ES2215138T3 - Utilizacion de derivados del acido indola-3-acetico en medicina. - Google Patents

Abstract

Compuesto de fórmula (I) **(fórmula)**, o derivado fisiológicamente funcional del mismo, para ser utilizado en un procedimiento de terapia en donde R1, R2, R3, y R¿3 se seleccionan independientemente de entre H o grupos alquilo inferior que tienen de 1 a 7 átomos de carbono; R4, R5, R6 y R7 se seleccionan independientemente de entre H, grupos atrayentes de electrones, grupos alquilo inferior que tienen de 1 a 7 átomos de carbono; grupos alcoxi inferior que tienen de 1 a 7 átomos de carbono; grupos arilo o grupos ariloxi; en donde al menos uno de R4, R5, R6 y R7 se selecciona de entre un grupo atrayente de electrones.

Description

Utilización de derivados del ácido indola-3-acético en medicina.

Esta invención está relacionada con derivados del ácido indol-3-acético (IAA) y con su utilización como productos farmacéuticos, en particular para el tratamiento de enfermedades neoplásicas.

El ácido indol-3-acético:

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es una fitohormona para el crecimiento de plantas, de origen natural, la cual ha sido estudiada ampliamente. Ya en 1956 se estudiaron sus efectos en humanos y se demostró que dosis únicas de 0,1 g/kg no resultaban tóxicas (Mirsky A and Diengott D, Hypoglycemic action of indole-3-acetic acid by mouth in patients with diabetes mellitus, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 93: 109-110, 1956. En 1964, se averiguó que sus productos de foto-oxidación actuaban como inhibidores del crecimiento de microorganismos (Still C, Fukuyama T and Moyed H, Inhibitory Oxiidation Products of Indole-3-ácetic acid, J. Biological Chemistry, 240, 6, 2612-2618, 1964).

Más recientemente, ha existido interés en la utilización del ácido indol-3-acético como profármaco, en combinación con peroxidasa de rábano (HRP). El IAA es contemplado como un profármaco adecuado, dado que el mismo no resulta tóxico en su forma estable, no es sustancialmente oxidado de forma significativa por medio de las peroxidasas de origen natural del cuerpo humano, pero es oxidado rápidamente por la HPR. La HPR y, otras peroxidasas, son enzimas que pueden ser suministrados en el punto deseado de actividad a través de procedimientos discutidos más adelante, tales como ADEPT y GDEPT.

Por ejemplo, el enzima puede estar unido a un anticuerpo monoclonal, a los efectos de que el mismo pueda unirse a un antígeno asociado a un tumor extra-celular. Este planteamiento en terapia de cáncer, identificado a veces como "terapia enzima/profármaco dirigida por anticuerpo" (ADEPT), se describe en el documento WO 88/07378 y se encuentra actualmente en ensayos clínicos en Fase II.

Una variación de ADEPT es la "terapia enzima/profármaco dirigida por polímero" (PDEPT), en la cual el compuesto que constituye el objetivo, por ejemplo el enzima, se une a un polímero no inmunógeno y biocompatible. Este polímero se localiza en el tumor debido a que los vasos sanguíneos en el tumor tienen pérdidas, permitiendo a las moléculas unidas al polímero penetrar en los espacios extra-celulares del tumor, lo cual no ocurre de manera rápida en los tejidos normales. La liberación a partir del tumor es lenta, debido a la falta de drenaje linfático, permitiendo que el enzima-polímero localizado active al profármaco. La PDEPT se describe con mayor detalle en "The Role of Polymer Conjugates in the Diagnosis and Treatment of Cancer", Duncan R et al., STP Pharma Scirnces 6: 237-263, 1996) y ha completado recientemente los ensayos en Fase I para administración de fármacos citotóxicos (por ejemplo, doxorubicina) a tumores (Vasey PA et al, Phase I clinical and pharmacokinetic study of PK1 [N-(2-hidroxipropil)methacrylamide copolymer doxorubicin]: first member of a new class of chemoterapeutic agents-drug-polymer conjugates, Clin. Cancer Res 5:83-94, 1999).

Un nuevo planteamiento terapéutico denominado "terapia enzima profármaco dirigida por virus" (VDEPT) tiene lugar cuando las células tumorales son el objetivo de un vector vírico que transporta un gen que codifica para el enzima relevante. El gen puede ser regulado de forma transcripcional, mediante secuencias de reforzador o de favorecedor específicas del tejido. El vector vírico penetra en las células tumorales y expresa el enzima, convirtiendo con ello al profármaco en el fármaco, activo dentro de las células tumorales (Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88, 8039).

De forma alternativa, se han utilizado procedimientos no víricos para el suministro de genes. Entre los citados procedimientos se incluyen la co-precipitación con fosfato cálcico, la microinyección, los liposomas y derivados, la electroporación, la ingesta de DNA directa, y la transferencia de DNA mediada por receptor. Estos procedimientos son revisados en Morgan & French, Annu. Rev. Biochem, 1993, 62:191. El término "GDEPT" (terapia enzima profármaco dirigida por gen) se utiliza para incluir tanto los sistemas de suministro víricos como los no víricos. La GDEPT se encuentra también actualmente en fase de ensayos clínicos.

La terapia fotodinámica (PDT), conlleva la utilización de luz para activar moléculas, con vistas a generar especies tóxicas. La mayoría de las técnicas actuales y de las propuestas utilizan oxígeno singulete como especie tóxica obtenida a partir de la reacción de un fotosensibilizador con oxígeno celular. El inconveniente mas destacado de esta técnica reside en el hecho de que la misma no funciona en tumores anóxicos y en el hecho de que los fotosensibilizadores no son excretados de manera rápida por el organismo y, como consecuencia de ello, los pacientes tratados con PDT permanecen sensibles a la luz durante un considerable período de tiempo con posterioridad a la finalización del tratamiento.

Se ha propuesto que el mecanismo de acción de la HRP sobre el IAA es el siguiente (Peroxidase-catalysed effects of indole-3-acetic acid and analogues on lipid membranes, DNA, and mammalian cells in vitro, Folkes L, et al, Biochemical Pharmacology, 57:375-382, 1999):

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En el diagrama mostrado anteriormente, Nu hace referencia a un centro nucleofílico celular encontrado en, por ejemplo, DNA o proteínas. En ausencia de oxígeno, el radical eskatol puede reaccionar con biomoléculas. De manera no habitual, el IAA es oxidado por la HRP sin requerir la presencia de peróxido de hidrógeno.

La naturaleza exacta de la acción citotóxica de los derivados oxidados de IAA no se conoce, si bien se han sugerido diversos posibles mecanismos.

Un trabajo recientemente llevado a cabo por los inventores ha demostrado que cuando el anillo aromático del IAA está sustituido por sustituyentes donantes de electrones, tales como metoxi, la velocidad de oxidación por medio de HPR se incrementa, si bien se reduce la citotoxicidad.

De manera sorprendente, los inventores han averiguado ahora que cuando el anillo aromático del IAA se encuentra sustituido por al menos un grupo atrayente de electrones, la citotoxicidad de los compuestos, cuando los mismos son activados por medio de peroxidasa, se incrementa. Esto resulta perticularmente sorprendente, en vista de la reacción más lenta entre los citados IAAs sustituidos y la peroxidasa.

Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I), o derivados fisiológicamente funcionales de los mismos, para su utilización en un procedimiento de terapia:

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en donde:

R_{1}, R_{2}, R_{3} y R'_{3} son seleccionados independientemente de entre H o alquilo inferior; y

R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} son seleccionados independientemente de entre H, grupos atrayentes de electrones (tales como F, Cl. Br, I, OCF_{3}, grupos carboxilo, grupos acetal, grupos arilo deficientes en electrones), grupos alquilo inferior, grupos alcoxi inferior, grupos arilo o grupos ariloxi, en donde al menos uno de R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} es seleccionado de entre un grupo que es atrayente de electrones.

Son grupos "atrayentes de electrones" aquellos que reducen la densidad electrónica en otras partes de la molécula. Entre los grupos que resultan adecuados para ser utilizados en la presente invención se incluyen, F, Cl, Br, I, OCF_{3}, grupos carboxilo, grupos acetal y grupos arilo deficientes en electrones. Los grupos atrayentes de electrones preferidos son F, Cl, Br y I, de los cuales, F, Cl y Br resultan los más preferidos.

"Alquilo inferior", en esta solicitud significa un grupo que tiene entre 1 y 7 átomos de carbono, que puede ser alifático o alicíclico, o una combinación de los mismos y que puede estar saturado, parcialmente insaturado o completamente insaturado. Este grupo puede soportar uno o más sustituyentes seleccionados de entre halo (a saber, F, Cl, Br, I, preferiblemente, F, Cl, Br), carboxilo, acetal, arilo, ariloxi y alcoxi.

Entre los ejemplos de grupos alquilo inferior lineales saturados se incluyen, sin que ello suponga una limitación, metilo, etilo, n-propilo, n-butilo y n-pentilo (amilo).

Entre los ejemplos de grupos alquilo inferior ramificados saturados se incluyen, sin que ello suponga una limitación, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo y neopentilo.

Entre los ejemplos de grupos alquilo inferior alicíclico (carbocíclico) saturados (identificados también como grupos "cicloalquilo C_{3-7}") se incluyen, sin que ello suponga una limitación, grupos no sustituidos tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo, al igual que grupos sustituidos (por ejemplo, grupos que comprenden los citados grupos), tales como metilciclopropilo, dimetilciclopropilo, metilciclobutilo, dimetilciclobutilo, metilciclopentilo, dimetilciclopentilo, metilciclohexilo, dimetilciclohexilo, ciclopropilmetilo y ciclohexilmetilo.

Entre los ejemplos de grupos alquilo inferior insaturados que presentan uno o más dobles enlaces carbono-carbono (identificados también como grupos "alquenilo C_{2-7}") se incluyen, sin que ello suponga una limitación, etenilo, (vinilo, -CH=CH_{2}), 2-propenilo (alilo, -CH-CH=CH_{2}), isopropenilo (-C(CH_{3})=CH_{2}), butenilo, pentenilo y hexenilo).

Entre los ejemplos de grupos alquilo inferior insaturados que presentan uno o más triples enlaces carbono-carbono (identificados también como grupos "alquinilo C_{2-7}") se incluyen, sin que ello suponga una limitación, etinilo (etinil) y 2-propinilo (propargilo).

Entre los ejemplos de grupos alquilo inferior alicícliclos insaturados (carbocíclicos) que tienen uno o más dobles enlaces carbono-carbono (identificados también como grupos "cicloalquenilo C_{3-7}") se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, grupos no sustituidos tales como ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, y ciclohexenilo, al igual que grupos sustituidos (por ejemplo, grupos que comprenden los citados grupos) tales como ciclopropenilmetilo y ciclohexenilmetilo.

"Carboxilo" en esta solicitud significa un grupo de estructura -C(=O)- e incluye carboxilatos, grupos acilo, amidas y haluros de acilo.

Grupos "carboxilato" significan grupos de estructura -C(=O)OR, donde R es H o un sustituyente carboxilo, por ejemplo, un grupo alquilo inferior o un grupo arilo C_{5-20}, preferiblemente un grupo alquilo inferior. Entre los ejemplos de grupos carboxilo se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, -C(=O)OH, -C(=O)OCH_{3}, -C(=O)OCH_{2}CH_{3}, -C(=O)OC(CH_{3})_{3} y -C(=O)OPh.

"Acilo" en esta solicitud significa un grupo de estructura -C(=O)R, donde R es H o un sustituyente acilo, por ejemplo, un grupo alquilo inferior o un grupo arilo C_{5-20}, preferiblemente un grupo alquilo inferior. Entre los ejemplos de grupos acilo se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, -C(=O)H (formilo), -C(=O)CH_{3} (acetilo), -C(=O)CH_{2}CH_{3} (propionilo), -C(=O)C(CH_{3})_{3} (butirilo), y -C(=O)Ph (benzoilo, fenona).

