peso molecular (Mr). En una realización puede usarse
sulfato de celulosa de peso molecular medio mayor de aproximadamente
500.000 daltons. En otra realización puede usarse sulfato de
celulosa de peso molecular medio de aproximadamente 1 a 2 millones
de daltons. El grado de sulfatación del sulfato de celulosa está
preferiblemente por encima de un 12% y de la forma más preferible
aproximadamente un 17-18% que representa la
sulfatación máxima. Puede usarse también sulfato de celulosa en
forma de una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo sulfato
sódico de celulosa. Otras sales farmacéuticamente aceptables
incluyen, entre otras, sulfato potásico, lítico y amónico de
celulosa.
El sulfato de celulosa en una cantidad eficaz
puede administrarse en una forma adecuada de dosificación,
dependiendo del lugar de administración. Una "cantidad eficaz"
se refiere a una cantidad eficaz a unas dosificaciones y durante
períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico
deseado, como por ejemplo prevenir o inhibir infecciones por virus
del papiloma. La cantidad eficaz puede variar según una serie de
factores como por ejemplo la infección que se está tratando, estado
de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo que se está
tratando. Aunque la cantidad eficaz puede determinarse fácilmente,
los estudios hasta la fecha sugieren que los mejores resultados se
pueden alcanzar con aproximadamente 1 a 200 mg/ml de sulfato de
celulosa, preferiblemente 1 a 100 mg/ml, y más preferiblemente 50 a
100 mg/ml.
Puede administrarse una cantidad eficaz de
sulfato de celulosa en el área o áreas que tienen o se espera que
entren en contacto con el agente infeccioso. Por ejemplo, para
prevenir, inhibir o tratar infecciones vaginales, o para prevenir o
inhibir cáncer cervical, el sulfato de celulosa puede administrarse
en forma de geles, espumas, supositorios, cremas o aerosoles en la
cavidad vaginal usando aplicadores apropiados. El sulfato de
celulosa puede administrarse también en el recto, o usando cápsulas
comestibles adecuadas y agentes saborizantes, en la boca, o en la
cavidad vaginal, de una o más parejas sexuales, sabiendo si están
infectadas o no, para prevenir o inhibir su transmisión durante las
relaciones vaginales o anales o el sexo oral. El sulfato de celulosa
puede administrarse antes, durante o después del acto sexual,
proporcionando una mayor flexibilidad y facilidad de uso. Si se
administra después del acto sexual, los mejores resultados pueden
lograrse inmediatamente después del acto sexual. Para prevenir o
inhibir lesiones epiteliales malignas, el sulfato de celulosa puede
aplicarse por vía tópica sobre la piel, por ejemplo en forma de
crema o gel. El sulfato de celulosa puede administrarse también en
forma de una dosificación oral, por ejemplo, en forma de un
comprimido.
Pueden combinarse vehículos o diluyentes
adecuados conocidos por los expertos en la técnica en la preparación
de una forma de dosificación adecuada, y se puede seguir a los
pacientes que reciben el tratamiento para ver su eficacia de la
forma conocida.
En el caso de un gel, el sulfato de celulosa
puede combinarse con glicerina y conservantes adecuados como por
ejemplo metilparabeno y propilparabeno. Pueden añadirse también
otros excipientes adecuados, por ejemplo, un agente espesante, como
por ejemplo hidroxietilcelulosa. Si el sulfato de celulosa se usa
sobre la piel, puede mezclarse simplemente en agua, solución salina
o en una solución tampón y aplicarse en forma de gel.
El Estudio de Seguridad de la Fase I indica que
el sulfato de celulosa que es no citotóxico se tolera mejor que el
nonoxinol-9, un agente citotóxico frecuentemente
encontrado en geles espermicidas, y tan bueno o incluso mejor que
K-Y Jelly, un lubricante. El sulfato de celulosa
ofrece una ventaja adicional en que la irritación por un agente
citotóxico puede provocar lesiones que pueden facilitar una
infección, y el uso de sulfato de celulosa no está asociado con
tales riesgos de infección.
