ES2234605T3 - Utilizacion de beta-interferon en la fabricacion de un medicamento destinado al tratamiento del sarcoma de ewing y eoe. - Google Patents

Abstract

Utilización de interferón-beta para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del sarcoma de Ewing o de EOE.

Description

Utilización de beta-interferón en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del sarcoma de Ewing y EOE.

La invención está relacionada con el uso de interferón-beta para el tratamiento de tumores óseos de Ewing en mamíferos.

La familia de tumores de Ewing representa el segundo tipo de tumores óseos más común observado en niños después del osteosarcoma. La familia incluye el sarcoma de Ewing (EWS o tumor óseo de Ewing), tumores extraóseos de Ewing (EOE), tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET o neuroepitelioma periférico) y tumores de Askin (PNET de la pared torácica). Estos tumores son enfermedades raras, en las que las células malignas se encuentran en el hueso y en los tejidos blandos y protocolos recientes utilizan el mismo tratamiento para esta familia de tumores. El EWS es mayoritariamente observado en adolescentes y en adultos jóvenes y los puntos más habituales de localización para la lesión primaria son los huesos pélvicos, el fémur, el húmero y las costillas. La incidencia del sarcoma de Ewing se estima en torno a aproximadamente el 60% de entre la familia de tumores de Ewing.

Estudios llevados a cabo utilizando marcadores inmunohistoquímicos, citogenética, genética molecular y cultivos tisulares indican que estos tumores proceden todos ellos de la misma célula madre primordial. Estudios citogenéticos llevados a cabo en relación con la familia de tumores de Ewing han identificado una alteración consistente de la localización del EWS sobre la banda q12 del cromosoma 22, la cual involucra también a otros cromosomas, incluyendo el 11 ó el 21. De forma característica, la terminación amino del gen del EWS está yuxtapuesta con el grupo carboxi terminal de otro cromosoma. En la mayor parte de los casos (90%), esta translocación cromosómica dirige la fusión de la terminación 5' del gen del EWS, codificando para una proteína que es capaz de participar en el metabolismo del RNA, con la terminación 3' del gen Fli-1, un componente de la familia del factor de transcripción Ets localizada sobre la banda q24 del cromosoma 11 (Delattre et al., Nature 359: 162-165 (1992)). En función de los puntos de rotura, pueden generarse diversos genes de fusión (entre los exones 7 y 11 del EWS y los exones 3 a 9 de Flui-1).

La fusión más habitual, EWS-Fli-1 de tipo I, fusiona el exón 7 del EWS con el exón Fli-1 del exón 6 y representa el 50% de los casos. La fusión de tipo II (25% de los casos) une el exón 7 del EWS con el exón 5 de Fli-1. Además de estos dos tipos de fusión principal, se han descrito aproximadamente otras 10 combinaciones.

En determinados casos de tumor de Ewing, el EWS no está fusionado con Fli-1 sino con otro componente de la familia Ets, por ejemplo FEV. Otros componentes de la familia Ets que pueden combinarse con el gen del EWS son el ERG (localizado sobre el cromosoma 21), el ETV (localizado sobre el cromosoma 7) y el E_{1}AF (localizado sobre el cromosoma 17), los cuales dan lugar a las siguientes translocaciones: t (21,22); t(7,22) y t(17,22), respectivamente.

Estas alteraciones genéticas permiten obtener una consecuencia bioquímica constante: Las células Ewing siempre expresan una proteína quimérica que soporta la región N-terminal del EWS fusionado con un dominio de unión DNA de la familia de la proteína Ets. Esta constancia sugiere que esta fusión desempeña un papel central en el desarrollo del tumor de Ewing.

En el sarcoma de Ewing, se ha demostrado, de forma experimental, el papel de la proteína de fusión EWS/Fli-1. Esta proteína puede transformar fibroblastos de ratones y estas células son capaces de generar tumores en ratones atímicos.

A partir de experimentos in vitro, se ha demostrado que la proteína EWS/Fli-1 era capaz de activar determinada transcripción genética de una forma más eficaz que el Fli-1. Este hecho sugiere que la fusión de proteínas EWS/Fli-1 ejerce sus acciones oncógenas a través de la activación anormal de determinados genes celulares.

Se ha demostrado también que la proteína PU-1, procedente también de la familia Ets, está implicada en el control de la expresión genética regulada por interferón y por citoquinas (Pérez et al., Mol. Cell Biol. 14: 5023-5031 (1994)).

Entre los importantes factores prognósticos para la familia de tumores de Ewing se incluyen el punto y el volumen del tumor primario y si la enfermedad es metastásica. Se considera que el tamaño del tumor constituye también una variable importante. Con el actual tratamiento, los estudios sugieren que entre el 50 y el 70% de los pacientes sin metástasis presentan una supervivencia exenta de enfermedad a largo plazo, en comparación con tan solo entre el 20 y el 30% que corresponde a los pacientes que presentan metástasis. Por tanto, existe una acusada necesidad de disponer en la técnica que un procedimiento eficaz para el tratamiento de tumores de la familia Ewing.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una camino eficaz para el tratamiento del sarcoma de Ewing y del EOE en un mamífero. Otras características y ventajeas de la presente invención serán expuestas en la detallada descripción de las realizaciones preferidas que sigue a continuación, y en parte resultarán evidentes a partir de la descripción o pueden ser conocidas a través de la práctica de la invención. Estas ventajas de la invención serán entendidas y comprendidas por medio de las composiciones y usos particularmente señalados en la descripción y en las reivindicaciones de la misma.

Rosolen et al. (Modern Pathology, 1997, 10:55-61) informaron acerca de que el tratamiento de una línea celular procedente de sarcoma de Ewing con interferón-alfa induce la inhibición del crecimiento celular in vitro.

