KR100773475B1

KR100773475B1 - 인돌-3-아세트산을 포함하는 광감작제, 및 이를 포함하는광역학적 치료용 키트

Info

Publication number: KR100773475B1
Application number: KR1020060063841A
Authority: KR
Inventors: 김동석; 김소영; 박경찬
Original assignee: 주식회사 웰스킨
Priority date: 2006-07-07
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2007-11-05
Also published as: JP2009542801A; US20080014248A1; WO2008004847A1; CN101484160A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 인돌-3-아세트산 (Indole-3-acetic acid; IAA)의 광감작제 (Photosensitizer)로서의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 광선에 의하여 활성화되는 성질을 갖는 IAA를 함유하는 광역학적 치료(photodynamic therapy, PDT)용 광감작제, 및 이를 포함하는 광역학 치료용 키트 및 광역학 치료용 조성물에 관한 것이다. IAA를 활성화 시키는 광원으로는 자외선 또는 가시광선을 사용할 수 있으며, 특히 청색광 또는 녹색광을 사용하는 것이 바람직하다.

(화학식 1)

인돌-3-아세트산, 광감작제, 광역학적 치료방법

Description

인돌-3-아세트산을 포함하는 광감작제, 및 이를 포함하는 광역학적 치료용 키트{PHOTOSENSITIZE CONTAINING INDOLE-3-ACETIC ACID, AND KIT FOR PHOTODYNAMIC THERAPY CONTAINING THE SAME}

도 1은 실시예 1의 인돌-3-아세트산과 Horseradish Peroxidase(HRP)에 의한 세포독성을 측정한 그래프이다.

도 2a 내지 2c는 실시예 2에서 다양한 종류의 세포주에 대한 인돌-3-아세트산과 HRP의 병행 사용에 의한 세포독성을 나타낸 그래프이다.

도 3는 실시예 3에서 다양한 종류의 세포주에 대한 인돌-3-아세트산과 광선의 병행 사용에 의한 세포독성을 나타낸 그래프이다.

도 4은 실시예 4에서 인돌-3-아세트산의 다양한 파장에 의한 광활성화 정도를 나타낸 그래프이다.

도 5는 실시예 5에서 Intense Pulsed Light (IPL) 단독 조사에 의하여 암세포들이 영향을 받지 않음을 보여주는 사진이다.

도 6는 실시예 6에서 IAA와 IPL의 병행 사용에 의한 암의 치료 효과를 나타내는 사진이다.

도 7는 실시예 7에서 IAA와 IPL의 병행 사용에 의한 암의 예방 효과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 인돌-3-아세트산 (Indole-3-acetic acid; IAA)의 광감작제 (Photosensitizer)로서의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 광선에 의하여 활성화되는 성질을 갖는 IAA를 함유하는 광역학적 치료(photodynamic therapy, PDT)용 광감작제, 및 이를 포함하는 광역학 치료용 키트 및 광역학 치료용 조성물에 관한 것이다. IAA를 활성화 시키는 광원으로는 자외선 또는 가시광선을 사용할 수 있으며, 특히 청색광 또는 녹색광을 사용하는 것이 바람직하다.

광역학 치료(photodynamic therapy, PDT)는 최근 암치료에 있어 가장 촉망 받는 치료 방법 중의 하나이다. 광역학 치료의 원리는 체내의 풍부한 산소와, 외부에서 공급되는 빛(광자)과, 빛에 민감한 반응을 보이는 물질(광감작제; photosensitizer)과의 종합적인 화학반응에 의하여 파생되는 단일상태 산소(singlet oxygen) 또는 자유 라디칼(free radical)이 각종 병변 부위나 암세포를 파괴하여 암을 치료하는 방법이다. 이러한 광역학 치료의 장점은 정상 세포는 보존하면서 병든 세포만 선택적으로 제거할 수 있다는 것과, 이로 인하여 전신 마취의 위험성을 배제할 수 있고, 간단하게 국소 마취만으로도 수술할 수 있기 때문에 시술이 용이하다는 것이다. 따라서 광역학 치료는 암세포 특이적 제거효과가 우수할 뿐 아니라, 시술 후 회복이 빠르고 입원 기간을 단축시켜 환자의 삶의 질을 증 진시키고 사회활동 복귀를 원활하도록 하여 사회 경제적으로도 좋은 효과를 얻을 수 있다는 이점을 갖는다.

광역학 치료는 1980년대부터 본격적으로 연구되어 왔으며, 1990년대 들어와 캐나다, 독일, 일본 등에서 임상시술이 승인된 이래, 미국의 FDA는 1996년 1월에 식도암 치료를 허가하였고, 1997년 9월에는 초기 폐암치료에 대하여 승인한 바 있다. 1996년 초 통계에 의하면 약 32개국에서 3000여건 정도의 광역학 치료가 시행되었다.

그러나 현재 시행되고 있는 광역학 치료는 부피가 큰 종양에서는 빛이 종양전체를 투과할 수 없어서 사용이 제한되고, 기존에 사용되는 포르피린(porphyrin)으로 대표되는 광감작제들이 고가이며, 인체내 대사가 느려 광독성의 부작용이 발생하고, 종양 내의 광감작제 농도가 낮아 광역학 치료의 효과를 충분히 볼 수 없다는 문제점을 갖는다.

