ES2260084T3 - Nuevos sustratos enzimaticos para la deteccion de pseudomonas aeruginosa. - Google Patents
Nuevos sustratos enzimaticos para la deteccion de pseudomonas aeruginosa.Info
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Abstract
Utilización in vitro de un sustrato enzimático para la detección de al menos un microorganismo Pseudomonas aeruginosa, estando constituido dicho sustrato por una parte diana y por una parte marcador, permitiendo la hidrólisis del sustrato la separación de la parte diana y de la parte marcador, caracterizando dicha parte diana la actividad enzimática buscada y permitiendo revelar una actividad enzimática Beta-Alanina aminopeptidasa de al menos un microorganismo Pseudomonas aeruginosa y estando constituida la parte marcador por una molécula que permite revelar la reacción de hidrólisis.
Description
Nuevos sustratos enzimáticos para la detección
de Pseudomonas aeruginosa.
La presente invención se refiere a un sustrato
utilizable en una prueba de detección de la actividad enzimática
\beta-alanina aminopeptidasa. Se refiere
igualmente a una composición que contiene al menos dicho sustrato,
así como a un procedimiento de detección de la especie bacteriana
Pseudomonas aeruginosa.
La utilización de sustratos específicos para
permitir la determinación de la presencia o de la ausencia de
actividades enzimáticas características de microorganismos se
remonta a hace mucho tiempo. En función de los sustratos escogidos,
según haya reacción o no, se puede caracterizar la naturaleza de un
género de microorganismos o diferenciar cepas y/o especies de un
género microbiano dado.
Los sustratos sintéticos de enzimas constan de
dos partes, una primera parte específica de la actividad
enzimática que se desea revelar, denominada en lo sucesivo parte
diana, y una segunda parte que actúa como marcador, denominada en
lo sucesivo parte marcador.
Estos sustratos específicos pueden ser
fluorógenos o cromógenos. De hecho, es la segunda parte, la parte
marcador, o el producto de su reacción con uno o varios compuestos,
véase a este respecto la solicitud de patente PCT/FR 99/00781
presentada a nombre de la solicitante, la que es fluorógena o
cromógena cuando deja de estar asociada a la primera parte
diana.
Ahora bien, el estado de la técnica no describe
ninguna prueba sencilla para caracterizar la especie Pseudomonas
aeruginosa, que sin embargo sigue siendo una de las especies
más buscadas debido a su gran patogenicidad, a su considerable
frecuencia de distribución y a su implicación en numerosas
enfermedades nosocomiales.
Las partes diana propuestas de acuerdo con la
presente invención, consisten en una gama de sustratos a base de
\beta-Alanina que permiten una verdadera detección
de Pseudomonas aeruginosa. La invención también hace
referencia a una composición que contiene al menos un sustrato de
ese tipo, así como a un procedimiento de detección de
Pseudomonas aeruginosa.
La actividad \beta-Alanina es,
sin lugar a dudas, sobradamente conocida. Así, en un artículo de
Kasafirek, Evzen y col., titulado "R\hat{o}le of amino acid
residues in chromogenic substrates cleaved by pancreatic
elactase", Collect. Czech. Chem. Commun. (1987), 52(6),
1625-33, se mencionan sustratos cromogénicos como
la \beta-Alanina p-Nitroanilina
(véase su síntesis en la página 1631).
La diferencia que nos parece esencial con
respecto a la presente invención, tiene por objeto la diana
buscada, es decir, Pseudomonas aeruginosa y no la enzima
pancreática elastasa.
Un artículo de J. B. Suszkiw y A. S. Brecher
sobre "Brain Aminoacyl Arylamidase. Further Purification of the
Soluble Bovine Enzyme and Studies on Substrate Specificity and
Possible Active-Site Residues", Biochemistry,
vol. 9, nº 20 (1970), páginas 4008-4017, propone
una técnica de purificación de una Arilamidasa soluble extraída del
encéfalo de bovinos, la \beta-Alanina
\beta-naftilamina (véase su síntesis en la página
4010, 2º párrafo).
En este caso, la diana también es diferente a la
que se contempla en esta patente.
Una solicitud de patente
WO-A-96/40980 describe un
procedimiento y una composición para detectar la existencia o medir
la concentración de todas las bacterias viables en una muestra de
producto alimentario. Para ello, se utilizan varios sustratos entre
los que cabe destacar el
N-Acetil-L-fenilalanil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina
de hidrocloruro.
No obstante, el objetivo principal de este
documento no es la especificidad de una sola especie, a saber,
Pseudomonas aeruginosa, sino obtener la de todas las
bacterias. Para ello, se utiliza un gran número de sustratos que no
permiten la detección de la actividad
\beta-alanina aminopeptidasa específica de
Pseudomonas aeruginosa, ya que la lista enumera numerosas
especies y sólo menciona como especies de Pseudomonas dos
especies concretas: Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas
putida. La primera de ellas se puede diferenciar fácilmente, ya
que Pseudomonas aeruginosa genera naturalmente una
coloración verde debido a la pioverdina que produce y la segunda no
posee ninguna actividad \beta-alanina
aminopeptidasa.
Con este fin, la presente invención se refiere a
una utilización in vitro de un sustrato enzimático para la
detección de al menos un microorganismo Pseudomonas
aeruginosa, estando constituido dicho sustrato por una parte
diana y por una parte marcador cuya separación se realiza mediante
la hidrólisis del sustrato, siendo la parte diana la que
caracteriza la actividad enzimática buscada, caracterizado porque
la parte diana permite revelar una actividad enzimática
\beta-alanina aminopeptidasa de al menos un
microorganismo Pseudomonas aeruginosa y porque la parte
marcador es una molécula que revela la reacción de hidrólisis.
