DE60100500T2

DE60100500T2 - Suspension enthaltend ein epi-hne protein, verfahren zu ihrer herstellung, daraus hergestelltes trockenpulveraerosol, arzneimittelzusammensetzungen enthaltend diese suspension oder dieses aerosol und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE60100500T2
Application number: DE60100500T
Authority: DE
Inventors: Alain Poncin; François Saudubray; Anne Bokman
Original assignee: Debiopharm SA
Current assignee: Debiopharm SA
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2021-10-27
Also published as: BR0115020A; DK1223972T3; EP1223972B1; DE60100500D1; CN1471405A; ATE245445T1; WO2002036158A8; HK1048064B; US6814982B2; EP1223972A1; CN100396329C; WO2002036158A1; MXPA03003785A; JP2004512377A; KR100826342B1; AU1701402A; HK1048064A1; CN1287856C; CN1636595A; CA2426992A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Suspension kristallisierter Teilchen eines EPI-hNE-Proteins, Verfahren zur Herstellung der Suspension, ein aus der Suspension stammendes Trockenpulver-Aerosol, eine die Suspension oder das Trockenpulver-Aerosol umfassende inhalierbare pharmazeutische Formulierung und die Verwendung der inhalierbaren pharmazeutischen Formulierung zur Herstellung eines Medikaments in der Behandlung verschiedener pathologischer Zustände.
Die internationale Patentanmeldung WO 96/20278 (Ley et al.) beschreibt eine Anzahl genetisch veränderter neuer Proteine, die die humane Neutrophilelastase (hNE) hemmen. Wie in der oben genannten Patentanmeldung angegeben wird, ist die humane Neutrophilelastase (ebenfalls als humane Leukozytenelastase bekannt) eine der hauptsächlichen neutralen Proteasen der Azurophilgranula polymorphonukleärer Leukozyten. Dieses Enzym ist an der Eliminierung von Pathogenen und an der Restrukturierung von Bindegewebe beteiligt.
Der prinzipielle systemische Inhibitor von hNE ist der α-1-Protease-Inhibitor, zuvor bekannt als α-1-Antitrypsin. In einer gewissen Anzahl pathologischer Situationen (Vererbungsstörungen, chronische Bronchitis, Emphysem, cystische Fibrose (Mukoviszidose)) ist dieser Inhibitor entweder nicht in ausreichenden Mengen im Blutstrom vorhanden oder ist inaktiviert, was zu einer unkontrollierten elastolytischen Aktivität von hNE führt, was eine umfassende Zerstörung des Lungengewebes verursacht.
WO 96/20278 schlägt daher neue Proteine vor, die stabile, nichttoxische, hoch wirksame Inhibitoren von hNE sind. Diese Inhibitoren bilden einen Teil einer Gruppe von Inhibitoren, die aus einer inhibitorischen Domäne vom Kunitz-Typ stammen, die im basischen Pankreas-Trypsin-Inhibitor (BPTI) oer einem Protein menschlichen Ursprungs, und zwar der leichten Kette des humanen Inter-α-Trypsin-Inhibitors (ITI), gefunden wird. Sie sind unter anderem EPI-hNE-1, EPI-hNE-2, EPI-hNE-3 und EPI-hNE-4. Die Inhibitoren aus WO 96/20278 werden durch biotechnologische Verfahren hergestellt und enthalten modifizierte DNA-Sequenzen in Bezug auf die biologischen Kunitz-Domänen, was sie hoch wirksam macht. Einer dieser Inhibitoren, EPI-hNE-4, ist von besonderem Interesse.
WO 96/20278 beschreibt die Herstellung von Produktionssystemen aus Pichia pastoris für hNE-Inhibitoren EPI-hNE-1, EPI-hNE-2, EPI-hNE-3 und EPI-hNE-4, die Proteinerzeugung und -reinigung (siehe insbesondere Beispiele 10–15).
Der Mutantenstamm GS115 der Hefe Pichia pastoris, der ein nichtfunktionales Histidinoldehydrogenase-Gen (his4) enthält, wurde durch Expression von Plasmiden transformiert, die eine Sequenz umfassen, die den S. cerevisiae-Kreuzungsfaktor alpha-Präpropeptid kodieren, der direkt an den Aminoterminus des gewünschten hNE-Inhibitors fusioniert ist, unter der Kontrolle des induzierbaren P. pastoris-aoxl-Genpromotors stromaufwärts und der aoxl-Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen stromabwärts. Die Expressionsplasmide wurden durch SacI-Verdauung linearisiert, und die lineare DNA wurde durch homologe Rekombination in das Genom des P. pastoris-Stammes GS115 durch Sphäroplastentransformation, Selektion auf Wachstum in Abwesenheit von hinzugegebenem Histidin und Durchmusterung auf den Phänotyp der Methanolnutzung, Sekretionswerte und Gendosis (abgeschätzt durch Southern Blot) eingefügt. Stämme, von denen angenommen wurde, dass sie ca. vier Kopien des Expressionsplasmids als eine Tandemeinheit in dem aox1-Genlocus integriert aufwiesen, wurden dann ausgewählt.
Kulturen der ausgewählten Stämme wurden zunächst im diskontinuierlichen Modus mit Glycerin als Kohlenstoffquelle gezüchtet und dann nach Verbrauch des Glycerins im Modus mit beschränkter Glycerinzufuhr gezüchtet, um die Zellmasse weiter zu erhöhen und den aox1-Promotor zu dereprimieren, und schließlich im Modus mit beschränkter Methanolzufuhr. Während der letzteren Phase ist der aox1-Promotor vollständig aktiv, und das Protein wird in das Kulturmedium sezerniert.
Das EPI-hNE-Protein wird dann gereinigt. Das spezifische Reinigungsverfahren variiert mit den spezifischen Eigenschaften jedes Proteins. Kurz gesagt wird das Kulturmedium zentrifugiert, der Überstand wird der Mikrofiltration und anschließend der Ultrafiltration unterworfen, gegebenenfalls einer Diafiltration, und dann wird das Protein durch Ammoniumsulfatausfällung und Ionenaustauscherchromatographie gewonnen.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 00 203 049.2 und die internationale Patentanmeldung PCT/FRO1/02699, die deren Priorität beansprucht, eingereicht durch die Firma der Anmelderin, beschreiben ein verbessertes Verfahren zur Reinigung eines EPI-hNE-Proteins mit pharmazeutischer Qualität aus dem Kulturmedium eines Wirtsstammes zur Expression der Proteine, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Leiten eines abstammenden Teils des Kulturmedium über ein ausgedehntes Bett von kationischem Austauscheradsorbens zur Gewinnung eines Eluats,
(b) Reinigung der Proteine gemäss ihrer Hydrophobizität im resultierenden Eluat,
(c) Leiten des resultierenden Eluats über eine kationische Austauschersäule,
(d) gegebenenfalls Filtrieren des resultierenden Mediums unter sterilen Bedingungen und
(e) gegebenenfalls Lyophilisieren des resultierenden Filtrats zur Gewinnung eines EPI-hNE-Proteins.

