ES2203601T3 - Suspension de una proteina de epi-hne, metodo para su preparacion, un aerosol en forma de polvo seco derivado de la misma, compuestos farmaceuticos que comprenden dicha suspension o dicho aerosol y sus utilizaciones. - Google Patents
Suspension de una proteina de epi-hne, metodo para su preparacion, un aerosol en forma de polvo seco derivado de la misma, compuestos farmaceuticos que comprenden dicha suspension o dicho aerosol y sus utilizaciones.Info
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Abstract
Suspensión de una proteína EPI-hNE, cuya suspensión se caracteriza porque la proteína EPI-hNE se encuentra presente en forma de partículas cristalinas que en su mayor parte tienen un diámetro o dimensión de partículas comprendido entre 1 y 6 ìm, en particular entre 3 y 6 ìm, determinado por granulometría láser, estando comprendida la concentración de la suspensión en EPI-hNE entre 1 y 80 mg/ml, preferentemente entre 2 y 50 mg/ml, en un vehículo acuoso a un pH comprendido entre 3 y 8, preferentemente entre 4 y 6, y más preferentemente a un pH comprendido entre 4, 0 y 5, 0.
Description
Suspensión de una proteína de
EPI-hNE, método para su preparación, un aerosol en
forma de polvo seco derivado de la misma, compuestos farmacéuticos
que comprenden dicha suspensión o dicho aerosol y sus
utilizaciones.
La presente invención se refiere a una suspensión
de partículas cristalizadas de una proteína de
EPI-hNE, a métodos para preparar dicha suspensión, a
un aerosol en forma de polvo seco derivado de dicha suspensión, a
una formulación farmacéutica inhalable que comprende dicha
suspensión o dicho aerosol en forma de polvo seco, y a la
utilización de dicha formulación farmacéutica inhalable para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de diferentes
estados patológicos.
La solicitud de patente internacional WO 96/20278
de Ley y otros, describe una serie de nuevas proteínas realizadas
por ingeniería genética que inhiben la elastasa neutrófila humana
(hNE). Tal como se ha indicado en la solicitud de patente antes
citada, la elastasa neutrófila humana (también conocida como
leucocito elastasa) es una de las proteasas neutras más importantes
de los granos azurófilos de leucocitos polimorfonucleares. Esta
encima está involucrada en la eliminación de patógenos, y en la
estructuración de tejidos conectivos.
El principal inhibidor sistémico de hNE es el
inhibidor \alpha-1-proteasa,
anteriormente conocido como \alpha1 antitripsina. En una serie de
situaciones patológicas (desórdenes hereditarios, bronquitis
crónica, enfisema, fibrosis cística), este inhibidor o bien no se
encuentra presente en cantidades suficientes en flujo sanguíneo o es
inactivado, conduciendo a actividad elastolítica incontrolada de
hNE, que provoca una extensa destrucción de los tejidos
pulmonares.
Por esta razón, la patente WO 96/20278 propone
nuevas proteínas que son estables, no tóxicas, inhibidoras de alta
eficacia de hNE. Estos inhibidores forman parte de un grupo de
inhibidores derivados de un dominio inhibitorio de tipo Kunitz
hallado en un inhibidor de tripsina pancreática básico (BPTI) o una
proteína de origen humano, es decir, la cadena ligera de inhibidor
humano Inter-\alpha-tripsina
(ITI). Son entre otros, EPI-hNE-1,
EPI-hNE-2,
EPI-hNE-3 y
EPI-hNE-4. Los inhibidores de WO
96/20278 son producidos por métodos de biotecnología y contienen
secuencias de ADN modificadas con respecto a los dominios biológicos
de Kunitz, que los hacen muy potentes. Uno de estos inhibidores,
EPI-hNE-4, es de particular
interés.
La patente WO 96/20278 describe la preparación de
sistemas de producción de Pichia pastoris para los
inhibidores hNE: EPI-hNE1,
EPI-hNE2, EPI-hNE-3
y EPI-hNE-4, producción y
purificación de proteínas (ver particularmente los Ejemplos
10-15).
La cepa mutante GS115 de la levadura Pichia
pastoris conteniendo un gen no funcional de histidinol
dehidrogenasa (his4) fue transformada por plásmidos de expresión que
comprendían la secuencia codificadora del factor alfa prepropéptido
de S. cerevisiae fusionado directamente al término amino del
inhibidor hNE deseado, bajo control del gen promotor de aox1 P.
pastoris de la parte superior y de la terminación de
transcripción aox1 de la parte inferior y secuencias de
poliadenilación. Los plásmidos de expresión fueron linealizados por
digestión Sacl y el ADN lineal fue incorporado por recombinación
homóloga en el genoma de la cepa GS115 de P. pastoris por
transformación de esferoplastos, selección para crecimiento en
ausencia de histidina añadida y rastreo por fenotipo de utilización
de metanol, niveles de secreción y dosis de genes (estimada por
transferencia Southern Blot). De este modo se seleccionaron cepas
que se estimaba que tenían unas cuatro copias del plásmido de
expresión integrado como conjunto tándem en el lugar genético
aoxl.
En primer lugar, se cultivaron cultivos de cepas
seleccionadas en forma de lote con glicerina como fuente de carbono,
y a continuación, después del agotamiento de la glicerina se
cultivaron en modalidad de alimentación con glicerina limitada para
incrementar adicionalmente la masa celular y rebajar el promotor de
aoxl, y finalmente en modalidad de alimentación con limitación de
metanol. Durante esta última fase, el promotor aox1 es completamente
activo y la proteína es segregada al medio de cultivo.
A continuación, la proteína
EPI-hNE es purificada. El proceso específico de
purificación varía con las características específicas de cada
proteína. De modo breve, el medio de cultivo es centrifugado, el
sobrenadante es sometido a microfiltración y posteriormente a
ultrafiltración, opcionalmente a diafiltración, y a continuación la
proteína es recuperada por precipitación por sulfato amónico y
cromatografía de intercambio de iones.