광역학 치료에 사용되고 있는 광감작제인 Photofrin^TM은 1996년 미국 FDA의 승인을 얻을 정도로 양호한 치료효과와 안정성을 가진 치료제이다. 그러나 투약 후 5-6주간 체내에 누적되어 부작용을 일으킬 수 있으며, 또한 순수한 Photofrin^TM은 제조하기가 어려우며, 광역학 치료시 최적 조건으로 알려져 있는 650-850nm 보다 낮은 630nm에서의 흡수로 인하여 종양세포에 수 mm 밖에 침투시킬 수 밖에 없어, 상대적으로 낮은 치료 효과를 나타낸다는 단점이 있다 (Chemistry & Industry, Sep 21, 1998, 739-743: Chemical & Engineering News, Nov 2, 1998, 22-27). 따라 서, 보다 나은 반응성을 가진 광감작제의 개발이 절실하다

차세대 광감작제로 알려진 화합물에는 포피린류(porphyrins), 클로린류(chlorines), 박테리오클로린류(bacteriochlrins), 포피센류(porphycenes) 등이 가장 많이 연구되고 있다 (J Org. Chem., 63, 1998, 1646-1656). 이 중에서, 식물에 많이 분포되어 있는 엽록소류(chlorophylls)에서 금속 이온을 제거한 피오파이틴류(pheophytins)는 헤마토포피린(hematoporphyrin) 유도체인 Photofrin^TM보다 장파장에서 흡수가 일어 날 뿐 아니라, 고순도로 분리 제조가 가능하여 차세대 광감작제로 많은 연구가 집중되고 있지만 아직 주목할만한 결과를 얻지 못하는 실정이다.

따라서 광역학 치료를 보다 효과적으로 수행하기 위한 광감작제의 개발이 요구된다.

이러한 요구에 부응하기 위하여, 본 발명의 목적은 상대적으로 높은 암조직 선택성과 최소의 부작용을 나타내는 새로운 광역학 치료용 광감작제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 광감작제를 포함하는 광역학 치료용 키트 및 광역학 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

IAA는 옥신(auxin)의 한 종류로, 식물의 옥신과 동일한 의미로 사용되기도 한다. 옥신은 식물생장을 조절하는 호르몬으로 알려져 있는데, 줄기 세포의 신장을 촉진하고 뿌리에서는 세포신장을 억제한다. 옥신은 식물의 줄기가 빛을 향해 자라도록 굴광성에 영향을 주며, 중력의 작용 방향에 따라 자라는 굴치성에는 반대작용을 한다. Plant auxin으로도 알려진 IAA는 오래전부터 항암 효과 등의 질병 치료 효과가 있는 것으로 알려져 왔지만, 그 작용기전은 잘 알려지지 않았다.

본 발명자들은 IAA의 항암 효과를 연구하던 중, IAA 단독으로는 세포독성효과가 없으며, IAA와 horseradish peroxidase (이하, 'HRP'라 칭함)와 복합적으로 작용할 때에만 암세포를 괴사시키는 작용을 나타낼 수 있음을 확인하였다 (Kim DS et al. Oxidation of indole-3-acetic acid by horseradish peroxidase induces apoptosis in G361 human melanoma cells. Cell Signal 2004; 16: 81-8). 이러한 기전은 최근 다른 연구자들에 의해서도 보고되었다 (Greco et al. Mechanisms of cytotoxicity induced by horseradish peroxide/indole-3-acetic acid gene therapy. J Cell Biochem 2002; 87: 221-32; Huang et al. Apoptosis of pancreatic cancer BXCP-3 cells induced by indole-3-acetic acid in combination with horseradish peroxide. World J Ganstroenterol 2005; 11: 4519-23).

상기의 연구들에 의하여, IAA의 항암작용은 HRP와의 반응에 의하여 발생되는 활성산소종이 중요한 작용을 하기 때문이라는 것을 알 수 있다. 그러나 HRP를 사용할 경우 이를 고농도로 암세포에 특이적으로 타겟팅을 하여야 하며, 이러한 타겟팅은 면역학적인 문제점과 간에서의 대사 등의 기술적으로 많은 어려움을 가질 뿐만 아니라, 이를 극복한다 할지라도 암세포 특이적인 타겟팅이 일어나지 않을 경우 정상세포의 손상을 가져올 수 있기 때문에 실제 임상에 사용하기 어렵다. 이러한 단점으로 인하여, IAA를 실제 암치료에 사용하기에 한계가 있다.

본 발명자들은 상기와 같이 실제로 임상에 사용하기 어려운 HRP를 대신하여 IAA를 활성화시킬 수 있는 다른 물질과 자극들을 탐색하던 중, 생체에 무해하고 조직 깊숙이 침투 가능한 빛을 IAA와 함께 사용하면 IAA 활성화에 있어서 동등한 효과를 얻을 수 있다는 사실을 확인하였으며, 특히 가시광선 중 청색광 또는 녹색광이 우수한 효과가 있음을 확인하였다. 물론 자외선도 IAA를 광활성화시킬 수 있는 것을 확인하였다.

