KR20100029844A - 티모신-알파 1에 의한 신경교아종의 치료 - Google Patents

티모신-알파 1에 의한 신경교아종의 치료 Download PDF

Info

Publication number
KR20100029844A
KR20100029844A KR1020107002516A KR20107002516A KR20100029844A KR 20100029844 A KR20100029844 A KR 20100029844A KR 1020107002516 A KR1020107002516 A KR 1020107002516A KR 20107002516 A KR20107002516 A KR 20107002516A KR 20100029844 A KR20100029844 A KR 20100029844A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
treatment
tumor
cell
thymalfasin
Prior art date
Application number
KR1020107002516A
Other languages
English (en)
Inventor
잭 알. 원즈
수잔 데라 몬테
Original Assignee
로드아일랜드하스피틀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 로드아일랜드하스피틀 filed Critical 로드아일랜드하스피틀
Publication of KR20100029844A publication Critical patent/KR20100029844A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A61K31/175—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine having the group, >N—C(O)—N=N— or, e.g. carbonohydrazides, carbazones, semicarbazides, semicarbazones; Thioanalogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/64—Sulfonylureas, e.g. glibenclamide, tolbutamide, chlorpropamide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2292—Thymosin; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

티모신-α1은 악성 신경교아종의 효과적인 치료로서 카무스틴(BCNU)와 조합하여 보조제로서 사용된다.