Los autores de la presente invención han demostrado ahora que el interferón beta (IFN-\beta) que se une al mismo receptor que el interferón-alfa (INF-\alpha), pero acerca del cual se sabe que ejerce distintas actividades (Runkel et al., 1998, The Journal of Biological Chemistry, 14:8003-8008), muestra una acción antiproliferativa sobre el sarcoma de Ewing.

Dichos autores han demostrado, particularmente, que la acción antiproliferativa del INF-\beta sobre las células que proceden del sarcoma de Ewing in vitro era marcadamente superior a la del INF-\alpha.

Por consiguiente, una realización de la presente invención va dirigida al uso de interferón-beta para la preparación de un medicamento para el tratamiento del sarcoma de Ewing y del EOE. Al mamífero que precisa de este tratamiento tiene que administrársele una cantidad terapéuticamente eficaz de INF-\beta. A tal efecto, se proporciona una composición adecuada para administración a un mamífero, para el tratamiento del sarcoma de Ewing, que comprende IFN-\beta en una cantidad terapéuticamente eficaz, conjuntamente con un soporte farmacéuticamente aceptable.

Debe darse por entendido que tanto la descripción general precedente como la siguiente descripción detallada se dan a título de ejemplo y explicación y pretenden tan solo proporcionar una nueva explicación de la invención, tal y como se reivindica.

Salvo que se defina lo contrario, la totalidad de términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento pretenden tener el mismo significado que el que es habitualmente aceptado por un experto en la materia en el correspondiente campo.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "familia de tumores de Ewing" significa un tipo de tumor encontrado en hueso y tejidos blandos, caracterizado por pequeñas células redondas y asociado con una alteración de la localización del EWS en el cromosoma 22. La familia de tumores incluye el sarcoma de Ewing (tumor de hueso de Ewing o ETB), tumores de Ewing extraóseos (EOE), tumores neuroectodérmicos primitivos periféricos (PNET o neuroepitelioma periférico) y tumores de Askin (PNET de la pared torácica).

Las células individuales de sarcoma de Ewing y EOE contienen núcleos entre redondos y ovalados con cromatina finamente dispersada, sin nucleolos. Ocasionalmente, se encuentran presentes células con núcleos más pequeños, más hipercromáticos (y probablemente degenerativos), proporcionando un patrón de "células claras-células oscuras". El citoplasma varía en cantidad, pero en el caso clásico, resulta claro que el mismo contiene glicógeno, el cual puede ser resaltado con un colorante ácido periódico de Schiff (PAS). Las células tumorales están estrechamente agrupadas en un patrón difuso sin evidencia de organización estructural.

El aspecto histológico del PNET difiere algo del sarcoma de Ewing y del EOE. Estos tumores están habitualmente compuestos por células hipercromáticas entre redondas y ovaladas, con un citoplasma mínimo. Las células tumorales están habitualmente dispuestas en grupos y trabéculas con una formación en roseta variable. Las rosetas pueden tener una luz central, pero son a menudo definidas por la enfermedad, estando compuestas de células tumorales dispuestas alrededor de un espacio vacío. El patrón de crecimiento lobular clásico se aprecia mejor a baja potencia, y difiere del crecimiento difuso habitual observado en EOE. Ocasionalmente, se observan grupos de células redondas, citológicamente uniformes, con cromatina dispersa que se asemejan a los del EOE, dispersadas en un, por otra parte habitual, PNET. Este solapamiento de características otorga seguridad al concepto según el cual estos tumores son en realidad el mismo tumor, con un espectro de diferenciación.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "mamífero" indica cualquier especie de mamífero e incluye, sin que ello suponga ninguna limitación, conejos, ratones, perros, gatos, primates y humanos, preferiblemente humanos. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere a cualquier procedimiento, acción, aplicación, terapia o similar, en el que un mamífero, incluyendo un ser humano, es sometido a una ayuda médica con el objeto de mejorar la dolencia del mamífero, de forma directa o indirecta. En el contexto de crecimiento tumoral o de crecimiento de célula tumoral, el término "tratamiento" incluye, sin que ello suponga ninguna limitación, la inhibición y la prevención.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "inhibición" puede ser valorado a través de la aparición retardada de tumores primarios y secundarios, desarrollo enlentecido de tumores primarios o secundarios, ocurrencia retrasada de tumores primarios o secundarios, gravedad retardada o reducida de efectos secundarios de la enfermedad, crecimiento tumoral detenido y regresión de tumores, entre otros aspectos. En sentido extremo, la inhibición completa se indica aquí como prevención.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el termino "prevención" significa que no ha tenido lugar ningún tipo de crecimiento tumoral o de crecimiento de células tumorales, si no había tenido lugar ninguno anteriormente, y que no ha tenido tampoco lugar ningún tipo de nuevo crecimiento tumoral o de células tumorales, si había tenido lugar alguno anteriormente.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento terapéutico" indica tratamiento de un sujeto una vez contraída una enfermedad, e incluye la terapia profiláctica.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad eficaz" significa una cantidad eficaz para llevar a cabo la función especificada. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" en relación con el tratamiento de un tumor, se refiere a una cantidad que resulta suficiente para proporcionar uno o más de los siguientes resultados: reducir el tamaño del tumor, inhibir la metástasis del tumor, inhibir el crecimiento del tumor, prevenir el crecimiento del tumor, aliviar la incomodidad debida al tumor o prolongar la vida de un paciente afectado por el tumor.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "interferón" significa la familia de proteínas citoquina y de glicoproteínas altamente homólogas, acerca de las cuales se sabe que presentan diversas actividades biológicas, tales como actividad antivírica, antiproliferativa e inmunomoduladora, al menos en la especie animal a partir de la cual se obtienen las citadas sustancias.

