DE60101914T2

DE60101914T2 - Verwendung von indol-3-essigsäurederivaten in der therapie

Info

Publication number: DE60101914T2
Application number: DE60101914T
Authority: DE
Inventors: Peter Northwood WARDMAN; Lisa K. Northwood FOLKES; Gabriele U. Northwood DACHS; Sharon Gower Street ROSSITER; Olga Greco
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-28
Publication date: 2004-10-28
Anticipated expiration: 2021-06-29
Also published as: EP1296676A1; WO2002002110A1; DE60101914D1; AU2001267690A1; US6890948B1; ATE258436T1; ES2215138T3; GB0016162D0; EP1296676B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Derivate von Indol-3-essigsäure ("indole-3-acetic acid", IAA) und deren Verwendung als Pharmazeutika, insbesondere zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen.
Indol-3-essigsäure
ist ein natürlich vorkommendes Pflanzenwachstums-Phytohormon, zu dem umfangreiche Untersuchungen durchgeführt wurden. Bereits 1956 wurde ihre Wirkung auf Menschen untersucht, und es zeigte sich, dass einmalige Dosen von 0,1 g/kg nicht toxisch waren (A. Mirsky und D. Diengott, "Hypoglycemic action of indole-3-acetic acid by mouth in patients with diabetes mellitus", Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Soc. Exp. Biol. Med. 93, 109–110 (1956)). 1964 wurde entdeckt, dass ihre Photooxidationsprodukte als Wachstumshemmer für Mikroorganismen wirken (C. Still, T. Fukuyama und H. Moyed, "Inhibitory Oxidation Products of Indole-3-acetic acid", J. Biological Chemistry 240(6), 2612–2618 (1964)).
Später bestand Interesse an der Verwendung von Indol-3-essigsäure als Prodrug in Kombination mit Meerrettich-Peroxidase ("horseradish peroxidase", HRP). IAA wird als geeignetes Prodrug angesehen, da sie in ihrer stabilen Form nichttoxisch ist, durch die natürlichen Peroxidasen im menschlichen Körper in nicht nennenswertem Ausmaß oxidiert wird, jedoch leicht durch HRP oxidiert wird. HRP und andere Peroxidasen sind Enzyme, die mittels nachstehend erläuterter Verfahren, wie z. B. ADEPT und GDEPT, an die gewünschte Aktivitätsstelle befördert werden können.
Beispielsweise kann das Enzym an einen monoklonalen Antikörper gebunden werden, damit es sich an ein extrazelluläres tumorassoziiertes Antigen binden kann. Dieser Ansatz der Krebstherapie, der häufig als "Antikörper-gerichtete Enzym-Prodrug-Therapie" ("antibody directed enzyme/prodrug therapy", ADEPT) bezeichnet wird, ist in der WO 88/07378 beschrieben und ist Gegenstand von klinischen Tests der zweiten Phase.
Eine Variation von ADEPT ist "Polymer-gerichtete Enzym-Prodrug-Therapie" ("polymer directed enzyme/prodrug therapy", PDEPT), bei der die Verbindung, auf die abgezielt werden soll, z. B. das Enzym, an ein wasserlösliches, biokompatibles und nichtimmunogenes Polymer gebunden wird. Dieses Polymer lokalisiert bzw. konzentriert sich aufgrund der Tatsache, dass die Blutgefäße in Tumoren nicht dicht sind, in den Tumoren, was es den Polymer-gebundenen Molekülen ermöglicht, in den extrazellulären Raum in Tumoren einzudringen, was in normalem Gewebe nicht so leicht passiert. Die Clearance aus den Tumoren erfolgt aufgrund des Fehlens lymphatischer Abführung nur langsam, was eine Aktivierung des Prodrugs durch das konzentriert vorliegende Enzym-Polymer ermöglicht. PDEPT wird detaillierter in "The Role of Polymer Conjugates in the Diagnosis and Treatment of Cancer" von R. Duncan et al., STP Pharma Sciences 6, 237–263 (1996), beschrieben und hat kürzlich die erste Phase klinischer Tests der Verabreichung zytotoxischer Arzneimittel (z. B. von Doxorubicin) an Tumoren durchlaufen (P. A. Vasey et al., "Phase I clinical and pharmaceutical study of PK1 [N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer doxorubicin]: first member of a new class of chemotherapeutic agents-drug-polymer conjugates", Clin. Cancer Res. 5, 83–94 (1999)).
Ein weiterer therapeutischer Ansatz namens "Virus-gerichtete Enzym-Prodrug-Therapie" ("virus directed enzyme prodrug therapy", VDEPT) wird angewandt, wenn mit einem viralen Vektor, der ein für das relevante Enzym kodierendes Gen trägt, auf Tumorzellen abgezielt wird. Das Gen kann transkriptionell durch gewebespezifische Promotoren oder Enhancersequenzen gesteuert werden. Der virale Vektor dringt in Tumorzellen ein und exprimiert das Enzym, wodurch das Prodrug innerhalb der Tumorzellen in das aktive Arzneimittel übergeführt wird (Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8039 (1991)).
Alternativ dazu wurden nichtvirale Verfahren zur Abgabe von Genen angewandt. Derartige Verfahren umfassen Calciumphosphat-Cofällung, Mikroinjektion, Liposomen und Derivate davon, Elektroporation, direkte DNA-Aufnahme sowie Rezeptorvermittelten DNA-Transfer. Ein Überblick findet sich bei Morgan & French, Annu. Rev. Biochem. 62, 191 (1993). Bei Verwendung des Ausdrucks "GDEPT" oder "Gengerichtete Enzym-Prodrug-Therapie" ("gene directed enzyme prodrug therapy") sind sowohl virale als auch nichtvirale Abgabesysteme umfasst. GDEPT befindet sich zur Zeit ebenfalls im klinischen Versuchsstadium.
Photodynamische Therapie (PDT) umfasst die Anwendung von Licht zur Aktivierung von Molekülen, um toxische Spezies zu erzeugen. Die Mehrzahl der gegenwärtigen und vorgeschlagenen Techniken verwendet Singulett-Sauerstoff als toxische Spezies, die aus der Reaktion eines Photosensitizers mit zellulärem Sauerstoff hervorgeht. Der Hauptnachteil dieser Technik ist, dass sie bei anoxischen Tumoren nicht funktioniert und dass die Photosensitizer vom Körper nicht leicht ausgeschieden werden, weswegen mit PDT behandelte Patienten noch für eine beträchtliche Zeitspanne nach der Behandlung lichtempfindlich bleiben.
Der Wirkmechanismus von HRP auf IAA wird wie folgt beschrieben ("Peroxidasecatalysed effects of Indole-3-acetic acid and analogues on lipid membranes, DNA, and mammalian cells in vitro", L. Folkes et al., Biochemical Pharmacology 57, 375–382 (1999)):
Im obigen Schema bezieht sich Nu auf ein zelluläres nukleophiles Zentrum, wie es beispielsweise in DNA oder Proteinen zu finden ist. In Abwesenheit von Sauerstoff kann das Skatol-Radikal mit Biomolekülen reagieren. Unüblicherweise wird IAA durch HRP oxidiert, ohne dass Wasserstoffperoxid erforderlich ist.
Die genaue Art der zytotoxischen Wirkung dieser oxidierten Derivate von IAA ist nicht bekannt, obwohl verschiedenste mögliche Mechanismen vorgeschlagen wurden.
Jüngere Arbeiten der Erfinder haben gezeigt, dass, wenn der aromatische Ring von IAA mit elektronenspendenden Substituenten, wie z. B. Methoxy, substituiert wird, die Geschwindigkeit der Oxidation durch HRP zunimmt, obwohl die Zytotoxizität abfällt.
Überraschenderweise haben die Erfinder nunmehr herausgefunden, dass, wenn der aromatische Ring von IAA mit zumindest einer Elektronen abziehenden Gruppe substituiert wird, die Zytotoxizität der Verbindungen bei Aktivierung durch Peroxidase abnimmt. Dies ist angesichts der langsameren Reaktion dermaßen substituierter IAAs mit Peroxidase besonders überraschend.
Demgemäß stellt ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Verbindung der Formel (I) oder physiologisch funktionelle Derivate davon in einem Therapieverfahren bereit:
worin:
R₁, R₂, R₃ und R'₃ jeweils unabhängig voneinander aus H und Niederalkyl ausgewählt sind; und
R₄, R₅, R₆ und R₇ jeweils unabhängig voneinander aus H, Elektronen abziehenden Gruppen (wie z. B. F, Cl, Br, I, OCF₃, Carboxylgruppen, Acetalgruppen, Arylverbindungen mit Elektronenmangel), Niederalkylgruppen, Niederalkoxygruppen, Arylgruppen und Aryloxygruppen ausgewählt sind, worin zumindest einer von R₄, R₅, R₆ und R₇ aus Elektronen abziehenden Gruppen ausgewählt ist.
"Elektronen abziehende Gruppen" sind Gruppen, die die Elektronendichte in anderen Teilen des Moleküls verringern. Zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung geeignete Gruppen umfassen F, Cl, Br, I, OCF₃, Carboxylgruppen, Acetalgruppen und Arylverbindungen mit Elektronenmangel. Bevorzugte Elektronen abziehende Gruppen sind F, Cl, Br und I, wobei F, Cl und Br besonders bevorzugt werden.
"Niederalkyl" bezeichnet in der vorliegenden Anmeldung eine Gruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, die aliphatisch oder alizyklisch oder eine Kombination davon sein kann und die gesättigt, teilweise ungesättigt oder zur Gänze ungesättigt sein kann. Diese Gruppe kann einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus Halogenen (d. h. F, Cl, Br, I, vorzugsweise F, Cl, Br), Carboxyl, Acetal, Aryl, Aryloxy und Alkoxy, tragen.
Beispiele für gesättigte unverzweigte Niederalkylgruppen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl und n-Pentyl (Amyl).
Beispiele für gesättigte verzweigte Niederalkylgruppen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, i-Propyl, i-Butyl, sec-Butyl, tert-Butyl und Neopentyl.
Beispiele für gesättigte alizyklische (carbozyklische) Niederalkylgruppen (auch als "C_3-7-Cycloalkyl"-Gruppen bezeichnet) umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, unsubstituierte Gruppen, wie z. B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl, sowie substituierte Gruppen, wie z. B. Methylcyclopropyl, Dimethylcyclopropyl, Methylcyclobutyl, Dimethylcyclobutyl, Methylcyclopentyl, Dimethylcyclopentyl, Methylcyclohexyl, Dimethylcyclohexyl, Cyclopropylmethyl und Cyclohexylmethyl.
Beispiele für ungesättigte Niederalkylgruppen mit einer oder mehreren Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen (auch als "C_2-7-Alkenyl"-Gruppen bezeichnet) umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Ethenyl (Vinyl, -CH=CH₂), 2-Propenyl (Allyl, -CH-CH=CH₂), Isopropenyl (-C(CH₃)=CH₂), Butenyl, Pentenyl und Hexenyl.
Beispiele für ungesättigte alizyklische (carbozyklische) Niederalkylgruppen mit einer oder mehreren Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen (auch als "C_2-7-Cycloalkenyl"-Gruppen bezeichnet) umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, unsubstituierte Gruppen, wie z. B. Cyclopropenyl, Cyclobutenyl, Cyclopentenyl und Cyclohexenyl, sowie substituierte Gruppen (z. B. Gruppen, die derartige Gruppen umfassen), wie z. B. Cyclopropenylmethyl und Cyclohexenylmethyl.
"Carboxyl" bezeichnet in der vorliegenden Anmeldung eine Gruppe mit der Struktur -C(=O)- und umfasst Carboxylate, Acylgruppen, Amide und Acylhalogenide.
"Carboxylate" bezeichnet Gruppen der Struktur -C(=O)OR, worin R H oder ein Carboxylsubstituent, z. B. eine Niederalkylgruppe oder eine C_5-20-Arylgruppe, vorzugsweise eine Niederalkylgruppe, ist. Beispiele für Carboxylgruppen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, -C(=O)OH, -C(=O)OCH₃, -C(=O)OCH₂CH₃, -C(=O)OC-(CN₃)₃ und -C(=O)OPh.
"Acyl" bezeichnet in der vorliegenden Anmeldung eine Gruppe der Struktur -C(=O)R, worin R H oder ein Acylsubstituent ist, z. B. eine Niederalkylgruppe oder eine C_5-20-Arylgruppe, vorzugsweise eine Niederalkylgruppe. Beispiele für Acylgruppen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, -C(=O)H (Formyl), -C(=O)CH₃ (Acetyl), -C(=O)-CN₂CH₃ (Propionyl), -C(=O)C(CH₃)₃ (Butyryl) und -C(=O)Ph (Benzoyl, Phenon).