Die am Ende des Schrittes (d) erhaltene Lösung oder ein daraus erhaltenes gefriergetrocknetes Pulver kann zur Herstellung der erfindungsgemässen Suspension verwendet werden, wobei die Suspension in eine erfindungsgemässe inhalierbare pharmazeutische Formulierung eingebracht werden kann.
Die Anmelderin, die ein Reinigungsverfahren für EPI-hNE-Proteine, insbesondere EPI-hNE-4, perfektioniert hat, hat anschließend umfangreiche Forschungsanstrengungen zur Entwicklung pharmazeutischer Zusammensetzungen unternommen, die die gereinigten EPI-hNE-Proteine enthalten.
Tatsächlich hat sich die Anmelderin auf die Entwicklung einer bukkalen inhalierbaren pharmazeutischen Zusammensetzung konzentriert, die eine Lösung von EPI-hNE-4 enthält. Jedoch wurde im Verlauf der Produktentwicklung gefunden, dass die Lösung von EPI-hNE-4, sobald sie sich im Vernebler befand, instabil war und auszufallen neigte, was die Lösung trüb machte.
Es wurde zuerst angenommen, dass die ausgefällte Form des Proteins therapeutisch inaktiv sein würde. Jedoch wurde in einer überraschenden und unerwarteten Weise gefunden, dass die ausgefällte Form eine kristallisierte Form von EPI-hNE-4 war, und dass diese Kristallisation die Aktivität des Proteins nicht nachteilig beeinflußte. Der Begriff "kristallisierte Form von EPI-hNE-4" bezeichnet hier eine unlösliche Form dieses Proteins mit einer stäbchenartigen Struktur und einer Teilchengrösse von hauptsächlich weniger als 10 μm.
Die Anmelderin hat dann ihre Anstrengungen auf die Entwicklung einer Suspension der EPI-hNE-Proteine gerichtet, in der das Protein in kristalliner Form sein würde, wobei die Suspension in eine pharmazeutische Zusammen setzung eingebracht werden kann, insbesondere in eine inhalierbare pharmazeutische Formulierung.
Es wurde überraschend gefunden, dass es möglich war, eine Suspension herzustellen, die bei Raumtemperatur unter bestimmten spezifischen Bedingungen von Konzentration und pH stabil ist, was dadurch die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen erlaubt, die die Suspension beinhalten und bei Raumtemperatur stabil sind. Diese Stabilität bei Raumtemperatur ist von besonderer Bedeutung für ambulante Behandlungen.
Die Verwendung einer Suspension von EPI-hNE-Proteinen anstelle einer Lösung stellt einen Hauptvorteil in der Herstellung inhalierbarer pharmazeutischer Zusammensetzungen dar, insoweit sie die Entwicklung einer Formulierung erlaubt, die eine höhere Konzentration des Wirkstoffs besitzt, wodurch die Verabreichung des Wirkstoffs in einem kürzeren Zeitraum erlaubt wird.
Dies ist ein bedeutender Faktor in der Verabreichung inhalierbarer Wirkstoffe, da der erforderliche Inhalationszeitraum häufig lang sein kann, was als eine Haupteinschränkung aufgefaßt wird und damit zu einer schlechten Therapietreue der Patienten führen kann.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung eine Suspension eines EPI-hNE-Proteins, wobei die Suspension dadurch gekennzeichnet ist, dass das EPI-hNE-Protein in Form von kristallinen Teilchen vorliegt, die hauptsächlich eine Teilchengrösse zwischen 1 und 6 μm aufweisen, insbesondere zwischen 3 und 6 μm, gemäss Bestimmung durch Laser-Granulometrie, wobei die Konzentration der Suspension im EPI-hNE-Protein zwischen 1 und 80 mg/ml beträgt, bevorzugt zwischen 2 und 50 mg/ml, am meisten bevorzugt abhängig von der für den behandelten therapeutischen Zustand erforderlichen Menge des EPI-hNE-Proteins, in einem wässrigen Träger bei einem pH zwischen 3 und 8, bevorzugt 4 und 6, am meisten bevorzugt bei einem pH von 4,0 bis 5,0.
Die obige Suspension ist bezüglich ihrer biologischen Aktivität und Teilchengrössenverteilung für einen Zeitraum von wenigstens zwei Monaten bei Raumtemperatur stabil.
Der wässrige Träger ist bevorzugt eine Kochsalzlösung mit isoosmotischem Druck.
Die Kochsalzlösung kann Natriumacetat und Natriumchlorid oder Natriumcitrat umfassen.
Das EPI-hNE-Protein ist in geeigneter Weise aus der Gruppe ausgewählt, die aus EPI-hNE-1, EPI-hNE-2, EPI-hNE-3 und EPI-hNE-4 besteht, bevorzugt EPI-hNE-3 oder EPI-hNE-4. Am meisten bevorzugt ist es EPI-hNE-4.
Die obige Suspension umfasst dann bevorzugt wenigstens 65% der kristallinen Teilchen von EPI-hNE-4 mit einer Teilchengrösse zwischen 3 und 6 μm gemäss Bestimmung durch Laser-Granulometrie.
Die inhalierte Masse dieser Suspension, bestimmt an einem Pari LC-star Nebuliser, beträgt ca. 40 bis 50%, was ein guter Wert für eine inhalierbare pharmazeutische Formulierung ist.
Der MMAD-Wert ("Median Mass Aerodynamic Diameter", aerodynamischer Medianmassendurchmesser) der Vernebelungströpfchen, die kristallisierte EPI-hNE-4-Teilchen enthalten, beträgt ca. 2 μm gemäss Bestimmung durch Impaktor-Granulometrie. Dieser MMAD-Wert ist gut geeignet, um eine hohe atembare Fraktion und ein wirksames Eindringen in die Lungen sicherzustellen.
Ein Trockenpulver kann aus der Suspension abgeleitet werden, z. B. durch dessen Unterwerfen dem Zentrifugieren, bevorzugt nach dem Einstellen seines pH-Wertes auf 3,5 bis 4,5, Abtrennen des Überstandes, vorsichtiges Vakuumtrocknen des Pellets, anschließendes Homogenisieren, um die Teilchen aus den Agglomeraten zu individualisieren. Unter diesen Bedingungen werden kugelartige Teilchen erhalten, die größtenteils eine Teilchengrösse oder einen Durchmesser zwischen 1 und 6 μm gemäss Bestimmung durch direkte Mikroskopie haben. Das Trockenpulver hat eine mit derjenigen der Suspension vergleichbare Grössenverteilung bei Bestimmung in Lösung durch Laser-Granulometrie.