한편, IAA는 산화될 경우 항암작용이 있기 때문에 페노티아지늄 염료 (phenothiazinium dye) 또는 톨루이딘 블루 염료 (toluidine blue dye) 등의 광감작제와 같이 사용하면 치료효과가 증가한다는 연구보고는 있었지만 (Folkes and Wardman. Enhancing the efficacy of photodynamic cancer therapy by radicals from plant auxin. Cancer Res. 2003;63:776-9), IAA 자체를 광감작제로 사용하지 는 않았으며, IAA의 광감작 효과에 대해서도 전혀 알려진 바가 없다.

그러나 본 발명자들은 IAA 자체의 광감작제로서의 작용을 확인하였으며, IAA의 광활성화에 자외선과 가시광선이 모두 효과적이며, 특히 청색광과 녹색광이 효과적이라는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 가시광선과는 달리 자외선은 투과의 깊이가 낮아 깊이 위치하는 암세포의 치료를 위해서는 적절하지 않으며 돌연변이와 노화를 유발할 수 있는 우려가 높기 때문에, 장파장 자외선 또는 가시광선이 보다 유리할 것으로 생각되며, 특히 청색광 또는 녹색광의 효용성이 더욱 기대된다.

본 발명에 있어서, IAA의 광감작제로서의 작용이 확인되었을 뿐 아니라, 실제로 IAA와 광선조사의 병용 사용에 의하여 종양 세포만 선택적으로 괴사가 유도되고, 정상 섬유모세포의 생존에는 아무 영향이 없음을 확인하였다 (도 3 참조).

따라서 본 발명은 가시광선, 특히 청색광 또는 녹색광을 광원으로 사용하는 광역학 치료에 있어서 IAA를 새로운 광감작제로 사용하여 암 또는 각종 질환의 치료에 적용하여 정상 세포에 대해서는 무해하고 병변 세포만 선택적으로 괴사시키는 우수한 치료 효과를 얻는 것을 주된 목적으로 한다.

상기 목적을 위하여, 본 발명은 하기의 화학식 1의 구조를 갖는 인돌-3-아세트산 (IAA)를 함유하는 광감작제를 제공한다:

(화학식 1)

또한, 본 발명은 유효성분으로서 광활성화 특성을 갖는 상기 화학식 1의 구조를 갖는 IAA를 치료적 유효량으로 함유하는 광역학 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 IAA 및 생체내 또는 생체외 광조사를 위한 광원을 포함하는 광역학 치료용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상기 화학식 1의 구조를 갖는 IAA는 별도의 광감작제의 사용을 요하지 않고 그 자체가 광감작제로서 작용하여, 광선 조사에 의하여 광활성화되고, 병변 세포에 특이적으로 세포 괴사를 유도하는 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. IAA를 광활성화시킬 수 있는 광선은 자외선 및 가시광선 범위의 광선이며, 모든 광선은 에너지를 가지므로 그 파장 범위에는 제한이 없다. 단, 생체내에서 IAA를 광활성화시키는 경우, 정상 조직에 대한 부작용을 고려하여, 280 nm 이상의 광선을 사용하는 것이 좋으며, 파장이 길어질수록 에너지가 낮아져서 조사시간이 길어지므로, 적정한 조사시간을 고려하여, 바람직하게는 280 nm 내지 1000 nm 범위의 광선을 사용하는 것이 좋고, 보다 바람직하게는 300 nm 내지 750 nm 범위의 광선을 사용하는 것이 좋다. 또한, IAA의 광활성화 효율을 고려할 때, 350 내지 400 nm 사이의 장파장 자외선, 400 내지 500 nm 사이의 청색광, 또는 500 내지 600 nm 사이의 녹색광을 사용하는 것이 좋다. 또한, IAA 활성화 정도, 세포 침투 정도 및 생체 안전성 등을 고려할 때, 청색광 또는 녹색광이 가장 바람직하다.

상기 광선의 조사를 위한 광원은 초음파 조사 방출기, 광방출 다이오드, 레이저 다이오드, 염료 레이저, 할로겐화 금속 램프, 플래쉬 램프, 기계적으로 필터링된 형광 광원, 기계적으로 필터링된 백열, 및 필라멘트 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 생체외 광조사를 위한 광원; 및 광역학 치료용 레이저 파이버 등의 생체내 광조사를 위한 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, IAA를 광역학 치료에 적용 시, 상기 IAA는 상기 생체외 광조사를 위한 광원에서 조사된 광선에 의하여 생체외에서 광활성화되어 체내에 투여되거나, 또는 체내 투여 후 병변 부위 또는 그 주변에 삽입된 생체내 광조사를 위한 광원에서 조사된 광선에 의하여 생체내에서 광활성화되는 것일 수 있다. 광선에 의한 IAA의 광활성화 시, IAA는 상기 광원으로부터 조사된 하나 이상의 파장의 광선에 치료학적으로 유효한 펄스 지속 시간 동안 조사된 노출되어 광활성화될 수 있다.

생체외에서 IAA를 광활성화시키는 경우, 조사되는 빛의 강도(에너지)에는 제한이 없으며, 빛의 강도가 낮아지면 지속 시간을 길게 하거나 및/또는 조사 횟수를 증가시키고, 빛의 강도가 높아지면 지속 시간을 짧게 하거나 및/또는 조사 횟수를 감소시켜 IAA를 광활성화시킨다.