"Amide" bezeichnet in der vorliegenden Anmeldung Gruppen mit der Struktur -C(=O)NR₁R₂, worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander ein Aminosubstituent sind, z. B. Wasserstoff, eine Niederalkylgruppe (auch als C_1-7-Alkylamino oder Di-C_1-7-alkylamino bezeichnet) oder eine C_5-20-Arylgruppe, vorzugsweise H oder eine C_1-7-Alkylgruppe. Beispiele für Amidogruppen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, -C(=O)NH₂, -C(=O)NHCH₃, -C(=O)N(CH₃)₂, -C(=O)NHCN₂CH₃ und -C(=O)N-(CH₂CH₃)₂, sowie Amidogruppen, worin R₁ und R₂ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, eine heterozyklische Struktur bilden, wie z. B. in Piperidinocarbonyl, Morpholinocarbonyl, Thiomorpholinocarbonyl und Piperazinocarbonyl.
"Acylhalogenid" bezeichnet Gruppen der Struktur -C(=O)X, worin X -F, -Cl, -Br oder -I, vorzugsweise -F, -Cl oder -I, ist.
"Acetal" bezeichnet in der vorliegenden Anmeldung eine Struktur -C(OR₃)(OR₄)-, worin der dritte Substituent wie für die (zuvor definierte) Carbonylgruppe ist. R₃ und R₄ sind aus Niederalkylgruppen ausgewählt oder bilden gegebenenfalls zusammen eine zweiwertige Alkylgruppe.
"Alkoxy" bezeichnet in der vorliegenden Anmeldung eine Gruppe der Struktur -OR, worin R eine gegebenenfalls substituierte Niederalkylgruppe ist, worin der Substituent Halogen (F, Cl, Br, I) und Aryl umfassen kann. Beispiele für Alkoxygruppen umfassen, ohen darauf beschränkt zu sein, -OCH₃ (Methoxy), -OCH₂CH₃ (Ethoxy), -OC(CH₃)₃ (tert-Butoxy), -OBn (Benzyloxy) und -OCH₂F (Fluormethoxy).
"Aryl" bezeichnet in der vorliegenden Anmeldung eine einwertige Gruppierung, die durch Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem Ringatom einer aromatischen C_5-20-Verbindung erhalten wird (auch als C_5-20-Arylgruppe bezeichnet), wobei die Verbindung einen oder zwei oder mehrere Ringe (z. B. kondensiert) sowie 5 bis 20 Ringatome aufweist. Vorzugsweise weist jeder Ring 5 bis 7 Ringatome auf.
Die Ringatome können allesamt Kohlenstoffatome sein, wie dies in "Carboarylgruppen" der Fall ist, so dass die Gruppen üblicherweise als "C_5-20-Carboarylgruppen" bezeichnet werden.
Beispiele für Arylgruppen, die keine Heteroatome im Ring aufweisen (d. h. C_5-20-Carboarylgruppen) umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Benzol (d. h. Phenyl), Naphthalin, Anthracen, Phenanthren und Pyren.
Alternativ dazu können die Ringatome ein oder mehrere Heteroatome aufweisen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, wie dies in "Heteroarylgruppen" der Fall ist. In diesem Fall kann die Gruppe üblicherweise als "C_5-20-Heteroarylgruppe" bezeichnet werden, worin "C_5-20" die Ringatome – Kohlenstoffatome und Heteroatome – angibt. Vorzugsweise weist jeder Ring 5 bis 7 Ringatome auf, wovon 0 bis 4 Heteroatome sind.
Beispiele für C_5-20-Heteroarylgruppen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, C₅-Heteroarylgruppen, die von Furan (Oxol), Thiophen (Thiol), Pyrrol (Azol), Imidazol (1,3-Diazol), Pyrazol (1,2-Diazol), Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, Oxadiazol und Oxatriazol abgeleitet sind; sowie C₆-Heteroarylgruppen, die von Isoxazin, Pyridin (Azin), Pyridazin (1,2-Diazin), Pyrimidin (1,3-Diazin, z. B. Cytosin, Thymidin, Uracil), Pyrazin (1,4-Diazin), Triazin, Tetrazol und Oxadiazol (Furazan) abgeleitet sind.
Beispiele für heterozyklische C_5-20-Gruppen (einschließlich C_5-20-Heteroarylgruppen), die kondensierte Ringe enthalten, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, solche, die von Chinolin, Isochinolin, Purin (z. B. Adenin, Guanin), Benzimidazol, Carbazol, Fluoren, Phenoxathiin, Benzofuran, Indol, Isoindol, Chinoxalin, Phenazin, Phenoxazin, Xanthen, Acridin und Phenothiazin abgeleitet sind.
"Arylgruppe mit Elektronenmangel" bezeichnet in der vorliegenden Anmeldung eine Arylgruppe, die Elektronen abzieht und inkludiert Heteroarylgruppen. Ein Beispiel für eine Arylgruppe mit Elektronenmangel ist p-Chlorphenyl.
"Aryloxy" bezeichnet in der vorliegenden Anmeldung eine Gruppe der Struktur -OR, worin R eine Arylgruppe ist. Ein Beispiel für eine Aryloxygruppe ist -OPh (Phenoxy).
"Physiologisch funktionelle Derivate von Prodrugs" umfasst Salze, Amide und Ester. Die Ester umfassen Carbonsäureester, in denen die Nicht-Carbonyl-Gruppierung der Estergruppe aus unverzweigtem oder verzweigtem C_1-6-Alkyl (z. B. Methyl, n-Propyl, n-Butyl oder t-Butyl); oder zyklischem C_3-6-Alkyl (z. B. Cyclohexyl) ausgewählt ist. Die Salze unfassen physiologisch annehmbare Basensalze, die z. B. von einer geeigneten Base herrühren, wie z. B. Alkalimetall- (z. B. Natrium-), Erdalkalimetall- (z. B. Mag nesium-), Ammonium- und NR''₄- (worin R'' C_1-4-Alkyl ist) Salze. Andere Salze inkludieren Säureadditionssalze, einschließlich Hydrochlorid- und Acetatsalze. Die Amide schließen nichtsubstituierte sowie mono- und disubstituierte Derivate ein. Derartige Derivate können nach auf dem Gebiet der Pharmazie an sich bekannten Verfahren hergestellt werden.
Vorzugsweise ist die Netto- oder Gesamtwirkung der Substituenten R₄, R₅, R₆ und R₇ Elektronen abziehend.
Die folgenden Präferenzen für die Gruppen R₁, R₂, R₃, R'₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ können unabhängig voneinander oder in beliebiger Kombination miteinander verwirklicht werden.
R₁ und R₂ sind vorzugsweise aus H oder gegebenenfalls substituierten Niederalkylgruppen ausgewählt, noch bevorzugter aus gegebenenfalls substituierten, gesättigten, unverzweigten Niederalkylgruppen, speziell aus Methyl und Ethyl. Die besonders bevorzugte Gruppe für R₁ und R₂ ist H.
Wenn die Niederalkylgruppe für R₁ substituiert ist, ist der Substituent vorzugsweise einer, der die Löslichkeit der gesamten Verbindung unterstützt, z. B. Morpholino oder Piperazinyl.
R'₃ ist vorzugsweise H. R₃ ist vorzugsweise aus H und gegebenenfalls substituierten gesättigten Niederalkylgruppen ausgewählt, noch bevorzugter aus gegebenenfalls substituierten, gesättigten, unverzweigten Niederalkylgruppen, speziell aus Methyl und Ethyl. Die besonders bevorzugte Gruppe für R₃ ist H, so dass R₃ und R'₃ in Kombination beide H sind.
Es wird bevorzugt, dass einer oder zwei, noch bevorzugter einer, von R₄, R₅, R₆ und R₇ – unabhängig voneinander – aus Elektronen abziehenden Gruppen ausgewählt ist bzw. sind.
Wenn einer oder mehrere von R₄, R₅, R₆ und R₇ nicht H oder eine Elektronen abziehende Gruppe ist bzw. sind, ist bzw. sind diese(r) vorzugsweise aus gegebenenfalls substituierten gesättigten Niederalkylgruppen ausgewählt, noch bevorzugter aus gegebenenfalls substituierten, gesättigten, unverzweigten Niederalkylgruppen, noch bevorzugter aus unsubstituierten unverzweigten Niederalkylgruppen, speziell aus Methyl und Ethyl.
Besonders bevorzugt wird, dass einer von R₄, R₅, R₆ und R₇ eine Elektronen abziehende Gruppe ist und die Übrigen H sind, insbesondere dass R₅ die Elektronen abziehende Gruppe ist.
Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung sind die Verbindungen der Formel (I), die in vitro eine stärkere zytotoxische Wirkung auf eine neoplastische Zelllinie zeigen als Indol-3-essigsäure (d. h., die bei Tests unter identischen Bedingungen weniger überlebende Zellen zurücklassen). Vorzugsweise sind die Zelllinie Hamsterlungen-Fibroblasten V79 von der European Tissue Culture Collection.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die Verwendung einer im ersten Aspekt der Erfindung definierten Verbindung der Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen bereit.
Die im ersten Aspekt der Erfindung definierten Verbindungen der Formel (I) können zusammen mit einem konjugierten Peroxidase-Enzym (beispiels- und vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase) in ADEPT- und PDEPT-Therapieverfahren, oder aber zusammen mit einem Vektor, der in einer Tumorzelle für ein Peroxidase-Enzym kodiert und fähig ist, dieses zu exprimieren, in einem GDEPT-Verfahren eingesetzt werden.
Das aufgrund des Einwirkens des Peroxidase-Enzyms auf die Verbindungen der Formel (I) erzeugte Arzneimittel kann zur selektiven Abtötung von oxischen und hypoxischen Tumorzellen in Verfahren zur Krebsbehandlung verwendet werden, beispielsweise in Fällen von Leukämie und speziell bei festen Krebsarten, einschließlich Brust-, Darm-, Leber-, Kopf- und Hals- sowie Lungen-Tumoren, inklusive Kleinzellen-Karzinomen.
Die im ersten Aspekt der Erfindung definierten Verbindungen der Formel (I) können in Verbindung mit einem Photosensitizer (z. B. Porphyrinen, Phenothiazinen (Methylenblau, Toluidinblau, Thionin), Diodeosin, Hypericin, Phthalocyaninen) in photodynamischen Therapie- (PDT-) Verfahren eingesetzt werden.
Bevorzugte Ausführungsformen des zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung können sich auf unterschiedliche Untergruppen von Verbindungen der Formel (I) beziehen.
Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine im ersten Aspekt der Erfindung definierte Verbindung der Formel (I) zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünner umfassen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Variation des Anteils an überlebenden V79-Zellen über der variierenden Konzentration einer Verbindung der Formel (I), nämlich 5-Fluorindol-3-essigsäure, nach 5-stündiger Inkubation mit oder ohne HRP (1,2 μg/l).
2 zeigt die Variation des Anteils an überlebenden V79-Zellen über der variierenden Konzentration von HRP nach 5-stündiger Inkubation zusammen mit 50 μM derselben Verbindung der Formel (I) wie in 1, nämlich 5-Fluorindol-3-essigsäure.
3 zeigt die Variation des Anteils an überlebenden MCF7- und HT29-Zellen nach Inkubation für variierende Zeitspannen zusammen mit 100 μM derselben Verbindung der Formel (I) wie in den 1 und 2, nämlich 5-Fluorindol-3-essigsäure, mit oder ohne NRP (1,2 μg/l).
4a zeigt die Variation des Anteils an überlebenden V79-Zellen nach einstündiger Inkubation über der variierenden Photolysezeit der Zellen zusammen mit Methylenblau, gegebenenfalls in Gegenwart von Verbindungen der Formel (I), nämlich von 5-Fluorindol-3-essigsäure und 5-Bromindol-3-essigsäure.
4b ist ähnlich wie 4a, mit der Ausnahme, dass Thionin anstelle von Methylenblau eingesetzt wurde.
4c ist ähnlich wie 4a, mit der Ausnahme, dass Toluidinblau anstelle von Methylenblau eingesetzt wurde.
4d ist ähnlich wie 4a, mit der Ausnahme, dass Diodeosin anstelle von Methylenblau eingesetzt wurde.
5 zeigt die Variation des Anteils an überlebenden transfizierten und Vergleichs-T24-Zellen nach 24-stündiger Inkubation über variierenden Konzentrationen von Verbindungen der Formel (I), nämlich von 5-Fluorindol-3-essigsäure und 5-Bromindol-3-essigsäure.
6 zeigt die Variation der Konzentration von 5-Fluorindol-3-essigsäure in Plasma und Geweben nach intraperitonealer Injektion in Mäuse.
Synthesewege
Verbindungen der Formel (I) können auf verschiedenen Wegen hergestellt werden, von denen einige nachstehend beschrieben werden.
Fischer-Indolsynthese
Die Ausgangsmaterialien für dieses Verfahren sind die entsprechenden Phenylhydrazine, die im Handel erhältlich oder aus dem entsprechenden Anilin synthetisierbar sind (K. C. Engvild, Acta Chem. Scand. B 31, 338–339 (1977); S. W. Fox, M. W. Bullock, J. Am. Chem. Soc. 73, 2756–2759 (1951)). Der gesamte Syntheseweg ist in Schema 1 dargestellt.