Ein Trockenpulver kann ebenfalls aus einer Lösung von EPI-hNE-Protein oder einem gefriergetrockneten Pulver von EPI-hNE-Protein abgeleitet werden.
Die Erfindung betrifft somit ebenfalls ein Trockenpulver, das kugelartige Teilchen von EPI-hNE-4 umfasst, die hauptsächlich eine Teilchengrösse oder einen Durchmesser zwischen 1 und 6 μm aufweisen, wobei bevorzugt wenigstens 75% der Teilchen eine Teilchengrösse oder einen Durchmesser zwischen 1 und 3 μm gemäss Bestimmung durch direkte Mikroskopie aufweisen, und größtenteils eine Teilchengrösse oder einen Durchmesser zwischen 1 und 6 μm aufweisen, wobei bevorzugt wenigstens 60% der Teilchen eine Teilchengrösse oder einen Durchmesser zwischen 1 und 3 μm gemäss Bestimmung durch Laser-Granulometrie aufweisen. Dieses Trockenpulver wird in geeigneter Weise durch ein Verfahren erhalten, das die Schritte der Trennung der Kristalle von der flüssigen Phase in der oben definierten Suspension des EPI-hNE-Proteins, Verwerfen des verbleibenden Wassers und Homogenisieren des erhaltenen brüchigen kompakten Kuchens umfasst.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Trockenpulver, das kugelartige Teilchen von EPI-hNE-4 umfasst, wobei wenigstens 90% der Teilchen eine Teilchengrösse oder einen Durchmesser zwischen 0,5 und 4,0 μm aufweisen, wobei der MMAD-Wert ca. 2,1 μm gemäss Bestimmung durch Laser-Granulometrie beträgt. Dieser MMAD-Wert ist gut geeignet, um eine hohe atembare Fraktion und ein wirksames Eindringen in die Lungen sicherzustellen, wenn das Pulver in einem geeigneten Treibmittelträger dispergiert wird. Dieses Trockenpulver kann zweckmäßig durch ein Verfahren erhalten werden, das den Schritt der Sprühtrocknung einer Lösung von EPI-hNE-Protein umfasst.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine inhalierbare pharmazeutische Formulierung, die die oben definierte Suspension des EPI-hNE-4-Proteins oder ein Trockenpulver-Aerosol umfasst, das das oben definierte Trockenpulver in einem geeigneten Treibmittelträger umfasst.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung einer Suspension von EPI-hNE-Protein, ausgehend entweder von einer Lösung von EPI-hNE-Protein oder von einem gefriergetrockneten Pulver.
Wenn von einer Lösung von EPI-hNE-Protein ausgegangen wird, umfasst ein geeignetes Verfahren zur Herstellung der Suspension die folgenden Schritte:

(a) Einstellen des pH-wertes der Lösung auf einen Wert zwischen 3,5 und 4,5, um die Kristallisation des EPI-hNE-Proteins zu erlauben, und
(b) Einstellen des pH-Wertes auf einen Wert zwischen 3,0 und 8,0.

Die obigen Schritte (a) und (b) können in geeigneter Weise bei einer Temperatur von 1 bis 40°C durchgeführt werden, bevorzugt von 4 bis 30°C. Wenn von einem gefriergetrockneten Pulver ausgegangen wird, umfasst ein geeignetes Verfahren zur Herstellung der Suspension die folgenden Schritte:

(a) Solubilisieren des EPI-hNE-Proteins in einem Puffer mit einem pH-Wert unterhalb 3,0,
(b) Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf einen Wert zwischen 3,5 und 4,5, um die Kristallisation der EPI-hNE-Proteins zu erlauben, und
(c) Einstellen des pH-Wertes auf einen Wert zwischen 3,0 und 8,0.

Die obigen Schritte (a), (b) und (c) können in geeigneter Weise bei einer Temperatur von 1 bis 40°C durchgeführt werden, bevorzugt von 4 bis 30°C.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung eines Trockenpulvers wie oben definiert, ausgehend von der obigen Suspension von EPI-hNE-Protein, einer Lösung oder einem gefriergetrockneten Pulver davon.
Wenn von einer Suspension von EPI-hNE-Protein ausgegangen wird, umfasst das Verfahren zur Herstellung des Trockenpulvers die Schritte der Trennung der Kristalle von der flüssigen Phase in der obigen Suspension, z. B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren an einem Submikronfilter, Verwerfen des verbleibenden Wassers, in geeigneter Weise unter Verwendung eines Verfahrens, das kein umfassendes Kompaktieren des Festphasenkuchens verursacht, z. B. durch vorsichtiges Verdampfen bei einer Temperatur unterhalb 40°C und bei einem Druck von geringfügig unter Atmosphärendruck, und Homogenisieren des so erhaltenen festen Kuchens, um die agglomerierten Teilchen zu individualisieren, in geeigneter Weise durch auf dem Gebiet des Mahlens allgemein bekannte Techniken, z. B. unter Verwendung einer Pulverisette 5 (Planetenmühle) von Fritsch oder einer elektrischen Mahlvorrichtung Moulin JK von Laboratoire Moderne, Paris.
Wenn von einer Lösung von EPI-hNE-Protein ausgegangen wird, umfasst ein geeignetes Verfahren zur Herstellung des Trockenpulvers die folgenden Schritte:

(a) Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf einen Wert zwischen 3,5 und 4,5, um die Kristallisation des EPI-hNE-Proteins zu erlauben,
(b) Trennen der Kristalle von der flüssigen Phase in der obigen Suspension, z. B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren an einem Submikronfilter,
(c) Verwerfen des verbleibenden Wassers, in geeigneter Weise unter Verwendung eines Verfahrens, das kein umfassendes Kompaktieren des Festphasenkuchens verursacht, bevorzugt durch vorsichtiges Verdampfen bei einer Temperatur unterhalb 40°C und bei einem Druck von geringfügig unterhalb Atmosphärendruck,
(d) Homogenisieren des so erhaltenen festen Kuchens, um die agglomerierten Teilchen zu individualisieren, in geeigneter Weise durch auf dem Gebiet des Mahlens allgemein bekannte Techniken.

Die obigen Schritte (a) und (b) können in geeigneter Weise bei einer Temperatur von 1 bis 40°C durchgeführt werden, bevorzugt von 4 bis 30°C.
Wenn von einer Lösung von EPI-hNE-Protein ausgegangen wird, umfasst ein bevorzugtes Verfahren den Schritt der Sprühtrocknung dieser Lösung. Die Parameter dieses Schrittes können zweckmäßig eingestellt werden, um eine Teilchengrössenverteilung sicherzustellen, so dass eine hohe atembare Fraktion und ein wirksames Eindringen in die Lungen sichergestellt wird, wenn das Pulver in einem geeigneten Treibmittelträger dispergiert wird.