"Amidas" en esta solicitud significan grupos de estructura -C(=O)NR_{1}R_{2}, en donde R_{1} y R_{2} son, independientemente sustituyente a amino, por ejemplo, hidrógeno, un grupo alquilo inferior (identificado también como alquilamino C_{1-7} o di-alquilamino C_{1-7}) o un grupo arilo C_{5-20}, preferiblemente H o un grupo alquilo C_{1-7}. Entre los ejemplos de grupos amido se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, -C(=O)NH_{2}, -C(=O)NHCH_{3}, -C(=O)NH(CH_{3})_{2}, -C(=O)NHCH_{2}CH_{3} y -C(=O)N(CH_{2}CH_{3})_{2}, al igual que grupos amido en los cuales R_{1} y R_{2} conjuntamente con el átomo de nitrógeno al cual está unidos, forman una estructura heterocíclica tal como, por ejemplo, en piperidinocarbonilo, morfolinocarbonilo, tiomorfolinocarbonilo y piperazinocarbonilo.

"Haluro de acilo" significa grupos de estructura -C(=O)X en donde X es -F, -Cl, -Br o -I, preferiblemente -Cl, -Br, o -I.

"Acetal" en esta solicitud significa una estructura -C(OR^{3})(OR^{4}), en donde el tercer sustituyente se refiere a un grupo carbonilo (definido anteriormente). R^{3} y R^{4} son seleccionados de entre grupos alquilo inferior, o pueden formar conjuntamente un grupo alquilo divalente.

"Alcoxi" en esta solicitud significa un grupo de estructura -OR, en donde R es un grupo alquilo inferior opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente puede incluir halo, (F, Cl, Br, I) y arilo. Entre los ejemplos de grupos alcoxi se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, -OCH_{3} (metoxi), -OCH_{2}CH_{3} (etoxi), -OC(CH_{3})_{3} (terc-butoxi), -OBn (benciloxi) y -OCH_{2}F (fluorometoxi).

"Arilo" en esta solicitud significa un resto monovalente obtenido por eliminación de un átomo e hidrógeno a partir de un átomo de anillo de un compuesto aromático C_{5}-_{20} (conocido también como grupo arilo C_{5-20}), teniendo el citado compuesto un anillo, o dos o más anillos (por ejemplo, fusionados) y teniendo entre 5 y 20 átomos de anillo. Preferiblemente, cada uno de los anillos tiene entre 5 y 7 átomos de anillo.

Los átomos de anillo pueden ser todos átomos de carbono, tal como en los "grupos carboarilo", en cuyo caso el grupo puede ser identificado convenientemente como un grupo "carboarilo C_{5-20}".

Entre los ejemplos de grupos arilo que no presentan heteroátomos de anillo (a saber, grupos carboarilo C_{5-20}) se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, los procedentes de benceno (a saber, fenilo), naftaleno, antraceno, fenantreno y pireno.

De manera alternativa, entre los átomos de anillo pueden incluirse uno o más heteroátomos, incluyendo, sin que ellos suponga ninguna limitación, oxígeno, nitrógeno y azufre, tal como en los "grupos heteroarilo". En este caso, el grupo puede ser convenientemente identificado como un grupo "heteroarilo C_{5-20}", en donde "C_{5-20}" significa átomos de anillo, ya sean átomos de carbono o heteroátomos. Preferiblemente, cada uno de los anillos tiene entre 5 y 7 átomos de anillo, de los cuales entre 0 y 4 son heteroátomos de anillo.

Entre los ejemplos de grupos heteroarilo C_{5-20} se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, grupos heteroarilo C_{5} obtenidos a partir de furano (oxazol), tiofeno (tiol), pirrol (azol), imidazol (1,3-diazol), pirazol (1,2-diazol), triazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, oxadiazol y oxatriazol; y grupos heteroarilo C_{6} obtenidos a partir de isoxazina, piridina (azina), piridazina (1,2-diazina), pirimidina (1,3-diazina; por ejemplo, citosina, timina, uracilo), pirazina (1,4-diazina), triazina, tetrazol y oxadiazol (furazano).

Entre los ejemplos de grupos heterocíclicos C_{5-20} (incluyendo grupos heteroarilo C_{5-20})que comprenden anillos fusionados, se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, aquellos obtenidos a partir de quinolina, isoquinolina, purina (por ejemplo, adenina, guanina), benzimidazol, carbazol, fluoreno, fenoxatiina, benzofurano, indol, isoindol, quinoxalina, fenazina, fenoxazina, xanteno, acridina y fenotiazina.

"Grupos arilo deficientes en electrones" en esta solicitud significan grupos arilo que son atrayentes de electrones e incluyen grupos heteroarilo. Un ejemplo de grupo arilo deficiente en electrones es el para-clorofenilo.

"Ariloxi" en esta solicitud significa un grupo de estructura -OR, en donde R es un grupo arilo. Un ejemplo de grupo ariloxi lo constituye -OPh (fenoxi).

Entre los derivados de profármacos fisiológicamente funcionales se incluyen sales, amidas y ésteres. Entre los ésteres se incluyen ésteres de ácido carboxílico en los cuales el resto no carbonilo de la agrupación éster es seleccionado de entre alquilo C_{1-6} de cadena lineal o ramificada (por ejemplo, metilo, n-propilo, n-butilo, o t-butilo); o un grupo alquilo cíclico C_{3-6} (por ejemplo, ciclohexilo). Entre las sales se incluyen sales de bases fisiológicamente aceptables, por ejemplo, obtenidas a partir de una base adecuada, tal como sales de metal alcalino (por ejemplo, sodio), de metal alcalinotérreo (por ejemplo, magnesio), sales de amonio y NR''_{4} (donde R'' es alquilo C_{1-4}). Otros tipos de sales incluyen sales de adición de ácido, incluyendo las sales clorhidrato y acetato. Entre las amidas se incluyen los derivados no sustituidos y los mono y di-sustituidos. Los citados derivados pueden ser preparados a través de técnicas conocidas per se en el campo de la farmacia.

Resulta preferido que el equilibrio o el efecto global de los sustituyentes R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} sea atrayente de electrones.

Las siguientes preferencias para los grupos R_{1},R_{2}, R_{3}, R'_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} pueden ser independientes las unas de las otras o pueden estar en combinación las unas con las otras.

R_{1} y R_{2} son preferiblemente seleccionados de entre H o grupos alquilo inferior saturados, opcionalmente sustituidos, más preferiblemente de entre grupos alquilo inferior lineales saturados opcionalmente sustituidos, más particularmente metilo o etilo. El grupo más preferido para R_{1} y R_{2} es H.

Si el grupo alquilo inferior de R_{1} está sustituido, el sustituyente es preferiblemente uno que contribuya a la solubilidad del compuesto entero, tal como morfolino o piperazinilo.

R'_{3} es preferiblemente H. R_{3} es seleccionado preferiblemente de entre H o de entre grupos alquilo saturados opcionalmente sustituidos, más preferiblemente de entre grupos alquilo lineales saturados opcionalmente sustituidos, más particularmente metilo o etilo. El grupo más preferido para R_{3} es H, por lo que en combinaciópn R_{3} y R'_{3} son ambos H.

Resulta preferido que uno o dos, más preferiblemente uno de R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} sea independientemente seleccionado a partir de grupos atrayentes de electrones.

Si uno o más de R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} no son H o un grupo atrayente de electrones, los mismos son preferiblemente seleccionados de entre grupos alquilo inferior opcionalmente sustituidos, más preferiblemente de entre grupos alquilo inferior lineales saturados opcionalmente sustituidos y, muy preferiblemente, de entre grupos alquilo inferior lineales no sustituidos, más particularmente metilo o etilo.

Resulta muy preferido el que uno de R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} sea un grupo atrayente de electrones y que el resto sean H y, en particular, que R_{5} sea el grupo atrayente de electrones.

Un aspecto preferido de la invención reside en los compuestos de fórmula (I), los cuales muestran un mayor efecto citotóxico (a saber, dejan menos células supervivientes cuando son objeto de prueba en idénticas condiciones) sobre una línea celular neoplásica in vitro que el ácido indol-3-acético. Preferiblemente, la línea celular es fibroblasto pulmonar de cobayo V79, obtenido a partir de la European Tissue Culture Collection.

Un segundo aspecto de la presente invención proporciona la utilización de un compuesto de fórmula (I), tal como se ha definido en el primer aspecto de la invención, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica.

Los compuestos de fórmula (I), tal como se han definido en el primer aspecto de la invención, pueden ser utilizados conjuntamente con un enzima peroxidasa conjugado (por ejemplo, y preferiblemente, peroxidasa de rábano) en procedimientos de terapia ADEPT y PDEPT o conjuntamente con un vector codificante y capaz de expresar un enzima peroxidasa (por ejemplo, y preferiblemente, peroxidasa de rábano) en una célula tumoral en un procedimiento GDEPT. El fármaco obtenido a través de la acción del enzima peroxidasa sobre los compuestos de fórmula (I) puede ser utilizado para la destrucción selectiva de células tumorales tóxicas e hipóxicas, en procedimientos de tratamiento de cánceres, por ejemplo, de leucemias, y particularmente de cánceres sólidos, incluyendo tumores de mama, intestino, hígado, cabeza y cuello y tumores de pulmón, incluyendo carcinoma de célula pequeña.

Los compuestos de fórmula (I), tal como se han definido en el primer aspecto de la presente invención, pueden ser utilizados conjuntamente con un fotosensibilizador (por ejemplo, porfirinas, fenotiazinas, (azul de metileno, azul de toluidina, tionina), rosa de bengala, hipericina, ftalocianinas), en procedimientos de terapia fotodinámica (PDT).

Las reacciones preferidas del segundo aspecto de la presente invención pueden estar relacionadas con diferentes subgrupos de compuestos de fórmula (I).

La invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I), tal como se ha definido en el primer aspecto de la invención, conjuntamente con un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de los gráficos

La Figura 1 muestra la variación en la fracción de supervivencia de células V79 frente a concentraciones variables de un compuesto de fórmula (I), ácido fluoro-indol-3-acético, después de 5 horas de incubación, con o sin HRP (1,2 \mug/L).

La Figura 2 muestra la variación en la fracción de supervivencia de células V79 frente a concentraciones variables de HRP, después de 5 horas de incubación, con 50 \muM del mismo compuesto de fórmula (I), tal como en la Figura 1, ácido 5-fluoro-indol-3-acético.

La Figura 3 muestra la variación en la fracción de supervivencia de células MCF7 y HT29, cuando son incubadas durante diferentes períodos de tiempo, con 100 \muM del mismo compuesto de fórmula (I), tal como en la Figuras 1 y 2, ácido 5-fluoro-indol-3-acético y con o sin HRP (1,2 \mug/L).

La Figura 4a muestra la variación en la fracción de supervivencia de células V79, después de 1 hora de incubación frente a períodos variables de fotolisis de las células, conjuntamente con azul de metileno, opcionalmente en presencia de compuestos de fórmula (I), ácido 5-fluoro-indol-3-acético o ácido 5-bromo-indol-3-acético.

La Figura 4b es similar a la Figura 4a, con la excepción de que se utilizó tionina en vez de azul de metileno.

La Figura 4c es similar a la Figura 4a, con la excepción de que se utilizó azul de toluidina en lugar de azul de metileno.

La Figura 4d es similar a la Figura 4a, con la excepción de que se utilizó rosa de bengala en vez de azul de metileno.

La Figura 5 muestra la variación en la fracción de supervivencia de células T24 transfectadas y control, transcurridas 24 horas desde la incubación, frente a concentraciones variables de compuestos de fórmula (I), ácido 5-fluoro-indol-3-acético o ácido 5-bromo-indol-3-acético.

La Figura 6 muestra la variación en la concentración de ácido 5-fluoro-indol-3-acético en plasma y tejidos, después de inyección intraperitoneal en ratones.

Rutas de síntesis

Los compuestos de Fórmula (I) pueden ser preparados a través de diversas rutas, algunas de las cuales son esquematizadas más adelante.