Schema 1
Einführung der Seitenkette
Wenn das Ausgangs-Indol erhältlich ist (z. B. 7-Chlorindol) oder auf einem der nachstehenden Wege synthetisiert werden kann, kann die Verbindung der Formel (I) durch Einführung der Acetat-Seitenkette in das Ausgangs-Indol unter Verwendung der in Schema 2 gezeigten Reagenzien synthetisiert werden (R. D. Dillard et al., J. Med. Chem. 39, 5119–5136 (1996)).
Schema 2
Halogenierte Verbindungen
Die Ausgangs-Indole von Verbindungen, in denen zumindest einer von R₄, R₅, R₆ und R₇ ein Halogen ist, können speziell nach dem Leimgrüber-Batcho-Verfahren, siehe Schema 3 (A. D. Batcho, W. Leimgrüber, Org. Synth. 63, 214–225 (1985)), oder dem Bartoli-Verfahren, siehe Schema 4 (G. Bartoli, G. Palmieri, Tet. Lett. 30, 2129–2132 (1989)), hergestellt werden.
Schema 4
Arylsubstituierte Verbindungen
Indole, in denen einer oder mehrere von R₄ bis R₇ eine Arylgruppe ist bzw. sind, können mittels Suzuki-Kupplung der geeigneten Arylborsäure mit dem entsprechenden Bromindol unter Anwendung einer Variation des von Carrera eingesetzten Verfahrens hergestellt werden (G. M. Carrera, G. S. Sheppard, Synlett. 1994, 93–94). Dies ist in Schema 5 dargestellt.
Schema 5
R₁ kann in jeder geeigneten Stufe im obigen Syntheseweg durch Deprotonierung des Indol-Stickstoffs mittels einer geeigneten Base (z. B. Natriumhydrid, Natriumcarbonat), gefolgt von der Reaktion mit einem geeigneten Elektrophil, vorzugsweise in der Form RX, worin X ein Halogen ist (z. B. Iodmethan), eingeführt werden.
R₃ kann durch Reaktion der substituierten IAA (R₃ = H) mit der Base LDA, gefolgt von einem Elektrophil eingeführt werden (A. H. Katz et al., Journal of Medicinal Chemistry 31, 1244–50 (1988)). Alternativ dazu könnte die gewünschte Seitenkette beispielsweise durch Reaktion des Ausgangs-Indols mit Natriumhydroxid, Ethanol und Lactonitril zur α-Methyl-IAA in das Ausgangs-Indol eingeführt werden (Erdtmann et al., Acta Chemica Scandinavia 8, 119–123 (1954)).
GDEPT
Vektorsysteme
Allgemein kann der Vektor zur Verwendung in GDEPT-Therapien jeder geeignete DNA- oder RNA-Vektor sein.
Geeignete nichtvirale Vektoren umfassen kationische Liposomen und Polymere. Geeignete virale Vektoren umfassen jene, die auf einem Retrovirus basieren. Derartige Vektoren sind im Fach allgemein zugänglich. Huber et al. (S. o.) berichten über die Verwendung von amphotropen Retroviren zur Transformation von Hepatom-, Brust-, Kolon- oder Hautzellen. Culver et al. (Science 256, 1550–1552 (1992)) beschreiben ebenfalls die Verwendung von retroviralen Vektoren für GDEPT. Derartige Vektoren oder davon abgeleitete Vektoren können ebenso verwendet werden. Auch andere Retroviren können herangezogen werden, um zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung geeignete Vektoren zu erhalten. Derartige Retroviren schließen Rous-Sarkom-Virus (RSV) mit ein.
Englehardt et al. (Nature Genetics 4, 27–34 (1993)) beschreiben die Verwendung von Adenovirus-basierten Vektoren bei der Abgabe des Mukoviszidose-Transmembran-Konduktanz-Produkts ("cystic fibrosis transmembrane conductance product", CFTR) in Zellen, und derartige Adenovirus-basierte Vektoren können ebenfalls eingesetzt werden. Vektoren, die Adenovirus-Promotor und andere Kontrollsequenzen nutzen, können von besonderem Nutzen bei der Abgabe eines Systems gemäß vorliegender Erfindung an Zellen in der Lunge sein und eignen sich daher zur Behandlung von Lungentumoren.
Auch andere Vektorsysteme, einschließlich auf dem Molony-Mäuse-Leukämie-Virus basierender Vektoren, sind bekannt (Z. Ram et al., Cancer Research 53, 83–88 (1993); Dalton und Treisman, Cell 68, 597–612 (1992)). Diese Vektoren enthalten den Mäuse-Leukämie-Virus-Enhancer, der stromauf, an einem β-Globin-Minimalpromotor kloniert wurde. Die untranslatierte β-Globin-5'-Region bis zum Initiationscodon ATG wird bereitgestellt, um die effiziente Translation des Enzyms zu steuern.
Geeignete Promotoren, die in zuvor beschriebenen Vektoren eingesetzt werden können, umfassen MLV-, (Cytomegalievirus-) CMV-, RSV- und Adenovirus-Promotoren. Bevorzugte Adenovirus-Promotoren sind die frühen Adenovirus-Genpromotoren. Auch starke Säugetier-Promotoren können geeignet sein. Ein Beispiel für einen derartigen Promotor ist der EF-1α-Promotor, der nach Mizushima und Nagata (Nucl. Acids Res. 18, 5322 (1990)) erhalten werden kann. Varianten derartiger Promotoren, die im Wesentlichen dieselbe Transkriptionsaktivität beibehalten, können ebenfalls eingesetzt werden.
Andere geeignete Promotoren umfassen gewebespezifische Promotoren sowie Promotoren, die durch kleine Moleküle, Hypoxie oder Röntgenstrahlung aktiverbar sind. Der Einsatz von Hypoxie-regulierter Genexpression zur Gentherapie wird in der EP-A-0.745.131 beschrieben.
HRP ist das Enzym der Wahl für die Aktivierung von Verbindungen der Formel (I). Andere geeignete Peroxidasen umfassen Tabak-Peroxidase, Erdnuss-Peroxidase, Lignin-Peroxidase, Ascorbat-Peroxidase, bakterielle Catalase-Peroxidasen, Hefe-Cytochrom-C-Peroxidase sowie Coprinus cinereus- (Arthomyces ramosus-, Coprinus macrorhizus-) Peroxidase. Synthetische Peroxidasen, wie z. B. Oxoiron-(IV)-tetra(N-methylpyridyl)porphyrine oder Microperoxidasen können ebenso eingesetzt werden. Microperoxidasen können sich als vorteilhaft erweisen, da sie kleine Moleküle sind und es daher weniger wahrscheinlich ist, dass sie immunologische Probleme verursachen. Die Enzyme können durch Standard-DNA-Rekombinationsverfahren, z. B. durch Klonierung des Enzyms, Bestimmung seiner Gensequenz und Änderung der Gensequenz durch Verfahren wie Fusion, Trunkierung, Substitution, Deletion oder Insertion von Sequenzen, beispielsweise durch stellengerichtete Mutagenese, modifiziert werden. Zur Diskussion von Standard-DNA-Rekombinationsverfahren sei auf "Molecular Cloning" von Sambrook et al. (1989, Cold Spring Harbor) verwiesen. Die vorgenommene Modifizierung kann jede beliebige sein, die dem Enzym seine Fähigkeit zur Katalyse der Bildung des Radikalkations in Verbindungen der Formel (I) belässt, jedoch andere Eigenschaften des Enzyms verändert, wie z. B. seine Reaktionsgeschwindigkeit, Selektivität oder immunologischen Eigenschaften.
Außerdem können als Ergebnis der Manipulationen, die zur Herstellung eines Vektors erforderlich sind, in dem eine für das Enzym kodierende Nukleinsäure-Sequenz mit den diversen anderen Vektorsequenzen verbunden ist, kleine Trunkierungen in der N- und/oder C-terminalen Sequenz vorkommen.
HRP wurde in Zielzellen durch Transfektion eines Konstrukts (pRK34-HRP) exprimiert, in dem HRP-cDNA mit der Signalsequenz für das menschliche Wachstumshormon und dem KDEL-Retentionsmotiv fusioniert ist (C. N. Connolly, C. E. Futter, A. Gibson et al., "Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase", J. Cell. Biol. 127, 641–652 (1994)). Für die resultierende HRP hat sich gezeigt, dass sie Indol-3-essigsäure akti viert und toxische Verbindungen erzeugt (O. Greco et al., "Development of an enzymelprodrug combination for gene therapy of cancer", Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 40, 478 (1999)).
ADEPT
Für Anwendungen in ADEPT-Systemen wird ein gegen einen tumorspezifischen Marker gerichteter Antikörper mit dem relevanten Enzym verbunden, das wie oben beschrieben modifiziert sein kann. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff "Antikörper", sofern nichts anderes angegeben wird, auch Fragmente von ganzen Antikörpern, die ihre Bindungsaktivität für ein Tumor-Zielantigen beibehalten. Derartige Fragmente inkludieren Fv-, F(ab')- und F(ab')₂-Fragmente sowie einkettige Antikörper. Weiters können die Antikörper und deren Fragmente humanisierte Antikörper sein, z. B. in der EP-A-239.400 beschriebene Antikörper.
Die Antikörper können durch herkömmliche Hybridom-Techniken oder – im Falle modifizierter Antikörper oder Fragmente – durch DNA-Rekombinationsverfahren erzeugt werden, z. B. durch Expression eines DNA-Konstrukts, das für den bzw. das modifizierte(n) Antikörper oder Fragment kodiert und mit einem Promotor operabel verbunden ist, in einem geeigneten Wirtsvektor. Geeignete Wirtszellen sind u. a. Bakterien- (z. B. E.coli-), Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen. Wenn der Antikörper durch solche Rekombinationstechniken erzeugt wird, kann das Enzym durch Verknüpfung einer für das (gegebenenfalls wie zuvor beschrieben modifizierte) Enzym kodierenden Nukleinsäuresequenz mit dem 3'- oder 5'-Ende der Sequenz des für den Antikörper oder dessen Fragment kodierenden Konstrukts produziert werden.
PDEPT
Damit der PDEPT-Ansatz verfolgt werden kann, muss die gewählte Peroxidase an ein Polymer gebunden werden, das wasserlöslich, biokompatibel und nichtimmunogen ist und das die Aktivität des Enzyms nicht aufhebt. PDEPT ruft wahrscheinlich weniger starke immunogene Wirkung als ADEPT hervor, da das fremde Enzym durch das Polymer maskiert wird. HRP wurde erfolgreich an Polyethylenglykol (PEG) sowie an andere Polymere gebunden (G. Fortier und M. Laliberte, "Surface modification of horseradish peroxidase with polyethylene glycol(s) of various molecular masses (Mr): relationship between the Mr of polyethylene glycol and the stability of horseradish peroxidase-poly(ethylene glycol) adducts unter varios denaturating conditions", Biotechnol. Appl. Biochem. 20, 394–413 (1994)).
PDT
Der Aktivierungsvorgang bei PDT kann äußerst stellenspezifisch erfolgen. Die Richtung und Breite eines Laserstrahls kann mit hoher Genauigkeit gesteuert werden. Daher kann er auf einen sehr eingeschränkten Bereich einwirken, was Schädigungen von benachbartem Gewebe minimiert.
Hochreaktive und somit zytotoxische Spezies können auch bei Aktivierungen mit relativ niedriger Energie erzeugt werden. Beispielsweise unterscheidet sich ein reaktiver angeregter Zustand von molekularem Sauerstoff, der Singulett-Zustand, nur um 90 kJ/mol von seinem Triplett-Grundzustand. Dies ermöglicht jedoch die Bildung ausreichender Konzentrationen der toxischen Spezies mittels Sensitizer, die bei Wellenlängen über 600 nm absorbieren (J. A. S. Carruth, "Clinical applications for photodynamic therapy", J. Photochem. Photobiol. 9, 396–397 (1991)).
Die Haupteinschränkung dieses Ansatzes resultiert aus der Physik des Lichts selbst und dessen Wechselwirkung mit menschlichem Gewebe. Die Fähigkeit von Licht, Gewebe zu durchdringen, hat sich als Wellenlängen-abhängig erwiesen. Die Durchdringungsfähigkeit steigt mit zunehmender Wellenlänge, aufgrund der Lichtstreuung und -reflexion ergeben sich jedoch Einschränkungen. In biologischem Gewebe ist der Streuungskoeffizient, beispielsweise von rotem Licht, viel höher als der Absorptionskoeffizient (J. A. S. Carruth, "Clinical applications for photodynamic therapy", J. Photochem. Photobiol. 9, 396–397 (1991); J. C. Kennedy und R. H. Pottier, "Endogenous protoporphyrin IX, a clinical useful photosensitizer for photodynamic therapy", J. Photochem. Photobiol. 14, 275–292 (1992)). Als Resultat werden Photonen, die in das Gewebe eindringen, mehrfach gestreut, bevor sie entweder absorbiert werden oder diffundieren. Obwohl erwartet werden kann, dass dies die bestimmten Bereichen zugeführte Energie erhöht, führt innere Reflexion zu einer exponentiellen Abnahme des Energieflusses mit zunehmender Entfernung von der Grenzfläche zwischen dem Gewebe und der Luft. Diese Einschränkungen wurden bei der Behandlung von relativ massiven Tumoren, oder wenn ein tieferes Eindringen erforderlich ist, durch Verwendung interstitieller optischer Fasern zum Teil überwunden.