Description

티모신-알파 1에 의한 신경교아종의 치료{TREATMENT OF GLIOBLASTOMA WITH THYMOSIN-ALPHA 1}
(관련 출원 데이터)
본 출원은 임시 출원 60/337,149(2001년 12월 10일 출원)의 혜택을 주장한다.
신경교아종(glioblastoma)은 성인의 가장 일반적인 1차 CNS 악성 종양이고, 증례의 약 75%의 비율을 차지한다. 뇌영상(neuro-imaging), 미세 수술 및 방사선의 개량에 의한 이들 치료의 꾸준한 진보가 있었지만, 신경교아종은 불치로 남아 있다(McDonald, 2001; Burton, 2000; Prados, 2000). 평균 기대 수명은 진단으로부터 1년 미만이고, 육안 종양 절제(gross tumor resection)를 포함하는 적극적 치료를 한 후에 5년 생존률은 10% 미만이다(Burton, 2000; Nieder, 2000; Napolitano, 1999; Dazzi, 2000). 신경교아종은 뇌에서의 급속하고, 공격적이며, 침윤성인 증식에 의해 죽음에 이르게 한다. 침윤성 증식 패턴때문에 이들 종양은 절제 불가능한 성질을 가진다. 신경교아종은 또한 방사선 및 화학 치료에 비교적 내성이 있어, 치료 후 재발률이 높다. 게다가, 신생 종양세포에 대한 면역 반응은 절제 및 방사선 치료 후에 나머지 신생 종양세포를 완전히 박멸시키는데 대개 비효율적이다(Roth, 1999; Dix, 1999; Sablotzki, 2000).
악성 신경교종(glioma) 세포는 T-세포 증식 및 IL-2의 생산을 저하시키는 면역억제 펩타이드를 생산함으로써 숙주의 면역계에 의한 검출을 회피한다(Dix, 1999). CNS는 또한 약간 면역특권 부여되고, 이에 의해 악성 신생 종양세포가 검출되지 않는 상태로 성장하게 된다. 환자의 신경교아종의 효과적인 치료에 대한 연구가 현재도 계속되고 있다. 이들 신생 종양세포와 싸우기 위해, 면역치료, 또는 면역계의 동원을 통한 치료는 다양한 모델로 연구되고 있다. 티모신 분획 5(TF5), 티모신 α-1(티말파신, thymalfasin), IFN-α, 및 IL-2는 악성 종양과 싸우는 그들의 능력이 연구되고 있는 많은 면역 관련 성분 중의 하나이다.
카무스틴(carmustine)(비스클로로에틸 니트로스우레아, bischloroethyl nitrosurea, BCNU 또는 BiCNU)은 클로로에틸니트로소우레아계의 화학 치료제이고, 이것은 클로로조틴(chlorozoticn, DCNU, Anderson, 1975), 로무스틴(lomustine, CCNU, Carter, 1968), 니무스틴(nimustine, Saijo, 1980) 및 라니무스틴(ranimustine, Sekido, 1979) 등의 다른 화학 치료제를 포함한다. 클로로에틸니트로소우레아는 다년간 1차 뇌 종양에 대한 단일 처리의 화학 치료로서 이용되어 왔다. 그렇지만, 역사적 통계치는 뇌 종양에 대한 단일 작용제로서의 이들 화합물의 효용성을 언제나 지지하는 것과 같이 보이지는 않는다(예를 들면, Aquafedda, 외). 생존 곡선 사이의 차이가 0.05 수준으로 상당하지 않지만, 단독 방사선치료와 비교하여 카무스틴과 방사선치료의 조합은 악성 신경교아종으로 고생하는 환자의 장기간(18개월) 생존에 적당한 이점을 가졌다(Walker, 1980).
티모신 α-1(티말파신)은 28-아미노산 펩티드이고, 순환계에서 발견되는 자연 발생하는 화합물의 합성 형태이다(Bodey, 2000; Bodey, 2001). 티말파신은 흉선세포의 성장과 분화, IL-2, T 세포 IL-2 수용체, IFN-γ, 및 IFN-α의 생산을 촉진한다(Andreone, 2001; Sztein, 1989; Knutsen, 1999; Spangelo, 2000; Tijerina, 1997; Garbin, 1997; Attia, 1993; Cordero, 1992; Baxevamis, 1994 & 1990; Beuth, 2000). 티말파신은 B형 간염 바이러스 감염(Chan, L-Y, 2001), C형 간염 바이러스 감염(Chan, H. L., 2001; Sherman, 1998; Schinazi), 허파 또는 머리 및 목의 암종, 흑색종(Bodey, 2000 & 2001; Garaci, 2000), 및 AIDS(Billich, 2002)를 치료하기 위한 임상 시험에 사용되고 있다. 신경교아종에 대한 감소된 T 세포 반응성의 증거와 함께, 이들 조사의 유망한 결과에 의해, 악성 신경교종을 치료하기 위한 티말파신 면역치료의 잠재적인 치료 이점을 평가하고, 티말파신이 이의 신생종양형성 방지 효과를 발휘하는 메커니즘을 결정하는 본 명세서를 유도하였다.
신경교아종은 진단의 12개월 이내에 대개 치명적인 고도의, 악성 중추 신경계(CNS) 종양이다. 최근의 연구는 IL-2 또는 IL-12 등의 프로-염증성(pro-inflammatory) 사이토킨을 사용하는 면역치료는 신경교아종을 가진 환자의 생존을 연장할 수도 있다는 것을 나타냈다. 티모신-α-1(티말파신)은 면역 모듈레이터로 작용하여 IL-2 생산 및 T-세포 증식을 증가시키는 흉선의 펩티드이다. 본 명세서는 모든 다른 그룹에 관하여 티말파신+BCNU으로 치료된 피험자에서 현저하게 감소된 종양 존재량(tumor burden) 및 증가된 림프 단핵의 염증성 세포 반응을 나타냈다. 생체외(in vitro) 실험은 티말파신 치료가 배양된 9L 세포 중의 생존능 또는 미토콘드리아의 기능에 대한 직접적인 효과를 갖지 않는다는 것을 나타냈다. 그렇지만, 티말파신 치료에 의해 FasL, FasR 및 TNFα-IR(각각, 65.89%, 44.08% 및 22.18%)을 포함하여, 프로-아팝토시스(pro-apoptosis) 유전자 발현의 현저하게 향상된 수준을 유발했다. 게다가, H2O2의 통상 비치명적인 투여량이 티말파신으로 치료되고 있는 9L 세포의 30-50%를 죽이도록, 티말파신 치료는 9L 세포를 산화적 스트레스에 대해 보다 민감하게 하였다. 추가의 연구는 티말파신이 그랜자임(Granzyme)B- (T 세포) 또는 BCNU- 매개된 치사에 대한 9L 세포 감도를 향상시킨다는 것을 나타냈다. 이 결과는 티말파신이 생체내(in vivo) 신경교아종의 클로로에틸티트로스우레아-매개된 박멸을 향상시키고, 티말파신이 프로-아팝토시스 메커니즘을 활성화시킴으로써 이의 효과를 조정하고, 신생 종양세포를 산화적 스트레스 및 그랜자임 B(T 세포) 또는 화학 치료에 의한 치사에 보다 민감하게 한다는 것을 나타낸다.
티말파신은 신경교아종 세포의 면역 매개 치사를 가능하게 하여, 보조제로서 클로로에틸니트로소우레아 화학치료 화합물과 조합하여 효과적인 항 신경교아종 치료에 사용할 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명은 자연 발생하는 TA1 이외에 자연 발생하는 TA1의 아미노산 서열, 이와 실질적으로 유사한 아미노산 서열, 또는 이의 단축된 서열 형태를 갖는 합성 TA1 및 재조합 TA1을 포함하는 티말파신(TA1) 펩티드에 적용 가능하고, TA1 예를 들면, TA1과 실질적으로 동일한 활성을 갖고 실질적으로 동일한 방식으로 기능하도록 TA1과 상당한 아미노산 상동성을 갖는 TA1 유도 펩티드와 실질적으로 유사한 생물 활성을 소유하는 치환, 제거, 연장, 교체, 또는 달리 변형된 서열을 갖는 그들의 생물학적 활성 유사체에 적용 가능하다.
신경교아종의 실험적 모델을 사용하는 생체내 연구는 BCNU 치료가 현저하게 종양 존재량을 감소시키지만, 반응은 검출 불가능한 반응을 나타내는 많은 증례에 불균일하다는 것을 나타냈다. 그렇지만, 티말파신+BCNU의 치료는 증례의 약 25%에서 평균 종양 존재량을 감소시키는 것과 종양을 치료하는 것에 대하여 모두 상당한 치료 이점을 제공하였다. 종양 존재량의 티말파신+BCNU을 매개한 감소는 뇌 중의 신생 종양세포 내외의 증가된 림프 단핵 세포 침윤물과 관계가 있었다. 잔류의 종양을 발견할 수 없는 경우에 있어서, 초기 종양 세포 침윤물과 관계가 있는 신경교 반흔(gliotic scar) 조직 및 적은 염증만이 발견되었다. 신경교아종 치료는 저용량 및 고용량의 티말파신+BCNU 처리된 그룹의 약 25%에서 발견되었다.