El sulfato de dextrano de un amplio intervalo de
peso molecular, puede administrarse tal y como se describe para el
sulfato de celulosa en formas de dosificación similares. En una
realización, puede usarse sulfato de dextrano de peso molecular
medio mayor de aproximadamente 500.000. En otra realización, el peso
molecular puede ser de aproximadamente 1-2
millones. La cantidad eficaz puede variar según una serie de
factores, incluyendo aquellos ya descritos y puede determinarse
fácilmente. En una realización, puede administrarse aproximadamente
0,1 a 200 mg/ml de dextrano, preferiblemente aproximadamente 1 a 100
mg/ml y más preferiblemente, 50 a 100 mg/ml.
Aunque se ha descrito el uso o administración de
sulfato de celulosa y sulfato de dextrano según la invención,
pueden administrarse de forma similar otros polisacáridos sulfatados
en formas de dosificación similares de acuerdo con la invención.
Preferiblemente, el polisacárido sulfatado tiene un peso molecular
que varía desde aproximadamente 15.000 a 3.000.000.
Preferiblemente, el peso molecular es mayor de aproximadamente
500.000. El polisacárido puede ser un homo- o heteropolisacárido,
preferiblemente un homopolisacárido, como son el sulfato de
celulosa y el sulfato de dextrano, con unidades monoméricas
constituidas por aldo-, desoxialdo-, ceto- o desoxicetopentosas,
incluyendo, pero no restringido a, arabinosa, ribosa, desoxirribosa,
galactosa, fructosa, sorbosa, ramnosa y mucosa, unidos por enlaces
alfa o beta. El polímero puede ser lineal o ramificado, con grupos
hidroxilo libres de las unidades monoméricas sulfatadas total o
parcialmente. Preferiblemente, los grupos hidroxilo estás
sulfatados totalmente. Las unidades monoméricas pueden modificarse
adicionalmente por presencia de grupos carboxilo, amino y éster.
Los polisacáridos sulfatados adecuados incluyen dermatán sulfato,
condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina, manán sulfato,
carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato, chitín sulfato,
heparina y heparín sulfato, todos los cuales se pueden obtener
comercialmente.
Se trata de que los términos, sulfato de
celulosa, sulfato de dextrano dermatán dermatano, condroitín
sulfato, pentosán sulfato, fucoidina, manán sulfato, carragenato,
dextrín sulfato, curdlán sulfato y chitín sulfato incluyan dentro
de su alcance sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. De
forma similar, el término polisacáridos sulfatados incluye dentro
de su alcance sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Además, aunque se contemplan seres humanos como sujetos en
necesidad de prevención, inhibición o tratamiento según la
invención, otros mamíferos susceptibles de una infección similar (y
lesiones en el caso de infección por virus del papiloma) son
también sujetos de tal prevención, inhibición o tratamiento.
Se sometió a ensayo el sulfato de celulosa para
ver su capacidad de inhibir la infección por BPV por medio de un
ensayo de formación de focos de células (véase Hermonat et
al. (1992) durante una descripción de este ensayo). Los
resultados se muestran a continuación. El sulfato de celulosa de
Dextran Products Limited (Lote 80971 en forma de sulfato sódico de
celulosa, conocido como Ushercell J.) se mezcló con BPV tipo I
(obtenido de fibropapilomas bovinos) antes de añadir el virus a
células de la línea C127 de fibroblasto de ratón, o se mezcló con
estas primeras células huésped antes de añadir el virus. En un
estudio de pesos moleculares, el intervalo de pesos moleculares de
sulfato de celulosa fue de aproximadamente 750 a 20,3 millones, con
un peso molecular medio de aproximadamente 1,01 millones. El peso
molecular máximo tal y como se ve en HPLC fue de aproximadamente
2,77 millones. En otro estudio, el peso molecular medio se determinó
que era de aproximadamente 1,9 millones con un peso molecular
máximo de aproximadamente 2,3 millones. A menos que se especifique
de otra manera, el peso molecular es en daltons.