La solicitud de patente europea No. 00203049.2 y
la solicitud de patente internacional PCT/FR01/02699 que reivindica
prioridad de aquélla presentada por la misma sociedad solicitante,
describe un método mejorado para la purificación de la proteína
EPI-HNE de calidad farmacéutica, a partir del medio
de cultivo de una cepa principal o huésped para la expresión de
dichas proteínas, que comprende las siguientes etapas:
- -
- (a) pasar una parte derivada del medio de cultivo sobre un lecho expandido de un adsorbente de intercambio catiónico a efectos de recuperar un eluido,
- -
- (b) conducir la separación de proteínas, de acuerdo con su hidrofobicidad, del eluido resultante.
- -
- (c) pasar el eluido resultante sobre una columna de intercambio catiónico,
- -
- (d) filtrar opcionalmente el medio resultante en condiciones estériles, y
- -
- (e) liofilizar opcionalmente el filtrado resultante a efectos de recuperar la proteína EPI-HNE.
La solución obtenida al final de la etapa (d) o
un material en polvo secado por congelación obtenido del mismo, se
puede utilizar para preparar la suspensión de acuerdo con la
presente invención, siendo capaz dicha suspensión de ser incorporada
en una formulación farmacéutica inhalable de acuerdo con la
invención.
La sociedad solicitante, que ha perfeccionado un
método de purificación de las proteínas EPI-hNE,
particularmente EPI-hNE-4, ha
dedicado a continuación una gran cantidad de esfuerzos y de
investigación al desarrollo de compuestos farmacéuticos que
contienen las proteínas EPI-hNE purificadas.
En realidad, la sociedad solicitante se ha
concentrado en el desarrollo de un compuesto farmacéutico inhalable
que contiene una solución de
Epi-hNE-4. No obstante, en el curso
del desarrollo del producto, se ha descubierto que la solución de
Epi-hNE-4, una vez dispuesta en el
atomizador, era inestable y tendía a precipitar enturbiando la
solución.
Se creía en primer lugar que la forma precipitada
de la proteína sería terapéuticamente inactiva. No obstante, en una
forma sorprendente e inesperada, se descubrió que la forma
precipitada era una forma cristalizada de EPI-hNE4 y
que esta cristalización no afectaba de manera adversa la actividad
de la proteína. El término "forma cristalizada de
EPI-hNE4" significa en esta descripción una forma
insoluble de esta proteína que tiene estructura de bacilos o
varillas y un tamaño de partículas especialmente inferior a 10
\mum.
La sociedad solicitante ha dirigido sus esfuerzos
al desarrollo de la suspensión de las proteínas
EPI-hNE en la que la proteína se encontraría en
forma cristalina, siendo capaz dicha suspensión de ser incorporada
en un compuesto farmacéutico, en particular una formulación
farmacéutica inhalable.
Se ha descubierto de manera sorprendente que era
posible preparar una suspensión estable a temperatura ambiente a
ciertas condiciones específicas de concentración y de pH,
permitiendo de esta manera la preparación de compuestos
farmacéuticos que incorporan dicha suspensión que son estables a
temperatura ambiente. Esta estabilidad a temperatura ambiente es de
particular importancia para tratamientos ambulatorios.
La utilización de una suspensión de proteínas
EPI-hNE, en vez de una solución, constituye una
principal ventaja en la preparación de compuestos farmacéuticos
inhalables, dado que permiten el desarrollo de una formulación más
concentrada en substancia activa, permitiendo de esta manera la
administración del medicamento dentro de un periodo de tiempo más
corto.
Éste es un factor importante en la administración
de medicamentos inhalables, dado que el periodo de tiempo de
inhalación necesario puede ser largo, lo que se considera una
limitación importante, y por lo tanto puede llevar a poca aceptación
por parte del paciente.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
una suspensión de proteína EPI-hNE, la cual se
caracteriza porque dicha proteína EPI-hNE se
encuentra presente en forma de partículas cristalinas que tienen
principalmente el tamaño de partículas comprendido entre 1 y 6
\mum, en particular entre 3 y 6 \mum, según determinación por
granulometría láser, estando comprendida la concentración de la
suspensión de la proteína EPI-hNE entre 1 y 80
mg/ml, preferentemente entre 2 y 50 mg/ml, dependiendo
preferentemente de modo más preferente de la cantidad de proteína
EPI-hNE requerida por el tratamiento del estado
terapéutico en un vehículo acuoso a un pH comprendido entre 3 y 8,
preferentemente entre 4 y 6, más preferentemente a un pH de 4,0 a
5,0.
La suspensión antes mencionada es estable en
cuanto a actividad biológica y distribución de tamaños de partículas
durante un periodo mínimo de dos meses a temperatura ambiente.
El vehículo acuoso es preferentemente una
solución salina que tiene presión isosmótica.
La solución salina puede comprender acetato
sódico y cloruro sódico o citrato sódico.
La proteína EPI-hNE es
seleccionada de manera adecuada del grupo que consiste en
EPI-hNE-1,
EPI-hNE-2,
EPI-hNE-3, y
EPI-hNE-4, preferentemente
EPI-hNE-3 o
EPI-HN34. Más preferentemente es
EPI-hNE4.
La suspensión indicada comprende preferentemente
un mínimo de 65% de las partículas cristalinas de
EPI-HNE4 con tamaño de partículas comprendido entre
3 y 6 \mum, según determinación por granulometría láser.
La masa inhalada de esta suspensión, determinada
en un nebulizador Pari LC-star, es aproximadamente
de 40 a 50%, lo que es un valor satisfactorio para una formulación
farmacéutica inhalable.
El MMAD (Diámetro, Aerodinámico de Masa Media) de
las gotitas nebulizadas que contienen partículas cristalizadas de
EPI-HNE4 es aproximadamente de 2 \mum, según
determinación por granulometría de impacto. Este valor MMAD es
adecuado para asegurar una fracción elevada respirable y efectiva
penetración en los pulmones.
Un polvo seco puede ser derivado de dicha
suspensión sometiendo, por ejemplo, a ésta última a centrifugación,
preferentemente después de ajustar su pH a 3,5-4,5,
separando el sobrenadante, secando suavemente en vacío la pastilla,
homogeneizando a continuación a efectos de individualizar las
partículas de los aglomerados. En estas condiciones se obtienen
partículas esferoidales, que en su mayor parte tienen un tamaño o
diámetro de partículas, comprendido entre 1 y 6 \mum, según
determinación por microscopia directa. El material en polvo seco
tiene una distribución de tamaños, comparable a la de la suspensión,
cuando se determina en solución por granulometría láser.