약간 기대하지 않았던 발견은 티말파신 만의 그룹이 대조군과 동일하거나 또는 악화된다는 것이다. 빈번히, 티말파신 치료된 랫트의 뇌는 성장하는 종양 덩어리와 복합된 염증 및 부종에 의해 보다 팽윤하여 헤르니아가 되었다. 이러한 점에 있어서 종양 세포 치사가 2개의 그룹에서 유사하지만, 부종 및 헤르니아형성은 더 높은 농도의 티말파신을 수용하는 그룹에서 더욱 우세하기 때문에, 더 낮은 농도의 티말파신±BCNU로 치료된 랫트는 더 높은 농도의 티말파신±BCNU로 치료된 랫트보다 더 좋은 결과를 가졌다는 것에 주목해야 한다.
그러므로, 티말파신 단독으로의 치료는 신경교아종을 박멸시키지 못했고, 수반성 종양 세포 치사가 없는 경우 과도의 팽윤에 의해 대개 유해했다. 이 결과는 추가로 티말파신이 악성 신생 종양세포에 대해 직접적인 세포독성의 영향을 거의 갖지 못하고, 티말파신+BCNU 치료에서 발견된 부가적인 종양 세포 치사는 티말파신의 간접적인 작용에 의해 조정된다는 것을 암시하였다. 티말파신 치료된 랫트의 뇌에 있어서, 주로 T 세포 및 마크로파지(macrophage)로서 특징되는 림프 단핵 염증성 세포의 증가된 밀도의 발견은 티말파신이 악성 종양에 대해 동원성 이펙터 면역 세포(recruiting effector immune cell)에서 중요한 역할을 갖는다는 것을 암시한다.
티말파신이 이의 항-신경교아종 효과를 조정하는 메커니즘을 측정하기 위해 일련의 생체외 실험이 실행되었다. 초기 연구에 의해 티말파신이 신경교아종 세포에 대해 상당한 직접적인 세포독성 효과를 갖지 않는다는 것을 측정하였다. 동일한 것이 신경아세포종 세포 및 유사분열 후의 피질 뉴런(post-mitotic cortical neuron)를 포함하는 다른 세포 타입에 대해서도 해당되었다. 이 조사를 확대하기 위해서, 본 발명자들은 티말파신이 세포 기능에 반대의 영향을 미치고, 혹시 이들을 아팝토시스에 대해 보다 민감하게 하는지에 대해 평가하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 성장 및 하우스키핑(housekeeping) 유전자뿐만 아니라, 프로-아팝토시스 및 프로-생존(pro-survival) 유전자의 발현 수준을 조사하였다. 이들 연구는 24 또는 72시간 동안의 티말파신 치료의 결과가 9L 신경교아종 세포 중의 프로-아팝토시스 유전자의 수준을 현저하게 증가시킨다는 것을 나타냈다. 유사한 결과가 Sy5y 신경아세포종 세포에 대해서 얻어졌다. 293 세포에 있어서, 프로-생존 매커니즘이 억제되고, 프로-아팝토시스 유전자가 영향을 받지 않는다는 것을 제외하고는 동일한 현상이 주목되었다. 이들 발견은 티말파신이 직접적인 세포독성 효과를 갖지 않지만, 프로-아팝토시스 유전자의 기초 발현을 증가시키거나 생존 유전자의 기초 발현을 감소시킴으로써 세포를 세포 독성제에 대해 더욱 민감화 할 수도 있다는 것을 암시한다. 이 가설을 시험하기 위해서, 본 발명자들은 티말파신 처리된 세포가 산화적 스트레스 또는 클로로에틸니트로스우레아 매개된 치사에 대해 보다 민감한지를 측정하였다. 연구는, 티말파신 처리의 24 또는 72시간 후에, 치사량 이하의 농도의 H2O2 또는 BCNU가 각각 9L 세포의 25% 또는 40%를 치사시켰음을 나타냈다. 그러므로, 티말파신의 적어도 일부 효과는 전적으로 T 세포 및 마크로파지의 동원과 면역 조절에 의해서라기 보다는 신생 종양세포에 대한 이의 작용에 의해 조정되었다.
티말파신의 면역 조절 특성 및 관련 분자가 입증되고 있다. 이의 주 효과는 프로-염증성 사이토킨 생산 및 림프구 증식을 증가시키는 것이다. 활성화된 T 림프구는 FasL-FasR 상호 작용을 통하여, 퍼포린-그랜자임 시스템(perforin-granzyme system)을 활성화시킴으로써 타겟 세포를 치사시킨다. 티말파신 처리된 9L 신경교아종 세포 중의 증가된 FasL/FasR 발현의 발견은, 활성화된 T 세포가 FasL/FasR 상호 작용을 통하여 이들 타겟 세포를 효과적으로 치사시킨다는 것을 암시한다. 그렇지만, 활성화된 T 세포 대신에 SLO(투과성제) 및 재조합 그랜자임 B로 구성되는 새로운 생체외 검정법을 이용함으로써, 본 발명자들은 티말파신 처리된 9L 신경교아종 세포가 SLO 및 그랜자임 B에 노출됨으로써 급격하게 치사된다는 것을 증명하였다. 이들 발견은 티말파신이 하기의 몇몇 방식으로 신경교아종 세포의 면역 매개된 치사를 효과적으로 촉진시킬 수도 있음을 암시한다: 1) 프로-아팝토시스 유전자 발현의 기초 수준을 증가시킴으로써 세포를 산화적 스트레스 및 세포독성/화학 치료제에 대해 더욱 민감하게 시킴; 2) 활성화된 T 세포 상에서 FasL과 상호 반응하여 아팝토시스를 증가시킬 수 있는 FasR의 수준을 증가시킴; 및 3) 활성화된 T 세포 및 마크로파지를 동원시키고, 타겟 종양 세포의 퍼포린-그랜자임 매개된 치사를 향상시킴. 게다가, 이 결과는 신경교아종의 티말파신 치료가 독립형 약제로서가 아니라, 클로로에틸니트로스우레아와 조합하여 사용될 때 효과적이라는 것을 강하게 나타낸다. 이 결과는 단독 투여된 티말파신은 최소의 종양 세포 박멸과 함께 팽윤과 염증이 증가하기 때문에, 불리할 수도 있다는 상당한 증거를 제공한다. 그러므로, 신경교아종의 치료에서 티말파신의 가장 적합한 역할은 숙주 면역 반응을 촉진시키고, 종래의 화학 치료에서 생존하는 잔류 종양 세포를 박멸시키기 위한 보조제로서 작용하는 것이다.
결론적으로, 여기서 설명된 본 발명은 티말파신이 하기를 포함하는 몇몇 채널을 통하여 조정되는 항 신경교아종 효과를 나타냄을 증명한다: 1) 산화적 스트레스 또는 사이톡식/화학치료제에 대해 종양 세포 감도를 증가시키는 프로- 아팝토시스/생존 유전자의 조절; 2) FasR-FasL 매개된 면역 세포 치사 캐스케이드를 촉진시킴; 및 3) 퍼포린-그랜자임 매개된 면역 세포 치사에 대해 타겟 세포 감도를 증가시킴. 그렇지만, 이의 항-신경교아종 특성에 대하여 티말파신의 치료 효과는 클로로에틸니트로스우레아의 병용 투여에 의존하고, 티말파신이 확정적 항 신생종양제라기 보다는 보조 면역 조절제로서 가장 적합하다는 것을 강조한다. 또한, 다른 화학치료 화합물과 조합될 때, 티말파신은 종래의 화학 치료에서 현재 발견되는 것보다 현저하게 높은 비율로 종양 존재량, 발달 및 재발을 감소시키는 것을 돕는 것에 유사한 양성 효과를 가질 것이라고 추정된다.
본 발명은 본래의(예를 들면, 자연 발생하는) 티말파신 이외, 본래의 티모신의 아미노산 서열, 이와 실질적으로 유사한 아미노산 서열, 또는 이로부터 단축된 서열을 갖는 합성 티말파신 및 재조합 티말파신에 적용 가능하고, 티말파신과 실질적으로 유사한 생물 활성을 소유하는 치환, 제거, 연장, 교체, 또는 달리 변형된 서열을 갖는 그들의 생물학적 활성 유사체에 적용 가능하다.
티말파신의 분리, 특성 결정 및 용도는 예를 들면, 미국 특허 No. 4,079,127, 미국 특허 No. 4,353,821, 미국 특허 No. 4,148,788 및 미국 특허 No. 4,116,951에서 설명된다.
BCNU의 화학치료 효과의 원하는 정도의 상승 작용을 유발하기 위하여 필요한 티말파신의 양은 통상적인 용량-적정 실험에 의해 결정될 수 있다. 티말파신은 16 mg/kg 체중/일까지의 용량을 투여한 경우 인간에게 안전한 것으로 알려져 있다. 티말파신의 바람직한 용량은 0.001mg/kg 체중/일 내지 10 mg/kg 체중/일이고, 가장 바람직하게는 0.02mg/kg 체중/일이다.
클로로에틸니트로스우레아는 약 90 ~ 250 mg/m2의 용량으로, 주사, 경구, 생분해성 웨이퍼 또는 당업자에게 공지된 다른 편리한 수단에 의하여 투여될 수 있다. 이는 1회량으로 제공될 수 있거나, 또는 이틀 연속하여 75 내지 100 mg/m2의 양으로 매일의 주사로 나누어 제공될 수 있다. 최초 용량으로부터 이어지는 투여량은 환자의 이전 용량에 따른 혈액학적 반응에 따라 조절되어야만 한다. 혈액 카운트는 1주마다 모니터되어야 하고, 혈액학적 독성이 지연되고 누적되므로 6주 전에 반복 코스가 제공되어서는 안된다. 150~200 mg/m2의 용량으로 매 6주마다 정맥내로 투여될 수 있는 클로로에틸니트로스우레아가 바람직하다. BCNU는 또한, 생분해성 웨이퍼(예를 들어, Gliadel, Guilford Pharmaceuticals)를 종양 베드에 직접 이식함으로써 투여될 수 있다. 만일 투여가 생분해성 웨이퍼를 통하여 이루어지는 경우에는, 공동 투여되는 티말파신은 웨이퍼내에서 직접 BCNU와 편의적으로 조합될 수 있다.
