UA77999C2 - Thymosin-alpha 1 for treatment of malignant glioblastoma - Google Patents

Description

Опис винаходу

Дана заявка стверджує вигоду попередньої |заявки 60/337149, зареєстрованої 10 грудня 2001р.|. 2 Гліобластома є найбільш широко розповсюдженим первинним злоякісним новоутворенням ЦНС і служить причиною майже 7595 випадків захворювань. Хоча в їх лікуванні й спостерігається стійкий прогрес завдяки вдосконаленням у нейро-візуалізації, мікрохірургії й опромінення, гліобластоми залишаються інкурабельними (Мебопаїйа, 20001; Вигіоп, 2000; Ргадовз, 2000). Середня передбачувана тривалість життя становить менше одного року із часу постановки діагнозу, а п'ятирічна виживаність після агресивної терапії, включаючи резекцію 70 великої пухлини, становить менше 1095 (Вигіоп, 2000; Міеадг, 2000; Мароїйапо, 1999; Юазлі, 2000). Гліобластоми є причиною смерті через швидкий, агресивний й інфільтративний ріст у мозку. Інфільтративний характер росту відповідає за неоперабельну природу цих пухлин. Гліобластоми досить стійкі також до опромінення й хіміотерапії, і тому швидкості появи посттерапевтичних рецидивів високі. Крім того, імунна реакція на пухлинні клітини здебільшого неефективна при повному знищенні пухлинних клітин, які залишаються після резекції й радіотерапії (Коб, 1999; Ріх, 1999; Забіоїгкі, 2000).

Злоякісні клітини гліоми уникають детектування імунною системою хазяїна, продукуючи імуносупресивні пептиди, які ослабляють Т-клітинну проліферацію й продукцію 1І--2 (Оіх, 1999). Центральна нервова система є до певної міри імунопривілейованою, що дозволяє злоякісним клітинам рости невиявленими. Пошук ефективного способу терапії пацієнтів із глобластомами усе ще триває зараз. Імунотерапія або терапія за допомогою рекрутменту імунної системи для боротьби із цими пухлинними клітинами досліджена на багатьох моделях. Серед багатьох зв'язаних з імунною системою компонентів, які вивчені на їх здатність боротися зі злоякісними пухлинами, тимозинова фракція 5 (ТЕ5), тимозин «1 (тималфазин), інтерферон-о, (ІЕМ-о) і інтерлейкін-2 (1І-2).

Кармустин (бісхлоретилнітрозосечовина, ВСМО або ВіІСМО) є хіміотерапевтичним агентом із сімейства хлоретилнітрозосечовин, яке включає й інші хіміотерапевтичні агенти, такі, як хлорозотоцин (ОСМИ) (Ападетгзоп, с 1975), ломустин (ССМІ) (Сапег, 1968), німустин (Зайо, 1980) і ранімустин (Зекідо, 1979). (У

Хлорнітрозосечовини використали як монотерапію при первинних пухлинах мозку протягом багатьох років; однак історична статистика, очевидно, не завжди підтверджувала ефективність цих сполук як єдиного агента при пухлинах мозку (наприклад, Адцагедаа й ін.). Комбінація кармустин плюс радіотерапія давала скромний виграш у тривалій (18-місячній) виживаності пацієнтів, уражених злоякісною гліобластомою, у порівнянні з однією Ф радіотерапією, хоча відмінності між кривими виживаності були незначними, на рівні 0,05 (УгаїКег, 1980). Ге)

Тимозин «41 (тималфазин) являє собою пептид з 28 амінокислот, синтетичну форму природної сполуки, яка - . . 2, : (22) знайдена в системі кровообігу (Водеу, 2000; Водеу, 2001). Тималфазин стимулює ріст і диференціювання тимоцитів, продукцію 1-2, рецепторів Т-клітинного 1-2, ІЄМ-у і ІМЕ-о; (Апагеопе, 20001; Зліеїп, 1989; Кпиївеп, ї- 1999; Зрапдеїюо, 2000; Тіегіпа, 1997; С«загріп, 1997; Айіа, 1993; Согдего, 1992; Вахематівз, 1994 й 1990; чн

