DE60026598T2

DE60026598T2 - Neue enzymatische substrate zum nachweis von pseudomonas aeruginosa

Info

Publication number: DE60026598T2
Application number: DE60026598T
Authority: DE
Inventors: Mireille Desmonceaux; Daniel Monget
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1999-12-06
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2020-12-07
Also published as: AU781668B2; ATE319852T1; US6905841B2; EP1235927B1; FR2801903A1; CN1262671C; CN1408026A; DE60026598D1; EP1621530A1; AU2184101A; BRPI0016173A; EP1235927A2; WO2001042491A3; ES2260084T3; WO2001042491A2; FR2801903B1; JP2003516158A; US20030044877A1; JP4907822B2; BRPI0016173B8

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Substrat, das in einem Test zum Nachweisen der β-Alaninaminopeptidaseenzymaktivität verwendet werden kann. Weiterhin betrifft sie eine Zusammensetzung, die mindestens solch ein Substrat enthält, sowie ein Verfahren zum Nachweisen der Bakterienspezies Pseudomonas aeruginosa.
Seit vielen Jahren werden bestimmte Substrate verwendet, um den Nachweis des Vorliegens bzw. Fehlens von Enzymaktivitäten, die für Mikroorganismen charakteristisch sind, zu ermöglichen. Aufgrund der Wahl der Substrate, mit denen gegebenenfalls eine Reaktion eintritt, kann man die Art einer Mikroorganismengattung charakterisieren oder zwischen Stämmen und/oder Spezies einer gegebenen Mikroorganismengattung unterscheiden.
Die synthetischen Enzymsubstrate bestehen aus zwei Teilen, nämlich einem ersten Teil, der für die aufzuzeigende Enzymaktivität spezifisch ist und der im folgenden Zielteil genannt wird, und einem zweiten Teil, der als Marker dient und der im folgenden Markerteil genannt wird.
Diese jeweiligen Substrate können fluoreszierend oder chromogen sein. Es ist nämlich dieser zweite Teil, der Markerteil, oder das Produkt seiner Reaktion mit einer oder mehreren anderen Verbindungen (siehe diesbezüglich die an die Anmelderin ausgegebene Patentanmeldung PCT/FR99/00781), der bzw. das, wenn er/es nicht mehr mit dem ersten Teil, dem Zielteil, assoziiert ist, fluoresziert oder chromogen ist.
Nun wird aber im Stand der Technik kein einfacher Test für die Charakterisierung der Spezies Pseudomonas aeruginosa beschrieben, bei der es sich jedoch aufgrund ihrer hohen Pathogenität, ihrer ziemlich weiten Verbreitung und der Tatsache, dass sie an zahlreichen nosokomialen Krankheiten beteiligt ist, um eine der am intensivsten beforschten Spezies handelt.
Erfindungsgemäß wird nun eine Reihe von Substraten, die auf β-Alanin als Zielteil beruhen und die alle einen echten Nachweis von Pseudomonas aeruginosa gestatten, vorgeschlagen. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die mindestens solch ein Substrat enthält, sowie ein Verfahren zum Nachweisen von Pseudomonas aeruginosa.
Die Wirkung von β-Alanin ist natürlich schon gut bekannt. So werden in einem Artikel von Kasafirek, Evzen et al., mit dem Titel „Role of amino acid residues in chromogenic substrates cleaved by pancreatic elastase" [Rolle von Aminosäureresten in von Pancreas-Elastase gespaltenen chromogenen Substraten], Collect. Czech. Chem. Commun. (1987), 52(6), 1625-33, chromogene Substrate wie zum Beispiel β-Alanin-p-nitroanilin (Synthese siehe Seite 1631) erwähnt.
Der Unterschied, der uns bezüglich der vorliegenden Erfindung wesentlich zu sein scheint, betrifft das in Angriff genommene Ziel, nämlich Pseudomonas aeruginosa, und nicht das Enzym Pancreas-Elastase.
In einem Artikel von J. B. Suszkiw, A. S. Brecher über „Brain Aminoacyl Arylamidase. Further Purification of the Soluble Bovine Enzyme and Studies on Substrate Specificity and Possible Active-Site Residues" [Hirn-Aminoacylaraylamidase. Weitere Aufreinigung des löslichen Rinder-Ezyms sowie Untersuchungen über die Substratspezifität und mögliche Reste mit aktiven Stellen.], Biochemistry, Bd. 9, Nr. 20 (1970), Seiten 4008-4017, wird eine Methode für die Aufreinigung einer aus Rinderhirn extrahierten löslichen Arylamidase, nämlich β-Alanin-β-naphthylamin (Synthese siehe Seite 4010, 2. Absatz) vorgeschlagen.
Wiederum handelt es sich um ein ganz anderes Ziel als bei uns.
Eine Patentanmeldung WO-A-96/40980 beschreibt ein Verfahren und eine Zusammensetzung zum Nachweisen des Vorliegens bzw. Messens der Konzentration der Gesamtheit aller lebenden Bakterien in einer Nahrungsmittelprobe. Zu diesem Zweck werden zahlreiche Substrate, darunter auch N-Acetyl-L-phenylalanyl-L-arginin-7-amido-4-methycumarinhydrochlorid, verwendet.
Die Hauptzielsetzung dieser Schrift ist jedoch nicht die Spezifität einer einzigen Spezies, nämlich Pseudomonas aeruginosa, sondern die Gesamtheit der Bakterien, zu diesem Zweck wird eine Vielzahl von Substraten verwendet, von denen keines den Nachweis der spezifischen β-Alaninaminopeptidase-Aktivität von Pseudomonas aeruginosa ermöglicht, da in der Aufzählung zahlreiche Spezies angeführt sind, wobei als Pseudomonas-Spezies nur zwei bestimmte Spezies erwähnt werden, nämlich Pseudomonas fluorescens und Pseudomonas putida, wobei die erstgenannte Spezies leicht zu unterscheiden ist, da Pseudomonas aeruginosa aufgrund der Tatsache, dass diese Spezies Pyoverdin produziert, auf natürliche Art und Weise eine grüne Färbung erzeugt und die letztgenannte Spezies keinerlei β-Alaninaminopeptidase-Aktivität aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft also ein Enzymsubstrat, das aus einem Zielteil und einem Markerteil besteht, wobei die Hydrolyse des Substrats das Trennen des Zielteils und des Markerteils ermöglicht, wobei der Zielteil die gesuchte Enzymaktivität kennzeichnet, dadurch gekennzeichnet, dass der Zielteil das Aufzeigen einer β- Alaninaminopeptidase-Enzymaktivität von mindestens einem Pseudomonas aeruginosa Mikroorganismus ermöglicht und wobei der Markerteil ein Molekül ist, das die Hydrolysereaktion aufzeigt.
Der Zielteil besteht gemäß einer bevorzugten alternativen Ausführungsform aus β-Alanin oder einem seiner Derivate und der Markerteil ist ein chromogenes oder fluoreszierendes Molekül.
Das Substrat weist immer noch gemäß einer bevorzugten alternativen Ausführungsform die folgende Formel auf: N₂N-CH₂-CH₂-CO-NH-R, wobei H₂N-CH₂-CH₂-CO- der Zielteil ist und -NH-R der chromogene oder fluoreszierende Markerteil des Substrats ist.
Der Markerteil besteht gemäß noch einer bevorzugten alternativen Ausführungsform aus Folgendem:

– β-Naphtylamin,
– Aminomethylcumarin, wie 7-Amino-4-methylcumarin,
– Aminobenzolderivat, wie 4-Amino-2,6-dichlorphenol,
– p-Nitroanilin oder
– 2-Aminoindoxyl oder 3-Aminoindoxyl.

Die Erfindung betrifft auch ein Enzymsubstrat, das aus einem Zielteil und einem Markerteil besteht, wobei die Hydrolyse des Substrats das Trennen des Zielteils und des Markerteils ermöglicht, wobei der Zielteil das Aufzeigen einer enzymatischen β-Alaninaminopeptidaseaktivität von mindestens einem Pseudomonas aeruginosa Mikroorganismus ermöglicht, und wobei der Markerteil ein Molekül ist, das die Hydrolysereaktion aufzeigt, dadurch gekennzeichnet, dass der Zielteil des Enzymsubstrats aus β-Alanin oder einem seiner Derivate besteht und der Markerteil aus Folgendem besteht:

– Aminobenzol-Derivat, wie 4-Amino-2,6-dichlorphenol,
– 2-Amino-indoxyl oder 3-Amino-indoxyl.

Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, die den Nachweis von mindestens einem Mikroorganismenstamm und/oder einer Mikroorganismenspezies ermöglicht und die mindestens ein wie oben beschriebenes Substrat und ein Nährmedium umfasst.
Gemäß einer Variante die Zusammensetzung, die den Nachweis von mindestens einem Mikroorganismenstamm und einer Mikroorganismenspezies oder von mindestens zwei Mikroorganismenstämmen oder zwei Mikroorganismenspezies ermöglicht, die mindestens ein wie oben beschriebenes Substrat, mindestens ein anderes Substrat und ein Nährmedium umfasst. Gemäß einer Variante enthält das Nährmedium einen Entwickler.
In diesem Fall enthält das Nährmedium Folgendes als Entwickler:

– 3,5-Dihydroxy-2-naphthoesäure, wenn der freigesetzte Markerteil ein Aminobenzolderivat ist.

Vorzugsweise liegt die Zusammensetzung in Form eines flüssigen Mediums oder eines Agarmediums vor.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen der Bakterienspezies Pseudomonas aeruginosa, bestehend aus Folgendem:

– Zusammenbringen von mindestens einem Substrat, das das Ermitteln der β-Alaninaminopeptidase-Enzymaktivität ermöglicht, mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens einen Pseudomonas-aeruginosa-Mikroorganismus enthält, und
– Beobachten des Erscheinens von Farb- und/oder Fluoreszenzreaktionen.

Gemäß einer Variante besteht das Verfahren zum Nachweisen der Bakterienspezies Pseudomonas aeruginosa aus Folgendem:

– Zusammenbringen von mindestens einem Substrat, das das Ermitteln der β-Alaninaminopeptidase-Enzymaktivität ermöglicht, mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens einen Pseudomonasaeruginosa-Mikroorganismus enthält,
– Zusammenbringen von mindestens einem Substrat, das das Ermitteln einer Enzymaktivität, die sich von der β-Alaninaminopeptidase-Enzymaktivität unterscheidet, ermöglicht, mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens einen von Pseudomonas aeruginosa verschiedenen Mikroorganismus enthält, wobei diese andere Enzymaktivität das Unterscheiden von Pseudomonas aeruginosa von diesem anderen Mikroorganismus ermöglicht, und
– Beobachten des Erscheinens von Farb- und/oder Fluoreszenzreaktionen.