티모신-α1은 악성 신경교아종의 효과적인 치료로서 카무스틴(BCNU)와 조합하여 보조제로서 사용된다.
(도면의 간단한 설명)
도 1은 티말파신이 9L 세포 생존능 및 미토콘드리아의 기능에 대한 최소 효과를 갖는 것을 나타낸다.
도 2는 72시간 동안 티말파신에 노출된 9L 세포 중의 증가된 프로-아팝토시스 유전자 발현을 나타낸다.
도 3은 티말파신(THY)이 9L 신경교아종 세포를 산화적 스트레스 또는 BCNU 화학 치료에 의한 치사에 대해 보다 민감하게 하는 것을 나타낸다.
도 4는 티말파신이 9L 신경교아종 세포를 그랜자임 B 매개된 치사에 보다 민감하게 하는 것을 나타내고, 패널(a)는 비히클(vehicle) 또는 티말파신에 노출된 세포에 대한 영향을 나타내고(24시간-급성, 72시간-만성), 다음에 비히클로 추가의 1시간 치료를 위해 분할되었고, 패널(b)는 비히클 또는 티말파신에 노출된 세포에 대한 영향을 나타내고(24시간-급성, 72시간-만성), 다음에 비히클로 추가의 3시간 치료를 위해 분할되었다.
도 5는 성체의 롱 에반스(Long Evans) 랫트의 우측 전두엽 내에 10,000개의 9L 신경교아종 세포를 주입한 후의 임상 신경병리학적 비정상성의 시간적 경과 전개를 나타낸다.
도 6은 생체내 신경교아종 발달에 대한 BCNU 및 BCNU+티말파신(THY)의 효과를 나타낸다.
도 7은 BCNU+티말파신(THY)으로 치료된 랫트에서 감소된 신경교아종 존재량 및 25% 치료를 나타낸다.
실시예 1 : 9L 및 293 종양 세포주의 티모신 - α1 처리
종양 세포주 : 랫트 9L 신경교아종세포 및 293 인간 신장세포를 5% FCS, 2mM L-글루타민 및 100 μM의 비-필수아미노산이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco-BRL, Grand Island, NY)에서 유지하였다. 모든 세포주는 5% CO2를 함유하는 습한 공기에서 37℃에서 유지하였다. 세포주는 ATCC (American Type Cell Culture Collection)로부터 구입하여 병원균이 없음을 확인하였다.
티모신 알파 1 처리 : 급성 티말파신 치료를 위하여, 20,000 세포/웰의 세포 밀도로 웰 플레이트에 도입된 세포를 24시간 동안 10-5 M 티말파신으로 처리하였다. 만성적으로 티말파신으로 처리되는 세포는 플라스크에서 배양하여 처리기간(3일)동안 10-5M의 티말파신(새로운 배지에 첨가하여)으로 매 24시간마다 처리하였다. 또한, 9L 세포에 대한 용량-반응 커브를 측정하기 위하여, 세포에 연속적으로 희석된 50 μM 내지 0.022 μM 농도범위의 티말파신을 처리하였다.
산화적 스트레스를 유도하기 위하여 H2O2를 세포에 사용하였다. 티말파신 또는 비히클로 24시간 동안 처리된 세포를 9 μM내지 1.8 mM의 농도범위의 H2O2에 노출시키고, 이후에, 후술하는 CV 및 MTT 분석법을 사용하여 생존능 및 미토콘드리아의 기능을 평가하였다. 티말파신을 연속적으로 희석한 양을 세포에 투여한 실험에서는 1.8 mM의 일정한 양의 H2O2를 세포에 처리하는데 사용하였다. 9L 세포에 대하여는, 세포에 처리하는 정확한 H2O2 농도를 결정하기 위하여 H2O2 커브를 전개하였다.
세포의 미토콘드리아 기능에 대한 티말파신 처리 및/또는 H2O2-유도 산화적 스트레스의 효과를 측정하기 위하여 MTT 분석법을 9L 및 293 세포주에 대하여 실시하였다. 처리후에, 10 ㎕의 MTT 용액을 배지 100 ㎕ 를 함유하는 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 MTT 염료와 함께 셀 타입에 따라 15분 내지 1시간 동안 인큐베이트하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 각 웰에 산성 이소프로판올 200 ㎕를 가하였다. 이 후, 세포의 용해가 일어날 때까지 상온에서 플레이트를 진탕하였다. 이어서, 540nm에서 Packard SpectraCountTM 기계로 판독하였다.
96-웰 플레이트에서 크리스탈 바이올렛 (Crystal Violet, CV)을 사용하여 세포를 염색하였다. 배지를 버린후에, 20㎕의 크리스탈 바이올렛을 각 웰에 첨가한 후, 상온에서 10분간 진탕하였다. 이어서, 플레이트를 온수로 다수회 세척하고 건조시켰다. 100-200㎕(세포밀도에 따라 선택)의 PBS w/1% SDS를 각 웰에 첨가하였다. 세포의 충분한 용해가 일어날 때까지 플레이트를 상온에서 진탕기위에서 인큐베이트하였다. 테스트된 다양한 그룹들 사이의 세포 생존능에서의 차이를 검출하기 위하여 540nm에서 플레이트를 판독하였다.
마이크로타이터 면역 세포화학 ELISA (Microtiter Immunocytochemical ELISA, MICE) 분석법(de la Monte, 1999)를 9L 및 293세포에 대하여 수행하였다. 세포를 96웰 플레이트에 도입하여, 10-5M 티말파신으로 24시간 처리하고, MICE분석법으로 분석하기 전에 밤샘 조직고정(histofixed)하였다. 고정된 세포를 트리스-버퍼된 염수(50 mM Tris, pH 7.5, 0.9% NaCl; TBS)에서 0.05% 사포닌으로 투과화시켰고, Superblock-TBS(Pierce, Rockford, IL)로 블록킹하였고, 이어서, 0.05% Tween-20 및 0.5% 소혈청알부민을 포함하는 TBS(TBST-BSA)에 0.5 - 1㎍/㎖로 각각 희석된 PCNA (proliferating cell nuclear antigen), bcl-2, p21/Wwaf-1, p53, FasL, FasR, TNF-R1 또는 GAPDH에 대한 1차 항체로 4℃에서 밤샘 인큐베이트하였다. 면역반응도는 호스래디쉬 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 2차 항체(Pierce, Rockford, IL) 및 TMB 가용성 기질(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 측정하였다. 반응은 1M H2SO4을 첨가하여 중지시켰고, 스펙트라카운트 마이크로플레이트 판독기 (Packard Instrument Co., Meriden, CT)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이어서, 쿠마시 블루 염료로 부착된 세포를 염색하고, 용출된 염료의 흡광도를 측정하여 세포밀도를 측정하였다(de la Monte, 1999). MICE 지수는 동일한 배양 웰 내에서 측정된 TMB 및 쿠마시 블루 흡광도와의 산출된 비율이다. 16개의 복제(replicate) 배양 웰로부터 얻어진 결과의 평균 ±표준편차는 그룹간 통계적 비교를 위하여 사용되었다.
9L 세포를 24시간동안 다양한 농도의 티말파신으로 처리한 제1의 실험은 MTT 분석을 통하여 보여지는 바와 같이 유의하지 않은 세포 미토콘드리아 기능 감소를 보여주었다(도 1). 세포의 사멸은 아팝토시스(apoptosis) 또는 네크로시스 (necrosis)보다는 미토콘드리아 기능장애에 의하여 매개되기 때문에 미토콘드리아 기능을 측정하였다. 이러한 시험은, 생체내 결과와 일치하게, 티말파신이 9L 신경교아종 세포에 대한 직접적인 세포독성 효과를 가지지 않는다는 것을 나타내는, 비히클-처리 대조군 및 티말파신-처리 배양물에서의 생존성 및 MTT 활성의 유사한 수준을 입증하였다.(도 1) 유사한 결과가 293 신장 세포 및 SH-Sy5y 신경세포를 포함하는 다른 세포주에 대하여도 얻어졌다.(데이터는 제시하지 않음).
티말파신이 직접적인 세포독성 효과를 가지지 않았기 때문에, 티말파신이 신경교아종의 성장을 억제하기 위하여 작용할 수 있는 다른 가능한 기전을 조사하였다. 이러한 관점에서, 하우스키핑 유전자 발현을 대조군으로 하여, 아팝토시스 또는 세포생존을 촉진하는 유전자 생성물의 발현을 조사하였다. 이러한 연구는 복수의 복제 배양물로부터의 데이타를 산출하기 위하여 MICE 분석법을 사용하여 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 24시간 동안 티말파신을 처리하여, 비히클-처리 대조군과 비교하여 FasR (44.08%), FasL (65.89%) 및 TNF-R1 (22.18%)의 유의하게 증가된 수준의 결과(P<0.01; 도 2)를 얻었다. 이에 반하여, bcl-2 및 GAPDH 의 발현수준은 티말파신 처리에 의하여 크게 영향을 받지는 않았다. 연구는 293세포를 사용하여 또한 수행하였는데, bcl-2(36.67%;P<0.01)에서의 두드러진 감소를 증명한 반면, FasR, FasL 또는 TNF-R1 발현 수준에서는 눈에 띄는 변화는 입증하지 못하였다.(데이터는 제시하지 않음) 따라서, MICE 분석법의 결과는 두개의 세포주에서 티말파신은 아팝토시스에 의한 세포사멸에 대한 세포의 감수성을 증가시키기 위하여 상이한 경로를 통하여 작용한다는 것을 나타낸다.