Inhibición del papilomavirus bovino tipo I por sulfato de celulosa | ||
[Sulfato de celulosa] \mug/ml | Procedimiento de exposición del compuesto | |
Preincubado con virus antes de la | Preincubado con células huésped | |
adición a células huésped | antes de la adición a virus | |
Focos inducidos por virus por cultivo | Focos inducidos por virus por cultivo | |
0 | 450 | 450 |
450 | 450 | |
5,0 | 121 | 72 |
97 | 60 | |
50 | 37 | 10 |
32 | 12 | |
500 | 0^{A} | 0^{A} |
0 | 0 | |
5000 | 0^{B} | 0^{B} |
0 | 0 | |
^{A}Ligera alteración de la monocapa | ||
^{B}Monocapa a aproximadamente un 80% de confluencia; alterada |
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indican una respuesta a dosis y la
formación de focos oncogénicos por el virus está completamente
inhibida a 500 \mug/ml cuando el sulfato de celulosa se mezcla con
el virus o con las células huésped.
El ensayo se repitió usando diferentes
concentraciones de sulfato de celulosa y los resultados se muestran
a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Inhibición del papilomavirus bovino tipo I por sulfato de celulosa | ||
[Sulfato de celulosa] \mug/ml | Procedimiento de exposición del compuesto | |
Preincubado con virus antes de la | Preincubado con células huésped | |
adición a células huésped | antes de la adición a virus | |
Focos inducidos por virus por cultivo | Focos inducidos por virus por cultivo | |
0 | 240 | 240 |
196 | 196 | |
1,6 | 196 | 53 |
168 | 13 |
[Sulfato de celulosa] \mug/ml | Procedimiento de exposición del compuesto | |
Preincubado con virus antes de la | Preincubado con células huésped | |
adición a células huésped | antes de la adición a virus | |
Focos inducidos por virus por cultivo | Focos inducidos por virus por cultivo | |
8,0 | 60 | 5 |
124 | 3 | |
40 | 116 | 0 |
104 | 0 | |
200 | 34 | 0 |
42 | 0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó inhibición completa a 40 \mug/ml
solamente cuando el sulfato de celulosa se incubó previamente con
células huésped, aunque se observó inhibición parcial a ese nivel de
dosis cuando se mezcló primero con el virus. A 200 \mug/ml se
obtuvo la inhibición casi completa de la infección cuando el sulfato
de celulosa se incubó previamente con el virus antes de la adición
a las células huésped. Estos resultados muestran que el sulfato de
celulosa inhibe la infección cuando se añade primero al virus o
cuando se añade primero a las células huésped, aunque tiende de
algún modo a ser más eficaz cuando se añade primero a las células
huésped.
En un estudio similar usando el ensayo de
formación de focos por BPV-1, se sometió a ensayo el
efecto del sulfato de celulosa y del sulfato de dextrano sobre BPV.
En este estudio, el sulfato de celulosa sometido a ensayo fue tal y
como se describe anteriormente. El sulfato de dextrano usado era de
Dextran Products Limited (Lote DSM-122) preparado
usando dextrano de peso molecular medio de aproximadamente 500.000
(en base a su viscosidad) y se estima que tiene un peso molecular
medio final mayor de aproximadamente 500.000 y puede ser
aproximadamente de 1 a 1,1 millones.
La actividad microbicida de los compuestos se
sometió a ensayo usando el ensayo de formación de focos por
BPV-1 perfectamente caracterizado (Dvoretzky, I., R.
Shober, S. K. Chattopadhyay, and D. R. Lowy. 1980. A quantitative
in vitro focus assay for bovine papilloma virus. Virology. 103:
369-375), con modificaciones para ensayos
microbicidas (Hermonat, P. L., (1992) supra; Howett, M. K.,
et al, (1999) supra). Cuando se usan los términos
inhibir o actividad microbicida tratan de referirse de forma amplia
a infección microbicida y/o efecto de inactivación de micro-
bios.
bios.