Bei den beiden Fällen oben ist das Nährmedium geliert.
In diesem Fall versetzt man das Nährmedium mit einem Mittel, das die Migration der beobachteten Färbung(en) reduziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer biologischen Eigenschaft, die den meisten Stämmen der Bakterienspezies Pseudomonas aeruginosa zu eigen ist, die über eine β-Alaninaminopeptidase-Aktivität verfügt. Diese Eigenschaft findet sich sonst nur bei seltenen anderen Spezies.
Die Erfindung besteht darin, dass man den für das Enzym spezifischen Zielteil, der aus β-Alanin besteht, mit einem entsprechenden Markerteil kombiniert. Solche Markerteile, die diese Aktivität aufzeigen können, existieren bereits, ihre Verwendung für den Nachweis von Pseudomonas aeruginosa ist jedoch nicht bekannt, da der Zusammenhang zwischen dieser Spezies und dieser Enzymaktivität niemals beschrieben wurde.
So besteht die erste Substratfamilie aus einem Molekül, das als Markerteil die Naphthylamine aufweist, wobei eine der Formeln, die dem Substrat β-Alanyl-β-naphthylamid entspricht,
lautet, wobei R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇ und R₈ ein Wasserstoff- oder Brom- oder Chlor- oder Iodatom bedeuten oder durch eine Gruppe des Typs -OH, -CH₃, -CH₂CH₃, -OCH₃, -OCH₂CH₃ oder COOH in jeder dieser Positionen. β-Naphthylamin kann zum Nachweis der β-Alaninaminopeptidase-Aktivität verwendet werden, was in der am 4. Juli 1978 an der Université Claude Bernard, Lyon, von Daniel Monget vorgelegten Doktorarbeit (Nr. 297) beschrieben wird. Da diese Art von Molekül farblos ist, ist es günstig, einen Entwickler, wie ein Diazoniumsalz, zuzugeben, damit sie verwendungsfähig sind.
Die zweite Substratfamilie des Stands der Technik besteht aus Molekülen, deren Markerteil auf Aminomethylcumarin basiert, das, sobal sein Zielteil abgespalten ist, fluoresziert. Die allgemeine Formel dieser Substratfamilie lässt sich von der folgenden Einzelformel, die dem β-Alanyl-7-amido-4-methylcumarin entspricht, ableiten:
wobei R₉, R₁₂, R₁₃, R₁₄ und R₁₅ ein Wasserstoff- oder Brom- oder Chlor- oder Iodatom bedeuten oder durch eine Gruppe des Typs -OH, -CH₃, -CH₂CH₃, -OCH₃, -OCH₂CH₃ oder COOH an jeder dieser Positionen. Dieser Substrattyp eignet sich schlecht für eine Verwendung in Agarmedien und wird mehr bei Flüssigmedien angewandt.
Die dritte Substratfamilie besteht aus β-Alanyl-4-amino-2,6-dichlorphenol, die 2,6-Dichloraminophenol als Markerteil aufweist, und die der folgenden allgemeinen Formel entspricht:
wobei R₁₆ und R₁₇ ein Wasserstoff- oder Brom- oder Chlor- oder Iodatom bedeuten oder durch eine Gruppe des -OH, -CH₃, -CH₂CH₃, -OCH₃, -OCH₂CH₃ oder COOH an jeder dieser Positionen. Dieser Molekültyp wurde bereits in einer früheren Patentanmeldung, nämlich der von der Anmelderin hinterlegten Schrift WO-A-99/51767 beschrieben und erfordert das Vorhandensein eines trockenen Entwicklers, zum Beispiel 3,5-Dihydroxy-2-naphthoesäure. Jedenfalls zeigt diese Patentanmeldung WO-A-99/51767, dass andere Moleküle, bei denen die beiden Chloratome und die Hydroxygruppe durch ein Wasserstoff- oder Brom- oder Chlor- oder Iodatom oder durch eine Gruppe des Typs -OH, -CH₃, -CH₂CH₃, -OCH₃, -OCH₂CH₃ oder COOH an jeder dieser Positionen ersetzt sind, verwendet werden können.
Die vierte Substratfamilie beruht auf β-Alanyl-p-nitnoanilid oder seinen Derivaten, wobei p-Nitroanilin als Markerteil dient. Die allgemeine Formel dieses Substrattyps lautet:
wobei R₁₈, R₁₉, R₂₀ und R₂₁ ein Wasserstoff- oder Brom- oder Chlor- oder Iodatom bedeuten oder durch eine Gruppe des -OH, -CH₃, -CH₂CH₃, -OCH₃, -OCH₂CH₃ oder COOH an jeder dieser Positionen. Bei diesem Produkt ist das Vorhandensein eines Entwicklers nicht erforderlich.
Die fünfte Substratfamilie beruht auf 2-Aminoindol oder 3-Aminoindol als Markerteil. Die allgemeine Formel dieser Substrate lautet:
für 2-Aminoindol und
für 3-Aminoindol.
Alle diese Substrate sind chromogen, mit Ausnahme der zweiten Familie, die fluoresziert, und stellen alle Moleküle dar, mit denen die β-Alaninaminopeptidase-Enzymaktivität von Pseudomonas aeruginosa identifiziert werden kann. Aufgrund dieser Identifikation kann man gut zwischen dieser klinisch-pathogenen Spezies und anderen verwandten gramnegativen Bazillenspezies unterscheiden.
1. Verwendete Substrate:
Die verwendeten Enzymsubstrate weisen die folgende Formel auf: H₂N-CH₂-CH₂-CO-NH-R, in der H₂N-CH₂-CH₂-COOH β-Alanin, also der Zielteil des Substrats, und -NH₂-R das Chromogen, also der Markerteil des Substrats, sind.
Es wurden vier Substrate, die den vier ersten zuvor beschriebenen Substratfamilien entsprechen, geprüft. Es handelt sich um:

– β-Alanyl-β-naphthylamid, das unter der Bezeichnung K1035 von Bachem, Bubendorf, Schweiz, vertrieben wird,
– β-Alanyl-7-amido-4-methylcumarin, das unter der Bezeichnung 11030 von Bachem, Bubendorf, Schweiz, vertrieben wird,
– β-Alanyl-4-amino-2,6-dichlorphenol, dessen Synthese unten beschrieben wird, sowie
– β-Alanin-p-nitroanilid, dessen Synthese weiter unten beschrieben wird.

β-Alanyl-4-amino-2,6-dichtorphenol wird ausgehend von N-tert.-Butoxycarboxyl-β-alanin (1,89 g, 10 mmol) dargestellt. Dieses N-tert.-Butoxycarboxyl-β-alanin wird in wasserfreiem Tetrahydrofuran (HPLC-Qualität, 30 ml) gelöst. Die Lösung wird mit einem Eis-Salz-Bad auf 0 °C abgekühlt und mit N-Methylmorpholin (2,02 g, 20 mmol) versetzt. Man erniedrigt die Temperatur auf unter –10 °C und versetzt nach und nach mit Chlorameisensäureisobutylester (2,74 g, 20 mmol), wobei die Temperatur unterhalb –8 °C gehalten wird. Zu dieser wasserfreien Suspension gibt man eine kalte Lösung von 4-Amino-2,6-dichlorphenol (1,78 g, 10 mmol), gelöst in Dimethylformamid und behandelt mit N-Methylmorpholin (4,08 g, 40 mmol), um die Base freizusetzen. Diese Lösung wird nun vor der oben genannten Zugabe unterhalb von Raumtemperatur aufbewahrt. Der erhaltene Ansatz wird eine Stunde lang im Eis-Salz-Bad und anschließend fünf Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Dünnschichtchromatographie zeigt eine fast vollständige Umwandlung des Produkts in das Amid. Die Suspension wird filtriert, um das N-Methylmorpholin-hydrochlorid zu entfernen, wobei der Rückstand durch Versetzen mit Tetrahydrofuran gewaschen wird. Abschließend werden das Tetrahydrofuran und ein wenig Dimethylformamid abrotiert und man gießt die erhaltene Lösung langsam auf stark gerührtes Eiswasser. Der graue Niederschlag wird gewonnen, gut mit Wasser gewaschen und bei 30-40 °C im Vakuumofen getrocknet. Das Produkt wird aus Methanol mit einem Zusatz von ein wenig Wasser umkristallisiert, wodurch man 1,72 g kleine weiße Kristalle erhält. Dabei handelt es sich um N-β-t-BOC-β-Alanyl-4-amino-2,6-dichlorphenol, welches anschließend in ganz wenig mit Chlorwasserstoff gesättigtem Essigester gelöst wird. Nach zwei Stunden bei ungefähr 16 °C wird die viskose Lösung vorsichtig in 250 ml wasserfreien Diethylether gegossen. Nach vier Stunden wird der pulverförmige Feststoff durch Vakuumfiltration gewonnen und mit Diethylether gewaschen. Das Produkt wird anschließen in einem Vakuumexsikkator getrocknet und isoliert, um die Hygroskopizität so gering wie möglich zu halten.
Die Synthese von – β-Alanin-p-nitroanilid erfolgt folgendermaßen. Eine Menge von 2,76 Gramme (g), also 20 Millimol (mmol), 4-Nitroanilin wird in Gegenwart von 40 Millilitern (ml) zuvor getrocknetem und gekühltem Pyridin bei einer Temperatur von mindestens 12 °C durch Rühren gelöst. Weiter werden 12 ml Pyridin mit Phosphortrichlorid (1 ml, doppelt destilliert) versetzt, ebenfalls bei einer Temperatur von mindestens 12 °C. Die beiden Lösungen werden anschließend auf mindestens 16 °C gekühlt, und die zweite Lösung, die das Phosphortrichlorid enthält, wird unter Rühren zu der ersten Lösung, die das Nitroanilin enthält, zugegeben. Dieser Mischvorgang wird mindestens 30 Minuten (min) lang bei einer Temperatur zwischen mindestens 14 und mindestens 16 °C und anschließend gleich lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Anschließend versetzt man die obige Lösung unter mindestens fünfminütigem Rühren nacheinander mit kleinen Portionen von 20 mmol, also 4,46 g, trockenem Benzyloxycarbonyl-β-alanin. Es wird noch 14 Stunden (h) lang zwischen 30 und 40 °C weitergerührt. Anschließend wird die Temperatur auf 50 °C gebracht und es wird noch acht Stunden lang weitergerührt. Die Dünnschichtchromatographie einer verdünnten Probe zeigt, dass ein Großteil der Ausgangsprodukte in das β-Aminoacylderivat ungewandelt wurde. Anschließend rotiert man das Pyridin bei 50 °C ab.
Das verbleibende viskose Öl wird stark mit zerkleinertem Eis in Gegenwart von Ethanol gerührt. Man erhält auf diese Weise teilweise einen gelblichen Feststoff an den Wänden des diesen enthaltenden Gefäßes sowie teilweise eine Kristallmasse. Der Feststoff wird aufgenommen, durch Absaugen filtriert und mit Wasser gewaschen. Das luftgetrocknete Produkt wird aus heißem Ethanol umkristallisiert. Das trockene Produkt wiegt 4,3 g und ist gemäß Dünnschichtchromatographie (DSC) an Silicagelplatten (Lösungsmittel Essigester/Toluol) homogen. Die Ausbeute beträgt 62,7 %. Der durch das Benzyloxycarbonyl gewährleistete Schutz, der in dem Benzyloxycarbonyl-β-alanin-p-nitroanilid vorliegt, wird anschließend entfernt. Es werden also 2,15 g dieser Substanz in so wenig wie möglich heißem Eisessig unter Rühren gelöst. Diese auf 25 °C abgekühlte Mischung wird unter Rühren mit einem gleichen Volumen von 30 %igem Bromwasserstoff in Eisessig versetzt. Nach 1 h 30 min wird die viskose Lösung langsam unter starkem Rühren in 400 ml wasserfreien Diethylether gegossen. Die erhaltene weiße Suspension wird anschließend filtriert, und der Rückstand wird mehrmals mit wasserfreiem Ether gewaschen und anschließend über Nacht in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Auf diese Weise erhält man 1,50 g β-Alanin-p-nitroanilid in Form des Bromidsalzes.
2. NACHWEIS DER β-ALANINAMINOPEPTIDASE-ENZYMAKTIVITÄT MITTELS UNTERSCHIEDLICHER ENZYMSUBSTRATE:
A – Prüfung des Substrats β-Alanyl-β-naphthylamid und der Selektivität des Zielteils:
Es wurden mehrere Spezies in einer Menge von fünf Stämmen pro Spezies, falls nicht anders angegeben, in Gegenwart von β-Alanyl-β-naphthylamid in Gallerien des Typs APIZYM von bioMérieux, La Balme, Frankreich, geprüft. Die Reaktionen wurden mit Bakteriensuspensionen mit einer Dichte von 4 Mc Farland (McF) in 0,01 M Phosphatpuffer bei pH 7,5 durchgeführt. Bei der Mc Farland-Skala handelt es sich um eine Bakterienkonzentrationsskala, bei der 4 McF 12 × 10⁸ Bakterien pro Milliliter entsprechen. Es wurden 80 Mikroliter Suspension von jedem Stamm in jedes der Näpfchen der Galerie gegeben. Die Galerien wurden vier Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Das Vorliegen der β-Ataninaminopeptidase wird durch Versetzen mit einem Tropfen ZYMB (Diazoniumsalz, Fast Blue BB), das von bioMérieux unter der Nummer 70480 im Handel erhältlich ist, nachgewiesen. Eine positive Reaktion wird durch das Auftreten einer Orange-Färbung bezeugt. Die Ergebnisse lauten folgendermaßen: Bei den im Folgenden aufgezählten Spezies tritt eine negative Reaktion auf; anders ausgedrückt wurde keine β-Alaninaminopeptidase-Aktivität nachgewiesen:

– Escherichia coli,
– Shigella spp. (4 Stämme),
– Shigella sonnei,
– Edwarsiella tarda (2 Stämme),
– Salmonella choleraesuis,
– Salmonella typhi,
– Salmonella spp.,
– Salmonella paratyphi 4,
– Salmonella gallinarum (3 Stämme),
– Salmonella arizonae,
– Citrobacter freundii,
– Citrobacter diversus,
– Klebsiella pneumoniae, spp. pneumoniae,
– Klebsiella pneumoniae, spp. oxytoca,
– Klebsiella ozaenae,
– Klebsiella rhinoscleromatis (3 Stämme),
– Hafnia alvei,
– Enterobacter aerogenes,
– Enterobacter cloacae,
– Enterobacter sakazakii,
– Enterobacter gergoviae,
– Serratia marcescens,
– Serratia odorifera,
– Serratia fonticola,
– Serratia plymuthica,
– Proteus vulgaris,
– Proteus mirabilis,
– Proteus morganii,
– Proteus rettgeri,
– Providencia alcalifaciens,
– Providencia stuartii
– Yersinia enterocolitica,
– Yersinia pseudotuberculosis,
– Pseudomonas putida,
– Comamonas acidovorans,
– Comamonas testosteroni,
– Pseudomonas alcaligenes,
– Pseudomonas stutzeri,
– Shewanella putrefaciens,
– Stenotrophmoonas maltophilia,
– Brevundimonas diminuta,
– Brevundimonas vesicularis,
– Ralstonia picketti,
– Pseudomonas luteola,
– Pseudomonas oryzihabitans,
– Sphingomonas paucimobilis,
– Sphingobacterium multivorum,
– Alcaligenes faecalis/odorans,
– Achromobacter xylosoxidans spp. denitrificans,
– Achromobacter xylosoxidans, spp. xylosoxidans,
– Bordetella bronchiseptica,
– Oligella ureolytica (2 Stämme),
– CDC IV C₂,
– Aeromonas hydrophila,
– Plesiomonas shigelloides,
– Vibrio alginolyticus,
– Vibrio parahaemolyticus (4 Stämme),
– Chryseobacterium meningosepticum,
– Empedobacter brevis (3 Stämme),
– Chryseobacterium balustinum (1 Stamm),
– Chryseobacterium indologenes,
– Weeksella virosa (4 Stämme),
– Myroides spp.,
– Pasteurella gallinarum (1 Stamm),
– Pasteurella multocida,
– Pasteurella pneumotropica (4 Stämme),
– Actinobacillus ureae (1 Stamm),
– Pasteurella haemolytica,
– Pasteurella aerogenes,
– Verwandte von Pasteurella (4 Stämme),
– Psychrobacter phenylpyruvicus (4 Stämme),
– Moraxella paraphenylpyruvica (3 Stämme),
– Moraxella lacunata (4 Stämme),
– Moraxella lac. sp. liquefaciens (7 Stämme),
– Moraxella non liquefaciens (13 Stämme),
– Moraxella bovis (4 Stämme),
– Moraxella osloensis (18 Stämme) und
– Actinobacillus spp.