Actualmente, los interferones son categorizados en cinco diferentes tipos; IFN alfa (IFN leucocito), IFN beta (IFN fibroblasto), IFN gamma (IFN inmune), IFN omega e IFN tau (factor trofoblástico). Para una revisión de los detalles y de la homología de las relaciones de las proteínas IFN conocidas, ver, por ejemplo, Viscomi, Biotherapy 10: 59-86 (1997).

Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "interferón-beta" e "IFN-\beta" incluyen la totalidad de proteínas, polipéptidos y péptidos que son INF-\betas de origen natural o recombinantes o derivados de los mismos, y que se caracterizan por la actividad biológica de aquellos IFN-\betas frente a enfermedades malignas, no malignas o víricas. Entre las mismas se incluyen compuestos de tipo IFN-\betas de origen natural (humano y no humano) e IFN-\betas recombinantes e INF-\betas sintéticos o semi-sintéticos.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "interferón-beta recombinante" se refiere a IFN-\beta obtenido por medio de técnicas de DNA recombinante, a saber, obtenido a partir de células transformadas a través de construcciones de DNA exógenas, que codifican para el polipéptido IFN-\beta deseado.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "Unidad Internacional" significa la unidad de potencia establecida internacionalmente para la medición de IFN, tal y como se definió en la International Conference for Unification of Formulae y como se reconoce por parte de los expertos en la materia.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "soporte farmacéuticamente aceptable" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el producto terapéutico. El mismo incluye cualquier tipo de disolventes, medios de dispersión, soluciones acuosas, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos y similares. La utilización de los citados medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas es bien conocido en el estado de la técnica. Con la excepción de cualquier medio o agente convencional resulte incompatible con el ingrediente activo, se contempla la utilización de los mismos en composiciones farmacéuticas. A las composiciones de la invención se les puede incorporar ingredientes activos suplementarios. Se dice que una composición es "farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "simultánea o secuencial" significa que el IFN-\beta se administra conjuntamente con otra citoquina o agente para quimioterapia o conjuntamente con radioterapia o cirugía o cuando la administración de IFN-\beta va precedida o seguida de no tratamiento con IFN-\beta. Cuando tiene lugar la terapia "secuencial", la diferencia temporal entre la administración de IFN-\beta y el no tratamiento con INF-\beta puede tener una duración de minutos, horas, días, semanas o meses, en función del tumor o del sarcoma que esté siendo tratado, del mamífero que esté siendo tratado y de la eficacia del tratamiento global.

El término "sustancialmente simultánea" significa "a aproximadamente el mismo tiempo", siendo la única limitación la de que ambas sustancias tienen que encontrarse presentes en el punto del tumor.

Según la presente invención, se ha descubierto que el IFN-\beta puede inhibir y/o evitar, de forma significativa, el crecimiento del tumor en el sarcoma de Ewing.

En una realización preferida, el IFN-\beta es IFN-\beta recombinante. Por ejemplo, IFN-\beta1a, (tal como el comercializado como REBIF® por Ares Serono o AVONEX® por Biogen, los cuales son IFNs recombinantes glicosilados obtenidos en células de mamífero o puede utilizarse IFN-\beta1b (tal como el comercializado bajo la marca BETASERON® de Schering AG o BETAFERON® de Berlex/Chiron). Más preferiblemente, se utiliza IFN-\beta1a recombinante glicosilado.

En la presente invención puede utilizarse un IFN-\beta natural extraído, al igual que uno comercializado bajo la marca FRONE® por Ares-Serono. El IFN-\beta humano natural puede ser purificado a partir de diversas fuentes celulares, incluyendo leucocitos aislados a partir de sangre completa, fibroblastos neonatales, linfoblastoides y diversas líneas celulares leucémicas. El IFN-\beta puede ser también un extracto de mamífero, tal como un rumiante o IFN-\beta bovino. Como tal, el IFN-\beta utilizado puede ser "homólogo" para el mamífero que tiene que ser tratado, significando que el mismo tiene el mismo origen que el de las especies de mamíferos que tienen que ser tratadas (por ejemplo, IFN-\beta humano para el tratamiento de un humano o IFN-\beta murino para el tratamiento de un ratón) o puede ser "heterólogo" para el mamífero que tiene que ser tratado, significando que el origen de la especie de IFN-\beta y la especie de mamífero son diferentes (por ejemplo, IFN-\beta humano para el tratamiento de un ratón o IFN-\beta murino para el tratamiento de un humano).

El IFN-\beta utilizado en la invención incluye también, por ejemplo, secuencias conocidas y aquellas variantes cuyos genes se caracterizan por un elevado grado de homología con la secuencia conocida y las cuales codifican para IFN-\beta biológicamente activo y compuestos que tienen sustancialmente la misma actividad biológica que la de las formas conocidas de IFN-\beta. El IFN-\beta puede contener también sencillas o múltiples inserciones de aminoácidos, abandonos y/o adiciones a la secuencia de origen natural y puede ser fragmentado a una parte que soporta el punto activo de
IFN-\beta.

En general, cualquier molécula IFN-\beta es abarcada por la presente invención e incluida en la expresión "IFN-\beta", siempre y cuando la totalidad de las moléculas tengan el efecto de evitar o reducir el tamaño del sarcoma de Ewing o el EOE in vitro, en animal de experimentación en laboratorio in vivo o en un mamífero que tenga que ser tratado.

La presente invención se ejemplifica a través del efecto del IFN-\beta frente a los tumores de sarcoma de Ewing en ratones. No obstante, debe darse por entendido que la presente invención se extiende a los efectos in vivo del IFN-\beta en todos los mamíferos, tales como los humanos, al sarcoma de Ewing o EOE. En una realización preferida, el mamífero es humano. Entre los ejemplos de mamíferos no humanos se incluyen el ganado animal, tal como vacas, cerdos, ovejas, caballos, cabras, animales de compañía tales como gatos y perros, y animales de experimentación en laboratorio, tales como ratones, concejos, cobayos y hámsteres.

Según la presente invención, el IFN-\beta puede ser administrado a través de cualquier ruta que resulte adecuada, tal como la oral o la parenteral, a saber, cualquier ruta diferente a la del canal alimentario. En una realización preferida, la administración parenteral se produce a través de vía intravenosa (dentro o hacia una vena), intramuscular (dentro de un músculo), subcutánea (introducida debajo de la piel o percutánea (efectuada a través de la piel. Se prefiere una inyección sistémica, en la que el IFN-\beta penetra en la corriente sanguínea, pero también puede utilizarse ventajosamente una inyección directa en el propio tumor.

La administración puede ser efectuada en forma de dosis única o de dosis repetidas, una o más veces después de un determinado período. Cuando el IFN-\beta se administra por medio de inyección, la administración puede ser efectuada por medio de inyecciones continuas o a través de un único o múltiples bolus. Los modos de administración y la posología puede ser determinada por parte de los expertos en la materia según criterios generalmente considerados para un tratamiento terapéutico adaptado a un paciente. Como tal, la dosificación del agente administrado dependerá de factores tales como la edad del paciente, el peso, la altura, el sexo, el estado médico general, el historial médico anterior, etc.

La cantidad eficaz de IFN-\beta dependerá del mamífero y de la dolencia que tenga que ser tratada. En general, resulta deseable proporcionarle al receptor una dosis única comprendida entre aproximadamente 1 x 10^{6} y aproximadamente 90 x 10^{6} Unidades Internacionales (IU), si bien puede administrarse una dosis más baja o más elevada. Preferiblemente, puede administrarse una dosis comprendida entre aproximadamente 1 x 10^{6} y aproximadamente 45 x 10^{6} IU. Los expertos ajustarán la dosificación y las pautas temporales de administración para adaptarlas a los síntomas clínicos de los pacientes. El citado conocimiento ha sido acumulado a lo largo de décadas y se ha publicado en la literatura médica. La composición de IFN-\beta puede ser administrada en solitario o formulada con soportes farmacéuticamente aceptables, ya sea a dosis únicas o múltiples. Como tal, en otra realización de la invención, el IFN-\beta tiene que ser administrado como parte de una composición farmacéutica que comprende un soporte farmacéuticamente aceptable.

Entre los soportes farmacéuticos aceptables se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, diluyentes o materiales de relleno sólidos inertes, soluciones acuosas estériles y diversos disolventes orgánicos no tóxicos. Los soportes farmacéuticamente aceptables deben ser inertes. Además, el soporte no debe reaccionar con, o de algún modo reducir, la eficacia de los ingredientes activos y, más particularmente, no debería reducir de forma significativa la eficacia o la estabilidad del IFN-\beta. Entre los soportes farmacéuticamente aceptables se incluyen agua, etanol, polietilenglicol, aceite mineral, petrolado, propilenglicol, lanolina y agentes similares.

Entre las formas farmacéuticas adecuadas para inyectables se incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril o debe ser fluida hasta el extremo de que exista facilidad de utilización mediante jeringa. Debe resultar también estable en condiciones de fabricación y de almacenamiento y conservada frente a la acción de la contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos.

La composición de IFN-\beta puede ser administrada en solitario o puede ser administrada simultánea o simultáneamente en combinación con cualquier agente farmacéutico, tal como otro agente eficaz frente al sarcoma de Ewing. En esta "terapia combinada", el IFN-\beta puede ser administrado con otras citoquinas y/o agentes para quimioterapia y/o protocolos radioterapéuticos y/o con cirugía. Entre las citadas citoquinas se incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, interleuquina-1, TNF-\alpha, IFN-\alpha, y/o interferón-gamma. Los agentes para quimioterapia representativos son bien conocidos en el estado de la técnica e incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, Doxorrubicina, Actimomicina, Ciclofosfamida (VadriaC), Etoposido, Ifosfamida y Vincristina.

Más particularmente, los autores de la presente invención han demostrado un efecto sinérgico que resulta de un tratamiento asociado de IFN-\beta e Ifosfamida.

Las cantidades de otras citoquinas será similar a las cantidades eficaces de IFN-\beta. Las cantidades eficaces de agentes para quimioterapia variarán en función del agente y son conocidos en el estado de la técnica. Las presentes composiciones pueden ser administradas bien en conjunción con las segundas modalidades de tratamiento o separadamente, por ejemplo, en momentos diferentes o en diferentes jeringas o comprimidos.

Para intentar eliminar el cáncer y algo del tejido que lo rodea, en algunos casos puede utilizarse la cirugía. Para eliminar cualquier tumor que haya permanecido después de aplicación de quimioterapia o de terapia de radiación puede también utilizarse la cirugía. En una realización preferida, la composición de IFN-\beta tiene que ser administrada en combinación con terapia quirúrgica, preferiblemente después de la operación quirúrgica.

Otro aspecto de la presente invención comprende además la administración sustancialmente simultánea o secuencial de una o más citoquinas, derivados de las mismas y/o uno o más agentes para quimioterapia y/o tratamiento simultáneo o secuencial por medio de radioterapia. Por consiguiente, el IFN-\beta puede ser co-administrado con otra citoquina o con otro agente para quimioterapia o cuando la administración de IFN-\beta va precedida o seguida de tratamiento con no IFN-\beta. Cuando tiene lugar la terapia "secuencial", la diferencia de tiempo transcurrido entre la administración de IFN-\beta y el tratamiento con IFN-\beta puede ser de minutos, horas, días, semanas o meses, en función del tumor o del sarcoma que esté siendo tratado, del mamífero que esté siendo tratado y de la eficacia del tratamiento global.

La presente invención está además relacionada con la utilización de IFN-\beta o un fragmento activo, mutante o derivado del mismo, en solitario o conjuntamente con una o más citoquinas y/o agentes para quimioterapia, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes que padecen de sarcoma de Ewing o EOE.

La misma describe también un procedimiento para la preparación de la composición farmacéutica mencionada anteriormente, caracterizado por el mezclado, según procedimientos conocidos, de los ingredientes activos con excipientes aceptables que son farmacéuticamente aceptables.

En la totalidad de los casos mencionados anteriormente, la presente invención se extiende también a la utilización de derivados de IFN-\beta. Por "derivado" se quiere dar a entender formas recombinantes, químicas, u otras formas sintéticas de IFN-\beta u otra citoquina o agente para quimioterapia y/o cualquier alteración tal como adición, sustitución, y/o abandono del componente de secuencia de aminoácido de la molécula, siempre y cuando el derivado posea la capacidad de evitar y/o inhibir el sarcoma de Ewing o el EOE.

La presente invención hace uso de una composición farmacéutica que comprende IFN-\beta y/o sus derivados, en solitario o en combinación con una o más de otras citoquinas y/o sus derivados y/o agentes para quimioterapia y uno o más soportes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

Los autores de la presente invención han establecido también que el IFN-\beta hace de mediador en la apóptosis, a través de la inducción de IRF-1 y de la activación de la caspasa-7.

Estos resultados proporcionan una base para un procedimiento de monitorización de la sensibilidad de las células de sarcoma de Ewing a la apóptosis mediada por IFN-\beta, por medio del seguimiento de la expresión y/o de la activación proteolizada de la caspasa-7. Este procedimiento puede resultar particularmente ventajoso para valorar la sensibilidad de un paciente hacia el tratamiento con IFN-\beta, por ejemplo mediante el análisis de muestras quirúrgicas de tumores de Ewing.

Este análisis de activación de caspasa-7 puede ser llevado a cabo a través de un procedimiento estándar que resulta bien conocido por parte e los expertos en la materia.

Resulta preferido un inmunoensayo de caspasa-7, por medio de un antibiótico dirigido contra esta proteína.

No obstante, se puede también detectar y/o cuantificar, por ejemplo, el mRNA que codifica para esta caspasa.

Habiendo ya descrito la invención a nivel general, la misma será más rápidamente comprendida a través de referencia a los siguientes Ejemplos, los cuales se proporcionan a título de ilustración y no pretenden quedar limitados por medio de la utilización de la presente invención, salvo que así se especifique.

Leyendas de las figuras

La Figura 1 representa el porcentaje de inhibición de crecimiento de líneas celulares tratadas con IFN-\alpha, \beta, o \gamma, a la misma concentración.

La Figura 2 representa el porcentaje de inhibición de crecimiento de células EW-7 tratadas con dosis crecientes de IFN-\alpha, \beta ó \gamma.

La Figura 3 representa el efecto de IFN-\beta sobre el desarrollo de tumor de Ewing, generado por medio de inyección subcutánea de células EW-7 en ratones. Los volúmenes relativos de tumor (RTV) son medidos de una forma que depende del tiempo.

La Figura 4 muestra una gráfica de velocidad de crecimiento de tumores de Ewing, que han crecido en ratones atímicos después de inyección de IFN-\beta. Se representa el valor promedio de los volúmenes relativos de tumor (RTV) de 12 ratones.

La Figura 5 representa el efecto de IFN-\beta sobre tumores de Ewing que han crecido en ratones atímicos. Los volúmenes de los tumores fueron determinados dos veces por semana para cada uno de los grupos y se determinó el volumen medio.

La Figura 6 representa la cuantificación de células apópticas en líneas celulares que proceden de sarcoma de Ewing. Las cuatro líneas celulares ES fueron estimuladas con IFN-\beta. Después de transcurridas 48 y 72 horas se detectaron los núcleos fragmentados utilizando colorante fluorescente Hoechst 33258 sobre células recogidas. Se evaluó la fragmentación nuclear mediante el contaje de células apópticas en la población total de células no tratadas y de células tratadas con IFN, respectivamente. Los porcentajes de células apópticas son los promedios de 3 experimentos independientes, después de dos lecturas por parte de dos experimentadores, para cada una de las cuatro líneas celulares.

La Figura 7 muestra los efectos de IFN-\beta sobre la expresión de la caspasa-1 y la caspasa-7. Células EW-7, EW-1, COH y ORS fueron tratadas por espacio de 18 horas con IFN-\beta. Los extractos celulares totales fueron sometidos a análisis Western blot. La caspasa-1 y la caspasa-7 fueron sucesivamente reveladas con anticuerpos específicos.

La Figura 8 y la Figura 9 muestran los efectos de IFN-\beta sobre tumores de Ewing que han crecido en ratones atímicos después de inyección de IFN-\beta. El valor promedio de los volúmenes relativos de tumor (RTV) de 12 ratones y los volúmenes medios fueron determinados cada tercer día.

Ejemplos Ejemplo 1 Actividad antiproliferativa de \beta-interferón sobre células que proceden de tumores de Ewing. Estudio in vitro

Para determinar sus actividades antiproliferativas sobre 5 líneas celulares, procedentes tanto de tumores primarios de Ewing (antes de cualquier tratamiento: EW-7, COH), o de recidivas metastatizadas (EW-1, ORS, Simon) (Fig.1), se utilizaron interferones \alpha e interferones-\beta (IFNs) (denominados Tipo I) e IFN-\gamma (Tipo II).

La línea EW1 es una línea de sarcoma de la 8ª costilla derecha. La línea procede de una efusión pleural (metástasis) (exón 7 de EW/exón 5 de Fli) (Melot et al., Hybridoma, 1997, Nº 16, página 457).