Se preincubaron alícuotas de
BPV-1 que contenían aproximadamente
100-200 unidades formadoras de focos con diluciones
de compuestos durante 10 minutos a 37ºC antes de la adición a los
cultivos de células C127 de ratón. Los cultivos de células C127 se
dispusieron en matraces de cultivo de tejidos T25 (Coming, Nueva
York), conteniendo 3 x 10^{5} células por matraz. Las mezclas
virus-compuesto en un total de 50 \mul se
añadieron luego a los matraces en 1 ml de medios, y se añadieron 3
ml adicionales de medios después de 24 horas de cultivo. Los medios
se cambiaron cada 3-4 días durante un período de 2
semanas. Los focos se contabilizaron después de la tinción de la
monocapa con violeta de cristal y haciendo un recuento de focos
teñidos microscópicamente. Cada concentración de compuestos se
ensayó por duplicado, y la media \pm desviación típica del número
de focos para la concentración de virus-fármaco en
la preincubación para cada compuesto se muestra a continuación como
Tabla C.
Efecto inhibidor de sulfato de celulosa y sulfato de dextrano cuando se mezclan con el virus del papiloma bovino | ||||
antes de la adición de la mezcla a las células huésped | ||||
Concentración (\mug/ml) | Media \pm desviación típica (% de control) | |||
Sulfato de celulosa | Sulfato de dextrano | |||
Línea celular C127 | Clon C127-D10 | Línea celular C127 | Clon C127-D10 | |
0 (control) | 100 | 100 | 100 | 100 |
0,01 | 80 \pm 12 | 73 \pm 31 | 81 \pm 3 | 64 \pm 8,0 |
0,1 | 76 \pm 9 | 80 \pm 16 | 102 \pm 10 | 83 \pm 16 |
1 | 73 \pm 5 | 33 \pm 3 | 97 \pm 7 | 69 \pm 7 |
10 | 42 \pm 3 | 3 \pm 3 | 113 \pm 2 | 3 \pm 3 |
100 | 10 \pm 2 | 2 \pm 3 | 43 \pm 7 | 3 \pm 3 |
1.000 | 0 | 0 | 6 \pm 3 | 0 |
10.000 | 0 | 0 | 0 | 0 |
También se sometió a ensayo la actividad
microbicida de los compuestos por pre-incubación de
células con compuestos seguida de la adición de virus a células
C127 recubiertas de compuesto. En estos experimentos, se añadieron
diluciones de compuestos a cultivos de células C127, se incubaron
durante 1 hora a 37ºC, se lavaron 3 veces con medios para retirar
el compuesto no unido, antes de la adición de aproximadamente 100
unidades formadoras de focos de BPV-1. Los cultivos
se incubaron durante 1 hora adicional, se lavaron tres veces para
retirar el virus no unido, después se continuó con la incubación
durante dos semanas con cambios de medios cada 3-4
días y se hizo un recuento de focos tal y como se describe
anteriormente. Los resultados se muestran a continuación en la
Tabla D.