생체내에서 IAA를 광활성화시키는 경우, 빛의 강도가 너무 낮으면 적절하게 표적 조직에 침투하여 효과적인 IAA 광활성화 효과를 나타낼 수 없고, 빛의 강도가 너무 높으면 정상 조직의 괴사 등의 부작용이 발생하므로, 이를 고려하여, 조사되는 빛의 강도는 1 내지 100 J/cm² 범위인 것이 좋다. 또한, 펄스 지속 시간이 너무 짧거나 조사 횟수가 너무 적으면 광활성화 효과가 미미하고, 펄스 지속 시간이 너무 길거나 조사 횟수가 너무 많으면 정상조직의 괴사 등 부작용이 나타날 수 있다. 또한, 상기한 바와 같이, 조사되는 빛의 강도에 따라서, 빛의 강도가 낮을 때는 지속 시간을 길게 하거나 조사 횟수를 늘리고, 빛의 강도가 높을 때는 지속 시간을 짧게 하거나 조사 횟수를 줄여야 안전하고 유용한 효과를 볼 수 있다. 따라서, 펄스 지속 시간과 조사 횟수는 빛의 강도 범위와 정상 조직에 대한 부작용 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있는 것으로, 일률적으로 정의하기 어렵지만, 바람직하게는 펄스 지속 시간은 0.1 내지 500 ms, 광선 조사 횟수는 1회 내지 100회로 하는 것이 효과적일 수 있다. 예컨대, 본 발명의 한 구체예에 있어서, 마우스에서 시행된 악성종양의 치료실험에서 빛의 강도는 20 J/cm²로 하고, 펄스의 길이는 15 ms로 하고, 광선의 조사는 회수는 1회로 할 수 있다. 바람직하게는 IPL (Intense Pulse Light)과 같은 강한 빛의 조사 장치에 의하여 광활성시킬 수 있다.

상기 IAA 함유 광역학 치료용 조성물은 광감작 활성을 갖는 IAA를 0.001 중량% 이상 99 중량% 이하, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 30 중량%의 함량으로 함유하는 것이 좋다. 충분한 IAA의 광감작 효과 및 치료 효과를 얻기 위해서는 IAA 함량이 0.001 중량% 이상인 것이 좋다. 상기 조성물은 액체, 반고체, 고체 또는 에어로졸 형태로 사용될 수 있으며, 예컨대, 수성 또는 비수성 현탁액, 용액, 크림, 연고, 젤, 시럽, 좌약, 정제, 캡슐 또는 미세방울 스프레이 등의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 상기와 같은 제형화에 필요한 부형제(delivery vehicle)를 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 조성물은 적용 형태 또는 투여 경로 등의 저장 및 투여 조건의 요구에 따라서, 통상의 보존제, 안정화제, 완충제, pH 조절제, 감미제, 향료, 염료 등으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 목적하는 치료 효과를 갖는 다른 종류의 약물을 한 가지 이상 추가로 함유할 수 있다.

상기 조성물 내에 함유된 광감작 활성을 갖는 IAA는 생체내 투여 전 미리 광조사되어 광활성화된 것이거나, 또는 생체내 투여 후 생체내 광조사를 위한 광원에 의한 광조사에 의하여 생체내에서 광활성화되는 것일 수 있다. IAA가 생체내에서 광활성화되는 경우, 생체내 광조사를 위한 광원과 함께 투여되거나, 상기 IAA 함유 조성물 투여와 별도로 생체내 광조사를 위한 광원을 병변 부위에 삽입하여, IAA의 광활성화를 수행할 수 있다. 상기 IAA의 광노출에 의한 광활성 이전에 IAA를 특정 부위로의 체내 침투를 향상시키기 위한 별도의 처리를 수행할 수 있다.

IAA 또는 IAA 함유 광역학 치료용 조성물의 체내 투여는 정맥 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 두개내 주사, 종양내 주사, 상피내 주사, 피부관통 주입, 식도 주입, 복부 주입, 동맥 주사, 관절내 주사, 구강내 투여 등의 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 광역학 치료용 조성물 또는 광역학 치료용 키트에 의하여 치료 가능한 질병에는 피부 및 이와 관련된 기관에 영향을 주는 질병 (예컨대, 광선각화증, 보웬병, 사마귀, 여드름, 기저세포암, 편평상피세포암, 악성흑색종, 건선, 편평태선 등), 구상 및 소화계 및 이와 관련된 기관에 영향을 주는 질병 (예컨대, 위암 및 십이지장암, 위염 등), 비뇨기 및 생식기 및 이와 관련된 기관에 영향을 주는 질병 (예컨대, 전립선암, 전립선염, 자궁암, 자궁내막염, 자궁경부암, 골반염질환 (예컨대, Pelvic inflammatory disease, 등), 호흡기 및 이와 관련된 기관에 영향을 주는 질병 (예컨대, 폐암 등), 순환계 및 이와 관련된 기관에 영향을 주는 질병 (예컨대, 백혈병 등), 두뇌 및 목에 영향을 주는 질병 (예컨대, 뇌암, 갑상선암, 후두암, 후두염, 비암, 비염, 설암 등), 내분비선 및 임파구세망계 및 이와 관련된 기관에 영향을 주는 질병 (예컨대, 림프종 등), 결합조직에 영향을 주는 질병 (예컨대, 홍반성루프스, 경피증, 류마토이드성 관절염 등), 및 미생물, 바이러스, 균주 및 기생충 감염과 관련된 질병 (예컨대, 농가진, 옹, 절 등) 등이 있으며, 바람직하게는 암이다.