Wenn von einem gefriergetrockneten Pulver von EPI-hNE-Protein ausgegangen wird, umfasst ein geeignetes Verfahren zur Herstellung des Trockenpulvers die folgenden Schritte:

(a) Solubilisieren des EPI-hNE-Proteins in einem Puffer mit einem pH-Wert unterhalb 3,0,
(b) Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf einen Wert zwischen 3,5 und 4,5, um die Kristallisation des EPI-hNE-Proteins zu erlauben,
(c) Trennen der Kristalle von der flüssigen Phase in der obigen Suspension, bevorzugt durch Zentrifugieren oder Filtrieren an einem Submikronfilter,
(d) Verwerfen des verbleibenden Wassers, in geeigneter Weise unter Verwendung eines Verfahrens, das kein umfassendes Kompaktieren des Festphasenkuchens verursacht, bevorzugt durch vorsichtigen Verdampfen bei einer Temperatur unterhalb 40°C und bei einem Druck von geringfügig unterhalb Raumdruck, und
(e) Homogenisieren des so erhaltenen festen Kuchens, um die agglomerierten Teilchen zu individualisieren, in geeigneter Weise durch auf dem Gebiet des Mahlens allgemein bekannte Techniken.

Die obigen Schritte (a) und (b) können in geeigneter Weise bei einer Temperatur von 1 bis 40°C durchgeführt werden, bevorzugt von 4 bis 30°C.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der obigen Suspension oder eines Trockenpulver-Aerosols eines EPI-hNE-Proteins zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung eines Krankheitszustandes, der aufgrund einer übermässigen Aktivität von hNE besteht.
Der Krankheitszustand kann insbesondere jede respiratorische Störung sein oder kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus cystischer Fibrose (Mukoviszidose), Emphysem, ARDS (Acute Respiratory Distress Syndrome) und COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) besteht.
Die nachfolgenden Beispiele werden zur besseren Beschreibung der Erfindung dienen, aber sind keineswegs als beschränkend aufzufassen.
Die folgende Beschreibung wird durch Bezugnahme auf die 1 bis 3B besser verständlich.
1 ist eine mikroskopische Aufnahme des Pellets, das nach dem Zentrifugieren einer EPI-hNE-4-Suspension erhalten wird und die stäbchenartige Struktur der EPI-hNE-4-Kristalle in Gegenwart von Wasser zeigt.
2 ist eine mikroskopische Aufnahme eines Vernebelungströpfchens mit einem Durchmesser von ca. 2,5 μm, das ein stäbchenförmiges kristallines EPI-hNE-4-Teilchen enthält.
3A und 3B sind mikroskopische Aufnahmen des Trockenpulvers, das die kugelartige Struktur der EPI-hNE-4-Teilchen in trockener Form zeigt.
Beispiel 1
Reinigung von EPI-hNE-4
Hefeproduktionssystem
Die hNE-Inhibitoren werden als sezernierte Proteine in den Kulturüberständen von Fermentationen des Pichia pastoris-Stammes GS115 mit hoher Zelldichte erzeugt.
Die Expressionsplasmide werden durch Ligieren synthetischer DNA-Sequenzen, die den Saccharomyces cerevisiae-Kreuzungsfaktor α-Präpropeptid kodieren, direkt an den 5'-Terminus der synthetischen DNA, die den gewünschten hNE-Inhibitor kodiert, konstruiert. Dieses Fusionsgen wird zwischen einen induzierbaren P. pastoris-aoxl-Genpromotor stromaufwärts und aoxl-Gentranskriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen stromabwärts eingeführt, die sich auf einem Plasmid befinden, das ebenfalls ein S. cerevisiae-his4-Gen kodiert.
Linearisierte Expressionsplasmid-DNA wird durch homologe Rekombination in das Genom des P. pastoris-Stammes GS115 durch Sphäroplastentransformation eingeführt. Regenerierte Sphäroplasten werden auf Wachstum in Abwesenheit von hinzugegebenem Histidin selektiert. Individuelle Isolate werden auf den Phänotyp der Methanolnutzung (mut +), Sezernierungsmengen und Genkopiezahl durchmustert. Der Stamm PEY-53, der ein hohes Maß an EPI-hNE-4 sezerniert, wurde daher ausgewählt. Von diesem Stamm wird gemäss Southern-Analyse der genomischen DNA angenommen, dass er vier Kopien der Expressionsplasmid-DNA enthält, die in den aox1-Genlocus integriert ist.
Proteinerzeugung
Der P. pastoris-Stamm PEY-53 wird in Fermentationen mit gemischter Zufuhr ähnlich dem in WO 96/20278 beschriebenen Verfahren gezüchtet, wobei der Unterschied darin besteht, dass Druckluft anstelle von gereinigtem Sauerstoff verwendet wird. Kurz gesagt werden die Kulturen zuerst im diskontinuierlichen Modus mit Glycerin als Kohlenstoffquelle gezüchtet. Nach Verbrauch des Glycerins werden die Kulturen für ca. vier Stunden im Modus mit beschränkter Glycerinzufuhr gezüchtet, um die Zellmasse weiter zu erhöhen und den aox1-Promotor zu dereprimieren. In der Enderzeugungsphase werden die Kulturen im Modus mit beschränkter Methanolzufuhr gezüchtet. Während dieser Phase ist der aox1-Promotor vollständig aktiv, und die hNE-Inhibitoren werden in das konditionierte Medium (C. M.) sezerniert. Die Endkonzentration von EPI-hNE-4 in der PEY-53-Fermentation C. M. betrug ca. 1.000 mg/l gemäss Bestimmung durch SDS-PAGE-Analyse und durch RP-HPLC. Der hauptsächliche, durch PEY-53-Kulturen erzeugte molekulare Typ ist das richtig gereifte EPI-hNE-4-Protein. Jedoch sezerniert dieser Stamm ebenfalls ca. 5–20% eines Proteins mit einem geringfügig höheren Molekulargewicht, das vermutlich alternativ gereiftes EPI-hNE-4-Protein darstellt. Das richtig gereifte EPI-hNE-4 kann im wesentlichen frei von diesen Verunreinigungen wie nachfolgend beschrieben gereinigt werden. 100 l des PEY-53 CM, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurden, wurden gesammelt und über ein ausgedehntes Bett wie folgt geleitet: 10 l Chromatographiematrix (Streamline SP von Amersham-Pharmacia) werden in 50 mM Ammoniumacetat pH 3,5 äquilibriert und im gleichen Puffer auf 30 l mit 300 cm/h fluidisiert. Nach Beladung wird die Säule in 10 mM Ammoniumacetat pH 3,5 gewaschen, um eine Absorption bei 280 nm von weniger als 0,05 zu erhalten. Die Perlen werden auf 10 l gepackt, und EPI-hNE-4 wird durch Waschen der Säule in 1 M Ammoniumacetatpuffer pH 4,5 gewonnen.