Síntesis de indoles de Fisher

Los materiales de partida para este procedimiento son las correspondientes fenilhidrazinas, las cuales se encuentran disponibles en el comercio o pueden ser sintetizadas a partir de la correspondiente anilina (KC Engvild, Acta Chem. Scand. B, 1977, 31:338-339; SW Fox, MW Bullock, J. Am. Chem. Soc., 1951, 73, 2756-2759). El procedimiento global de síntesis se muestra en el esquema 1.

Esquema 1

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Introducción de cadena lateral

Si se dispone del indol de partida (por ejemplo, 7-cloroindol) o el mismo puede ser sintetizado a través de una de las rutas de síntesis indicadas más adelante, el compuesto de fórmula (I) puede ser sintetizado a través de la introducción de la cadena lateral acetato sobre el indol de origen, utilizando los reactivos mostrados en el Esquema 2 (RD Dillard et al., J. Med. Chem, 1996, 39, 5119-5136).

Esquema 2

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Compuestos halogenados

Los indoles de partida de los compuestos en los cuales al menos uno de R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} es halógeno pueden ser preparados, en particular, a través del procedimiento de Leimgrüber-Batcho, ver Esquema 3 (AD Batcho, W Leimgrüber, Org. Synt., 1985, 63, 214-225) o del procedimiento Bartoli, ver Esquema 4 (G. Bartoli, G. Palmieri, Tet. Lett. 1989, 30, 2129-2132).

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Esquema 3

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Esquema 4

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Compuestos sustituidos con arilo

Los indoles en los cuales uno o más de R_{4} a R_{7} es un grupo arilo pueden ser preparados mediante acoplamiento Suzuki del ácido arilborónico adecuado con el correspondiente bromoindol, utilizando una variación sobre el procedimiento utilizado por Carrera (GM Carrera, GS Sheppard, Synlett, 1994, 93-94). Esto se esboza en el Esquema 5.

Esquema 5

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R_{1} puede ser introducido en cualquier estadio que resulte adecuado en las rutas de síntesis descritas anteriormente, a través de la desprotonación del nitrógeno del indol mediante una base adecuada (por ejemplo, hidruro sódico, carbonato sódico), seguido de reacción con un electrófilo adecuado, preferiblemente en forma RX, donde X es un halógeno (por ejemplo, yodometano).

R_{3} puede ser introducido por medio de reacción del IAA sustituido (R_{3}=H) con la base LDA, seguido de un electrófilo (AH Katz, et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1988, 31, 1244-50). De manera alternativa, la cadena lateral deseada podría ser introducida sobre el indol de partida, por medio de, por ejemplo, reacción entre el indol de partida con hidróxido sódico, etanol y lactonitrilo para proporcionar el \alpha-metil IAA (erdtmann et al., Acta Chemica Scandinavia., 1954, 8: 119-123).

GDEPT Sistemas de vector

En general, el vector que tiene que ser utilizado en terapias GDEPT puede ser cualquier vector RNA o DNA que resulte adecuado.

Entre los vectores no víricos adecuados se incluyen los liposomas y los polímeros catiónicos. Entre los vectores víricos adecuados se incluyen aquellos que están basados en retrovirus. Los citados vectores se encuentran ampliamente disponibles en la técnica. Huber et al., (ibid) informan acerca de la utilización de retrovirus anfótropos para la transformación de células de hepatoma, mama, colon o piel. Culver et al., (Science (1992) 256: 1550-1552) describen también la utilización de vectores retrovíricos en GDEPT. Pueden utilizarse los citados vectores o también los vectores obtenidos a partir de los mismos. Para preparar vectores adecuados para su utilización en la presente invención pueden también utilizarse otros retrovirus. Entre los citados retrovirus se incluye el virus sarcoma de Rous (RSV).

Englehardt et al., (Nature Genetics (1993) 4; 27-34) describen la utilización de vectores basados en adenovirus en el suministro del producto de conductancia de transmembrana en fibrosis cística (CFTR) a las células y puede también utilizarse el citado vector basado en adenovirus. A la hora de suministrar un sistema según la invención a células en el pulmón, y por tanto de utilidad de el tratamiento de tumores de pulmón, pueden resultar de particular utilidad los vectores que utilizan promotores de adenovirus y otras secuencias de control.

Se conocen otros sistemas de vectores, entre los cuales se incluyen los vectores basados en el virus de leucemia murina Molony (Ram, Z et al., Cancer Research (1993) 53: 83-88; Dalton & Treisman, Cell (1992) 68:597-612. Estos vectores contienen el reforzador del virus Leukemia Murine (MLV), clonado aguas arriba en un favorecedor mínimo \beta-globina. La región \beta-globina 5'-no traducida hasta el inicio del codon ATG es suministrada para dirigir la traducción eficaz del enzima.

Entre los favorecedores adecuados que pueden utilizarse en los vectores descritos anteriormente se incluyen el MLV, (citomegavirus) CMV, RSV y favorecedores adenovirus. Los favorecedores adenovirus preferidos son los favorecedores de gen temprano de adenovirus. Pueden resultar también adecuados los favorecedores de mamíferos fuertes. Un ejemplo del citado tipo de favorecedores lo constituye el favorecedor EF-1\alpha, el cual puede ser obtenido por referencia a Mizushima and Nagata ((1990), Nucl. Acids Res., 18:5322). Pueden también utilizarse variaciones de los citados favorecedores que conserven actividades transcripcionales sustancialmente similares.

En la relación de otros favorecedores adecuados se incluyen también favorecedores específicos de tejido y favorecedores activados por moléculas pequeñas, hipoxia o Rayos-X. La utilización de expresión genética regulada por hipoxia para terapia genética se describe en el documento EP-A-0745131.

La HRP es el enzima de elección para la activación de compuestos de fórmula (I). Entre otras peroxidasas adecuadas se incluye la peroxidasa del tabaco, la peroxidasa de cacahuete, la peroxidasa de lignina, la peroxidasa de ascorbato, las peroxidasas de las bacterias catalasas, la peroxidasa de citocromo c de levadura y la peroxidasa Coprinus cinereus (Arthomyces ramosusu, Coprinus macrorhizus). Pueden también utilizarse peroxidasas sintéticas, por ejemplo, oxoiron (IV) tetra(N-metilpiridil)porfirinas o microperoxidasas. La utilización de microperoxidasas puede resultar ventajosa, dado que se trata de proteínas pequeñas y, por lo tanto, tienen menos probabilidad de provocar problemas inmunológicos. Los enzimas pueden ser modificados por medio de técnicas de DNA recombinante estándar, por ejemplo, mediante el clonado del enzima, determinación de su secuencia genética y modificando su secuencia genética a través de procedimientos tales como la fusión, truncación, sustitución, abandono o inserción de secuencias, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida a un punto. Puede hacerse referencia a "Molecular cloning", de Sambrook et al., (1989, Cold Spring Harbor) para discusión de técnicas de DNA estándar. La modificación puede ser cualquiera que todavía deje al enzima con la capacidad para catalizar la formación del catión radical en compuestos de fórmula (I), pero que modifique otras propiedades del enzima, por ejemplo, su velocidad de reacción, propiedades inmunológicas o selectividad.

Además, como resultado de las manipulaciones requeridas para producir un vector en el cual una secuencia de ácido nucleico codificante está unida a diversas otras varias secuencias, pueden tener lugar pequeñas truncaciones en la secuencia N- y/o C-terminal.

La HRP ha sido expresada en células objetivo mediante la transfección de una construcción (pRK34-HRP), en la cual el HRP cDNA está fusionada con la señal de referencia para la hormona de crecimiento humana y el motivo de retención KDEL (Connolly CN, Futter CE, Gibson A, et al., Transport into and out the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase, J. Cell Biol. 1994; 127: 641-652). Se ha demostrado que la HRP resultante activa al ácido indol-3-acético y produce compuestos tóxicos (Greco, O. Et al., Development of an enzyme/prodrug combination for gene therapy of cancer, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 40, 478 (1999)).

ADEPT

Para aplicaciones en sistemas ADEPT, un anticuerpo dirigido frente a un marcador específico de tumor es unido al enzima relevante, el cual puede ser modificado tal como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. A los efectos de la presente invención, el término "anticuerpo", salvo que se indique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos completos los cuales conservan su actividad de unión para un antígeno objetivo tumoral. Entre los citados fragmentos se incluyen, fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')_{2}, al igual que anticuerpos de cadena única. Además, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo, tal como se describe en el documento EP-A-239400.

Los anticuerpos pueden ser producidos a través de técnicas de hibridoma convencional o, en caso de anticuerpos modificados o de fragmentos, a través de tecnología de DNA recombinante, por ejemplo, a través de la expresión en un vector huésped adecuado de una construcción de DNA que codifica para el anticuerpo modificado o el fragmento, operativamente unido al favorecedor. Entre las células huésped adecuadas se incluyen células de bacterias (por ejemplo, E. Coli), levaduras, insectos y mamíferos. Cuando el anticuerpo es producido a través de las citadas técnicas recombinantes, el enzima puede ser obtenido a través de la unión de una secuencia de ácido nucleico que codifica para el enzima (opcionalmente modificada, tal como se describe anteriormente) a la terminación 3' ó 5' de la secuencia de la construcción que codifica para el anticuerpo o fragmento del mismo.

PDEPT

Con vistas a seguir el planteamiento PDEPT, la peroxidasa elegida tiene que estar unida a un polímero que sea soluble en agua, biocompatible, no inmunógeno y que no elimine la actividad del enzima. La PDEPT es probable que presente menos efectos inmunógenos graves que la ADEPT, debido al enmascaramiento del enzima extraño por parte del polímero. La HRP se ha unido con éxito a polietilenglicol (PEG), al igual que a otros polímeros (Fortier G and Laliberté M, "Surface modification of horseradish peroxidase with polyethilene glycol(s) of various molecular masses "Biotechnol. Appl. Biochem. 17; 115-130, 1993; Laliberté M, et al., Surface modification of horseradish peroxidase with polyethilene glycol(s) of various molecular masses (Mr): relationship between the Mr of polyethilene glycol and the stability of horseradish peroxidase-poly (ethylene glicol) adducts under various denaturing conditions., Biotechnol. Appl. Biochem. 20: 394-413, 1994.

PDT

El procedimiento de activación en PDT puede ser altamente específico del punto de aplicación. La dirección y la anchura del rayo láser puede ser controlada con gran precisión. Por consiguiente, el mismo puede actuar sobre un área muy limitada, minimizando el daño al tejido vecino.

Las especies altamente reactivas y, por lo tanto citotóxicas, pueden también ser el resultado de activaciones con energía relativamente baja. Por ejemplo, un estado excitado reactivo de oxígeno molecular, el estado singulete, difiere en tan solo 90 Kj/mol de su estado triplete fundamental. No obstante, esto permite la formación de suficientes contracciones de las especies tóxicas, a través de los sintetizadores que absorben a longitudes de onda más largas que 600 nm (Carruth, J.A.S., Clinical Applications for photodynamic therapy, J. Photochem Photobiol (1991) 9, 396-397.

La principal limitación de este planteamiento surge de la física de la propia luz y de su interacción con el tejido humano. Se ha averiguado que la capacidad que tiene la luz de penetrar en el tejido humano depende de la longitud de onda. La capacidad de penetración se incrementa con el incremento de la longitud de onda, pero surgen limitaciones debido a la difracción y a la reflexión. En tejidos biológicos, el coeficiente de difracción, por ejemplo de la luz roja, es muy superior al coeficiente de absorción (Carruth, J.A.S., Clinical applications for photodynamic therapy, J. Photochem Photobiol (1991) 9, 396-397; Kennedy, J.C. and Pottier, R.H., Endogenous protoporphyrin IX, a clinical useful photosensitizer for photodynamic therapy, J. Photochem Photobiol (1992) 14, 275-292). Como resultado, los fotones que penetran en el tejido son difractados varias veces antes de ser o bien absorbidos o difundidos. Si bien podría esperarse que esto incrementaría la energía suministrada a determinadas áreas, lo que resulta es un descenso exponencial en el flujo de energía a medida que se incrementa la distancia desde la interfaz tejido-aire. Estas limitaciones han sido superadas parcialmente en el tratamiento de tumores relativamente voluminosos o cuando resulta necesaria una penetración más profunda, a través de la utilización de fibras ópticas intersticiales múltiples.