실시예

이하, 본 발명을 하기의 실시예를 들어 보다 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명이 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1) 인돌-3-아세트산과 HRP 에 의한 세포독성 효과

본 실험을 통하여 IAA의 세포독성효과는 HRP와 함께 사용할 때에 나타나며 IAA 단독으로는 전혀 독성을 나타내지 못한다는 사실을 확인하였다.

(세포 배양)

악성흑색종 세포주인 G361 (ATCC, Rockville, MD)세포를 5%의 CO₂, 37 ℃ 하에서 10%의 태아소혈청(FBS), 50 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 50 ㎍/mL의 페니실린을 첨가한 RPMI 1640 배지(WelGene, 대구, 한국)에서 배양하였다.

(G361 세포에서의 독성 실험)

상기 RPMI 배양액에 키운 세포를 24개의 well을 가진 배양용기에 분주하고 (4 X 10⁴개/well), 태아소혈청이 포함되어 있지 않은 배지에서 24시간동안 배양하였다. 세포독성 효과는 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 분석법을 이용하여 측정하였다(Kim, D. S., Jeon, S. E., Park, K. C. Cell Signal, 16, 81-8, 2004).

HRP (1.2 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO)로 처리한 군(도 1에서 '○'로 표시됨)과 HRP를 처리하지 않은 군(도 1에서 '■'로 표시됨)으로 나누어, 상기 배지에 용해되어 있는 IAA의 최종 농도가 1 에서 500 mM되게 처리하여 20 시간 배양한 다음, MTT 용액 0.5 ㎎/㎖를 넣고 배지에서 4 시간 더욱 배양하였다. 이후 1 ml 디메틸설폭사이드 용액을 웰에 넣어 용해시키고, ELISA 판독기(TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 계산식 1로 계산하여 세포 생존율을 환산하였고, 그 결과는 도 1로 나타내었다. 도 1에서 IAA를 함유하지 않는 대조군의 생존율을 100 %로 하였다.

(계산식)

세포 생존율(%)=(실험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100

도 1에서 확실할 수 있는 바와 같이, IAA를 단독으로 처리한 군(■)에서는 아무런 세포독성도 보이지 않은 반면, IAA와 HRP를 함께 처리한 군(○)에서는 100 mM이상의 농도에서 확연한 세포독성 효과가 관찰되었다. 본 실험 결과, IAA는 단독으로는 세포독성 효과를 나타내지 못하며, HRP 등의 활성화제의 사용이 필수적임을 알 수 있다.

실시예 2) 여러 종류 세포주에 대한 IAA/ HRP 의 세포독성 효과

다양한 종류의 종양세포주 및 섬유모세포 등을 배양한 후, IAA와 HRP를 처리하였다. 실험결과 IAA/HRP 병용 사용은 암세포주에는 세포독성 효과가 좋은 반면, 정상세포인 섬유모세포에는 독성효과가 없음을 확인할 수 있었다.

(세포 배양)

위암세포주 (SNU1, SNU16, SNU601, SNU719, 한국세포주은행, 서울, 한국), 간암세포주 (PLC/PRF5, 한국세포주은행, 서울, 한국), 및 폐암세포주 (NCI-H157, NCI-H1264, 한국세포주은행, 서울, 한국)를 5%의 CO₂, 37 ℃ 하에서 10%의 태아소혈청(FBS), 50 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 50 ㎍/mL의 페니실린을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 배양하였고, 간암세포주 (SK-HEP-1, 한국세포주은행, 서울, 한국)는 같은 조건의 DMEM 배지(WelGene, 대구, 한국)에서 배양하였다. 섬유모세포 (fibroblasts)는 어린아이의 포경수술을 통하여 얻어진 포피에서 분리하여 사용하 였다. 피부 생검은 Rheinward and Green의 방법을 따라 수행하였으며 (Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 1975;6:331-43.), 상기 분리한 섬유모세포는 10%의 태아소혈청(FBS), 50 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 50 ㎍/mL의 페니실린을 첨가한 DMEM 배지에서 배양하였다.

(다양한 세포에서의 독성 실험)

배양액에 키운 세포를 24개의 well을 가진 배양용기에 분주하고 (4 X 10⁴개/well), 태아소혈청이 포함되어 있지 않은 배지에서 24시간동안 배양하였다. 세포독성 효과는 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석법을 이용하여 측정하였다. HRP (1.2 mg/ml)로 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어, 상기 배지에 용해되어 있는 IAA의 최종 농도가 50 에서 1000 mM되게 처리하여 20 시간 배양한 다음, MTT 용액 0.5 ㎎/㎖를 넣고 배지에서 4 시간 더욱 배양하였다. 이후 1 ml 디메틸설폭사이드 용액을 웰에 넣어 용해시키고, ELISA 판독기를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 계산식 1로 계산하여 세포 생존율을 환산하였고, 그 결과는 도 2a 내지 2c에 나타내었다. 도 2a 내지 2c에서 IAA를 함유하지 않는 대조군의 생존율을 100 %로 하였다.

