DE60015306T2

DE60015306T2 - Verwendung von beta interferon zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung von ewings sarkom und eoe

Info

Publication number: DE60015306T2
Application number: DE60015306T
Authority: DE
Inventors: Josiane Sanceau; Jeanne Wietzerbin
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Curie
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Curie
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-10
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2020-04-11
Also published as: ATE280584T1; ES2234605T3; FR2791894A1; WO2000061172A1; EP1165117A1; DE60015306D1; EP1165117B1; FR2791894B1; CA2369427C; CA2369427A1; US6749846B1; AU4918900A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Interferon-Beta zur Behandlung des Ewing-Knochentumors bei Säugetieren.
Die Familie der Ewing-Tumore stellt die zweithäufigste Variante von Knochentumoren dar, die bei Kindern nach einer Knochenerkrankung beobachtet wird. Die Familie umfasst das Ewing-Sarkom (EWS oder Ewings Knochentumor), extraossären Ewing (EOE), primitive neuroektodermale Tumore (PNET oder periphere Neuroepithelioma) und Askin-Tumore (PNET der Brustwand). Diese Tumore sind seltene Krankheiten, bei denen bösartige Zellen in den Knochen und in weichem Gewebe gefunden werden. Gegenwärtige Protokolle verwenden die selbe Behandlung für diese Familie an Tumoren. EWS wird meistens bei Jugendlichen und jungen Erwachsenen beobachtet und die häufigsten Stellen für die primäre Läsion sind die Beckenknochen, Oberschenkelknochen, Oberarmknochen und die Rippen. Das Vorkommen an Ewing-Sarkomen innerhalb der Familie der Ewing-Tumore wird auf ungefähr 60 % geschätzt.
Studien mit immunohistochemischen Markern, Zytogenetik, Molekulargenetik und Zeltkulturen zeigen, dass sich all diese Tumore von derselben Primordialstammzelle ableiten. Zytogenetische Studien der Tumore der Ewing-Familie haben eine konsistente Veränderung des EWS-Locus auf Band q12 des Chromosoms 22 ergeben, welche möglicherweise andere Chromosomen inklusive der Chromosome 11 oder 21 mit einschließt. Das Amino-Terminus des EWS-Gens grenzt auf charakteristische Weise an das Carboxy-Terminus eines anderen Chromosoms. Inder Mehrzahl der Fälle (90 %) steuert diese Chromosomentranslokation die Verschmelzung des 5'-Endes des EWS-Gens, welches ein Protein codiert, das in der Lage ist am RNA-Metabolismus teilzunehmen, mit dem 3'-Ende des Fli-1-Gens, einem Mitglied der Ets-Transkriptionsfaktor-Familie, die auf Chromosom 11, Band q24 (Delattre et al., Nature 359:162- 165 (1992)) lokalisiert ist. Manche fusionierten Gene können gemäß der Spaltstellen (zwischen Exon 7 und 11 des EWS und Exon 3 bis 9 des Fli-1) hergestellt werden.
Die häufigere Fusion vom EWS-Fli-1-Typs I fusioniert EWS-Exon 7 mit Fli-1 Exon 6 und stellt 50 % der Fälle dar. Die Typ-II-Fusion (25 % der Fälle) verbindet das EWS-Exon 7 mit dem Fli-1-Exon 5. Zusätzlich zu diesen beiden Hauptfusionstypen wurden ungefähr zehn weitere Kombinationen beschrieben.
In einigen Fällen des Ewing-Tumors ist das EWS nicht mit Fli-1 fusioniert, sondern mit einem anderen Mitglied der Ets-Familie, wie beispielsweise FEV. Andere Mitglieder der Ets Familie, welche mit dem EWS-Gen kombinieren können, sind ERG (lokalisiert auf Chromosom 21), ETV (lokalisiert auf Chromosom 7) und E₁AF (lokalisiert auf Chromosom 17), was zu den folgenden Translokationen führt: t(21;22), t(7;22) und t(17;22).
Diese genetischen Veränderungen ergeben eine konstante biochemische Konsequenz: Ewing-Zellen exprimieren immer ein chimäres Protein mit einem N-terminierten Bereich, in dem das EWS mit einer DNA-Bindungsdomäne der Ets-Protein-Familie fusioniert ist. Diese Konstanz legt den Schluss nahe, dass diese Fusion eine zentrale Rolle bei der Entwicklung eines Ewing-Tumors ausübt.
Beim Ewing-Sarkom wurde die Rolle des EWS/Fli-1-Fusionsproteins experimentell nachgewiesen. Dieses Protein kann Fibroblast von Mäusen verändern und diese Zellen sind in der Lage Tumore in nackten Mäusen entstehen zu lassen.
Bei in vitro-Experimenten wurde gezeigt, dass das EWS/Fli-1-Protein in der Lage ist, gewisse Gen-Transkriptionen effizienter als Fli-1zu aktivieren. Diese Tatsache legt den Schluss nahe, dass die Fusion des EWS/Fli-1-Proteins ihre onkogenen Wirkungen mittels abnormaler Aktivierung gewisser zellulärer Gene ausübt.
Es wurde auch gezeigt, dass das PU-1-Protein, welches auch aus der Ets-Protein-Familie stammt, in die Steuerung der Interferon- und Zytokin-regulierten Genexpression verwickelt ist (Perez et al., Mol. Cell Biol. 14:5023-5031 (1994)).
Wichtige voraussagende Faktoren für die Familie der Ewing-Tumore schließt die Lage und das Volumen des primären Tumors und ob die Krankheit metastatisch ist, ein. Die Größe des Tumors wird auch als eine wichtige Variable betrachtet. Mit der aktuellen Behandlung sagen Studien, dass 50 – 70 % der Patienten ohne metastatische Krankheit auf lange Sicht ein krankheitsfreies Überleben haben, verglichen mit lediglich 20 % – 30 für Patienten, die eine metastatische Krankheit aufweisen. Aus diesem Grund verbleibt ein akuter Bedarf nach einem effektiven Verfahren zur Behandlung der Familie der Ewing-Tumore.
In diesem Sinne stellt die vorliegende Erfindung eine effektive Art der Behandlung des Ewing-Sarkoms und EOE bei einem Säugetier bereit. Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele bekannt gemacht werden und teilweise aus der Beschreibung oder der Durchführung der Erfindung deutlich werden. Diese Vorteile der Erfindung werden durch Zusammensetzungen und Verwendungen, die insbesondere in der schriftlichen Beschreibung und in den Ansprüche dargelegt sind, realisiert und erhalten.