Es wurden verschiedene Tumortypen als potenzielle Ziele von PDT identifiziert. Diese umfassen Kopf- und Hals-Tumoren, Karzinome des Bronchus, bösartige Hirntumoren, oberflächliche Tumoren der Blase und Gefäßerkrankungen, die bei klinischen Versuchen allesamt einen viel versprechenden Response gezeigt haben (J. Regula, A. J. Mac Roberts, A. Gorchein, Buonaccorsi, S. M. Thorpe, G. M. Spencer, A. R. W. Hartfield und S. G. Brown, "Photosensitisation and photodynamic therapy oesophageal, duodenal and colorectal tumours using 5-aminoleavulic acid induced protoporphyrin IX-a pilot study", Gut 36, 67–75 81995)).
Die Induktion von Apoptose bei menschlichen Tumorzellen durch Photoprodukte von mit Riboflavin sensitivierter Indol-3-essigsäure wurde vor kurzem beschrieben (A. M. Edwards et al., "Apoptosis induction in nonirradiated human HL-60 and murine NSO/2 tumor cells by photoproducts of indole-3-acetic acid and riboflavin", Photochemistry and Photobiology 70, 645–649 (1999)).
Die Verwendung von Verbindungen der Formel (I) verbessert PDT. Bei PDT führt die Photolyse von Photosensitizern P gemäß Gleichung (1) zur Reaktion des gebildeten angeregten Triplett-Zustands ³P* mit Sauerstoff im Grundzustand, was zur Bildung von toxischem Singulett-Sauerstoff gemäß Gleichung (2) führt. Ein Nachteil von herkömmlicher PDT ist, dass bei Anoxie keine Toxizität auftritt. Ohne sich an eine bestimmte Theorie binden zu wollen, wird eine Verbindung der Formel (I), nachstehend beispielhaft mit IAA angegeben, durch ³P* oxidiert, was gemäß Gleichung (3) ein Indol-Radikalkation erzeugt, welches – wie zuvor beschrieben – zu toxischen Produkten führt, und zwar unter Beteiligung von Sauerstoff oder nicht. P + hν → ³P* (1) ³P* + O₂ → P + ¹O₂ (2)
Die Kombination – unter aeroben oder anaeroben Bedingungen – einer Verbindung der Formel (I) mit einem Photosensitizer sollte eine niedrigere Konzentration an Photosensitizer ergeben, die erforderlich ist, um dieselbe Toxozität zu erzielen. Dies würde die durch die Bestrahlung hervorgerufene Schädigung von normalem Gewebe nach der Behandlung verringern, die bis zu mehrere Wochen nach der Behandlung auftreten kann. Die Sensitizer-Wirkung von IAA-Derivaten sollte zumindest einige Stunden lang anhalten, bis die IAA ausgeschieden wird.
Die zuvor beschriebene PDT-Technik kann unter Verwendung einer Kombination von geeigneten Verbindungen der Formel (I) und Photosensitizern angewandt werden. Die bevorzugte Wellenlänge des eingesetzten Lichts beträgt 500 bis 800 nm.
Anwendungen der Erfindung
Verbindungen der Erfindung können in vitro oder in vivo für eine Reihe von Anwendungen eingesetzt werden. Beispielsweise wurde für GDEPT eine Anzahl von Vektorsystemen zur Expression von Peroxidasen in einer Zelle entwickelt. Die Weiterent wicklung derartiger Systeme (z. B. die Entwicklung von für spezielle Zelltypen geeigneten Promotoren) erfordert geeignete Prodrug-Kandidaten, die nach Aktivierung mit Peroxidase zur Abtötung von Zellen fähig sind. Prodrug-Verbindungen der Formel (I), die für Peroxidasen anfällig sind, können in derartigen Modellsystemen eingesetzt werden. Die Modellsysteme können In-vitro-Modellsysteme oder In-vivo-Xenotransplantat-Modellsysteme sein, die beispielsweise in Nacktmäuse implantierte menschliche Tumorzellen umfassen.
Verbindungen der Formel (I) in Kombination mit Photosensitizern, die durch Licht mit einer Wellenlänge zwischen 500 und 800 nm aktiviert werden, können in vitro – zusammen mit anderen geeigneten Formen der Aktivierung – gegen Panels von unterschiedlichen Tumorzelltypen getestet werden, um die Wirksamkeit gegen derartige Tumorzellen zu bestimmen. Die Wirksamkeit von Verbindungen der Erfindung gegenüber einer Reihe von Tumorzelltypen kann als Anhaltspunkt für die Entwicklung weiterer Antitumorverbindungen dienen.
Verbindungen der Formel (I) können auch in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers eingesetzt werden. Derartige Behandlungen umfassen Verfahren zur Behandlung des Wachstums von neoplastischen Zellen in einem Patienten mit einer neoplastischen Erkrankung, welche die Verabreichung von Verbindungen der Formel (I) als Teil eines ADEPT-, GDEPT-, PDEPT- oder PDT-Systems an einen Patienten umfassen, der die Behandlung braucht, wobei die neoplastischen Erkrankungen Leukämie und massive Tumoren umfasst, wie z. B. Eierstock-, Kolon-, Lungen-, Nieren-, Brust-, Darm-, Kopf- und Hals-, CNS-Tumoren und Melanome.
Es versteht sich, dass bezüglich der Behandlung von Tumoren eine solche Behandlung jegliche vom Arzt getroffene Maßnahmen zur Linderung der Auswirkungen des Tumors auf den Patienten umfasst. Obwohl die vollständige Rückbildung des Tumors ein wünschenswertes Ziel ist, umfasst eine wirksame Behandlung somit auch jegliche Maßnahmen, mit denen eine teilweise Rückbildung des Tumors sowie eine Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, einschließlich seiner Metastasen, erzielt werden kann. Derartige Maßnahmen können wirksam das Leben verlängern und/oder die Lebensqualität verbessern und die Krankheitssymptome lindern.
Therapien
Nachstehend werden ADEPT-, GDEPT- und PDEPT-Verfahren beschrieben. Die Grundlage von PDT wurde bereits zuvor erläutert, die nachstehenden Informationen bezüglich der Verabreichung von Produkten bezieht sich allerdings auch auf diese Art der Therapie.
ADEPT-Therapie
Das Antikörper/Enzym-Konjugat für ADEPT kann gleichzeitig mit dem Prodrug verabreicht werden, häufig erscheint es jedoch in der klinischem Praxis vorteilhaft, das Antikörper/Enzym-Konjugat vor dem Prodrug zu verabreichen, z. B. bis zu 72 Stunden oder sogar 1 Woche davor, um dem Antikörper/Enzym-Konjugat die Möglichkeit zu geben, sich im Bereich des Tumorziels zu lokalisieren bzw. konzentrieren. Durch diese Vorgangsweise bei der Verabreichung des Prodrugs ist die Umwandlung des Prodrugs in das zytotoxische Mittel tendenziell auf jene Bereiche beschränkt, in denen sich das Antikörper/Enzym-Konjugat konzentriert, d. h. im Bereich des Zieltumors. Auf diese Weise wird eine vorzeitige Freisetzung der aufgrund der Einwirkung der Peroxidase auf die Prodrugs der vorliegenden Erfindung gebildeten Verbindung minimiert.
Bei ADEPT kann der Grad der Lokalisierung des Enzym/Wirkstoff-Konjugats (ausgedrückt als Verhältnis zwischen lokalisiertem und frei zirkulierendem aktivem Konjugat) weiter erhöht werden, indem die in der WO 89/10140 beschriebenen Clearance- und/oder Inaktivierungssysteme eingesetzt werden. Dies umfasst – üblicherweise nach der Verabreichung des Konjugats und vor der Verabreichung des Prodrugs – die Verabreichung einer Komponente (einer "zweiten Komponente"), die in der Lage ist, sich an einen Teil des Konjugats zu binden, um das Enzym im Blut zu inaktivieren und/oder die Clearance des Konjugats aus dem Blut zu beschleunigen. Eine derartige Komponente einen Antikörper gegen die Enzym-Komponente des Systems umfassen, der fähig ist, das Enzym zu inaktivieren.
Die zweite Komponente kann an ein Makromolekül gebunden sein, wie z. B. ein Dextran, ein Liposom, Albumin, Macroglobulin oder einen Blutgruppe-0-Erythrozyten, so dass die zweite Komponente daran gehindert wird, den Gefäßbereich zu verlassen. Zusätzlich oder alternativ dazu kann die zweite Komponente eine ausreichende Anzahl an kovalent gebundenen Galactoseresten oder an Resten anderer Zucker, wie z. B. Lactose oder Mannose, umfassen, damit sie sich im Plasma an das Konjugat binden kann, aber unter Einwirkung von Rezeptoren für Galactose oder andere Zucker in der Leber zusammen mit dem Kunjugat aus dem Plasma entfernt wird. Die zweite Komponente sollte so für ihren Einsatz konstruiert und verabreicht werden, dass sie in nicht nennenswertem Ausmaß in den extravaskulären Raum des Tumors eindringen kann, wo sie das lokalisierte Konjugat vor und während der Verabreichung des Prodrugs inaktivieren könnte.
Bei ADEPT-Systemen obliegt die Entscheidung bezüglich der Dosierung des Prodrugs und des Konjugats schlussendlich dem Arzt, der dabei Faktoren wie Alter, Gewicht und Zustand des Patienten zu berücksichtigen hat. Geeignete Dosen von Prodrug und Konjugat finden sich bei Bagshawe et al., Antibody, Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals 4, 915–922 (1991). Eine geeignete Dosis des Konjugats kann von 500 bis 200.000 Enzymeinheiten/m² (z. B. 20.000 Enzymeinheiten/m²) reichen, und eine geeignete Dosis des Prodrugs kann von etwa 0,1 bis 200 mg/kg, vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 100 mg/kg, Körpergewicht des Patienten pro Tag reichen.
Zur Sicherstellung einer maximalen Konzentration des Konjugats an der Stelle der gewünschten Behandlung ist es normalerweise wünschenswert, die Verabreichung der beiden Komponenten um zumindest 4 Stunden zeitversetzt vorzunehmen. Das genaue Schema wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst, wie z. B. die Art des Tumors, auf den abgezielt wird, und die Art des Prodrugs, allerdings stellt sich üblicherweise innerhalb von 48 Stunden eine geeignete Konzentration des Konjugats an der Stelle der gewünschten Behandlung ein.
Die Abzielungsstrategie kann bei manchen Kombinationen von Prodrug und Peroxidase durch gezielte Abgabe des Wasserstoffperoxid-Cofaktors an den Tumor unterstützt werden. Gezielte Abgabe von entweder Polymer- oder Antikörper-gebundener Glucose-Oxidase wird beispielsweise von M. Samoszuk, J. Emerson, V. Nguyen et al., "Targeting of glucose oxidase to murine lymphoma allografts", Tumor Targeting 1, 37–43 (1995), und von O. Ben-Yoseph, B. D. Ross, "Oxidation therapy: the use of a reactive oxygen species-generating enzyme system for tumour treatment", Br. J. Cancer 70, 1131–1135 (1994), beschrieben.
Das Antikörper/Enzym-Konjugat kann auf jede geeignete Art verabreicht werden, die üblicherweise bei ADEPT-Therapien eingesetzt wird. Dies umfasst auch die parenterale Verabreichung des Antikörpers auf eine Weise und in Formulierungen ähnlich den nachstehend beschriebenen.
PDEPT-Therapie
Wie bei der ADEPT-Therapie kann das Polymer/Enzym-Konjugat gleichzeitig verabreicht werden, häufig erscheint es jedoch in der klinischem Praxis vorteilhaft, das Polymer/Enzym-Konjugat vor dem Prodrug zu verabreichen, z. B. bis zu 72 Stunden oder sogar 1 Woche davor, um dem Polymer/Enzym-Konjugat die Möglichkeit zu geben, sich im Bereich des Tumorziels zu lokalisieren bzw. konzentrieren und dadurch die Reaktion von Enzym und Prodrug an einer anderen als der gewünschten Aktivitätsstelle zu verhindern.
Dosierung und Verabreichung von Polymer/Enzym und Prodrug sind wie zuvor für ADEPT beschrieben.