Según una variante de realización preferente, la
parte diana está constituida por (\beta-alanina o
por uno de sus derivados y la parte marcador es una molécula
cromógena o fluorógena.
Siempre según una variante de realización
preferente, el sustrato presenta la siguiente fórmula:
H_{2}N-CH_{2}-CH_{2}-CO-NH-R,
en la que
H_{2}N-CH_{2}-CH_{2}-CO-
es la parte diana y -NH-R es la parte marcador
cromógena o fluorógena del
sustrato.
De nuevo según una variante de realización
preferente, la parte marcador está formada por:
- -
- \beta-Naftilamina,
- -
- una Aminometilcumarina, como la 7-Amino-4-metil-cumarina,
- -
- un derivado del Aminobenceno, como el 4-Amino-2,6-diclorofenol,
- -
- p-Nitroanilina, o
- -
- 2-Amino-indoxil o 3-Amino-indoxil.
La invención también se refiere a un sustrato
enzimático que consta de una parte diana y de una parte marcador
cuya separación se realiza mediante la hidrólisis del sustrato,
siendo la parte diana la que permite revelar una actividad
enzimática \beta-alanina aminopeptidasa de al
menos un microorganismo Pseudomonas aeruginosa y estando
constituida la parte marcador por una molécula que revela la
reacción de hidrólisis, caracterizado porque la parte diana de
dicho sustrato enzimático está formada por
\beta-alanina o por uno de sus derivados y porque
la parte marcador está formada por:
- -
- un derivado del Aminobenceno, como el 4-Amino-2,6-diclorofenol,
- -
- 2-Amino-indoxil o 3-Amino-indoxil.
La invención también se refiere a una
composición que permite la detección de al menos una cepa y/o una
especie de microorganismos, que está constituida por al menos un
sustrato como el anteriormente descrito y por un medio de
cultivo.
Según una variante, la composición que permite
la detección de al menos una cepa y una especie de microorganismos
o de al menos dos cepas o dos especies de microorganismos, está
constituida por al menos un sustrato como el anteriormente
descrito, por al menos otro sustrato y por un medio de cultivo.
Según una variante, el medio de cultivo contiene
un revelador.
En tal caso, el revelador que contiene el medio
de cultivo es el:
- Ácido
3,5-dihidroxi-2-naftoico,
siempre y cuando la parte marcador liberada sea un derivado el
Aminobenceno.
Preferentemente, la composición presenta la
forma de un medio líquido o de un medio gelosado.
Por último, la invención se refiere a un
procedimiento de detección de la especie bacteriana Pseudomonas
aeruginosa que consiste en:
- -
- introducir al menos un sustrato que permite detectar la actividad enzimática \beta-alanina aminopeptidasa en presencia de una muestra susceptible de contener al menos un microorganismo Pseudomonas aeruginosa, y
- -
- observar la aparición de reacciones coloreadas y/o fluorescentes.
Según una variante, el procedimiento de
detección de la especie bacteriana Pseudomonas aeruginosa
consiste en:
- -
- introducir al menos un sustrato que permite detectar la actividad enzimática \beta-alanina aminopeptidasa en presencia de una muestra susceptible de contener al menos un microorganismo Pseudomonas aeruginosa,
- -
- introducir al menos un sustrato que permite detectar una actividad enzimática diferente a \beta-alanina aminopeptidasa en presencia de la muestra susceptible de contener al menos otro microorganismo diferente a Pseudomonas aeruginosa, permitiendo esta otra actividad enzimática diferenciar a Pseudomonas aeruginosa de este otro microorganismo, y
- -
- observar la aparición de reacciones coloreadas y/o fluorescentes.
En los dos supuestos anteriores, el medio de
cultivo está gelificado.
En este caso, a este medio de cultivo se le
añade un producto que reduce la migración de la coloración o
coloraciones obtenidas.
La presente invención se refiere a la
utilización de una propiedad biológica propia de la mayoría de las
cepas de la especie bacteriana Pseudomonas aeruginosa, que
posee una actividad \beta-alanina aminopeptidasa.
Esta propiedad sólo se encuentra en otro pequeño número de
especies.
La invención consiste en asociar a la parte
diana específica de la enzima, que está formada por la
\beta-Alanina, una parte marcador adaptada. Se
conoce la existencia de tales partes marcador para revelar dicha
actividad, pero se desconoce su utilización para detectar
Pseudomonas aeruginosa, ya que el vínculo entre esta especie
y esta actividad enzimática nunca ha sido descrito.
Así, la primera familia de sustratos está
formada por una molécula que tiene a las Naftilaminas como parte
marcador, cuya fórmula correspondiente al sustrato
\beta-alanil-\beta-naftilamida
es:
en la que R_{2}, R_{3},
R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} representan un átomo
de hidrógeno o de bromo o de cloro o de yodo o un grupo de tipo
-OH, -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}, -OCH_{3}, -OCH_{2}CH_{3} o
COOH en cada una de esas posiciones. La
\beta-Naftilamina se puede utilizar para detectar
la actividad \beta-alanina aminopeptidasa, esto
es lo que describe la tesis de Doctor-Ingeniero del
señor Daniel Monget, defendida en la Universidad Claude Bernard -
Lyon I el 4 de julio de 1978 (Nº de orden 297). Como este tipo de
moléculas es incoloro, para poder utilizarlas es conveniente añadir
un revelador, como la sal de
diazonio.