Веш, 2000). Тималфазин застосовувався в клінічних випробуваннях для лікування інфекції, яка викликається вірусом гепатиту В (І-Є Спап, 2001), гепатиту С (Н.Г. Спап, 2001; Зпептап, 1998; Зспіпагі), карцином легені або голови й шиї, меланоми (Водеу, 2000 й 2001; Сагасі, 2000) і синдрому набутого імунодефіциту (АЮ) (Війісп, 2002). Багатообіцяючі результати цих досліджень разом з доказом зниженої Т-клітинної « 20 сприйнятливості гліобластом привели до даної роботи, яка оцінює потенційну терапевтичну вигоду імунотерапії шв с тималфазином при лікуванні злоякісних гліом і яка визначає механізми, за якими тималфазин проявляє свою протипухлинну дію. 1» Гліобластоми є високозлоякісними новоутвореннями центральної нервової системи, які майже завжди мають фатальний результат у межах 12 місяців від постановки діагнозу. Недавні дослідження показали, що імунотерапія 75 З використанням прозапальних цитокінів, таких, як І/-2 або 1-12, може збільшити виживаність пацієнтів із -І гліобластомами. Тимозин 41 (тималфазин) являє собою пептид тимусу, який діє як імуномодулятор, збільшуючи продукцію 1-2 і Т-клітинну проліферацію. Дана робота демонструє значно знижене пухлинне навантаження й

Ш- посилену відповідь лімфо-мононуклеарних запальних клітин у пацієнтів, яких лікували комбінацією

Ге) тималфазин-ВСМИ, у порівнянні з усіма іншими групами. Експерименти іп міго продемонстрували, що обробка 5р тималфазином не мала прямого впливу на життєздатність або мітохондріальну функцію в культивованих клітинах ік 9. Однак обробка тималфазином приводила до значного підвищення рівнів експресії проапоптотичних генів,

Ге) включаючи Разі, Раз й ТМЕо-ІК (65,8995, 44,0895 й 22,1895, відповідно). Крім того, обробка тималфазином робила клітини 9! більш чутливими до окисного стресу, так що звичайні не летальні дози перекису водню вбивали 30-50905 клітин 9, які були оброблені тималфазином. Подальші дослідження виявили, що тималфазин підсилює чутливість клітин 9! до В- (Т-клітинного) гранзиму або опосередкованої ВСМО загибелі. Результати показують, що тималфазин підсилює опосередковану хлоретилнітрозосечовиною ліквідацію гліобластоми іп мімо і що

Ф, тималфазин опосередковує свої ефекти шляхом активації проапоптотичних механізмів, роблячи злоякісні клітини ко більш чутливими до окисного стресу й знищення за допомогою гранзиму В (Т-клітинного) або хіміотерапії.

Фіг.1 показує, що тималфазин мінімально впливає на життєздатність і мітохондріальну функцію клітин 91. во Фіг.2 показує посилену експресію проапоптотичних генів у клітинах 9, які піддані впливу тималфазину протягом 72 год.

Фіг.3 показує, що тималфазин (ТНУ) робить гліобластомні клітини 9. більш чутливими до знищення окисним стресом або хіміотерапією з ВСМИ.

Фіг.4 показує, що тималфазин робить гліобластомні клітини 9 більш чутливими до опосередкованого 65 гранзимом В знищення; панель А показує вплив на клітини, піддані впливу наповнювача або тималфазину (24год. - гострий, 72год. - хронічний), потім розділені для додаткової обробки наповнювачем протягом Ігод., і панель

(В) показує вплив на клітини, піддані впливу наповнювача або тималфазину (24год. - гострий, 72год. - хронічний), потім розділені для додаткової обробки наповнювачем протягом Згод.

Фіг5 показує часовий хід розвитку клініко-нейропатологічних аномалій після імплантації 10000 гліобластомних клітин 9. у праву лобову частку головного мозку дорослих щурів І опд Емапзв.

Фіг.6 показує вплив ВСМИ і комбінації ВСМО нтималфазин (ТНУ) на прогресування гліобластоми іп мімо.

Фіг.7 показує знижене гліобластомне навантаження й 2595 вилікування в щурів, оброблених комбінацією

ВСМИжтималфазин (ТНУ).

У цей час знайдено, що тималфазин може потенціювати опосередковане імунною системою знищення клітин 70 гліобластоми, що уможливлює його застосування як адюванта в комбінації із хлорнітрозосечовиною як хіміотерапевтичної сполуки ефективної антигліобластомної терапії.