Un polvo seco puede ser también obtenido de una
solución de proteína EPI-hNE o de un material en
polvo liofilizado de proteína EPI-hNE.
La invención se refiere, por lo tanto, a un
material en forma de polvo seco que comprende partículas
esferoidales de EPI-hNE-4
principalmente con el tamaño de partículas o diámetro comprendido
entre 1 y 6 \mum, preferentemente, como mínimo, a 75% de las
partículas con un tamaño de partículas o diámetro entre 1 y 3
\mum, según determinación por microscopia directa y teniendo
principalmente unas dimensiones de partículas o diámetro entre 1 y 6
\mum, preferentemente, como mínimo, 60% de las partículas con un
tamaño de partículas o diámetro entre 1 y 3 \mum, según
determinación por granulometría láser. Este material en forma de
polvo seco se obtiene de manera adecuada por un método que comprende
las etapas de separar, en la suspensión antes mencionada de proteína
EPI-hNE, los cristales de la fase líquida,
descartando el agua residual y homogeneizando la torta compacta
fragmentable obtenida.
La presente invención se refiere también a un
polvo seco que comprende partículas esferoidales de
EPI-hNE-4, teniendo como mínimo, 90%
de las partículas un tamaño de partículas o diámetro entre 0,5 y 4,0
\mum, siendo el MMAD de 2,1 \mum aproximadamente, según
determinación por granulometría láser. Este valor MMAD es adecuado
para asegurar, cuando el polvo está dispersado en un propulsor
adecuado, una elevada fracción respirable y penetración efectiva en
los pulmones. El material en forma de polvo seco se puede obtener de
manera conveniente por un método que comprende la etapa de secado
por pulverización de una solución de proteína
EPI-hNE.
La invención se refiere también a una formulación
farmacéutica inhalable que comprende la suspensión anteriormente
indicada de proteína EPI-hNE-4 o un
aerosol de polvo seco que comprende el material en forma de polvo
seco antes indicado en un vehículo propulsor adecuado.
La invención se refiere, además, a métodos para
la preparación de una suspensión de la proteína
EPI-hNE, empezando en una solución de proteína
EPI-hNE o en un material en polvo secado por
liofilización.
Cuando se empieza en una solución de
EPI-hNE, un método adecuado para preparar la
suspensión comprende las siguientes etapas:
- (a) llevar el pH de la solución a un valor comprendido entre 3,5 y 4,5, para permitir la cristalización de la proteína EPI-hNE, y
- (b) llevar el pH a un valor comprendido entre 3,0 y 8,0.
Las anteriores etapas (a) y (b) se pueden llevar
a cabo de manera adecuada a una temperatura de 1 a 40ºC,
preferentemente de 4 a 30ºC.
Cuando se empieza en un material en polvo
liofilizado, un método adecuado para preparar la suspensión
comprende las siguientes etapas:
- (a) solubilizar la proteína EPI-hNE en un tampón que tenga un pH inferior a 3,0
- (b) llevar el pH de la solución a un valor comprendido entre 3,5 y 4,5, para permitir la cristalización de la proteína EPI-hNE, y
- (c) llevar el pH a un valor comprendido entre 3,0 y 8,0.
Las anteriores etapas (a), (b) y (c) se pueden
llevar a cabo de manera adecuada a una temperatura de 1 a 40ºC,
preferentemente de 4 a 30ºC.
La invención también se refiere a métodos para la
preparación de un polvo seco, tal como se define anteriormente
partiendo de la suspensión antes mencionada de la proteína
EPI-hNE, solución de material en polvo liofilizado
de la misma.
Cuando se empieza con una suspensión de proteína
EPI-hNE el método para la preparación del material
en polvo seco comprende las etapas de separación, en la suspensión
antes mencionada, de los cristales de la fase líquida, por ejemplo,
por centrifugación o filtrado en un filtro submicrónico, eliminar el
agua residual, utilizar de manera adecuada un método que no provoque
compactado importante de la torta de la fase sólida, por ejemplo,
por evaporación sólida a una temperatura inferior a 40ºC y una
presión ligeramente inferior a la presión atmosférica y
homogeneizando la torta sólida obtenida a efectos de individualizar
las partículas aglomeradas de manera adecuada mediante técnicas
conocidas en el sector de molturación, por ejemplo, utilizando un
Pulverisette 5 (modelo planetario) de Fritsch o bien un aparato de
molturación eléctrica Moulin JK de Laboratoire Moderne, París.
Cuando se empieza en una solución de proteína
EPI-hNE, un método adecuado para preparar el polvo
seco comprende las etapas siguientes:
- (a) llevar el pH de la solución a un valor comprendido entre 3,5 y 4,5, a efectos de permitir la cristalización de la proteína EPI-hNE.
- (b) separar, en la suspensión anterior, los cristales de la fase líquida, por ejemplo, por centrifugación o filtrado sobre un filtro submicrónico,
- (c) descartar el agua residual, utilizando de manera adecuada un método que no provoca un compactado extenso de la fase sólida, preferentemente por evaporación suave de una temperatura inferior a 40ºC y una presión ligeramente inferior a la atmosférica.
- (d) homogeneizar la torta sólida obtenida a efectos de individualizar las partículas aglomeradas, de manera adecuada por técnicas bien conocidas en el sector de molturación.
Las etapas (a) y (b) pueden ser llevadas a cabo
de manera adecuada a una temperatura de 1 a 40ºC, preferentemente de
4 a 30ºC.
Cuando se empieza en una solución de proteína
EPI-hNE, un método preferente comprende la etapa de
secar por pulverización esta solución. Los parámetros de esta etapa
pueden ser ajustados de manera conveniente para asegurar una
distribución de tamaños de partículas tal que aseguren, cuando el
material en polvo es dispersado en un vehículo propulsor adecuado,
una importante fracción respirable y una penetración efectiva en los
pulmones.
Cuando se empieza a partir de un material en
polvo liofilizado de proteína EPI-hNE un método
adecuado para preparar el material en polvo, comprende las
siguientes etapas:
- (a) solubilizar la proteína EPI-hNE en un tampón que tenga un pH inferior a 3,0
- (b) llevando el pH de la solución a un valor comprendido entre 3,5 y 4,5, a efectos de permitir la cristalización de la proteína EPI-hNE.