La segunda familia de sustratos del estado de la
técnica está constituida por moléculas cuya parte marcador es a
base de Aminometilcumarina, que es fluorescente una vez liberada de
su parte diana. La fórmula general de esta familia de sustratos se
puede deducir de la fórmula particular siguiente, que corresponde
a la
\beta-Alanil-7-amido-4-metilcumarina:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{9}, R_{12},
R_{13}, R_{14}, y R_{15} representan un átomo de hidrógeno o
de bromo o de cloro o de yodo o un grupo de tipo -OH, -CH_{3},
-CH_{2}CH_{3}, -OCH_{3}, -OCH_{2}CH_{3} o COOH en cada una
de esas posiciones. Este tipo de sustratos está poco adaptado para
ser utilizado en medios gelosados y se utiliza más en medios
líquidos.
La tercera familia de sustratos está constituida
por el
\beta-Alanil-4-amino-2,6-diclorofenol,
que presenta como parte marcador el 2,6 Dicloroaminofenol, y cuya
fórmula global es la siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{16} y R_{17}
representan un átomo de hidrógeno o de bromo o de cloro o de yodo o
un grupo de tipo -OH, -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}, -OCH_{3},
-OCH_{2}CH_{3} o COOH en cada una de esas posiciones. Este tipo
de moléculas ya fue descrito en una solicitud de patente
WO-A-99/51767 presentada previamente
por la solicitante, y requiere la presencia de un revelador seco,
como el Ácido 3,5
dihidroxi-2-naftoico. No obstante,
esta solicitud de patente
WO-A-99/51767 demuestra que es
posible utilizar otras moléculas en las que los dos átomos de cloro
y el grupo hidroxilo están sustituidos por un átomo de hidrógeno o
de bromo o de cloro o de yodo o por un grupo de tipo -OH,
-CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}, -OCH_{3}, -OCH_{2}CH_{3} o COOH
en cada una de esas
posiciones.
La cuarta familia de sustratos es a base de
\beta-Alanil p-nitroanilida o
derivados, con la p-Nitroanilina como parte
marcador. La fórmula general de este tipo de sustratos es la
siguiente:
en la que R_{18}, R_{19},
R_{20}, y R_{21} representan un átomo de hidrógeno o de bromo o
de cloro o de yodo o un grupo de tipo -OH, -CH_{3},
-CH_{2}CH_{3}, -OCH_{3}, -OCH_{2}CH_{3} o COOH en cada una
de esas posiciones. Este producto no requiere la presencia de un
revelador.
La quinta familia de sustratos es a base de
2-Amino-indol o de
3-Amino-indol como parte marcador.
La fórmula general de estos sustratos es la siguiente para el
2-Amino-indol:
y para el
3-Amino-indol:
Todos estos sustratos son cromógenos, salvo la
segunda familia que es fluorógena, y todos ellos constituyen
moléculas que permiten la identificación de la actividad enzimática
3-alanina aminopeptidasa de Pseudomonas
aeruginosa. Esta identificación permite diferenciar
correctamente esta especie patógena en clínica de otras especies de
bacilos Gram negativos similares.
La fórmula de los sustratos enzimáticos
utilizados es la siguiente:
H_{2}N-CH_{2}-CH_{2}-CO-NH-R,
en la que
H_{2}N-CH_{2}-CH_{2}-COOH
es la \beta-Alanina, es decir, la parte diana del
sustrato, y -NH_{2}-R es el cromógeno, es decir,
la parte marcador de dicho
sustrato.
Se probaron cuatro sustratos que se corresponden
con las cuatro primeras familias de sustratos anteriormente
descritas. Hay:
- -
- la \beta-Alanil-\beta-naftilamida, comercializada con la referencia K1035 por la empresa Bachem, Bubendorf, Suiza,
- -
- la \beta-Alanil-7-amido-4-metilcumarina, comercializada con la referencia I1030 por la empresa Bachem, Bubendorf, Suiza,
- -
- el \beta-Alanil-4-amino-2,6-diclorofenol, cuya síntesis se expondrá más abajo, y
- -
- la \beta-Alanina p-nitroanilida, cuya síntesis se expondrá más adelante.
La síntesis del
\beta-Alanil-4-amino-2,6-diclorofenol
se efectúa a partir de
N-Terc-butoxicarboxil-\beta-alanina
(1,89 g, 10 mmol). El
N-Terc-butoxicarboxil-\beta-alanina
se disuelve en Tetrahidrofurano anhidro (HPLC gradiente, 30 ml).
La solución se enfría a 0ºC en un baño de hielo y de sal, y se
añade N-metilmorfolina (2,02 g, 20 mmol). Se baja
la temperatura por debajo de -10ºC y se añade gradualmente el
Isobutil cloroformato (2,74 g, 20 mmol) a la vez que se mantiene la
temperatura por debajo de -8ºC. Sobre la suspensión anhidra
anterior, se añade una solución fría de
4-Amino-2,6-diclorofenol
(1,78 g, 10 mmol) disuelta en Dimetilformamida y tratada con N-
metilmorfolina (4,08 g, 40 mmol) para liberar la base libre. Esta
solución se mantiene por debajo de la temperatura ambiente antes de
la adición anteriormente mencionada. La mezcla reactiva obtenida se
agita en un baño de hielo y de sal durante 1 hora, y luego durante
5 horas a temperatura ambiente. Una cromatografía en capa fina
indica una conversión prácticamente completa del producto en amida.