아팝토시스에 대한 9L 및 293 세포의 감수성을 증가시키는 티말파신의 능력의 입증은 H2O2-유도 산화적 스트레스 테스트로 탐색하였다. MTT 분석법을 통하여 측정한 것과 같이, 24시간동안 티말파신으로 처리되고, 이어서, 24시간동안 H2O2로 처리된 9L 세포는, 24시간동안 H2O2만으로 처리된 9L 세포와 비교하여 생존성에 있어서 유의한 감소를 보였다(도 3). 티말파신 및 270 μM H2O2 으로 처리된 9L세포는, 270 μM H2O2 만으로 처리된 9L 세포와 비교하여 MTT를 통하여 보여지는 것처럼 미토콘드리아 기능에 있어서 26.6% 감소를 보였다(도 3). 분석에서 293세포를 타깃으로 사용하여 유사한 결과를 얻었다(데이타는 제시하지 않음).
실시예 2 : 그랜자임 -유도 아팝토시스 연구
이상에서 기술한 MICE 분석연구는 9L 신경교아종에서의 티말파신-유도 TNF-R1, FasL 및 FasR 발현을 입증하였다. 티말파신으로 처리되거나 (또는 처리되지 않은) 9L 신경교아종의 세포독성 T-림프구(cytotoxic T-lymphocyte,CTL)유도 아팝토시스에 대한 상이한 감수성을 측정하기 위하여, 9L 세포를 티말파신으로 24시간동안 급성적으로, 또는 72시간동안 만성적으로 처리하고, 이후, 이들을 다시 수합하고, 96-웰 블랙 플레이트에 재도입하고(7.5 x 105 세포/75 ㎕/웰), 37℃에서 1시간 또는 3시간 동안 20,000 유닛/㎖ 스트렙토리신 O (Streptolysin O, SLO)와 100ng 재조합 그랜자임 B (반응 부피 100㎕)에 노출시키는 실험을 수행하였다. SLO는 퍼포린 대신에 세포를 투과화 하기 위하여 사용하였고, 재조합 그랜자임 B는 분석을 표준화하기 위하여 사용하였다. 대조군 연구는 SLO, 그랜자임 B 또는 양쪽 모두를 생략한 평행 반응을 포함한다. 생존 세포 밀도는 상대 광 유닛을 배양 웰당 103 내지 106 세포 사이의 세포밀도와 연관시키는 넓은 선형 동적 범위를 갖는 ATPlite 분석법(Packard Instrument Company, Meriden, CT)을 사용하여 측정하였다.
생체내에서, 악성 종양 세포는 IL-2 및 IL-12와 같은 프로-염증성 사이토킨에 의하여 동원된 세포독성 T 세포 및 마크로파지에 의하여 사멸된다. 세포독성 T 세포는 표적 세포막에 구멍을 형성하는 퍼포린 및 표적 세포를 효소적으로 파괴하여 사멸시키는 그랜자임 B를 방출하여 사멸시킨다. 9L 신경교아종 세포의 T 세포 매개 사멸을 증진하는 티말파신의 잠재적 능력을 연구하기 위하여, 1시간 또는 3시간 동안 스트렙토리신 O (투과화 작용제)의 존재 또는 비존재하에서 티말파신- 또는 비히클-처리 9L 세포를 그랜자임 B와 함께 인큐베이트하는 생체외 분석을 수행하였다. ATP 루미네슨스(luminescence) 분석법을 사용하여 생존능을 측정하였고, SLO + 그랜자임 B 처리와 관련된 상대적 사멸을 측정하기 위하여 그룹비교를 행하였다. 이러한 연구는 SLO, 그랜자임 B 또는 비히클 단독에 노출된 티말파신-처리 배양물에 상대적으로 SLO + 그랜자임 B 에 노출된 티말파신-처리 배양물에서의 세포 생존능의 유의한 감소를 증명하였다(p<0.001; 도 4a 및 4b). 또한, SLO + 그랜자임 B 로의 1-시간 인큐베이션과 비교한 3-시간 후 수행된 분석에서 관찰되는 세포 손실의 실질적으로 더 높은 수준에 의하여 증명되는 바와 같이 그랜자임 B-매개 사멸은 시간에 걸쳐 진행되었다(도 4a 및 4b). 이에 반하여, 비히클-처리 대조군 배양물은 SLO, 그랜자임 B, 비히클 또는 SLO + 그랜자임 B에 노출되었을 때, 유사한 수준의 생존능을 나타내었다. 이러한 연구에서, 급성 (24시간) 티말파신 노출은, 분석전 72시간 동안(만성) 티말파신으로 인큐베이트된 배양과 비교하여 매우 유의한 정도의 그랜자임 B + SLO-매개 세포 사멸과 연관되었다.(도 4)
실시예 3: 1차 신경세포 배양물의 세포 생존능에 대한 티말파신의 영향
비-종양 뇌세포에 대하여 독성을 나타내지 않는 티말파신 용량을 선택할 수 있도록 하기 위하여 1차 대뇌피질 신경 배양물을 연구하였다. 이전의 연구에서 크리스탈 바이올렛(CV) 및 MTT 흡광도가 웰당 1 ×104 로부터 5 ×105 세포까지 세포밀도와 함께 직선적으로 증가하는 것을 나타냈기 때문에, 세포 생존능 및 미토콘드리아 기능은 크리스탈 바이올렛(CV) 및 MTT 분석법을 사용하여 측정하였다(de la Monte, 2001 & 2000).
96-웰 플레이트에서 티말파신의 연속 희석액(3.3 ×10-5M 내지 1 ×10-9M 범위의 최종농도)으로 처리한 1차 대뇌피질 신경세포는 사용된 실험적 용량에서 세포 생존능에 감소를 보이지 않았다. 사용된 티말파신의 가장 높은 농도(3.3 ×10-7M)에서는 MTT 분석을 통하여 보여지는 바와 같이 생존능에서 30%감소를 보였다. 그러나, 이러한 용량은 확립된 실험과 임상적 용량보다 높은 것이다.
실시예 4 : 랫트 신경교아종의 생체내 보조제(adjuvant)티말파신 처리
랫트 9L 신경교아종 세포를 ATCC(Washington, D.C.)으로부터 구입하여 병원균이 없음을 확인하였다. 세포를 5% 소태아혈청(fetal calf serum, FCS) 및 2 mM 글루타민이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)에서 유지하였다. 배지에는 항생제는 첨가하지 않았다. 주입하기 전에, 세포를 포스페이트 버퍼된 염수(PBS)로 세정하고, 배양 표면으로부터 분리하였으며, 0.25% 트립신/0.05% EDTA로 단세포 현탁액으로 분리하였다. 분리된 세포를 혈청이 없는 DMEM에서 3회 세척하였고, 최종적으로 5 ×106 생존세포/㎖의 밀도로 혈청이 없는 DMEM에 현탁하였다. 생존세포밀도는 트리판 블루 배제 및 헤모사이토미터 챔버를 사용하여 측정하였다.
실험은 비스클로로에틸 니트로스우레아(BCNU)처리와 비교하여, 티말파신 단독으로 혹은 BCNU와 조합하여 전달되면 신경교아종 존재량을 유의하게 감소시킬 수 있는지를 측정하기 위하여 디자인하였다. 신경교아종의 생체내 모델은 성체(250-300그램) 롱 에반스 랫트내에 발생시켰다. 랫트에, 50% 에탄올내에 100 mg/kg 케타민 및 100 mg/kg 크실라진(xylazine)을 함유하는 칵테일을 복막내 단일 주사하여 마취하였다. 마취후, 머리를 면도하고, 포비돈 요오드로 준비시킨 후, 랫트를 정위 헤드프레임에 위치시켰다. 중심선 절개를 행하고 3mm 천두공(burr hole)을 전두엽상에 천공하고, 9L 신경교종세포 현탁액 2㎕(전체 10,000세포)를 3.5 mm의 깊이로 위치한 26-게이지 니들이 부착된 헤밀턴 시린지를 사용하여 뇌안으로 직접 주입하였다. 니들을 제거한 후, 상처를 멸균한 염수로 세정하고, 동물을 프레임으로부터 옮기고, 피부를 재흡수 가능한 봉합사로 봉하였다. 랫트를 다시 그들의 우리에 두고 체중감소, 음식 및 물 섭취량 감소, 반-부전마비(hemiparesis), 발작 또는 무활동성을 포함하는 일정의 쇠약 징후를 관찰하였다. 일정 정도의 고통이 관찰되면 동물을 120 mg/kg 소디엄 펜토바비탈로 안락사시켰다. 동물을 매일 관찰하고 1주일간 체중을 측정하였다. 실험적으로, 10,000 9L 세포를 주입한 경우 이식 26일내에 100%의 동물이 사망하였다.
