ES2234605T3 - Utilizacion de beta-interferon en la fabricacion de un medicamento destinado al tratamiento del sarcoma de ewing y eoe. - Google Patents
Utilizacion de beta-interferon en la fabricacion de un medicamento destinado al tratamiento del sarcoma de ewing y eoe.Info
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Abstract
Utilización de interferón-beta para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del sarcoma de Ewing o de EOE.
Description
Utilización de beta-interferón en
la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del
sarcoma de Ewing y EOE.
La invención está relacionada con el uso de
interferón-beta para el tratamiento de tumores óseos
de Ewing en mamíferos.
La familia de tumores de Ewing representa el
segundo tipo de tumores óseos más común observado en niños después
del osteosarcoma. La familia incluye el sarcoma de Ewing (EWS o
tumor óseo de Ewing), tumores extraóseos de Ewing (EOE), tumores
neuroectodérmicos primitivos (PNET o neuroepitelioma periférico) y
tumores de Askin (PNET de la pared torácica). Estos tumores son
enfermedades raras, en las que las células malignas se encuentran en
el hueso y en los tejidos blandos y protocolos recientes utilizan el
mismo tratamiento para esta familia de tumores. El EWS es
mayoritariamente observado en adolescentes y en adultos jóvenes y
los puntos más habituales de localización para la lesión primaria
son los huesos pélvicos, el fémur, el húmero y las costillas. La
incidencia del sarcoma de Ewing se estima en torno a aproximadamente
el 60% de entre la familia de tumores de Ewing.
Estudios llevados a cabo utilizando marcadores
inmunohistoquímicos, citogenética, genética molecular y cultivos
tisulares indican que estos tumores proceden todos ellos de la misma
célula madre primordial. Estudios citogenéticos llevados a cabo en
relación con la familia de tumores de Ewing han identificado una
alteración consistente de la localización del EWS sobre la banda q12
del cromosoma 22, la cual involucra también a otros cromosomas,
incluyendo el 11 ó el 21. De forma característica, la terminación
amino del gen del EWS está yuxtapuesta con el grupo carboxi terminal
de otro cromosoma. En la mayor parte de los casos (90%), esta
translocación cromosómica dirige la fusión de la terminación 5' del
gen del EWS, codificando para una proteína que es capaz de
participar en el metabolismo del RNA, con la terminación 3' del gen
Fli-1, un componente de la familia del factor de
transcripción Ets localizada sobre la banda q24 del cromosoma 11
(Delattre et al., Nature 359: 162-165
(1992)). En función de los puntos de rotura, pueden generarse
diversos genes de fusión (entre los exones 7 y 11 del EWS y los
exones 3 a 9 de Flui-1).
La fusión más habitual,
EWS-Fli-1 de tipo I, fusiona el exón
7 del EWS con el exón Fli-1 del exón 6 y representa
el 50% de los casos. La fusión de tipo II (25% de los casos) une el
exón 7 del EWS con el exón 5 de Fli-1. Además de
estos dos tipos de fusión principal, se han descrito aproximadamente
otras 10 combinaciones.
En determinados casos de tumor de Ewing, el EWS
no está fusionado con Fli-1 sino con otro componente
de la familia Ets, por ejemplo FEV. Otros componentes de la familia
Ets que pueden combinarse con el gen del EWS son el ERG (localizado
sobre el cromosoma 21), el ETV (localizado sobre el cromosoma 7) y
el E_{1}AF (localizado sobre el cromosoma 17), los cuales dan
lugar a las siguientes translocaciones: t (21,22); t(7,22) y
t(17,22), respectivamente.
Estas alteraciones genéticas permiten obtener una
consecuencia bioquímica constante: Las células Ewing siempre
expresan una proteína quimérica que soporta la región
N-terminal del EWS fusionado con un dominio de unión
DNA de la familia de la proteína Ets. Esta constancia sugiere que
esta fusión desempeña un papel central en el desarrollo del tumor de
Ewing.
En el sarcoma de Ewing, se ha demostrado, de
forma experimental, el papel de la proteína de fusión
EWS/Fli-1. Esta proteína puede transformar
fibroblastos de ratones y estas células son capaces de generar
tumores en ratones atímicos.
A partir de experimentos in vitro, se ha
demostrado que la proteína EWS/Fli-1 era capaz de
activar determinada transcripción genética de una forma más eficaz
que el Fli-1. Este hecho sugiere que la fusión de
proteínas EWS/Fli-1 ejerce sus acciones oncógenas a
través de la activación anormal de determinados genes celulares.
Se ha demostrado también que la proteína
PU-1, procedente también de la familia Ets, está
implicada en el control de la expresión genética regulada por
interferón y por citoquinas (Pérez et al., Mol. Cell Biol.
14: 5023-5031 (1994)).
Entre los importantes factores prognósticos para
la familia de tumores de Ewing se incluyen el punto y el volumen del
tumor primario y si la enfermedad es metastásica. Se considera que
el tamaño del tumor constituye también una variable importante. Con
el actual tratamiento, los estudios sugieren que entre el 50 y el
70% de los pacientes sin metástasis presentan una supervivencia
exenta de enfermedad a largo plazo, en comparación con tan solo
entre el 20 y el 30% que corresponde a los pacientes que presentan
metástasis. Por tanto, existe una acusada necesidad de disponer en
la técnica que un procedimiento eficaz para el tratamiento de
tumores de la familia Ewing.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona una camino eficaz para el tratamiento del sarcoma de
Ewing y del EOE en un mamífero. Otras características y ventajeas de
la presente invención serán expuestas en la detallada descripción de
las realizaciones preferidas que sigue a continuación, y en parte
resultarán evidentes a partir de la descripción o pueden ser
conocidas a través de la práctica de la invención. Estas ventajas de
la invención serán entendidas y comprendidas por medio de las
composiciones y usos particularmente señalados en la descripción y
en las reivindicaciones de la misma.
Rosolen et al. (Modern Pathology, 1997,
10:55-61) informaron acerca de que el tratamiento de
una línea celular procedente de sarcoma de Ewing con
interferón-alfa induce la inhibición del crecimiento
celular in vitro.