La suspensión se filtra para eliminar el Hidrocloruro de
N-metilmorfolina y el residuo se lava añadiendo
Tetrahidrofurano. A continuación se utiliza un vaporizador
giratorio para retirar el Tetrahidrofurano y un poco de
Dimetilformamida, y la solución obtenida se vierte lentamente en
agua helada vigorosamente agitada. El precipitado gris se retoma,
se lava concienzudamente con agua y se seca en un horno de vacío a
30-40ºC. El producto se recristaliza en metanol con
la adición de un poco de agua, permitiendo obtener 1,72 g de
pequeños cristales blancos. Se trata del
N-\beta-t-BOC-p-alanil-4-amino-2,6-diclorofenol
que posteriormente se disuelve en un volumen mínimo de Acetato de
etilo saturado de cloruro de hidrógeno. Al cabo de 2 horas a unos
16ºC, la solución viscosa se vierte lentamente en 250 ml de Éter
dietílico anhidro. Después de 4 horas, el sólido pulverulento se
recupera mediante filtración al vacío y se lava con Éter dietílico.
Por último, el producto se seca en un desecador de vacío y se aísla
para minimizar la higroscopicidad.
La síntesis de la
\beta-Alanina p-nitroanilida es la
siguiente. Una masa de 2,76 gramos (g), es decir, 20 milimoles
(mmol) de 4-Nitroanilina se disuelve por agitación
en presencia de 40 mililitros (ml) de piridina seca y previamente
enfriada a una temperatura de menos 12ºC. Por otra parte, se añade
Tricloruro de fósforo (1 ml redestilado) a 12 ml de piridina,
siempre a la temperatura de menos 12ºC. Las dos soluciones se
enfrían posteriormente a menos 16ºC y la segunda solución que
contiene el Tricloruro de fósforo se añade bajo agitación a la
primera solución que contiene la Nitroanilina. Esta mezcla se
efectúa entre menos 14ºC y menos 16ºC durante al menos 30 minutos
(min) y luego a temperatura ambiente durante otro tanto tiempo. A
continuación, se añaden 20 mmol, es decir, 4,46 g de
Benziloxicarbonil-\beta-Alanina
seco en pequeñas cantidades sucesivas sobre la solución anterior
agitada durante al menos 5 min. Esta agitación se prosigue durante
14 horas (h) entre 30 y 40ºC. Después, la temperatura se lleva
hasta 50ºC y se continúa con la agitación durante otras 8 horas.
Una cromatografía en capa fina de una muestra diluida revela que
una gran parte de los productos de base ha sido transformada en
derivado \beta-aminoacil. A continuación se retira
la piridina por evaporación giratoria a 50ºC. El aceite viscoso
residual se agita vigorosamente con el hielo picado en presencia de
etanol. De este modo se obtiene, por una parte, un sólido amarillo
sobre las paredes del recipiente continente y, por otra parte, una
masa cristalina. El sólido se retoma, se filtra por aspiración y
se lava con agua. El producto secado al aire se recristaliza en
etanol caliente. El producto seco pesa 4,3 g y es homogéneo según
una cromatografía en capa fina (CCF) realizada utilizando placas de
gel de sílice (disolvente - etilacetato/tolueno). El rendimiento es
del 62,7%. La protección constituida por el Benziloxicarbonil,
presente en el Benziloxicarbonil-\beta-
alanina-p-nitroanilida, es
posteriormente eliminada. Así, 2,15 g de esta sustancia se
disuelven en un volumen mínimo de ácido acético glacial caliente
bajo agitación. A esta mezcla, enfriada a 25ºC, se le añade un
volumen idéntico de Bromuro de hidrógeno al 30% en ácido acético
glacial bajo agitación. Al cabo de 1 h 30 min, la solución viscosa
se vierte lentamente
en 400 ml de Éter dietil anhidro, bajo fuerte agitación. La suspensión blanca obtenida se filtra posteriormente y el residuo se lava varias veces con éter anhidro y luego se seca en un desecador de vacío durante toda una noche. De este modo, se obtienen 1,50 g de \beta-Alanina-p-nitroanilida en forma de sal de bromuro.
en 400 ml de Éter dietil anhidro, bajo fuerte agitación. La suspensión blanca obtenida se filtra posteriormente y el residuo se lava varias veces con éter anhidro y luego se seca en un desecador de vacío durante toda una noche. De este modo, se obtienen 1,50 g de \beta-Alanina-p-nitroanilida en forma de sal de bromuro.