(계산식)

세포 생존율(%)=(실험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100

도 2a 내지 2c에서 알 수 있는 바와 같이, IAA 만 단독 처리한 경우에는 암세 포주와 정상세포 모두에서 세포 독성 효과가 나타나지 않았으며, IAA와 HRP를 함께 처리한 경우에는 암세포주에서만 특이적으로 세포독성 효과가 나타났으며, 정상 섬유모세포에는 세포독성 효과가 나타나지 않았다.

실시예 3) 여러 종류의 세포주에 대한 IAA/ UVB 의 세포독성

다양한 종류의 종양세포주 및 섬유모세포 등을 배양한 후, 자외선을 조사한 IAA를 처리하였다. 실험결과 IAA/UVB 병용사용은 암세포주에는 세포독성 효과가 좋은 반면, 정상세포인 섬유모세포에는 독성효과가 없음을 확인하였다.

(세포 배양)

악성흑색종 세포주인 G361(ATCC, Rockville, MD)를 5%의 CO₂, 37 ℃ 하에서 10%의 태아소혈청(FBS), 50 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 50 ㎍/mL의 페니실린을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 배양하였고, 쥐의 악성흑색종 세포주인 B16(한국세포주은행, 서울, 한국)과 간암세포주 (SK-HEP-1, 한국세포주은행, 서울, 한국)는 같은 조건의 DMEM 배지에서 배양하였다. 섬유모세포 (fibroblasts)는 어린아이의 포경수술을 통하여 얻어진 포피에서 분리하였다. 피부 생검은 Rheinward and Green의 방법을 따라 수행하였으며, 분리한 섬유모세포는 10%의 태아소혈청(FBS), 50 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 50 ㎍/mL의 페니실린을 첨가한 DMEM 배지에서 배양하였다.

(다양한 세포에서의 독성 실험)

배양액에 키운 세포를 24개의 well을 가진 배양용기에 분주하고 (4 X 10⁴개/well), 태아소혈청이 포함되어 있지 않은 배지에서 24시간동안 배양하였다. 세포 독성 효과는 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석법을 이용하여 측정하였다. UVB (100 mJ/cm²)를 조사한 IAA를 처리한 군과 UVB 조사 없이 IAA만 처리한 군으로 나누어, 상기 배지에 용해되어 있는 IAA의 최종 농도가 0.5 에서 1 mM 되도록 처리하여 20 시간 배양한 다음, MTT 용액 0.5 ㎎/㎖를 넣고 배지에서 4 시간 더욱 배양하였다. 이후 1 ml 디메틸설폭사이드 용액을 웰에 넣어 용해시키고, ELISA 판독기를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 계산식 1로 계산하여 세포 생존율을 환산하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 IAA를 함유하지 않는 대조군의 생존율을 100 %로 하였다.

(계산식)

세포 생존율(%)=(실험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, IAA 만 단독 처리한 경우에는 암세포주와 정상세포 모두에서 세포 독성 효과가 나타나지 않았으며, UVB를 조사한 IAA를 함께 처리한 경우에는 암세포주에서만 특이적으로 세포독성 효과가 나타났으며, 정상 섬유모세포에는 세포독성 효과가 나타나지 않았다.

실시예 4) IAA의 다양한 파장에 의한 광감작 효과

IAA의 광감작에 미치는 다양한 파장의 영향을 조사하기 위하여 HL-2000-HP 광원 (Ocean Optics, Dunedin, FL, 미국) 조사기를 사용하였다. 자유 라디칼의 생성은 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)가 자유 라디칼에 의하여 형광을 나타내는 dichlorofluorescein (DCF)를 생성한다는 원리를 이용하여 측정하였다. DCFH-DA를 활성화시키기 위하여, DCFH-DA를 100% 에탄올에 1 mM의 농도로 용해시킨 후, 상기 용액을 350 ul 취하고, 0.01 N NaOH 1.75 ml와 혼합하고, 5, 10 및 20 분 동안 반응시켰다. 여기에 25 mM의 나트륨-인산 완충용액 (pH 7.2) 17.9 ml를 첨가하여 활성화된 DCFH-DA 용액을 준비한다. 활성화된 DCFH-DA용액에 IAA 1 mM을 처리하고 HL-2000-HP 광원과 함께 다양한 파장에 해당하는 필터(380, 400, 480, 520, 590, 640 nm)(Thorlabs, Inc., Long Beach, CA, 미국)를 사용하여 각 파장에서 IAA가 광감작되는지 여부를 조사하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 흡광도는 ELISA reader를 사용하여 490 nm에서 측정하였다.

도 4에서 보여지는 것과 같이, 5 내지 20분 조사한 결과, 480 nm (청색광)와 520 nm (녹색광)의 파장이 다른 파장에 비하여 우수한 IAA 광감작 효과를 보였다.

실시예 5) IPL 단독조사에 의한 암의 치료효과

다이오드 광원으로는 충분한 임상적 효과를 기대하기 어렵다는 점을 고려하여, 본 동물 실험에서는 비교적 강한 에너지의 빛을 조사하는 IPL(Intense Pulsed Light)을 동물실험시 광원으로 사용하였다.