Los autores de la presente invención han
demostrado ahora que el interferón beta
(IFN-\beta) que se une al mismo receptor que el
interferón-alfa (INF-\alpha), pero
acerca del cual se sabe que ejerce distintas actividades (Runkel
et al., 1998, The Journal of Biological Chemistry,
14:8003-8008), muestra una acción antiproliferativa
sobre el sarcoma de Ewing.
Dichos autores han demostrado, particularmente,
que la acción antiproliferativa del INF-\beta
sobre las células que proceden del sarcoma de Ewing in vitro
era marcadamente superior a la del INF-\alpha.
Por consiguiente, una realización de la presente
invención va dirigida al uso de interferón-beta para
la preparación de un medicamento para el tratamiento del sarcoma de
Ewing y del EOE. Al mamífero que precisa de este tratamiento tiene
que administrársele una cantidad terapéuticamente eficaz de
INF-\beta. A tal efecto, se proporciona una
composición adecuada para administración a un mamífero, para el
tratamiento del sarcoma de Ewing, que comprende
IFN-\beta en una cantidad terapéuticamente eficaz,
conjuntamente con un soporte farmacéuticamente aceptable.
Debe darse por entendido que tanto la descripción
general precedente como la siguiente descripción detallada se dan a
título de ejemplo y explicación y pretenden tan solo proporcionar
una nueva explicación de la invención, tal y como se reivindica.
Salvo que se defina lo contrario, la totalidad de
términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento
pretenden tener el mismo significado que el que es habitualmente
aceptado por un experto en la materia en el correspondiente
campo.
Tal y como se utiliza en el presente documento,
el término "familia de tumores de Ewing" significa un tipo de
tumor encontrado en hueso y tejidos blandos, caracterizado por
pequeñas células redondas y asociado con una alteración de la
localización del EWS en el cromosoma 22. La familia de tumores
incluye el sarcoma de Ewing (tumor de hueso de Ewing o ETB), tumores
de Ewing extraóseos (EOE), tumores neuroectodérmicos primitivos
periféricos (PNET o neuroepitelioma periférico) y tumores de Askin
(PNET de la pared torácica).
Las células individuales de sarcoma de Ewing y
EOE contienen núcleos entre redondos y ovalados con cromatina
finamente dispersada, sin nucleolos. Ocasionalmente, se encuentran
presentes células con núcleos más pequeños, más hipercromáticos (y
probablemente degenerativos), proporcionando un patrón de "células
claras-células oscuras". El citoplasma varía en
cantidad, pero en el caso clásico, resulta claro que el mismo
contiene glicógeno, el cual puede ser resaltado con un colorante
ácido periódico de Schiff (PAS). Las células tumorales están
estrechamente agrupadas en un patrón difuso sin evidencia de
organización estructural.
El aspecto histológico del PNET difiere algo del
sarcoma de Ewing y del EOE. Estos tumores están habitualmente
compuestos por células hipercromáticas entre redondas y ovaladas,
con un citoplasma mínimo. Las células tumorales están habitualmente
dispuestas en grupos y trabéculas con una formación en roseta
variable. Las rosetas pueden tener una luz central, pero son a
menudo definidas por la enfermedad, estando compuestas de células
tumorales dispuestas alrededor de un espacio vacío. El patrón de
crecimiento lobular clásico se aprecia mejor a baja potencia, y
difiere del crecimiento difuso habitual observado en EOE.
Ocasionalmente, se observan grupos de células redondas,
citológicamente uniformes, con cromatina dispersa que se asemejan a
los del EOE, dispersadas en un, por otra parte habitual, PNET. Este
solapamiento de características otorga seguridad al concepto según
el cual estos tumores son en realidad el mismo tumor, con un
espectro de diferenciación.
Tal y como se utiliza en el presente documento,
el término "mamífero" indica cualquier especie de mamífero e
incluye, sin que ello suponga ninguna limitación, conejos, ratones,
perros, gatos, primates y humanos, preferiblemente humanos. Tal y
como se utiliza en el presente documento, el término
"tratamiento" se refiere a cualquier procedimiento, acción,
aplicación, terapia o similar, en el que un mamífero, incluyendo un
ser humano, es sometido a una ayuda médica con el objeto de mejorar
la dolencia del mamífero, de forma directa o indirecta. En el
contexto de crecimiento tumoral o de crecimiento de célula tumoral,
el término "tratamiento" incluye, sin que ello suponga ninguna
limitación, la inhibición y la prevención.
Tal y como se utiliza en el presente documento,
el término "inhibición" puede ser valorado a través de la
aparición retardada de tumores primarios y secundarios, desarrollo
enlentecido de tumores primarios o secundarios, ocurrencia retrasada
de tumores primarios o secundarios, gravedad retardada o reducida de
efectos secundarios de la enfermedad, crecimiento tumoral detenido y
regresión de tumores, entre otros aspectos. En sentido extremo, la
inhibición completa se indica aquí como prevención.
Tal y como se utiliza en el presente documento,
el termino "prevención" significa que no ha tenido lugar ningún
tipo de crecimiento tumoral o de crecimiento de células tumorales,
si no había tenido lugar ninguno anteriormente, y que no ha tenido
tampoco lugar ningún tipo de nuevo crecimiento tumoral o de células
tumorales, si había tenido lugar alguno anteriormente.
Tal y como se utiliza en el presente documento,
el término "tratamiento terapéutico" indica tratamiento de un
sujeto una vez contraída una enfermedad, e incluye la terapia
profiláctica.
Tal y como se utiliza en el presente documento,
el término "cantidad eficaz" significa una cantidad eficaz para
llevar a cabo la función especificada. Una "cantidad
terapéuticamente eficaz" en relación con el tratamiento de un
tumor, se refiere a una cantidad que resulta suficiente para
proporcionar uno o más de los siguientes resultados: reducir el
tamaño del tumor, inhibir la metástasis del tumor, inhibir el
crecimiento del tumor, prevenir el crecimiento del tumor, aliviar la
incomodidad debida al tumor o prolongar la vida de un paciente
afectado por el tumor.