Se probaron varias especies, a razón de cinco
cepas por especie, salvo si se precisa el número, en presencia de
\beta-alanil-\beta-naftilamida
en galerías de tipo API ZYM de la casa bioMérieux, La Balme,
Francia. Las reacciones se efectuaron con suspensiones bacterianas
a una densidad de 4 Mc Farland (McF) en tampón fosfato a 0,01 M pH
7, 5. La escala de Mc Farland es una escala de concentración
bacteriana, en la que 4 McF se corresponden con 12x108 bacterias
por mililitro. Para cada cepa, se introdujeron 80 microlitros de
suspensión en cada uno de los pocillos de la galería. Las galerías
se pusieron a incubar a 37ºC durante 4 h. La presencia de
\beta-alanina aminopeptidasa se determina
añadiendo una gota de ZYMB (sal de diazonio, Fast Blue BB),
comercializado por bioMérieux con la referencia 70480. La aparición
de una coloración naranja indica una reacción positiva. Los
resultados son los siguientes: hay una reacción negativa para las
especies enumeradas a continuación, o lo que es lo mismo, no se
detectó ninguna actividad \beta-alanina
aminopeptidasa:
- -
- Escherichia coli,
- -
- Shigella spp. (4 cepas),
- -
- Shigella sonnei,
- -
- Edwarsiella tarda (2 cepas),
- -
- Salmonella choleraesuis,
- -
- Salmonella typhi,
- -
- Salmonella spp.,
- -
- Salmonella paratyphi A,
- -
- Salmonella gallinarum (3 cepas),
- -
- Salmonella arizonae,
- -
- Citrobacter freundii,
- -
- Citrobacter diversus,
- -
- Klebsiella pneumoniae, spp. pneumoniae,
- -
- Klebsiella pneumoniae, spp. oxytoca,
- -
- Klebsiella ozaenae,
- -
- Klebsiella rhinoscleromatis (3 cepas),
- -
- Hafnia alvei,
- -
- Enterobacter aerogenes,
- -
- Enterobacter cloacae,
- -
- Enterobacter sakazakii,
- -
- Enterobacter gergoviae,
- -
- Serratia marcescens,
- -
- Serratia odorifera,
- -
- Serratia fonticola,
- -
- Serratia plymuthica,
- -
- Proteus vulgaris,
- -
- Proteus mirabilis,
- -
- Proteus morganii,
- -
- Proteus rettgeri,
- -
- Providencia alcalifaciens,
- -
- Providencia stuartii,
- -
- Yersinia enterocolitica,
- -
- Yersinia pseudotuberculosis,
- -
- Pseudomonas putida,
- -
- Comamonas acidovorans,
- -
- Comamonas testosteroni,
- -
- Pseudomonas alcaligenes,
- -
- Pseudomonas stutzeri,
- -
- Shewanella putrefaciens,
- -
- Stenotrophomonas maltophilia,
- -
- Brevundimonas diminuta,
- -
- Brevundimonas vesicularis,
- -
- Ralstonia pickettii,
- -
- Pseudomonas luteola,
- -
- Pseudomonas oryzihabitans,
- -
- Sphingomonas paucimobilis,
- -
- Sphingobacterium multivorum,
- -
- Alcaligenes faecalis/odorans,
- -
- Achromobacter xylosoxidans spp. denitrificans,
- -
- Achromobacter xylosoxidans spp. xylosoxidans,
- -
- Bordelella bronchiseptica,
- -
- Oligella ureolytica (2 cepas),
- -
- CDC IV C_{2},
- -
- Aeromonas hydrophila,
- -
- Plesiomonas shigelloïdes,
- -
- Vibrio alginolyticus,
- -
- Vibrio parahacmolyticus (4 cepas),
- -
- Chryseobacterium meningosepticum,
- -
- Empedobacter brevis (3 cepas),
- -
- Chryseobacterium balustinum (1 cepa),
- -
- Chryseobacterium indologenes,
- -
- Weeksella virosa (4 cepas),
- -
- Myroides spp.,
- -
- Pasteurella gallinarum (1 cepa),
- -
- Pasteurella multocida,
- -
- Pasteurella pneumotropica (4 cepas),
- -
- Actinobacillus ureae (1 cepa),
- -
- Pasteurella haemolytica,
- -
- Pasteurella aerogenes,
- -
- Similares a Pasteurella (4 cepas),
- -
- Psychrobacter phenylpyruvicus (4 cepas),
- -
- Moraxella paraphenylpiruvica (3 cepas),
- -
- Moraxella lacunata (4 cepas),
- -
- Moraxella tac. sp. liquefaciens (7 cepas),
- -
- Moraxella non liquefaciens (13 cepas),
- -
- Moraxella bovis (4 cepas),
- -
- Moraxella osloensis (18 cepas), y
- -
- Actinobacillus spp.
En cambio, hay una reacción positiva para las
especies que se enumeran a continuación, o lo que es lo mismo, se
detectó una actividad \beta-alanina
aminopeptidasa:
- -
- Serratia liquefaciens,
- -
- Pseudomonas aeruginosa,
- -
- Pseudomonas fluorescens,
- -
- Burkholderia cepacia,
- -
- Pseudomonas mendocina, y
- -
- Ochrobactrum anthropi.
CDC significa Center for Disease Control. Los
grupos CDC designan grupos de cepas pendientes de un nombre de
especie.
El sustrato
\beta-alanil-\beta-naftilamida,
y más concretamente la parte diana, la
\beta-alanina, es pues particularmente selectiva
ya que sólo seis (6) especies poseen la actividad
\beta-alanina aminopeptidasa frente a setenta y
nueve (79) especies que no la poseen, lo que supone un 7,1% de
especies positivas entre todas las que fueron probadas.
La diferenciación de Pseudomonas
aeruginosa entre las seis especies se puede realizar fácilmente
en medio gelosado por la presencia de una coloración verde debida
a la producción de pioverdina por parte de esta especie.
El sustrato
\beta-Alanil-7-amido-4-metilcumarina
se utilizó con la metodología que se especifica a continuación.
Las cepas se aislaron en los medios bioMérieux, Francia,
siguientes:
- -
- Columbia sangre de carnero,
- -
- Tripticasa de soja sangre de carnero, y
- -
- Mac Conkey (medio de aislamiento de las enterobacterias).
Las reacciones se efectuaron en tarjetas Vitek 2
(Marca registrada, bioMérieux, Saint Louis, Missouri, Estados
Unidos de América) con suspensiones bacterianas ajustadas a una
densidad comprendida entre 0,375 y 0,750 McF.
La tabla 1 que figura más abajo revela el
interés o no del sustrato probado para algunas de las especies ya
mencionadas en el apartado anterior o para especies nuevas (por
ejemplo Ochrobactrum anthropi).