종양은 5일간 발달시킨 후, 항-종양 처리를 하였다. 랫트는 6개의 처리그룹으로 나누었다: 비히클 대조군; 저 티말파신(45 ㎍/kg); 고 티말파신(200㎍/kg); 저 티말파신 + BCNU; 고 티말파신 + BCNU; 및 BCNU (9.4 mg/kg). BCNU는 대뇌 내부 종양 접종후 6일에 단일 복막내 (intraperitoneal, I.P.)주사로 투여하였다. 티말파신으로 처리된 랫트는 종양세포 접종후 6일부터 시작하여 3일간 계속하여 티말파신 단일 I.P. 주사를 제공하였다. 종양 접종후 20일에 랫트를 희생시켰다. 랫트를 120 mg/kg 소디엄 펜토바비탈의 I.P. 주사에 의하여 죽였다. 뇌를 채취한 후 절개하여 히스토초이스(Amresco Co., Solon, Ohio)에 침지하여 고정하고, 파라핀 임베딩을 하였다. 종양 존재량을 전체 조직 블록 및 헤마톡시린 및 에오신으로 염색된 조직학적 섹션으로부터 평가하였다. 조직학적 섹션은 염증세포 침윤을 검출하기 위하여 면역 조직화학적 염색 연구에도 사용되었다.
신경교아종 모델 : 성체 롱 에반스 랫트의 대뇌내부에 접종된 10,000 9L 랫트 신경교아종 세포는 점진적으로 확대되어 21일 내에 랫트를 죽게하는 종양을 반복적으로 생산하였다. 시간에 따른 종양 성장의 진행 및 이와 관련된 임상적 징후는 다음과 같은 특징을 가진다: 1) 7일에 종양 직경 4 - 5 mm를 가지는 증가된 물리적 활성; 2) 14일에 종양 직경 7 - 8 mm의 하이퍼-반응성 및 빈번한 관련된 종양내 출혈; 및 3) 21일에 대뇌 헤르니아 형성에 이은 10-12 mm의 종양덩어리와 졸림(도 5). 헤마톡시린 및 에오신으로 염색된 조직학적 섹션으로부터 침윤성 악성 종양세포로 구성되는 커다란 종양 덩어리가 존재한다는 것을 확인하였다. 전체 대뇌를 통한 관상(coronal) 섹션의 조직병리학적 연구는, 9L 세포 접종 5일내에 종양세포가 표면 피질에 국부적으로 위치하고 연수를 덮는 작은 종양덩어리를 형성하였다는 것을 입증하였다. 14일내에 종양덩어리는 기초 신경절 및 측면 공동의 벽을 포함하는 더욱 깊은 구조에까지 확장하고, 중등도의 부종과 관련되나 헤르니아 형성은 하지 않는다 (중심선 구조의 이동). 21일에는, 종양 덩어리가 반대측면 대뇌반구에까지 확장하는 변동정도를 가지고 우측 전두엽을 거의 차지하였다(도 3). 광범위한 종양 덩어리는 두드러진 대뇌 부종, 출혈 및 헤르니아 형성과 관련이 있었다.
반(半)정량적 조직학적 등급 스케일을 사용하여 그룹간 비교를 위한 종양 존재량을 평가하였다: 0 - 치료, 잔존종양 없음; 1 - 표면 피질에 한정된 미세종양(<1 mm); 2 - 반구 단면 섹션의 25%이하를 차지하는 종양 덩어리(1-2 mm); 3 - 반구 단면 섹션의 50% 이하를 차지하고(2-3 mm) 및 깊은 구조에 까지 확장된 종양 덩어리; 4 - 헤르니아 형성과 함께 반구 단면 섹션의 50 - 90% 포함하는 광범위한 종양 존재량. 섹션은 처리그룹을 알려주지 않은 채 2명의 독립적 개인에 의해 동시에 코드화되고 등급분류하였다. 등급분류에서의 일관성을 확증하기 위하여 모든 샘플을 뒤섞고 코드 하에서 재-검토하였다.
신경교아종 생장에 대한 티말파신 및 BCNU 의 영향 (도 6): 예비연구에서 자발적 종양 거부가 관찰되지 않았기 때문에 모든 실험은 9L 신경교아종 세포 이식후 20일에 중단하였다. 비히클로 처리된 랫트는 종양 생장의 동일한 시간-의존적 진행 및 비-처리된 동물에서 관찰되는 임상적 징후를 나타내었다. BCNU로 처리된 랫트는 비히클 처리된 대조군과 비교하여 종양 덩어리에서 눈에 띄는 감소를 나타냈다. 그러나, 반응은, 명백히 어떠한 외견상 치료적 반응도 보이지 않는 거의 절반의 그룹에서 이질적이었다. 나머지 동물들에서, 종양 존재량은 50%이하로 감소하였다. 티말파신만으로 처리된 랫트는 대조군과 유사한 종양생장 및 임상적 쇠약율을 가졌다. 또한, 티말파신 처리 랫트는 대조군을 포함한 다른 모든 그룹과 비교하여 과도한 대뇌내 팽창 및 실질적으로 큰 정도의 헤르니아 형성(천두공을 통하여 뇌조직 돌출)을 가졌다. 이에 반하여, 티말파신 + BCNU 그룹은 종양 퇴행의 전체적인 증거를 가지는 가장 적은 전체 종양 존재량을 나타내었다. 종양 존재량을 평가하기 위한 표준화된 등급 스킴을 사용하여, BCNU 단독 처리가 비히클- 또는 티말파신(저 또는 고 용량)-처리(P<0.001)에 비하여 종양 존재량을 감소시킨다는 것과, 저(45㎍/kg) 또는 고(200 ㎍/kg) 용량 티말파신 + BCNU로 처리된 랫트는 가장 작은 평균종양 존재량을 확인하였다(도 6). 추가 연구는 티말파신 + BCNU 처리 그룹에서의 감소된 종양 존재량에 더하여 25% 치료율을 가지는 추가된 임상 및 병리학적 향상을 확인하였다(P<0.001; 도 7).
또한, 조직병리학적 분석은 종양 병소 내 및 이에 근접한 림프 단핵 염증성 세포의 존재를 증명하였다. 비히클처리 또는 BCNU-처리 랫트의 뇌에서, 침윤은 적고 혈관 주위 공간에 주로 분포하였다. BCNU와 함께 또는 함께하지 않은 티말파신-처리 랫트에서, 염증세포 침윤은 두드러지고, 인접한 실질 및 덮고 있는 연수 뿐만 아니라 종양 덩어리와도 연관이 있었다. 면역 조직화학적 염색 연구에 의해 세포는 T 림프구 및 마크로파지로 확인되었다. BCNU와 함께 또는 함께하지 않는 고-용량의 티말파신으로 처리된 랫트는 저-용량의 티말파신으로 처리된 랫트보다 더욱 큰 대뇌팽창을 가졌다. 조직학적 및 면역 조직화학적 염색 연구는 고 티말파신 그룹에서 종양 덩어리와 관련된 더욱 광범위한 부종 및 염증의 존재를 확인하였다.
참고문헌
Andreone P, Cursaro C, Gramenzi A, Margotti M, Ferri E, Talarico S, (2001) "In vitro effect of thymosin alpha I and interferon alpha on Thi and Th2 cytokine synthesis in patients with chronic hepatitis C" Journal of Viral Hepatitis 8: 194-201.
Aquafredda, D., Brain Tumor Treatmants: BCNU (Carmustine), http ://virtualtrials. com/ bcnu2 . cfm
Attia, W.Y., et al., Thymosin stimulates interleukin-6 production from rat spleen cells in vitro. Immunopharmacology, 1993. 26(2): p. 171-9.
Baxevanis, C.N., et al., Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother, 1994. 38(4): p. 281-6.
Baxevanis, C.N., et al., Enhancement of human T lymphocyte function by prothymosin alpha: increased production of interleukin-2 and expression of interleukin-2 receptors in normal human peripheral blood T lymphocytes. Immunopharmacol Immunotoxicol. 1990. 12(4): p. 595-617.
Beuth, J., J.M. Schierholz, and G. Mayer, Thymosin alpha(l) application augments immune response and down-regulates tumor weight and organ colonization in BALB/c-mice. Cancer Lett, 2000, 159(1): p. 9-13.
Billich, A., Thymosin alphal, SciClone Pharmaceuticals. Curr Opin Investig Drugs, 2002. 3(5): p. 698-707.
tig Drugs, 2002. 3(5): p. 698-707.
Bodey, B., et al.. Review of thymic hormones in cancer diagnosis and treatment. Int J Immunopharmacol, 2000. 22(4): p. 261-73.
Bodey, B Thymic hormones in cancer diagnostics and treatment. Expert Opin Biol Ther, 2001. 1(1): p. 93-107,
Burton, E.G. and M.D. Prados, Malignant gliomas. Curr Treat Options Oncol, 2000. 1(5): p. 459-68.