La línea COH es una línea tumoral de la rodilla con metástasis pulmonar. La línea procede del tumor primario antes de quimioterapia (exón 10 de EW/exón 6 de Fli) (Melot et al., Hybridoma, 1997, 16, página 457).

La línea EW7 es una línea tumoral de la escápula. Esta línea procede del tumor primario antes de quimioterapia (exón 7 de EW/exón 6 de Fli).

La línea ORS es una línea celular que procede de un tumor secundario (metástasis) (Melot et al., Hybridoma, 1997, Nº. 16, página 457).

La línea SIMON es también una línea celular que procede de un tumor secundario (metástasis).

Con independencia de la línea celular utilizada, el tratamiento de 24- ó 48 horas con IFN-\gamma o con IFN-\alpha (400 unidades/ml), da lugar a una baja inhibición del crecimiento celular, 10-25%.

El tratamiento con IFN-\beta (REBIF®, IFN-\beta recombinante glicosilado, a razón de 400 unidades/ml) resulta más eficaz que el tratamiento con IFN-\alpha ó IFN-\gamma, dado que el mismo conduce, después de 24 horas de activación, a una inhibición del crecimiento que es más elevada del 50%, con independencia de la línea celular utilizada, con por ejemplo una inhibición del 70% sobre la línea EW-7 (cf. Figura 1).

Tal y como se muestra en la Figura 2, esta diferencia en la actividad antiproliferativa entre los tres IFNs no depende de la dosis de IFN utilizada. Las células EW-7 son seleccionadas con vistas a medir el efecto antiproliferativo sobre dosis crecientes de IFNs, a partir de 50 unidades/ml y hasta alcanzar las 5.000 unidades/ml. En general, con independencia de la dosis utilizada, la inhibición del crecimiento después de la adición de INF-\beta es mucho mas elevada que el efecto observado después de la adición de IFN-\alpha o IFN-\gamma: entre el 40 y el 80% de inhibición para el IFN-\beta, frente a entre el 6 y 10% y entre el 6 y el 20% para el IFN-\gamma y el IFN-\alpha, respectivamente. Debe destacarse el hecho de que la adición de IFN-\beta, a razón de 500 unidades/ml, proporciona prácticamente la máxima respuesta antiproliferativa.

Los efectos diferenciales observados entre los dos IFNs podrían ser la consecuencia de una diferencia en el mecanismo de activación de genes inducido por los IFNs e implicado en sus efectos antiproliferativos, tales como los genes que codifican para la 2'5'-oligo(A)-sintasa o para el IRF-1 (Factor Regulador de Interferón 1).

Ejemplo 2 Acción antiproliferativa de INF-\beta sobre el crecimiento de tumores de Ewing. Estudio in vivo con ratones atímicos A. Inyección de células malignas

Se generaron tumores sólidos por medio de la inyección subcutánea de 20 x 10^{6} células EW7 (línea celular procedente de tumor de omoplato) a partir de tumor primario, antes de aplicación de quimioterapia ((exón 7 EW/exón 6 Fli) en ratones atímicos de 6 semanas de edad.

Transcurridos 10 días, se constituyeron dos grupos de cinco ratones cada uno de ellos, un grupo de ratones control y un grupo de ratones que recibieron IFN-\beta (REBIF®).

Se aplicaron inyecciones en el propio tumor con 5 x 10^{5} unidades de IFN por ratón, 3 veces por semana. El tratamiento continuó durante un período de 5 semanas, durante el cual se determinaron volúmenes tumorales cada 3 días.

Los volúmenes relativos de tumor (RTV) demostraron un crecimiento tumoral más lento después de la inyección de IFN-\beta. La Figura 3, construida a partir de datos promedio de RTV, muestra un descenso muy agudo en las velocidades de crecimiento después de la inyección de IFN-\beta

Estos resultados, obtenidos a partir de tumores establecidos en la fase de crecimiento experimental, permiten confirmar los resultados in vitro con líneas celulares.

B. Injerto tumoral sólido

Se llevó a cabo un segundo experimento in vivo con ratones atímicos de 8 semanas de edad. Una muestra de tumor de 5 mm de diámetro, procedente de un tumor sólido, se desarrolló en un ratón atímico después de inyección de 20 x 10^{6} células EW7, se conservó mediante transferencia in vivo, y se injertó en ratones atímicos.

Tres días después de la aplicación del injerto, se constituyeron dos grupos de 12 ratones cada uno de ellos, un grupo control recibió inyecciones de solución tampón fosfato (PBS) y un grupo recibió inyecciones de IFN-\beta. 1 x 10^{6} unidades de IFN-\beta fueron inyectadas en puntos tumorales de acuerdo con un régimen de 5 días por semana (de lunes a viernes) durante 1 mes.

Se determinaron las curvas de crecimiento de tumor después de la medición de diámetros de tumores inyectados en cada uno de los ratones, dos veces por semana (Figura 4).

La Figura 4 muestra los gráficos obtenidos a partir de RTV promedios para cada uno de grupos de 12 ratones. Se observó una progresión casi lineal de desarrollo de tumor en los ratones control, mientras que la proliferación de tumores era prácticamente nula en injertos que habían recibido IFN-\beta. Este resultado fue confirmado a través de cálculos promedio para cada uno de los grupos (Figura 5).

Vale la pena destacar que un mes después de la interrupción de la inyección de IFN, el 40% de los ratones que habían recibido IFN-\beta no desarrolló tumores.

A la vista de la anterior descripción obtenida con los ejemplos, los expertos en la materia serán capaces de llevar a la práctica la invención de varias formas y realizaciones sin apartarse del espíritu y del campo de cobertura de la invención, tal y como se define en las reivindicaciones anexas.