La separación de las especies Pseudomonas
aeruginosa y Ochrobactrum anthropi se realiza a través
de pruebas sencillas como la hidrólisis de la arginina (ADH) o la
utilización de acetamida.
| Especies | Número de cepas | Número de reacciones | Número de reacciones | Reacciones difíciles |
| probadas | negativas | positivas | de interpretar | |
| Shigella boydii | 10 | 10 | 0 | 0 |
| Shigella | 10 | 10 | 0 | 0 |
| dysenteriae | ||||
| Shigella | 10 | 10 | 0 | 0 |
| flexneri | ||||
| Chromobacterium | 11 | 9 | 1 | 1 |
| violaceum | ||||
| Chryseobacterium | 10 | 10 | 0 | 0 |
| indologenes | ||||
| Ochrobactrum | 11 | 0 | 11 | 0 |
| anthropi | ||||
| Oligella | 10 | 10 | 0 | 0 |
| urethralis | ||||
| Pseudomonas | 137 | 2 | 134 | 1 |
| aeruginosa | ||||
| Ralstonia | 10 | 8 | 2 | 0 |
| pickettii | ||||
| Pseudomonas | 10 | 0 | 10 | 0 |
| mendocina | ||||
| Pseudomonas | 10 | 10 | 0 | 0 |
| stutzeri | ||||
| Comamonas | 10 | 10 | 0 | 0 |
| testosteroni |
Por lo tanto, el sustrato
\beta-Alanil-7-amido-4-metilcumarina
es particularmente eficaz para detectar las especies:
- -
- Ochrobactrum anthropi, ya que la tasa de reacciones positivas es del 100%,
- -
- Pseudomonas aeruginosa, ya que la tasa de reacciones positivas es del 97,8%, y
- -
- Pseudomonas mendocina, ya que la tasa de reacciones positivas es del 100%.
El valor obtenido para Pseudomonas
aeruginosa es particularmente interesante, ya que el conjunto
de muestras sometidas a prueba comprende 137 especies. Las tres
cepas que no reaccionan o que reaccionan mal, están asociadas a la
variabilidad biológica de esta especie.
Otras especies muestran una aptitud parcial para
hidrolizar la
\beta-alanil-7-amido-4-metilcumarina,
se trata de:
- -
- Ralstonia pickettii, ya que la tasa de reacciones positivas es del 20%, y
- -
- Chromobacterium violaceum, ya que la tasa de reacciones positivas es del 10%.
Tras aislamiento en agar Columbia con sangre de
cordero, las cepas son sometidas a prueba en medio líquido en
tarjetas Vitek 2 (Marca registrada, bioMérieux, Saint Louis,
Missouri, Estados Unidos de América) que contienen el sustrato
\beta-Alanil-4-amino-2,6-diclorofenol,
en presencia del Ácido
3,5-dihidroxi-2-naftoico
y de un medio reactivo peptonado y tamponado a pH 8,5. Las
densidades de las suspensiones bacterianas son de 0,5 MF/NaCl 4,5
g/l. La lectura visual se efectúa al cabo de 22 a 24 horas de
incubación. La tabla 2 que figura más abajo recoge los resultados
obtenidos.
| Especies | Número de cepas | Número de reacciones | Número de reacciones |
| probadas | negativas | positivas | |
| Citrobacter amalonaticus | 2 | 2 | 0 |
| Citrobacter freundii | 2 | 2 | 0 |
| Citrobacter koseri | 1 | 1 | 0 |
| Enterobacter aerogenes | 2 | 2 | 0 |
| Enterobacter cloacae | 2 | 2 | 0 |
| Enterobacter intermedius | 1 | 1 | 0 |
| Escherichia coli | 2 | 2 | 0 |
| Proteus mirabilis | 2 | 2 | 0 |
| Proteus vulgaris | 1 | 1 | 0 |
| Providencia stuartii | 1 | 1 | 0 |
| Salmonella arizonae | 1 | 1 | 0 |
| Serratia liquefaciens | 1 | 0 | 1 |
| Serratia marcescens | 3 | 0 | 3 |
| Klebsiella oxytoca | 2 | 2 | 0 |
| Klebsiella pneumoniae | 3 | 3 | 0 |
| Achromobacter xylosoxydans | 2 | 2 | 0 |
| Acinetobacter baumannii | 2 | 2 | 0 |
| Aeromonas hydrophila | 2 | 2 | 0 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Especies | Número de cepas | Número de reacciones | Número de reacciones |
| probadas | negativas | positivas | |
| Brevundimonas diminuta | 2 | 2 | 0 |
| Burkholderia vesicularis | 1 | 1 | 0 |
| Chryseobacterium meningosepticum | 2 | 2 | 0 |
| Ochrobactrum anthropi | 1 | 0 | 1 |
| Monaxella non liquefaciens | 2 | 2 | 0 |
| Myroides spp. | 1 | 1 | 0 |
| Pseudomonas aeruginosa | 13 | 0 | 13 |
| Pseudomonas fluorescens | 2 | 1 | 1 |
| Pseudomonas mendocina | 1 | 0 | 1 |
| Pseudomonas putida | 1 | 1 | 0 |
| Pseudomonas stutzeri | 3 | 3 | 0 |
| Ralstonia pickettii | 1 | 1 | 0 |
| Shewanella algae | 1 | 1 | 0 |
| Shewanella putrefaciens | 1 | 1 | 0 |
| Sphingomonas paucimobilis | 2 | 2 | 0 |
| Stenotrophorn onas maltophilia | 2 | 2 | 0 |
| Streptococcus agalactiae | 1 | 1 | 0 |
| Streptococcus pyogenes | 2 | 2 | 0 |
| Enterococcus faecalis | 2 | 2 | 0 |
| Enterococcus faecium | 2 | 2 | 0 |
| Vibrio vulnificus | 1 | 1 | 0 |
Con este sustrato,
\beta-Alanil-4-amino-2,6-diclorofenol,
se obtienen resultados que siempre son muy significativos con
Pseudomonas aeruginosa, Serratia liquefaciens y Serratia
marcescens, y relativamente significativos con Pseudomonas
mendocina y Ochrobactrum anthropi. Por lo tanto, podría
ser interesante combinar este sustrato con otro sustrato que
permita distinguir a Pseudomonas aeruginosa de los otros
microorganismos que presentan una reactividad positiva (véase
párrafo nº3). El caso de Pseudomonas fluorescens es difícil
de interpretar y se debe más bien a un problema de manipulación o
a la variabilidad genética de esta especie.