Im Gegensatz dazu tritt bei einigen im Folgenden aufgezählten Spezies eine positive Reaktion auf; anders ausgedrückt, wurde eine β-Alaninaminopeptidase-Aktivität nachgewiesen:

– Serratia liquefaciens,
– Pseudomonas aeruginosa,
– Pseudomonas fluorescens,
– Burkholderia cepacia,
– Pseudomonas mendocina. und
– Ochrobactrum anthropi.

CDC bedeutet „Center for Disease Control". Bei den CDC-Gruppen handelt es sich um Bezeichnungen von Gruppen von Stämmen, denen noch eine Speziesbezeichnung zuzuordnen ist.
Das Substrat β-Alanyl-β-naphthylamid, insbesondere der Zielteil, das β-Alanin, ist also insofern besonders selektiv, als nur sechs (6) Spezies eine β-Alaninaminopeptidase-Aktivität aufweisen, während neunundsiebzig (79) Spezies diese nicht aufweisen, was ungefähr 7,1 % positive Spezies unter den Prüfspezies bedeutet.
Die Unterscheidung von Pseudomonas aeruginosa unter den sechs Spezies kann leicht mit einem Agarmedium durch das Vorhandensein einer grünen Färbung aufgrund der Pyoverdinproduktion dieser Spezies durchgeführt werden.
B – Prüfung des Substrats β-Alanyl-7-amido-4-methylcumarin und Wirksamkeit bei dem Nachweis von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen:
Das Substrat β-Alanyl-7-amido-4-methylcumarin wurde mit der folgenden Methodik verwendet. Die Stämme waren an den folgenden Medien von bioMérieux, Frankreich, isoliert worden:

– Columbia-Schafsblut,
– Trypticase-Soja-Schafsblut, sowie
– MacConkey (Isolationsmedium für Enterobakterien)

Die Reaktionen wurden in Karten des Typs Vitek 2 (eingetragenes Warenzeichen, bioMérieux, Saint Louis, Missouri, Vereinigte Staten) mit Bakteriensuspensionen, die auf eine Dichte zwischen 0,375 und 0,750 McF eingestellt worden waren, durchgeführt.
In Tabelle 1 unten wird angegeben, ob das geprüfte Substrat für gewisse Spezies, die bereits im vorhergehenden Kapitel genannt wurden, oder für neue Spezies (zum Beispiel Ochrobactrum anithropi) von Bedeutung ist oder nicht.
Mit einfachen Tests wie der Hydrolyse von Arginin (ADH) oder der Verwertung von Acetamid lässt sich zwischen Pseudomonas aeruginosa und der Spezies Ochrobactrum anithropi unterscheiden.
Tabelle 1: Wirksamkeit des Substrats ß-Alanyl-7-amido-4-methylcumarin
Das Substrat ist β-Alanyl-7-amido-4-methylcumarin ist daher besonders wirkungsvoll für den Nachweis der Spezies:

– Ochrobactrum anthropi, da die positiven Reaktionen 100 ausmachen,
– Pseudomonas aeruginosa, da die positiven Reaktionen 97,8 ausmachen, sowie
– Pseudomonas mendocina, da die positiven Reaktionen 100 ausmachen.

Der für Pseudomonas aeruginosa gefundene Wert ist insofern besonders interessant, als die Anzahl der geprüften Proben 137 Spezies umfasst. Dass drei Stämme nicht oder nur schlecht reagieren, hängt mit einer biologischen Variabilität dieser Spezies zusammen.
Andere Spezies verfügen über eine teilweise Fähigkeit, β-Alanyl-7-amido-4-methylcumarin zu hydrolysieren, wobei es sich um folgende handelt:

– Ralstonia pickettii, da die positiven Reaktionen 20 % ausmachen, und
– Chromobacterium violaceum, da die positiven Reaktionen 10 ausmachen.