우선 IPL의 단독효과를 알아보기 위하여, 종양세포 주사 1일 후 IPL을 조사하였다. IPL 조사 4일 후 조직학적 소견을 확인하여 도 5에 나타내었으며, 진피내 종양결절의 조직 소견내 아무런 괴사의 소견을 볼 수 없어서 IPL 단독으로는 아무런 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.

(암세포주의 이식)

인체 폐암 세포주인 NCI-H1264 세포주를 0.1M PBS 용액 (pH 7.2)으로 세척한 후, 1 x 10⁶, 1 x 10⁵, 그리고 5 x 10⁴로 세포수를 다르게 하여 30G syringe를 이용하여 각각 누드 생쥐(Charles River Lab. Wilmington, MA, 수컷, 6주령, 체중 22-25 g)에 피내 주사하여 4일 후 조직소견을 관찰한 결과 종양이 형성되는 것을 확인하였다. 암세포주 이식이 완료된 후, 실험 동물은 무균 동물 사육실에서 일정기간 종양결절이 형성될 때까지 사육하였다.

(IPL의 조사)

가시광선의 조사기기로서 Eclipse 사의 intense pulsed light (IPL) 기기를 사용하였다. 실험에 사용한 IPL 기기는 515 nm에서 1200 nm 사이의 광선을 조사할 수 있는 기기로 20 J/cm²의 에너지량으로 광선을 조사하였다. 종양 형성 부위에 Transmission gel(PROGEL DA-YO Medical, 서울, 한국)을 바른 후, IPL을 각 부위마다 2 회씩 조사하였다. 광역학 치료가 끝난 투여군은 동물 사육실에서 다음 실험때까지 사육하였다.

(Hematoxylin & Eosin 염색)

실험이 종료된 후, 누드 생쥐에서 종양 주변 조직을 떼어내어 10% 중성 포르말린에서 24시간 고정시킨 후 파라핀 블록을 제작하였다. 파라핀 블록은 5㎛ 두께로 박절하여 Hematoxylin & Eosin 염색을 시행하여 형태학적인 소견을 관찰하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, IPL 단독 처리한 경우 진피내 종양결절의 조직에서의 아무런 괴사의 소견을 볼 수 없고, 아무 처리하지 않은 대조군과 유사한 모습을 나타냄을 관찰할 수 있었으며, 이로부터, IPL 단독으로는 아무런 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.

실시예 6) IAA와 IPL 의 병용사용에 의한 암 치료효과

인체 폐암 세포주인 NCI-H1264 세포주 1 x 10⁶개를 누드 생쥐(Charles River Lab. Wilmington, MA, 수컷, 6주령, 체중 22-25 g)에 피내 주사한 후, 한 그룹은 4일째, 다른 한 그룹은 7일째 IAA를 50 mg/kg의 양으로 정맥내 주사하고, 30분 후에 상기 실시예 5와 같이 IPL (20 J/cm²)을 조사하였다. 12일 후, 상기 실시예 5의 방법과 TUNEL 시험법에 따라 조직검사를 시행한 결과, 종양내 괴사의 현상을 확인할 수 있었다. 따라서 IAA는 IPL과 같이 사용하였을 때 세포괴사를 유도하는 능력이 있으며, 암 등의 질환의 치료에 효과가 있음을 확인하였다.

(IAA의 투여)

실험에 사용할 IAA (10mg/ml in 50mM NaHCO₃/ 2% v/v 에탄올/물, pH 7)를 준비한다. 종양결절이 형성된 실험동물은 대조군과 투여군으로 분리하고, 투여군은 두 개의 군으로 나누어, 한 군은 종양 주입 후 4일째에, 다른 한 군은 종양 주입 후 7일째에 IAA (pH 7, 50 mg/kg)를 정맥내 주사를 통하여 주입하였다. IAA 주입 후 30분 후에 상기 실시예 5와 같이 IPL (20 J/cm²)을 조사하였다.

(TUNEL 시험법)

TUNEL (Chemicon, Temecula, CA) 검출키트를 사용하여 사용 설명서에 따라 시험을 진행하였다. 간략히 서술하면, 상기 IAA 주입 및 IPL 조사 후 12일 후에, 누드 생쥐에서 조직을 떼어내어 10% 포르말린에서 24시간 고정시킨 후, 0.1% Triton X-100을 사용하여 세포 투과성을 증대시켰다. DNA의 깨짐은 말단 데옥시뉴클레오타이드 전이효소(terminal deoxynucleotidyl transferase)와 항디곡시제닌 퍼옥시다아제 콘쥬게이트(anti-digoxigenin peroxidase conjugate)의 배양에 의하여 표지하였다. 색깔의 형성은 퍼옥시다아제의 기질인 디아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 사용하여 관찰하였다.