- (c) separar en la suspensión antes mencionada, los cristales de la fase líquida, preferentemente por centrifugación o filtrado en un filtro submicrónico,
- (d) eliminar el agua residual, de manera adecuada con utilización de un método que no provoque compactado extenso de la fase sólida en forma de torta, preferentemente por evaporación suave a una temperatura por debajo de 40ºC y una presión ligeramente inferior a la presión ambiente, y
- (e) homogeneizar la torta sólida obtenida a efectos de individualizar las partículas aglomeradas, de manera adecuada por técnicas bien conocidas en la técnica de molturación
Las anteriores etapas (a) y (b) pueden ser
llevadas a cabo de manera adecuada a una temperatura comprendida
entre 1 y 40ºC, preferentemente de 4 a 30ºC .
La presente invención se refiere también a la
utilización de la suspensión antes mencionada o aerosol de polvo
seco de una proteína EPI-hNE para la preparación de
medicamentos para el tratamiento de estados de enfermedad debidos a
actividad excesiva de hNE.
El estado de enfermedad puede ser, en particular,
cualquier desorden respiratorio o se puede seleccionar entre el
grupo que consiste en fibrosis cística, enfisema, ARDS (Síndrome de
Alteración Respiratoria Aguda) y COPD (Enfermedad Pulmonaria
Obstructiva Crónica).
Los ejemplos siguientes servirán para describir
mejor la invención, pero en modo alguno se tienen que considerar
como limitativos.
La siguiente descripción se comprenderá mejor
haciendo referencia a las figuras 1 a 3B.
La figura 1 es una micrografía de una pastilla
obtenida después de centrifugación de una suspensión de
EPI-HNE4 que muestra la estructura de varillas de
los cristales de EPI-hNE-4 en
presencia de agua.
La figura 2 es una micrografía de una gotita
nebulizada que tiene un diámetro aproximado de 2,5 \mum que
contiene una partícula cristalina en forma de varilla de
EPI-HNE4.
\newpage
Las figuras 3A y 3B son micrografías del polvo
seco que muestra la estructura esferoidal de las partículas
EPI-hNE4 en forma seca.
Los inhibidores hNE son producidos en forma de
proteínas segregadas en los sobrenadantes de cultivos de alta
densidad de células de Pichia pastoris de fermentaciones de
la cepa GS115.
Los plásmidos de expresión son construídos por
ligado de las secuencias sintéticas de ADN que codifican la
Saccharomyces cerevisiae acoplando directamente el factor
\alpha prepropéptido directamente al término de 5' del ADN
sintético que codifica el inhibidor hNE deseado. El gen de fusión es
comprendido en forma de sandwich entre un promotor de gen P.
pastoris aox1 inducible de forma ascendente y una terminación de
transcripción de gen aox1 descendente y secuencias de
poliadenilación que son llevadas a cabo en un plásmido que también
codifica un gen S. cerevisiae his4.
La expresión linealizada de ADN de plásmido es
incorporada por recombinación homóloga en el genoma de la cepa GS115
del P. pastoris por transformación de esferoplastos. Los
esferoplastos regenerados son seleccionados para crecimiento en
ausencia de histidina añadida. Los aislados individuales son
rastreados para el fenotipo de utilización de metanol (mut +),
niveles de secreción, y número de copias de gen. La cepa
PEY-53 que segrega un elevado nivel de
EPI-HNE-4 fue seleccionada de modo
correspondiente. Esta cepa se estima mediante análisis Southern de
ADN genómico conteniendo cuatro copias del plásmido de expresión de
ADN integrado en el locus del gen aox1.
Se cultivan cepas PEY-53 de P.
pastoris en fermentaciones de alimentación de tipo mixto de
forma similar al procedimiento descrito en WO 96/20278, con la
diferencia de que se utiliza aire a presión en vez de oxígeno
purificado. De modo breve, los cultivos son cultivados en primer
lugar por lotes con glicerina como fuente de carbono. Después de la
eliminación de la glicerina, los cultivos son cultivados durante
unas cuatro horas en modalidad de alimentación de limitación de
glicerina para incrementar adicionalmente masas celulares y reducir
el promotor aox1. En la producción final, los cultivos son
cultivados en modalidad de alimentación limitada de metanol. Durante
esta fase, el promotor aox1 es completamente activo y los
inhibidores de hNE son segregados al medio condicionado (C.M). La
concentración final de EPI-hNE-4 en
la fermentación de PEY-53 C.M. era aproximadamente
de 1000 mg/l determinada por análisis SDS-PAGE y
RP-HPLC. La especie molecular más importante
producida por cultivos PEY-53 es la proteína
EPI-hNE-4 debidamente procesada. No
obstante, esta cepa segrega también aproximadamente
5-20% de proteína que tiene un peso molecular
ligeramente más elevado que representa presumiblemente proteína
EPI-hNE-4 procesada de manera
alternativa. La EPI-hNE-4 procesada
de manera correcta puede ser purificada substancialmente libre de
estos contaminantes, tal como se describe más adelante. 100 l del
PEY-53 CM obtenido tal como se describe en el
Ejemplo 1 fueron recogidos y pasados sobre un lecho expandido del
modo siguiente: 10 l de matriz cromatográfica (Streamline SP de
Amersham-Pharmacia) son equilibrados en 50 mM de
acetato amónico pH 3,5 y fluidizados en el mismo tampón a 30 l a 300
cm/h. Después de la carga, la columna es lavada en 10 mM de acetato
amónico pH 3,5 obteniendo una absorción en 280 nm por debajo de
0,05. Los gránulos son envasados a 10 l y
EPI-hNE-4 se recupera por lavado de
la columna en 1 M de acetato amónico pH 4,5 tampón.
De este modo, se obtuvieron 10 l de una solución
conteniendo aproximadamente 100 g de EPI-hNE4
(determinado por ensayo espectrométrico a 280 nm, por
RP-HPLC, ensayo de proteína Coomassie y ensayo de
actividad biológica).
El ensayo de proteínas RP-HPLC
(columna de sílice Licrosphere 100RP de Pharmacia/gradiente de agua
+ 1% TFA y acetonitrilo + 1% TFA) demostraron que la forma procesada
alternativamente no está separada de la forma correcta. La
contaminación por contaminantes verdes es también detectable.