Rosolen et al. (Modern Pathology, 1997, 10:55-61) haben beschrieben, dass die Behandlung einer Zelllinie, die sich vom Ewing-Sarkom ableitet, mit Interferon-Alpha eine Inhibierung des Zellwachstums in vitro induziert.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben nun gezeigt, dass Interferon-Beta (IFN-β), welches an den selben Rezeptor bindet wie Interferon-Alpha (IFN-α), aber von dem bekannt ist, dass es bestimmte Aktivitäten aufweist (Runkel et al., 1998, The Journal of Biological Chemistry, 14:8003-8008), eine wachstumshemmende Aktivität bezüglich des Ewing-Sarkoms zeigt.
Die Autoren haben insbesondere gezeigt, dass die wachstumshemmende Aktivität in vitro von IFN-β auf Zellen, die sich vom Ewing-Sarkom ableiten, der von IFN-α deutlich überlegen ist.
Aus diesem Grund ist ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung auf die Verwendung von Interferon-Beta zur Zubereitung eines Arzneimittels für die Behandlung des Ewing-Sarkoms oder EOE gerichtet.
Dem Säugetier, das eine solche Behandlung benötigt, wird eine therapeutisch aktive Menge an IFN-β verabreicht. Aus diesem Grund wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die geeignet ist einem Säugetier zur Behandlung des Ewing-Sarkoms oder EOE zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht zu werden, umfassend eine therapeutisch aktive Menge an IFN-β.
Es wird klargestellt, dass sowohl die vorangehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende ausführliche Beschreibung lediglich beispielhaft und erläuternd ist und als weitere Erläuterung der beanspruchten Erfindung gedacht ist.
Wenn nicht irgendwo anders definiert, sollen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung haben, wie sie ansonsten von einem Fachmann auf dem relevanten Gebiet verstanden wird.
Der Begriff „Familie der Ewing-Tumore", wie er hier verwendet wird, bezeichnet einen Typ an Tumor, der in Knochen und in weichem Gewebe gefunden wird, und der durch kleine, runde Zellen sowie eine Veränderung des EWS-Lokus auf dem Chromosom 22 charakterisiert ist. Die Familie an Tumoren umfasst das Ewing-Sarkom (EWS oder Ewings Knochentumor), extraossären Ewing (EOE), periphere primitive neuroektodermale Tumore (PNET oder periphere Neuroepithelioma) und Askin-Tumore (PNET der Brustwand).
Die einzelnen Zellen des Ewing-Sarkoms und EOE enthalten runde bis ovale Kerne mit fein verteiltem Chromatin ohne Nukleoli. Gelegentlich sind Zellen mit kleinerem, hyperchromatischerem (und wahrscheinlich degenerativem) Kern vorhanden, welche ein „helle Zelle-dunkle Zelle"-Muster ergeben. Das Zytoplasma variiert in der Menge, aber im klassischen Fall ist es klar und enthält Glykogen, welches mittels eines Periodsäure-Schiff(PAS)-Flecks hervorgehoben werden kann. Die Tumorzellen sind eng gepackt und wachsen in einem diffusen Muster ohne Anzeichen einer strukturellen Organisation.
Das histologische Erscheinungsbild von PNET weicht etwas von dem des Ewing-Sarkoms und des EOE ab. Diese Tumore setzen sich typischerweise aus runden bis Eiähnlichen hyperchromatischen Zellen mit minimalem Zytoplasma zusammen. Die Tumorzellen sind typischerweise in Nestern und Trabeculaes mit variabler Rosetten-Formation angeordnet. Die Rosetten können ein zentrales Lumen haben, sind aber häufig unklar abgegrenzt, zusammengesetzt aus Tumorzellen, die sich um einen leeren Raum anordnen. Das klassische lobuläre Wachstumsmuster wird am besten bei kleiner Leistung gewürdigt und unterscheidet sich von dem typischen diffusen Wachstum, das in EOE beobachtet wird. Gelegentlich werden hier und da Gruppen an zytologisch gleichen, runden Zellen mit verteiltem Chromatin, die denen in EOE ähneln, in ansonsten typischem PNET beobachtet. Dieses Überlappen von Merkmalen verleiht dem Konzept, dass diese Tumore tatsächlich derselbe Tumor mit einem Spektrum an Unterscheidungen sind, Vertrauen.
Der Begriff „Säugetier", wie er hier benutzt wird, bezeichnet Säugetierspezies und umfasst nicht abschließend Kaninchen, Mäuse, Hunde, Katzen, Primaten und Menschen, vorzugsweise Menschen. Der Begriff „Behandlung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jedes Verfahren, jede Wirkung, jede Anwendung, jede Therapie oder ähnliches, worin ein Säugetier, inklusive eines Menschens, einer medizinischen Hilfe mit dem Ziel der Verbesserung des Befindens des Säugetiers direkt oder indirekt unterworfen wird. Im Zusammenhang mit Tumorwachstum oder Tumorzellenwachstum schließt „Behandlung" nicht abschließend Inhibierung und Verhinderung ein.
Der Begriff „Inhibierung", wie er hier verwendet wird, kann neben anderem als die verspätete Entwicklung von primären oder sekundären Tumoren, verlangsamte Entwicklung von primären oder sekundären Tumoren, das verringerte Auftreten von primären oder sekundären Tumoren, die verlangsamte oder verringerte Schwere von sekundären Effekten der Krankheit, ein stehen gebliebenes Tumorwachstum und ein Rückgang der Tumore aufgefasst werden. Der Extremfall einer vollständigen Inhibierung wird hierin als Prävention bezeichnet.
Der Begriff „Prävention", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass kein Tumor oder kein Tumorzellenwachstum, wenn überhaupt, aufgetreten ist und kein weiterer Tumor oder kein weiteres Tumorzellenwachstum, falls es bereits Wachstum gegeben hat, aufgetreten ist.
Der Begriff „therapeutische Behandlung", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die Behandlung einer Versuchsperson nachdem sie sich eine Krankheit zugezogen hat und umfasst auch eine prophylaktische Therapie.
Der Begriff "effektive Menge", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine Menge, die ausreicht, um die spezifizierte Wirkungsweise auszuführen. Eine „therapeutisch effektive Menge" bedeutet in Bezug auf die Behandlung eines Tumors, eine Menge die ausreicht, um eines oder mehr der folgenden Ergebnisse hervorzurufen: Reduzierung der Größe des Tumors, Inhibierung der Metastase des Tumors, Inhibierung des Tumorwachstums, Verhinderung des Wachstums des Tumors, Entlastung von Beeinträchtigungen aufgrund des Tumors oder Verlängerung des Lebens eines Patienten mit dem Tumor.
Der Begriff „Interferon", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die Familie an hoch homologen Zytokin-Proteinen und Glycoproteinen, von denen bekannt ist, dass sie verschiedenste biologische Aktivitäten aufweisen, wie zum Beispiel antivirale, wachstumshemmende und immunomodulierende Aktivität bei mindestens der Spezies an Tier von dem diese Substanzen stammen.