상기 관찰 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, Hematoxylin & Eosin 염색과 TUNEL 시험법 모두에서 IAA와 IPL의 병행 처리에 의하여 종양 괴사가 유도되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 7) IAA와 IPL 의 병용사용에 의한 암의 예방효과

IAA와 IPL의 병용 사용으로 암세포의 괴사를 일으킬 수 있다는 사실은 확인하였으나, 광역학 치료 등의 방법을 사용하여 해결해야 할 암의 치료는 종양 덩어리의 치료보다는, 암의 조직학적 전이 또는 타기관으로의 원격 전이 등에 대한 예방일 것이다. 이러한 효과를 확인하기 위하여, 암세포를 주사하고 종양결절이 발생하기 전 주기적으로 IAA와 IPL치료를 병행 시행한 후 결과를 비교해 보았다. 실시예 5 에서와 같이 NCI-H1264 세포주를 이식한후, 1일째, 3일째, 5일째 되는 날 각각 3회에 걸쳐 실시예 6와 같이 IAA를 투여하고, 30분 후에 실시예 5와 같이 IPL을 조사하였다.

10일 후 실시예 5의 방법에 따라 조직검사를 시행한 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 치료를 시행하지 않은 대조군에서는 종양의 결절이 생긴 반면, IAA와 IPL을 병용 사용한 군에서는 종양세포를 발견할 수 없었 다. 따라서 본 발명의 IAA와 IPL 병행 사용 방법을 적절히 사용하면 원격전이 등에 의한 조직학적 전이 세포를 치료하는데 유용할 것이라고 기대된다.

본 발명의 효과는 상대적으로 높은 암조직 선택성과 최소의 부작용을 나타내는 IAA 라는 새로운 광감작제를 사용하는 광역동 치료에 대한 것으로 본 발명의 감작제는 기존에 암치료에 임상연구 중인 IAA이나 연구자들에 의해 IAA의 작용에는 가시광선 특히 청색광이나 녹색광을 이용하여 IAA를 광활성화시키면 우수한 항암효과 및 전이 예방 등의 효과를 기대할 수 있는 반면, 정상 세포에 대한 세포 독성 등의 부작용은 매우 적음을 확인할 수 있었다.

Claims

하기 화학식 1의 구조를 갖는 인돌-3-아세트산을 함유하는 광감작제:

(화학식 1)
제1항에 있어서, 280 nm 내지 1000 nm 범위의 광선에 대하여 광감작 활성을 보이는 광감작제.
광감작 활성을 갖는 하기의 화학식 1의 구조의 인돌-3-아세트산을 0.001 중량% 내지 30 중량%의 양으로 함유하는, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 조성물:

(화학식 1)
제3항에 있어서, 상기 인돌-3-아세트산은 280 nm 내지 1000 nm 범위의 광선에 의하여 생체외 또는 생체내에서 광활성화되는 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 인돌-3-아세트산은 350 내지 400 nm의 장파장 자외선, 또는 400 내지 500 nm의 청색광, 또는 500 내지 600 nm의 녹색광에 의하여 생체외 또는 생체내에서 광활성화되는 것인 조성물.
제3항에 있어서, 액체, 반고체, 고체 및 에어로졸로 이루어진 군 중에서 선택된 형태로 제형화된 것인 조성물.
제 6항에 있어서, 수성 또는 비수성 현탁액, 용액, 크림, 연고, 젤, 시럽, 좌약, 정제, 캡슐 및 미세-방울 스프레이로 이루어진 군 중에서 선택된 형태로 제형화된 것인 조성물.
제3항에 있어서, 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 및 신경계의 암으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 증상의 치료 또는 예방에 적용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 정맥 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 두개 내 주사, 종양 내 주사, 상피내 주사, 피부관통 전달, 식도 투여, 복부 투여, 동맥 주사, 관절내 주사, 및 구강내 투여로 이루어진 군 중에서 선택된 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
i) 광감작 활성을 갖는 하기의 화학식 1의 구조의 인돌-3-아세트산, 또는 상기 인돌-3아세트산을 0.001 중량% 내지 30 중량%의 양으로 함유하는 조성물; 및

(화학식 1)

ii) 파장이 280 nm 내지 1000 nm 범위인 광선을 조사하기 위한 광원

을 포함하는, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 키트.
제10항에 있어서, 상기 광원은 350 내지 400 nm 사이의 장파장 자외선, 또는 400 내지 500 nm 사이의 청색광, 또는 500 내지 600 nm 사이의 녹색광을 조사하기 위한 것인, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 키트.
제10항에 있어서, 상기 광원은 초음파 조사 방출기, 광 방출 다이오드, 레이저 다이오드, 염료 레이저, 할로겐화 금속 램프, 플래쉬 램프, 기계적으로 필터링된 형광 광원, 기계적으로 필터링된 백열 및 필라멘트 광원로 이루어진 군 중에서 선택된 생체외 광조사를 위한 광원; 및 생체내 광조사를 위한 광역학 치료용 레이저 파이버로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것인, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 키트.
제10항에 있어서, 상기 광원에서 조사되는 광선의 빛의 강도는 1 내지 100 J/cm² 범위인, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 키트.
제13항에 있어서, 상기에서 광원에서 방사되는 광선의 펄스 지속 시간은 0.1 내지 500 ms이고, 광선의 조사 횟수는 1회 내지 100회인, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 키트.
제10항에 있어서, 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 및 신경계의 암으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 증상의 치료 또는 예방에 적용되는 것을 특징으로 하는, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 키트.