La solución fue sometida a filtrado estéril en un
filtro de 22 \mum (Millipack 200 de la firma Millipore) antes de
otra purificación adicional.
Se llevó a cabo cromatografía de interacción
hidrofóbica haciendo pasar los 10 l de solución antes mencionados
por un sistema BioProcess (Pharmacia), utilizando una matriz Fast
Flow de fenil sefarosa de la firma Pharmacia en la columna de 15 l
BPTG de la firma Pharmacia. Los tampones utilizados fueron A:
acetato sódico 50mM pH 4,5 + 1M NaCl, y B: acetato sódico 50 mM pH
4,5. La elución fue llevada a cabo en una etapa a 100% B con un
caudal de 300 cm/h.
El eluido contenía unos 50 g de
EPI-hNE4 purificado (determinado por ensayo
espectrofotométrico a 280 nm, ensayo de proteína Coomassie y ensayo
de actividad biológica).
El ensayo RP-HPLC demostró que la
forma procesada alternativamente no se encontraba separada. No se
pudieron detectar pigmentos verdes.
A continuación se llevó a cabo cromatografía de
intercambio catiónico utilizando un sistema cromatográfico
Bioprocess de la firma Pharmacia. La matriz utilizada era la matriz
Macroprep High S de BioRad (matriz rígida basada en metacrilato
reticulado soportando grupos superficiales de sulfonato), en una
columna 15 l BPG200 de Pharmacia. Los tampones utilizados fueron A:
acetato amónico 10 mM pH 3,5, B: acetato sódico 50 mM pH 6,2 y C:
bicarbonato amónico 10 mM pH 7,8. Una primera elución en el tampón
B fue utilizada para separar la forma procesada incorrectamente. La
elución se llevó a cabo a continuación en una etapa a 100% B con un
caudal de 300 cm/h.
El eluido contenía aproximadamente 40 g de
EPI-hNE4 purificada (determinado por ensayo
espectrométrico 280 nm, ensayo de proteínas Coomassie y ensayo de
actividad biológica), correspondiendo a un rendimiento por medio del
proceso de purificación de 40% aproximadamente.
El RP-HPLC demostró menos de 1,5%
de la forma procesada de manera alternativa. No eran detectables
pigmentos verdes.
El eluido fue secado en congelación y mantenido a
-20ºC.
Empezando del material en polvo liofilizado de
EPI-hNE4 obtenido en el Ejemplo 1, se prepararon 12
lotes de las siguientes suspensiones de EPI-HNE4
utilizando el método que se describe más adelante.
Formulación 10/4: suspensión de 10 mg/l
EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y cloruro
sódico de pH 4,0
Formulación 10/5: suspensión de 10 mg/l
EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y cloruro
sódico de pH 5,0
Formulación 5/4: suspensión de 5 mg/l
EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y cloruro
sódico de pH 4,0
Formulación 5/5: suspensión de 5 mg/l
EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y cloruro
sódico de pH 5,0
Formulación 2,5/4: suspensión de 2,5 mg/l
EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y cloruro
sódico de pH 4,0
Formulación 2,5/5: suspensión de 2,5 mg/l
EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y cloruro
sódico de pH 5,0
Formulación 20/4 (4ºC): suspensión de 20
mg/l EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y
cloruro sódico de pH 4,0, preparada a una temperatura de 4ºC.
Formulación 20/4 (30ºC): suspensión de 20
mg/l EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y
cloruro sódico de pH 4,0, preparada a una temperatura de 30ºC.
Formulación 30/4 (4ºC): suspensión de 30
mg/l EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y
cloruro sódico de pH 4,0, preparada a una temperatura de 4ºC.
Formulación 30/4 (30ºC): suspensión de 30
mg/l EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y
cloruro sódico de pH 4,0, preparada a una temperatura de 30ºC.
Formulación 50/4 (4ºC): suspensión de 50
mg/l EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y
cloruro sódico de pH 4,0, preparada a una temperatura de 4ºC.
Formulación 50/4 (30ºC): suspensión de 50
mg/l EPI-hNE4 en solución de acetato sódico y
cloruro sódico de pH 4,0, preparada a una temperatura de 30ºC.
Una solución de 15 mg/ml de
EPI-hNE-4, a pH 3,0, es preparada
del modo siguiente: 140 mg de
EPI-hNE-4 en polvo son solubilizados
en 7 ml de un tampón de 10 mM de acetato sódico pH 3,0. El pH se
lleva a 2,0 con 1M ácido clorhídrico (HCl). Después de disolución,
la solución fue filtrada sobre un filtro MediaKap 5 y el pH fue
llevado a pH 3,0 utilizando hidróxido sódico 1M (NaOH).
La concentración de proteína fue comprobada por
espectrofotometría UV y la solución fue diluida con 10 mM de acetato
sódico hasta la concentración de 15 mg/ml.
A medio volumen de acetato sódico 10 mM se
añadió 2,4% de cloruro sódico pH12 obteniendo una solución de 10
mg/ml EPI-hNE-4, pH 4,0. En caso
necesario el pH se ajustó a 4\pm0,1 con 1M HCl o 1M hidróxido
sódico.
La solución fue transferida a un recipiente de
cristal y se dejó cristalizar durante una noche a temperatura
ambiente.
Se centrifugó una muestra de 50 \mul y la
pastilla tomada para análisis microscópico con contraste de
fase.
La figura 1 es una micrografía de esta pastilla
que muestra una estructura parecida a varillas de los cristales de
EPI-hNE-4.
La suspensión es homogeneizada, y a continuación
medio volumen es transferido a otro recipiente de vidrio y es
llevada a pH 5,0 con 1M NaOH. En este punto, las suspensiones de pH
4,0 y 5,0 son diluidas repetidamente según sea necesario para
obtener concentraciones de 5 mg/ml y 2,5 mg/ml.
Se prepararon formulaciones 20/4 (4ºC), 20/4
(30ºC), 30/4 (4ºC), 30/4 (30ºC), 50/4 (4ºC) y 50/4 (30ºC)
substancialmente igual que se ha descrito anteriormente partiendo de
30, 45 y 75 mg/l soluciones de EPI-hNE4
respectivamente, llevándose a cabo todas las etapas a una
temperatura de 4ºC o a una temperatura de 30ºC, dejándose la
solución para cristalizar durante un periodo de 72 horas. No se
observó diferencia significativa en la quinética de la
cristalización entre estas dos temperaturas.