Por otra parte, se puede constatar que la
presencia de polivinil piruvato (PVP) mejora la coloración de las
reacciones positivas.
Básicamente se trata de la misma metodología que
en el subapartado C anterior, salvo por lo que respecta a la
lectura visual, que se efectúa tras 19 h de incubación. Se utilizó
como sustrato la \beta-Alanil
p-nitroanilida. Los resultados se recapitulan en la
tabla 3 que figura a continuación.
| Especies | Número de cepas | Número de reacciones | Número de reacciones |
| probadas | negativas | positivas | |
| Citrobacter amalonaticus | 2 | 2 | 0 |
| Citrobacter freundii | 2 | 2 | 0 |
| Citrobacter koseri | 1 | 1 | 0 |
| Enterobacter aerogenes | 2 | 2 | 0 |
| Enterobacter cloacae | 2 | 2 | 0 |
| Enterobacter intermedius | 1 | 1 | 0 |
| Escherichia coli | 2 | 2 | 0 |
| Proteus mirabilis | 2 | 2 | 0 |
| Proteus vulgaris | 1 | 1 | 0 |
| Providencia stuartii | 1 | 1 | 0 |
| Salmonella arizonae | 1 | 1 | 0 |
| Serratia liquefaciens | 1 | 0 | 1 |
| Serratia marcescens | 1 | 0 | 1 |
| Klebsiella oxytoca | 2 | 2 | 0 |
| Klebsiella pneumoniae | 2 | 2 | 0 |
| Achromobacter xylosoxydans | 2 | 2 | 0 |
| Acinetobacter baumannii | 2 | 2 | 0 |
| Aeromonas hydrophila | 2 | 2 | 0 |
| Brevundimonas diminuta | 1 | 1 | 0 |
| Burkholderia vesicularis | 1 | 1 | 0 |
| Chryseobacterium meningosepticum | 1 | 1 | 0 |
| Moraxella non liguefaciens | 2 | 2 | 0 |
| Myroides spp. | 1 | 1 | 0 |
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | 0 | 4 |
| Pseudomonas putida | 1 | 1 | 0 |
| Pseudomonas stutzeri | 3 | 3 | 0 |
| Ralstonia pickettii | 1 | 1 | 0 |
| Shewanella algae | 1 | 1 | 0 |
| Sphingomonas paucimobilis | 2 | 2 | 0 |
| Stenotrophomonas maltophilia | 2 | 2 | 0 |
| Vibrio vulnificus | 1 | 1 | 0 |
El resultado es muy significativo, ya que se
distingue perfectamente la presencia de Pseudomonas
aeruginosa con respecto a otras especies que no presentan la
actividad enzimática \beta-alanina
aminopeptidasa.
Por lo tanto, los sustratos cuya parte diana es
la \beta-Alanina que permiten revelar la
actividad \beta-alanina aminopeptidasa, están
particularmente adaptados para la detección de Pseudomonas
aeruginosa y de algunas otras especies (Serratia
liquefaciens, Pseudomonas marcescens, Pseudomonas mendocina y
Ochrobactrum anthropi), cuya frecuencia de aparición en una
muestra es considerablemente menor que la de Pseudomonas
aeruginosa. Debido a este hecho, la detección de la presencia
de esta actividad enzimática tenderá a estar relacionada con la
presencia de Pseudomonas aeruginosa en la muestra biológica
sometida a prueba. Sin embargo, cabe la posibilidad, como se
demuestra en el apartado siguiente, de diferenciar Pseudomonas
aeruginosa de una de esas otras especies que presentan la
actividad \beta-alanina aminopeptidasa.
Esta utilización de dos sustratos para revelar
dos actividades enzimáticas diferentes es particularmente
interesante. Es por ejemplo el caso de las actividades
\beta-glucosidasa y
\beta-alanina aminopeptidasa.
Así, el ejemplo A del apartado 2 ha demostrado
que las especies Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas
mendocina poseen una actividad \beta-alanina
aminopeptidasa. Sin embargo, es posible diferenciar esas dos
especies mediante la búsqueda de la actividad
\beta-glucosidasa que sólo está presente en
Pseudomonas mendocina. Esta enzima se puede revelar, por
ejemplo, con el sustrato
6-Cloro-3-indolil-\beta-D-glucopiranósido,
comercializado por Biosynth, Staad, Suiza.
La diferenciación de estas dos especies se puede
realizar en medio gelosado, como se describe a continuación.