GDEPT-Therapie
Zur Verwendung der Vektoren bei der Therapie werden die Vektoren üblicherweise in virale Teilchen verpackt und die Teilchen der Tumorstelle zugeführt, beispielsweise wie von Ram et al. (s. o.) beschrieben. Die Virusteilchen können so modifiziert werden, dass sie einen Antikörper, Fragmente davon (einschließlich einkettiger) oder einen Tumor-gerichteten Liganden enthalten, um die Abzielung auf den Tumor zu unterstützen. Alternativ dazu können die Vektoren in Liposomen verpackt werden. Die Liposomen können auf einen bestimmten Tumor abgezielt werden. Dies kann durch Bindung eines Tumor-gerichteten Antikörpers an das Liposom erzielt werden. Virusteilchen können ebenfalls in Liposomen miteinbezogen werden. Die Teilchen können auf jede geeignete, dem Arzt zur Verfügung stehende Weise dem Tumor zugeführt werden. Vorzugsweise sind die viralen Teilchen in der Lage, die Tumorzellen selektiv zu infizieren. Mit "selektivem Infizieren" ist gemeint, dass die viralen Teilchen primär Tumorzellen infizieren und dass der Anteil an infizierten Nicht-Tumorzellen so gering ist, dass die Schädigung von Nicht-Tumorzellen durch die Verabreichung eines Prodrugs – je nach Art der zu behandelnden Krankheit – annehmbar niedrig liegt. Schlussendlich obliegt die Entscheidung darüber dem behandelnden Arzt.
Ein geeigneter Verabreichungsweg ist mittels Injektion der Teilchen in steriler Lösung. Viren, wie z. B. solche, die aus packenden Zelllinien isoliert wurden, können ebenfalls durch regionale Perfusion oder direkte intratumorale Injektion oder durch direkte Injektion in eine Körperhöhle (intercaviterielle Verabreichung), beispielsweise durch intraperitoneale Injektion, verabreicht werden.
Der genaue Dosierungsplan muss bei GDEPT selbstverständlich von jeweiligen klinischen Arzt für den jeweiligen Patienten individuell bestimmt werden, was wiederum durch die genaue Art des Prodrugs und des aus dem Prodrug freizusetzenden zytotoxischen Mittels gesteuert wird. Allgemeine Richtlinien können jedoch angegeben werden. Eine Chemotherapie dieser Art umfasst normalerweise die parenterale Verabreichung von modifiziertem Virus, wobei sich eine Verabreichung auf intravenösem Wege häufig als am praktischsten erweist. Der GDEPT-Ansatz kann mit Radiotherapie kombiniert werden, um die Effizienz weiter zu steigern. Wenn GDEPT mit Radiotherapie kombiniert wird, kann die Kombination aus der Verbindung der Formel (I) und dem GDEPT-System als Radiosensitizer angesehen werden.
Bei GDEPT-Systemen ist die Menge an viralem oder anderem zugeführtem Vektor so bemessen, dass eine ausreichend hohe Zellkonzentration des Enzyms bereitgestellt wird, um die wirksame Umwandlung von Prodrugs zu Zytotoxinen zu katalysieren. Typischerweise wird der Vektor dem Patienten verabreicht und anschließend die Aufnahme des Vektors durch transfizierte oder infizierte (im Fall von viralen Vektoren) Zellen verfolgt, beispielsweise durch Abnahme und Analyse einer Biopsie-Probe des Gewebes, auf das abgezielt wird. Dies kann durch klinische Versuche bestimmt werden, welche die Verabreichung einer Reihe von Testdosen an einen Patienten und die Messung des Ausmaßes an Infektion oder Transfektion einer Zielzelle oder eines Zieltumors umfasst. Die erforderliche Menge an Prodrug ist dabei ähnlich jener bei ADEPT-Systemen oder höher.
Bei Anwendung von GDEPT-Systemen wird das Prodrug üblicherweise nach der Verabreichung des für ein Enzym kodierenden Vektors verabreicht. Geeignete Dosen an Prodrug liegen bei etwa 0,1 bis 200 mg/kg, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 100 mg/kg, Körpergewicht des Patienten pro Tag.
Verabreichung von Prodrugs
Obwohl es möglich ist, dass die Verbindungen der Formel (I) alleine verabreicht werden, wird bei Verwendung in beliebigen der zuvor erwähnten Verfahren bevorzugt, sie als pharmazeutische Formulierungen darzubieten. Die Formulierungen umfassen die Verbindungen zusammen mit einem oder mehreren annehmbaren Trägern dafür sowie gegebenenfalls anderen therapeutischen Bestandteilen oder Verdünnern. Der oder die Träger müssen insofern "annehmbar" sein, als darunter verstanden wird, dass sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich und für den Empfänger derselben unschädlich sind, was z. B. für Liposomen zutrifft. Geeignete Liposomen umfassen beispielsweise jene, die das positiv geladene Lipid N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA) enthalten, jene, die Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) enthalten, sowie jene, die 3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin (DC-Chol) enthalten.
Zur parenteralen oder intramuskulären Verabreichung geeignete Formulierungen umfassen wässrige und nichtwässrige sterile Injektionslösungen, die gegebenenfalls Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika, bakterizide Antibiotika und gelöste Stoffe enthalten können, welche die Formulierung mit dem Blut des geplanten Empfängers isotonisch machen; und wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, die gegebenenfalls Suspendiermittel und Verdicker enthalten, sowie Liposomen und andere mikropartikuläre Systeme, die zum Abzielen der Verbindung auf Blutkomponenten oder auf ein oder mehrere Organe dienen. Die Formulierungen können in Einfach- oder Mehrfachdosis-Behältern, z. B. in dicht verschlossenen Ampullen und Fläschchen, angeboten werden und können in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, der lediglich die Zugabe eines sterilen flüssigen Trägers, z. B. Wasser zur Injektion, unmittelbar vor Verwendung erfordert. Injektionslösungen und -suspensionen können ad hoc aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Es versteht sich, dass die Formulierungen zusätzlich zu den zuvor speziell beschriebenen Bestandteilen – je nach Art der jeweiligen Formulierung – auch andere her kömmlicherweise im Fach eingesetzte Mittel enthalten können. Von all den möglichen Formulierungen werden sterile, pyrogenfreie, wässrige und nichtwässrige Lösungen bevorzugt.
Die Dosen können nacheinander, z. B. in stündlichen, täglichen, wöchentlichen oder monatlichen Intervallen, oder als Reaktion auf spezielle Erfordernisse des Patienten verabreicht werden. Bevorzugte Verabreichungswege sind orale Zufuhr und Injektion, typischerweise parenterale oder intermuskuläre Injektion oder intratumorale Injektion. In PDT-Verfahren können dermale oder topische Verabreichung bevorzugt werden, z. B. subkutane Injektion oder Cremen und Salben; derartige Verabreichungswege sind allgemein bekannt.
Der genaue Dosierungsplan muss selbstverständlich von jeweiligen klinischen Arzt für den jeweiligen Patienten individuell bestimmt werden, was wiederum durch die genaue Art der Verbindung der Formel (I) gesteuert wird. Allgemeine Richtlinien können jedoch angegeben werden. Typische Dosierungsbereiche sind allgemein die oben beschriebenen, die in einer einzigen oder in mehreren Dosen verabreicht werden können. In Abhängigkeit vom Zustand des Patienten und von anderen Faktoren kann der behandelnde Arzt auch andere Dosierungen festlegen.
Die folgenden Beispiele dienen zur Illustration der Erfindung.
Versuchsdetails
Alle luftempfindlichen Reaktionen wurden unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Die Glasgeräte wurden ofengetrocknet und vor Verwendung in wasserfreier Atmosphäre abgekühlt. Die Schmelzpunkte wurden unter Verwendung eines Gallenkamp-Schmelzpunktmessgeräts bestimmt und sind unkorrigiert. NMR-Spektren (60 MHz) wurden auf einem Jeol MY60-Spektrometer aufgenommen. Massenspektren wurden wurden auf einem Waters Integrity HPLC/MS-System aufgenommen.
Beispiel 1
Allgemeines Verfahren der Fischer-Indolsynthese (K. C. Engvild et al., s. o.) (siehe Überblick in Schema 1)
L-Glutaminsäure (30 mmol) (oder das geeignete Derivat) wurde in einer äquimolaren Menge an 2 M Natriumhydroxid gelöst und auf 0°C gekühlt. Natriumhypochlorit-Lösung (1 Äquivalent) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 0°C 1 h lang gerührt. 3 M Salzsäure (3 Äquivalente) wurde anschließend zugesetzt und das Gemisch bei 55°C gerührt, bis es im Stärke-Iodid-Test negativ war. Das substituierte Phenylhydrazin-hydrochorid (typischerweise 10 mmol) wurde der warmen Lösung zugesetzt und das Gemisch 1 h lang gerührt, während es auf Raumtemperatur abkühlte. Das Gemisch wurde dann mit Ethylacetat (3 × 50 ml) extrahiert, die vereinigten organischen Extrakte über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um das rohe Phenylhydrazon zu ergeben.
Dieses Produkt wurde danach in Pyridin (24 ml) gelöst. Konz. Salzsäure (31 ml) wurde zugesetzt, gefolgt von 85%iger Phosphorsäure (8–10 ml), und das Gemisch wurde unter Inertatmosphäre 18 h lang rückflusserhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde auf dasselbe Volumen an eiskaltem Wasser gegossen, anschließend mit Diethylether (3 × 75 ml) extrahiert, die vereinigten Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um das Rohprodukt zu ergeben, das durch Umkristallisation mit Chloroform gereinigt wurde.
Beispiel 1(a): 5-Chlorindol-3-essigsäure (SR024)
Cremefarbene Nadeln; Ausbeute 11%; Fp. 160–161°C (Lit.: 158–159°C); m/z 209 (M⁺), 164 (M⁺ – CO₂H), 128; δH/ppm (CDCl₃) 7,66 (1H, s), 7,19 (3H, m), 3,74 (2H, s); gef.: C 57,05%, H 3,82%, N 6,62% (ber.: C 57,30%, H 3,85%, N 6,68%).
Beispiel 1(b): 7-Fluorindol-3-essigsäure (SR022)
Beigefarbenes Pulver, Ausbeute 24%, Fp.: 159–161°C (Lit.: 161–162°C); m/z 193 (M⁺), 148 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm (CD₃COOD₃) 7,63–6,78 (4H, m, ArH), 3,71 (2H, s, ArCH₂).
Beispiel 1(c): 5-Trifluormethoxyindol-3-essisäure (SR073)
Weißes Pulver; Ausbeute 7%; Fp. 120–122°C; m/z 259 (M⁺), 214 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm (CDCl₃) 7,43–7,11 (4H, m, ArH), 3,76 (2H, s, ArCH₂); gef.: C 50,96%, H 3,18%, N 5,40% (ber.: C 50,98%, H 3,11%, N 5,40%).
Beispiel 1(d): 5-Fluor-2-methylindol-3-essigsäure (SR036)
Weiße Plättchen, Ausbeute 10%, Fp.: 182–184°C (Lit.: 179–182°C); m/z 207 (M⁺), 162 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm (CD₃COOD₃) 7,24–6,60 (3H, m, ArH), 3,65 (2H, s, ArCH₂), 2,36 (3H, s, 2-Me).
Beispiel 1(e): 7-Fluor-5-methylindol-3-essisäure (SR109)
Cremefarbenes Pulver; Ausbeute 5%; Fp. 138–140°C; m/z 207 (M⁺), 162 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm (CD₃COCD₃) 7,29–7,13 (2H, m, ArH), 6,78–6,56 (1H, m, ArH), 3,69 (2H, s, ArCH₂), 2,38 (3H, s, 5-Me); gef.: C 62,89%, H 4,86%, N 6,57% (ber.: C 63,76%, H 4,86%, N 6,76%).
Beispiel 1(f): 7-Fluor-4-methylindol-3-essigsäure (SR148)
Blass-beigefarbenes Pulver; Ausbeute 4%; Fp. 162–164°C (Zers.); m/z 207 (M⁺), 162 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm (CD₃COOD₃) 7,25 (1H, m, ArH), 6,71 (1H, m, ArH), 6,56 (1H, ArH), 3,87 (2H, s, ArCH₂), 2,58 (3H, s, 4-CH₃).
Beispiel 1(g): 4,6-Dichlorindol-3-essisäure (SR085)
Cremefarbene Nadeln; Ausbeute 5%; Fp. 223–224°C (Lit.: 210–214°C); m/z 245, 243 (M⁺), 200, 198 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm (CD₃COOD₃) 7,31 (2H, br, ArH [H2, H7]), 6,98 (1H, s, ArH [H5]), 3,97 (2H, s, ArCH₂).
Beispiel 1(h): 5-Chlor-7-fluorindol-3-essisäure (SR091)
Weißes Pulver; Ausbeute 4%; Fp. 164–166°C; m/z 229, 227 (M⁺), 184, 182 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm (CD₃COOD₃) 7,69–6,76 (3H, m, ArH), 3,72 (2H, s, ArCH₂),; gef.: C 51,57%, H 3,26%, N 6,01% (ber.: C 52,77%, H 3,10%, N 6,15%; ber. C₁₀H₇CIFNO₂ × 0,25H₂O: C 51,72%, H 3,26%, N 6,04%).