Se han identificado diversos tipos de tumores como potenciales objetivos para PDT. Entre los mismos se incluyen los tumores de cabeza y cuello, los carcinomas de los bronquios, los tumores cerebrales malignos, los tumores superficiales de la vejiga y la enfermedad vascular, los cuales han presentado, todos ellos, prometedoras respuestas en clínica (Regula, J., Mac Roberts, A.J., Gorchein, A., Buonaccorsi, Thorpe, S.M. Spencer, G.M., Hartfield, A.R.W. and Bown, S.G.; Photosensitisation and photodynamic therapy of oesophageal, duodenal and colorectal tumours using 5-aminoleavulic acid induced protoporphyrin IX-a pilot study, Gut (1995)36, 67-75).

Se ha descrito recientemente la inducción de apoptosis en células tumorales humanas a través de fotoproductos de ácido indol-3-acético, sensibiliazados mediante riboflavina (Edwards, A.M., et al., Apoptosis induccion in nonirradiated human HL-60 and murine NSO/2 tumor cells by photoproducts of indole-3-acetic acid and riboflavin. Photochemistry and Photobiology, 70, 645-649, 1999).

La utilización de compuestos de fórmula (I) refuerza la PDT. En PDT, la ecuación (1) de fotolisis de fotosensibilizadores P da como resultado la reacción del estado excitado triplete generado ^{3}P* con oxígeno en estado fundamental, produciendo oxígeno singulete tóxico, ecuación (2). Un inconveniente con PDT convencional reside en que no se genera toxicidad en anoxia. Sin que ello represente quedar vinculado por la teoría, un compuesto de fórmula (I), ilustrado como el IAA indicado anteriormente, es oxidado por ^{3}P* para generar un cation radical indol, ecuación (3), el cual, tal como se ha comentado anteriormente, conduce a productos tóxicos, con o sin la implicación de oxígeno.

P + h\nu \rightarrow ^{3}P\text{*}

^{3}P\text{*} + O_{2} \rightarrow P + ^{1}O_{2}

^{3}P\text{*} + IAA \rightarrow P + IAA\bullet+

La combinación, ya sea en condiciones aeróbicas o anóxicas, de un compuesto de fórmula (I) con un fotosensibiliador, debería traducirse en una concentración más baja de fotosensibilizador para alcanzar la misma toxicidad. Esto reduciría el daño normal provocado al tejido, a partir de la exposición a la luz después del tratamiento, lo cual puede ocurrir hasta varias semanas después del tratamiento. Los efectos sensibilizadores de los derivados de IAA deberían durar únicamente unas pocas horas, hasta que el IAA es excretado.

La técnica de PDT, tal como se ha discutido anteriormente, puede ser utilizada mediante el empleo de una combinación de compuestos adecuados de fórmula (I) y fotosensibilizadores. La longitud de onda preferida es de 500-800 nm.

Aplicaciones de la invención

Los compuestos de la invención pueden ser utilizados in vitro o in vivo para una diversidad de aplicaciones. Por ejemplo, para GDEPT se ha desarrollado un determinado número de sistemas de vectores para la expresión de la peroxidasa en una célula. El posterior desarrollo de tales sistemas (por ejemplo, el desarrollo de favorecedores adecuados para tipos de células específicas) requiere profármacos candidatos adecuados capaces de destruir células cuando son activados por la peroxidasa. En los citados sistemas modelo pueden utilizarse compuestos profármaco de fórmula (I) susceptibles a la peroxidasa. Los sistemas modelo pueden ser sistemas modelo in vitro o sistemas modelo de xenotransplante in vivo, comprendiendo, por ejemplo, células tumorales humanas implantadas en ratones atímicos.

Los compuestos de fórmula (I), en conjunción con fotosensibilizadores activados por luz que tienen una longitud de onda comprendida entre 500 y 800 nm pueden ser objeto de prueba in vitro con otras formas adecuadas de activación frente a grupos de tipos de células tumorales diferentes para determinar la eficacia frente a las citadas células tumorales. La eficacia de los compuestos de la invención frente a una gama de tipos celulares tumorales puede ser utilizada como puntos de referencia para el desarrollo de nuevos compuestos antitumorales.

Los compuestos de fórmula (I) puede ser también utilizados en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal. El citado tratamiento incluye un procedimiento de tratamiento del crecimiento de células neoplásicas en un paciente con una enfermedad neoplásica, que comprende la administración a un paciente que precise de tratamiento de los compuestos de fórmula (I), formando parte de un sistema ADEPT, GDEPT, PDEPT o PDT, en el que entre las enfermedades neoplásicas se incluyen la leucemia y los tumores sólidos, tales como los de ovario, colon, pulmón, renal, mama, intestino, cabeza y cuello, CNS y los melanomas.

Se da por entendido que, en lo que concierne al tratamiento de tumores, el tratamiento incluye cualquier topo de medida que adopte el médico para aliviar el efecto del tumor sobre un paciente. Por consiguiente, si bien la total remisión del tumor constituye un objetivo deseable, el tratamiento eficaz incluirá también cualquier tipo de medida que sea capaz de alcanzar la remisión parcial del tumor, al igual que el desaceleramiento en la velocidad de crecimiento de un tumor, incluyendo sus metástasis. Las citadas medidas pueden resultar eficaces a la hora de prolongar y/o de reforzar la calidad de vida y el alivio de los síntomas de la enfermedad.

Terapias

Los procedimientos ADEPT, GDEPT y PDEPT se describirán ahora. La base para la PDT ha sido descrita con anterioridad, pero la información acerca de la administración de productos indicada más adelante resulta también aplicable a este tipo de terapia.

Terapia ADEPT

El conjugado anticuerpo/enzima para ADEPT puede ser administrado de forma simultánea con el profármaco, pero a menudo se considera preferible, en la práctica clínica, la administración del conjugado enzima/anticuerpo con anterioridad al profármaco, por ejemplo, hasta 72 horas o incluso 1 semana antes, con vistas a proporcionarle al conjugado enzima/anticuerpo una oportunidad de localización en la región del objetivo tumoral. Actuando de esta forma, se administra el profármaco, la conversión del profármaco en agente citotóxico tiende a ser confirmada en las regiones en las que se localiza el conjugado enzima/agente, a saber, la región del tumor objetivo. De esta forma, la liberación prematura del compuesto producido a través de la acción de las peroxidasas sobre los profármacos de la presente invención resulta minimizada.

En ADEPT, el grado de localización del conjugado enzima/agente (en términos de relación de conjugado activo circulante localizado a libre) puede ser reforzado de forma adicional utilizando los sistemas de liberación y/o inactivación descritos en el documento WO89/10140. Esto conlleva, habitualmente después de la administración del conjugado y antes de la administración del profármaco, la administración de un componente (un "segundo componente") que es capaz de unirse a parte del conjugado con vistas a inactivar el enzima en la sangre y/o acelerar la liberación del conjugado del la sangre. El citado componente puede incluir un anticuerpo para el componente enzima, el cual es capaz de inactivar al enzima.

El segundo componente puede estar unido a una macromolécula, tal como dextrano, un liposoma, albúmina, macroglobulina o un grupo sanguíneo eritrocito O, con vistas a que el segundo componente quede impedido de abandonar el compartimento vascular. Además, o como una alternativa, el segundo componente puede incluir un número suficiente de restos galactosa unidos covalentemente, o de restos de otros azúcares tales como lactosa o manosa, a los efectos de que el mismo pueda unirse al conjugado en plasma pero pueda ser eliminado conjuntamente con el conjugado desde el plasma, por medio de receptores de la galactosa u otros azúcares en el hígado. El segundo componente debería ser diseñado para ser utilizado y administrado de tal forma que el mismo no pueda, en ninguna medida apreciable, penetrar en el espacio extravascular del tumor, donde el mismo pudiera inactivar al conjugado localizado con anterioridad y durante la administración del profármaco.

En sistemas ADEPT, la dosis de profármaco y de conjugado quedará en última instancia bajo criterio del médico, quien deberá tener en cuenta factores tales como la edad, el peso y la condición del paciente. En Bagshawe et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals (1991), 4, 915-922 se proporcionan dosis adecuadas de profármaco y de conjugado. Una dosis adecuada de conjugado puede estar comprendida entre 500 y 200.000 unidades enzima/m^{2} (por ejemplo, 20.000 unidades de enzima/m^{2}) y una dosis adecuada de profármaco puede estar comprendida entre aproximadamente 0,1 y 200 mg/kg, preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 mg/kg por paciente y por día.

Con vistas a asegurar la máxima concentración de conjugado en el punto de tratamiento deseado, resulta normalmente deseable separar la administración de los dos componentes durante al menos 4 horas. El régimen exacto estará influenciado por diversos factores, incluyendo la naturaleza del tumor objetivo y la naturaleza del profármaco, pero habitualmente existirá una concentración adecuada de conjugado en el punto deseado de tratamiento dentro de 48 horas.

La estrategia de objetivo puede verse reforzada en algunas combinaciones de fármaco y peroxidasa por medio del suministro del co-factor peróxido de hidrógeno al tumor. El suministro dirigido al objetivo de o bien glucosa oxidasa unida o bien a polímero o a anticuerpo se describe, por ejemplo, por Samoszuk M, Emerson J, Nguyen V, et al., "Targeting of glucose oxidase to murine lymphoma allografts"., Tumor Targeting (1995) 1, 37-43, Ben-Yoseph O, Ross BD., "Oxidation therapy: the use of a reactive oxygen species-generating enzyme system for tumour treatment", Br. J. Cancer (1994) 70, 1131-1135.

El conjugado anticuerpo/enzima puede ser administrado a través de cualquier ruta habitualmente utilizada en terapia ADEPT. Entre las mismas se incluye la administración perenteral del anticuerpo de manera y con formulaciones similares a las descritas más adelante.

Terapia PDEPT

Tal como en la terapia ADEPT, el conjugado polímero/enzima puede ser administrado de forma simultánea pero resulta a menudo preferible, en la práctica clínica, administrar el conjugado polímero/enzima con anterioridad al profármaco, por ejemplo, hasta 72 horas o incluso 1 semana antes, con vistas a proporcionarle al conjugado polímero/enzima una oportunidad de localización en la región del objetivo tumoral, y evitar, por tanto, que la reacción del enzima y el profármaco se desarrolle en un punto que no corresponda al deseado.

La dosificación y la administración del polímero/enzima y del profármaco se efectuará tal como se ha descrito anteriormente para ADEPT.

Terapia GDEPT

Para la utilización de los vectores en terapia, los mismos serán habitualmente introducidos en el interior de partículas víricas y las partículas suministradas al punto del tumor, tal como se describe, por ejemplo, en Ram et al., (ibid). Las partículas víricas pueden ser modificadas con vistas a que incluyan un anticuerpo, un fragmento del mismo (incluyendo una cadena única) o un ligando dirigido al tumor para reforzar la posición del tumor como objetivo. De forma alternativa, los vectores pueden ser ubicados en el interior de liposomas. Los liposomas pueden ser dirigidos a un tumor en particular. Esto puede ser logrado mediante la unión de un anticuerpo dirigido a un tumor al liposoma. Partículas víricas pueden ser también incorporadas en el interior de liposomas. Las partículas pueden ser suministradas al tumor a través de cualquier medio que resulte adecuado, a la disposición del médico. Preferiblemente, las partículas víricas serán capaces de infectar las células tumorales de una forma selectiva. Por "infectar selectivamente" se quiere dar a entender que las partículas víricas infectarán principalmente a las células tumorales y que la proporción de células no tumorales infectadas es tal que el daño a las células no tumorales derivado de la administración de un profármaco será aceptablemente bajo, dada la naturaleza de la enfermedad que está siendo tratada. Finalmente, esto será determinado por un médico.

Una ruta de administración adecuada es a través de inyección de las partículas en una solución estéril. También pueden administrase virus, por ejemplo, virus aislados a partir de líneas celulares envolventes, a través de administración por medio de perfusión regional o de inyección intratumoral directa, o de inyección directa en el interior de una cavidad corporal (administración intracaviterial), por ejemplo, a través de inyección intraperitoneal.