C – Prüfung des Substrats β-Alanyl-4-amino-2,6-dichlorphenol und Wirksamkeit beim Nachweis von Stämmen von Pseudomonas aeruginosa:
Nach Isolation auf Columbia-Schafsblutagar werden die Stämme in Flüssigmedien auf Karten des Typs Vitek 2 (eingetragenes Warenzeichen, bioMérieux, Saint Louis, Missouri, Vereinigte Staten), die das Substrat β-Alanyl-4-amino-2,6-dichlorphenol enthalten, in Gegenwart von 3,5-Dihydroxy-2-naphthoesäure, und einem gepufferten Pepton-Reaktionsmedium bei pH 8,5 geprüft. Die Dichte der Bakteriensuspensionen beträgt 0,5 MF/NaCl 4,5 g/l. Die visuelle Auswertung erfolgt nach 22- bis 24-stündiger Inkubation. Die gefundenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt.
Tabelle 2: Wirksamkeit des Substrats β-Alanyl-4-amino-2,6-dichlorphenol
Mit diesem Substrat, nämlich β-Alanyl-4-amino-2,6-dichlorphenol, erzielt man Ergebnisse, die bei Pseudomonas aeruginosa, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens immer stark signifikant sind und bei Pseudomonas mendocina und Ochrobactrum anthropi relativ signifikant sind. Es kann daher von Interesse sein, dieses Substrat mit einem anderen Substrat, das die Unterscheidung von Pseudomonas aeruginosa von anderen Mikroorganismen mit positiver Reaktivität ermöglicht, zu kombinieren (siehe 3. Absatz). Der Fall Pseudomonas fluorescens ist schwierig zu interpretieren und deutet eher auf ein Handhabungsproblem oder auf die genetische Variabilität dieser Spezies hin.
Weiterhin ist bemerkenswert, dass das Vorhandensein von Polyvinylpyruvat (PVP) die Färbung der positiven Reaktionen verbessert.
D – Prüfung des Substrats β-Alanyl-para-nitroanilid:
Es handelt sich im Wesentlichen um die gleiche Methodik wie oben in Absatz C, nur dass die visuelle Auswertung nach 19-stündiger Inkubation erfolgt. Als Substrat wurde β-Alanyl-p-nitroanilid verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten zusammengefasst.
Tabelle 3: Wirksamkeit des Substrats β-Alanyl-p-nitroanilid
Das Ergebnis ist insofern sehr aussagekräftig, als leicht zwischen dem Vorhandensein von Pseudomonas aeruginosa im Vergleich zu anderen Spezies, die über keine β-Alaninaminopeptidase-Enzymaktivität verfügen, unterschieden werden kann.
Mit den Substraten, deren Zielteil β-Alanin ist, mit dem die β-Alaninaminopeptidase-Enzymaktivität nachgewiesen werden kann, eignen sich daher ganz besonders für den Nachweis von Pseudomonas aeruginosa und von einigen anderen Spezies (Serratia liquefaciens, Pseudomonas marcescens, Pseudomonas mendocina und Ochrobactrum anthropi), die in einer Probe wesentlich seltener auftreten als Pseudomonas aeruginosa. Aus diesem Grund wird am häufigsten das Vorhandensein dieser Enzymaktivität in Verbindung mit dem Vorhandensein von Pseudomonas aeruginosa in der geprüften biologischen Probe nachgewiesen werden. Es ist jedoch wie im folgenden Absatz gezeigt möglich, zwischen Pseudomonas aeruginosa und einer dieser anderen Spezies mit β-Alaninaminopeptidase-Aktivität zu unterscheiden.
3) GEMEINSAME VERWENDUNG DER BEIDEN ENZYMSUBSTRATE FÜR DEN NACHWEIS VON ZWEI VERSCHIEDENEN ENZYMAKTIVITÄTEN, VON DENEN ES SICH BEI EINER UM DIE β-ALANINAMINOPEPTIDASE-ENZYMAKTIVITÄT HANDELT:
Diese Verwendung der beiden Substrate für den Nachweis von zwei verschiedenen Enzymaktivitäten ist besonders wichtig. Dies ist zum Beispiel bei der β-Glucosidaseaktivität und der β-Alaninaminopeptidaseaktivität der Fall.
So wurde in Beispiel A von Kapitel 2 gezeigt, dass die Spezies Pseudomonas aeruginosa und Pseudomonas mendocina beide eine β-Alaninaminopeptidase-Aktivität aufweisen. Man kann jedoch zwischen diesen beiden Spezies dadurch unterscheiden, dass man die β-Glucosidaseaktivität untersucht, die bei Pseudomonas mendocina fehlt. Dieses Enzym kann zum Beispiel mit dem Substrat 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glycopyranosid von Biosynth, Staad, Schweiz, nachgewiesen werden.
Die Unterscheidung zwischen diesen beiden Spezies kann auf Agarmedium wie im Folgenden beschrieben durchgeführt werden.
Ein Trypticase-Soja-Agarmedium wird mit

– 200 mg 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glycopyranosid,
– 50 mg β-Alanyl-N,N'-dimethyl-p-phenylendiamin und
– 15 mg 3,5-Dihydroxy-2-naphthoesäure

Das Medium wird aufgeteilt, und folgendermaßen inokuliert:

– 10 Schalen werden mit Reinkulturen, die fünf Pseudomonas aeruginosa-Stämmen und fünf Pseudomonas mendocina-Stämmen entsprechen, inokuliert und
– 2 Schalen werden mit einer Mischung von zwei Stämmen beimpft, wobei es sich bei einem um Pseudomonas aeruginosa und bei dem anderen um Pseudomonas mendocina handelt.