Ejemplo 3 Efecto del IFN-\beta sobre la expresión de IRF-1 en sarcoma de Ewing procedente de líneas celulares

Para investigar la expresión y la regulación del gen IRF-1 a través de IFN-\beta, los autores de la invención valoraron la expresión del gen IRF-1 a través de la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). El total de RNAs extraído a las 3,6 y a las 18 horas después del tratamiento con IFN-\beta demostró que el mRNA específico para IRF-1 estaba inducido por IFN-\beta. En células EW-7, el IFN-\beta inducía la expresión del gen IRF-1 de una forma que depende del tiempo, durante un máximo de 6 horas de estimulación. No obstante, después de la estimulación por medio de IFN-\beta, el IRF-1 mRNA resultaba aún detectable a las 18 horas. Para las otras tres líneas celulares ES se obtuvieron resultados similares, pero con diferentes niveles de inducción del gen IRF-1.

Ejemplo 4 La relación entre la expresión de IRF-1 y el IFN-\beta provocó apóptosis en líneas celulares de sarcoma de Ewing

Los autores de la presente invención estaban particularmente interesados en determinar si la estimulación de estas líneas celulares ES por medio de IFN-\beta provocaba apóptosis, y la posible relación entre la apóptosis y la expresión del gen IRF-1. A tal efecto, se evaluó la fragmentación nuclear mediante teñido Hoechst y se cuantificó mediante contaje del número de células apópticas en la población total de células no tratadas o de células tratadas con IFN-\beta durante 48 o 72 horas (Figura 6). Las células EW-7 y COH mostraron un incremento dependiente del tiempo en las células apópticas después del tratamiento con IFN-\beta, mientras que las células EW-1 y ORS no sufrieron apóptosis significativa durante cualquier período de tratamiento. Se analizaron las diferencias en la sensibilidad de las cuatro líneas celulares ES a la apóptosis dependiente de IFN-\beta y la correlación entre los niveles de proteínas p21^{WAF-1/Cip-1}y Bcl-2, por medio de análisis de inmunotransferencia después de tratamiento con IFN-\beta. La infra-regulación del total de proteína celular Bcl-2 estaba relacionada con la sobre-regulación de p21^{WAF-1/Cip-1} y la expresión de IRF-1 en las células EW-1 o ORS, a la vez que no se observaba cambio alguno en la expresión de la proteína Bcl-2 en las células EW-1 o en las células ORS.. La proteína p21^{WAF-1/Cip-1} no resultaba detectable en las células EW-1 o en las células ORS, hayan sido las mismas tratadas o no con IFNs.

Debido a que se ha demostrado que la inducción de apóptosis por parte de las citoquinas conlleva la expresión de genes caspasa, los autores de la invención exploraron el posible refuerzo de la expresión del gen caspasa en líneas celulares ES por parte de IFN-\beta. A tal efecto, se llevaron a cabo ensayos de protección de RNasa para la familia de caspasa, utilizando el equipo hApol (Pharmingen), después de estimulación de células ES con IFN-\beta por espacio de 18 horas. La expresión de caspasa-7 mRNA se incrementó de forma significativa en las células EW-7 estimuladas con IFN-\beta y, en menor medida, el nivel de mRNA de la caspasa-3 y -8; y los niveles de mRNA de las caspasas-1, -6 y -9 permanecieron sin modificar. En las células COH se observaron resultados similares. En células EW-1 y ORS, los niveles de mRNA de las caspasas permanecieron sin modificar.

A la vista de los resultados de protección de RNasa, los autores investigaron la posibilidad de que el IFN-\beta refuerce la proteolisis, conduciendo a la formación de subunidades de caspasa activas. La caspasa-1 20 kDa proteolizada fue revelada en primer lugar después de sondeo con anticuerpos, frente a la forma activa de caspasa-1. Una vez limpiada la mancha, las formas de 33 kDa y de 18 kDa de la caspasa-7 fueron detectadas con anticuerpos específicos frente a caspasa-7 (los cuales eran anticuerpos de ratón purificados, obtenidos de Pharmigen (Becton Dickinson)). Los análisis de inmunotransferencia con anticuerpos frente a caspasa-7 revelaron que el IFN-\beta no tan solo incrementaba la cantidad de proteína procaspasa-7, sino que también generaban la subunidad activa proteolizada de 18 kDa (figura 7). Estos procedimientos fueron tan solo observados en células EW-7 naturales de tipo p53 y en células tumorales COH. Se observó también un incremento en la subunidad caspasa-1 20 kDa en células EW-7 y COH, después de tratamiento con IFN-\alpha o IFN-\beta, pero no resultaba detectable en células EW-1 ó en células ORS (Figura 7). Tanto el incremento en la expresión del gen de caspasa-7 como la rotura de pro-caspasa-7 después de tratamiento con IFN-\beta, sugieren que en las células que proceden de sarcoma de Ewing, el IFN-\beta desencadena la muerte celular mediante la sobre-regulación selectiva de la caspasa-7 activada.