Beispiel 2
Allgemeines Verfahren zur Synthese von substituierten Indolessisäuren aus dem substituierten Ausgangsindol (R. D. Dillard et al., s. o.) (siehe Schema 2)
Das im Handel erhältliche oder wie nachstehend erläutert synthetisierte substituierte Indol (typischerweise 5–10 mmol) wurde in trockenem TNF (20 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. N-Butyllithium (1,1 Äquivalente) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 0°C 20 min lang gerührt. Zinkchlorid (1,1 Äquivalente einer 1 M Lösung in Diethylether) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt. Ethyl-bromacetat (1,1 Äquivalente) wurde danach innerhalb von 5 min zugesetzt, und das Gemisch wurde weitere 24 h lang gerührt. Wasser (20 ml) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde anschließend mit Ethylacetat (3 × 30 ml) extrahiert, die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), und die Lösung im Vakuum eingeengt, um das Rohprodukt zu ergeben. Das Rohmaterial wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (Hexan : EtOAc = 3 : 1) gereinigt, was das substituierte Ethyl-indolyl-3-acetat in mäßiger bis geringer Ausbeute ergab, wobei in den meisten Fällen beträchtliche Mengen an Ausgangsmaterial wiedergefunden wurden. Verseifung erfolgte durch 4-stündiges Erhitzen des Esters unter Rückfluss in 10%iger methanolischer NaOH (40 ml), wonach das Gemisch mit 1 M Salzsäure angesäuert und die ausgefällte Indol-3-essigsäure abfiltriert wurde. Weitere Reinigung erfolgte durch Umkristallisation aus Chloroform.
Beispiel 2(a): 7-Chlorindol-3-essisäure (SR052)
Aus im Handel erhältlichem Ausgangsmaterial; cremefarbene Nadeln; Ausbeute 11%; Fp. 164–165°C (Lit.: 163–165°C); m/z 211, 209 (M⁺), 164 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm (CD₃COOD₃) 7,61–6,99 (4H, m, ArH), 3,77 (2H, s, ArCH₂); gef.: C 55,51%, H 3,77%, N 6,42% (ber.: C 57,30%, H 3,85%, N 6,68%).
Beispiel 3
Allgemeines Verfahren zur Leim rüber-Batcho-Synthese des Indols (A. D. Batcho et al., s. o.) (siehe Überblick in Schema 3)
5 g des halogenierten Nitrotoluols wurden zusammen mit N,N-Dimethylformamid-dimethylacetal (1,1 Äquivalente) und Pyrrolidin (1,1 Äquivalente) erhitzt, bis die Reaktion anhand von Dünnschichtchromatographie als vollständig abgelaufen bewertet wurde. Zugabe von Methanol und Einengen unter reduziertem Druck ergaben das β-Pyrrolidinostyrol entweder als dunkelrotes Öl oder als kristallinen Feststoff, das bzw. der anschließend ohne weitere Reinigung reduziert wurde.
Das β-Pyrrolidinostyrol (ca. 20 mmol) wurde in Methanol (50 ml) gelöst. Raney-Nickel (0,5 ml einer 50%igen (Gew./Vol.) Aufschlämmung in Wasser) und Hydrazinhydrat (30 mmol) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 45°C 30 min lang gerührt, wonach eine weitere Portion Hydrazinhydrat (30 mmol) zugesetzt und das Gemisch bei 45–50°C eine weitere Stunde lang gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celite filtriert und das Filtrat eingedampft, was ein braunes Öl ergab, das mittels Flash-Säulenchromatographie (Hexan : EtOAc = 4 : 1) gereinigt wurde, um das resultierende Indol zu ergeben. Die Indol-3-essigsäure wurde im Anschluss daran über den Ethylester synthetisiert, wie zuvor in Beispiel 2 beschrieben.
Beispiel 3(a): 4-Fluorindol-3-essisäure (SR039)
Bräunlich-weiße Prismen; Ausbeute 22%; Fp. 129–131°C (Lit.: 128–129°C); m/z 193 (M⁺), 148 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm (CD₃COOD₃) 7,23–6,49 (4H, m, ArH), 3,85 (2H, s, ArCH₂); gef.: C 61,87%, H 4,19%, N 7,12% (ber.: C 62,18%, H 4,17%, N 7,25%).
Beispiel 3(b): 6-Fluorindol-3-essisäure (SR043)
Cremefarbene Nadeln; Ausbeute 30%; Fp. 161–163°C (Lit.: 165°C); m/z 193 (M⁺), 148 (M⁺ – CO₂H), 101; δH/ppm (CD₃COCD₃) 7,61–6,43 (4H, m, ArH), 3,73 (2H, s, ArCH₂); gef.: C 62,08%, H 4,18%, N 7,22% (ber.: C 62,18%, H 4,17%, N 7,25%).
Beispiel 3(c): 6-Chlorindol-3-essigsäure (SR058)
Hellrosa Plättchen; Ausbeute 14%; Fp. 183–185°C (Lit.: 182–184°C); m/z 209 (M⁺), 164 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm 7,66–7,06 (4H, m, ArH), 3,71 (2H, s, ArCH₂); gef.: C 57,38%, H 3,84%, N 6,67% (ber.: C 57,30%, H 3,85%, N 6,68%).
Beispiel 3(d): 6-Bromindol-3-essigsäure (SR069)
Hellrosa glänzende Flocken; Ausbeute 12%; Fp. 174–176°C (Lit.: 172–177°C); m/z 255, 253 (M⁺), 210, 208 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm (CD₃COOD₃) 7,61–7,12 (4H, m, ArH), 3,76 (2H, s, ArCH₂); gef.: C 44,79%, H 3,20%, N 5,11% (ber.: C 47,27%, H 3,17%, N 5,51%).
Beispiel 4
Allgemeines Verfahren zur Herstellung von Arylindolen durch Suzuki-Kupplung von Bromindolen (siehe Überblick in Schema 5)
Das geeignete Bromindol (2–5 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) (5 Mol-%) wurden in Toluol (15 ml) unter Stickstoff 5 min lang gerührt, wonach die Arylborsäure (1,1 Äquivalente) in Ethanol (4 ml) zugesetzt wurde, gefolgt von wässrigem Natriumcarbonat (2 Äquivalente); anschließend wurde das Gemisch unter Stickstoff 24 h lang auf 80°C erhitzt. Wasser (20 ml) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde mit Ethylacetat (3 × 50 ml) extrahiert, die organischen Phasen getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, was das Rohprodukt ergab, das mittels Säulenchromatographie (Hexan : EtOAc = 3 : 1) gereinigt wurde, um das reine Arylindol zu ergeben. Die Indol-3-essigsäure wurde im Anschluss daran über den Ethylester synthetisiert, wie zuvor in Beispiel 2 beschrieben.
Beispiel 4(a): 5-(4-Chlorphenyl)indol-3-essigsäure (SR150)
Weiße Flocken; Ausbeute 15%; Fp. 166–168°C; m/z 287, 285 (M⁺), 242, 240 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm (CD₃COOD₃) 7,84–7,28 (8H, m, ArH), 3,77 (2H, s, ArCH₂); gef.: C 67,05%, H 4,20%, N 4,83% (ber.: C 67,26%, H 4,23%, N 4,90%).
Beispiel 5
Allgemeines Verfahren zur Synthese von Indolen nach dem Bartoli-Verfahren (G. Bartoli et al., s. o.) (siehe Überblick in Schema 4)
Das geeignete 2-substituierte Nitrobenzol (typischerweise 5–10 mmol) wurde in THF (20 ml) gelöst und auf –40°C abgekühlt. Vinylmagnesiumbromid (3 Äquivalente einer 1 M Lösung in Ether) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde bei –40°C 20 min lang gerührt und anschließend auf gesättigte Ammoniumchlorid-Lösung gegossen. Das Gemisch wurde mit Diethylether (3 × 50 ml) extrahiert, die vereinigten organischen Extrakte getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, was das rohe Indol ergab, das mittels Flash-Chromatographie gereinigt wurde. Die resultierenden Indol-Zwischenprodukte können nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren in die entsprechenden Indol-3-essigsäuren übergeführt werden.
Beispiel 5(a): 7-Bromindol-3-essisäure
7-Bromindol: blassbraune Nadeln; Ausbeute 24%; Fp. 42–44°C (Lit. (Aldrich Chemikalienkatalog): 41–44°C); m/z 197, 195 (M⁺).
Beispiel 5(b): 6,7-Dichlorindol-3-essigsäure
6,7-Dichlorindol: cremefarbene, flockige Nadeln; Ausbeute 25%; Fp. 50–52°C; m/z 185, 187, 189 (Verhältnis 9 : 6 : 1, M⁺), 150, 152 (M⁺ – Cl).
Beispiel 6 N-substituierte Indol-3-essigsäuren Beispiel 6(a): 6-Chlor-1-methylindol-3-essigsäure (SR139)
Natriumhydrid (0,19 g) einer 60%igen Suspension in Öl) wurde in trockenem THF (10 ml) suspendiert. 6-Chlorindol-3-essigsäure (SR058) (100 mg, 0,48 mmol) in THF (5 ml) wurde zugetropft und das Gemisch danach 10 min lang gerührt. Iodmethan (0,34 g, 2,4 mmol) wurde anschließend zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das überschüssige Natriumhydrid wurde durch Zutropfen von Wasser sorgfältig zerstört, wonach das Gemisch angesäuert (1 M HCl) und mit Ethylacetat (3 × 50 ml) extrahiert wurde; die organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel abgedampft, was ein braunes Pulver ergab. Ausbeute: 75 mg, 70%; Fp. 130–132°C (Zers.); m/z 225, 223 (M⁺), 180, 178 (M⁺ – CO₂H); δH/ppm 7,46–6,92 (4H, m, Ar-H), 3,77 (3H, s, N-Me), 3,70 (2H, s, ArCH₂).
Beispiel 6(b): 5-Fluor-1-methylindol-3-essisäure (SR164)
Synthetisiert wie in Beispiel 6(a); weiße Nadeln; Ausbeute 52%; Fp. 134–136°C; m/z 207 (M⁺), 162 (M⁺ – CO₂H).
Beispiel 7: Messungen der zytotoxischen Wirkung einer Behandlung mit Verbindungen der Formel (I) und Merrettichperoxidase (HRP) unter Verwendung von Hamster(V79-) und menschlichen (MCF7- und HT29-) Zelllinien in vitro
Beispiel 7(a): V79-Zellen
Hamsterlungen-Fibroblasten-V79-Zellen wurden von der European Tissue Culture Collection erhalten. Die Zellen wurden über das Wochenende in 75-ml-Gewebekulturschalen als gebundene Zellen in Eagle's Modified Essential Medium (EMEM), das mit 10% fötales Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänzt worden war, gezüchtet und in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C in 5% CO₂/Luft inkubiert. Die Zellen wurden durch eine Trypsinbehandlung entfernt, sobald eine konfluente Schicht gewachsen war: die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung und 2 ml 0,5% (Gew./Vol.) Schweinetrypsin, dem 0,2% (Gew./Vol.) EDTA zugesetzt worden waren, einige Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen, bis die Zellen gelockert waren. Das Trypsin wurde durch Zusatz von 10 ml schleudermodifiziertem EMEM (ergänzt mit 7,5% fötalem Kälberserum) gestoppt, und die Zellen wurden in einer Schleuder-Kultur wachsen gelassen und mit 5% CO₂/Luft vorbegast, wobei die Zellen in logarithmischer Wachstumsphase gehalten wurden.
Die Zellen wurden für Toxizitätsmessungen vorbereitet, indem sie gezählt und pro Probe je drei Mal mit 200, 2.000 oder 20.000 Zellen/6 cm Petrischale in 3 ml EMEM ausplattiert wurden. Die Zellen wurden zumindest 1 Stunden lang binden gelassen, wonach das Medium entfernt und 2 ml Phenolrot-freie ausgeglichene Hank-Salzlösung entweder alleine (Vergleich) oder mit 50 oder 100 μM der zu testenden Verbindung der Formel (I) zugesetzt wurden. HRP (50 μl von 0,048 mg/ml) wurde jenen Testschalen, die es erforderten, zugesetzt, und die Zellen wurden 0, 0,5, 1, 1,5 oder 2 Stunden lang im Inkubator belassen. Nach der Inkubationszeit wurde das Arzneimittel entfernt, die Zellen wurden mit 2 ml Hank-Lösung gewaschen, und dann wurden 4 ml EMEM zugesetzt. Die Zellen wurden 7 Tage lang zu Kolonien von > 50 Zellen wachsen gelassen. Nach 7 Tagen wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden 5 Minuten lang mit 75% Methanol fixiert. Das Methanol wurde dann entfernt, und die Zellen wurden 5 Minuten lang mit 1% (Gew./Vol.) Kristallviolett eingefärbt. Dann wurden die Zellen gewaschen und die Kolonien gezählt. Die Überlebensrate der Zellen wurde bestimmt, indem das Verhältnis zwischen wachsenden Kolonien und unbehandelten Vergleichszellen bestimmt wurde.