A un medio gelosado de tripticasa de soja se
añaden:
- -
- 200 mg de 6-Cloro-3-indolil-\beta-D-glucopiranósido,
- -
- 50 mg de \beta-Alanil-N,N'-dimetil-p-fenileno-diamina, y
- -
- 15 mg de Ácido 3,5-dihidroxi-2-naftoico.
El medio se distribuye y se siembra de la manera
siguiente:
- -
- 10 cajas con cultivos puros correspondientes a cinco cepas de Pseudomonas aeruginosa y cinco cepas de Pseudomonas mendocina, y
- -
- 2 cajas con una mezcla de dos cepas, una de ellas de Pseudomonas aeruginosa y la otra de Pseudomonas mendocina.
Las cajas de Petri se incuban a
35-37ºC. Al cabo de 18-24 horas de
incubación, se observa la coloración de las colonias. Las colonias
azules con un halo azul corresponden a Pseudomonas
aeruginosa y a la presencia de la actividad
\beta-alanina aminopeptidasa, mientras que las
colonias púrpuras con halo azul corresponden a Pseudomonas
mendocina y a la presencia de las actividades
\beta-alanina aminopeptidasa y
\beta-glucosidasa.
Por lo tanto, es muy sencillo diferenciar en un
mismo medio una mezcla de cepas que pertenecen a estas dos especies
cuando están presentes en una misma muestra. Este ejemplo demuestra
que se pueden combinar varios sustratos relacionados con diferentes
reacciones enzimáticas en un mismo medio reactivo, una de ellas
según la presente invención, para caracterizar a Pseudomonas
aeruginosa.
Claims (12)
1. Utilización in vitro de un sustrato
enzimático para la detección de al menos un microorganismo
Pseudomonas aeruginosa, estando constituido dicho sustrato
por una parte diana y por una parte marcador, permitiendo la
hidrólisis del sustrato la separación de la parte diana y de la
parte marcador, caracterizando dicha parte diana la actividad
enzimática buscada y permitiendo revelar una actividad enzimática
\beta-Alanina aminopeptidasa de al menos un
microorganismo Pseudomonas aeruginosa y estando constituida
la parte marcador por una molécula que permite revelar la reacción
de hidrólisis.
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque la parte diana de dicho sustrato
enzimático está formada por \beta-Alanina o por
uno de sus derivados y la parte marcador es una molécula cromógena
o fluorógena.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque el sustrato enzimático presenta la
fórmula:
H_{2}N-CH_{2}-CH_{2}-CO-NH-R,
en la que
H_{2}N-CH_{2}-CH_{2}-CO-
es la parte diana y -NH-R es la parte marcador
cromógena o fluorógena del
sustrato.
4. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la parte
marcador de dicho sustrato enzimático está formada por:
- -
- \beta-Naftilamina,
- -
- una Aminometilcumarina, como la 7-Amino-4-metil- cumarina,
- -
- un derivado del Aminobenceno, como el 4-Amino-2,6- diclorofenol,
- -
- p-Nitroanilina, o
- -
- 2-Amino-indoxil o 3-Amino-indoxil.
5. Sustrato enzimático formado por una parte
diana y una parte marcador, permitiendo la hidrólisis del sustrato
la separación de la parte diana y de la parte marcador, permitiendo
dicha parte diana revelar una actividad enzimática
\beta-alanina aminopeptidasa de al menos un
microorganismo Pseudomonas aeruginosa y estando constituida
la parte marcador por una molécula que permite revelar la reacción
de hidrólisis, caracterizado porque la parte diana de dicho
sustrato enzimático está formada por
\beta-Alanina o por uno de sus derivados y la
parte marcador está formada por:
- -
- un derivado del Aminobenceno, como el 4-Amino-2,6-diclorofenol,
- -
- 2-Amino-indoxil o 3-Amino-indoxil.
6. Composición que permite la detección de al
menos una cepa y/o una especie de microorganismos, que comprende al
menos un sustrato, según la reivindicación 5, y un medio de
cultivo.
7. Composición que permite la detección de al
menos una cepa y una especie de microorganismos o de al menos dos
cepas o dos especies de microorganismos, que comprende al menos un
sustrato, según la reivindicación 5, al menos otro sustrato y un
medio de cultivo.
8. Composición, según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 ó 7, caracterizada porque el medio de
cultivo contiene un revelador, como el Ácido
3,5-dihidroxi-2-naftoico,
cuando la parte marcador liberada es un derivado del Aminobenceno,
como el Dicloro-amino-fenol.
9. Composición, según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, caracterizada por presentar la forma
de un medio líquido o de un medio gelosado.
10. Procedimiento de detección de la especie
bacteriana Pseudomonas aeruginosa, que consiste en:
- -
- introducir al menos un sustrato que permite detectar la actividad enzimática \beta-alanina aminopeptidasa en presencia de una muestra susceptible de contener al menos un microorganismo Pseudomonas aeruginosa,
- -
- introducir al menos un sustrato que permite detectar una actividad enzimática diferente a \beta-alanina aminopeptidasa en presencia de la muestra susceptible de contener al menos otro microorganismo diferente a Pseudomonas aeruginosa, permitiendo esta otra actividad enzimática diferenciar a Pseudomonas aeruginosa de este otro microorganismo, y
- -
- observar la aparición de reacciones coloreadas y/o fluorescentes.
11. Procedimiento, según la reivindicación 10,
caracterizado por llevarse a cabo en un medio de cultivo
gelificado.
12. Procedimiento, según la reivindicación 11,
caracterizado porque al medio de cultivo se le añade un
producto que reduce la migración de la coloración o coloraciones
y/o fluorescencias obtenidas.
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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