Tal y como se utiliza en el presente documento,
el término "interferón" significa la familia de proteínas
citoquina y de glicoproteínas altamente homólogas, acerca de las
cuales se sabe que presentan diversas actividades biológicas, tales
como actividad antivírica, antiproliferativa e inmunomoduladora, al
menos en la especie animal a partir de la cual se obtienen las
citadas sustancias.
Actualmente, los interferones son categorizados
en cinco diferentes tipos; IFN alfa (IFN leucocito), IFN beta (IFN
fibroblasto), IFN gamma (IFN inmune), IFN omega e IFN tau (factor
trofoblástico). Para una revisión de los detalles y de la homología
de las relaciones de las proteínas IFN conocidas, ver, por ejemplo,
Viscomi, Biotherapy 10: 59-86 (1997).
Tal y como se utiliza en el presente documento,
los términos "interferón-beta" e
"IFN-\beta" incluyen la totalidad de
proteínas, polipéptidos y péptidos que son
INF-\betas de origen natural o recombinantes o
derivados de los mismos, y que se caracterizan por la actividad
biológica de aquellos IFN-\betas frente a
enfermedades malignas, no malignas o víricas. Entre las mismas se
incluyen compuestos de tipo IFN-\betas de origen
natural (humano y no humano) e IFN-\betas
recombinantes e INF-\betas sintéticos o
semi-sintéticos.
Tal y como se utiliza en el presente documento,
el término "interferón-beta recombinante" se
refiere a IFN-\beta obtenido por medio de técnicas
de DNA recombinante, a saber, obtenido a partir de células
transformadas a través de construcciones de DNA exógenas, que
codifican para el polipéptido IFN-\beta
deseado.
Tal y como se utiliza en el presente documento,
el término "Unidad Internacional" significa la unidad de
potencia establecida internacionalmente para la medición de IFN, tal
y como se definió en la International Conference for Unification of
Formulae y como se reconoce por parte de los expertos en la
materia.
Tal y como se utiliza en el presente documento,
el término "soporte farmacéuticamente aceptable" se refiere a
un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se
administra el producto terapéutico. El mismo incluye cualquier tipo
de disolventes, medios de dispersión, soluciones acuosas,
revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes
retardantes de la absorción e isotónicos y similares. La utilización
de los citados medios y agentes para sustancias activas
farmacéuticas es bien conocido en el estado de la técnica. Con la
excepción de cualquier medio o agente convencional resulte
incompatible con el ingrediente activo, se contempla la utilización
de los mismos en composiciones farmacéuticas. A las composiciones de
la invención se les puede incorporar ingredientes activos
suplementarios. Se dice que una composición es "farmacéuticamente
aceptable" si su administración puede ser tolerada por un
paciente receptor.
Tal y como se utiliza en el presente documento,
"simultánea o secuencial" significa que el
IFN-\beta se administra conjuntamente con otra
citoquina o agente para quimioterapia o conjuntamente con
radioterapia o cirugía o cuando la administración de
IFN-\beta va precedida o seguida de no tratamiento
con IFN-\beta. Cuando tiene lugar la terapia
"secuencial", la diferencia temporal entre la administración de
IFN-\beta y el no tratamiento con
INF-\beta puede tener una duración de minutos,
horas, días, semanas o meses, en función del tumor o del sarcoma que
esté siendo tratado, del mamífero que esté siendo tratado y de la
eficacia del tratamiento global.
El término "sustancialmente simultánea"
significa "a aproximadamente el mismo tiempo", siendo la única
limitación la de que ambas sustancias tienen que encontrarse
presentes en el punto del tumor.
Según la presente invención, se ha descubierto
que el IFN-\beta puede inhibir y/o evitar, de
forma significativa, el crecimiento del tumor en el sarcoma de
Ewing.
En una realización preferida, el
IFN-\beta es IFN-\beta
recombinante. Por ejemplo, IFN-\beta1a, (tal como
el comercializado como REBIF® por Ares Serono o AVONEX® por Biogen,
los cuales son IFNs recombinantes glicosilados obtenidos en células
de mamífero o puede utilizarse IFN-\beta1b (tal
como el comercializado bajo la marca BETASERON® de Schering AG o
BETAFERON® de Berlex/Chiron). Más preferiblemente, se utiliza
IFN-\beta1a recombinante glicosilado.
En la presente invención puede utilizarse un
IFN-\beta natural extraído, al igual que uno
comercializado bajo la marca FRONE® por Ares-Serono.
El IFN-\beta humano natural puede ser purificado a
partir de diversas fuentes celulares, incluyendo leucocitos aislados
a partir de sangre completa, fibroblastos neonatales,
linfoblastoides y diversas líneas celulares leucémicas. El
IFN-\beta puede ser también un extracto de
mamífero, tal como un rumiante o IFN-\beta bovino.
Como tal, el IFN-\beta utilizado puede ser
"homólogo" para el mamífero que tiene que ser tratado,
significando que el mismo tiene el mismo origen que el de las
especies de mamíferos que tienen que ser tratadas (por ejemplo,
IFN-\beta humano para el tratamiento de un humano
o IFN-\beta murino para el tratamiento de un
ratón) o puede ser "heterólogo" para el mamífero que tiene que
ser tratado, significando que el origen de la especie de
IFN-\beta y la especie de mamífero son diferentes
(por ejemplo, IFN-\beta humano para el tratamiento
de un ratón o IFN-\beta murino para el tratamiento
de un humano).
El IFN-\beta utilizado en la
invención incluye también, por ejemplo, secuencias conocidas y
aquellas variantes cuyos genes se caracterizan por un elevado grado
de homología con la secuencia conocida y las cuales codifican para
IFN-\beta biológicamente activo y compuestos que
tienen sustancialmente la misma actividad biológica que la de las
formas conocidas de IFN-\beta. El
IFN-\beta puede contener también sencillas o
múltiples inserciones de aminoácidos, abandonos y/o adiciones a la
secuencia de origen natural y puede ser fragmentado a una parte que
soporta el punto activo de
IFN-\beta.