In Tabelle 1 zeigen die Werte den überlebenden Anteil nach 2-stündiger Behandlung mit den IAA-Derivaten in den angegebenen Konzentrationen, zusammen mit HRP (1,2 μg/ml). Sofern nicht anders angegeben (durch n = Anzahl an Einzelversuchen) sind die Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Versuchen angegeben. Nach diesen Zeitspannen und bei diesen Konzentrationen wurde mit IAA-Derivaten alleine oder mit HRP alleine keine detektierbare zytotoxische Wirkung beobachtet.
Tabelle 1
Die 1 und 2 beziehen sich auf Versuche, die unter Verwendung von 5-Fluorindol-3-essigsäure durchgeführt wurden. 1 zeigt die Variation des Anteils an überlebenden Zellen über der variierenden Konzentration von 5-Fluorindol-3-essigsäure nach 5-stündiger Inkubation mit oder ohne HRP (1,2 μg/l). 2 zeigt die Variation des Anteils an überlebenden Zellen über der variierenden Konzentration von HRP nach 5-stündiger Inkubation mit 50 μM 5-Fluorindol-3-essigsäure.
Beispiel 7(b): Menschliche Zelllinien
Menschliche Brustkarzinomzellen (MCF7) und menschliche Kolonkarzinomzellen (HT29) wurden von der European Tissue Culture Collection erhalten. Die Zellen wurden als gebundene Monoschichten in EMEM gezüchtet, das mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 5% (Gew./Vol.) nichtessentiellen Aminosäuren, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänzt worden war, und in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C in 5% CO₂/Luft inkubiert. Versuche zur Überlebensrate von Zellen wurden genauso wie für V79-Zellen durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Zellen direkt aus einer trypsinierten konfluenten Schale in Petrischalen ausplattiert wurden und zumindest 4 Stunden lang ausplattieren gelassen wurden, bevor das Arzneimittel zugesetzt wurde.
3 zeigt die Variation des Anteils an überlebenden MCF7- und HT29-Zellen, wenn sie unterschiedlich lange mit 100 μM 5-Fluorindol-3-essigsäure und mit oder ohne HRP (1,2 μg/l) inkubiert wurden.
Beispiel 8: Messungen der zytotoxischen Wirkungen einer Behandlung mit Verbindungen der Formel (I) und an ein Polymer gebundener Merrettichperoxidase (HRP) (Polymer-gereichtete Enzym-Prodrug-Therapie, PDEPT)
Herstellung des HRP-Polymer-Konjugats
HRP wurde basierend auf dem Verfahren von Fortier und Laliberte (1993, w. o.) an Polyethylenglykol (PEG) konjugiert. HRP (7,82 mg) wurde mit Methoxypoly(ethylenglykol)nitrophenylcarbonat (PEG, Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama, USA) mit einem Molekulargewicht von 5.240 Da (42,66 mg) in 4 ml 0,1 M Boratpuffer, pH 9,4, über Nacht bei 4°C vermischt. Am Tag darauf wurden 50 ml 35 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, zugesetzt, und das resultierende gelbe p-Nitrophenol wurde mittels Filtration durch ein Vectraspin-Filter (Whatman) mit 20 kDa Cutoff abfiltriert. Das resultierende konzentrierte Gemisch von HRP und HRP-PEG-Konjugat wurde über Nacht im Kühlschrank gelagert. Die Proteine wurden auf einer extrafeinen Säule Sephadex G 75 (2 × 35 cm) mit 25 mM Natriumacetat pH 5 bei 1 ml/h, 4°C getrennt, und nach 1 Stunde wurden Fraktionen mit einem Fraktionssammler abgenommen. Der HRP-Gehalt wurde spektralphotometrisch bei 405 nm gemessen. Die Reinheit der Fraktionen wurde auf einem SDS-PAGE-Gel (8% Agarosegel mit 4 Sammelgel) gemessen, und die Banden wurden 50 Minuten lang mit Coomassie-Blau (0,25 g Coomassie-Blau in 10 ml Eisessig und 90 ml 50% Methanol) eingefärbt. Das Gel wurde über Nacht mit 10 ml Eisessig und 90 ml 50% Methanol entfärbt. Etwa 10 mg reines HRP-PEG-Konjugat wurden erhalten, mit einem Molekulargewichtsbereich von bis zu 25 kDa über dem von reiner HRP. Das resultierende Protein wurde unter Stickstoff getrocknet und bei –20°C unter Stickstoff gelagert.
Messung der Peroxidaseaktivität des HRP-Polymer-Konjugats
Die Aktivität des HRP-PEG wurde unter Anwendung des Sigma-ABTS- (2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure-) Verfahrens gemessen. ABTS (0,725 ml 0,1 mM in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 5), 12,5 μM HRP-Lösung (etwa 20 μg/ml in 40 mM Phosphatpufter mit 0,25% Rinderserumalbumin und 0,5% (Gew./Vol.) Triton X-100 pH 6,8) und 25 μl 0,3% Wasserstoffperoxid wurden vermischt, und die Geschwindigkeit der Absorptionszunahme bei 406 nm wurde (mit einem 400-nm-Sperrfilter) auf einem Diodentafel-Spektralphotometer 8452A von Hewlett Packard gemessen. Ausgehend von einem Extinktionskoeffizienten von 36.800 M^–1s^–1 wurde die Aktivität von HRP/PEG aus der Einheitsdefinition berechnet: 1 Einheit NRP oxidiert 1 μM ABTS pro Minute bei pH 5, 25°C.
Bioverteilungsstudien am HRP-Polymer-Konjugat
Versuche zur Messung der Gewebeaufnahme von HRP-PEG wurden an weiblichen CBA/Gy-Mäusen mit einem subkutanen Dorsum-Brust-Adenokarzinomtumor (CaNT) durchgeführt. Die Tumoren resultierten aus einer Beimpfung mit einer 0,5-ml-Suspension eines aufgeschlossenen festen Tumors unter Inhalationsnarkose. Die Tumo ren wurden etwa 3 Wochen später verwendet (die Tumoren wiesen eine mittlere Masse von etwa 0,4 g auf).
Den Mäusen wurden 0,3 ml 0,5 mg/ml HRP-PEG intraperitoneal (i. p.); 50 μl 3 mg/ml HRP-PEG intratumoral (i. t.) oder 100 μl 1,5 mg/ml HRP-PEG intravenös (i. v.) injiziert. Die Mäuse wurden bis zu 48 Stunden später durch zervikale Dislokation getötet, die Gewebe wurden entfernt, abgewogen und bei –20°C gelagert. Blut wurde aus dem Brustkorb entfernt, zentrifugiert und das Plasma bei –20°C gelagert.
HRP-PEG-Gewebeansammlung wurde unter Verwendung von Tetramethylbenzidin (TMB) gemessen. Gewebe wurden in 2 ml 0,5% Hexadecytrimethylammoniumbromid in 50 mM Phosphatpuffer (pH 6) mazeriert und zwei Frier-Tau-Zyklen unterzogen. Die Suspensionen wurden 2 h lang auf 60°C erhitzt, bei 4500 U/min 5 min lang zentrifugiert und bei –20°C gelagert. Die Enzymaktivität wurde gemessen, indem 1,87 ml 80 mM Phosphatpufter pH 5,4, 70 μl 99 mM Wasserstoffperoxid, 20 μl 1 mg/ml TMB in 10% Dimethylsulfoxid (DMS) und 40 μl Probe vermischt wurden. Die Geschwindigkeit der Absorptionszunahme bei 630 nm wurde auf einem Diodentafel-Spektralphotometer 8452A von Hewlett Packard gemessen. Die Absorptionsänderung pro Minute wurde in Bezug auf den Proteingehalt der Proben berechnet, die mithilfe eines Bio-Rad-Lowry-Verfahrens gemessen wurden, nachdem sie in Wasser auf das 10fache verdünnt worden waren. Enzymwerte wurden in Bezug auf Vergleichswerte gemessen, wodurch Ungenauigkeiten aufgrund von Variationen des Hämoglobingehalts eliminiert werden konnten. Die Aufnahme von HRP-PEG in den Tumor erfolgte nach i. p.- und i. t.-Injektion, obwohl die Aufnahme durch die Leber stark war. Eine i. t.-Injektion von HRP-PEG ermöglichte die Messung der Aktivität im Tumor bis zu 20 Stunden danach. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen, wird angenommen, dass die Aufnahme durch die Leber auf Mannoseglykoproteinrezeptoren auf Leberzellen zurückzuführen ist, die selektiv HRP (das ein Mannoseglykoprotein ist) aus dem Kreislauf aufnehmen, was durch Proteinmodifikation ver mieden werden kann, ohne die Aktivität zu beeinträchtigen (J. W. Tams, K. G. Welinder, Anal. Biochem. 228, 48–55 (1995).
Beispiel 9: Messungen der zytotoxischen Wirkung einer Behandlung mit Verbindungen der Formel (I) und an einen Antikörper ebundener Merrettichperoxidase (NRP) (Antikörper-gerichtete Enzym-Prodrug-Therapie, ADEPT)
Eingesetztes Xenotransplantat
Die menschliche Kolonadenokarzinomzelllinie LS174 wurde verwendet, um in den Flanken von MF1-Nacktmäusen ein Xenotransplantatmodell zu bilden. Darauffolgendes Passagieren erfolgte durch subkutane Implantation von kleinen Tumorstücken (etwa 1 mm³). Der Tumor ist ein wenig bis mäßig differenziertes, karzinoembryonale Antigene (CEA) produzierendes Adenokarzinom mit kleinen Drüsenazini, die keine messbaren CEA in den Kreislauf sekretieren. Alle verwendeten Mäuse waren weiblich, 2 bis 3 Monate alt und wogen 20 bis 25 g.
Eingesetzter Antikörper
Der Antikörper A5B7 wurde verwendet. Hierbei handelt es sich um einen monoklonalen Anti-CEA-Antikörper, der positive Färbung für Drüsenlumenflächen und Zytoplasma im LS174-T-Xenotransplantatmodell zeigt. Der Antikörper wurde unter Anwendung des Iodogenverfahres mit ¹²⁵I markiert, und zwar bis zu einer spezifischen Aktivität von 37 MBq/1 mg Protein, und durch Passage durch ein 0,22-mm-Filter (Gelman, Northampton, Großbritannien) sterilisiert.
Herstellung des Antikörper-Enzym-Konjugats
Das Verfahren von Nakan und Kawaoi (1974), das von Hudson und Hay (1980) modifiziert wurde, wurde verwendet. Der A5B7-Antikörper wurde dreimal bei 4°C gegen 0,2 M Natriumcarbonatpuffer pH 9,5 dialysiert. HRP (Sigma Typ VI, RZ~3,0, 4 mg) wurde in 1,0 ml entionisiertem Wasser gelöst. Frisch zubereitetes Natriumperiodat (200 μl, 0,1 M) wurde zu dem Gemisch zugesetzt und 20 Minuten lang vorsichtig bei Raumtemperatur gerührt, um die HRP zu aktivieren. Die Lösung wurde über Nacht gegen Natriumacetat (1 l, 1 mM pH 4,4) bei 4°C dialysiert. Carbonatpuffer (20 μl, 0,2 M) wurde dem dialysierten HRP-Aldehyd zugesetzt, wodurch der pH kurz vor Zusatz des zu markierenden Antikörpers auf 9 bis 9,5 erhöht wurde. Die Lösung wurde 2 Stunden lang unter vorsichtigem Rühren inkubiert. Boranat (100 μl 4 mg/ml frisch zubereitet) wurde zugesetzt und 2 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen, um das freie Enzym zu reduzieren. Die Lösung wurde dann über Nacht gegen Boratpuffer (2 l 0,1 M pH 7,4) dialysiert. Die markierten Antikörper wurden bei 4°C gelagert.
Untersuchungen der Bioverteilung des Antikörper-Enzym-Konjugats
Das mit ¹²⁵I markierte Konjugat wurde in mehreren Versuchen eingesetzt. Unter Verwendung von Gruppen aus 4 Mäusen wurde die Antikörper- und Antikörper-Enzym-Verteilung 6, 24 und 48 Stunden nach der Antikörperinjektion untersucht. Alle Mäuse erhielten 0,75 Mbq/20 g ¹²⁵I-A5B7 i. v. in die Schwanzvene. Zum gewählten Zeitpunkt wurden die Mäuse ausbluten gelassen, und Leber, Niere, Lunge, Milz, Kolon, Muskeln und Tumor wurden zum Vergleich der Aktivitätsbewertung entfernt. Jedes Gewebe wurde gewogen, in 7 M KOH verdaut und mithilfe eines Gammazählers (Wizard: Pharmacia, Milton Keynes, Großbritannien) gezählt. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der injizierten Dosis pro g Gewebe ausgedrückt, und die Gruppen wurden mithilfe des Mann-Witney-U-Tests verglichen. Den Mäusen konnten nach Belieben Futter und Wasser zu sich nehmen, wobei das Wasser 0,1% Kaliumiodid enthielt, um die Aufnahme von Iod durch die Schilddrüse zu blockieren.