Винахід застосовний до пептидів тималфазину (ТАТ), включаючи природний ТАТ, а також синтетичний ТА! і рекомбінантний ТА1, який має амінокислотну послідовність природного ТАТ, амінокислотну послідовність в основному подібну до нього або його скорочену форму і їх біологічно активні аналоги, які мають заміщену, /5 укорочену, подовжену, замінену або по-іншому модифіковані послідовності, які мають біологічну активність, по суті подібну до активності ТАТ, наприклад, пептид, що є похідним ТАТ, який має достатню амінокислотну гомологію з ТАТ, так що він функціонує по суті тим же самим чином й в основному з такою ж активністю, як ТА1.

Дослідження іп мімо з використанням експериментальної моделі гліобластоми демонстрували, що в той час як обробка з ВСМИ повинна значно знижувати пухлинне навантаження, відповіді були неоднорідними, у багатьох 2о випадках не дають детектованих реакцій. Однак обробка комбінацією тималфазин-ВвВСМИ забезпечувала значний терапевтичний виграш як відносно зниження середнього пухлинного навантаження, так і вилікування пухлин приблизно в 2595 випадків. Опосередковані комбінацією тималфазин-ВСМИ зниження пухлинного навантаження були асоційовані зі збільшенням лімфо-мононуклеарних клітинних інфільтратів всередині й навколо злоякісних клітин у мозку. У випадках, коли не було знайдено залишкової пухлини, були визначені тільки тканина сч ов ГлЛІОТИЧНОГО рубця й слабке запалення, асоційовані з початковими клітинними інфільтратами. Вилікування гліобластоми спостерігали приблизно в 2595 груп, оброблених низькими дозами й високими дозами комбінації іо) тимал фазин-ВСМИ.

Досить несподівана знахідка полягала в тому, що групи, які одержували тільки тималфазин, харчувалися так само, як контрольна, або гірше. Часто мозки оброблених тималфазином щурів були більше опухлими й виходили ду зо за межі ділянки через запалення й набряк, що з'єднався із масою пухлини, яка росте. Щодо цього примітний той факт, що щури, оброблені більш низькою концентрацією комбінації тималфазин-ВСМИу, мали кращі показники, ніж Ме ті, які були оброблені більш високою концентрацією тималфазиниВСМИ, оскільки загибель пухлинних клітин була зу однаковою у двох групах, але набряк й утворення грижі переважали в групі, яка одержувала більш високу концентрацію тималфазину. в

Отже, обробка одним тималфазином не знищувала гліобластоми й, можливо, була пошкоджувальною завдяки /-|че надлишковому набряканню за відсутності супутньої загибелі клітин. Результати далі дозволили припустити, що тималфазин має слабке або не виявляє прямого цитотоксичного вітливу на клітини злоякісних пухлин і що додаткова загибель пухлинних клітин, яка спостерігається при обробці комбінацією тималфазин-ВСМИ, була опосередкована непрямими діями тималфазину. У мозку оброблених тималфазином щурів виявлення підвищеної « 420 Щільності лімфо-мононуклеарних запальних клітин, які були охарактеризовані як переважно Т-клітини й ш

Гані макрофаги, дозволило припустити, що тималфазин відіграє важливу роль у рекрутингу ефекторних імунних клітин у злоякісних пухлинах. )» Була проведена серія експериментів іп міго, щоб визначити механізм, за яким тималфазин опосередковує свої антигліобластомні впливи. Початкові дослідження визначили, що тималфазин не має прямої цитотоксичної дії на клітини гліобластоми. Те ж саме було правильно для інших типів клітин, включаючи клітини нейробластоми й -І постмітотичні кортикальні нейрони. Щоб розширити ці дослідження заявники оцінювали, чи впливає несприятливо тималфазин на функцію клітин й, можливо, робить їх більш чутливими до апоптозу. Щоб це здійснити, заявники і досліджували рівні експресії генів, які діють на користь апоптозу й виживаності, а також гена росту й (Те) "хаускипінг" гена. Ці дослідження виявили, що обробка тималфазином протягом 24 або 72 год приводить до значного підвищення рівня проапоптотичних генів у клітинах гліобластоми 91. Подібні результати були отримані ее, для нейробластомних клітин зубу. У клітинах 293 відзначений той же феномен, за винятком того, що механізми,

Ге) які діють на користь виживаності, були інгібовані, і проапоптотичні гени не піддавалися впливу. Ці знахідки припускають, що хоча тималфазин не має прямої цитотоксичної дії, він може робити клітини більш чутливими до цитотоксичних агентів шляхом посилення базальної експресії проапоптотичних генів або ослаблення базальної експресії генів виживаності. Щоб досліджувати цю гіпотезу, заявники визначили, чи є оброблені тималфазином клітини більш чутливими до окисного стресу або до загибелі, опосередкованої хлоретилнітрозосечовиною.