IFN-\beta.
En general, cualquier molécula
IFN-\beta es abarcada por la presente invención e
incluida en la expresión "IFN-\beta", siempre
y cuando la totalidad de las moléculas tengan el efecto de evitar o
reducir el tamaño del sarcoma de Ewing o el EOE in vitro, en
animal de experimentación en laboratorio in vivo o en un
mamífero que tenga que ser tratado.
La presente invención se ejemplifica a través del
efecto del IFN-\beta frente a los tumores de
sarcoma de Ewing en ratones. No obstante, debe darse por entendido
que la presente invención se extiende a los efectos in vivo
del IFN-\beta en todos los mamíferos, tales como
los humanos, al sarcoma de Ewing o EOE. En una realización
preferida, el mamífero es humano. Entre los ejemplos de mamíferos no
humanos se incluyen el ganado animal, tal como vacas, cerdos,
ovejas, caballos, cabras, animales de compañía tales como gatos y
perros, y animales de experimentación en laboratorio, tales como
ratones, concejos, cobayos y hámsteres.
Según la presente invención, el
IFN-\beta puede ser administrado a través de
cualquier ruta que resulte adecuada, tal como la oral o la
parenteral, a saber, cualquier ruta diferente a la del canal
alimentario. En una realización preferida, la administración
parenteral se produce a través de vía intravenosa (dentro o hacia
una vena), intramuscular (dentro de un músculo), subcutánea
(introducida debajo de la piel o percutánea (efectuada a través de
la piel. Se prefiere una inyección sistémica, en la que el
IFN-\beta penetra en la corriente sanguínea, pero
también puede utilizarse ventajosamente una inyección directa en el
propio tumor.
La administración puede ser efectuada en forma de
dosis única o de dosis repetidas, una o más veces después de un
determinado período. Cuando el IFN-\beta se
administra por medio de inyección, la administración puede ser
efectuada por medio de inyecciones continuas o a través de un único
o múltiples bolus. Los modos de administración y la posología puede
ser determinada por parte de los expertos en la materia según
criterios generalmente considerados para un tratamiento terapéutico
adaptado a un paciente. Como tal, la dosificación del agente
administrado dependerá de factores tales como la edad del paciente,
el peso, la altura, el sexo, el estado médico general, el historial
médico anterior, etc.
La cantidad eficaz de IFN-\beta
dependerá del mamífero y de la dolencia que tenga que ser tratada.
En general, resulta deseable proporcionarle al receptor una dosis
única comprendida entre aproximadamente 1 x 10^{6} y
aproximadamente 90 x 10^{6} Unidades Internacionales (IU), si bien
puede administrarse una dosis más baja o más elevada.
Preferiblemente, puede administrarse una dosis comprendida entre
aproximadamente 1 x 10^{6} y aproximadamente 45 x 10^{6} IU. Los
expertos ajustarán la dosificación y las pautas temporales de
administración para adaptarlas a los síntomas clínicos de los
pacientes. El citado conocimiento ha sido acumulado a lo largo de
décadas y se ha publicado en la literatura médica. La composición de
IFN-\beta puede ser administrada en solitario o
formulada con soportes farmacéuticamente aceptables, ya sea a dosis
únicas o múltiples. Como tal, en otra realización de la invención,
el IFN-\beta tiene que ser administrado como parte
de una composición farmacéutica que comprende un soporte
farmacéuticamente aceptable.
Entre los soportes farmacéuticos aceptables se
incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación, diluyentes o
materiales de relleno sólidos inertes, soluciones acuosas estériles
y diversos disolventes orgánicos no tóxicos. Los soportes
farmacéuticamente aceptables deben ser inertes. Además, el soporte
no debe reaccionar con, o de algún modo reducir, la eficacia de los
ingredientes activos y, más particularmente, no debería reducir de
forma significativa la eficacia o la estabilidad del
IFN-\beta. Entre los soportes farmacéuticamente
aceptables se incluyen agua, etanol, polietilenglicol, aceite
mineral, petrolado, propilenglicol, lanolina y agentes
similares.
Entre las formas farmacéuticas adecuadas para
inyectables se incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son
solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para preparación
extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En
todos los casos, la forma debe ser estéril o debe ser fluida hasta
el extremo de que exista facilidad de utilización mediante jeringa.
Debe resultar también estable en condiciones de fabricación y de
almacenamiento y conservada frente a la acción de la contaminación
de microorganismos tales como bacterias y hongos.
La composición de IFN-\beta
puede ser administrada en solitario o puede ser administrada
simultánea o simultáneamente en combinación con cualquier agente
farmacéutico, tal como otro agente eficaz frente al sarcoma de
Ewing. En esta "terapia combinada", el
IFN-\beta puede ser administrado con otras
citoquinas y/o agentes para quimioterapia y/o protocolos
radioterapéuticos y/o con cirugía. Entre las citadas citoquinas se
incluyen, sin que ello suponga ninguna limitación,
interleuquina-1, TNF-\alpha,
IFN-\alpha, y/o interferón-gamma.
Los agentes para quimioterapia representativos son bien conocidos en
el estado de la técnica e incluyen, sin que ello suponga ninguna
limitación, Doxorrubicina, Actimomicina, Ciclofosfamida (VadriaC),
Etoposido, Ifosfamida y Vincristina.
Más particularmente, los autores de la presente
invención han demostrado un efecto sinérgico que resulta de un
tratamiento asociado de IFN-\beta e
Ifosfamida.
Las cantidades de otras citoquinas será similar a
las cantidades eficaces de IFN-\beta. Las
cantidades eficaces de agentes para quimioterapia variarán en
función del agente y son conocidos en el estado de la técnica. Las
presentes composiciones pueden ser administradas bien en conjunción
con las segundas modalidades de tratamiento o separadamente, por
ejemplo, en momentos diferentes o en diferentes jeringas o
comprimidos.
Para intentar eliminar el cáncer y algo del
tejido que lo rodea, en algunos casos puede utilizarse la cirugía.