El régimen exacto de dosificación para GDEPT necesitará, naturalmente, ser determinado por médicos individuales para pacientes individuales y esto, a su vez, será controlado a través de la naturaleza exacta del profármaco y del agente citotóxico que tiene que ser liberado a partir del profármaco. No obstante, pueden proporcionarse algunas orientaciones de carácter general. La quimioterapia de estas características implicará normalmente la administración de virus modificados, y la administración a través de la ruta intravenosa es frecuentemente considerada la más práctica. El planteamiento GDEPT pude ser combinado con radioterapia para reforzar adicionalmente la eficacia. Cuando la GDEPT se combina con radioterapia, la combinación del compuesto de fórmula (I) con el sistema GDEPT puede ser considerada un radiosensibilizador.

En sistemas GDEPT la cantidad de virus o de otros vectores suministrados será la suficiente como para proporcionar una concentración celular lo suficientemente elevada de enzima para catalizar la conversión eficaz de profármacos en citotoxinas. Habitualmente, el vector será suministrado al paciente y después se monitorizará la ingesta del vector mediante células transfectadas o infectadas (en el caso de vectores víricos), por ejemplo, mediante recuperación y análisis de una muestra de biopsia del tejido objetivo. Esto puede ser determinado mediante ensayos clínicos, lo cual conlleva la administración de una gama de dosis de ensayo a un paciente y la medición del grado de infección o de transfección de una célula o tumor objetivo. La cantidad requerida de profármaco será similar o superior a la correspondiente a los sistemas ADEPT.

Al utilizar un sistema GDEPT el profármaco será habitualmente administrado después de la administración del vector que codifica para un enzima. Las dosis adecuadas de profármaco oscilan entre aproximadamente 0,1 y 200 mg/kg, preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 mg/kg por paciente y por día.

Administración de profármacos

Si bien resulta posible la administración de los compuestos de fórmula (I) en solitario, resulta preferible presentarlos en forma de formulaciones farmacéuticas, para ser utilizadas con cualquiera de los procedimientos anteriores. Las formulaciones comprenden los compuestos conjuntamente con uno o más soportes aceptables de los mismos y, opcionalmente, otros ingredientes o diluyentes terapéuticos. El soporte o soportes tienen que ser "aceptables", en el sentido de ser compatibles con los restantes ingredientes de la formulación y no perjudiciales para los recipientes de los mismos, por ejemplo, liposomas. Entre los liposomas adecuados se incluyen, por ejemplo, aquellos que comprenden el lípido cargado positivamente (N[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA), aquellos que comprenden dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) y los que comprenden 3\beta[N-(n'N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol).

Entre las formulaciones adecuadas para administración intramuscular o parenteral se incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas, las cuales pueden contener anti-oxidantes, tampones, bacteriostatos, antibióticos bacterioicidas y solutos que convierten a las soluciones en isotónicas con la sangre del receptor al que van dirigidos; una suspensión estéril acuosa y no acuosa, la cual puede incluir agentes de suspensión y agentes espesantes y liposomas u otros sistemas de micropartículas, los cuales han sido diseñados para dirigir los compuestos a los componentes de la sangre o a uno o más órganos. Las formulaciones pueden ser presentadas en forma de dosis unitarias o de recipientes multi-dosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales y pueden ser almacenadas en forma liofiloizada, requiriendo tan solo la adición de un soporte líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes de su utilización. Las soluciones y las suspensiones para inyección pueden ser preparadas de forma extemporánea, a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo de los descritos anteriormente.

Debe darse por entendido que, además de los ingredientes mencionados anteriormente de forma particular, las formulaciones pueden incluir otros agentes convencionales en el estado de la técnica, teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión. De entre las formulaciones posibles, resultan preferibles las soluciones acuosas y las soluciones no acuosas exentas de pirógenos.

Las dosis pueden ser administradas de forma secuencial, por ejemplo, a intervalos horarios, diarios, semanales o mensuales, o en respuesta a una necesidad específica del paciente. Entre las rutas preferidas de administración se encuentran el suministro oral y la inyección, habitualmente la inyección intramuscular o parenteral o la inyección intratumoral. Para procedimientos de PDT la administración dérmica o tópica puede resultar preferida, por ejemplo, inyección subcutánea o cremas y ungüentos y los citados procedimientos de administración resultan bien conocidos.

El régimen exacto de dosificación precisará ser, naturalmente, determinado por parte de médicos individuales para pacientes individuales y este, a su vez, será controlado a través de la naturaleza exacta del compuesto de fórmula (I), pero puede proporcionarse algún tipo de guía general. Las bandas de dosificación habituales serán generalmente las descritas anteriormente, las cuales pueden ser administradas en dosis únicas o múltiples. Pueden utilizarse otras dosis en función de la dolencia del paciente y de otros factores, a discreción del médico.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Detalles experimentales

La totalidad de reacciones sensibles al aire se llevaron a cabo en atmósfera de nitrógeno. Los utensilios de cristal fueron secados en horno y enfriados en atmósfera anhidra con anterioridad a su utilización. Se determinaron los puntos de fusión utilizando un aparato de punto de fusión Gallenkamp y no se han corregido. Los espectros NMR (60 MHz) fueron registrados en un espectrómetro Jeol MY60. Los espectros de masas fueron registrados en un sistema Waters integrity HPLC/MS.

Ejemplo 1 Procedimiento general para la síntesis de indol de Fischer (Engvild KC et al., ibid) (ver esquema 1 para esbozo)

Se disolvió ácido L-glutámico (30 mmol) (o el derivado adecuado) en una cantidad equimolar de hidróxido sódico 2 M y se enfrió a 0ºC. Se añadió solución de hipoclorito sódico (1 equivalente) y la mezcla fue sometida a agitación a 0ºC por espacio de 1 hora. Se añadió entonces ácido clorhídrico 3 M (3 equivalentes) y la mezcla fue sometida a agitación a 55ºC hasta que dio negativo en yoduro de almidón. El clorhidrato de fenilhidrazina sustituido (habitualmente 10 mm) fue añadido a la solución caliente y se sometió la mezcla a agitación por espacio de 1 hora, mientras se enfriaba hasta temperatura ambiente. La mezcla fue entonces extraída con acetato de etilo (3 x 50 ml), los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio y se extrajo el disolvente al vacío para proporcionar la fenilhidrazona cruda.

El producto fue disuelto entonces en piridina (24 ml). Se añadió ácido clorhídrico concentrado (31 ml), seguido de ácido fosfórico al 85% (8-10 ml) y se calentó la mezcla a reflujo en una atmósfera inerte por espacio de 18 horas. La mezcla de reacción enfriada fue derramada en un volumen igual de agua enfriada con hielo y después extraída con éter dietílico (3 x 75 ml), se secaron las capas de éter combinadas (MgSO_{4}) y se extrajo el disolvente al vacío para proporcionar el producto crudo, el cual fue purificado por medio de recristalización a partir de cloroformo.

Ejemplo 1(a)

Ácido 5-cloroindol-3 acético (SR024)

9

Agujas de color blanco oscurecido, rendimiento 11%, p.f. 160-161ºC (lit. 158-159ºC), m/z 209 (M+), 164 (M+ -CO_{2}H), 128; \deltaH/ppm (CDCl_{3}) 7,66 (1H, s); 7,19 (3H, m); 3,74(2H, s); encontrado C 57,05%, H 3,82%, N 6,62% (calculado C 57,30%, H 3,85%, N 6,68%).

Ejemplo 1(b)

Ácido 7-fluoroindol-3-acético (SR022)

10

\newpage

Polvo de color beige, rendimiento 24%, p.f. 159-161ºC (lit. 161-162ºC); m/z 193(M+), 148 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm (CD_{3}COCD_{3}) 7,63-6,78 (4H, m, ArH); 3,71 (2H, s, ArCH_{2}).

Ejemplo 1(c)

Ácido 5-trifluorometoxiindol-3-acético (SR073)

11

Polvo de color blanco, rendimiento 7%, p.f. 120-122ºC; m/z 259 (M+); 214 M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm (CDCl_{3}) 7,43-7,11 (4H, m, ArH); 3,76 (2H, s, ArCH_{2}); encontrado C 50,96%; H 3,18%, N 5,40% (calculado C 50,98%; H 3,11%;N 5,40%).

Ejemplo 1(d)

Ácido 5-fluoro-2-metilindol-3-acético (SR036)

12

Placas de color blanco, rendimiento 10%, p.f. 182-184ºC (lit. 179-182ºC); m/z 207 (M+); 162 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm (CD_{3}COCD_{3}) 7,24-6,60 (3H, m, ArH); 3,65 (2H, s, ArCH_{2}); 2,36(3H, s, 2-Me).

Ejemplo 1(e)

Ácido 7-fluoro-5-metilindol-3-acético (SR109)

13

Polvo de color blanco oscurecido, rendimiento 5%, p.f. 138-140ºC; m/z 207 (M+); 162 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm (CD_{3}COCD_{3}) 7,29-7,13 (2H, m, ArH); 6,78-6,56 (1H, m, ArH); 3,69(2H, s, ArCH_{2}); 2,38 (3H, s, 5-Me); encontrado C 62,89%; H 4,86%; N 6,57% (calculado C 63,76%, H 4,86%, N 6,76%).

Ejemplo 1(f)

Ácido 7-fluoro-4-metilindol-3-acético (SR148)

14

Polvo de color beige pardo, rendimiento 4%, p.f. 162-164ºC dec., m/z: 207 (M+), 162 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm (CD_{3}COCD_{3}) 7,25 (1H, m, ArH); 6,71 (1H, m, ArH); 3,87 (2H, s, ArCH_{2}); 2,58 (3H, s, 4-CH_{3}).

\newpage

Ejemplo 1(g)

Ácido 4,6-dicloroindol-3-acético (SR085)

15

Agujas de color blanco oscurecido, rendimiento 5%, p.f. 223-224ºC (lit. 210-214ºC); m/z 245, 243 (M+), 200, 198 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm (CD_{3}COCD_{3}) 7,31 (2H, br, ArH [H2, H7]), 6,98 (1H, s, ArH[H5]), 3,97 (2H, s, ArCH_{2}).

Ejemplo 1(h)

Ácido 5-cloro-7-fluoroindol-3-acético (SR091)

16

Polvo de color blanco, rendimiento 4%, p.f. 164-166ºC; m/z:229, 227 (M+), 184, 182 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm (CD_{3}COCD_{3}) 7,69-6,76 (3H, m, ArH); 3,72 (2H, s, ArCH_{2}); encontrado C 51,57, H 3,26%, N 6,01%, (Calculado, C 52,77%, H 3,10%, N 6,15%, calculado C_{10}H_{7}ClFNO_{2}\cdot0,25H_{2}O C 51,72%, H 3,26%, N 6,04%).

Ejemplo 2 Procedimiento general para la síntesis de ácidos indolacético sustituidos, a partir de indol sustituido de origen

(Dillard, RD, et al., ibid) (ver esquema 2)

El indol sustituido, el cual puede encontrarse disponible en el comercio o ser sintetizado, según se muestra más adelante (habitualmente 5-10 mmol), fue disuelto en THF anhidro (20 ml) y enfriado a 0ºC. Se añadió n-butillitio (1,1 equivalentes) y se agitó la mezcla a 0ºC por espacio de 20 minutos. Se añadió cloruro de zinc (1,1 equ. De una solución 1 M en éter dietílico) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente por espacio de 2 horas. Se añadió entonces bromoacetato de etilo (1,1 equivalentes) por espacio de 5 minutos y la mezcla fue agitada durante un nuevo período de 24 horas. Se añadió agua (20 ml) y se extrajo la mezcla con acetato de etilo (3 x 30 ml), se secaron los extractos orgánicos combinados (MgSO_{4}) y se concentró la solución al vacío para proporcionar el producto crudo. El material crudo fue purificado por medio de cromatografía en columna flash (3:1 hexano :EtOAc) para proporcionar el indolil-3-acetato de etilo sustituido, con un rendimiento entre moderado y bajo, con recuperación significativa del producto de partida en la mayoría de los casos. La saponificación se llevó a cabo mediante el calentamiento del éster a reflujo durante 4 horas en NaOH metabólico al 10% (40 ml), acidificando después la mezcla con ácido clorhídrico 1 M y filtrando el ácido indol-3-acético precipitado.