Im Augenblick sind die Interferone in fünf verschiedene Typen unterteilt: Alpha-IFN (leukozytisches IFN), Beta-Interferon (Fibroblastinterferon), Gamma-Interferon (Immuninterferon), Omega-Interferon und Tau-Interferon (Trophoblastinterferon). Für einen Überblick über die Details und die Beziehungen der Homologen der bekannten Interferon-Proteine wird zum Beispiel auf Viscomi, Biotherapy 10:59-86 (1997) verwiesen.
Die Begriffe „Interferon-Beta" und „IFN-β", wie sie hierin verwendet werden, schließen alle Proteine, Polypeptide und Peptide ein, welche natürliche oder rekombinante IFN-βs oder Derivate davon sind und welche durch eine biologische Aktivität dieser IFN-β gegenüber malignen, nicht-malignen oder Virus-Erkrankungen charakterisiert sind. Diese umfassen IFN-β ähnliche Verbindungen aus einer Vielzahl an Quellen wie zum Beispiel natürliches IFN-β (menschlich und nicht-menschlich), rekombinantes IFN-β und synthetisches sowie halb-synthetisches IFN-β.
Der Begriff „rekombinantes Interferon-Beta", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf IFN-β hergestellt durch rekombinante DNA-Techniken, wie zum Beispiel hergestellt aus Zellen, die mittels eines exogenes DNA-Konstrukts, welches die gewünschten IFN-β-Polypeptide entschlüsselt, transformiert wurden.
Der Begriff "internationale Einheit", wie er hierin verwendet wird, bedeutet die international etablierte Potenzeinheit zur Bestimmung von IFN, wie sie durch die „International Conference for Unification of Formulae" definiert wurde und von den Fachleuten auf den Gebiet erkannt wird.
Der Begriff "pharmazeutisch akzeptabler Träger", wie er hierin verwendet wird, steht für ein Verdünnungsmittel, einen Zusatzstoff, einen Excipienten oder ein Vehikel mit dem das Therapeutikum verabreicht wird. Es umfasst jegliche und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, wässrigen Lösungen, Beschichtungen, antibakteriellen und antifungalen Mittel, isotonische und absorptionsverzögerenden Mittel und ähnliches. Die Verwendung dieser Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik wohlbekannt. Mit Ausnahme der konventionellen Medien oder Mittel, die inkompatibel mit dem aktiven Inhaltsstoff sind, kann über deren Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen nachgedacht werden. Ergänzende aktive Inhaltsstoffe können außerdem in die Zusammensetzungen der Erfindung eingebracht werden. Eine Zusammensetzung wird als „pharmakologisch akzeptabel" bezeichnet, wenn ihre Verabreichung von dem empfangenden Patienten toleriert wird.
„Simultan oder sequentiell", wie es hierin verwendet wird, bedeutet dass IFN-β zusammen mit einem anderen Zytokinen oder chemotherapeutischem Mittel oder zusammen mit Radiotherapie oder einem chirurgischen Eingriff oder dort, wo eine IFN-β-Verabreichung vorausgeht oder von einer Nicht-IFN-β-Behandlung gefolgt wird, verabreicht wird. Wo eine „sequentielle" Therapie stattfindet, kann der Zeitraum zwischen der Verabreichung von IFN-β und der Nicht-IFN-β-Behandlung in Abhängigkeit des zu behandelnden Tumors oder Sarkoms, des zu behandelnden Säugetiers und der Effektivität der Gesamtbehandlung Minuten, Stunden, Tage, Wochen oder Monate betragen.
Der Begriff „im wesentlichen simultan" bedeutet „ungefähr zur selben Zeit" lediglich mit der Einschränkung, dass beide Substanzen zusammen an der Stelle des Tumors vorhanden sein müssen.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass IFN-β signifikant das Tumorwachstum im Ewing-Sarkom inhibieren und/oder verhindern kann.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das IFN-β rekombinantes IFN-β.
Zum Beispiel kann rekombinantes IFN-β1a, (wie zum Beispiel jenes, das als REBIF^® durch Ares-Serono oder als AVONEX^® durch Biogen kommerzialisiert wurde, welche glykosilierte rekombinante IFNs hergestellt in Säugetier-Zellen sind) oder IFN-β1b (wie zum Beispiel jenes, das unter dem Namen BETASERON^® durch Schering AG oder BETAFERON^® durch Berlex/Chiron kommerzialisiert wurde) eingesetzt werden. Mehr bevorzugt wird glykosiliertes rekombinantes IFN-β1a eingesetzt.
Ein extrahiertes, natürliches IFN-β kann genauso in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, wie zum Beispiel jenes, welches unter der Bezeichnung FRONE^® durch Ares-Serono kommerzialisiert wurde. Natürliches, menschliches IFN-β kann von mehreren Zellen als Quelle, umfassend Leukozyten, die aus Gesamtblut isoliert wurden, neonatale Fibroblasten sowie lymphoblastenartige und verschiedene leukämische Zelllinien, gewonnen werden. IFN-β kann auch ein Säugetier-Extrakt, wie zum Beispiel IFN-β von Wiederkäuern oder Rindern, sein. So kann das eingesetzte IFN-β „homolog" zu dem zu behandelnden Säugetier sein, was bedeutet, dass es den selben Ursprung hat wie die zu behandelnde Säugetierspezies (e.g. menschliches IFN-β zur Behandlung eines Menschens oder von einer Maus stammendes IFN-β zur Behandlung von Mäusen) oder „heterolog" zu dem zu behandelnden Säugetier sein, was bedeutet, dass die Spezies von der das IFN-β stammt und die zu behandelnde Spezies an Säugetier verschieden sind (e.g. menschliches IFN-β zur Behandlung einer Maus oder von einer Maus stammendes IFN-β zur Behandlung eines Menschen).
Das IFN-β, welches in der Erfindung eingesetzt wird, umfasst weiterhin zum Beispiel bekannte Sequenzen und solche Varianten, deren Gene durch einen hohen Grad an Homologie mit den bekannten Sequenzen charakterisiert sind und welche biologisch aktives IFN-β kodieren, und Verbindungen, die im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität aufweisen, wie sie bekannte Formen an IFN-β haben. Das IFN-β kann auch einfache oder mehrfache Insertionen, Löschungen und/oder Hinzufügungen von Aminosäuren zu der natürlich vorkommenden Sequenz aufweisen und kann zu einem Teil, der die aktive Stelle des IFN-β trägt, fragmentiert sein.