La granulometría de partículas
EPI-HNE4 en las suspensiones preparadas en el
Ejemplo 2 fue analizada en un Coulter Multisizer II. Algunos de los
resultados se indican en la siguiente Tabla 1.
[EPI-HNE-4] mg/ml | pH | Porcentaje de partículas con un tamaño de partículas o diámetro entre 3 y 6 \mum |
10 | 4,0 | 67,25 |
10 | 5,0 | 65,65 |
5 | 4,0 | 69,27 |
5 | 5,0 | 68,55 |
2,5 | 4,0 | 71,13 |
20 (4ºC) | 4,0 | 87,3 |
20 (30ºC) | 4,0 | 84,2 |
30 (4ºC) | 4,0 | 85,1 |
30 (30ºC) | ,0 | 89,0 |
50 (4ºC) | 4,0 | 85,6 |
50 (30ºC) | 4,0 | 87,8 |
La Tabla anterior muestra que en cada una de las
suspensiones, como mínimo, 65% de las partículas tienen un diámetro
entre 3 y 6 \mum.
La actividad biológica de la suspensión de
EPI-hNE-4 fue confirmada midiendo el
nivel de inhibición de la elastasa neutrófila humana utilizando una
prueba colorimétrica.
La elastasa humana hidroliza el substrato
sintético de
N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida.
\newpage
Durante la hidrólisis, la
p-nitroanilida producida (color amarillo) queda
liberada. La actividad biológica de
EPI-hNE-4 es calculada de este modo
con respecto al nivel de inhibición de la elastasa humana, siguiendo
la disminución de la liberación de la
p-nitroanilida.
Se prepararon varias diluciones de una suspensión
de EPI-hNE-4, anotando la respectiva
concentración de proteína por espectrofotometría UV utilizando como
solución de dilución Tris 100 mM, NaCl 50 mM, Triton X100 0,25%, BSA
0,1%, pH 8,0.100 \mul de la 100 nM
EPI-hNE-4 diluida se añaden a tubos
de pruebas de 5 ml. Se añaden 100 \mul de hNE 100 nM en el mismo
tampón y las muestras diluidas son incubadas durante 15 minutos a
temperatura ambiente (no es necesaria agitación). Se añaden 100
\mul del sustrato 4,2 mM (tal como se ha descrito anteriormente),
y la mezcla es incubada durante 15 minutos a 37ºC, la reacción se
interrumpe por adición de 50 \mul de ácido acético glacial. Se
mide la absorbancia a 410 nm de longitud de onda, utilizando el
tampón solo y el hNE sin muestra
EPI-hNE-4 como controles.
La distribución de tamaños y la actividad
inhibitoria de EPI-hNE4 de 3 suspensiones de
EPI-hNE-4 concentraciones 2,5, 5 y
10 mg/ml a pH 5,0 y 3 suspensiones de
EPI-hNE-4 concentraciones 20, 30 y
50 mg/ml a pH 4,0 se analizaron durante un periodo de dos meses, a
efectos de verificar su estabilidad.
Las suspensiones fueron preparadas de acuerdo con
el método obtenido en el Ejemplo 2. Tres viales de cada suspensión
fueron almacenados a temperatura ambiente durante dos meses para las
3 suspensiones de EPI-hNE-4 con
concentraciones de 2,5, 5 y 10 mg/ml a pH 4,0 y a 4ºC para las 3
suspensiones de EPI-hNE-4 con
concentraciones de 20, 30 y 50 mg/ml a pH 4,0.
Se determinó la actividad biológica de las
suspensiones al inicio y al final del periodo de dos meses
utilizando el ensayo de inhibición de elastasa neutrófila humana por
vía colorimétrica, tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo 4.
No se observó diferencia significativa alguna entre el inicio y el
final del periodo de dos meses.
La distribución de tamaños de las partículas se
midió por granulometría láser utilizando un Coulter Multisizer II al
inicio y al final del periodo de dos meses. No hay modificación
significativa en la distribución de tamaños de la suspensión de
EPI-HNE4 10 mM a pH 5,0 después de un periodo de dos
meses de almacenamiento a temperatura ambiente.
La distribución de tamaños y la actividad
inhibitoria de EPI-HNE4 de la suspensión de
EPI-hNE-4 con concentraciones de 10
mg/ml a pH 5,0 no mostró ningún cambio significativo después de 10
meses de almacenamiento a temperatura ambiente.
La suspensiones preparadas en el Ejemplo 2 fueron
nebulizadas en un nebulizador de chorro Pari
LC-star.
La masa inhalable, determinada según
procedimientos bien conocidos en esta técnica, fue de
40-50%, que es un valor satisfactorio para la
formulación farmacéutica inhalable.
La distribución de tamaños de partículas
nebulizadas fue analizada por granulometría láser en un Coulter
Multisizer II. El MMAD era de 3-4 \mum.
La distribución de tamaños de partículas
nebulizadas fue analizada por granulometría de impacto sobre
sucesivos filtros de 8,0 \mum, 6,0 \mum, 4,0 \mum, 3,0 \mum,
2,0 \mum, 1,5 \mum 1,0 \mum, 0,75 \mum, 0,5 \mum, y 0,25
\mum de acuerdo con procedimientos bien conocidos en esta técnica.
Para cada una de las suspensiones comprobadas se encontró un MMAD de
unas 2 \mum.
La figura 2 es una micrografía de una gotita
nebulizada que tiene un diámetro aproximado de 2,5 \mum y que
contiene una partícula cristalina de EPI-hNE4 en
forma de varilla
15 mg/ml de solución de
EPI-hNE-4, pH 3,0, fue preparada del
modo siguiente: se solubilizaron 140 mg de
EPI-hNE-4 en forma de polvo en 7 ml
de un tampón de acetato sódico 10 mM a pH 3,0. El pH es llevado a
2,0 con ácido clorhídrico 1M (HCl). Después de disolución, la
solución fue filtrada sobre un filtro MediaKap 5 y el pH se llevó a
pH 3,0 utilizando hidróxido sódico 1M (NaOH).
La concentración de proteína fue comprobada por
espectrofotometría UV y la solución fue diluida con acetato sódico
10 mM hasta una concentración de 15 mg/ml.