Efecto inhibidor de sulfato de celulosa y sulfato de dextrano cuando se mezclan con células diana, seguido de la | ||
adición del lavado de células y adición del virus del papiloma bovino | ||
Concentración (\mug/ml) | Media \pm desviación típica (focos/pocillo) | |
Sulfato de celulosa | Sulfato de dextrano | |
0 | 88 \pm 15,6 | 115 (n = 1) |
10 | 103 \pm 6,3 | 31 \pm 16,9 |
100 | 120 \pm 8,4 | 15 \pm 4,6 |
1.000 | 87 \pm 45,1 | 4 \pm 2,6 |
10.000 | 2 \pm 1,3 | 0 |
Los resultados de la Tabla C demostraron que
ambos compuestos mostraban actividad microbicida contra
BPV-1. De 10 a 100 \mug/ml el sulfato de celulosa
mostró inhibición moderada a alta de la capacidad de infección por
virus del papiloma usando la línea celular C127, con una inhibición
completa a 1 mg/ml. El sulfato de dextrano mostró inhibición
moderada a 100 \mug/ml y una inhibición muy alta a 1 mg/ml. Los
clones derivaban de la línea celular parenteral C127 como
consecuencia de los continuos problemas de BPV-1
para inducir focos después de varios pases celulares de la línea
celular parenteral no clonada. Un clon, denominado
C127-D10, que produjo focos tras infección por
BPV-1, se eligió para un ensayo de repetición de los
compuestos. Cuando se sometió a ensayo a este clon para ver la
actividad microbicida, se requirió menos compuesto para lograr una
considerable reducción en los focos inducidos por
BPV-1 cuando se compara con las células parenterales
C127 no clonadas.
Se realizó una pre-incubación de
células C127-D10 con compuestos antes de la adición
de BPV-1 para determinar si los efectos
microbicidas del sulfato de celulosa y de sulfato de dextrano se
extendían hasta un bloqueo de la interacción del virus con las
superficies de las células. En estos experimentos, se añadieron
dosificaciones de compuestos a los cultivos celulares seguido de la
retirada por lavado del reactivo no unido antes de la adición del
virus. Después de una incubación de 1 hora con virus, se retiró el
virus no unido por lavado y se siguieron los cultivos para ver los
focos después de dos semanas.
Los resultados (Tabla D) indicaron que estos
reactivos mostraban algún interferencia del virus con las
superficies de las células huésped tal y como evidenciaba una
reducción dependiente de la dosis de focos inducidos por
BPV-1. El sulfato de dextrano mostró una
interferencia más acusada con una reducción sustancial en focos a
dosis de 10 \mug/ml. Por el contrario, el sulfato de dextrano
solamente mostró débiles efectos microbicidas cuando las células
C127-D10 se trataron previamente con este compuesto,
excepto a una concentración de 10 \mug/ml. La diferencia en los
resultados vistos con el estudio anterior es probablemente debida al
hecho de que en el primer estudio no se retiró por lavado el
sulfato de celulosa no unido antes de la adición del virus. Aunque
el sulfato de celulosa u otros polisacáridos sulfatados tras su
administración, por ejemplo, por vía vaginal, deberían permanecer
en la cavidad vaginal, los resultados anteriores más probables
representan efectos in vivo y se espera que el compuesto
in vivo inactive el virus del papiloma por asociación directa
e interfiriendo con la unión del virus a las células.
El sulfato de celulosa y el sulfato de dextrano
se prepararon cada uno en forma de una solución de 2 mg/ml en NaCl
al 0,9% y se sometieron a ensayo para ver su actividad microbicida
usando en ensayo in vitro de infección transitoria por HPV
descrito originalmente por Smith y colegas (Smith, L. H., C. Foster,
M. E. Hitchcock y R. Isseroff. 1993. In vitro
HPV-11 infection of human foreskin. J. Invest.
Dermatol. 101: 292-295) con algunas
modificaciones (Ludmerer, S. W., W. L. McClements, X. M. Wang, J. C.
Ling, K. U. Jansen y N. D. Christensen. 2000. HPV11 mutant
virus-like particles elicit immune responses that
neutralize virus and delineate a novel neutralizing domain.
Virology 266: 237-245). También se usó una
lectura en base a un ELISA de unos datos de Densidad Óptica (D.O.)
usando ruptura por fosfatasa alcalina del sustrato fosfato de
p-nitrofenilo para medir la infección por HPV tal y como se
describe anteriormente.
En el ensayo convencional de
PCR-TI (PCR con transcripción inversa, Ludmerer, S.
W., et al, supra; Smith L. H. et al,
supra; Smith L. H., C. Foster, M. E. Hitchcock, G. S.