Para eliminar cualquier tumor que haya permanecido después de
aplicación de quimioterapia o de terapia de radiación puede también
utilizarse la cirugía. En una realización preferida, la composición
de IFN-\beta tiene que ser administrada en
combinación con terapia quirúrgica, preferiblemente después de la
operación quirúrgica.
Otro aspecto de la presente invención comprende
además la administración sustancialmente simultánea o secuencial de
una o más citoquinas, derivados de las mismas y/o uno o más agentes
para quimioterapia y/o tratamiento simultáneo o secuencial por medio
de radioterapia. Por consiguiente, el IFN-\beta
puede ser co-administrado con otra citoquina o con
otro agente para quimioterapia o cuando la administración de
IFN-\beta va precedida o seguida de tratamiento
con no IFN-\beta. Cuando tiene lugar la terapia
"secuencial", la diferencia de tiempo transcurrido entre la
administración de IFN-\beta y el tratamiento con
IFN-\beta puede ser de minutos, horas, días,
semanas o meses, en función del tumor o del sarcoma que esté siendo
tratado, del mamífero que esté siendo tratado y de la eficacia del
tratamiento global.
La presente invención está además relacionada con
la utilización de IFN-\beta o un fragmento activo,
mutante o derivado del mismo, en solitario o conjuntamente con una o
más citoquinas y/o agentes para quimioterapia, en la fabricación de
un medicamento para el tratamiento de pacientes que padecen de
sarcoma de Ewing o EOE.
La misma describe también un procedimiento para
la preparación de la composición farmacéutica mencionada
anteriormente, caracterizado por el mezclado, según procedimientos
conocidos, de los ingredientes activos con excipientes aceptables
que son farmacéuticamente aceptables.
En la totalidad de los casos mencionados
anteriormente, la presente invención se extiende también a la
utilización de derivados de IFN-\beta. Por
"derivado" se quiere dar a entender formas recombinantes,
químicas, u otras formas sintéticas de IFN-\beta u
otra citoquina o agente para quimioterapia y/o cualquier alteración
tal como adición, sustitución, y/o abandono del componente de
secuencia de aminoácido de la molécula, siempre y cuando el derivado
posea la capacidad de evitar y/o inhibir el sarcoma de Ewing o el
EOE.
La presente invención hace uso de una composición
farmacéutica que comprende IFN-\beta y/o sus
derivados, en solitario o en combinación con una o más de otras
citoquinas y/o sus derivados y/o agentes para quimioterapia y uno o
más soportes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Los autores de la presente invención han
establecido también que el IFN-\beta hace de
mediador en la apóptosis, a través de la inducción de
IRF-1 y de la activación de la
caspasa-7.
Estos resultados proporcionan una base para un
procedimiento de monitorización de la sensibilidad de las células de
sarcoma de Ewing a la apóptosis mediada por
IFN-\beta, por medio del seguimiento de la
expresión y/o de la activación proteolizada de la
caspasa-7. Este procedimiento puede resultar
particularmente ventajoso para valorar la sensibilidad de un
paciente hacia el tratamiento con IFN-\beta, por
ejemplo mediante el análisis de muestras quirúrgicas de tumores de
Ewing.
Este análisis de activación de
caspasa-7 puede ser llevado a cabo a través de un
procedimiento estándar que resulta bien conocido por parte e los
expertos en la materia.
Resulta preferido un inmunoensayo de
caspasa-7, por medio de un antibiótico dirigido
contra esta proteína.
No obstante, se puede también detectar y/o
cuantificar, por ejemplo, el mRNA que codifica para esta
caspasa.
Habiendo ya descrito la invención a nivel
general, la misma será más rápidamente comprendida a través de
referencia a los siguientes Ejemplos, los cuales se proporcionan a
título de ilustración y no pretenden quedar limitados por medio de
la utilización de la presente invención, salvo que así se
especifique.
La Figura 1 representa el porcentaje de
inhibición de crecimiento de líneas celulares tratadas con
IFN-\alpha, \beta, o \gamma, a la misma
concentración.
La Figura 2 representa el porcentaje de
inhibición de crecimiento de células EW-7 tratadas
con dosis crecientes de IFN-\alpha, \beta ó
\gamma.
La Figura 3 representa el efecto de
IFN-\beta sobre el desarrollo de tumor de Ewing,
generado por medio de inyección subcutánea de células
EW-7 en ratones. Los volúmenes relativos de tumor
(RTV) son medidos de una forma que depende del tiempo.
La Figura 4 muestra una gráfica de velocidad de
crecimiento de tumores de Ewing, que han crecido en ratones atímicos
después de inyección de IFN-\beta. Se representa
el valor promedio de los volúmenes relativos de tumor (RTV) de 12
ratones.
La Figura 5 representa el efecto de
IFN-\beta sobre tumores de Ewing que han crecido
en ratones atímicos. Los volúmenes de los tumores fueron
determinados dos veces por semana para cada uno de los grupos y se
determinó el volumen medio.
La Figura 6 representa la cuantificación de
células apópticas en líneas celulares que proceden de sarcoma de
Ewing. Las cuatro líneas celulares ES fueron estimuladas con
IFN-\beta. Después de transcurridas 48 y 72 horas
se detectaron los núcleos fragmentados utilizando colorante
fluorescente Hoechst 33258 sobre células recogidas. Se evaluó la
fragmentación nuclear mediante el contaje de células apópticas en la
población total de células no tratadas y de células tratadas con
IFN, respectivamente. Los porcentajes de células apópticas son los
promedios de 3 experimentos independientes, después de dos lecturas
por parte de dos experimentadores, para cada una de las cuatro
líneas celulares.
La Figura 7 muestra los efectos de
IFN-\beta sobre la expresión de la
caspasa-1 y la caspasa-7. Células
EW-7, EW-1, COH y ORS fueron
tratadas por espacio de 18 horas con IFN-\beta.
Los extractos celulares totales fueron sometidos a análisis Western
blot. La caspasa-1 y la caspasa-7
fueron sucesivamente reveladas con anticuerpos específicos.