Se alcanzó una purificación adicional mediante recristalización a partir de cloroformo.

Ejemplo 2(a)

Ácido 7-cloroindol-3-acético (SR052)

17

A partir de material de partida disponible comercialmente. Polvo de color blanco oscurecido, rendimiento 11%, p.f. 164-165ºC (lit. 163-165ºC); m/z: 211, 209 (M+), 164 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm (CD_{3}COCD_{3}) 7,61-6,99 (4H, m, ArH); 3,77 (2H, s, ArCH_{2}); encontrado C 55,51%, H 3,77%, N 6,42% (calculado C 57,30%, H 3,85%, N 6,68%).

Ejemplo 3 Procedimiento general para la síntesis Leimgrüber-Batcho del indol

(Batcho, AD, et al., ibid) (ver esquema 3 para esbozo)

5 g del halonitrotolueno fueron calentados con acetal dimetílico de N,N-dimetilforfamida (1,1 equivalentes), hasta que se consideró que la reacción se había completado, por medio de cromatografía de capa fina. La adición de metanol y la concentración en condiciones de presión reducidas proporcionaron el \beta-pirrolidinoestireno, ya sea en forma de aceite de color rojo oscuro o como sólido cristalino, el cual fue sometido después a reducción sin purificación adicional.

El \beta-pirrolidinoestireno (ca 20 mmol) fue disuelto en metanol (50 ml). Se añadieron níquel Raney (0,5 ml al 50% peso/volumen en agua) e hidrazina hidrato (30 mmol). La mezcla fue sometida a agitación a 45ºC por espacio de 30 minutos y se añadió posteriormente una porción adicional de hidrazina hidrato (30 mmol) y la mezcla fue sometida a agitación a 45-50ºC durante un nuevo período de 1 hora. La mezcla de reacción fue filtrada a través de celite y se evaporó el filtrado para proporcionar un aceite de color marrón, el cual fue purificado por medio de cromatografía flash (4:1 hexano:EtOAc), para proporcionar el indol resultante. El ácido indol-3-acético fue sintetizado entonces a través del éster etílico, por medio del procedimiento descrito en el ejemplo 2 indicado anteriormente.

Ejemplo 3(a)

Ácido 4-fluoroindol-3-acético (SR039)

18

Prismas de color blanco-amarronado, rendimiento 22%, p.f. 129-131ºC (lit. 128-129ºC); m/z: 193 (M+), 14,8 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm (CD_{3}COCD_{3}); 7,23-6,49 (4H, m, ArH); 3,85 (2H, s, ArCH_{2}); encontrado C: 61,87%, H 4,19%, N: 7,12% (calculado C: 62,18%, H: 4,17%, N: 7,25%).

Ejemplo 3(b)

Ácido 6-fluoroindol-3-acético (SR043)

19

Agujas de color blanco oscurecido, rendimiento 30%, p.f. 161-163ºC (lit. 165ºC); m/z: 193 (M+), 148 (M+
-CO_{2}H); \deltaH/ppm (CD_{3}COCD_{3}): 7,61-6,43 (4H, m, ArH)), 3,73 (2H, s, ArCH_{2}); encontrado C: 62,08%, H: 4,18%, N: 7,22% (calculado C: 62,18%, H: 4,17%; N: 7,25%).

Ejemplo 3(c)

Ácido 6-cloroindol-3-acético (SR058)

20

Placas de color rosa pálido, rendimiento 14%, p.f. 183-185ºC (lit. 182-184ºC); m/z 209 (M+), 164 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm 7,66\cdot7,06 (4H, m, ArH); 3,71 (2H, s, ArCH_{2}); encontrado C 57,38%; H 3,84%; N 6,67% (calculado C 57,30%; H 3,85%; N 6,68%).

Ejemplo 3(d)

Ácido 6-bromoindol-3-acético (SR069)

21

Copos lustrosos de color rosa pálido, rendimiento 12%, p.f. 174-176ºC (lit. 172-177ºC); m/z 255,253 (M+), 210,208 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm (CD_{3}COCD_{3}) 7,61-7,12 (4H, m, ArH); 3,76 (2H, s, ArCH_{2}); encontrado C 44,79%; H 3,20%; N 5,11% (calculado C 47,27%; H 3,17%; N 5,51%).

Ejemplo 4 Procedimiento general para la preparación de arilindoles a través de acoplamiento Suzuki de bromoindoles

(Ver esquema 5 para esbozo)

El bromoindol adecuado (2-5 mmol) y tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0) (5% mol) fueron agitados en tolueno (15 ml), en atmósfera de nitrógeno, por espacio de 5 minutos y después se añadió el ácido arilborónico (1,1 equivalentes) en etanol (4 ml), seguido de carbonato sódico acuoso (2 equivalentes) y la mezcla fue calentada después a 80ºC en atmósfera de nitrógeno, por espacio de 24 horas. Se añadió agua (20 ml) y se extrajo la mezcla con acetato de etilo (3x50 ml), se secaron las capas orgánicas (MgSO_{4}) y se extrajo el disolvente al vacío para proporcionar el producto crudo, el cual fue purificado por medio de cromatografía (3:1 hexano:EtOAc) para proporcionar el arilindol puro. El ácido indol-3-acético fue después sintetizado a través del éster etílico, tal como se describe en el Ejemplo 2 anterior.

Ejemplo 4(a)

Ácido 5-(4-clorofenil)indol-3-acético (SR150)

22

Copos de color blanco, rendimiento 15%, p.f. 166-168ºC; m/z 287, 285 (M+); 242,240 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm (CD_{3}COCD_{3}) 7,84-7,28 (8H, m, ArH); 3,77 (2H, s, ArCH_{2}); encontrado C 67,05%; H 4,20%; N 4,83% (calculado C 67,26%; H 4,23%; N 4,90%).

Ejemplo 5 Procedimiento general para síntesis de indoles a través del procedimiento Bartoli

(Bartoli G, et al., ibid.) (ver esquela 4 para esbozo)

El nitrobenceno adecuado, sustituido en la posición 2 (habitualmente 5-10 mmol), fue disuelto en THF (20 ml y enfriado a -40ºC). Se añadió bromuro de vinilmagnesio (3 equivalentes de una solución 1 M en éter) y se agitó la mezcla a -40ºC por espacio de 20 minutos, derramándose luego en la solución de cloruro amónico saturada. La mezcla fue extraída con éter dietílico (3x50 ml) y se secaron las capas orgánicas combinadas (MgSO_{4}), extrayéndose el disolvente al vacío para proporcionar el indol crudo, el cual fue purificado a través de cromatografía flash. Los intermedios de indol resultantes pueden ser convertidos en los correspondientes ácidos 3-indol acético a través del procedimiento descrito en el Ejemplo 2.

Ejemplo 5(a)

Ácido 7-bromoindol-3-acético

23

7-bromoindol. Agujas de color marrón pálido, rendimiento 24%, p.f. 42-44ºC (catálogos químicos Aldrich) 41-44ºC; m/z 197, 195 (M+).

Ejemplo 5(b)

Ácido 6,7-dicloroindol-3-acético

24

6,7-dicloroindol. Agujas peludas de color blanco oscurecido, rendimiento 25%; p.f. 50-52ºC; M/Z 185, 187, 189 (relación 9:6:1, M+); 150, 152 (M+ -Cl).

Ejemplo 6 Ácidos indol-3-acético N-sustituidos

Ejemplo 6(a)

Ácido 6-cloro-1-metilindol-3-acético (SR139)

25

Se suspendió hidruro sódico (0,19 g de una suspensión al 60% en aceite) en THF anhidro (10 ml). Se añadió gota a gota ácido 6-cloroindol-3-acético (SR058) (100 mg; 0,48 mmol) en THF (5 ml) y se agitó después la mezcla con agitación por espacio de 10 minutos. Se añadió entonces yodometano (0,34 g; 2,4 mmol) y se dejó la mezcla en agitación durante el transcurso de una noche. Se destruyó cuidadosamente el exceso de hidruro sódico, mediante la adición de agua, gota a gota y se acidificó luego la mezcla (HCl 1 M) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 ml), secándose las capas orgánicas sobre MgSO_{4}, y se evaporó el disolvente para proporcionar un polvo de color marrón, con un rendimiento de 75 mg, 70%, p.f. 130-132ºC dec.; m/z 225, 223 (M+), 180, 178 (M+ -CO_{2}H); \deltaH/ppm 7,46-6,92 (4H, m, ArH); 3,77 (3H,s, N-Me); 3,0 (2H, s, ArCH_{2}).

Ejemplo 6(b)

Ácido 5-fluoro-1-metilindol-3-acético (SR164)

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Sintetizado como en el Ejemplo 6(a). Agujas de color blanco, rendimiento 52%, p.f. 134-136ºC; m/z 207(M+), 162 (M+-CO_{2}H).

Ejemplo 7 Mediciones de los efectos citotóxicos del tratamiento con compuestos de fórmula (I) y peroxidasa de rábano (HRP), utilizando líneas celulares de cobayo (V79) y humanas (MCF7 y HT29), in vitro

Ejemplo 7(a)

Células V79

Se obtuvieron células V79 de fibroblasto de pulmón de cobayo, procedentes de la European Tissue Culture Collection. Las células fueron cultivadas durante el fin de semana en pletinas de cultivo de tejidos de 75 mL, en forma de células unidas, en medio esencial modificado por Eagle (EMEM), suplementado con suero de ternera fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 \mug/mL e incubadas en una incubadora humidificada a 37ºC, en CO_{2}/aire al 5%. Las células fueron extraídas mediante un tratamiento con tripsina una vez hubo crecido una capa confluyente; Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato y 2 mL de tripsina porcina 0,5% peso/volumen con EDTA 02% peso volumen, añadido por espacio de unos pocos minutos a temperatura ambiente, hasta que la totalidad de las células quedaron liberadas. La tripsina fue desactivada a través de la adición de 10 mL de EMEM modificada por rotor (suplementado con suero de ternera fetal al 7,5%) y se dejó que las células crecieran en un cultivo giratorio, pre-gasificado con CO_{2}/aire al 5%, manteniendo las células en crecimiento
logarítmico.

Las células fueron preparadas para mediciones de toxicidad mediante el contaje y colocación en placas de 200, 2000 ó 20.000 células/plato de Petri de 6 cm en 3 mL de EMEM, por triplicado para cada una de las muestras. Se dejó que las células se unieran por espacio de al menos 1 hora, se extrajo entonces el medio y se añadió 2 mL de solución de sal equilibrada de Hank, exenta de rojo de fenol, ya sea en solitario (control) o con 50 ó 100 \muM del compuesto de fórmula (I) que debe ser comprobado. Se añadió HRP (50 \muL de 0,048 mg/mL) a los platos de prueba que lo requerían y se lavó con 2 mL de Hanks, añadiéndose después 4 m de EMEM. Se dejó que las células crecieran durante un período de 7 días hasta colonias de > 50 células. A los 7 días se extrajo el medio y se fijaron las células con metanol al 75%, por espacio de 5 minutos. El metanol fue extraído posteriormente y las células se tiñeron con 1% de violeta de cristal al 1% peso/volumen, por espacio de 5 minutos. Se lavaron las células y contabilizaron las
colonias.

Se determinó la supervivencia celular calculando la relación de colonias crecientes, comparándola con las células control no tratadas.

En la Tabla 1, los valores que se indican son la fracción de supervivencia después de 2 horas de tratamiento con los derivados de IAA, a las concentraciones mostradas conjuntamente con HRP (1,2 \mug/mL). Salvo que se indique lo contrario (por n= número de experimentos individuales), se proporcionan los valores promedio \pm los errores estándar de tres experimentos. A los tiempos y concentraciones indicados no se detectaron efectos citotóxicos únicamente con derivados IAA o únicamente con HRP.