Im allgemeinen ist jedes IFN-β-Molekül von der vorliegenden Erfindung umfasst und ist in dem Ausdruck „IFN-β" eingeschlossen, vorausgesetzt alle diese Moleküle zeigen den Effekt der Verhinderung oder Verringerung der Größe des Ewing-Sarkoms oder EOE in vitro, in Versuchstieren in vivo oder in einem zu behandelden Säugetier.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Wirkung von IFN-β gegen das Ewing-Sarkom in Mäusen veranschaulicht. Es wird jedoch klargestellt, dass sich die vorliegende Erfindung auf die in vivo-Effekte von IFN-β in allen Säugetieren wie zum Beispiel Mensche und auf alle Ewing-Sarkome und EOE erstreckt. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Säugetier ein Mensch. Beispielhaft genannte, nicht-menschliche Säugetiere umfassen Vieh wie zum Beispiel Kühe, Schweine, Schafe, Pferde, Ziegen, Begleittiere wie Katzen und Hunde und Versuchstiere wie zum Beispiel Mäuse, Kaninchen, Meerschweinchen oder Hamster.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das IFN-β mittels jeder geeigneten Route wie zum Beispiel oral oder parenteral, abgesehen von der Route über den Verdauungskanal, verabreicht werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel erfolgt die parenterale Verabreichung mittels intravenöser (innerhalb oder in eine Vene), intramuskulärer (in einen Muskel), subkutaner (eingeführt unterhalb der Haut) oder perkutaner (Effekt durch die Haut) Mittel. Eine systematische Injektion, bei der das IFN-β in den Blutstrom gelangt, ist bevorzugt, aber eine direkte Injektion in den Tumor selbst kann auch vorteilhaft angewendet werden.
Die Verabreichung kann als einmalige Dosis oder als wiederholte Dosen ein- oder mehrmals innerhalb einer bestimmten Periode erfolgen. Wenn das IFN-β mittel einer Injektion verabreicht wird, kann die Verabreichung durch kontinuierliche Injektionen oder durch einen einzelnen Bolus oder mehrere Boluse erfolgen. Die Verabreichungsarten und die Posologie können von Fachleuten gemäß der Kriterien, die im Allgemeinen für eine therapeutische Behandlung eines Patienten in Betracht gezogen werden, bestimmt werden. Als solche wird die Dosierung des zu verabreichenden Mittels von solchen Faktoren wie dem Alter, dem Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, dem allgemeinen medizinischen Zustand, der medizinischen Vorgeschichte des Patienten, etc. abhängen.
Die effektive Menge an IFN-β hängt vom Säugetier und den Behandlungsbedingungen ab. Im allgemeinen ist es wünschenswert, den Rezipienten mit einer Dosis, welche im Bereich von ungefähr 1 × 10⁶ bis ungefähr 90 × 10⁶ internationalen Einheiten (IU) liegt, zu versorgen, obwohl niedrigere oder höhere Dosen verabreicht werden können. Vorzugsweise kann eine Dosis im Bereich von ungefähr 1 × 10⁶ bis ungefähr 45 × 10⁶ internationalen Einheiten (IU) verabreicht werden. Erfahrene praktische Ärzte werden das Timing und die Dosierung anpassen, damit sie zu den klinischen Symptomen des Patienten passen. Dieses Wissen wurde über Jahrzehnte angesammelt und ist in der medizinischen Literatur beschrieben. Die IFN-β-Zusammensetzung können alleine oder in einer Formulierung mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern in Einzel- oder Mehrfach-Dosen verabreicht werden. Aus diesem Grund wird in einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung das IFN-β als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält, verabreicht.
Geeignete pharmazeutische Träger umfassen nicht abschließend inerte, feste Verdünnungsmittel oder Füllmaterialien, sterile wässrige Lösungen und verschiedene nichttoxische organische Lösungsmittel. Pharmazeutisch akzeptable Träger sollten inert sein. Weiterhin sollten die Träger nicht mit den aktiven Inhaltsstoffen reagieren oder auf andere Weise deren Effektivität reduzieren und im Besonderen sollten sie die Effektivität oder Stabilität von IFN-β nicht verringern. Pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen Wasser, Ethanol, Polyethylenglykol, Mineralöl, Petrolatum, Propylenglykol, Lanolin und ähnliche Mittel.
Die pharmazeutische Form, die zur injizierbaren Anwendung geeignet ist, beinhaltet sterile wässrige Lösungen (wo Wasserlöslichkeit vorliegt) oder Dispersionen und sterile Pulver zur spontanen Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen sollte die Form steril sein und soweit flüssig, dass eine einfache Injizierbarkeit vorliegt. Sie sollte auch stabil unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung sein sowie gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie zum Beispiel Bakterien und Pilze geschützt sein.
Die IFN-β-Zusammensetzung kann alleine oder simultan oder sequentiell in Kombination mit jeglichen therapeutischen Mitteln wie zum Beispiel einem weiteren Mittel, das gegen das Ewing-Sarkom wirksam ist, verabreicht werden. In dieser „kombinierten Therapie" kann das IFN-β mit anderen Zytokinen und/oder chemotherapeutischen Mitteln und/oder mit einem radiotherapeutischen Protokoll und/oder mit chirurgischen Eingriffen verabreicht werden. Solche Zytokine beinhalten nicht abschließend Interleukin-1, TNF-α, IFN-α und/oder Interferon-Gamma. Typische Vertreter an chemotherapeutischen Mitteln sind im Stand der Technik wohlbekannt und beinhalten nicht abschließend Doxorubicin, Actimomycin, Cyclophosphamid (VAdriaC), Etoposid, Ifosfamid und Vinkristin.
Im Besonderen haben die Autoren der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass ein synergistischer Effekt aus der gekoppelten Behandlung von IFN-β und Ifosfamid resultiert.
Die Mengen an den anderen Zytokinen sind ähnlich zu den effektiven Mengen an IFN-β. Die effektiven Mengen an chemotherapeutischen Mitteln variiert in Abhängigkeit vom Mittel und sind im Stand der Technik wohlbekannt. Die Zusammensetzungen können entweder in Verbindung mit den Modalitäten der zweiten Behandlung oder separat, zum Beispiel zu verschiedenen Zeiten oder in verschiedenen Spritzen oder Tabletten, verabreicht werden.