Leiserowitz, K. Hall, R. Isseroff, N. D. Christensen y J. W.
Kreider. 1995. Titration of HPV-11 infectivity
and antibody neutralization can be measured in vitro. J.
Invest. Dermatol. 105: 438-444) para la
detección de infección por HPV-11, se
pre-incubaron alícuotas de HPV-11
(10 \mul) con diluciones de compuestos (40 \mul) durante 30
minutos a 37ºC añadiéndose después las mezclas a los cultivos de
células A431 humanas. Los cultivos réplica de células A431 se
establecieron colocando en placas 5 x 10^{5} células (en 1 ml de
medio de cultivo de tejidos) por pocillo en placas de cultivo de 6
pocillos. Se añadieron mezclas virus-compuesto a
cultivos individuales de A431 y los cultivos se incubaron durante
otros 4 días (después de incubación durante una noche, se añadieron
otros 2 ml de medio de cultivo a cada cultivo). Las células se
recuperaron en 1 ml de Trizol (GIBCO/BRL), después se preparó la
totalidad del ARN para transcripción inversa y producción de ADNc
viral a partir de transcritos víricos empalmados abarcando un mayor
sitio de ayuste entre E1 y E4 (Ludmerer, S. W. et al,
supra; Smith, L. H. et al, supra). Se llevaron
a cabo dos ciclos de amplificación por PCR usando cebadores
anidados preparados a partir de la secuencia publicada para la
detección del transcrito vírico ayustado, y los productos de la PCR
se detectaron como bandas teñidas con etidio sobre geles de azarosa
(Ludmerer, S. W. et al, supra; Smith, L. H. et
al, supra). Los productos de la PCR se clonaron y
secuenciaron para confirmar el origen vírico del producto de la
PCR. La presencia del producto vírico de tamaño correcto de PCR se
usó para confirmar el éxito de la infección por
HPV-11, así como la incapacidad para inactivar y/o
bloquear el virus por el compuesto de ensayo. Por otro lado, la
falta de un producto vírico de PCR se interpretó como que indicaba
inactivación del virus, y/o una incapacidad del virus para infectar
células A431. Los transcritos amplificados de
\beta-actina (Smith, L. H. et al,
supra) se usaron como control para establecer la integridad
de aislamiento de ARN y de los procedimientos de
PCR-TI para células no infectadas y para cultivos
en los que se logró la inactivación de HPV-11.
El ensayo de PCR-TI para detectar
infección por HPV-40 se diseñó de forma similar para
la detección de infección por HPV-11 tal y como se
describe anteriormente.
También se incluyó una modificación del ensayo de
PCR-TI que incorporaba una lectura en base a un
ELISA (Boehringer-Mannheim) para determinar la
actividad microbicida. Se infectaron réplicas de cultivos celulares
de células A431 con una alícuota de viriones de HPV infecciosos tal
y como se describe anteriormente. Después de 4 días de cultivo, se
recuperaron las células y se extrajo el ARN. El ARN se sometió a
transcripción inversa usando cebadores anti-sentido
(inversos) corriente abajo para HPV-11 o
HPV-40 y \beta-actina (como
control/transcrito celular de expresión general en todas las
células) para iniciar la síntesis de ADNc. El ADNc se procesó a
través de dos tandas de 30 ciclos de amplificación por PCR usando
cebadores anidados: la segunda tanda de ciclos usando digoxigenina
(DIG)-dUTP para marcar los productos de PCR con DIG.
Los productos de PCR marcados con DIG se desnaturalizaron y después
se renaturalizaron junto con un oligonucleótido biotinilado
específico para el producto de PCR diana. Los productos
biotinilados se detectaron en ELISA con placas recubiertas con
estreptavidina (para capturar el producto de PCR biotinilado
diana), después anticuerpos anti-DIG y sustrato.
Los productos de PCR marcados se añadieron directamente a las
placas de ELISA, o se valoraron en diluciones de 10 veces por
duplicado para cada cultivo celular para cada dilución vírica.