TABLA 1

27

Las Figuras 1 y 2 están relacionadas con experimentos llevados a cabo utilizando ácido 5-fluoro-indol-3-acético. La Figura 1 muestra la variación en la fracción de supervivencia de células frente a concentración variable de ácido 5-fluoro-indol-3-acético, después de 5 horas de incubación, con o sin HRP (1,2 \mug/L). La Figura 2 muestra la variación en la fracción de supervivencia de células frente a concentraciones variables de HRP, después de 5 horas de incubación, con 50 \muM de ácido 5-fluoro-indol-3-acético.

\newpage

Ejemplo 7(b)

Líneas celulares humanas

Células de carcinoma de mama humano (MCF7) y células de carcinoma de colon humano (HT29) fueron obtenidas desde la European Tissue Culture Collection. Las células fueron cultivadas como capas unidas en EMEM, suplementado con suero de ternera fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 5% peso/volumen, penicilina 100 U/mL, y estreptomicina 100 \mug/mL y se incubaron en una incubadora humidificada a 37ºC en CO_{2}/aire al 5%. Se llevaron a cabo experimentos de supervivencia de células, exactamente igual que para las células V79, con la excepción de que las células fueron ubicadas en platos de Petri directamente a partir de una pletina confluyente tripsinizada y se dejaron en las placas durante al menos 4 horas antes de la adición del fármaco.

La Figura 3 muestra la variación en la fracción de supervivencia de células MCF7 y HT29, cuando se incubaron durante períodos de tiempo de diferente extensión con ácido 5-fluoro-indol-3-acético 100 \muM y con o sin HRP (1,2 \mug/L).

Ejemplo 8 Mediciones de los efectos citotóxicos de tratamiento con compuestos de fórmula (I) y peroxidasa de rábano (HRP) unida a un polímero (Terapia enzima-profármaco dirigida por polímero, PDEPT) Preparación del conjugado HRP-Polímero

La HRP fue conjugada con polietilenglicol (PEG), en base al procedimiento de Fortier y Laliberté (1993, ibid). Se mezcló HRP (7,82 mg) con carbonato de metoxipoli(etilenglicol)-nitrofenilo (PEG, Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama, USA) peso molecular 5240 Da (42,66 mg) en 4 mL de tampón borato 0,1 M, pH 9,4, durante el transcurso de una noche a 4ºC. Al día siguiente se añadieron 50 mL de tampón fosfato sódico 35 mM, pH 6,5 y se extrajo el producto p-nitrofenol resultante de color amarillo mediante filtración a través de un filtro con cierre Vectraspin (Whatman) de 20 Kda. La mezcla concentrada resultante de HRP y conjugado HRP-PEG fue almacenada durante el transcurso de una noche en un frigorífico. Las proteínas fueron separadas en una columna superfina Sephadex G75 (2 x 35 cm) con acetato sódico 25 mM pH 5, a 1 mL/h, 4ºC y se recogieron fracciones cada hora con un recogedor de fracciones. La HRP fue medida espectroscópicamente a 405 nm. La pureza de las fracciones se midió sobre gel SDS-PAGE (gel de agarosa 8% con gel apilado 4%) y las bandas se tiñeron con azul de Coomassie (0,25 g azul de coomassie en 10 mL de ácido acétic glacial y 90 mL de metanol al 50%), por espacio de 50 minutos. El gel fue desteñido durante el transcurso de la noche con 10 mL de ácido acético glacial y 90 mL de metanol al 50%. Se obtuvieron aproximadamente 10 mg de conjugado HRP-PEG puro, con una banda de pesos moleculares de hasta 25 kDa más puros que la HRP pura. La proteína resultante fue secada en atmósfera de nitrógeno y almacenada en atmósfera de nitrógeno a -20ºC.

Medición de la actividad de la peroxidasa del conjugado HRP-polímero

Se midió la actividad de HRP-PEG, utilizando el procedimiento Sigma ABTS (ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico). Se mezclaron ABTS (0,725 mL de 9,1 mM en tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 5); solución HRP 12,5 \muM (aproximadamente 20 \mug/ml en tampón fosfato 40 mM con sueroalbúmina bovina 0,25% y Triton X-100 0,5% peso/volumen pH 6,8) y 25 \muL de peróxido de hidrógeno 0,3% y se midió la velocidad de incremento en la absorbancia a 406 nm (con un filtro de cierre de 400 nm) en un espectrofotómetro diodo array Hewlett Packard 8452A. Asumiendo un coeficiente de extinción de 36.800 M^{-1}s^{-1}, se calculó la actividad de HRP/PEG a partir de la definición de unidad: 1 unidad de HRP oxidará 1 \mumol de ABTS por minuto a pH 5,25, 25ºC.

Estudios de biodistribución del conjugado HRP-polímero

Se llevaron a cabo experimentos para medir la ingesta de HRP-PEG en tejido en ratones CBA/Gy hembra, con un tumor adenocarcinoma de mama dorsal subcutáneo (CaNT). Los tumores surgieron como consecuencia de la inoculación con una suspensión de 0,5 mL de un tumor solido disgregado bajo condiciones de inhalación anestésicas. Los tumores fueron utilizados aproximadamente 3 semanas más tarde (los tumores tenían una masa promedio de aproximadamente 0,4 g).

Los ratones fueron inyectados intra-peritonealmente (i.p.) con 0,3 mL de HRP-PEG 0,5 mg/mL, intra-tumoralmente (i.t.) con 50 \muL de HRP-PEG 3 mg/mL o intra-venosamente (i.v.) con 100 \muL de HRP-PEG 1,5 mg/mL. Los ratones fueron sacrificados por medio de dislocamiento cervical dentro de las 48 horas posteriores, se extrajeron los tejidos, se pesaron y almacenaron a -20ºC. Se extrajo sangre desde la cavidad pectoral, se centrifugó y se almacenó el plasma a -20ºC.

Se midió la acumulación en tejido de HRP-PEG utilizando tetrametilbencidina (TMB). Los tejidos fueron macerados en 2 mL de bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 0,5% en tampón fosfato 50 mM (pH 6) y se congelaron-descongelaron dos veces. Las suspensiones fueron calentadas a 60ºC por espacio de 2 horas, se centrifugaron a 4500 rpm por espacio de 5 min y se almacenaron a -20ºC. Se midió la actividad del enzima mezclando 1,87 mL de tampón fosfato 80 mM, pH 5,4; 70 \muL de peróxido de hidrógeno 88 mM; 20 \muL de TMB 1 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO) y 40 \muL de muestra. Se midió la velocidad de aumento en la absorbancia a 630 nm con un espectrofotómetro diodo array Hewlett Packard 8452A. Se calculó la modificación en la absorbancia por minuto en relación con el contenido proteínico de las muestras, las cuales se midieron a través del procedimiento de Bio Rad Lowry, una vez diluidas 10 veces en agua. Se midieron los niveles de enzima en relación con los niveles control, lo cual permitió que las incorrecciones procedentes de las variaciones en el contenido de hemoglobina pudiera ser eliminadas. La ingesta de HRP-PEG en el tumor tuvo lugar después de inyección i.p. y i.t., si bien resultó más elevada la ingesta en el hígado. La inyección de HRP-PEG i.t. permitió medir la actividad en el tumor hasta transcurridas 20 horas más tarde. Sin pretender quedar vinculados por la teoría, la ingesta en el hígado se cree debida a que los receptores glicoproteina manosa sobre las células hepatocito retuvieron selectivamente la HRP (que es una glicoproteína manosa) de la circulación, lo cual puede ser evitado mediante modificación de la proteína sin afectar a la actividad (J.W.Tams, KJ.G. Welinder, Anal. Biochem. 1995, 228, 48-55).

Ejemplo 9 Mediciones de los efectos citotóxicos del tratamiento con compuestos de fórmula (I) y peroxidasa de rábano (HRP) unida a antibiótico (Terapia Enzima Profármaco dirigida por Antibiótico, ADEPT) El xenotransplante tumoral utilizado

Para desarrollar un modelo de xenotrasplante en los flancos de ratones atímicos MF1 se utilizó la línea celular LS174T de adenocarcinoma de colon humano. El paso subsiguiente fue la implantación de piezas tumorales pequeñas (aproximadamente 1 mm^{3}). El tumor es un adenocarcinoma productor de antígeno carcinoembriónico (CEA), entre pobre y moderadamente diferenciado, con ácinos glandulares pequeños, el cual secreta CEA no medible a la circulación. La totalidad de ratones utilizados eran hembras, con edades comprendidas entre los 2 y 3 meses y peso comprendido entre 20 y 25 g.

El anticuerpo utilizado

Se utilizó el anticuerpo A5B7. Se trata de un anticuerpo anti-CEA monoclonal que proporciona un teñido positivo para la superficie luminar glandular y citoplasma en el modelo de xenotrasplante LS174T. El anticuerpo fue marcado con ^{125}I, utilizando el procedimiento yodogen, hasta una actividad específica de 37 MBq/1 mg de proteína, y esterilizado por medio del paso a través de un filtro de 0,22 mm (Gelman, Northampton, UK).

Preparación del conjugado anticuerpo-enzima

Se utilizó el procedimiento de Nekane y Kawaoi (1974), modificado por Hudson y Hay (1980). El anticuerpo A5B7 fue diazilizado tres veces frente a tampón carbonato sódico 0,2 M, pH 9,5, a 4ºC. Se disolvió HRP (Sigma Type VI, RZ\sim3,0; 4 mg) wn 1,0 ml de agua desionizada. Se añadió peryodato sódico recién preparado (200 \muL, 0,1 M) a la mezcla y se agitó suavemente por espacio de 20 minutos a temperatura ambiente para activar la HRP. La solución fue dializada durante el transcurso de una noche frente a acetato sódico (1L, 1 mM pH 4,4), a 4ºC. Se añadió tampón carbonato (20 \muL, 0,2 M) al aldehído HRP dializado, elevando el pH hasta situarlo entre 9 y 9,5, justo antes de llevar a cabo la adición del anticuerpo que tiene que ser marcado. La solución fue incubada a temperatura ambiente por espacio de 2 horas, con agitación suave. Se añadió borohidruro sódico (100 \muL, 4 mg/ml, preparado recientemente) y se dejo 2 horas a 4ºC para reducir el enzima libre. La solución fue entonces dializada durante el transcurso de la noche frente a tampón borato (2L, 0,1 M pH 7,4). Los anticuerpos marcados fueron almacenados a 4ºC.

Estudios de la biodistribución del conjugado anticuerpo-enzima

El conjugado marcado con ^{125}I fue utilizado en algunos experimentos. Utilizando grupos de 4 ratones, anticuerpo y anticuerpo-enzima, se investigó la distribución a las 6, 24 y a las 48 horas desde la inyección del anticuerpo. La totalidad de ratones recibieron 0,75 MBq/ 20 g ^{125}I-A5B7 i.v., en la vena de la cola. En los momentos temporales seleccionados, los ratones fueron desangrados y se extrajeron el hígado, riñón, pulmón, bazo, colon, músculo y el tumor, para llevar a cabo la valoración de la actividad comparativa. Cada uno de los tejidos fue pesado, digerido en KOH 7 M y sometido a contaje a través de un contador gamma (Wizard: Pharmacia, Milton Keynes, UK). Los resultados se expresaron en forma de porcentaje de dosis inyectada por g de tejido y se compararon los grupos utilizando la prueba de Mann-Witney. Los ratones recibieron alimento y agua a voluntad, conteniendo el agua un 0,1% de yoduro de potasio para bloquear la ingesta de yodo.

En otros experimentos, se determinó la actividad enzimática del conjugado HRP-A5B7. Utilizando dos grupos de cuatro ratones atímicos soportando el tumor LS174T, se midió la actividad anticuerpo-enzima y la distribución en tejidos, a las 24 y a las 72 horas de haberse aplicado la inyección de anticuerpo. Todos los ratones fueron inyectados i.v. con 250 \mug de HRP-A5B7 en la vena de la cola. Los ratones fueron desangrados en los momentos temporales seleccionados y se extrajo el tumor, el hígado, el pulmón, el riñón, el músculo y el plasma, almacenándolos a -20ºC. Se midió la actividad del enzima utilizando el procedimiento de tetrametilbenzidina descrito anteriormente para el ensayo del conjugado HRP-PEG. Se midió la actividad en relación con los ratones con tumores control no tratados.