A medio volumen de acetato sódico 10mM, se
añadieron 2,4% de cloruro sódico pH 12 para obtener una solución de
10mg/ml EPI-hNE-4, pH 4,0. En caso
necesario, el pH puede ser ajustado a 4\pm0,1 con 1M HCl o 1M
hidróxido sódico.
La solución fue transferida a un recipiente de
cristal y se dejó cristalizar durante 72 horas a temperatura
ambiente.
La suspensión fue filtrada en un filtro de 0,22
\mum. El filtro fue recubierto y secado durante una noche en un
secador conteniendo gel de sílice azul (sistema que permite la
evaporación gradual del agua). Se recuperó un polvo compacto
disgregable en el filtro. Se llevó a cabo una homogeneización
mecánica manual simple utilizando un mortero, lo que da lugar a un
polvo visualmente muy fino y homogéneo.
Este material en polvo fue observado directamente
al microscopio sobre una placa Thomas. La figura 3A es una
micrografía del material en polvo mostrando la estructura irregular
esferoidal de la EPI-HNE4 en forma seca, poseyendo
la mayor parte de las partículas individuales un diámetro de
partículas comprendido entre 1 y 6 \mum. Las zonas oscuras de la
micrografía representan probablemente superposición de partículas
individuales o aglomerados remanentes de la muestra homogeneizada
manualmente de forma insuficiente.
El análisis estadístico del diámetro de las
partículas individuales (media de las partículas más grandes y de
las de menor diámetro esferoidales) medidas directamente al
microscopio con placas Thomas mostraron en las micrografías que la
mayor parte (más del 80 %) de las partículas tienen un diámetro (o
dimensiones de partículas) comprendido entre 1 y 6 \mum, como
mínimo, 75% de las partículas tienen un diámetro (o dimensiones de
partículas) entre 1 y 3 \mum. El diámetro medio de las partículas
(o dimensiones de las partículas) es aproximadamente de 2,1 \mum y
el diámetro medio (o tamaño de las partículas) es de 2,33 \pm 0,18
\mum.
El material en polvo fue dispersado en una
solución de NaCl al 1% y analizado por granulometría láser en un
Coulter Multisizer II. El análisis estadístico completo de los datos
de la granulometría láser mostró una distribución de tamaños de
partículas muy similar a la obtenida en el Ejemplo 3, teniendo como
mínimo 65% de las partículas un diámetro (o tamaño de partículas)
entre 1 y 6 \mum.
Se preparó una suspensión de 10 mg/ml de
EPI-hNE4 a pH 5,0 a partir de este material en polvo
por un procedimiento muy similar al descrito en el Ejemplo 2. La
actividad biológica de la suspensión fue determinada utilizando el
ensayo de inhibición de elastasa neutrófila humana por vía
colorimétrica, tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo 4.
Esta actividad biológica no era significativamente distinta de la
determinada para la suspensión de 10 mg/ml de
EPI-hNE4 a pH 5,0 del Ejemplo 5.
Se preparó un polvo seco a partir de 2 l de
suspensión obtenida durante la producción de los lotes anteriores de
EPI-hNE-4.
La suspensión fue centrifugada durante 30 minutos
a 10000 g. El supernadante fue eliminado y la pastilla resultante
fue homogeneizada en 100 ml de tampón de bicarbonato amónico 10 mM.
La suspensión fue filtrada en un filtro de 0,22 \mum. El filtro
fue recuperado y secado durante una noche en un secador que contenía
gel de sílice azul (sistema que permite la evaporación gradual de
agua). Se recuperaron cuatro gramos de un material en polvo compacto
y disgregable a partir del filtro. Se llevó a cabo la
homogeneización utilizando un aparato de molturación eléctrico
Moulin JK de Laboratoire Moderne, París, dando lugar de este modo a
un polvo muy fino visualmente homogéneo.
La granulometría de este material en polvo fue
analizada en un aparato Malvern (Malvern Mastersizer 2000 (Malvern,
UK), dotado de un muestreador seco "Scirocco 2000".).
Los resultados demostraron que la mayor parte de
partículas (más del 80%) tienen un diámetro (o tamaño de partículas)
comprendido entre 1 y 6 \mum, poseyendo, como mínimo, 60% de las
partículas un díametro (o tamaño de las partículas) entre 1 y 3
\mum. El diámetro medio (o tamaño de partículas) era
aproximadamente de 2,66 \mum.
\newpage
1 g de EPI-hNE4 en forma de polvo
en forma cristalizada (Ejemplo 8) fue solubilizada en agua
conteniendo ácido clorhídrico al 1% con pH 2,5. Esta solución fue
secada por pulverización (atomización) utilizando un secador de mini
pulverización Buchi B191.A bajo las condiciones siguientes:
- diámetro interno del rociador: 0,7 mm
- caudal de rociado: 3,4 g/l
- presión de aire: 600 l/h
- caudal del aire de secado: 35 m^{3}/h
- temperatura de entrada del aire de secado:
120ºC
- temperatura de salida del aire de secado:
74-75ºC
El material en polvo fue observado de manera
directa al microscopio en una placa Thomas. La Figura 3B es una
micrografía del material en polvo mostrando la estructura esferoidal
irregular de EPI-HNE4 en forma seca, poseyendo la
mayor parte de las partículas un tamaño de partículas o diámetro
comprendido entre 1 y 3 \mum. La ausencia de zonas oscuras
comparado con la figura 3A muestra la homogeneidad satisfactoria del
material en polvo.
La distribución de tamaños de las partículas de
material en polvo fue analizada por granulometría láser utilizando
un dispositivo Malverne Multisizer 2000 dotado de un muestreador
seco Scirocco 2000.
Los resultados demostraron que el 90% de las
partículas tienen un tamaño o diámetro de partículas de
0,5-4,0 \mum, el 75% un diámetro o tamaño de
partículas de 0,5-2,8 \mum, 60% un diámetro de
partículas de 0,5-2,2 \mum, siendo el MMAD de 2,16
\mum.
La determinación de la actividad biológica
específica de material en polvo, tal como se describe en el Ejemplo
4, mostró que la proteína era completamente activa.