Ф, Дослідження показали, що після обробки тималфазином протягом 24 або 72год. сублетальні концентрації ко перекису водню або ВСМИО вбивали 2595 або 4095, відповідно, клітин 9. Отже, принаймні деякі з ефектів тималфазину швидше були опосередковані його дією на пухлинні клітини, ніж були тільки результатом імунної бор модуляції й рекрутменту Т-клітин і макрофагів.

Були встановлені імуномодулюючі властивості тималфазину й споріднених молекул. їх головними ефектами є посилення продукції прозапальних цитокінів і проліферації лімфоцитів. Активовані Т-лімфоцити вбивають клітини-мішені за допомогою взаємодій генів Разі -РазК і шляхом активації системи перфорин-гранзим. Виявлення підвищеної експресії Разі/БРазкК в оброблених тималфазином гліобластомних клітинах 9 припускає, що б5 активовані Т-клітини могли б ефективно вбивати ці клітини-мішені за допомогою взаємодій генів Раві -Разк.

Однак, використовуючи новий аналіз іп міїго, створений із застосуванням 51 О (агента, що сприяє проникності) і рекомбінантного гранзиму В замість Т-клітин. заявники продемонстрували, що оброблені тималфазином гліобластомні клітини 9 швидко гинули, піддаючись впливу 5 О і гранзиму В. Ці знахідки припускають, що тималфазин може ефективно сприяти опосередкованій імунною системою загибелі гліобластомних клітин декількома шляхами: (1) збільшенням базальних рівнів експресії проапоптотичних генів, роблячи клітини більш чутливими до окисного стресу і цитотоксичних/хіміотерапевтичних агентів; (2) збільшення рівнів РавзкК, який міг би взаємодіяти з Базі на активованих Т-клітинах і привести до прискореного апоптозу; і (3) рекрутингом активованих Т-клітин і макрофагів і посиленням опосередкованої перфорином-гранзимом загибелі пухлинних клітин-мішеней. Крім того, результати чітко вказують на те, що обробка тималфазином гліобластом ефективна при 7/0 Використанні в комбінації із хлоретилнітрозосечовинами, але не як єдиний агент. Результати забезпечують істотний доказ того, що тималфазин, введений поодинці, може бути шкідливим через посилене набрякання й запалення при мінімальній загибелі пухлинних клітин. Отже, найбільш підходящою роллю для тималфазину при терапії глюобластом є роль як допоміжного агента для посилення імунної відповіді хазяїна й знищення залишкових пухлинних клітин, які пережили загальноприйняту хіміотерапію.

На закінчення робота, описана в контексті, демонструє, що тималфазин має антигліобластомну дію, яка опосередковується декількома шляхами, включаючи: (1) модуляцію генів проапоптозу/виживаності, що приводить до підвищеної чутливості пухлинних клітин до окисного стресу або цитотоксичних/хіміотерапевтичних агентів; (2) активацію опосередкованих РазкК-Базі каскадів загибелі імунних клітин; і (3) посилення чутливості клітин-мішеней до опосередкованої перфорином-гранзимом загибелі імунних клітин. Однак терапевтичні ефекти го тималфазину у відношенні його антигліобластомних властивостей залежали від супутнього введення хлоретилнітрозосечовин, підкреслюючи тим самим, що тималфазин був би більш підходящим як ад'ювантний імуномодулятор, а не певний протипухлинний агент. Очевидно також, що при комбінуванні з іншими хіміотерапевтичними сполуками тималфазин проявляв би подібні позитивні ефекти в полегшенні зменшення пухлинного навантаження, прогресування й рецидивів при значно більш високих швидкостях, ніж ні, що с г спостерігаються тепер при загальноприйнятій хіміотерапії.

Винахід застосовний до нативного (тобто до природного) тималфазину, а також до синтетичного тималфазину іо) й рекомбінантного тималфазину, який має амінокислотну послідовність нативного тимозину, амінокислотних послідовностей в основному подібних до нього, або скороченої його послідовності і їх біологічно активних аналогів, які мають заміщені, укорочені, подовжені, замінені або іншим способом модифіковані послідовності, Ге!

Зо які мають біологічну активність, по суті подібну до активності тималфазину.