La Figura 8 y la Figura 9 muestran los efectos de
IFN-\beta sobre tumores de Ewing que han crecido
en ratones atímicos después de inyección de
IFN-\beta. El valor promedio de los volúmenes
relativos de tumor (RTV) de 12 ratones y los volúmenes medios fueron
determinados cada tercer día.
Para determinar sus actividades
antiproliferativas sobre 5 líneas celulares, procedentes tanto de
tumores primarios de Ewing (antes de cualquier tratamiento:
EW-7, COH), o de recidivas metastatizadas
(EW-1, ORS, Simon) (Fig.1), se utilizaron
interferones \alpha e interferones-\beta (IFNs)
(denominados Tipo I) e IFN-\gamma (Tipo II).
La línea EW1 es una línea de sarcoma de la 8ª
costilla derecha. La línea procede de una efusión pleural
(metástasis) (exón 7 de EW/exón 5 de Fli) (Melot et al.,
Hybridoma, 1997, Nº 16, página 457).
La línea COH es una línea tumoral de la rodilla
con metástasis pulmonar. La línea procede del tumor primario antes
de quimioterapia (exón 10 de EW/exón 6 de Fli) (Melot et al.,
Hybridoma, 1997, 16, página 457).
La línea EW7 es una línea tumoral de la escápula.
Esta línea procede del tumor primario antes de quimioterapia (exón 7
de EW/exón 6 de Fli).
La línea ORS es una línea celular que procede de
un tumor secundario (metástasis) (Melot et al., Hybridoma,
1997, Nº. 16, página 457).
La línea SIMON es también una línea celular que
procede de un tumor secundario (metástasis).
Con independencia de la línea celular utilizada,
el tratamiento de 24- ó 48 horas con IFN-\gamma o
con IFN-\alpha (400 unidades/ml), da lugar a una
baja inhibición del crecimiento celular, 10-25%.
El tratamiento con IFN-\beta
(REBIF®, IFN-\beta recombinante glicosilado, a
razón de 400 unidades/ml) resulta más eficaz que el tratamiento con
IFN-\alpha ó IFN-\gamma, dado
que el mismo conduce, después de 24 horas de activación, a una
inhibición del crecimiento que es más elevada del 50%, con
independencia de la línea celular utilizada, con por ejemplo una
inhibición del 70% sobre la línea EW-7 (cf. Figura
1).
Tal y como se muestra en la Figura 2, esta
diferencia en la actividad antiproliferativa entre los tres IFNs no
depende de la dosis de IFN utilizada. Las células
EW-7 son seleccionadas con vistas a medir el efecto
antiproliferativo sobre dosis crecientes de IFNs, a partir de 50
unidades/ml y hasta alcanzar las 5.000 unidades/ml. En general, con
independencia de la dosis utilizada, la inhibición del crecimiento
después de la adición de INF-\beta es mucho mas
elevada que el efecto observado después de la adición de
IFN-\alpha o IFN-\gamma: entre
el 40 y el 80% de inhibición para el IFN-\beta,
frente a entre el 6 y 10% y entre el 6 y el 20% para el
IFN-\gamma y el IFN-\alpha,
respectivamente. Debe destacarse el hecho de que la adición de
IFN-\beta, a razón de 500 unidades/ml, proporciona
prácticamente la máxima respuesta antiproliferativa.
Los efectos diferenciales observados entre los
dos IFNs podrían ser la consecuencia de una diferencia en el
mecanismo de activación de genes inducido por los IFNs e implicado
en sus efectos antiproliferativos, tales como los genes que
codifican para la
2'5'-oligo(A)-sintasa o para
el IRF-1 (Factor Regulador de Interferón 1).
Se generaron tumores sólidos por medio de la
inyección subcutánea de 20 x 10^{6} células EW7 (línea celular
procedente de tumor de omoplato) a partir de tumor primario, antes
de aplicación de quimioterapia ((exón 7 EW/exón 6 Fli) en ratones
atímicos de 6 semanas de edad.
Transcurridos 10 días, se constituyeron dos
grupos de cinco ratones cada uno de ellos, un grupo de ratones
control y un grupo de ratones que recibieron
IFN-\beta (REBIF®).
Se aplicaron inyecciones en el propio tumor con 5
x 10^{5} unidades de IFN por ratón, 3 veces por semana. El
tratamiento continuó durante un período de 5 semanas, durante el
cual se determinaron volúmenes tumorales cada 3 días.
Los volúmenes relativos de tumor (RTV)
demostraron un crecimiento tumoral más lento después de la inyección
de IFN-\beta. La Figura 3, construida a partir de
datos promedio de RTV, muestra un descenso muy agudo en las
velocidades de crecimiento después de la inyección de
IFN-\beta
Estos resultados, obtenidos a partir de tumores
establecidos en la fase de crecimiento experimental, permiten
confirmar los resultados in vitro con líneas celulares.
Se llevó a cabo un segundo experimento in
vivo con ratones atímicos de 8 semanas de edad. Una muestra de
tumor de 5 mm de diámetro, procedente de un tumor sólido, se
desarrolló en un ratón atímico después de inyección de 20 x
10^{6} células EW7, se conservó mediante transferencia in
vivo, y se injertó en ratones atímicos.
Tres días después de la aplicación del injerto,
se constituyeron dos grupos de 12 ratones cada uno de ellos, un
grupo control recibió inyecciones de solución tampón fosfato (PBS) y
un grupo recibió inyecciones de IFN-\beta. 1 x
10^{6} unidades de IFN-\beta fueron inyectadas
en puntos tumorales de acuerdo con un régimen de 5 días por semana
(de lunes a viernes) durante 1 mes.
Se determinaron las curvas de crecimiento de
tumor después de la medición de diámetros de tumores inyectados en
cada uno de los ratones, dos veces por semana (Figura 4).
La Figura 4 muestra los gráficos obtenidos a
partir de RTV promedios para cada uno de grupos de 12 ratones. Se
observó una progresión casi lineal de desarrollo de tumor en los
ratones control, mientras que la proliferación de tumores era
prácticamente nula en injertos que habían recibido
IFN-\beta. Este resultado fue confirmado a través
de cálculos promedio para cada uno de los grupos (Figura 5).
