JP2986215B2 - Dnアーゼ含有医薬製剤 - Google Patents

Dnアーゼ含有医薬製剤

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    • C12Y301/21Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
    • C12Y301/21001Deoxyribonuclease I (3.1.21.1)

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願への相互参照 本出願は、その主題が1989年12月8日付けの米国特許
出願第07/448,038号、1988年12月23日付けの米国特許出
願第07/289,958号、および1992年6月8日付けの米国特
許出願第07/895,300号に含まれる開示内容に関連するも
のである。そのため、これら先行出願の内容を参考とし
てここに組み入れるものとする。

発明の分野 本発明は、ポリデオキシリボ核酸(DNA)を加水分解
し得るホスホジエステラーゼであるデオキシリボヌクレ
アーゼ(DNアーゼともいう)の製剤化に関する研究より
得られた結果に関わるものである。

本発明は、一般的には、個体の肺に投与するための医
薬製剤としての、治療上有効な形態のDNアーゼを含む配
合物の調製に関する。本発明は、このような配合物自
体、その臨床面での使用、並びにDNアーゼ配合物の調製
および使用方法に関する。

発明の背景 DNアーゼはポリデオキシリボ核酸を加水分解すること
ができるホスホジエステラーゼである。様々な生物種か
ら様々な程度にDNアーゼが精製されている。哺乳動物DN
アーゼの完全なアミノ酸配列は1973年に最初に得られ
た。例えば、Liaoら,J.Bio.Chem.248,1489(1973)を参
照のこと。

DNアーゼは多くの効能が知られており、治療目的で使
われてきた。その主な治療用途は、肺炎や嚢胞性線維症
のような疾患における肺分泌の粘弾性を低減せしめ、そ
れにより呼吸気道の浄化を助けることであった。例え
ば、Lourencoら,Arch.Intern.Med.142,2299(1982);Sh
akら,Proc.Nat.Acad.Sci.87,9188(1990);およびHubb
ardら,New England Journal of Medicine 326,812(199
2)を参照のこと。

ヒトDNアーゼをコードするDNAが単離され、その配列
が決定されている。そして組換え哺乳動物宿主細胞にお
いてそのDNAを発現させることにより、商業的量でのヒ
トDNアーゼの生産が可能となった。例えば、Shakら,Pro
c.Nat.Acad.Sci.87,9188(1990)を参照のこと。組換え
ヒトDNアーゼ(rhDNアーゼと記す)は、特にDNアーゼが
通常自然界で結合しているタンパク質やプロテアーゼ類
を含まない精製形態で、臨床上有効であることがわかっ
た。

ヒトDNアーゼを医薬として有効な形態で得るための手
段および方法は、先に引用した特許出願に記載されてい
る。DNアーゼの精製法としては、いろいろな特殊な方法
が当技術分野で知られている。例えば、1977年12月27日
付けのKhouwらによる米国特許第4,065,355号;Markey,FE
BS Letters 167,155(1984);およびNefskyら,Euro.Jo
urn.Biochem.179,215(1989)を参照のこと。

本出願は製剤化のためのDNアーゼの使用に基づくもの
である。DNアーゼはそのままで用いたり、アミド分解
(deamidated)形態と非アミド分解形態の混合物として
用いたり、または単離されたアミド分解形態もしくは非
アミド分解形態で用いたりすることができ、非アミド分
解ヒトDNアーゼがより活性の種であると見なされてい
る。このような形態の製造および分離は先に引用した特
許出願の主題となっている。

本発明は、治療効果を得るためにDNアーゼの生物活性
種が肺に直接投与されるようなDNアーゼ(上記の生物活
性形態のすべてを含む)の製剤化に向けられる。

DNアーゼは個体の肺の中でその治療効果を示すことか
ら、DNアーゼを治療上有効な形態で気道に付着させるこ
とが不可欠である。それゆえ、DNAアーゼの配合物はこ
のようなDNアーゼを生物活性形態で含むことが重要であ
り、また、効率のよい投与を確実なものとするために、
吸入した際に、DNアーゼが、好ましくは治療すべき個体
の肺の中に、生物活性形態で送り込まれるように製剤化
することが重要である。

まず初めに、吸入可能な乾燥粉末とするために、DNア
ーゼを多かれ少なかれ標準的な凍結乾燥法にかけた。凍
結乾燥法は治療効果を得るための適切な投与の必要条件
(すなわち、分散性、均一な粒子径、非凝集形態、生物
学的に活性な薬効成分)を満たす性質を備えた粉末が常
に得られるように管理することが困難である。

一般的に、噴霧乾燥法は化学工業、食品産業、生化学
および医薬品産業においてさまざまな用途で使われてい
る。例えば、「医薬品の噴霧乾燥(The Spray Drying o
f Pharmaceuticals)」と題するDrug Development and
Industrial Pharmacy 18(11 and 12),1169−1206(19
92)と、一般的には、米国特許第4,233,405号を参照の
こと。

噴霧乾燥は物質の加工法として次第に認められつつあ
り、抗生物質のような医薬品、とりわけ食品に使われて
きた。薬剤としてのタンパク質の噴霧乾燥は興味のもて
る新しい分野であり、従って、商業的には利用されてい
ない。

上述したような、必要とされる治療特性をもたない製
品につながる可能性がある噴霧乾燥法には多くの問題が
山積みしている。

例えば、Mumenthalerらは、1991年11月にワシントン
D.C.で開催された第6回AAPSミーティングにおいて実施
可能性の研究について提唱し、その後この研究をPharma
ceutical Research 11,12(1994)に発表した。この実
施可能性研究では2種類のタンパク質薬剤、すなわち組
換えヒト成長ホルモンおよび組換え組織型プラスミノー
ゲンアクチベーター、を噴霧乾燥する試みが報告され
た。この研究において、タンパク質は加工中に熱変性を
受けやすく、それゆえ、治療目的にかなう生物活性を示
さなくなる恐れがあるため、治療用タンパク質への噴霧
乾燥の適用はむしろ研究されていないことが強調され
た。当技術分野でのこの先入観を裏付けるのに役立つ多
くの刊行物がこの報告書中に引用されている。

上記の研究では、ヒト成長ホルモンを約4%以下の残
留水分量となるまで乾燥させることができたが、およそ
25%以上のタンパク質が加工中に分解され、その結果、
必要な治療効果を商業的に望めない製品が得られたと報
じられた。

ヒト成長ホルモンの場合と対照的に、組織型プラスミ
ノーゲンアクチベーターの場合には噴霧乾燥が実施可能
であると判明した。この方法を用いて治療上有効な配合
物を調製するのに不可欠な現象へのタンパク質の感受性
にはタンパク質の分子構造の判別不能な差異や他の要因
が大きく反映している、ことが強調された。

かくして、吸入、つまり肺への吸入による投与におい
て、これら混同した結果から強調される点は、この方法
で所定の生物活性タンパク質の治療上許容される配合物
を成功裏に調製できるのか予測がつかないということで
ある。さらに、治療吸入によるタンパク質の投与に要求
される追加の必要条件が更なる不確実性を導入すること
となる。

治療上の成功についての予測を複雑化する事態として
は賦形剤および熱安定性の影響がある。実際に、治療用
配合物を調製するためのこの方法について今後研究を行
うための営利事業が創設されている。

発明の概要 本発明は、多くの適合性の賦形剤と組み合わせたDNア
ーゼを噴霧乾燥により製剤化することによって、薬効成
分として生物活性形態のDNアーゼを含む乾燥粉末の分散
体が得られ、該分散体は当然の治療効果を得るために個
体の肺の中に投与するのに適するような物理的特性を備
えている、という知見に基づいている。

かくして、本発明は、適合性の賦形剤と薬効成分とし
てのDNアーゼを含む液体組成物を噴霧乾燥し、そして前
記工程の噴霧乾燥品を生物活性形態のDNアーゼを含む分
散性粉末として回収する各工程を含んでなる、DNアーゼ
含有医薬製剤の調製方法に向けられる。

本発明はまた、前記調製方法の製品として得られる治
療上有効なDNアーゼ配合物にも向けられる。

本発明は、かかる配合物、および該配合物を個体の肺
に投与することを含めてその調製方法、並びに該配合物
の調製およびその治療上の使用に関する全ての関連態様
に向けられる。

本発明は、さらに特定すると、個体の肺に投与すると
き、そこで生物活性DNアーゼ薬効成分による治療効果を
発現するのに適した形態であるように、エーロゾル剤形
で用いられる、すなわち気体中に、適当な分散性および
粒子径特性を有する(好ましくは実質的に非凝集形態
の)微細な固体粒子または液滴中の固体粒子が分散浮遊
している分散体として用いられる、粉末としてのDNアー
ゼを含有する医薬製剤の調製に向けられる。

本発明は、噴霧乾燥における一般的なパラメーターを
組み合わせた際に治療上有効な配合物を調製するのに有
用な、かかる噴霧乾燥法による該配合物の調製に向けら
れる。特に、DNアーゼ粉末は、有効DNアーゼ成分の約4
%以下が凝集形態で存在するような配合物に調製され得
る。DNアーゼの変性温度は媒体に応じて約50〜75℃であ
る。従って、その温度範囲を大幅に越えることのない噴
霧乾燥法の入口温度を採用することが好ましい。

同様に、DNアーゼの変性温度に関しては出口温度も重
要な考慮事項となる。噴霧乾燥法における出口温度は、
最適でないにしても、製品の乾燥と一致させて可能な限
り低くすることが好ましいとわかった。一般的には、周
囲温度から75℃までの出口温度が採用され、より好まし
くは周囲温度から70℃までである。

噴霧乾燥に付される溶液のpHに関しては、過度の凝集
やアミド分解を避けるために、たいてい約5〜8の範囲
とするのが最適である。約6〜7のpH範囲が好ましいと
わかった。

噴霧乾燥法では初めにDNアーゼを含む溶液を用いる。
こうした溶液は水性であることが好ましく、製剤上適合
しうる賦形剤を1種以上含むだろう。DNアーゼの濃度は
約1〜80mg/mlまたはそれ以上であり、より好ましくは
5〜30mg/mlである。

製造上許容される各種の賦形剤が利用でき、噴霧乾燥
法にとって好ましい溶液を調製する際に用いられるが、
賦形剤の特性は適度に分散性の最終製品をつくる上で重
要であるものの、(必ずしも)本質的なものではないこ
とが判明した。一般に、適当な賦形剤は塩化ナトリウ
ム、糖(例えば、スクロース、ラクトース、トレハロー
スおよびマンニトール)、誘導カルシウムまたは他の2
価カチオン(例を挙げると、塩化カルシウム、塩化亜
鉛、塩化マンガンおよび塩化マグネシウムから得られる
もの)より成る群から選ばれる。質量濃度と液滴の大き
さとが共同で粒子径をコントロールする。例えば、塩の
量が増すと噴霧乾燥品の分散性が高まることが見いださ
れた。糖の場合には、その割合が約30%以上に増加する
と、分散性が低下する。

ここに記載した噴霧乾燥法は、当技術分野で商業的に
入手できる多くの装置のいずれを使ってもうまく使用で
きる。

ここに記載した粉末製品は、通常の方法を用いて追加
の既知乾燥賦形剤とブレンドすることにより、いろいろ
な用途に適合した配合物をつくることができる。

図面の簡単な説明 図1は、本明細書の実施例1に記載したとおりに製造
したrhDNアーゼ粒子の走査型電子顕微鏡写真を示す。

図2Aおよび2Bは、rhDNアーゼ粉末の再分散に使用した
装置の例として挙げたRotahaler の2つの概略図であ
る。

図3は、rhDNアーゼ粉末のエーロゾルサイジングのた
めの、Rotahalerをのど部に接続させたマルチステージ
液体インピンジャーを示す。

図4〜7は、異なるNaCl含量を有する4つの配合物に
ついての、原料粉末の粒子径分布とRotahalerにより生
成されたエーロゾル霧中のものとの比較である。

図8は、NaClを含むrhDNアーゼ粉末の粒子径に対する
再分散性を示す。

第9図Aおよび9Bは、多分散粉末(例えば、幾何学的
標準偏差 約2.5)のタイプの吸引可能なエーロゾル粒
子への粉末の再分散性と一次粒子径との関係を示す。

図10は、NaCl含量がrhDNアーゼ粉末の再分散に及ぼす
影響を示す。

図11は、配合物中のNaCl含量とそれらの結晶化度との
直線関係を示す。

第12A〜12Fは、NaClを含むrhDNアーゼ粒子の走査型電
子顕微鏡写真を示す。

図13は、40%のラクトースを配合したrhDNアーゼ粉末
についての、原料粉末とRotahalerにより生成されたエ
ーロゾル霧との粒子径分布の比較である。

図14は、異なる糖を含むrhDNアーゼ粉末のそれらの糖
含量に対する再分散性を示す。

第15図は、糖を配合したrhDNアーゼ粉末の再分散性に
粒子径が及ぼす影響を示す。

図16A〜16Fは、糖を含むrhDNアーゼ粒子の走査型電子
顕微鏡写真を示す(16A,B,C:40%糖、16D,E,F:84%糖、
16A,D:スクロース、16B,E:ラクトース、16C,F:トレハロ
ース)。

図17は、DNアーゼ含有配合物の等電点電気泳動ゲルを
示す。レーン1と4はDNアーゼ/塩配合物であり、レー
ン2と5はDNアーゼ/ラクトース配合物であり、レーン
3と6は純粋なDNアーゼ配合物である。

発明の詳細な説明 A.定義 ここで用いる「DNアーゼ」、「ヒトDNアーゼ」または
「組換えヒトDNアーゼ」とは、ヒト成熟DNアーゼのアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド、並びにDNAの加水分解
において酵素的に活性のあるそのアミノ酸配列変異体
(対立遺伝子変異体を含む)を指す。従って、これらの
用語は、先に引用され、参考としてここに組み込まれる
特許出願において開示され、製造された物質の広い定義
を意味する。こうした用語はアミド分解ヒトDNアーゼと
非アミド分解ヒトDNアーゼの精製混合物および各々の精
製形態を含むことが理解されよう。

ここで用いる「賦形剤」とは、患者の肺に投与したと
き治療効果を示す噴霧乾燥品を適切にかつ成功裏に調製
するためにDNアーゼと一緒に用いられる製造上許容され
る物質のことである。適当な賦形剤は当技術分野で公知
であって、一般的に上述したとおりであり、また、例え
ば、Physician's Desk Reference、Merck IndexおよびR
emington's Pharmaceutical Sciencesに記載されてい
る。

ここで用いる「治療上有効な」またはその文法的に同
等の用語は、ここに記載の噴霧乾燥品の範囲内で投与さ
れる、治療すべき個体の重量1kgあたりヒトDNアーゼ約
1μg〜1mgの投与量を意味する。DNアーゼの現在の1
日の治療量は約2.5mgである。ヒトDNアーゼの治療上有
効な量は、例えば、治療目的および治療すべき個体の健
康状況に左右されるだろう。その全てにおいて、本発明
は、必須構成要素として、個体の肺に投与した際に前記
の治療効果をうまく引き出すように調製された、治療上
有効な量を含む配合物を提供する。

ここで用いる「エーロゾル」という用語は薬学的意味
で用いられ、空気中に微細な固体粒子が分散している
か、空気中に液滴中の固体粒子または溶液の小滴が分散
している分散体から成る配合物を包含する。この用語は
エーロゾルとして、特に内容物を吸入により個体の肺の
中に投与するために、容器から分配された物質を含み、
また、そのように作動する容器をも包含する。ここに記
載のエーロゾル剤は肺への導入に適した粒子径の分散固
体粒子を含むものである。こうした粒子は、治療すべき
個体の肺の中で治療効果をあげるために、粒子径が約1
〜6ミクロンの、実質的に凝集していない、生物学的に
活性なDNアーゼ分子であるべきである。

DNアーゼ配合物は肺内部の粘液の粘弾性を酸素的に変
化させるために用いられる。こうした配合物は、とりわ
け、異常に粘性で化膿性の分泌を伴う肺疾患、例えば感
染性肺炎、気管支炎または気管気管支炎、気管支拡張
症、嚢胞性線維症、喘息、結核、真菌感染症などを含め
た、急性または慢性の気管支肺疾患の症状を有する患者
を治療するのに有効である。こうした治療のために、こ
こに記載の新規配合物は治療すべき個体の気管支に別の
慣用方法で点滴注入される。ここに記載の配合物は、治
療有効量のDNアーゼが肺の直接作用によって個体に送達
されるような、DNアーゼの肺への確実な導入に特に適し
ている。

B.好ましい実施態様 序 エーロゾル送達のためにDNアーゼの乾燥粉末が調製さ
れた。噴霧乾燥法によって粉末を得たが、この粉末中に
は最高4%の分子凝集物が存在していた。凝集物の存在
は、毒性や免疫原性のような望ましくない作用が起こり
得るため、最小限に抑えることが好ましい。噴霧法の際
の機械的剪断応力が原因で凝集が起こるとは考えられな
い。何となれば、ジェット噴霧化の間にDNアーゼは変性
しなかったからである。それゆえ、凝集は噴霧液滴が高
温の空気にさらされる乾燥法に関係があるのかもしれな
い。事実、以前の実験からは、超音波噴霧化の間に熱変
性のためにDNアーゼの凝集物が形成されることが示され
ている。

C.実施例 実施例1 最初の実施可能性試験は噴霧乾燥の後の粒径分布とrh
DNアーゼの特性を測定するために計画され、150mM NaC
l,1mM CaCl2,pH6.6中に配合した4mg/ml rhDNアーゼを使
用して行った。噴霧乾燥は実験室規模の噴霧乾燥器(Bu
chi,Model 190)を使用して行った。操作の間、タンパ
ク質溶液は、5ml/分の一定速度で、臑動ポンプによりノ
ズル(0.5−mm内径)に供給し、圧縮空気流によりアト
マイズした。乾燥空気は乾燥チャンバーに90℃及び3600
0L/hr(STP条件)で下降する噴霧液滴と同じ方向に流入
させた。実験室雰囲気からのダスト粒子の吸引を避ける
ために、乾燥空気とアトマイゼーション空気はそれぞれ
70μm及び0.22mμフィルターを用いて予備的にろ過し
た。生成物粉末はサイクロンにより乾燥空気流から分離
し、回収容器に集めた。

得られた微細白色噴霧乾燥粉末は熱重量分析によって
含水率を分析し、粒径と形態を電式顕微鏡により調べ
た。また、噴霧乾燥したrhDNアーゼ粉末(0.13g)をmil
li−Q水10mlに溶解し、以下のアッセイを使用して再溶
解されたrhDNアーゼの性質を調べた。

−色及び透明度:溶液の外観を目視で調べる。

−再調製された溶液のpH。

−UV分光測光走査:1.6(mg/ml)-1cm-1の吸収率を使用
してrhDNアーゼ濃度を測定する。

−ゲルサイジングクロマトグラフィー:rhDNアーゼの分
子凝集物及びフラグメントの存在を測定する。

−原子吸光炎光光度分析;Na+含量を測定する。

−等電点電気泳動法(IEF):rhDNアーゼの電荷分布を測
定する。

−SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE):rh
DNアーゼの共有結合凝集物及びフラグメントの存在を測
定する。

−メチルグリーンDNA活性アッセイ:rhDNアーゼの活性を
測定する。

結果噴霧乾燥した粉末は、およそ30%のrhDNアーゼ、
60%のNaCl及び5%の水を含むことが判った。溶液中の
ナトリウム対タンパク質のモル比が、噴霧乾燥粉末にお
いて維持されていた(表A)。IEFによって確認される
ように、rhDNアーゼの電荷分布は噴霧乾燥後も変わらな
かった。再溶解した噴霧乾燥粉末のpH、色、外観は実質
的に変化しなかった(再調製された透明は溶液にはいく
らかの粒子が見られた)。ゲルサイジングクロマトグラ
フィーでは凝集物の形成によるモノマーのパーセントの
わずかな減少が見られた。生成した凝集物の一部は、SD
S PAGEにより検出される還元可能な高分子量バンドの存
在により示されるように、分子内ジスルフィド架橋結合
によるものである。最も重要なこととして、噴霧乾燥の
後のrhDNアーゼの比活性は変化しなかった(表A)。電
子顕微鏡観察により、噴霧乾燥粉末が球形粒子であり、
適当に分散され吸入されれば肺の気管支気管領域に付着
されるようなサイズの範囲にあることが示された(図
A)。

実施例2 材料及び方法 rhDNアーゼ粉末を、4.7mg/ml rhDNアーゼ、1mM CaC
l2、150mM NaClを含むストック溶液から調製した。スト
ック溶液は、水を補充することなくダイアフィルトレー
ションにかけて90〜100mg/mlのrhDNアーゼとした。予め
決められた量の水とNaClを濃縮ストック溶液に加えて、
ある範囲のNaCl濃度のrhDNアーゼ溶液を調製した。糖配
合物については、溶液を最初に高度に精製された水中で
透析して過剰のNaClとCaCl2を除去し、その後ダイアフ
ィルトレーションにより濃縮し、rhDNアーゼ及び糖の所
望の濃度に調整した。粉末中のrhDNアーゼ及び賦形剤の
含有量の詳細を表1及び2に示す。

注: 1. 1.6(mg/ml)-1cm-1の吸光率を使用して280nmにお
けるUV吸収により求めたrhDNアーゼ含有量。

2. 熱重量分析によって決定された含水率。

3. 炎光光度法によって決定されたNaCl含有量。

4. モノマー%はサイズ排除クロマトグラフィーによっ
て決定した。

5. 活性はUV吸収によって測定されたタンパク質濃度に
対して標準化したメチルグリーンアッセイによって決定
した。

ND:測定せず a:114±2%、測定数=8 b:109.8及び100.7%の2つの測定値の平均 注: 1. 約30%のほぼ同じ賦形剤重量比率で、糖粉末は、Na
Cl粉末よりも1〜3%高い含水率を示した。

2. 重量差によって決定された糖含有量。

含水率は熱重量分析により決定した(TGA 7,Perkin E
lmer)。粉末の結晶化度は、粉末X線回折により測定し
た。粒子形態は走査型電子顕微鏡(SEM)(525M,Philip
s)で観察した。

rhDNアーゼの噴霧乾燥 噴霧乾燥は、フィルターを通しかつ/または除湿した
空気を使用してBuchi 190 Mini Spray Dryerで行った。
起こり得る生成物の熱分解を最小限にするために、サイ
クロンと回収容器を冷却した。rhDNアーゼ溶液は、5ml/
分の速度で供給した。入口及び出口の空気温度はそれぞ
れ90℃及び55℃とした。

結果と考察 塩化ナトリウムを含有するrhDNアーゼの噴霧乾燥粉末 図4〜7は、異なる塩含有量を有する4つの配合物に
ついて、当初の粉末の粒径分布(レーザー回折によって
測定)を、Rotahalerによって生成されたエーロゾル霧
中のもの(マルチステージ液体インピンジャーによって
測定)と比較するものである。原料粉末については、単
位密度を推定して直径を得た。1.3の測定された密度を
使用した補正により曲線は若干上方に移動するが、粒子
の空気力学的直径は密度の平方根に比例するので、その
影響は最小限に止まる。データにより、エーロゾルは十
分に再分散されておらず、当初の粒子の粒径分布を回復
していないことを示している。これはほとんどの粉末吸
入器について通常に見られることであり、粉末の凝集性
と器具(Retahaler)の分散効率に起因するものであ
る。

粒子径及びNaCl(あるいはrhDNアーゼ)含有量の関数
としての再分散の概要を図8に示す。破線で示した外挿
線は粉末の挙動について予想される傾向を示す。

粒子径の影響 一次粒子径と吸引可能なエーロゾル粒子への再分散性
との予想される関係を図9A及び9Bに示す。一般に、粒子
がより細かくなるとその凝集性がより高くなり、これは
低い再分散性につながる。粒子が大きくなると凝集性の
低下により、よりよく分散される。さらに粒子径を増加
させていくと分散性は最大に達し、微細粒子の減少によ
り分散性は再び低下する。8% NaCl配合物はこの挙動
を示す(図8)。平均粒子径が2μmから5.8μmに増
加することにより再分散性が4〜10%改善されることが
判る。

賦形剤含有量の影響 rhDNアーゼ粉末の再分散性に対するNaCl含有量の影響
を図10に示す。配合物はすべて2.7〜3.3μmの平均粒子
径の同様の粒子径分布を有する(レーザー回折からの範
囲1.04〜1.63)。線形のプロットが得られ、塩含有量が
高くなるほど再分散性がよくなる。

結晶化度及び総水分の影響 結晶化度は、粉末中の結晶物質の存在の尺度である。
図11に示すとおり、配合物中のNaCl含有量とその結晶化
度の間には線形の関係が得られた。従って、粉末の再分
散性と結晶化度の間には相関関係がある。総水分(表
1)と再分散性の関係は線形でなく、このことは他の分
離化学的変量(例えば、総水分ではなく表面に吸着され
た湿気成分)からの影響の可能性を示唆している。

粒子形態の影響 図12A〜12Fは、NaCl含有量が増加するにつれて、形態
は非常に滑らかなきめの表面を有する球から、多数の立
方体塩結晶を表面に有する球に、そして小面のある球
に、そして最終的には凝集した塩結晶の球に変化するこ
とを示している。このような一連の形態的特徴が観察さ
れた。小面のある球及び滑らかな球は非常に類似してい
るが、それらの再分散は非常に異なっているので、肉眼
で観察される形態は重要ではない。

糖を含むrhDNアーゼの噴霧乾燥粉末 図13は、例として、40%ラクトースを配合したrhDNア
ーゼ粉末について当初の粉末とRotahalerで生成された
エーロゾル霧の粒度分布を比較する。NaCl配合物と同様
に、当初の粒子の粒度分布がエーロゾル中では回復され
ないことが示されている。

糖の種類の影響 図14においては、ラクトースを含むrhDNアーゼ粒子
が、スクロースあるいはトレハロースを含むものよりも
よく分散した。最高の再分散性は>40%で、塩配合物の
ものにほぼ匹敵する。所与の糖については、糖含有量が
増加すると再分散性は低下する。しかし、糖含有量が増
加すると粒径も増加する(噴霧溶液中の全溶質含有量を
同じ当初レベルに維持したときでさえ、より高い糖%は
より大きい平均径を示す)。このように、粉末の性能の
変化は、部分的には粒径の変化にもよる。これはNaCl配
合物の挙動とは非常に異なる。

所与の糖については、再分散性は約2μmの平均粒径
から減少し、最大値は粒径≦2μmにおいて起こること
を示している(図15)。通常、微細な粒子は非常に粘着
性が高く、従ってよく分散されない(図9A及び9B)。微
細な糖粒子はかなりよく分散する。

結晶化度、水分量及び粒子形態の影響 塩のために特有の結晶化度をしたNaCl粉末と異なり、
結晶性の糖粉末はないことがX線粉末回折によって測定
された。糖粉末について観察された幅広い突出部は非晶
質物質の典型的な特徴である。従って、糖粉末の再分散
性は結晶化度に関係がない。

水分量(表2)による再分散性の系統的な変化はなか
った。所与の糖については、糖含有量が異なる粉末の含
水率の違いは1〜2%だけであった。同様の糖濃度の3
種の異なる糖について、水分の差は同様に小さいもので
あった。水分吸着等温線(moisture sorption isother
m)によれば、DNアーゼ粉末の結晶化は比較的高い湿度
(約70%から85%またはそれ以上)で起こることが示さ
れており、従って粉末は比較的低い湿度の条件で製造し
貯蔵することが望ましい。

SEMにより調べると、全ての糖配合rhDNアーゼ粉末は
非常に滑らかなきめの表面をもつ類似した外観を有して
おり(図16A〜16F)、これもNaCl粒子との明確な相違で
ある。しかし、糖含有量が非常に高い場合、即ち90%の
場合は、粒子形態は実際に不規則に見え、その径は非常
に大きく(図16D〜F)、これらの特徴はいずれもこれ
らの粉末の非常に低い再分散性の理由となるものであっ
た。配合物の完全性は図17のIEFの結果により裏付けら
れる。

マンニトールについての試験 マンニトールについては30%の含有量についてのみ試
験した。他の粉末と同様に、SEMでは粒子は滑らかな球
であった。しかし、粉末は独特な挙動を示し、大きい平
均粒径(6.5μm)で低い水分量(3.72%)と再分散性
(8.6%)を示した。さらに、生成物は結晶質であった
(マンニトールの存在による)。

安定性 全ての研究において、噴霧乾燥した粉末生成物は、ア
ミド分解の有意な増加を示さなかった。種々の温度での
貯蔵の間の凝集の変化と酵素活性の観点からの安定性を
表3〜6に示す。糖がrhDNアーゼ粉末に良好な長期安定
性を与えることは明らかである。

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l.)14P(1989). Kassem,N.M.and Ganderton,D.,Influence of carrier s
urface on the characteristics of powder aerosels,
J.Pharm.Pharmacol.42(Suppl.)11P(1990). 結論 これまで、本発明の実施に使用できる特定の方法につ
いて詳細に記載した。本明細書に記載したDNアーゼの配
合物を調製し、特性付けし、治療的に投与するのに使用
される具体的な方法を詳述し、それに関する具体的なモ
デル系についてさらに開示したので、当業者は本発明の
成果を利用するにあたっての同様の情報を得るために別
の信頼できる方法をいかに考案するか十分に知得するで
あろう。従って、これまでの記載が情報源としていかに
詳細なものと見えるとしても、全体の範囲を制限するも
のと解するべきではなく、本発明の範囲は添付の請求の
範囲の法に則った解釈によってのみ決定されるべきもの
である。

フロントページの続き (72)発明者 ゴンダ,イゴール アメリカ合衆国 94109 カリフォルニ ア州 サン フランシスコ,ラーキン ストリート 2351番地 (72)発明者 スー,チュン シー. アメリカ合衆国 94022 カリフォルニ ア州 ロス アルトス ヒルズ,デルソ ン コート 13120番地 (72)発明者 ムメンタラー,マルコ スイス国 ムテンツ シーエイチ−4132 イム シェンズリ 107番地 (72)発明者 シャー,スティーブン ジェイ. アメリカ合衆国 94002 カリフォルニ ア州 ベルモント,リンカーン アヴェ ニュー 2417番地 (56)参考文献 特開 平4−271785(JP,A) 特表 平4−502406(JP,A) 特表 平6−510036(JP,A) 特表 平5−508315(JP,A) 米国特許5279823(US,A) 米国特許4233405(US,A) Proc.Natl.Acad.Sc i.USA.Vol.87(1990)P. 9188−9192 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) A61K 38/43 - 38/54 CA(STN)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】a) 適合性の賦形剤および有効成分とし
    てのDNアーゼを含有する液体組成物を噴霧乾燥し、そし
    て b) 工程a)の噴霧乾燥品を、生物活性形態のDNアー
    ゼを含む分散性粉末として回収する、 ことを含む、DNアーゼ含有医薬製剤の調製方法。
  2. 【請求項2】前記の噴霧乾燥品が個体の肺にエーロゾル
    投与器具を使って投与するのに適したエーロゾルの形態
    である、請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項3】形成された液滴がDNアーゼの変性温度を越
    えない温度をもつような入口温度で前記の噴霧乾燥工程
    を実施する、請求項1に記載の方法。
  4. 【請求項4】前記の液体組成物のDNアーゼ濃度が1〜80
    mg/mlである、請求項1に記載の方法。
  5. 【請求項5】前記のDNアーゼ含有粉末が4%より少ない
    DNアーゼの凝集形態を含む、請求項1に記載の方法。
  6. 【請求項6】前記の液体組成物が固体含量の10〜90%の
    量で賦形剤としてのNaClを含有する、請求項1に記載の
    方法。
  7. 【請求項7】前記の液体組成物が固体含量の10〜90%の
    量で賦形剤としての糖を含有する、請求項1に記載の方
    法。
  8. 【請求項8】有効成分としての生物学的に活性な形態の
    DNアーゼおよび適合性の賦形剤を含む、噴霧乾燥医薬製
    剤。
  9. 【請求項9】エーロゾル形態である、請求項8に記載の
    噴霧乾燥医薬製剤。
  10. 【請求項10】噴霧乾燥品を回収した後に、前記のDNア
    ーゼが噴霧乾燥品1mgにつき0.01〜1mgの量でその中に存
    在する、請求項8に記載の噴霧乾燥医薬製剤。
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US364,074 1994-12-27
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