Dadurch wurden 10 l einer Lösung erhalten, die ca. 100 g EPI-hNE-4 enthielt (gemäss Bestimmung durch spektrometrischen Test bei 280 nm durch RP-HPLC, Coomassie-Proteintest und biologischen Aktivitätstest).
RP-HPLC (Kieselerdesäule Licrosphere 100RP von Pharmacia/Gradient aus Wasser + 1% TFA und Acetonitril + 1% TFA) zeigte, dass die alternativ gereifte Form nicht von der richtigen Form getrennt wird. Die Verunreinigung durch grüne Verunreinigungen ist ebenfalls nachweisbar.
Die Lösung wurde an einem 22 μm-Filter (Millipack 200 von Millipore) vor der weiteren Reinigung sterilfiltriert.
Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung wurde durchgeführt, indem die obigen 10 l Lösungen über ein BioProcess-System (Pharmacia) geleitet wurden, wobei eine Phenylsepharose-Fast Flow-Matrix von Pharmacia in einer 15 l BPTG-Säule von Pharmacia verwendet wurde. Die verwendeten Puffer waren: A: Natriumacetat 50 mM pH 4,5 + 1 M NaCl, und B: Natriumacetat 50 mM pH 4,5. Die Elution wurde in einem Schritt mit 100% B bei einer Fließgeschwindigkeit von 300 cm/h durchgeführt.
Das Eluat enthielt ca. 50 g gereinigtes EPI-hNE-4 (gemäss Bestimmung durch spektrophotometrischen Testbei 280 nm, Coomassie-Proteintest und biologischen Aktivitätstest).
RP-HPLC zeigte, dass die alternativ gereifte Form nicht abgetrennt wurde. Kein grünes Pigment war nachweisbar.
Kationenaustauscherchromatographie wurde dann unter Verwendung eines Bioprocess-Chromatographiesystems von Pharmacia durchgeführt. Die verwendete Matrix war Macroprep High S-Matrix von BioRad (steife Matrix auf Basis von vernetztem Methacrylat, das Sulfonatgruppen an der Oberfläche trägt) in einer 15 l BPG200-Säule von Pharmacia. Die verwendeten Puffer waren: A: Ammoniumacetat 10 mM pH 3,5, B: Natriumacetat 50 mM pH 6,2, und C: 10 mM Ammoniumbicarbonat pH 7,8. Eine erste Flution in Puffer B wurde zur Trennung der fehlgereiften Form verwendet. Die Flution wurde dann durch einen Schritt mit 100% B bei einer Fließgeschwindigkeit von 300 cm/h durchgeführt.
Das Eluat enthielt ca. 40 g gereinigtes EPI-hNE-4 (gemäss Bestimmung durch spektrometrischen Test bei 280 nm, Coomassie-Proteintest und biologischen Aktivitätstest), entsprechend einer Gesamtausbeute des Reinigungsverfahrens von ca. 40%.
RP-HPLC zeigte weniger als 1,5% der alternativ gereiften Form. Kein grünes Pigment war nachweisbar.
Das Eluat wurde gefriergetrocknet und bei –20°C aufbewahrt.
Beispiel 2
Herstellung von EP2-hNE-4-Formulierungen
Ausgehend von dem in Beispiel 1 erhaltenen gefriergetrockneten EPI-hNE-4-Pulver wurden 12 Chargen der folgenden EPI-hNE-4-Suspensionen unter Verwendung des nachfolgend beschriebenen Verfahrens hergestellt.
Formulierung 10/4: Suspension aus 10 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 4,0
Formulierung 10/5: Suspension aus 10 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 5,0
Formulierung 5/4: Suspension aus 5 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 4,0
Formulierung 5/5: Suspension aus 5 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 5,0
Formulierung 2.5/4: Suspension aus 2,5 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 4,0
Formulierung 2,5/5: Suspension aus 2,5 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 5,0
Formulierung 20/4 (4°C): Suspension aus 20 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 4,0, hergestellt bei einer Temperatur von 4°C
Formulierung 20/4 (30°C): Suspension aus 20 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 4,0, hergestellt bei einer Temperatur von 30°C
Formulierung 30/4 (4°C): Suspension aus 30 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 4,0, hergestellt bei einer Temperatur von 4°C
Formulierung 30/4 (30°C): Suspension aus 30 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 4,0, hergestellt bei einer Temperatur von 30°C
Formulierung 50/4 (4°C): Suspension aus 50 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 4,0, hergestellt bei einer Temperatur von 4°C
Formulierung 50/4 (30°C): Suspension aus 50 mg/l EPI-hNE-4 in Natriumacetat- und Natriumchloridlösung mit pH 4,0, hergestellt bei einer Temperatur von 30°C
Allgemeines Verfahren zur Herstellung von Suspensionen von kristallinen Teilchen von EPI-hNE-Proteinen
Herstellung von Suspensionen mit 2,5, 5 und 10 mg/l EPI-hNE-4
Eine Lösung von EPI-hNE-4 mit 15 mg/ml bei pH 3,5 wird wie folgt hergestellt: 140 mg EPI-hNE-4 in Pulverform werden in 7 ml eines 10 mM Natriumacetatpuffers pH 3,0 solubilisiert. Der pH wird mit 1 M Salzsäure (HCl) auf 2,0 eingestellt. Nach Auflösung wurde die Lösung an einem Media-Kap 5-Filter filtriert, und der pH wurde auf pH 3,0 unter Verwendung von 1 M Natriumhydroxid (NaOH) eingestellt.
Die Proteinkonzentration wurde durch W-Spektrophotometrie überprüft, und die Lösung wurde mit 10 mN Natriumacetat auf eine Konzentration von 15 mg/ml verdünnt.
Ein halbes Volumen von 10 mM Natriumacetat, 2,4% Natriumchlorid pH 12 wurde hinzugegeben, um eine Lösung von 10 mg/ml EPI-hNE-4 pH 4,0 zu erhalten. Nach Bedarf kann der pH auf 4 ± 0,1 mit 1 M HCl oder 1 M Natriumhydroxid eingestellt werden.
Die Lösung wurde in ein Glasgefäß überführt und bei Raumtemperatur über Nacht zur Kristallisation stehengelassen.
Eine Probe von 50 μl wurde zentrifugiert und das Pellet zur Analyse durch Kontrastphasenmikroskopie entnommen.
1 ist eine mikroskopische Aufnahme dieses Pellets, die die stäbchenartige Struktur der EPI-hNE-4-Kristalle zeigt.