\vskip1.000000\baselineskip
Detección de PCR-TI en ELISA de infección transitoria de HPV-11 y HPV-40 | |||
Condiciones de cultivo celular^{a} | Concentración de productos de PCR^{b} | Media (desviación típica) de lecturas de | |
D.O. de ELISA | |||
Sonda de HPV-11 | Sonda de HPV-40 | ||
Infección por HPV-11 | 10 | 1,827 (0,174) | -0,013 (0,000) |
1 | 1,540 (0,034) | NE^{c} | |
0,1 | 0,845 (0,039) | NE | |
Infección por HPV-40 | 10 | 0,012 (0,002) | 2,000 (0,000) |
1 | NE | 1,842 (0,080) | |
0,1 | NE | 1,027 (0,028) | |
^{a} Cultivos de A431 infectados con HPV-11 y HPV-40 | |||
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm} Volumen (\mu l) de productos de reacción a partir de la segunda tanda de productos de amplificación por PCR añadidos a los pocillos de ELISA.\end{minipage} | |||
^{c} No ensayado. |
\vskip1.000000\baselineskip
ELISA de PCR-TI para la detección de infección transitoria de células A431 humanas con HPV-11 o HPV-40^{a} | ||
Compuesto (\mug/ml a dosis de pretratamiento vírico) | Media (desviación típica) de lectura de D.O. para | |
ELISA de PCR-TI | ||
Sonda de HPV-11 | Sonda de \beta-actina | |
Experimento #1^{b} | ||
Solo células | 0,043 (0,004) | 1,645 (0,052) |
Sólo HPV-11 | 1,417 (0,063) | 1,564 (0,051) |
1000 \mug/ml de sulfato de celulosa (no virus) | 0,028 (0,004) | 1,427 (0,013) |
1000 \mug/ml de sulfato de dextrano (no virus) | 0,000 (0,000) | 1,470 (0,001) |
1000 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c} | 0,038 (0,001) | 1,518 (0,020) |
100 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c} | 0,049 (0,001) | 1,532 (0,025) |
10 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c} | 1,485 (0,045) | 1,576 (0,021) |
100 \mug/ml de sulfato de dextrano^{c} | 0,035 (0,000) | 1,583 (0,022) |
10 \mug/ml de sulfato de dextrano^{c} | 0,023 (0,000) | 1,636 (0,105) |
Compuesto (\mug/ml a dosis de pretratamiento vírico) | Media (desviación típica) de lectura de D.O. para | |
ELISA de PCR-TI | ||
Sonda de HPV-40 | Sonda de \beta-actina | |
Experimento #2^{d} | ||
1000 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c} | 0,037 (0,004) | N.D.^{e} |
100 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c} | 0,128 (0,008) | N.D. |
10 \mug/ml de sulfato de celulosa^{c} | 0,397 (0,050) | N.D. |
1000 \mug/ml de sulfato de dextrano^{c} | 0,006 (0,007) | N.D |
100 \mug/ml de sulfato de dextrano^{c} | 0,375 (0,073) | N.D. |
10 \mug/ml de sulfato de dextrano^{c} | 0,042 (0,007) | N.D. |
Solamente HPV-40 | 1,320 (0,074) | N.D. |
^{a} Dos experimentos adicionales que dan resultados similares. | ||
^{b} Infectado con HPV-11. | ||
^{c} Con virus. | ||
^{d} Infectado con HPV-40 | ||
^{e} No determinado |
La actividad microbicida se determinó como la
detección de productos teñidos de PCR o como lectura en base aun
ELISA tal y como se describe anteriormente. La inactivación de los
virus o la falta de infección por virus quedó en evidencia por la
incapacidad para detectar productos víricos ayustados de
PCR-TI (los resultados no se muestran) y/o la falta
de antecedentes anteriores a los valores de ELISA cuando se usa el
ensayo ELISA para detectar productos marcados de PCR. Se llevó a
cabo un experimento inicial para probar la especificidad del ensayo
de PCR-TI en base a un ELISA usando infección por
HPV-11 y HPV-40 de células A431
(Tabla E). Se observó una detección altamente específica de
HPV-11 y HPV-40 por la presencia de
valores altos de D.O. para ELISA para la sonda de
HPV-11 a partir de cultivos infectados por
HPV-11 pero no infectados por HPV-40
y viceversa.