Ejemplo 10 Mediciones de los efectos citotóxicos del tratamiento con compuestos de fórmula (I) combinados con fotosensibilizadores y luz visible en terapia fotodinámica (PDT)

Células de cobayo V79 fueron sometidas a fotolisis en presencia de una diversidad de fotosensibilizadores y de compuestos de fórmula (I).

Las células V79 fueron colocadas en placas durante al menos 1 hora en EMEM, sobre placas de 6 pocillos en duplicado, en DMEM exento de fenol. El medio fue retirado de las células en la oscuridad y se añadieron 2 mL 2\muM del fotosensibilizador y 0,1 mM del compuesto de prueba (5-fluoro IAA y 5-bromo IAA) en oscuridad y se procedió inmediatamente con la fotolisis durante períodos de tiempo variables, utilizando una matriz de diodos emisores de luz a longitudes de onda adecuadas para el fotosensibilizador. Las células fueron dejadas en la incubadora durante 1 hora, se extrajeron los fármacos, se lavaron las células con 2 mL de solución de PBS en oscuridad y se cultivaron durante un período de 6 días en 3 mL de EMEM. Se contabilizaron colonias de > 50 células una vez fijadas y teñidas con violeta de cristal (ver anteriormente).

Los resultados, en términos de fracción de supervivencia de células (en relación con células control no tratadas) frente a tiempo creciente de fotolisis, se muestran en las figuras indicadas más adelante.

Fotosensibilizador	Azul de metileno	Tionina	Azul de toluidina	Rosa de bengala
Longitud de onda de luz
irradiante (nm)	660	630	630	574
Figura para resultados	4a	4b	4c	4d

Con el fotosensibilizador o con únicamente IAA, a las mismas concentraciones se observó una toxicidad muy pequeña. La toxicidad puede ser debida a la formación de las citotoxinas putativas, 3-metileno-2-oxiindoles, los cuales se demostró se formaban a través de cromatografía líquida de alta resolución.

Ejemplo 11 Mediciones de los efectos citotóxicos del tratamiento con compuestos de fórmula (I) y peróxidasa de rábano (HRP) utilizando células transitoriamente transfectadas con el gen que codifica para HRP (Terapia enzima-profármaco dirigida por gen, GDEPT)

Células T24 de carcinoma de vejiga humana, células de carcinoma mamario MCF-7 (ambas obtenidas de la European Collection of Cell Cultures, Salisbury, UK), FaDu, células de carcinoma escamoso nasofaríngeo (American Type Cultura Collection, Manassas, VA) fueron mantenidas en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado con suero de ternera fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 g/ml e incubadas en un incubador humidificado a 37ºC y un 5% de CO_{2}/aire. Únicamente fueron utilizadas las células que dieron negativo por infección con micoplasma.

El plásmido pRK34-HRP conteniendo HRP cDNA fue proporcionado por el Dr. D. F. Cutler, University College, London (Connolly CN, Futre CE, Gibson A, et al., Transport into and out of the Golgi complex studied by transfected cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. J. Cell Biol. 1994; 127: 641-652).

Se obtuvieron transfectadores transitorios mediante la exposición de células a complejos de péptidos dirigidos a integrina, lipofectina y DNA (Hart SL, Arancibia-Cárcamo CV, Wolfert MA, et al. Lipid-mediated enhancement by a nonviral integrin-tergeting vector. Human Gene Ther. 1998; 9: 575-585) y fueron ensayadas en busca de la expresión genética transcurridas 24 horas. La eficacia de la transfección fue estimada en aproximadamente el 20% para las células T24, entre el 16 y el 20% para las células MCF-7 y entre el 10 y el 14% para las células FaDu.

Las células no transfectadas y las transfectadas con crecimiento exponencial fueron contabilizadas y colocadas en placas a baja densidad sobre platos de Petri y expuestas a los compuestos de fórmula (I) durante un período de 24 horas en solución de sal equilibrada con Hanks exenta de rojo de fenol (HBSS), en una incubadora a 37ºC.

Alternativamente, para comprobar la actividad en condiciones hipóxicas, células T24 fueron pre-ubicadas en placas en una cabina anaeróbica y, después de un período de incubación de entre 5 y 6 horas para asegurar condiciones anóxicas, fueron expuestas a los compuestos de fórmula (I) por espacio de 24 horas en la cabina. La totalidad de plásticos y medios fueron pre-incubados en anoxia durante 48 horas antes de ser utilizados, para eliminar los restos de oxígeno.

Después de la exposición al fármaco, las células fueron lavadas con PBS y cultivadas por espacio de entre 8 y 20 días en medio DMEM completo, suplementado con células alimentadoras (células V79 expuestas a irradiación ^{60}Co 250Gy). Después de fijación y teñido con violeta de cristal 2,5% peso/volumen en alcohol metilazo, se marcaron las colonias > 50 células. Las fracciones supervivientes fueron evaluadas en relación con los controles tratados con HBSS.

La Figura 5 muestra la variación en la fracción superviviente de las células T24 control y transfectadas en condiciones tóxicas, frente a concentraciones variables de ácido 5-fluoro-indol-3-acético o de ácido 5-bromo-indol-3-acético.

A partir de las curvas de supervivencia se estimó una concentración de compuesto de prueba para reducir la supervivencia celular y se establecieron las tablas indicadas más adelante, en las que RPC representa células transfectadas, HRP^{-} células no transfectadas, y factor la relación de IC_{50} para células transfectadas a células no transfectadas.

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Ejemplo 12 Distribución del ácido 5-fluoroindol acético in vivo en ratones con tumor NT carcinoma

Ácido 5-fluoro-indol acético (5 mg/mL) en etanol/agua al 2% en volumen/volumen fue ajustado a pH 7,4 con NaOH e inyectado i.p., a una dosis de 50 mg/kg en ratones CBA hembra, afectados por tumor NT carcinoma (ver ejemplo 8, para detalles). Los ratones fueron sacrificados a las dos horas de habérseles suministrado el fármaco y se extrajeron la sangre y los tejidos inmediatamente, colocándolos sobre hielo. La sangre completa fue centrifugada y el plasma almacenado a -20ºC. Las muestras de tejido fueron pesadas y homogeneizadas en entre 4 a 9 volúmenes de agua enfriada con hielo. El tejido homogeneizado fue después almacenado a -20ºC.

Para análisis de HPLC, se mezcló plasma (50 \muL) con IAA de estándar interno (130 \muM, 25 \muL) y la proteína precipitó con acetonitrilo (50 \muL). Las muestras fueron centrifugados y el sobrenadante inyectado directamente para análisis de HPLC. Para niveles de tejido, se mezclaron muestras (250 \muL) con IAA de estándar interno (130 \muM, 25 \muL) y precipitó con acetonitrilo (250 \muL) para inyección directa para análisis HPLC. El análisis con HPLC fue llevado a cabo con una columna Hypersil 50DS 125x4,6 mm, fluyendo con A: acetonitrilo 75% y B: acetato amónico 20 mM (pH 5,1) con un gradiente entre el 15 y el 70% A, en 10 minutos, a razón de 2 mL/minuto. La detección se realizó a 290 nm, utilizando un detector Waters 486 de longitud de onda variable.

La cantidad de ácido 5-fluoro-indol acético en las muestras se ilustra en la Figura 6. Estos resultados muestran que se alcanzan en el tumor concentraciones suficientes para lograr un efecto citotóxico. Los elevados niveles en el riñón están en consonancia con la excreción de cantidades sustanciales del compuesto no modificado, las cuales, sin que ello indique deseo de quedar vinculados por la teoría, son el resultado del bloqueo de la hidroxilación por P450s, a través del sustituyente 5-flúor.

Leyendas de las figuras

Figura 1:	-\bullet- con HRP; -\circ- sin HRP
Figura 3:	-\circ- controls MCF7; -\bullet- MCF7 + 5-F-IAA/HRP
	-\boxempty- controles HT29; -\blacksquare- HT29+ 5-F-IAA/HRP
Figura 4a:	-\circ- únicamente azul de metileno
	-\bullet- Azul de metileno+5-F-IAA
	-\blacktriangle-azul de metileno + 5-Br-IAA
Figura 4b:	-\circ- únicamente tionina
	-\bullet- Tionina + 5-F-IAA
	-\blacktriangle-Azul de tionina + 5-Br-IAA
Figura 4c:	-\circ- únicamente azul de toluidina
	-\bullet- Azul de toluidina + 5-F-IAA
	-\blacktriangle-Azul de toluidina + 5-Br-IAA
Figura 4d:	-\circ- únicamente rosa de bengala
	-\bullet- Rosa de bengala + 5-F-IAA
	-\blacktriangle-Rosa de bengala + 5-Br-IAA

Figura 5:	-\circ- control + 5-F-IAA
	-\bullet- Transfectantes + 5-F-IAA
	-\boxempty- Control + 5-Br-IAA
	-\blacksquare-Transfectantes + 5-Br-IAA
Figura 6:	-\circ-plasma
	-\bullet-Tumor
	-\boxempty-Hígado
	-\blacksquare-Corazón
	-\Delta-Riñón
	-\blacktriangle-Músculo

Claims (17)

1. Compuesto de fórmula (I), o derivado fisiológicamente funcional del mismo, para ser utilizado en un procedimiento de terapia

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en donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, y R'_{3} se seleccionan independientemente de entre H o grupos alquilo inferior que tienen de 1 a 7 átomos de carbono;

R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} se seleccionan independientemente de entre H, grupos atrayentes de electrones, grupos alquilo inferior que tienen de 1 a 7 átomos de carbono; grupos alcoxi inferior que tienen de 1 a 7 átomos de carbono; grupos arilo o grupos ariloxi; en donde al menos uno de R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} se selecciona de entre un grupo atrayente de electrones.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en donde el grupo atrayente de electrones se selecciona de entre el grupo que consiste en F, Cl, Br, I, OCF_{3}, carboxilo, acetal y arilo atrayente de electrones.

3. Compuesto según la reivindicación 2, en donde el grupo atrayente de electrones se selecciona de entre el grupo que consiste en F, Cl, Br y I.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el equilibrio de los sustituyentes R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} es atrayente de electrones.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente de entre H o grupos alquilo inferior saturados, opcionalmente sustituidos, que tienen de1 a 7 átomos de carbono.

6. Compuesto según la reivindicación 5, en donde R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente de entre H, metilo o etilo.

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde R'_{3} es H.

8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde R_{3} se selecciona de entre H o grupos alquilo inferiores saturados opcionalmente sustituidos que tienen 1 a 7 átomos de carbono.

9. Compuesto según la reivindicación 8, en donde R_{3} se selecciona de entre H, metilo o etilo.

10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde uno o dos de R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} se selecciona independientemente de entre grupos atrayentes de electrones.

11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde si uno o más de R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} no son hidrógeno o un grupo atrayente de electrones, los mismos son seleccionados de entre grupos alquilo inferior saturados opcionalmente sustituidos, que tienen de 1 a 7 átomos de carbono.

12. Compuesto según la reivindicación 11, en donde aquellos de los grupos R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} que no son H o un grupo atrayente de electrones, se seleccionan de entre H, metilo o etilo.

13. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde uno de R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{7} es un grupo atrayente de electrones y los demás son H.

14. Utilización de un compuesto de fórmula (I), tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica.

15. Composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable.

16. Sistema de dos componentes para el tratamiento de una enfermedad neoplásica que comprende:

(i)

un vector que codifica y que es capaz de expresar un enzima peroxidasa en una célula tumoral; y

(ii)

Un compuesto según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

17. Sistema de dos componentes para el tratamiento de una enfermedad neoplásica que comprende:

(i)

un anticuerpo dirigido a tumor o un polímero unido a un enzima peroxidasa; y

(ii)

un compuesto según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.