Die Suspension wird homogenisiert, und dann wird die Hälfte des Volumens in ein weiteres Glasgefäß überführt und mit 1 M NaOH auf pH 5,0 eingestellt. An diesem Punkt werden die Suspensionen bei pH 4,0 und 5,0 wiederholt nach Bedarf verdünnt, um Konzentrationen von 5 mg/ml und 2,5 mg/ml zu erhalten.
Herstellung von Suspensionen mit 20, 30 und 50 mg/l EPI-hNE-4
Die Formulierungen 20/4 (4°C), 20/4 (30°C), 30/4 (4°C), 30/4 (30°C), 50/4 (4°C) und 50/4 (30°C) wurden im wesentlichen wie oben beschrieben hergestellt, ausgehend von Lösungen von EPI-hNE-4 mit 30, 45 bzw. 75 mg/l, wobei alle Schritte entweder bei einer Temperatur von 4°C oder bei einer Temperatur von 30°C durchgeführt wurden, wobei die Lösung während eines Zeitraums von 72 Stunden kristallisieren gelassen wurde. Kein signifikanter Unterschied in der Kristallisationskinetik wurde zwischen diesen zwei Temperaturen beobachtet.
Beispiel 3
Analyse der EPI-hNE-4-Suspensionen durch Laser-Granulometrie
Die Granulometrie der EPI-hNE-4-Teilchen in den in Beispiel 2 hergestellten Suspensionen wurde an einem Coulter Multisizer II analysiert. Einige der Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
Die obige Tabelle zeigt, dass in jeder der Suspensionen wenigstens 65% der Teilchen einen Durchmesser zwischen 3 und 6 μm haben.
Beispiel 4
Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität der EPI-hNE-4-Suspensionen
Die biologische Aktivität der EPI-hNE-4-Suspension wurde durch Messung des Grades der Hemmung der humanen Neutrophilelastase unter Verwendung eines kolorimetrischen Tests bestätigt.
Humane Elastase hydrolysiert das synthetische Substrat N-Methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val-p-nitroanilid.
Während der Hydrolyse wird das Produkt p-Nitroanilid (gelbe Farbe) freigesetzt. Die biologische Aktivität von EPI-hNE-4 wird dann in Bezug auf das Ausmaß der Hemmung der humanen Elastase durch Verfolgen der Abnahme der Freisetzung von p-Nitroanilid berechnet.
Verschiedene Verdünnungen einer Suspension von EPI-hNE-4 werden hergestellt, wobei die spezifische Proteinkonzentration durch W-Spektrophotometrie festgestellt und als Verdünnungslösung Tris 100 mM, NaCl 50 mM, Triton X100 0,25%, BSA 0,1%, pH 8,0 verwendet wird. 100 μl des verdünnten 100 nM EPI-hNE-4 werden in 5 ml-Reagenzgläsern gegeben.
100 μl von hNe 100 nM im gleichen Puffer werden hinzugegeben, und die verdünnten Proben werden für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert (Rühren ist nicht erforderlich). 100 μl von 4,2 mM Substrat (wie oben beschrieben) werden hinzugegeben, und die Mischung wird für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 μl Eisessig beendet. Die Extinktion bei 410 nm Wellenlänge wird gemessen, wobei der Puffer allein und das hNE ohne EPI-hNE-4-Probe als Kontrollen verwendet werden.
Beispiel 5
Stabilität der EPI-hNE-4-Suspensionen
Die Grössenverteilung und die inhibitorische Aktivität von EPI-hNE-4 von 3 Suspensionen der EPI-hNE-4-Konzentrationen 2,5, 5 und 10 mg/ml bei pH 5,0 und von 3 Suspensionen der EP2-hNE-4-Konzentrationen 20, 30 und 50 mg/ml bei pH 4,0 wurden über einen zweimonatigen Zeitraum zur Verifizierung ihrer Stabilität analysiert.
Die Suspensionen wurden gemäss dem in Beispiel 2 umrissenen Verfahren hergestellt. Drei Fläschchen jeder Suspension wurden bei Raumtemperatur für zwei Monate für die 3 Suspensionen der EPI-hNE-4-Konzentrationen 2,5, 5 und 10 mg/ml bei pH 4,0 und bei 4°C für die 3 Suspensionen der EPI-hNE-4-Konzentrationen 20, 30 und 50 mg/ml bei pH 4,0 gelagert.
Die biologische Aktivität der Suspensionen wurde zu Beginn und zum Ende des zweimonatigen Zeitraums unter Verwendung des oben in Beispiel 4 beschriebenen kolorimetrischen Inhibierungstests der humanen Neutrophilelastase bestimmt. Kein signifikanter Unterschied wurde zwischen dem Beginn und dem Ende des zweimonatigen Zeitraums festgestellt.
Die Grössenverteilung der Teilchen wurde durch Laser-Granulometrie unter Verwendung eines Coulter Multisizer II zu Beginn und zum Ende des zweimonatigen Zeitraums gemessen. Es gibt keine signifikante Veränderung der Grössenverteilung der Suspension von EPI-hNE-4 10 mg/ml, pH 5,0 nach einem zweimonatigen Lagerzeitraum bei Raumtemperatur.
Die Grössenverteilung und die inhibitorische Aktivität von EPI-hNE-4 der Suspension der EPI-hNE-4-Konzentrationen 10 mg/ml bei pH 5,0 zeigte keine signifikante Veränderung nach zehnmonatiger Lagerung bei Raumtemperatur.
Beispiel 6
Vernebelung der EP2-hNE-4-Suspensionen. Grössenverteilungsanalyse und mikroskopische Beobachtung der Vernebelungströpfchen
Die in Beispiel 2 hergestellten Suspensionen wurden in einem Pari LC-star Jet Nebulizer vernebelt.
Die inhalierbare Masse gemäss Bestimmung durch fachbekannte Verfahren betrug ca. 40–50%, was ein guter Wert für eine inhalierbare pharmazeutische Formulierung ist.
Die Teilchengrössenverteilung des Nebulisats wurde durch Laser-Granulometrie an einem Coulter Miltisizer II analysiert. Der MMAD-Wert betrug 3–4 μm.
Die Teilchengrössenverteilung des Nebulisats wurde durch Impaktor-Granulometrie an aufeinanderfolgenden Filtern von 8,0 μm, 6,0 μm, 4,0 μm, 3,0 μm, 2,0 μm, 1,5 μm, 1,0 μm, 0,75 μm, 0,5 μm und 0,25 μm gemäss fachbekannten Verfahren analysiert. Für jede der untersuchten Suspensionen wurde ein MMAD-Wert von ca. 2 μm festgestellt.
2 ist eine mikroskopische Aufnahme eines Vernebelungströpfchens mit einem Durchmesser von ca. 2,5 μm, das ein stäbchenförmiges kristallines EPI-hNE-4-Teilchen enthält.