In anderen Versuchen wurde die Enzymaktivität des HRP-A5B7-Konjugats gemessen. Unter Verwendung von zwei Gruppen LS174T-Tumor-tragender Nacktmäuse wurden die Antikörper-Enzym-Aktivität und -Verteilung in Geweben 24 und 72 Stunden nach der Antikörperinjektion gemessen. Allen Mäusen wurden i. v. 250 μg HRP-A5B7 in die Schwanzvene injiziert. Die Mäuse wurden zu gewählten Zeitpunkten ausbluten gelassen, und der Tumor, Leber, Lunge, Niere, Muskeln und Plasma wur den entfernt und bei –20°C gelagert. Die Enyzmaktivität wurde unter Anwendung des oben für den HRP-PEG-Konjugattest beschriebenen Tetramethylbenzidinverfahrens gemessen. Die Aktivität wurde in Bezug auf unbehandelte tumortragende Vergleichsmäuse gemessen.
Beispiel 10: Messungen der zytotoxischen Wirkung einer Behandlung mit Verbindungen der Formel (I) zusammen mit Photosensitizer und sichtbarem Licht während photodynamischer Therapie (PDT)
V79-Hamsterzellen wurden in Gegenwart mehrerer Photosensitizer und Verbindungen der Formel (I) photolysiert.
V79-Zellen wurden zumindest 1 Stunde lang in EMEM auf Platten mit 6 Wells jeweils in Doppelversuchen in phenolfreiem DMEM ausplattiert. Das Medium wurde im Dunkeln von den Zellen entfernt, und 2 ml 2 μM Photosensitizer und 0,1 mM Testverbindung (5-Fluor-IAA und 5-Brom-IAA) wurden im Dunkeln zugesetzt und sofort unterschiedlich lange unter Verwendung einer Matrix von Licht emittierenden Dioden, die eine für den Photosensitizer geeignete Wellenlänge aufwiesen, photolysiert. Die Zellen wurden 1 Stunden lang in einem Inkubator belassen, die Arzneimittel entfernt, die Zellen im Dunkeln mit 2 ml PBS-Lösung gewaschen und dann 6 Tage in 3 ml EMEM vermehren gelassen. Nach Fixierung und Färbung mit Kristallviolett (siehe oben) wurden Kolonien von > 50 Zellen gezählt.
Die Ergebnisse in Bezug auf den überlebenden Anteil an Zellen (bezogen auf unbehandelte Vergleichszellen) über der zunehmenden Photolysedauer sind in den nachstehend angegebenen Figuren dargestellt.
Nur sehr schwache Toxizität wurde mit dem Photosensitizer oder IAA alleine in denselben Konzentrationen beobachtet. Die Toxizität könnte auf die Bildung des vermutlichen Zytotoxins 3-Methylen-3-oxindol zurückzuführen sein, dessen Bildung durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie nachgewiesen wurde.
Beispiel 11: Messungen der zytotoxischen Wirkung einer Behandlung mit Verbindungen der Formel (I) und Merrettichperoxidase (HRP) unter Verwendung von Zellen, die vorübergehend mit dem für HRP kodierenden Gen transfiziert wurden (Gengerichtete Enzym-Prodrug-Therapie, GDEPT)
Menschliche Blasenkazinom-T24-Zellen, MCF-7-Säugetierkarzinomzellen (beide von der European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Großbritannien), FaDu, Zellen eines squamösen Nasopharynxkarzinoms (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), das mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin ergänzt war, eingebracht und in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C in 5% CO₂/Luft inkubiert. Nur Zellen, deren Tests auf Mykoplasmainfektion negativ ausfielen, wurden verwendet.
Das Plasmid pRK34-HRP, das die HRP-cDNA enthielt, wurde von Dr. D. F. Cutler, University College, London (C. N. Connolly, C. E. Futter, A. Gibson et al., "Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase", J. Cell Biol. 127, 641–652 (1994), bereitgestellt.
Vorübergehende Transfektanten wurden erzielt, indem die Zellen Komplexen von Integrin-gerichteten Peptiden, Lipofectin und DNA ausgesetzt wurden (S. L. Hart, C. V. Aracibia-Cárcamo, M. A. Wolfert et al., "Lipid-mediated enhancement of transfection by a nonviral integrin-targeted vector", Human Gene Ther. 9, 575–585 (1998), und wurden nach 24 h auf Genexpression getestet. Die Transfektionseffizienz wurde für T24-Zellen auf etwa 20%, für MCF-7-Zellen auf etwa 16 bis 20% und für FaDu-Zellen auf etwa 10 bis 14% geschätzt.
Exponentiell wachsende, transfizierte und untransfizierte Zellen wurden gezählt und in geringer Dichte auf Petrischalen ausplattiert und 24 Stunden lang Verbindungen der Formel (I) in Phenolrot-freier ausgeglichener Hank-Salzlösung (HBSS) in einem Inkubator mit 37°C ausgesetzt.
Alternativ dazu wurden, um die Aktivität unter hypoxischen Bedingungen zu testen, T24-Zellen in einen Anaerobierschrank eingebracht und nach 5- bis 6-stündiger Inkubation zur Sicherstellung von anoxischen Bedingungen 24 Stunden lang in dem Schrank Verbindungen der Formel (I) ausgesetzt. Alle Kunststoffe und Medien wurden vor ihrer Verwendung 48 Stunden lang in Anoxie vorinkubiert, um Restsauerstoff zu entfernen.
Nachdem sie einem Arzneimittel ausgesetzt worden waren, wurden Zellen mit PBS gespült und 8 bis 20 Tage lang in komplettem DMEM vermehren gelassen, das durch Feeder-Zellen (V79-Zellen, die ⁶⁰CO-Bestrahlung mit 250 Gy ausgesetzt wurden) ergänzt worden war. Nach Fixierung und Einfärbung mit 2,5% Kristallviolett (Gew./Vol.) in denaturiertem Alkohol wurden Kolonien von > 50 Zellen gezählt. Der Anteil an Überlebenden wurden in Bezug auf HBSS-behandelte Vergleiche bewertet.
5 zeigt die Variation des Anteils an überlebenden transfizierten und Vergleichs-T24-Zellen unter oxischen Bedingungen über der variierenden Konzentrationen von 5-Fluorindol-3-essigäsure oder 5-Bromindol-3-essigsäure.
Die Konzentration einer Testverbindung zur Verringerung der Überlebensrate der Zellen um 50% (IC₅₀) wurde anhand der Überlebenskurven geschätzt und ist in der folgenden Tabelle angeführt, worin "HRP⁺" für transfizierte Zellen, "HRP^–" für untransfizierte Zellen und "Faktor" für das Verhältnis der IC₅₀ zwischen transfizierten Zellen und untransfizierten Zellen steht.
Beispiel 12: Verteilung von 5-Ffuorindolessigsäure in vivo in Mäusen mit dem Karzinom-TM-Tumor
5-Fluorindolessigsäure (5 mg/ml) in 2 Vol.-% Ethanol/Wasser wurden mit NaOH auf einen pH von 7,4 eingestellt und weiblichen CBA-Mäusen, die den Karzinom-TM-Tumor trugen, i. p. in einer Dosis von 50 mg/kg injiziert (Details siehe Beispiel 8). Die Mäuse wurden 2 Stunden nach der Arzneimittelverabreichung getötet, und das Blut und die Gewebe wurden sofort entfernt und auf Eis gelegt. Das Vollblut wurde zentrifugiert, und das Plasma wurde bei –20°C gelagert. Eine Gewebeprobe wurde gewogen und in 4 bis 9 Volumina eiskaltem Wasser homogenisiert. Das homogenisierte Gewebe wurde dann bei –20°C gelagert.
Für eine HPLC-Analyse wurde Plasma (50 μl) mit innerem IAA-Standard (130 μM, 25 l) und mit Acetonitril ausgefälltem Protein (50 μl) vermischt. Die Proben wurden zentrifugiert, und der Überstand wurde direkt für eine HPLC-Analyse injiziert. Für Gewebewerte wurden Proben (250 μl) mit innerem IAA-Standard (130 μM, 25 μl) vermischt und mit Acetonitril (250 μl) ausgefällt, um sie direkt für HPLC-Analysen zu injizieren. Eine HPLC-Analyse wurde mit einer Hypersil-Säule 50DS 125 × 4,6 mm durchgeführt, wobei mit A: 75% Acetonitril und B: 20 mM Ammoniumacetat (pH 5,1) mit einem Gradienten von 15 auf 70% A bei 2 ml/min innerhalb von 10 Minuten eluiert wurde. Die Detektion fand bei 290 nm unter Verwendung eines Waters-485-Detektors mit variabler Wellenlänge statt.
Die Menge an 5-Fluorindol-essigsäure in den Proben ist in 6 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass im Tumor ausreichende Konzentrationen erhalten werden, um zytotoxische Wirkung zu erzielen. Hohe Werte in der Niere stimmen mit der Exkretion von beträchtlichen Mengen der unveränderten Verbindung überein, die – ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen – aus der Blockierung der Hydroxylierung durch P450s durch den 5-Fluor-Substituenten resultiert.
Legende der Figuren
1:
mit HRP; -o- ohne HRP
3: -o- MCF7-Vergleiche;
MCF7 + 5-F-IAA/HRP; -⧠- HT29-Vergleiche;
HT29 + 5-F-IAA/HRP
4a: -o- Methylenblau alleine
Methylenblau + 5-F-IAA
Methylenblau + 5-Br-IAA
4b: -o- Thionin alleine
Thionin + 5-F-IAA
Thioninblau + 5-Br-IAA
4c: -o- Toluidinblau alleine
Toluidinblau + 5-F-IAA
Toluidinblau + 5-Br-IAA
4d: -o- Diodeosin alleine
Diodeosin + 5-F-IAA
Diodeosin + 5-Br-IAA
5 -o- Vergleich + 5-F-IAA
Transfektanten + 5-F-IAA -⧠- Vergleich + 5-Br-IAA
Transfektanten + 5-Br-IAA
6: -o- Plasma
Tumor -⧠- Leber
Herz -Δ- Niere
Muskel

Claims

Verbindung der Formel (I) oder ein physiologisch funktionelles Derivat davon zur Verwendung in einem Therapieverfahren:
worin R₁, R₂, R₃ und R'₃ unabhängig voneinander aus H oder Niederalkylgruppen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind; R₄, R₅, R₆ und R₇ unabhängig voneinander aus H, Elektronen abziehenden Gruppen, Niederalkylgruppen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, Niederalkoxygruppen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, Arylgruppen oder Aryloxygruppen ausgewählt sind, worin zumindest eines von R₄, R₅, R₆ und R₇ aus einer Elektronen abziehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin die Elektronen abziehende Gruppe aus der aus F, Cl, Br, I, OCF₃, Carboxyl, Acetal und Aryl mit Elektronenmangel bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 2, worin die Elektronen abziehende Gruppe aus der aus F, Cl, Br und I bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verbindung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Substituenten R₄, R₅, R₆ und R₇ in Summe Elektronen abziehend sind.
Verbindung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander aus H oder gegebenenfalls substituierten gesättigten Niederalkylgruppen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind.
Verbindung nach Anspruch 5, worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander aus H, Methyl oder Ethyl ausgewählt sind.
Verbindung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin R'₃ H ist.
Verbindung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin R₃ aus H oder gegebenenfalls substituierten gesättigten Niederalkylgruppen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 8, worin R₃ aus H, Methyl oder Ethyl ausgewählt ist.
Verbindung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin eines oder zwei von R₄, R₅, R₆ und R₇ jeweils unabhängig voneinander aus Elektronen abziehenden Gruppen ausgewählt sind.
Verbindung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin, wenn eines oder mehrere von R₄, R₅, R₆ und R₇ nicht H oder eine Elektronen abziehende Gruppe sind, sie aus gegebenenfalls substituierten gesättigten Niederalkylgruppen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind.
Verbindung nach Anspruch 11, worin jene von R₄, R₅, R₆ und R₇, die nicht H oder eine Elektronen abziehende Gruppe sind, aus H, Methyl oder Ethyl ausgewählt sind.
Verbindung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin eines von R₄, R₅, R₆ und R₇ eine Elektronen abziehende Gruppe ist und die restlichen H sind.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünner umfasst.
Zwei-Komponenten-System zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen, welches umfasst: (i) einen Vektor, der für ein Peroxidase-Enzym kodiert und es in einer Tumorzelle exprimieren kann; sowie (ii) eine Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert.
Zwei-Komponenten-System zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen, welches umfasst: (i) einen Tumor-gerichteten Antikörper oder ein Tumor-gerichtetes Polymer, der bzw. das an ein Peroxidase-Enzym gebunden ist; sowie (ii) eine Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert.