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Die
Erfindung betrifft einen elektrochemischen Biosensor-Teststreifen
für die
quantitative Analyse von Analyten, die von Interesse sind, und betrifft
ein Verfahren zum Erzeugen desselben sowie ein elektrochemisches
Biosensor-System
unter Verwendung desselben.
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Auf
dem Gebiet der Medizin finden elektrochemische Biosensoren umfangreiche
Anwendung zur Analyse von Biomaterialien und einschließlich Blut.
In Hospital- und klinischen Laboratorien sind von diesen die elektrochemischen
Biosensoren unter Nutzung von Enzymen besonders vorherrschend, da sie
leicht anzuwenden sind und hinsichtlich der Messempfindlichkeit überlegen
sind und einen raschen Zugriff zu den Testergebnissen ermöglichen. Bei
elektrochemischen Biosensoren haben in der letzten Zeit Elektrodenmethoden
umfangreiche Anwendung gefunden. Beispielsweise lässt sich
die quantitative Messung eines Analyten, der von Interesse ist,
in einem durch Siebdruck erstellten Elektroden system dadurch erzielen,
dass man ein Enzym aufweisendes Reagens auf den Elektroden fixiert, eine
Probe einführt
und über
die Elektroden ein elektrisches Potential anlegt.
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Zu
einem elektrochemischen Biosensor unter Anwendung einer Elektrodenmethode
kann verwiesen werden auf die
US-P-5
120 420 , worin ein elektrochemischer Biosensor-Teststreifen
offenbart wird, bei dem von dem Vorteil eines Kapillarraums zur
Einführung
des Analyten Gebrauch gemacht wird und worin die Verwendung eines
Trennelements zwischen einem isolierenden Substrat und einer Abdeckung
zur Erzeugung des Kapillarraums gelehrt wird.
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Ein
anderer elektrochemischer Biosensor-Teststreifen findet sich in
der
US-P-5 437 999 , worin
neuerdings eine Methode der Mustererzeugung, wie sie typischerweise
in der PCB-Industrie zur Anwendung gelangt, für die Erzeugung eines elektrochemischen
Biosensors angewendet wird, die zu dem Zustandekommen von präzise abgegrenzten Elektrodenbereichen
führt.
Dieser elektrochemische Biosensor-Teststreifen ist angeblich in
der Lage, die Analytenkonzentrationen auf einer sehr kleinen Probengröße genau
zu bestimmen.
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Bezug
nehmend auf
1 hat man den Typ von
sich gegenüberstehenden
Elektroden eines elektrochemischen Biosensor-Teststreifens, wie
er in der
US-P-5 437 999 beschrieben
wird und wie er sich in einem auseinander gebauten Zustand in einer
Ansicht in auseinander gezogener Darstellung von
1A spezifizieren
lässt sowie
in einem zusammengebauten Zustand in einer perspektivischen Ansicht
von
1B. Im typischen Fall führt man mit diesen Sensoren
eine elekrochemische Messung aus, indem eine Potentialdifferenz über zwei
oder mehrere Elektroden anlegt, die sich im Kontakt mit einem Reagens
und einer Probe befinden. Wie man aus der Figur entnehmen kann,
weist der elektrochemische Biosensor-Teststreifen zwei Elektroden
auf: eine Arbeitselektrode, auf der die Reaktionen ablaufen, und eine
Referenzelektrode, die als Standardpotential dient.
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Es
gibt zwei Möglichkeiten
der Anordnung solcher Arbeits- und Referenzelektroden. Die eine
ist vom Typ der sich gegenüberliegenden
Elektroden, wie er in
1A gezeigt ist, worin ein als
Arbeitselektrode gebildetes Substrat von einer Referenzelektrode
durch ein Trennelement in Sandwich-Form getrennt ist. Die andere
Möglichkeit
ist die vom angrenzenden Typ, worin sowohl eine Arbeits- als auch eine Referenzelektrode
in paralleler Form Seite-an-Seite auf dem gleichen Substrat erzeugt
sind. In der
US-P-5 437 999 wird
ebenfalls ein elektrochemischer Biosensor mit nebeneinander liegenden
Elektroden offenbart, indem man sich eines Trennelements zu Eigen
macht, der ein isolierendes Substrat, auf dem die Elektroden erzeugt
sind, von einem anderen isolierenden Substrat trennt, das als Abdeckung
unter Erzeugung eines Kapillarraums dient.
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Bezug
nehmend auf 1 ist im Einzelnen ein
als Referenzelektrode ausgebildetes Substrat, d.h. das Referenzelektrodenelement 10,
räumlich von
einem als Arbeitselektrode ausgebildeten Substrat, d.h. ein Arbeitselektrodenelement 20,
durch ein Trennelement 16 getrennt. Normalerweise ist das Trennelement 16 auf
dem Referenzelektrodenelement 10 während der Fertigung fest angeordnet,
in 1A jedoch von dem Referenzelektrodenelement 10 getrennt
gezeigt. In dem Trennelement 16 befindet sich ein Ausschnitt 13 zwischen
dem Referenzelektrodenelement 10 und der Arbeitselementelektrode 20 und
bildet einen Kapillarraum 17. Der erste Ausschnitt 22 in
dem Arbeitselektrodenelement 20 legt eine Arbeitselektrodenfläche frei,
die an dem Kapillarraum 17 exponiert ist. Bei der Befestigung
an dem Referenzelektrodenelement 10 begrenzt ein erster
Ausschnitt 13 in dem Trennelement 16 einen Referenzelektrodenbereich 14,
wie in 1 mit den Phantomlinien dargestellt
wird, der ebenfalls an den Kapillarraum 17 exponiert ist.
Zweite Ausschnitte 12 und 23 exponieren einen
Referenzelektrodenbereich 11 bzw. einen Arbeitselektrodenbereich 21 und
dienen als Kontaktstellen, durch die hindurch ein elektrochemischer
Biosensor-Teststreifen 30, ein Messgerät und eine Stromversorgung
miteinander verbunden werden.
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In
dem in 1B gezeigten zusammengebauten
Zustand hat ein elektrochemischer Biosensor-Teststreifen 30 eine
erste Öffnung 32 an
einer Kante. Ferner kann eine Lüftungsöffnung 24 in
dem Arbeitselektrodenelement 20 auf eine Lüftungsöffnung 15 in
dem Referenzelektrodenelement 10 auftreffen und so für eine zweite Öffnung 32 sorgen.
Bei Gebrauch lässt
sich eine einen Analyten enthaltende Probe in den Kapillarraum 17 entweder über die Öffnung 31 oder 32 einführen. In
jedem Fall wird die Probe sofort in den elektrochemischen Biosensor-Teststreifen
durch Kapillarwirkung hineingezogen. Als Ergebnis kontrolliert der
elektrochemische Biosensor-Teststreifen automatisch das gemessene
Probenvolumen ohne Eingriff des Anwenders.
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Den
bisher existierenden, kommerziell verfügbaren, elekrochemischen Biosensor-Teststreifen, einschließlich denen,
die vorstehend in den Patent-Fundstellen beschrieben wurden, mangelt
es jedoch an dem folgenden schwerwiegenden Problem: Da Elektroden
auf den Substraten planar erzeugt werden und Reagenzien, einschließlich Enzyme,
auf den Elektroden immobilisiert werden, können während der Immobilisation die
flüssigen
Phasen der Reagenzien leicht nach unten fließen, so dass sie in bestimmten
Formen schwer zu immobilisieren sind. Dieses ist besonders problematisch
in Bezug auf die Genauigkeit des Nachweises oder der Messung, da die
Möglichkeit
besteht, dass das Reagens, das auf den Elektroden immobilisiert
ist, von einem zum anderen jeweiligen Teststreifen differieren könnte. Darüber hinaus
ist die Elektrodenfläche,
die dem Kapillarraum exponiert ist, in den planaren Substraten beschränkt erzeugt,
die die Elektroden einnehmen. So ist eine schmalere Elektrodenfläche in der
Tat hinsichtlich der Nachweisgenauigkeit eingeschränkt.
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In
der
US-P-5 437 999 werden
auch Verfahren für
die Erzeugung von Elektroden für
elektrochemische Biosensor-Teststreifen beschrieben, in der eine
Methode zur Mustererzeugung in einem elektrisch leitfähigen Material
gelehrt wird, das auf einem isolierenden Substrat mit Hilfe der
Photolithographie fest angeordnet ist, sowie eine Methode des Siebdruckens
eines elektrisch leitfähigen
Materials direkt auf einen standardgemäßen Leiterplattensubstrat.
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Die
Photolithographie führt
in der Regel jedoch zu hohen Produktionskosten. Darüber hinaus hat
diese Methode in der Massenproduktion ihre Schwierigkeiten, da sie
beim Erzielen feiner Muster auf einer großen Fläche nicht besonders erfolgreich ist.
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Wie
bei dem Siebdrucken ist eine flüssige Phase
auf einem elektrisch leitfähigen
Material erforderlich. Obgleich als elektrisch leitfähige Materialien für Elektroden
auf Grund ihrer Überlegenheit
in der Nachweisleistung und der chemischen Beständigkeit geeignet, sind flüssige Phasen
von Edelmetallen, wie beispielsweise Gold, Palladium, Platin u.dgl.
sehr kostspielig. Anstelle dieser kostspieligen Edelmetalle wird
dementsprechend Kohlenstoff in der Praxis eingesetzt. Der mit Hilfe
des Siebdruckens von Kohlenstoff erhaltene Elektrodenstreifen ist
in seiner Oberfläche
so ausgeprägt
ungleichförmig,
dass seine Nachweisleistung gering ist.
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Ebenfalls
wurde ein Verfahren zum Erzeugen einer Elektrode für einen
elektrochemischen Biosensor-Teststreifen vorgeschlagen, worin ein
dicker Draht, der durch Abscheiden von Palladium auf Kupfer erhalten
wird, durch Erhitzen auf ein Substrat aufgeklebt wird, wie beispielsweise
eine Kunststofffolie. Dieses Verfahren hat jedoch insofern einen
Nachteil, dass es auf Grund seiner prozessbedingten Eigenschaften
für den
Elektrodenstreifen schwierig ist, eine schmale, dünne Form
einzunehmen. Wenn sich die elektrischen Ladungen, die durch Reaktion
zwischen Reagenzien und Proben erzeugt werden, näher an den Elektroden befinden,
werden sie von den Elektroden mit größerer Wahrscheinlichkeit eingefangen
und detektiert. Dadurch bewirkt das Aufkleben eines dicken Drahts
auf eine Kunststofffolie eine Abnahme des Wirkungsgrades des Nachweises
auf dem elektrochemischen Biosensor-Teststreifen. Darüber hinaus
kann es leicht zu einem Ablösen
des dicken Drahts von der Kunststofffolie auf Grund einer geringen
Haftfestigkeit zwischen ihnen kommen, und die dicke Elektrode erfordert
hohe Materialkosten.
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Die
US-P-5 846 392 offenbart
einen elektrochemischen Biosensor-Teststreifen sowie ein Verfahren zu
seiner Herstellung entsprechend der Präambel der Ansprüche 1 bis
5. Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von den Lehren der
US-P-5 846 392 insofern,
dass die Elektroden auf der gleichen Seite angeordnet sind, in der
der quer verlaufende offene Kanal gebildet ist, so dass sie sich
in die Kapillarpassage hinein erstrecken, sowie darin, dass das Reagens
in inneren des Kanals fixiert ist.
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Die
vorliegende Erfindung gewährt
somit einen elektrochemischen Biosensor-Teststreifen, bei dem sich
entsprechende Reagenzien in einem bestimmten Muster fest anordnen
lassen und eine maximale wirksame Fläche auf eine Elektrode zum Nachweis
von Ladungen gewährleistet
ist, wodurch eine präzise
quantitative Bestimmung von gesuchten Analyten möglich ist.
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Ferner
gewährt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen eines elektrochemischen
Biosensor-Teststrefens, das wirtschaftlich günstig, ist sowie den präzisen Nachweis
von Analyten ermöglicht.
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Ebenfalls
gewährt
die Erfindung ein Biosensorsystem, das einen elektrochemischen Biosensor-Teststreifen
gemäß dem ersten
Aspekt aufweist und einer Referenzelektrode des elektrochemischen Biosensor-Streifens,
indem ein elektrischen Potential über die zwei Elektroden gelegt
wird und der als Ergebnis der Reaktion zwischen dem Reagens und
der Probe erzeugte Strom gemessen wird.
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Die
vorgenannten und andere Merkmale und Vorteile bevorzugter Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten
Beschreibung anhand eines Beispiels lediglich in Verbindung mit
den beigefügten
Zeichnungen dadurch aber verständlich,
worin sind:
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1 zeigt einen konventionellen elektrochemischen
Biosensor-Teststreifen vom Typ gegenüberliegender Elektroden, der
im Einzelnen in einer auseinander gezogenen perspektivischen Ansicht von 1A im
auseinander ge nommenen Zustand gezeigt ist und in einer perspektivischen
Ansicht von 1B in einem zusammen gebauten
Zustand;
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2 schematisch eine Struktur eines elektrochemischen
Biosensor-Teststreifens
gemäß der vorliegenden
Erfindung in perspektivischen Ansichten;
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3 ein alternatives Verfahren zum Erzeugen
eines Teststreifens, bei dem es sich nicht um eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung handelt;
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4 eine
schematische Veranschaulichung eines Prozessraums, worin Elektroden
eines Teststreifens erzeugt werden, indem mit Hilfe einer Schattenmaske
gesputtert wird;
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5 ein Sputterprozess mit der Hilfe einer Schattenmaske
vom Klebstoff-Typ in schematischen Querschnittansichten und
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6 ein Verfahren zum Erzeugen eines Teststreifens
gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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Die
Anwendung der bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung lassen sich am Besten unter Bezugnahme
auf die beigefügten Zeichnungen
verstehen, worin ähnliche
Zahlen für ähnliche
bzw. entsprechende Teile verwendet werden. Die bevorzugten Ausführungsformen
sind als veranschaulichend, nicht jedoch als die vorliegende Erfindung
einschränkend
zu betrachten.
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Bezug
nehmend auf 2, ist schematisch eine
Struktur eines elektrochemischen Biosensor-Teststreifens gemäß der vorliegenden
Erfindung in perspektivischen Darstellungen gezeigt. Wie zu erkennen
ist, weist der elektrochemische Biosensor-Teststreifen der vorliegenden
Erfindung ein isolierendes Substrat 41 oder 42 auf,
worauf eine Rille 45 oder 46 durch Prägen mit
einer drückenden
Methode des Formens oder mit Hilfe einer Vakuum-Formmethode (2A)
oder durch Gravieren (2B) ausgeformt ist. Auf dem
isolierenden Substrat 41 oder 42 wird eine Elektrode 44 installiert.
Die Rille 45 oder 46 hat unabhängig davon, ob sie geprägt oder
graviert ist, die Aufgabe, für
eine sichere Befestigung der entsprechenden Reagenzien darauf (nicht
gezeigt) zu sorgen.
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Damit
fließen
in einer solchen Struktur des elektrochemischen Biosensor-Teststreifens gemäß der vorliegenden
Erfindung die Reagenzien über dem
Substrat 41 oder 42, während sie auf der Rille 45 oder 46 festgehalten
werden, nicht ab. Mit anderen Worten ermöglicht der elektrochemische
Biosensor-Teststreifen,
der in 2 dargestellt ist, dass die Reagenzien
in einem bestimmten Muster immobilisiert werden, womit sie ausreichend
unbeweglich sind, um die gesuchten Analyten genau zu detektieren
oder zu messen.
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Zusätzlich verfügt die in
dem Teststreifen gemäß der vorliegenden
Erfindung installierte Elektrode, wie sie in 2 bezeigt
wird, über
eine dreidimensionale Struktur, so dass die einem Kapillarraum exponierte
Elektrodenfläche
um so viel weiter erhöht werden
kann, wie es eine entsprechende Rillentiefe (abweichende Linie)
gibt. Dieses zeigt eine Zunahme in der Elektrodenfläche, die
zum Einfangen der durch ein Reagens erzeugten Ladungen in der Lage
ist und zu einer Verbesserung des Wirkungsgrades der Detektion führt.
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Wie
vorstehend veranschaulicht, können
die konventionellen Methoden, wie beispielsweise die Methoden des
Siebdruckens und die Klebemethoden für dicken Draht eine solche
präzise
dreidimensionale Struktur einer Elektrode in einem elektrochemischen
Biosensor-Teststreifen nicht erreichen.
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Nachfolgend
wird eine detaillierte Beschreibung für ein neuartiges Verfahren
gegeben, mit dem man in der Lage ist, eine solche präzise, mit
dreidimensionaler Struktur versehene Elektrode in einem elektrochemischen
Biosensor-Teststreifen zu erstellen, indem man Vorteile gegenüber den
konventionellen Verfahren nutzt.
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Bezug
nehmend auf 3 wird ein alternatives
Verfahren zum Erzeugen eines elektrochemischen Biosensor-Teststreifens
veranschaulicht, das keine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist.
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Zunächst werden
zwei Metallelektrodenstreifen 52 und 54 parallel
auf einem isolierenden Substrat 50 ausgebildet, wobei der
eine Metallelektrodenstreifen eine Oxidationsstelle als Arbeitselektrode 52 bildet
und der andere Metallelektrodenstreifen als eine entsprechende Referenzelektrode 54 dient.
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Für die Verwendung
in dem isolierenden Substrat 54 ist jedes beliebige Material
möglich, wenn
es über
eine elektrisch isolierende Eigenschaft verfügt, um jedoch den elektrochemischen
Biosensor-Teststreifen der vorliegenden Erfindung in einer Massenproduktion
zu erzeugen, besitzen diese vorzugsweise eine ausreichend große Flexibilität, um ein
Verarbeiten in einem Walzenprozess zu überstehen, und besitzen eine
ausreichende Biegesteifigkeit, wie sie für Träger benötigt wird. Als derartige isolierende
Substratmaterialien sind Polymere vorzuschlagen, von denen Beispiele
Polyester einschließen,
Polycarbonat, Polystyrol, Polyimid, Polyvinylchlorid, Polyethylen,
mit Bevorzugung auf Polyethylenterephthalat.
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Die
Ausbildung der Elektrodenstreifen 52 und 54 auf
dem isolierenden Substrat 50 wird durch eine Methode des
Sputterns mit der Hilfe einer Schattenmaske erzielt. Im Einzelnen
wird, nachdem eine Schattenmaske, in der eine Elektrodenstreifenkontur in
einem Muster angeordnet ist, auf das isolierende Substrat 50 aufgebracht
wurde, ein typischer Sputterprozess ausgeführt, wobei die Entfernung der Schattenmaske
die Elektrodenstreifen 52 und 54 auf dem isolierenden
Substrat 50 zurücklässt. In
diesem Zusammenhang kommt es durch eine Vorbehandlung, wie beispielsweise
eine Bodenentladung oder durch Plasmaätzen, über dem isolierenden Substrat zu
einer Verbesserung der Haftfestigkeit zwischen dem isolierenden
Substrat und den Elektrodenstreifen. So hat sich in der Tat gezeigt,
dass, wenn eine Elektrode aus Gold (Au) auf einer mit Lichtbogen
behandelten Kunststofffolie erzeugt wird, die Haftfestigkeit zwischen
der Elektrode und dem isolierenden Substrat gemessen mit Hilfe eines
Abziehversuches nahezu perfekt ist (100%).
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Bezug
nehmend auf 4 wird ein Prozessraum gezeigt,
worin ein Teststreifen durch Sputtern mit Hilfe einer Schattenmaske
erzeugt wird. In dieser Figur wird ein Target mit der Bezugszahl 71 bezeichnet,
eine Mehrzahl von Punktmagneten mit der Zahl 72, eine Eisenplatte
mit der Zahl 73, ein isolierendes Substrat mit der Zahl 74,
eine Schattenmaske mit der Zahl 75 und Flächen, in
denen Elektroden ausgebildet werden sollten, mit der Zahl 76.
Beim Sputtern müssen
die Maske 75 und das Substrat 74 miteinander in
engem Kontakt sein. Sofern es dazwischen einen Spalt gibt, penetriert,
so klein er auch ist, das abzuscheidende Material, z.B. Gold, den
Spalt, wodurch ein zusammengeklapptes Muster resultiert. Es wird
eine Mehrzahl von Punktmagneten eingesetzt, um die Schattenmaske
mit dem isolierenden Substrat 74 in einem engen Kontakt
zu bringen. Wenn die Schattenmaske 75 in diesem Zusammenhang
dick ist, kann sie nicht an den Magneten auf Grund ihrer eigenen
Masse und eines Verzugs befestigt werden. Die von den Erfindern
der vorliegenden Erfindung erhaltenden experimentellen Daten zeigen,
dass eine bevorzugte Dicke der Schattenmaske 75 in den
Bereich von 0,1 bis 0,3 mm fällt.
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Die
Magnete sind vorzugsweise in einem inversen Punktmuster angeordnet,
d.h. die Eisenplatte 73 wird auf die Punktmagneten 72 gesetzt.
In diesem Fall kann, da es kaum zu einer Verformung des Plasmas
kommt, hinsichtlich des Abstandes zwischen dem Substrat 74 und
dem Target 71 zu einer starken Verringerung kommen, was
eine starke Zunahme des Abscheidungswirkungsgrades zur Folge hat.
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Sofern
ein Plasma erzeugt wird, lässt
sich der Prozessraum bis zu der Temperatur erhitzen, bei der sich
Kunststofffolien normalerweise verwerfen. In diesem Fall wird daher
eine Aluminiumlegierung, die über
hohe Wärmedurchlässigkeitseigenschaften
und paramagnetische Eigenschaften verfügt, wie beispielsweise SUS
430, als die Schattenmaske verwendet.
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Für die Verwendung
in Elektroden geeignet sind Edelmetalle. Beispiele für die Edelmetalle schließen Palladium
ein, Platin, Gold, Silber usw., und zwar auf Grund der überlegenen
elektrochemischen Eigenschaften hinsichtlich der Stabilität auf den
Elektrodenoberflächenbereichen,
des elektrochemischen Reproduktionsvermögens, der Oxidationsbeständigkeit
usw. Besonders bevorzugt ist Gold, das sich solchen Vorteilen erfreut,
wie relativ kostengünstig
zu sein, einfach verarbeitbar zu sein, in Bezug auf das Klebvermögen an Kunststoff überlegen zu
sein und eine hohe elektrische Leitfähigkeit zu haben. Obgleich
eine aus Gold durch Sputtern erzeugte Elektrode bis herab zu 100
nm dünn
ist, ist sie für
den einmaligen Gebrauch geeignet, da sie einen elektrisch geringen
Widerstand hat und mechanisch fest auf dem isolierenden Substrat,
wie beispielsweise einer Kunststofffolie, sitzt. Alternativ können eher
als derartige ausschließliche
Edelmetalle Metallmaterialien verwendet werden, die auf dem isolierenden Substraten,
wie beispielsweise Kunststoffen, fest haften und kostengünstig sind,
um Primärelektroden
zu erzeugen, auf denen aus wirtschaftlichen Gründen das Edelmetall dünn überzogen
ist.
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Zurück zu 3B ist
das Reagens 56, das mit dem Analyten reaktionsfähig ist,
mit einer geeigneten Breite über
den zwei Elektroden 52 und 54 auf dem isolierenden
Substrat fest angeordnet. Der elektrochemische Biosensor-Teststreifen kann
auf ein breites Spektrum von Analyten zählen. Massive Materialien,
wie beispielsweise Vollholz, Blutserum, Urin, Neurotransmitter u.dgl.
sowie fermentierte und natürliche
Materialien lassen sich mit Hilfe des elektrochemischen Biosensor-Teststreifens
detektieren oder messen. Das Reagens 56 kann auf den Elektrodenbereich
des isolierenden Substrats 50 mit Hilfe einer automatischen
Dispensiervorrichtung oder unter Anwendung des Siebdruckens, Walzenbeschichtens oder
Rotationsbeschichtens aufgetragen sein. Sobald über den zwei Elektroden ein
elektrisches Potential angelegt ist, nachdem eine Probe bereitgestellt
wurde, reagiert das Reagens mit der Probe innerhalb einer Reaktionszeit
unter Erzeugung von Ladungen. Da diese Ladungen, die durch enzymatische Reaktionen
erzeugt werden, im Verhältnis
zu der Konzentration des gesuchten Analyten stehen, liefert die
quantitative Bestimmung der Ladungen eine Kenntnis im Zusammenhang
mit der Konzentration des Analyten.
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Als
Reagens
56 sind Enzyme oder Redox-Vermittler verfügbar. Eine
Reihe von Enzymen lässt
sich in Abhängigkeit
von den zu detektierenden und zu messenden Analyten verwenden. Beispielsweise
kann Glucoseoxidase zur Anwendung gelangen, wenn Glucose detektiert
oder analysiert werden soll. Verwendbare Redox-Vermittler lassen
sich beispielsweise mit Kaliumferricyanid und einem Imidazolosmium-Mediator
exemplifizieren, die in der
US-P-5
437 999 offenbart wurden. Abgesehen von Enzymen und Redox-Vermittlern
kann das Reagens
56 ferner Puffer, hydrophile Makromoleküle, grenzflächenaktive
Mittel und/oder Filmbildner aufweisen. Im Verlaufe der Reaktion
mit einer Probe ist die Aufgabe eines Puffers in dem Reagens, die
pH-Wert-Bedingung konstant zu halten. Andererseits sind die hydrophilen
Makromoleküle
nützlich,
um andere Komponenten des Reagens auf der Elektrode zu fixieren.
Inzwischen erleichtern grenzflächenaktive
Mittel die Einführung
von Proben in einem Kapillarraum, durch Kapillarwirkung, was nachfolgend
erläutert
wird. Somit kann das Reagens zur Detektion oder Messung von Glucose
Kaliumferricyanid, ein Kaliumphosphat-Puffer, Cellulose, Hydroxyethylcellulose,
ein Triton X-100-Tensid, Natriumsuccinat und Glucoseoxidase in Kombination
aufweisen. Eine detaillierte Herstellungsmethode derartiger Reagenzien
sowie verfügbare
Enzyme und Redox-Vermittler finden sich in der
US-P-5 762 770 .
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Bezug
nehmend auf 3C ist eine isolierende Platte 58 auf
den Elektroden 52 und 54 und dem isolierenden
Substrat durch Thermokaschieren oder mit Hilfe eines doppelseitigen
Klebmittels befestigt. 3D zeigt ein Profil der Struktur
von 3C. Wie zu sehen ist, hat die isolierende Platte 58 einen Bereich,
um mit den Elektroden 52 und 54 und dem isolierenden
Substrat 50 und einem hervorstehenden Bereich in Kontakt
zu sein, der der Fläche
entspricht, auf der das Reagens 56 befestigt ist. Als ein
Material zur Verwendung in der isolierenden Platte 58 kann das
gleiche Material geeignet sein, wie das für das isolierende Substrat 50.
Ohne von der isolierenden Platte 58 bedeckt zu sein, bleibt
ein oberer Teil des isolierenden Substrats 50 entblößt. Die
Elektroden 52 und 54, die teilweise an ihren oberen
Teilen exponiert sind, können
als Kontaktstellen dienen, durch die hindurch der elektrochemische
Biosensor-Teststreifen, ein Messgerät und eine Stromversorgung elektrisch
miteinander verbunden sind.
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Wie
in 3D gezeigt, bildet der hervorragende Bereich der
isolierenden Platte 58 zusammen mit dem isolierenden Substrat 50 einen
Kapillarraum 64, der die Elektroden 52 und 54 in
Richtung der Breite durchquert. Der Kapillarraum muss nicht vollständig so
breit sein, kann jedoch breiter oder schmaler sein als das Reagens 56.
In ähnlicher
Weise braucht der Kapillarraum in seiner Länge ebenfalls nicht vollständig genauso
groß sein,
sondern kann größer oder
kleiner sein als die Breite des isolierenden Substrats. Lediglich
um den Fehler zu verringern, der bei der Einführung einer Probe in den Kapillarraum
auftritt, stimmt die Länge
des Kapillarraums vorzugsweise mit der Breite des isolierenden Substrats 50 überein.
Der Kapillarraum 64, der auf diese Weise gebildet wird,
ist dort, wo eine Probe, wie beispielsweise Blut eingeführt wird.
Dieses Einführen
wird durch Kapillarwirkung erleichtert, so dass eine präzise Bestimmung
selbst bei einer kleinen Probenmenge erfolgen kann.
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Nachfolgend
das Prinzip der Messung der Konzentration eines gesuchten Analyten,
d.h. einer Substanz, die unter Verwendung des elektrochemischen
Biosensor-Teststreifens der vorliegenden Erfindung detektiert und/oder
analysiert werden soll. Wenn ein Glucosespiegel im Blut unter Anwendung einer
Glucoseoxidase mit Kaliumferricyanid als Redox-Vermittler assayiert
werden soll, wird die Glucose beispielsweise oxidiert, während das
Ferricyanid zu Ferrocyanid reduziert wird, die beide mit Hilfe der Glucoseoxidase
katalysiert werden. Nach einer vorbestimmten Zeitdauer, wenn ein
elektrisches Potential von einer Stromquelle über die zwei Elektroden gelegt
wird, passiert ein Strom infolge des Elektronenaustauschs, der zu
der Reoxidation des Ferrocyanids beigetragen hat. Das über den
zwei Elektroden von einer Stromquelle angelegte elektrische Potential
beträgt
geeigneterweise nicht mehr als 300 mV und liegt vorzugsweise in
der Größenordnung
von etwa 100 mV, wenn die Eigenschaften des Mediators mit berücksichtigt
werden.
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Unter
der Anwendung eines in dem Amperemeter gespeicherten Algorithmus
kann damit der gemessene Strom als eine relativ zu der Konzentration des
Analyten in der Probe abhängige
Variable ausgegeben werden. Nach einer anderen mathematischen Methode
kann durch Integration des gemessenen Stroms in einer Strom/Zeit-Kurve über eine
bestimmte Zeitdauer die Ladungsgesamtmenge, die während dieser
Zeitdauer erzeugt wurde, erhalten werden, die direkt proportional
zu der Konzentration des Analyten ist. Verkürzt kann die Konzentration
eines Analyten in einer Probe quantitativ bestimmt werden, indem
der Diffusionsstrom gemessen wird, der erzeugt wird durch die auf
enzymatische Reaktion basierende elektrische Oxidation eines Redox-Vermittlers.
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Wendet
man sich 5 zu, so gibt es dort schrittweise
dargestellte Prozesse zum Erzeugen von Elektroden durch Sputtern
mit der Hilfe einer Schattenmaske vom Klebstoff-Typ.
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Es
wird eine Kunststofffolie 80 bereitgestellt, auf die mit
Hilfe einer Klebstoffschicht 82 entsprechend der Darstellung
in 5A eine Kunststofffolie 84 als Schattenmaske
aufgebracht ist. Die Klebstoffschicht 82 befindet sich
in Bezug zur Kunststofffolie 80 in einem Zwischenzustand
der Haftung, so dass sie sich leicht voneinander lösen können.
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Anschließend werden
die Kunststofffolie 84 und die Klebstoffschicht 82 an
vorbestimmten Bereichen in dem Muster der auszubildenden Elektroden mit
Hilfe eines Schneidplotters oder Graviervorrichtung entsprechend
der Darstellung in 5B ausgeschnitten.
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Danach
werden die ausgeschnittenen Bereiche abgenommen, und es folgt ein
Aufsputtern von Gold 88 mit Hilfe von Vakuum vollständig über der verbleibenden
Struktur zur Erzeugung von Elektroden, wobei die Kunststofffolie 84 entsprechend
der Darstellung in 5C als eine Schattenmaske verwendet
wird.
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Abschließend werden
die verbleibende Kunststofffolie 84 und die Klebstoffschicht 82 entfernt,
um die Elektroden entsprechend der Darstellung in 5D freizulegen.
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Ähnlich wie
in diesem Fall ermöglicht
eine Schattenmaske vom Klebstoff-Typ
die Erzeugung von Mustern bis zur Bearbeitungsgrenze eines Schneid plotters.
Im Gegensatz zu den typischen Eisen-Schattenmasken ist eine solche
Schattenmaste vom Klebstoff-Typ auch flexibel und haftet an der
Folie, auf der Elektroden erzeugt werden sollen, so dass durch Sputtern
ohne Unterdiffusion präzise
Muster erstellt werden können.
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Bezug
nehmend auf 6 wird das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung für
die Erzeugung eines elektrochemischen Biosensor-Teststreifens angewendet.
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Zunächst wird
ein Kunststoffsubstrat 90 bereitgestellt, auf dem eine
Struktur eines Elektrodenstreifens entsprechend der Darstellung
in 6A geschaffen werden soll.
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Danach
wird eine Vertiefung
92 in Querrichtung auf dem Kunststoffsubstrat
92 entsprechend
der Darstellung in
6B erzeugt. In diesem Zusammenhang
bevorzugt man, dass beide Seiteneinfassungen
93 der Vertiefung
bis auf die Goldelektroden, die später abgeschieden werden, leicht
schräg
gestellt sind, an ihren Rändern
ausgeschnitten sind. Für die
Erzeugung der Vertiefung
92 kann eine Press- oder Vakuumformmethode
angewendet werden, um die Oberfläche
des Kunststoffsubstrats
90 zu prägen. Alternativ kann die Vertiefung
92 unter
Anwendung einer Graviervorrichtung erzeugt werden. Die letztere Methode
wurde zur Erzeugung der Vertiefung
92 von
6B übernommen.
Da das Material bei der Kunststofffolie
90 in der Regel
um eine Rolle gewickelt wird, wird die Verwendung einer Graviervorrichtung zum
Auskehlen der Kunststofffolie in Betracht einer Massenproduktion
mehr bevorzugt. Diese Prozedur ermöglicht lediglich zwei Bogen
Kunststofffolie zu einem elektrochemischen Biosensor-Teststreifen
zu formen, der über
einen eingebauten Kapillarraum verfügt, ohne dass zusätzlich ein
Trennelement wie in der
US-P-5
437 999 verwendet werden muss.
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Anschließend werden
die Elektrodenstreifen 94 und 95 entsprechend
der Darstellung in 6C erzeugt. Dafür wird Gold
im Vakuum auf das Kunststoffsubstrat 90 mit Hilfe einer
Schattenmaske gesputtert, wie vorstehend ausgeführt worden ist. Über die
Arbeitselektrode und Referenzelektrode wird innerhalb der Vertiefung 92 ein
Reagens 98 aufgetragen und getrocknet, wie in 6D gezeigt
wird.
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Für die Aufgabe,
eine derartige dreidimensionale Struktur eines Elektrodenstreifens
entsprechend der Darstellung in 6C zu
erstellen, erzeugt die Anpassung einer Planaren Schattenmaske auf dem
mit Vertiefung versehenen Substrat einen Spalt mit einer Höhe wie die
des Kapillarrohrs zwischen der Maske und dem Substrat, durch den
das Gold von dem Target 71 eindringt und zur Ausbildung
undeutlich begrenzter Muster führt.
Um dieses Problem zu umgehen, wurden die drei folgenden Methoden
eingesetzt. Erstens, wurde die Schattenmaske so gekrümmt konstruiert,
dass sie auf die Form der Vertiefung passt. Auf Grund der überlegenen
Verarbeitungsfähigkeit
lässt sich
das SUS 430 zu einer dreidimensionalen Struktur der Schattenmaske
formen. Eine andere Lösung
bestand darin, die Prozessparameter oder die Struktur des Prozessraums
zu kontrollieren. Je geringer der Druck des Prozessraums ist, umso
länger
ist die mittlere freie Weglänge
der gesputterten Goldatome. Auf diese Weise treffen die Atome in
senkrechter Richtung auf das Substrat auf und werden in ihrer Zahl
dichter. Mit anderen Worten, bewegen sich weniger Atome in lateraler
Richtung, was zu einer genaueren Abgrenzung der Elektroden führt. Darüber hinaus
erzeugt eine Verlängerung
des Abstandes zwischen dem Target 71 und dem Substrat 74 einen
Nettofluss von gesputterten Atomen senkrecht zu dem Substrat 74.
Wo zum Beispiel ein 5 Inch-kreisrundes Target eingesetzt wird, wird
zumeist keine ausgebreitete Mustererzeugung angetroffen, wenn der
Abstand des Substrats mehr als 7 cm beträgt. Die letzte Maßnahme der
gemäß der vorliegenden
Erfindung, die zur Überwindung
der undeutlichen Abgrenzung der Elektrodenmuster erforderlich ist,
ist die Verwendung eines Kollimators, um die Atome zu blockieren,
die sich in lateraler Richtung bewegen. Im Gegensatz zu einer Wabenstruktur
der Kollimatoren, die üblicherweise
bei Verarbeitungsvorrichtungen für
Halbleiter verwendet werden, ist der in der vorliegenden Erfindung
zur Anwendung gelangende Kollimator ein Blindmuster, da er die Bewegung
von Atomen lediglich in lateraler Richtung einschränkt.
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Abschließend wird
eine isolierende Platte 96 auf das Kunststoffsubstrat in
einer solchen Weise aufgeklebt, dass der größere Teil des Kunststoffsubstrats 90 und
einschließlich
die Vertiefung 92 mit der isolierenden Platte 96 bedeckt
sind, während
der andere obere Teil unbedeckt bleibt, wie in 6E gezeigt
wird. Im Ergebnis bildet die Vertiefung zusammen mit der isolierenden
Platte 96 einen Kapillarraum. Durch den Kapillarraum wird
eine Probe, wie beispielsweise Blut, in den elektrochemischen Biosensor-Teststreifen
eingeführt.
Ein Profil des fertigen elektrochemischen Biosensor-Teststreifens
von 6E ist in 6F in
einer übertriebenen
Darstellung des Kapillarraums 99 gezeigt.
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Wie
vorstehend beschrieben, ist der Teststreifen der vorliegenden Erfindung
zur genauen quantitativen Bestimmung von gesuchten Analyten auf
Grund seiner festen Fixierung entsprechender Reagenzien in einem
bestimmten Muster und auf Grund dessen in der Lage, weil er eine
maximale wirksame Fläche
der Elektrode zur Detektion von Ladungen besitzt.
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Darüber hinaus
ist das Verfahren zum Erzeugen eines solchen Teststreifens gemäß der vorliegenden
Erfindung mit der dünnen
Elektrode aus ökonomischer
Sicht günstig,
was auf die Verwendung der dünnen
Elektroden-Filme zurückzuführen ist,
wodurch die präzise
Detektion von Analyten ermöglicht wird.