Beispiel 7
Herstellung eines Trockenpulvers, Analyse des Pulvers durch mikroskopische Beobachtung und Bestimmung seiner biologischen Aktivität
Eine Lösung von EPI-hNE-4 mit 15 mg/ml bei pH 3,0 wird wie folgt hergestellt: 140 mg EPI-hNE-4 in Pulverform werden in 7 ml eines 10 mM Natriumacetatpuffers pH 3,0 solubilisiert. Der pH wird mit 1 M Salzsäure (HCl) auf 2,0 eingestellt. Nach Auflösung wurde die Lösung an einem Media- Kap 5-Filter filtriert, und der pH wurde unter Verwendung von 1 M Natriumhydroxid (NaOH) auf 3,0 eingestellt.
Die Proteinkonzentration wurde UV-Spektrophotometrie überprüft, und die Lösung wurde mit 10 mM Natriumacetat auf eine Konzentration von 15 mg/ml verdünnt.
Ein halbes Volumen von 10 mM Natriumacetat, 2,4% Natriumchlorid pH 12 wurde hinzugegeben, um eine Lösung von 10 mg/ml EPI-hNE-4, pH 4,0 zu erhalten. Nach Bedarf kann der pH-Wert auf 4 ± 0,1 mit 1 M HCl oder 1 M Natriumhydroxid eingestellt werden.
Die Lösung wurde in ein Glasgefäß überführt und zur Kristallisation während 72 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
Die Suspension wurde an einem 0,22 μm-Filter filtriert. Der Filter wurde aufgefangen und über Nacht in einem Exsikkator getrocknet, der Blaugel enthielt (ein System, das die allmähliche Verdampfung von Wasser erlaubt). Ein bröckeliges kompaktes Pulver wurde aus dem Filter gewonnen. Einfache manuelle mechanische Homogenisierung wurde unter Verwendung eines Mörsers durchgeführt, um dadurch ein sehr feines, visuell homogenes Pulver zu erhalten.
Das Pulver wurde durch direkte Mikroskopie an einer Thomas-Platte beobachtet. 3A ist eine mikroskopische Aufnahme des Pulvers, die die unregelmäßige kugelartige Struktur von EPI-hNE-4 in trockener Form zeigt, wobei die meisten der individuellen Teilchen einen Durchmesser oder eine Teilchengrösse zwischen 1 und 6 μm haben. Die dunklen Zonen in der mikroskopischen Aufnahme stellen wahrscheinlich die Überlagerung individueller Teilchen oder verbleibende Agglomerate der manuell unzureichend homogenisierten Probe dar.
Die statistische Analyse des Durchmessers der individuellen Teilchen (Mittelwert des größten und des kleinsten Durchmessers der kugelartigen Teilchen), gemessen an den mikroskopischen Aufnahmen der direkten Mikroskopie an einer Thomas-Platte, zeigte, dass die meisten (über 80%) der Teilchen einen Durchmesser (oder eine Teilchengrösse) zwischen 1 und 6 μm haben, wobei wenigstens 75% der Teilchen einen Durchmesser (oder eine Teilchengrösse) zwischen 1 und 3 μm haben. Der Median-Durchmesser (oder die Median-Teilchengrösse) beträgt ca. 2,1 μm, und der mittlere Durchmesser (oder die mittlere Teilchengrösse) beträgt 2,33 ± 0,18 μm.
Das Pulver wurde in einer 1%igen NaCl-Lösung dispergiert und durch Laser-Granulometrie an einem Coulter Multisizer II analysiert. Die vollständige statistische Analyse der Laser-Granulometriedaten zeigte eine Teilchengrössenverteilung, die sehr ähnlich der in Beispiel 3 erhaltenen ist, wobei wenigstens 65% der Teilchen einen Durchmesser (oder eine Teilchengrösse) zwischen 1 und 6 μm haben.
Eine Suspension mit 10 mg/ml von EPI-hNE-4 bei pH 5,0 wurde aus diesem Pulver durch ein Verfahren hergestellt, das dem in Beispiel 2 beschriebenen sehr ähnlich war. Die biologische Aktivität der Suspension wurde unter Verwendung des in Beispiel 4 oben beschriebenen kolorimetrischen Inhibierungstests der humanen Neutrophilelastase bestimmt. Diese biologische Aktivität war nicht signifikant unterschiedlich von derjenigen, die für die Suspension von 10 mg/ml EPI-hNE-4 bei pH 5,0 in Beispiel 5 bestimmt wurde.
Beispiel 8
Herstellung eines Trockenpulvers und dessen Analyse durch Laser-Granulometrie
Ein Trockenpulver wurde aus 2 l der Suspension hergestellt, die während der Herstellung der vorhergehenden Chargen von EPI-hNE-4 erhalten wurde.
Die Suspension wurde 30 min mit 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das resultierende Pellet wurde in 100 ml 10 mM Ammoniumbicarbonatpuffer homogenisiert. Die Suspension wurde an einem 0,22 μm-Filter filtriert. Der Filter wurde aufgefangen und über Nacht in einem Exsikkator getrocknet, der Blaugel enthielt (ein System, das die allmähliche Verdampfung von Wasser erlaubt). 4 g eines bröckeligen kompakten Pulvers wurden aus dem Filter gewonnen. Homogenisierung wurde unter Verwendung einer elektrischen Mahlvorrichtung Moulin JK von Laboratoire Moderne, Paris, durchgeführt, wodurch ein sehr feines, visuell homogenes Pulver gewonnen wurde.
Die Granulometrie dieses Pulvers wurde an einer Malvern-Vorrichtung analysiert (Malvern Mastersizer 2000 (Malvern, UK), ausgerüstet mit einem Trockenprobennehmer "Scirocco 2000").
Die Ergebnisse zeigten, dass der Großteil der Teilchen (über 80%) einen Durchmesser (oder eine Teilchengrösse) zwischen 1 und 6 μm hat, wobei wenigstens 60% der Teilchen einen Durchmesser (oder eine Teilchengrösse) zwischen 1 und 3 μm haben. Der Median-Durchmesser (oder die Median-Teilchengrösse) betrug ca. 2,66 μm.