Vale la pena destacar que un mes después de la
interrupción de la inyección de IFN, el 40% de los ratones que
habían recibido IFN-\beta no desarrolló
tumores.
A la vista de la anterior descripción obtenida
con los ejemplos, los expertos en la materia serán capaces de llevar
a la práctica la invención de varias formas y realizaciones sin
apartarse del espíritu y del campo de cobertura de la invención, tal
y como se define en las reivindicaciones anexas.
Para investigar la expresión y la regulación del
gen IRF-1 a través de IFN-\beta,
los autores de la invención valoraron la expresión del gen
IRF-1 a través de la reacción en cadena de la
polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). El
total de RNAs extraído a las 3,6 y a las 18 horas después del
tratamiento con IFN-\beta demostró que el mRNA
específico para IRF-1 estaba inducido por
IFN-\beta. En células EW-7, el
IFN-\beta inducía la expresión del gen
IRF-1 de una forma que depende del tiempo, durante
un máximo de 6 horas de estimulación. No obstante, después de la
estimulación por medio de IFN-\beta, el
IRF-1 mRNA resultaba aún detectable a las 18 horas.
Para las otras tres líneas celulares ES se obtuvieron resultados
similares, pero con diferentes niveles de inducción del gen
IRF-1.
Los autores de la presente invención estaban
particularmente interesados en determinar si la estimulación de
estas líneas celulares ES por medio de IFN-\beta
provocaba apóptosis, y la posible relación entre la apóptosis y la
expresión del gen IRF-1. A tal efecto, se evaluó la
fragmentación nuclear mediante teñido Hoechst y se cuantificó
mediante contaje del número de células apópticas en la población
total de células no tratadas o de células tratadas con
IFN-\beta durante 48 o 72 horas (Figura 6). Las
células EW-7 y COH mostraron un incremento
dependiente del tiempo en las células apópticas después del
tratamiento con IFN-\beta, mientras que las
células EW-1 y ORS no sufrieron apóptosis
significativa durante cualquier período de tratamiento. Se
analizaron las diferencias en la sensibilidad de las cuatro líneas
celulares ES a la apóptosis dependiente de
IFN-\beta y la correlación entre los niveles de
proteínas p21^{WAF-1/Cip-1}y
Bcl-2, por medio de análisis de inmunotransferencia
después de tratamiento con IFN-\beta. La
infra-regulación del total de proteína celular
Bcl-2 estaba relacionada con la
sobre-regulación de
p21^{WAF-1/Cip-1} y la expresión
de IRF-1 en las células EW-1 o ORS,
a la vez que no se observaba cambio alguno en la expresión de la
proteína Bcl-2 en las células EW-1 o
en las células ORS.. La proteína
p21^{WAF-1/Cip-1} no resultaba
detectable en las células EW-1 o en las células ORS,
hayan sido las mismas tratadas o no con IFNs.
Debido a que se ha demostrado que la inducción de
apóptosis por parte de las citoquinas conlleva la expresión de genes
caspasa, los autores de la invención exploraron el posible refuerzo
de la expresión del gen caspasa en líneas celulares ES por parte de
IFN-\beta. A tal efecto, se llevaron a cabo
ensayos de protección de RNasa para la familia de caspasa,
utilizando el equipo hApol (Pharmingen), después de estimulación de
células ES con IFN-\beta por espacio de 18 horas.
La expresión de caspasa-7 mRNA se incrementó de
forma significativa en las células EW-7 estimuladas
con IFN-\beta y, en menor medida, el nivel de mRNA
de la caspasa-3 y -8; y los niveles de mRNA de las
caspasas-1, -6 y -9 permanecieron sin modificar. En
las células COH se observaron resultados similares. En células
EW-1 y ORS, los niveles de mRNA de las caspasas
permanecieron sin modificar.
A la vista de los resultados de protección de
RNasa, los autores investigaron la posibilidad de que el
IFN-\beta refuerce la proteolisis, conduciendo a
la formación de subunidades de caspasa activas. La
caspasa-1 20 kDa proteolizada fue revelada en primer
lugar después de sondeo con anticuerpos, frente a la forma activa de
caspasa-1. Una vez limpiada la mancha, las formas de
33 kDa y de 18 kDa de la caspasa-7 fueron detectadas
con anticuerpos específicos frente a caspasa-7 (los
cuales eran anticuerpos de ratón purificados, obtenidos de Pharmigen
(Becton Dickinson)). Los análisis de inmunotransferencia con
anticuerpos frente a caspasa-7 revelaron que el
IFN-\beta no tan solo incrementaba la cantidad de
proteína procaspasa-7, sino que también generaban la
subunidad activa proteolizada de 18 kDa (figura 7). Estos
procedimientos fueron tan solo observados en células
EW-7 naturales de tipo p53 y en células tumorales
COH. Se observó también un incremento en la subunidad
caspasa-1 20 kDa en células EW-7 y
COH, después de tratamiento con IFN-\alpha o
IFN-\beta, pero no resultaba detectable en células
EW-1 ó en células ORS (Figura 7). Tanto el
incremento en la expresión del gen de caspasa-7 como
la rotura de pro-caspasa-7 después
de tratamiento con IFN-\beta, sugieren que en las
células que proceden de sarcoma de Ewing, el
IFN-\beta desencadena la muerte celular mediante
la sobre-regulación selectiva de la
caspasa-7 activada.
Para demostrar el papel de IRF-1
en apóptosis en células de sarcoma de Ewing, los autores de la
invención intentaron generar células que expresaran
IRF-1. Las líneas celulares ES que expresan
IRF-1 de forma constitutiva han resultado difíciles
de establecer debido a los potentes efectos citotóxicos del
IRF-1 endógeno. Así pues, para determinar si la
inducción de IRF-1 reforzaba la muerte de las
células de tumor de Ewing, las cuales son normalmente resistentes a
la muerte celular mediada por IFN-\beta, se
utilizó una forma inducible de IRF-1. Como
consecuencia, se utilizó un sistema inducible por tetraciclina,
utilizando el activador tTA inverso (rTA) que permite la expresión,
inducible por doxiciclina (Dox) de IRF-1 (Nguyen, H.