Die Petrischalen werden bei 35-37 °C inkubiert. Nach 18-24-stündiger Inkubation wird die Färbung der Kolonien beobachtet. Blaue Kolonien mit einem blauen Hof entsprechen Pseudomonas aeruginosa und dem Vorliegen der β-Alaninaminopeptidase-Aktivität, während die purpurfarbenen Kolonien mit einem blauen Hof Pseudomonas mendocina und dem Vorliegen der beiden Aktivitäten β-Alaninaminopeptidase-Aktivität und β-Glucosidase-Aktivität entrsprechen.
Man kann so sehr einfach auf ein- und demselben Medium zwischen einer Mischung von Stämmen, die zu diesen beiden Spezies gehören, unterscheiden, wenn diese in ein- und derselben Probe vorliegen. Dieses Beispiel zeigt, dass es möglich ist, mehrere Substrate in Verbindung mit mehreren Enzymaktivitäten in ein- und demselben Reaktionsmedium zu kombinieren, wobei es sich bei einer um eine erfindungsgemäße Enzymreaktion für die Charakterisierung von Pseudomonas aeruginosa handelt.

Claims

Die In-vitro-Verwendung eines enzymatischen Substrats für den Nachweis von mindestens einem Pseudomonas aeruginosa Mikroorganismus, wobei das Substrat aus einem Zielteil und einem Markerteil besteht, wobei die Hydrolyse des Substrats das Trennen des Zielteils und des Markerteils ermöglicht, wobei der Zielteil die gesuchte Enzymaktivität kennzeichnet, und das Aufzeigen einer β-Alaninaminopeptidase-Enzymaktivität aus mindestens einem Pseudomonas aeruginosa Mikroorganismus ermöglicht, und wobei der Markerteil ein Molekül ist, das die Hydrolysereaktion aufzeigt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Zielteil des Enzymsubstrats aus β-Alanin oder einem seiner Derivate besteht und der Markerteil ein chromogenes oder fluoreszierendes Molekül ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzymsubstrat die folgende Formel aufweist: H₂N-CH₂-CH₂-CO-NH-R, wobei H₂N-CH₂-CH₂-CO- der Zielteil ist und -NH-R der chromogene oder fluoreszierende Markerteil des Substrats ist.
Verwendung gemäß einem des Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Markerteil des Enzymsubstrats aus Folgendem besteht: – β-Naphthylamin, – Aminomethylcumarin, wie 7-Amino-4-methylcumarin, – Aminobenzol-Derivat, wie 4-Amino-2,6-dichlorphenol, – p-Nitroanilin oder – 2-Amino-indoxyl oder 3-Amino-indoxyl.
Ein Enzymsubstrat, das aus einem Zielteil und einem Markerteil besteht, wobei die Hydrolyse des Substrats das Trennen des Zielteils und des Markerteils ermöglicht, wobei der Zielteil das Aufzeigen einer enzymatischen β-Alaninaminopeptidaseaktivität von mindestens einem Pseudomonas aeruginosa Mikroorganismus ermöglicht, und wobei der Markerteil ein Molekül ist, das die Hydrolysereaktion aufzeigt, dadurch gekennzeichnet, dass der Zielteil des Enzymsubstrats aus β-Alanin oder einem seiner Derivate besteht und der Markerteil aus Folgendem besteht: – Aminobenzol-Derivat, wie 4-Amino-2,6-dichlorphenol, – 2-Amino-indoxyl oder 3-Amino-indoxyl.
Eine Zusammensetzung, die den Nachweis von mindestens einem Mikroonganismenstamm und/oder einer Mikroorganismenspezies ermöglicht und die mindestens ein Substrat gemäß Anspruch 5 und ein Nährmedium umfasst.
Eine Zusammensetzung, die den Nachweis von mindestens einem Mikroorganismenstamm und einer Mikroorganismenspezies oder mindestens zwei Mikroorganismenstämmen oder zwei Mikroorganismenspezies ermöglicht und die mindestens ein Substrat gemäß Anspruch 5, mindestens ein anderes Substrat und ein Nährmedium umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium einen Entwickler, wie etwa 3,5-Dihydroxy-2-Naphthoesäure, enthält, wenn der freigesetzte Markerteil ein Aminobenzol-Derivat wie Dichlor-aminophenol ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form eines flüssigen Mediums oder eines Agarmediums vorliegt.
Ein Verfahren zum Nachweisen der Bakterienspezies Pseudomonas aeruginosa, bestehend aus Folgendem: – Zusammenbringen von mindestens einem Substrat, das das Ermitteln der β-Alaninaminopeptidase-Enzymaktivität ermöglicht, mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens einen Pseudomonas aeruginosa Mikroorganismus enthält, – Zusammenbringen von mindestens einem Substrat, das das Ermitteln einer Enzymaktivität, die sich von der β-Alaninaminopeptidase-Enzymaktivität unterschiedet, ermöglicht, mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens einen von Pseudomonas aeruginosa verschiedenen Mikroorganismus enthält, wobei diese andere Enzymaktivität das Unterscheiden von Pseudomonas aeruginosa von diesem anderen Mikroorganismus ermöglicht, und – Beobachten des Erscheinens von Farb- und/oder Fluoreszenzreaktionen.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem gelierten Nährmedium durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass dem Nährmedium ein Produkt, das die Migration der Färbung(en) und/oder der Fluoreszenz(en) reduziert, zugegeben wird.