Chirurgische Eingriffe können in gewissen Fällen eingesetzt werden, um zu versuchen, den Krebs und einiges umgebendes weiches Gewebe zu entfernen. Chirurgische Eingriffe können auch gemacht werden, um jeglichen Tumor, der nach einer Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie überbleibt, zu entfernen. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die IFN-β-Zusammensetzung in Kombination einer chirurgischen Therapie verabreicht, vorzugsweise nach einem chirurgischen Eingriff.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält die im Wesentlichen simultane oder sequentielle Verabreichung eines oder mehrerer anderer Zytokine, Derivate davon und/oder eines oder mehrerer chemotherapeutischer Mittel und/oder die simultane und/oder sequentielle Behandlung mittels Radiotherapie. Dementsprechend kann das IFN-β zusammen mit anderen Zytokinen oder chemotherapeutischen Mitteln oder zusammen mit Radiotherapie oder wo eine Verabreichung von IFN-β einer Nicht-IFN-β-Behandlung vorangeht oder von dieser gefolgt wird, verabreicht werden. Wo eine „sequentielle" Therapie statt findet, kann der Zeitunterschied zwischen der Verabreichung von IFN-β und der Nicht-IFN-β-Behandlung in Abhängigkeit des Tumors oder des zu behandelnden Sarkoms, des zu behandelnden Säugetiers und der Effektivität der Gesamtbehandlung Minuten, Stunden, Tage, Wochen oder Monate betragen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von IFN-β oder aktiven Fragmenten, Mutanten oder Derivaten davon alleine oder zusammen mit einem oder mehreren Zytokinen und/oder chemotherapeutischen Mitteln bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Patienten, die das Ewing-Sarkom oder EOE tragen.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung der oben genannten pharmazeutischen Zusammensetzung beschrieben, bei dem gemäß bekannter Verfahren die aktiven Inhaltsstoffe mit akzeptablen Excipienten, welche pharmazeutisch akzeptabel sind, gemischt werden.
In all den oben genannten Fällen erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung von Derivaten von IFN-β. Mit „Derivat" sind rekombinante, chemische oder andere synthetische Formen an IFN-β oder anderen Zytokinen oder chemotherapeutischem Mittel und/oder jede Veränderung wie zum Beispiel Insertion, Löschung und/oder Hinzufügung zu der Aminosäuresequenz-Komponente des Moleküls unter der Voraussetzung, dass das Derivat die Fähigkeit besitzt, das Ewing-Sarkom oder EOE zu verhindern oder zu inhibieren, gemeint.
Die vorliegende Erfindung macht weiterhin Gebrauch von einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die IFN-β und/oder seine Derivate alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Zytokinen und/oder Derivaten davon und/oder chemotherapeutischen Mitteln und einem oder mehr pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmittel enthält.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben auch festgestellt, dass IFN-β die Apoptose via Induktion von IRF-1 und die Aktivierung von Caspase-7 vermittelt.
Diese Ergebnisse bilden die Basis für ein Verfahren zur Überwachung der Empfindlichkeit von Ewing-Sarkomzellen gegenüber der durch IFN-β vermittelten Apoptose, mittels Verfolgung der Expression und/oder proteolisierter Aktivierung von Caspase-7. Dieses Verfahren kann im Besonderen vorteilhaft sein, um die Empfindlichkeit eines Patienten gegenüber einer Behandlung mit IFN-β zu bestimmen, beispielsweise indem Operationsproben des Ewing-Tumors analysiert werden.
Die Analyse der Aktivierung von Caspase-7 kann mittels jedes Standardverfahrens, welches bei Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, durchgeführt werden.
Ein Immunoassay von Caspase-7 mittels eines Antikörpers, der gegen dieses Protein gerichtet ist, ist bevorzugt.
Man kann auch die kodierende mRNA zum Beispiel für diese Caspase entdecken und/oder quantifizieren.
Nachdem nun die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird das Ganze sogleich durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, welche als Erläuterung und nicht zur Limitierung der vorliegenden Erfindung gedacht sind, wenn es nicht anders angegeben ist, verstanden.
BESCHRIFTUNG DER FIGUREN
1 zeigt die prozentuale Inhibierung des Wachstums von Zelllinien, die mit IFN-α, β oder γ mit derselben Konzentration behandelt wurden.
2 zeigt die prozentuale Inhibierung des Wachstums von EW-7-Zellen, die mit ansteigenden Dosen an IFN-α, IFN-β oder IFN-γ behandelt wurden.
3 zeigt den Effekt von IFN-β auf die Entwicklung des Ewing-Tumors, welcher durch subkutane Injektion von EW-7-Zellen in Mäuse generiert wurde. Relative Tumorvolumina (RTV) werden auf eine Zeit-abhängige Weise gemessen.
4 zeigt das Diagramm der Wachstumsrate des Ewing-Tumors, der in einer nackten Maus gewachsen ist, nach der Injektion von IFN-β. Der Durchschnittswert der relativen Tumorvolumina (RTV) vor 12 Mäusen ist gezeigt.
5 zeigt den Effekt von IFN-β auf den Ewing-Tumor, der in einer nackten Maus gewachsen ist. Die Tumorvolumina wurden zweimal pro Woche für jede Gruppe bestimmt und das mittlere Volumen wurde bestimmt.
6 zeigt die Quantifizierung von apoptotischen Zellen in Zelllinien, die vom Ewing-Sarkom stammen. Die vier ES-Zelllinien wurden mit IFN-β stimuliert. Nach 48 und 72 Stunden wurden die fragmentierten Kerne unter Verwendung des fluoreszierenden Farbstoffs Hoechst 3328 bei entnommenen Zellen detektiert. Die Kernfragmentierung wurde bestimmt in dem die apoptotischen Zellen in den Gesamtpopulationen an unbehandelten bzw. mit IFN-β behandelten Zellen gezählt wurden. Die Prozentzahl an apoptotischen Zellen sind das Mittel dreier, unabhängiger Experimente nach zwei Ablesungen durch zwei Experimentatoren für jede der vier Zelllinien.
7 zeigt die Effekte von IFN-β auf die Expression von Caspase-1 und Caspase-7. EW-7-, EW-1-, COH- und ORH Zellen wurden für 18 Stunden mit IFN-β behandelt. Die gesamten Zellextrakte wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Caspase-1 und Caspase-7 wurden nacheinander spezifischen Antikörpern ausgesetzt.
8 und 9 zeigen den Effekt von IFN-β auf Ewing-Tumore, welche in nackten Mäusen gewachsen sind, nach einer Injektion von IFN-β. Der Durchschnittswert der relativen Tumorvolumina (RTV) von 12 Mäusen und das mittlere Volumen wurden jeden dritten Tag bestimmt.
BEISPIELE
Beispiel 1: Wachstumshemmende Aktivität von β-Interferon auf Zellen, die von Ewing-Tumoren stammen. Studie in vitro.
α- und β-Interferone (IFNs) (genannt Typ I) und γ-IFN (Typ II) werden wegen ihrer wachstumshemmenden Aktivität bei 5 Zelllinien, die entweder von primären Ewing-Tumoren (vor jeglicher Behandlung: EW-7, COH) oder metastatischen Rezidiva (EW-1, ORS, Simon) (1) abstammen, eingesetzt.