Chan, H.L., et al.. The efficacy of thymosin in the treatment of chronic hepatitis B virus infection: a meta-analysis. Aliment Pharmacol Ther, 2001. 15(12): p. 1899-905.
Chan, L-Y. (2001) "Thymosin alpha I for the treatment of chronic hepatitis B virus infection: a meta-analysis." Digestive Disease Week, Atlanta, Georgia, Abstract 2910
Cordero, O.J., et al., Prothymosin alpha enhances human natural killer cell cytotoxicity: role in mediating signals forNK activity. Lymphokine CytokineRes, 1992. 11(5): p. 277-85.
Dazzi, C., et alA sequential chemo-radiotherapeutic treatment for patients with malignant gliomas: a phase H pilot study. Anticancer Res, 2000. 20(IB): p, 515-8.
de la Monte, S.M., N. Ganju, and J.R. Wands, Microtiter immunocytochemical ELISA assay. Biotechniques, 1999. 26(6): p. 1073-6, 1078.
de la Monte, S.M., et al., Oxidative stress and hypoxia-like injury cause Aizheimer-type molecular abnormalities in central nervous system neurons. Cell Mol Life Sci. 2000. 57(10): p. 1471-81.
de la Monte, S.M., et al., Ethanol impairs insulin-stimulated mitochondrial function in cerebellar granule neurons. Cell Mol Life Sci, 2001. 58(12-13): p. 1950-60.
Dix, A.R., et al., Immune defects observed in patients with primary malignant brain tumors. J Neuroimmunol, 1999. 100(1-2): p. 216-32.
Garaci, E., Pica, F., Rasi, GPalamara, A. T., and Favalli, C. Combination therapy with BRMs in cancer and infectious diseases, Mech Ageing Dev. 96: 103-16. 1997.
Garaci, E., et al., Thymosin alpha I in the treatment of cancer: from basic research to clinical application. Int J immunopharmacol, 2000. 22(12): p. 1067-76.
Garbin, F., et al., Prothymosin alpha I effects, in vitro, on the antitumor activity and cytokine production of blood monocytes from colorectal tumor patients. Int J Immunopharmacol, 1997. 19(6): p. 323-32.
Knutsen, A.P., et al., Thymosin-alphal stimulates maturation ofCD34+ stem cells into CD3+4+ cells in an in vitro thymic epithelia organ coculture model. Int J Immunopharmacol, 1999.21(1): p. 15-26.
MacDonald, D.R., Temozolomide for recurrent high-grade glioma. Semin Oncol, 2001. 28(4 Suppl 13): p. 3-12.
Napolitano, M., et al., Treatment of supratentorial glioblastoma multiforme with radiotherapy and a combination ofBCNU and tamoxifen: a phase II study. J Neurooncol, 1999. 45(3): p. 229-35.
Nieder, C., A.L. Grosu, and M. Molls, A comparison of treatment results for recurrent malignant gliomas. Cancer Treat Rev, 2000. 26(6): p. 397-409.
Physician's Desk Reference, 4 8fh Ed. (1994) 651-3 "BiCNU".
Prados, M.D. and V. Levin, Biology and treatment of malignant glioma. Semin Oncol, 2000. 27(3 Suppl 6): p. 1-10.
Roth, W. and M. Weller, Chemotherapy and immunotherapy of malignant glioma: molecular mechanisms and clinical perspectives. Cell Mol Life Sci, 1999. 56(5-6): p. 481-506.
Sablotzki, A., et aL, Dysregulation of immune response following neurosurgical operations, Acta Anaesthesiol Scand, 2000. 44(1): p. 82-7.
Schinazi, RF, Sommadossi, J-P, and Thomas, HC, editors. International Medical Press, 379-383.Sherman, K.E. and Sherman, S.N. (1998) "Interferon plus thymosin alpha I treatment of chronic hepatitis C infection: a meta-analysis," in Therapies for Viral Hepatitis. Spangelo, B.L., et al., Interleukin-I beta and thymic peptide regulation of pituitary and glial cell cytokine expression and cellular proliferation. AnnN Y Acad Sci, 2000. 917: p. 597-607.
Sztein, M.B. and S.A. Serrate, Characterization of the immunoregulatory properties of thymosin alpha I on interieukin-2 production and interleukin-2 receptor expression in normal human lymphocytes. IntJImmunopharmacol, 1989. 11(7): p. 789-800.
Tijerina, M., et al., A novel thymosin peptide stimulates interleukin-6 release from rat C6 glioma cells in vitro. Neuroimmunomodulation, 1997. 4(3): p. 163-70.
Walker M.D., Green S.B., Byar D.P., Alexander EBatzdorf U., Brooks W.HHunt W.E., MacCarty C.S., Mahaley M.S., Mealey J., Owens G., Ransohoff JRobertson J.T..Shapiro W.R., Smith K.R., Wilson G.B., Strike TA randomized comparisons of radiotherapy and nitrosureas for the treatment of malignant glioma after surgery, NEJM, 303:1323-1329 1980.