Claims (16)
1. Suspensión de una proteína
EPI-hNE, cuya suspensión se caracteriza
porque la proteína EPI-hNE se encuentra presente en
forma de partículas cristalinas que en su mayor parte tienen un
diámetro o dimensión de partículas comprendido entre 1 y 6 \mum,
en particular entre 3 y 6 \mum, determinado por granulometría
láser, estando comprendida la concentración de la suspensión en
EPI-hNE entre 1 y 80 mg/ml, preferentemente entre 2
y 50 mg/ml, en un vehículo acuoso a un pH comprendido entre 3 y 8,
preferentemente entre 4 y 6, y más preferentemente a un pH
comprendido entre 4,0 y 5,0.
2. Suspensión, según la reivindicación 1, en la
que el vehículo acuoso es una solución salina que tiene presión
iso-osmótica.
3. Suspensión, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la solución salina comprende
acetato sódico y cloruro sódico o citrato sódico.
4. Suspensión, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la proteína
EPI-hNE es EPI-hNE4.
5. Suspensión, según la reivindicación 4, en la
que, como mínimo, el 65% de las partículas cristalinas de
EPI-hNE-4 tienen un tamaño de
partículas o diámetro comprendido entre 3 y 6 \mum, determinado
por granulometría láser.
6. Suspensión, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que es apropiada para proporcionar
después de nebulización gotitas nebulizadas que contienen
EPI-HNE4 en partículas cristalizadas que tienen un
MMAD de 2 \mum, aproximadamente determinado por granulometría de
impacto.
7. Polvo seco que contiene partículas
esferoidales de EPI-hNE-4 que tienen
principalmente un tamaño de partículas o diámetro comprendido entre
1 y 6 \mum, preferentemente, como mínimo, 75% de las partículas
con un diámetro o tamaño de partículas entre 1 y 3 \mum,
determinado por microscopia directa.
8. Polvo seco que contiene partículas
esferoidales de EPI-hNE-4 que tienen
principalmente un tamaño de partículas o diámetro comprendido entre
1 y 6 \mum, preferentemente, como mínimo, 60% de las partículas
con un diámetro o tamaño de partículas entre 1 y 3 \mum,
determinado por granulometría láser.
9. Polvo seco que comprende partículas
esferoidales de EPI-hNE-4 poseyendo,
como mínimo, 90% de las partículas un diámetro o tamaño de
partículas entre 0,5 y 4,0 \mum, siendo el MMAD aproximadamente de
2,1 \mum determinado por granulometría láser.
10. Formulación farmacéutica inhalable que
comprende una suspensión de una proteína EPI-hNE de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un aerosol
de polvo seco que comprende un polvo seco, según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en un vehículo propulsor adecuado.
11. Método para la preparación de la suspensión
de proteína EPI-hNE, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende, partiendo de una solución que
contiene proteína EPI-hNE, las siguientes
etapas:
- (a)
- llevar el pH de la solución a un valor comprendido entre 3,5 y 4,5, para permitir la cristalización de la proteína EPI-hNE, y
- (b)
- llevar el pH a un valor comprendido entre 3,0 y 8,0.
12. Método para la preparación de la suspensión
de proteína EPI-hNE, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende, partiendo de un material en
polvo liofilizado de una proteína EPI-hNE, las
siguientes etapas:
- (a)
- solubilizar la proteína EPI-hNE en un tampón que tiene un pH inferior a 3,0
- (b)
- llevar el pH de la solución a un valor comprendido entre 3,5 y 4,5, a efectos de permitir la cristalización de la proteína EPI-hNE, y
- (c)
- llevar el pH a un valor comprendido entre 3,0 y 8,0.
13. Método para la preparación de un polvo seco,
tal como se define en la reivindicación 7 u 8, que comprende las
etapas de separar en una suspensión, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, los cristales de la fase líquida,
descartando el agua residual y homogeneizando la torta compacta
disgregable obtenida.
14. Método para la preparación de un material en
polvo seco, según la reivindicación 9, que comprende la etapa de
secar por pulverización una solución de proteína
EPI-hNE.
15. Utilización de una formulación farmacéutica
inhalable, según la reivindicación 10, para la preparación de un
medicamento para tratar un estado de enfermedad debido a actividad
excesiva de hNE.
16. Utilización, según la reivindicación 15, en
la que el estado es un desorden respiratorio o es seleccionado entre
fibrosis cística, enfisema, ARDS (Síndrome de Alteración
Respiratoria Aguda) y COPD (Enfermedad Pulmonaria Obstructiva
Crónica).
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Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US6057287A (en) | 1994-01-11 | 2000-05-02 | Dyax Corp. | Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof |
DK1531791T3 (da) | 2002-06-07 | 2010-11-01 | Dyax Corp | Forebyggelse og begrænsning af iskæmi |
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US20040265238A1 (en) * | 2003-06-27 | 2004-12-30 | Imtiaz Chaudry | Inhalable formulations for treating pulmonary hypertension and methods of using same |
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KR100770362B1 (ko) * | 2004-12-30 | 2007-10-26 | (주)두비엘 | 분무건조 고분자형 콜렉틴족 단백질 및 그의 제조방법 |
AU2008289005A1 (en) * | 2007-08-21 | 2009-02-26 | Genzyme Corporation | Treatment with kallikrein inhibitors |
WO2010080833A1 (en) | 2009-01-06 | 2010-07-15 | Dyax Corp. | Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors |
LT3459564T (lt) | 2010-01-06 | 2022-03-10 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Plazmos kalikreiną surišantys baltymai |
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AU2015235967B2 (en) | 2014-03-27 | 2020-10-22 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Compositions and methods for treatment of diabetic macular edema |
CO2018007151A2 (es) | 2015-12-11 | 2018-09-20 | Dyax Corp | Inhibidores de calicreína plasmática y usos de los mismos para tratar ataque de angioedema hereditario |
CN110141561A (zh) * | 2018-03-29 | 2019-08-20 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种可气溶胶化蛋白干粉吸入剂的制备技术 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5663143A (en) * | 1988-09-02 | 1997-09-02 | Dyax Corp. | Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase |
US5148381A (en) * | 1991-02-07 | 1992-09-15 | Intel Corporation | One-dimensional interpolation circuit and method based on modification of a parallel multiplier |
DE573603T1 (de) * | 1991-03-01 | 1999-05-06 | Dyax Corp | Hemmstoffe für menschliche neutrophile elastase und menschliches kathepsin g. |
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