Die EW-1-Linie ist eine Sarkomlinie der achten rechten Rippe. Diese Linie stammt von einem Pleuraerguss (Metastasen) (Exon 7 von EW/Exon 5 von Fli) (Melot et al., Hybridoma, 1997, Nr. 16, Seite 457).
Die COH-Linie ist eine Tumorlinie aus dem Knie mit pulmonalen Metastasen. Diese Linie stammt von einem primären Tumor vor der Chemotherapie (Exon 10 von EW/Exon 6 von Fli) (Melot et al., Hybridoma, 1997, Nr. 16, Seite 457).
Die EW-7-Linie ist eine Tumorlinie aus der Scapula. Diese Linie stammt von einem primären Tumor vor der Chemotherapie (Exon 7 von EW/Exon 6 von Fli).
Die ORS-Linie ist eine Zelllinie, die von einem sekundären Tumor (Metastasen) stammt (Melot et al., Hybridoma, 1997, Nr. 16, Seite 457).
Die SIMON-Linie ist auch eine Zelllinie, die von einem sekundären Tumor stammt (Metastasen).
Unabhängig von der verwendeten Zelllinie führte die 24-Stunden- und 48-Stunden-Behandlung mit γ-Interferon oder mit α-Interferon (400 Einheiten/ml) zu einer geringen Inhibierung des Zeltwachstums von 10 bis 25 %.
Die Behandlung mit β-IFN (REBIF^®, glykosiliertes rekombinantes β-IFN1a, 400 Einheiten/ml) ist effektiver, als die Behandlung mit α-IFN oder γ-IFN, weil es nach 24 Stunden der Aktivierung zu einer Inhibierung des Wachstums führt, die größer als 50 unabhängig von der eingesetzten Zelllinie ist, führt. Die Inhibierung von in der EW-7-Linie beträgt zum Beispiel 70 % (siehe 1).
Wie in 2 gezeigt, hängt dieser Unterschied an wachstumshemmender Aktivität zwischen den drei IFNs nicht von der Dosis an eingesetztem IFN ab. Die EW-7-Zellen wurden ausgewählt, um den wachstumshemmenden Effekt mit ansteigender Dosis von 50 Einheiten/ml bis 5000 Einheiten/ml an IFNs zu bestimmen. Im Allgemeinen ist die Inhibierung des Wachstums, unabhängig von der eingesetzten Dosis an IFN, nach Zugabe von β-IFN viel größer als der Effekt, der beobachtet wird, wenn α-IFN oder γ-IFN zugegeben werden: von 40 bis 80 % Inhibierung für β-IFN gegenüber 6 bis 10 % und 6 bis 20 % für γ-IFN bzw. α-IFN. Es fällt auf, dass die Zugabe von 500 Einheiten/ml β-IFN praktisch das Maximum an wachstumshemmender Reaktion ergibt.
Die unterschiedlichen Effekte, die zwischen den zwei IFNs beobachtet werden, können die Konsequenzen eines Unterschieds im Mechanismus der Aktivierung der Gene, die durch die IFNs induziert werden und an ihrer wachstumshemmenden Wirkung beteiligt sind, sein, wie zum Beispiel Gene, die 2'5'Oligo(A)-Synthease oder IRF-1 (Interferon Regulatory Factor 1) kodieren.
Beispiel 2: Wachstumshemmende Wirkung von IFN-β auf das Wachstum von Ewing-Tumoren. Eine in vivo-Studie bei nackten Mäusen.
A. Injektion von malignen Zellen
Feste Tumore wurden mittels subkutaner Injektion von 20 × 10⁶ EW-7-Zellen (Zelllinie, die von einem Schulterblatt-Tumor stammt) eines primären Tumors vor der Chemotherapie (EW Exon 7 / Fli Exon 6) in 6 Wochen alten nackten Mäusen, generiert.
Nach zehn Tagen wurden zwei Gruppen an fünf Mäusen gebildet; eine Kontroll-Mäusegruppe und eine Mäusegruppe, die IFN-β erhält (REBIF^®).
Die Injektionen in den Tumor selber wurden dreimal pro Woche mit 5 × 10⁵ IFN-Einheiten pro Maus durchgeführt. Die Behandlung wurde über eine Periode von 5 Wochen durchgeführt, wobei die Tumorvolumina jeden dritten Tag bestimmt wurden.
Die relativen Tumorvolumina (RTV) zeigen ein verlangsamtes Tumorwachstum nach der Injektion von IFN-β. 3, gestaltet aus den durchschnittlichen RTV-Daten, zeigt einen sehr starken Abfall der Erneuerungswachtumsraten nach der Injektion von IFN-β.
Diese Ergebnisse von etablierten Tumoren in der experimentellen Wachstumsphase erlauben die Bestätigung der in vitro-Ergebnisse mit Zelllinien.
B. Transplantat eines festen Tumors
Ein zweites Experiment wurde in vivo mit 8 Wochen alten nackten Mäusen durchgeführt. Eine Probe eines Tumors mit einem Durchmesser von 5 mm von einem festem Tumor, der sich nach der Injektion von 20 × 10⁶ EW-7-Zellen in einer nackten Maus gebildet hat, und durch einen in vivo-Transfer haltbar gemacht wurde, wurde in nackte Mäuse transplantiert.
Drei Tage nach der Transplantation wurden zwei Gruppen an jeweils 12 Mäusen mit einer Kontrollgruppe, die Injektionen mit Phosphat-Puffer-Lösung (PBS) erhält, und mit einer Gruppe, die Injektionen mit IFN-β erhält, gebildet. 1 × 10⁶ Einheiten an IFN-β wurden in die Tumorstellen in einem 5-Tage-Rhythmus (Montag bis Freitag) für einen Monat injiziert.
Die Tumorwachstumskurven wurden nach der Messung der Durchmesser der transplantierten Tumore in jeder Maus zweimal pro Woche bestimmt (4).
4 zeigt die Diagramme, die von den durchschnittlichen RTV für jede 12-Mäuse-Gruppe erhalten wurden. Eine fast lineare Progression der Tumorentwicklung wurde bei den Kontrollmäusen beobachtet, während die Tumorproliferation in den Transplantaten, die IFN-β erhalten haben, praktisch gleich Null ist. Dieses Ergebnis wurde durch Mittelbildung für jede Gruppe bestätigt (5).
Es ist notwendig drauf hinzuweisen, dass einem Monat nach der Unterbrechung der Injektion von IFN-β, 40 % der Mäuse, die IFN-β erhalten hatten, keine Tumore entwickelten.