Claims (6)

  1. 티모신-알파 1 (TA 1)를 포함하는, 신경교아종(glioblastoma)에 걸린 환자의 신경교아종 종양 존재량(tumor burden)을 감소시키기 위한 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 클로로에틸니트로스우레아를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 클로로에틸니트로스우레아는 BCNU인 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 BCNU는 150 - 200 mg/m2의 용량으로 투여되는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 티모신-알파 1은 0.001 mg/kg 체중/일 내지 10mg/kg 체중/일의 용량으로 투여되는 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 티모신-알파 1은 0.02 mg/kg 체중/일의 용량으로 투여되는 약학적 조성물.
KR1020107002516A 2001-12-10 2002-12-10 티모신-알파 1에 의한 신경교아종의 치료 KR20100029844A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33714901P 2001-12-10 2001-12-10
US60/337,149 2001-12-10

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2004-7008939A Division KR20040091611A (ko) 2001-12-10 2002-12-10 티모신-알파 1에 의한 신경교아종의 치료

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20100029844A true KR20100029844A (ko) 2010-03-17

Family

ID=23319320

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107002516A KR20100029844A (ko) 2001-12-10 2002-12-10 티모신-알파 1에 의한 신경교아종의 치료
KR10-2004-7008939A KR20040091611A (ko) 2001-12-10 2002-12-10 티모신-알파 1에 의한 신경교아종의 치료

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2004-7008939A KR20040091611A (ko) 2001-12-10 2002-12-10 티모신-알파 1에 의한 신경교아종의 치료

Country Status (22)

Country Link
US (1) US20060166870A1 (ko)
EP (1) EP1461063B1 (ko)
JP (1) JP2005516910A (ko)
KR (2) KR20100029844A (ko)
CN (1) CN1615147A (ko)
AT (1) ATE356628T1 (ko)
AU (1) AU2002357115B2 (ko)
BR (1) BR0214848A (ko)
CA (1) CA2469595A1 (ko)
DE (1) DE60218896T2 (ko)
DK (1) DK1461063T3 (ko)
EA (1) EA005822B1 (ko)
ES (1) ES2283653T3 (ko)
IL (1) IL162434A0 (ko)
MX (1) MXPA04005585A (ko)
NO (1) NO20042927L (ko)
NZ (1) NZ533942A (ko)
PL (1) PL370829A1 (ko)
PT (1) PT1461063E (ko)
SI (1) SI1461063T1 (ko)
UA (1) UA77999C2 (ko)
WO (1) WO2003049697A2 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2288118B1 (es) 2006-05-10 2008-11-01 Bcn Peptides, S.A. Procedimiento para sintetizar timosinas.
CN108226016A (zh) * 2018-01-12 2018-06-29 浙江普罗亭健康科技有限公司 肿瘤免疫细胞亚群精准分型的质谱流式检测试剂盒
CN112147326B (zh) * 2020-09-04 2022-04-08 北京大学 一种肿瘤免疫细胞亚群分型精准检测试剂盒

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4079127A (en) * 1976-10-28 1978-03-14 Board Of Regents Of The University Of Texas Thymosin alpha 1
US4116951A (en) * 1977-04-22 1978-09-26 Hoffmann-La Roche Inc. [Asn2 ]-thymosin α1 and analogs thereof
US4148786A (en) * 1978-06-26 1979-04-10 American Home Products Corporation Analgesic polypeptide
DE2919592A1 (de) * 1979-05-15 1981-01-15 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur herstellung von thymosin- alpha 1 und derivaten davon
IT1238231B (it) * 1989-12-18 1993-07-12 Consiglio Nazionale Ricerche Impiego di immunomodulanti come agenti sinergici di chemioterapici nella terapia dei tumori
FR2793684B1 (fr) * 1999-05-17 2001-08-10 Ethypharm Lab Prod Ethiques Utilisation de microspheres biodegradables liberant un agent anticancereux pour le traitement du glioblastome, procede de preparation de ces microspheres et suspension les contenant
US6462017B1 (en) * 2000-05-01 2002-10-08 Sciclone Pharmaceuticals, Inc. Method of reducing side effects of chemotherapy in cancer patients

Also Published As

Publication number Publication date
IL162434A0 (en) 2005-11-20
CA2469595A1 (en) 2003-06-19
DK1461063T3 (da) 2007-05-21
KR20040091611A (ko) 2004-10-28
SI1461063T1 (sl) 2007-08-31
PL370829A1 (en) 2005-05-30
MXPA04005585A (es) 2005-03-23
ATE356628T1 (de) 2007-04-15
EA200400755A1 (ru) 2004-12-30
WO2003049697A2 (en) 2003-06-19
NO20042927L (no) 2004-09-09
DE60218896T2 (de) 2007-09-20
UA77999C2 (en) 2007-02-15
CN1615147A (zh) 2005-05-11
EA005822B1 (ru) 2005-06-30
ES2283653T3 (es) 2007-11-01
AU2002357115B2 (en) 2007-12-13
NZ533942A (en) 2007-01-26
EP1461063A2 (en) 2004-09-29
DE60218896D1 (de) 2007-04-26
AU2002357115A1 (en) 2003-06-23
EP1461063A4 (en) 2005-08-31
BR0214848A (pt) 2004-11-09
WO2003049697A3 (en) 2004-01-15
EP1461063B1 (en) 2007-03-14
US20060166870A1 (en) 2006-07-27
JP2005516910A (ja) 2005-06-09
PT1461063E (pt) 2007-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101757523B1 (ko) 구획 증후군의 치료에 사용하기 위한 항분비 단백질
JP4153564B2 (ja) 薬物性腎障害または薬物性肝障害の予防及び治療組成物
Ahmad et al. Inhibition of tyrosine kinase signaling by tyrphostin AG126 downregulates the IL-21/IL-21R and JAK/STAT pathway in the BTBR mouse model of autism
CN110934879B (zh) 靶向组织微环境中衰老细胞的抗衰老药物d/a及其应用
Vyas et al. A second-generation proteasome inhibitor and doxorubicin modulates IL-6, pSTAT-3 and NF-kB activity in MDA-MB-231 breast cancer cells
ES2800162T3 (es) Uso terapéutico de moduladores funcionales negativos de la eritropoyetina
KR102128003B1 (ko) 분리된 미토콘드리아를 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물
SK279960B6 (sk) Liečivo zložené z prvej a druhej účinnej látky
KR20100029844A (ko) 티모신-알파 1에 의한 신경교아종의 치료
US10729747B2 (en) Methods and compositions for modulating myofibroblast activities
ES2235200T3 (es) Mutante de hgf y su uso como agente anticanceroso.
CN114732816B (zh) 2-芳基-1,3二氢苯并咪唑衍生物在制备治疗肾癌药物中的用途
JP7376678B2 (ja) Ｍ１マクロファージを有効成分として含む癌細胞標的型薬物送達体及び光熱治療効果増進用組成物
Cheng et al. Sustained developmental endothelial locus-1 overexpression promotes spinal cord injury recovery in mice through the SIRT1/SERCA2 signaling pathway
Simmons 5-Ht1f receptor agonism for the treatment of spinal cord injury
ES2234605T3 (es) Utilizacion de beta-interferon en la fabricacion de un medicamento destinado al tratamiento del sarcoma de ewing y eoe.
Xu et al. Resveratrol promotes the repair of spinal cord injury by modulating M1/M2 polarization via NF-κB and STAT3 signaling pathway
Desai et al. Noncanonical Nf-κB Activation by Icariin-Triggered CEBP-β/G-CSF Axis Confers Neuroprotection in Ischemic Optic Neuropathy
JP2017535607A (ja) アポエクオリン含有組成物および神経細胞の炎症を治療するためのアポエクオリンの使用方法
Enkhbaatar et al. OPEN ACCESS EDITED BY
KR20220071357A (ko) 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 조성물
Karagiannis et al. Neuroprotective properties of erythropoietin in cerebral ischemia
CA2531878A1 (en) Therapeutic use of g53135-05(fgf-20) in radiation protection
Hélène Exercise as an Anti‐inflammatory Therapy for Cancer Cachexia: A Focus on
Tweed Role of the TNFα/NF-κB Pathway in Sensory Neurone Survival during Peripheral Nerve Regeneration

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application