Et al., Oncogene, 15: 1425-1435 (1997)).
Lones celulares procedentes de
rtTA-IRF-1 de las cuatro líneas
celulares ES fueron expandidas de forma individual y cribadas para
determinar la expresión de IRF-1 a través de
análisis Western blot, seguido de un período de 48 horas de
crecimiento en medio, con o sin Dox. La estimulación con Dox condujo
a la inducción de la proteína IRF-1 en las cuatro
líneas celulares ES-TA/IRF-1, pero
no en las líneas celulares rtTA control. Para determinar si la
inducción de IRF-1 estaba asociada con la
fragmentación nuclear, las células fueron teñidas con colorante
fluorescente Hoechst, después de tratamiento Dox de las células
transfectadas durante un período de 24 o 48 horas. La totalidad de
líneas celulares ES-TA/IRF-1, con
independencia de sus estatus p53, sufrió apóptosis en función del
tiempo después de estimulación mediante Dox. Entre el 40 y el 50% de
las células apópticas fueron detectadas después de la estimulación.
El análisis Western blot de los extractos totales de células
ES-TA/IRF-1 mostraba una correlación
entre la inducción mediante Dox y la
sobre-regulación de
p21^{WAF-1/Cip-1}, con
infra-regulación concomitante de la proteína Bcl 2.
Se observó también un nivel creciente de la subunidad
caspasa-7 activa proteolizada en las cuatro líneas
celulares ES-TA/IRF-1 tratadas con
Dox, por espacio de 48 horas, pero no en las líneas celulares
control rtTA. Considerados globalmente, estos resultados sugieren
que las caspasa-7 está involucrada en la apóptosis
mediada por IRF-1, en las células de sarcoma de
Ewing.
La intención del experimento era estudiar el
efecto del IFN-\beta sobre el desarrollo
(crecimiento) de un tumor de Ewing existente.
Una muestra de tumor de 5 mm de diámetro,
procedente de un tumor sólido, se desarrolló en ratones atímicos
después de inyección de 20 x 10^{6} células EW-7 y
se conservó por medio de transferencia in vivo, siendo
injertada en ratones atímicos de 8 semanas de edad. Transcurridas 3
semanas, los ratones, los cuales habían desarrollado un tumor de
entre aproximadamente 100 y 200 mm^{3}, fueron divididos en dos
grupos "aleatorios" de 12 ratones, recibiendo el primer grupo
PBS como control y el segundo IFN-\beta
(REBIF®).
Se inyectó IFN-\beta en el
interior de la propia masa tumoral, a una dosis de 8 x 10^{5}
unidades por ratón, 5 veces por semana (de lunes a viernes). Se
continuó con la aplicación de la dosis por espacio de 5 semanas,
durante las cuales los tumores fueron medidos cada tercer día.
Los volúmenes relativos (RTV) y los diámetros
tumorales promedio definidos revelaron un descenso muy marcado del
desarrollo del tumor (Figura 8 y Figura 9).
Este experimento sobre tumores existentes en su
fase de crecimiento exponencial mostraba claramente que el
IFN-\beta presenta un efecto antitumoral sobre el
tumor de Ewing.
Se investigó el efecto de un tratamiento por
quimioterapia con isofosfamida, asociado con tratamiento con
IFN-\beta, sobre el crecimiento de un tumor de
Ewing existente, por medio de la administración a los ratones de 60
mg/kg de peso corporal de Ifosfamida durante 3 días, conjuntamente
con la administración intratumoral de 100.000 U/día de
IFN-\beta, seguida IFN-\beta en
solitario, cinco veces por semana.
El crecimiento del tumor de Ewing resultó
inhibido con estos tratamientos asociados, mientras el tamaño de
este tumor permanecía estable.
Además, los autores han evidenciado que los
tratamientos asociados presentan un efecto sinérgico, dado que la
citada acción es mucho más elevada que la que resulta de la
administración de IFN-\beta y de Ifosfamida
independiente.
Claims (14)
1. Utilización de interferón-beta
para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del
sarcoma de Ewing o de EOE.
2. Utilización según la reivindicación 1, para el
tratamiento del sarcoma de Ewing.
3. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho
interferón-beta es interferón-beta
1a.
4. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho
interferón-beta es interferón-beta
recombinante.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho
interferón-beta está glicosilado.
6. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho
interferón-beta está destinado a ser administrado
por vía oral o parenteral.
7. Utilización según la reivindicación 6, en el
que la citada administración parenteral se efectúa a través de
administración intramuscular, intravenosa, subcutánea o
percutánea.
8. Utilización según la reivindicación 6, en el
que el citado interferón-beta tiene que ser
administrado a través de inyección sistémica o directa al tumor.
9. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el citado
interferón-beta está destinado a ser administrado en
una cantidad eficaz, comprendida entre aproximadamente 1 y
aproximadamente 90 millones de Unidades Internacionales,
preferiblemente comprendida entre aproximadamente 1 y
aproximadamente 45 millones de Unidades Internacionales.
10. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el citado
interferón-beta está destinado a ser administrado de
forma simultánea o secuencial, conjuntamente con uno o más agentes
utilizados en el tratamiento de la familia de tumores de Ewing.
11. Utilización según la reivindicación 10, en el
que el agente es Ifosfamida.
12. Procedimiento in vitro para
monitorizar la sensibilidad de las células de sarcoma de Ewing
frente a la apoptosis mediada por IFN-\beta, en el
que se evalúa la expresión y/o la activación de la
caspasa-7, resultando dicha expresión y/o activación
indicativa de la sensibilidad de las células de sarcoma de Ewing a
la apoptosis mediada por IFN-\beta.
13. Procedimiento de la reivindicación 12, en el
que la citada expresión y/o activación es evaluada por medio de un
inmunoensayo de caspasa-7
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 13, en el que dichas células de sarcoma de
Ewing proceden de una muestra quirúrgica de tumores de Ewing.
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