Angesichts der voran gegangenen Beschreibung mit Beispielen, werden die Fachleute in der Lage sein, die Erfindung in verschiedensten Möglichkeiten und Ausführungsbeispielen durchzuführen, ohne vom Geist und dem Umfang der Erfindung, wie sie in den beigefügten Ansprüchen definiert ist, abzuweichen.
Beispiel 3: Effekt von IFN-β auf die Expression von IRF-1 in Zellen, die vom Ewing-Sarkom stammen.
Um die Genexpression von IRF-1 und die Regulierung durch IFN-β zu untersuchen, haben die Autoren der Erfindung die Genexpression von IRF-1 mittels Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) abgeschätzt. Die gesamte RNA, die nach 3, 6 und 18 Stunden nach der Behandlung mit IFN-β extrahiert wurde, zeigt, dass IRF-1-spezifische mRNA durch das IFN-β induziert wurde. In EW-7-Zellen induziert IFN-β die Genexpression von IRF-1 in einer zeitabhängigen Weise für bis zu 6 Stunden nach der Stimulation. Jedoch nach der Stimulation mit IFN-β, ist mRNA von IRF-1 noch 18 Stunden detektierbar. Ähnliche Ergebnisse wurden für die drei anderen ES-Zelllinien erhalten, aber mit unterschiedlichem Graden an IRF-1-Gen-Induktion.
Beispiel 4: Verhältnis zwischen IRF-1-Expression und IFN-β-induzierter Apoptose in Ewing-Sarkom-Zelllinien.
Die Autoren der Erfindung waren insbesondere daran interessiert festzustellen, ob die Stimulation dieser ES-Zelllinien durch IFN-β eine Apoptose provoziert, sowie das mögliche Verhältnis zwischen Apoptose und der Genexpression von IRF-1 zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurde die Kernfragmentierung mittels Hoechst-Färbung bestimmt und quantifiziert, indem die Anzahl an apoptotischen Zellen in den Gesamtpopulationen an unbehandelten bzw. an mit für 48 oder 72 Stunden mit IFN-β behandelten Zellen (6) bestimmt wurden. EW-7- und COH-Zellen zeigen einen Zeit-abhängigen Anstieg an apoptotischen Zellen nach der Behandlung mit IFN-β, während EW-1- und ORS-Zellen keine signifikante Apoptose während jeder Periode der IFN-β-Behandlung unterliefen.
Die Unterschiede in der Sensibilität dieser vier ES-Zelllinien gegenüber IFN-β-abhängiger Apoptose und die Korrelation zwischen p21^WAF-1/Cip-1 und den Bcl-2 Proteinniveaus wurde mittels Immun-Blotting-Analyse nach der Behandlung mit IFN-β untersucht. Die Herabregelung des gesamten zellulären Bcl-2-Proteins korrelierte mit der Heraufregelung der Expression von p21^WAF-1/Cip-1- und IRF-1 in EW-7- und COH-Zellen, wohingegen keine Veränderung bei der Expression des Bcl-2-Proteins in EW-1- oder ORS-Zellen beobachtet wurde. Das p21^WAF-1/Cip-1-Protein war in EW-1- und ORS-Zellen nicht nachweisbar, egal ob sie mit IFN-β behandelt wurden oder nicht.
Da die Induktion der Apoptose durch Zytokine die Beteiligung vor der Expression der Caspase-Gene gezeigt hat, haben die Autoren der Erfindung die mögliche Steigerung der Expression der Caspase-Gene in ES-Zelllinien mittels IFN-β untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein RNase-Schutz-Assay für die Caspase-Familie unter Verwendung des hApol-Kits (Pharmingen) nach der Stimulierung der ES-Zellen mit IFN-β für 18 Stunden, durchgeführt. Die Expression der Caspase-7-mRNA stieg signifikant in den mit IFN-β-stimulierten EW-7-Zellen an. In einem geringeren Maße stieg der Gehalt an mRNA in Caspase-3 und Caspase-8 an, während der Gehalt an Caspasen-1, Caspasen-6 und Caspasen-9 unverändert blieb. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den COH-Zellen beobachtet. In EW-1- und ORS-Zellen blieb der Gehalt an mRNA von Caspasen unverändert.
Im Lichte der Ergebnisse des RNase-Schutzes haben die Autoren der Erfindung die Möglichkeit untersucht, dass IFN-β die Proteolyse, die zur Bildung von aktiven Caspase-Untereinheiten führt, steigert. Die proteolisierte 20 kDa Caspase-1 wurde zunächst nach der Aussetzung mit Antikörpern der aktiven Form der Caspase gegenübergestellt. Nach dem Strippen des Blots wurden die 35-kDa- und die 18-kDa-Formen der Caspase-7 mit spezifischen Antikörpern gegen Caspase-7 nachgewiesen (welche aufgereinigte Maus-Antikörper von Pharmingen (Becton Dickinson) waren). Immuno-Blot-Analyse mit Antikörpern gegen Caspase-7 zeigte, dass IFN-β nicht nur die Menge an Pro-Caspase-7-Protein ansteigen lässt, sondern auch proteolisierte aktive Untereinheiten von 18 kDa (7) generiert. Diese Prozesse wurden nur in den p53-Zellen des Wildtyps von EW-7- und COH-Tumorzellen beobachtet. Ein Anstieg in der 20-kDa-Caspase-1-Untereinheit wurde auch in EW-7- und COH-Zellen nach der Behandlung mit IFN-α und IFN-β beobachtet, sie konnte aber nicht in EW-1- oder ORS-Zellen nachgewiesen werden (7). Der Anstieg in der Genexpression von Caspase? und die Abspaltung von Pro-Caspase-7, welche nach der Behandlung mit IFN-β nachgewiesen wurden, legen den Schluss nahe, dass in Zellen, welche vom Ewing-Sarkom stammen, IFN-β den Zelltod durch selektive Heraufregelung von aktivierter Caspase-7 auslöst.
Beispiel 5: Ektopische Expression von IRF-1.