Ejemplo 5 Expresión eptópica de IRF-1

Para demostrar el papel de IRF-1 en apóptosis en células de sarcoma de Ewing, los autores de la invención intentaron generar células que expresaran IRF-1. Las líneas celulares ES que expresan IRF-1 de forma constitutiva han resultado difíciles de establecer debido a los potentes efectos citotóxicos del IRF-1 endógeno. Así pues, para determinar si la inducción de IRF-1 reforzaba la muerte de las células de tumor de Ewing, las cuales son normalmente resistentes a la muerte celular mediada por IFN-\beta, se utilizó una forma inducible de IRF-1. Como consecuencia, se utilizó un sistema inducible por tetraciclina, utilizando el activador tTA inverso (rTA) que permite la expresión, inducible por doxiciclina (Dox) de IRF-1 (Nguyen, H. Et al., Oncogene, 15: 1425-1435 (1997)). Lones celulares procedentes de rtTA-IRF-1 de las cuatro líneas celulares ES fueron expandidas de forma individual y cribadas para determinar la expresión de IRF-1 a través de análisis Western blot, seguido de un período de 48 horas de crecimiento en medio, con o sin Dox. La estimulación con Dox condujo a la inducción de la proteína IRF-1 en las cuatro líneas celulares ES-TA/IRF-1, pero no en las líneas celulares rtTA control. Para determinar si la inducción de IRF-1 estaba asociada con la fragmentación nuclear, las células fueron teñidas con colorante fluorescente Hoechst, después de tratamiento Dox de las células transfectadas durante un período de 24 o 48 horas. La totalidad de líneas celulares ES-TA/IRF-1, con independencia de sus estatus p53, sufrió apóptosis en función del tiempo después de estimulación mediante Dox. Entre el 40 y el 50% de las células apópticas fueron detectadas después de la estimulación. El análisis Western blot de los extractos totales de células ES-TA/IRF-1 mostraba una correlación entre la inducción mediante Dox y la sobre-regulación de p21^{WAF-1/Cip-1}, con infra-regulación concomitante de la proteína Bcl 2. Se observó también un nivel creciente de la subunidad caspasa-7 activa proteolizada en las cuatro líneas celulares ES-TA/IRF-1 tratadas con Dox, por espacio de 48 horas, pero no en las líneas celulares control rtTA. Considerados globalmente, estos resultados sugieren que las caspasa-7 está involucrada en la apóptosis mediada por IRF-1, en las células de sarcoma de Ewing.

Ejemplo 6 Actividad antitumoral de IFN-\beta sobre el tumor de Ewing. Estudio en ratones atímicos

La intención del experimento era estudiar el efecto del IFN-\beta sobre el desarrollo (crecimiento) de un tumor de Ewing existente.

Una muestra de tumor de 5 mm de diámetro, procedente de un tumor sólido, se desarrolló en ratones atímicos después de inyección de 20 x 10^{6} células EW-7 y se conservó por medio de transferencia in vivo, siendo injertada en ratones atímicos de 8 semanas de edad. Transcurridas 3 semanas, los ratones, los cuales habían desarrollado un tumor de entre aproximadamente 100 y 200 mm^{3}, fueron divididos en dos grupos "aleatorios" de 12 ratones, recibiendo el primer grupo PBS como control y el segundo IFN-\beta (REBIF®).

Se inyectó IFN-\beta en el interior de la propia masa tumoral, a una dosis de 8 x 10^{5} unidades por ratón, 5 veces por semana (de lunes a viernes). Se continuó con la aplicación de la dosis por espacio de 5 semanas, durante las cuales los tumores fueron medidos cada tercer día.

Los volúmenes relativos (RTV) y los diámetros tumorales promedio definidos revelaron un descenso muy marcado del desarrollo del tumor (Figura 8 y Figura 9).

Este experimento sobre tumores existentes en su fase de crecimiento exponencial mostraba claramente que el IFN-\beta presenta un efecto antitumoral sobre el tumor de Ewing.

Ejemplo 7 Efecto de la asociación quimioterapia/INF-\beta sobre el crecimiento de tumores de Ewing en ratones atímicos

Se investigó el efecto de un tratamiento por quimioterapia con isofosfamida, asociado con tratamiento con IFN-\beta, sobre el crecimiento de un tumor de Ewing existente, por medio de la administración a los ratones de 60 mg/kg de peso corporal de Ifosfamida durante 3 días, conjuntamente con la administración intratumoral de 100.000 U/día de IFN-\beta, seguida IFN-\beta en solitario, cinco veces por semana.

El crecimiento del tumor de Ewing resultó inhibido con estos tratamientos asociados, mientras el tamaño de este tumor permanecía estable.

Además, los autores han evidenciado que los tratamientos asociados presentan un efecto sinérgico, dado que la citada acción es mucho más elevada que la que resulta de la administración de IFN-\beta y de Ifosfamida independiente.

Claims (14)

1. Utilización de interferón-beta para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del sarcoma de Ewing o de EOE.

2. Utilización según la reivindicación 1, para el tratamiento del sarcoma de Ewing.

3. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho interferón-beta es interferón-beta 1a.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho interferón-beta es interferón-beta recombinante.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho interferón-beta está glicosilado.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho interferón-beta está destinado a ser administrado por vía oral o parenteral.

7. Utilización según la reivindicación 6, en el que la citada administración parenteral se efectúa a través de administración intramuscular, intravenosa, subcutánea o percutánea.

8. Utilización según la reivindicación 6, en el que el citado interferón-beta tiene que ser administrado a través de inyección sistémica o directa al tumor.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el citado interferón-beta está destinado a ser administrado en una cantidad eficaz, comprendida entre aproximadamente 1 y aproximadamente 90 millones de Unidades Internacionales, preferiblemente comprendida entre aproximadamente 1 y aproximadamente 45 millones de Unidades Internacionales.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el citado interferón-beta está destinado a ser administrado de forma simultánea o secuencial, conjuntamente con uno o más agentes utilizados en el tratamiento de la familia de tumores de Ewing.

11. Utilización según la reivindicación 10, en el que el agente es Ifosfamida.

12. Procedimiento in vitro para monitorizar la sensibilidad de las células de sarcoma de Ewing frente a la apoptosis mediada por IFN-\beta, en el que se evalúa la expresión y/o la activación de la caspasa-7, resultando dicha expresión y/o activación indicativa de la sensibilidad de las células de sarcoma de Ewing a la apoptosis mediada por IFN-\beta.

13. Procedimiento de la reivindicación 12, en el que la citada expresión y/o activación es evaluada por medio de un inmunoensayo de caspasa-7

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, en el que dichas células de sarcoma de Ewing proceden de una muestra quirúrgica de tumores de Ewing.