Beispiel 9
Herstellung eines Trockenpulvers durch Sprühtrocknen und dessen Analyse durch Laser-Granulometrie und biologischen Test
1 g EPI-hNE-4 in Pulverform oder in kristallisierter Form (siehe Beispiel 8) wurde in Wasser solubilisiert, das 1% Salzsäure pH 2,5 enthielt. Diese Lösung wurde unter Verwendung eines Minisprühtrockners Buchi B191.A unter den nachfolgenden Bedingungen sprühgetrocknet (atomisiert):

– Innendurchmessser der Sprüheinheit: 0,7 mm
– Sprühfließgeschwindigkeit: 3,4 g/l
– Luftdruck: 600 l/h
– Trocknungsluft-Fließgeschwindigkeit: 35 m³/h
– Trocknungsluft-Einlaßtemperatur: 120°C
– Trocknungsluft-Auslaßtemperatur: 74–75°C

Das Pulver wurde durch direkte Mikroskopie an einer Thomas-Platte beobachtet. 3B ist eine mikroskopische Aufnahme des Pulvers, das die unregelmäßige kugelartige Struktur des EPI-hNE-4 in trockener Form zeigt, wobei die meisten der individuellen Teilchen einen Durchmesser oder eine Teilchengrösse zwischen 1 und 3 μm haben. Die Abwesenheit dunkler Zonen im Vergleich mit 3A zeigt die gute Homogenität des Pulvers.
Die Grössenverteilung der Pulverteilchen wurde durch Laser-Granulometrie unter Verwendung eines Malvern Multisizer 2000 analysiert, der mit einem Trockenprobennehmer Scirocco 2000 ausgerüstet war.
Die Ergebnisse zeigten, dass 90% der Teilchen einen Durchmesser oder eine Teilchengrösse von 0,5–4,0 μm, 75% einen Durchmesser oder eine Teilchengrösse von 0,5–2,8 μm und 60% einen Durchmesser oder eine Teilchengrösse von 0,5–2,2 μm haben, wobei der MMAD-Wert 2,16 μm beträgt.
Die Bestimmung der spezifischen biologischen Aktivität des Pulvers wie in Beispiel 4 beschrieben zeigte, dass das Protein vollständig aktiv war.

Claims

Suspension aus einem EPI-hNE-Protein, wobei die Suspension dadurch gekennzeichnet ist, dass das EPI-hNE-Protein in Form von kristallinen Teilchen vorliegt, die hauptsächlich einen Durchmesser oder eine Teilchengrösse zwischen 1 und 6 μm aufweisen, insbesondere zwischen 3 und 6 μm, bestimmt durch Laser-Granulometrie, wobei die EPI-hNE-4-Konzentration der Suspension zwischen 1 und 80 mg/ml beträgt, bevorzugt zwischen 2 und 50 mg/ml, in einem wässrigen Träger bei einem pH zwischen 3 und 8, bevorzugt 4 und 6, am meisten bevorzugt bei einem pH zwischen 4,0 und 5,0.
Suspension gemäss Anspruch 1, worin der wässrige Träger eine Kochsalzlösung mit einem isoosmotischen Druck ist.
Suspension gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Kochsalzlösung Natriumacetat und Natriumchlorid oder Natriumcitrat umfasst.
Suspension gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das EPI-hNE-Protein EPI-hNE-4 ist.
Suspension gemäss Anspruch 4, worin wenigstens 65% der kristallinen Teilchen von EPI-hNE-4 eine Teilchengrösse oder einen Durchmesser zwischen 3 und 6 μm aufweisen, bestimmt durch Laser-Granulometrie.
Suspension gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, die dazu neigt, nach Vernebelung Vernebelungströpfchen zu ergeben, die kristallisierte EPI-hNE-4-Teilchen enthält, die einen MMAD-Wert von ca. 2 μm aufweisen, bestimmt durch Impaktor-Granulometrie.
Trockenpulver, das kugelartige Teilchen von EPI-hNE-4 umfasst, die hauptsächlich einen Durchmesser oder eine Teilchengrösse zwischen 1 und 6 μm aufweisen, wobei vorzugsweise wenigstens 75% der Teilchen einen Durchmesser oder eine Teilchengrösse zwischen 1 und 3 μm aufweisen, bestimmt durch direkte Mikroskopie.
Trockenpulver, das kugelartige Teilchen von EPI-hNE-4 umfasst, die hauptsächlich einen Durchmesser oder eine Teilchengrösse zwischen 1 und 6 μm aufweisen, wobei vorzugsweise wenigstens 60% der Teilchen einen Durchmesser oder eine Teilchengrösse zwischen 1 und 3 μm aufwiesen, bestimmt durch Laser-Granulometrie.
Trockenpulver, das kugelartige Teilchen von EPI-hNE-4 umfasst, wobei wenigstens 90% der Teilchen einen Durchmesser oder eine Teilchengrösse zwischen 0,5 und 4,0 μm aufweisen, wobei der MMAD-Wert ca. 2,1 μm beträgt, bestimmt durch Laser-Granulometrie.
Inhalierbare pharmazeutische Formulierung, die eine Suspension aus einem EPI-hNE-Protein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Trockenpulver-Aerosol umfasst, das ein Trockenpulver gemäss einem der Ansprüche 7 bis 9 in einem geeigneten Treibmittelträger umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Suspension aus einem EPI-hNE-Protein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, das ausgehend von einer Lösung, die ein EPI-hNE-Protein enthält, die folgenden Schritte umfasst: (a) Einstellen des pH-Werts der Lösung auf einen Wert zwischen 3,5 und 4,5, um die Kristallisation des EPI-hNE-Proteins zu erlauben, und (b) Einstellen des pH-Werts auf einen Wert zwischen 3,0 und 8,0.
Verfahren zur Herstellung einer Suspension aus einem EPI-hNE-Protein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, das ausgehend von einem gefriergetrockneten Pulver aus einem EPI-hNE-Protein die folgenden Schritte umfasst: (a) Solubilisieren des EPI-hNE-Proteins in einem Puffer mit einem pH-Wert unterhalb 3,0, (b) Einstellen des pH-Werts der Lösung auf einen Wert zwischen 3,5 und 4,5, um die Kristallisation des EPI-hNE-Proteins zu erlauben, und (c) Einstellen des pH-Werts auf einen Wert zwischen 3,0 und 8,0.
Verfahren zur Herstellung eines Trockenpulvers wie in Anspruch 7 oder 8 definiert, umfassend die Schritte aus Abtrennen der Kristalle aus der flüssigen Phase in einer Suspension gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, Verwerfen des verbleibenden Wassers und Homogenisieren des erhaltenen brüchigen kompakten Kuchens.
Verfahren zur Herstellung eines Trockenpulvers wie in Anspruch 9 definiert, umfassend den Schritt des Sprühtrocknens einer Lösung aus dem EPI-hNE-Protein.
Verwendung einer inhalierbaren pharmazeutischen Formulierung gemäss Anspruch 10 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Erkrankungszustandes, der aufgrund einer übermässigen hNE-Aktivität besteht.
Verwendung gemäss Ansprach 15, worin der Zustand eine Atemwegsstörung ist oder aus cystischer Fibrose, Emphysem, ARDS (Acute Respiratory Distress Syndrome) und COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) ausgewählt ist.