Um die Rolle von IRF-1 bei der Apoptose in Zellen des Ewing-Sarkoms aufzuzeigen, haben sich die Autoren der Erfindung an die Generierung von Zellen, die IRF-1 exprimieren, gewagt. ES-Zelllinien, die konstitutiv IRF-1 exprimieren, waren aufgrund der starken zytotoxischen Wirkung des endogenen IRF-1 schwierig herzustellen. Es wurde eine induzierbare Form von IRF-1 eingesetzt, um zu bestimmen, ob die Induktion von IRF-1 den Tod von Ewing-Tumorzellen verstärkt, die normalerweise resistent gegenüber einem IFN-β-vermittelt Zelltod sind. Folglich wurde ein Tetracyclininduzierbares System eingesetzt, welches den Reverse-tTA-Aktivator (rtTA) verwendet, der eine Doxycyclin(Dox)-induzierbare Expression von IRF-1 erlaubt (Nguyen, H. et al., Oncogene, 15:1425-1435 (1997)). Zellklone von rtTA-IRF-1 von allen ES-Zeltlinien wurden individuell expandiert und nach 48 Stunden Wachstum in einem Medium mit oder ohne Dox mittels Western-Blot-Analyse nach Expression von IRF-1 untersucht. Stimulation mit Dox führte zu einer Induktion des IRF-1-Proteins in den vier ES-TA/IRF-1-Zelllinien, aber nicht in den Kontroll-rtTA-Zelllinien. Um zu bestimmen, ob die Induktion von IRF-1 mit einer Kernfragmentierung einher geht, wurden Zellen nach der Behandlung von transfizierten Zellen für 24 oder 48 Stunden mit Dox, mit dem Hoechst-Farbstoff eingefärbt. Alle ES-TA/IRF-1-Zelllinien unterliefen unabhängig von ihrem p53-Status eine Zeit-abhängige Apoptose nach Stimulation mit Dox. 40 bis 50 % an apoptotischen Zellen wurden nach einer 48-ständigen Stimulation mit Dox nachgewiesen und fast alle Zellen waren 96 Stunden nach der Stimulation einer Apoptose unterlaufen. Western-Blot-Analyse der gesamten Extrakte der ES-TA/IRF-1-Zellen zeigte eine Korrelation zwischen der IRF-1-Induktion durch Dox und der Heraufregelung von p21^WAF-1/Cip-1, die von einer Herabregelung des Bcl-2-Proteins begleitet wurde. Ein ansteigender Gehalt an proteolisierter, aktiver Caspase-7-Untereinheit wurde auch in den vier ES-TA/IRF-1-Zelllinien, die mit Dox für 48 Stunden behandelt wurden, beobachtet, aber nicht in den Kontroll-rtTA-Zelllinien. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse den Schluss nahe, dass Caspase-7 an der IRF-1-vermittelten Apoptose in Ewing-Sarkomzellen beteiligt ist.
Beispiel 6: Antitumor-Aktivität von IFN-β auf den Ewing-Tumor – Studie in nackten Mäusen
Das Ziel dieses Experimentes war die Untersuchung des Effekts von IFN-β auf die Entwicklung (Wachstum) eines existierenden Ewing-Tumors.
Eine Tumorprobe mit 5 mm Durchmesser, welche von einem festen Tumor, der sich in nackten Mäusen nach der Injektion von 20 × 10⁶ EW-7-Zellen gebildet hatte, durch in-vivo-Transfer haltbar wurde, wurde in 8 Wochen alte nackte Mäuse transplantiert. Nach drei Wochen wurden die Mäuse, die einen Tumor von ungefähr 100 – 200 mm³ entwickelt hatten, in 2 „zufällige" Gruppen von 12 Mäusen aufgeteilt. Die erste Gruppe erhielt PBS als Kontrolle und die zweite Gruppe IFN-β (REBIF^®).
IFN-β wurde fünfmal pro Woche (Montag bis Freitag) in die Tumormasse selbst in einer Dosis von 8 × 10⁵ Einheiten pro Maus injiziert. Die Dosierung erfolgte über 5 Wochen, während die Tumore jeden dritten Tag gemessen wurden.
Die relativen Tumorvolumina (RTV) und mittleren Tumordurchmesser, die entsprechend bestimmt wurden, zeigen eine deutliche Verlangsamung der Tumorentwicklung (8 und 9).
Dieses Experiment bei existierenden Tumoren in ihrer exponentiellen Wachstumsphase zeigt deutlich, dass IFN-β einen Antitumor-Effekt bezüglich des Ewing-Tumors aufweist.
Beispiel 7: Effekt der Kopplung Chemotherapie/IFN-β auf den Wachstum des Ewing-Tumors in nackten Mäusen.
Der Effekt einer chemotherapeutischen Behandlung mit Ifosfamid, gekoppelt mit einer Behandlung mit IFN-β auf das Wachstum eines existierenden Ewing-Tumors in nackten Mäusen wurde durch Verabreichung von 60 mg/kg Körpergewicht an Ifosfamid an die Mäuse innerhalb von drei Tagen zusammen mit einer intratumoralen Verabreichung von 100.000 Einheit/Tag an IFN-β, gefolgt von einer fünfmaligen in der Woche, alleinigen Verabreichung von IFN-β.
Das Wachstum des Ewing-Tumors wurde mit diesen gekoppelten Behandlungen inhibiert, da die Größe des Tumors gleich blieb.
Darüber hinaus haben die Autoren nachgewiesen, dass die gekoppelten Behandlungen einen synergistischen Effekt haben, da die genannte Wirkung viel größer ist als die, die aus einer unabhängigen Verabreichung von IFN-β und Ifosfamid resultiert.

Claims

Verwendung von Interferon-Beta zur Zubereitung eines Arzneimittels für die Behandlung des Ewing-Sarkoms oder EOE.
Verwendung gemäß Anspruch 1, für die Behandlung des Ewing-Sarkoms.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Interferon-Beta Interferon-Beta-1a ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Interferon-Beta rekombinantes Interferon-Beta ist,
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Interferon-Beta glykosyliert ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Interferon-Beta dazu bestimmt ist, oral oder parenteral verabreicht zu werden.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die parenterale Verabreichung eine intramuskuläre, intravenöse, subkutane oder perkutane Verabreichung ist.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei das Interferon-Beta dazu bestimmt ist, durch systematische Injektion oder direkte Tumorinjektion verabreicht zu werden.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Interferon-Beta dazu bestimmt ist, in einer wirksamen Menge von etwa 1 bis etwa 90 Millionen internationalen Einheiten, bevorzugt von etwa 1 bis 45 Millionen internationalen Einheiten verabreicht zu werden.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Interferon-Beta dazu bestimmt ist, gleichzeitig oder sequentiell mit einem oder weiterer Wirkstoff, der zur Behandlung von Tumoren der Ewing-Familie eingesetzt wird, verabreicht zu werden,
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei der Wirkstoff Ifosfamid ist.
Ein in-vitro-Verfahren zur Überwachung der Empfindlichkeit von Ewing-Sarkomzellen gegenüber der durch IFN-β vermittelten Apoptose, wobei die Expression und/oder Aktivierung von Caspase-7 bewertet wird und wobei die Expression und/oder Aktivierung ein Indikator für die Empfindlichkeit von Ewing-Sarkomzellen gegenüber der durch IFN-β vermittelten Apoptose ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Expression und/oder Aktivierung mittels eines Immunoassays von Caspase-7 bewertet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 13, wobei die Ewing-Sarkomzellen aus einer chirurgischen Probe eines Ewing-Tumors entstammen.