Ambos compuestos demostraron una importante
actividad microbicida contra HPV-11 y
HPV-40 en ambos ensayos y se resumen experimentos
representativos usando ELISA de PCR-TI en la Tabla
F. Los resultados mostraron que los productos de
PCR-TI a partir de células solas o a partir de
cultivos no infectados tratados con compuestos demostraron de forma
consistente bajas lecturas de D.O. en el ensayo ELISA para los
productos de HPV y elevadas lecturas de D.O. para el producto de
\beta-actinina. Tras infección por
HPV-11 y/o HPV-40, los cultivos
mostraron elevados niveles de productos víricos detectables por
ELISA, y la adición de microbicidas disminuyó la señal hasta señal
de ruido (no infectados). Para el sulfato de celulosa, esto ocurrió
a 100 y 1000 \mug/ml, y para el sulfato de dextrano a 10 y 100
\mug/ml cuando se sometieron a ensayo para ver la actividad
microbicida contra HPV-11. En los ensayos para la
infectividad por HPV-40, el sulfato de celulosa fue
microbicida a 100 y 1000 \mug/ml y el sulfato de dextrano a 100 y
1000 \mug/ml. No hubo citotoxicidad celular para ninguna de las
dosis de compuestos tal y como se determinó por examen microscópico
de los cultivos celulares.
Claims (13)
1. Uso de una cantidad eficaz de un
polisacárido sulfatado para fabricar un medicamento para tratar,
inhibir o prevenir una infección por virus del papiloma en un sujeto
en necesidad de tal tratamiento, inhibición o prevención,
en el que el polisacárido sulfatado se selecciona
del grupo constituido por sulfato de celulosa, sulfato de dextrano,
dermatán sulfato, condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina,
manán sulfato, carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato,
chitín sulfato, heparina y heparín sulfato.
2. Uso de una cantidad eficaz de un
polisacárido sulfatado para fabricar un medicamento para prevenir o
inhibir una lesión epitelial maligna en un sujeto en necesidad de
tal prevención o inhibición,
en el que el polisacárido sulfatado se selecciona
del grupo constituido por sulfato de celulosa, sulfato de dextrano,
dermatán sulfato, condroitín sulfato, pentosán sulfato, fucoidina,
manán sulfato, carragenato, dextrín sulfato, curdlán sulfato,
chitín sulfato, heparina y heparín sulfato.
3. El uso según la reivindicación 2, en
el que la lesión maligna es cáncer cervical.
4. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el polisacárido sulfatado es
sulfato de celulosa.
5. El uso según la reivindicación 4, en
el que la sulfatación del sulfato de celulosa es de al menos un
12%.
6. El uso según la reivindicación 5, en
el que el sulfato de celulosa está completamente sulfatado.
7. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, en el que el sulfato de celulosa tiene un
peso molecular medio de aproximadamente 1-2
millones.
8. El uso según cualquier una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el polisacárido sulfatado es
sulfato de dextrano.
9. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6 o reivindicación 8, en el que el polisacárido
sulfatado tiene un peso molecular medio mayor de aproximadamente
500.000.
10. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 9, en el que la cantidad eficaz es de
aproximadamente 0,1 a 200 mg/ml.
11. El uso según la reivindicación 10, en el
que la cantidad eficaz es de aproximadamente 1 a 100 mg/ml.
12. El uso según la reivindicación 11, en el
que la cantidad eficaz es de aproximadamente 50 a 100 mg/ml.
13. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el sujeto es un paciente
humano.
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