Виділення, характеристика й застосування тималфазину описане, |наприклад, у патентах 5 4079127, Ме 4353821, 4148788 й 4116951). Кількість тималфазину, необхідна для того, щоб домогтися потрібного ступеня Ге! потенціювання хіміотерапевтичного ефекту ВСМИ, може бути визначена за допомогою рутинних експериментів титрування дози. Було знайдено, що тималфазин безпечний для людини при введенні в таких високих дозах, як - 1бмг/кг маси тіла/день. Переважна доза тималфазину знаходиться в діапазоні 0,001мг/кг маси тіла/день до ї- 1бмг/кг маси тіла/день, доза приблизно 0,02мг/кг маси тіла/день є найбільш переважною.

Хлорнітрозосечовина може бути введена в дозі приблизно 90-250мг/м2 за допомогою ін'єкції, перорально, за допомогою біодеградованої капсули або якими-небудь іншими звичайними способами, відомими фахівцям. «

Вона може бути дана як однократна доза або розділена на щоденні ін'єкції, такі, як 75-100мг/м 2, на два послідовних дні. Наступне дозування від початкової дози повинно бути скоректовано відповідно до - с гематологічної відповіді пацієнта на попередню дозу. Аналіз крові повинен реєструватися щотижня, і повторні курси не повинні даватися раніше б тижнів через те, що гематологічна токсичність є відстроченою й )» кумулятивною. Переважною хлоретилнітрозосечовиною є та, яка може бути введена в дозі 150-200мг/м 2 внутрішньовенно кожні б тижнів. ВСМО може бути також введена шляхом імплантації біодеградованих капсул (наприклад, Сііадеї, сзційога Рнагтасеціїсаіз) безпосередньо в ложі пухлини. Якщо введення відбувається за -| допомогою біодеградованої капсули, тималфазин, який співводиться, можна зручно об'єднати з ВСМИ безпосередньо в капсулі. -і не . й

Приклад 1: обробка тимозином «4/1 ліній пухлинних клітин 91 й 293 се) Лінії пухлинних клітин: щурячі клітини гліобластоми 9 і клітини нирки людини 293 підтримували в с 50 модифікованому Дюльбекко середовищі Ігла (ОМЕМ) з додаванням 595 ембріональної телячої сироватки (ЕС5), 2ММ І-глутаміну й 100мМмкМ не незамінних амінокислот (Сірсо-ВКІ, (згапа Івіапа, ММ). Всі клітинні лінії

Ме) витримували при 372 у зволоженій атмосфері, яка містить 595 СО 5. Клітинні лінії були отримані від

Американської колекції типів культур і були сертифіковані як вільні від патогенів.

Обробка тимозином АЇ: для гострої обробки клітини, висіяні в 9б-лункові планшети при щільності клітин 29 20000клітин/лунку, обробляли 109М тималфазину протягом 24год. Клітини, оброблені хронічно тималфазином, гФ) вирощували у флаконах й обробляли кожні 24год. із 10 9М тималфазину (доданого у свіжому середовищі) т протягом всієї обробки (З дні). Крім того, для визначення кривої доза-відповідь на тималфазин для клітин 9. клітини обробляли розведеними за серіями кількостями тималфазину, одержуючи концентрації тималфазину в діапазоні від ХОмМкМ до 0,022мкМ. 60 Перекис водню використали, щоб індукувати у клітинах окисний стрес. Клітини, які були оброблені тималфазином або наповнювачем протягом 24год, були піддані дії перекису водню з діапазоном концентрацій від

ОмМкМ до 1,8мкМ і потім оцінювалися на життєздатність і мітохондріальну функцію, використовуючи аналізи з барвниками кристалічний фіолетовий (СМ) і тіазоліл голубий (МТТ), як описано. В експериментах, у яких розведені за серіями кількості тималфазину вводили в клітини, постійну кількість 1,9ММ перекису водню бо використали для обробки клітин. Для клітин 9 була побудована крива перекису водню для того, щоб визначити точну концентрацію перекису водню, якою обробляти клітини.

МтТ-аналізи проводили на клітинах ліній 9І. й 293, щоб визначити вплив обробки тималфазином й індукованого перекисом водню окисного стресу на мітохондріальну функцію клітин. Після обробки додавали 1Омкл МТТ у кожну лунку, що містить 100мкл середовища. Планшети інкубували з барвником МТТ у термостаті на 372С впродовж 15хв.-Тгод. залежно від типу клітин. Потім середовище видаляли, і в кожну лунку додавали 200мкл підкисленого ізопропанолу. Планшети струшували при кімнатній температурі доти, поки не відбувався лізис, потім зчитували при 54Онм на приладі РасКага ЗресігаСоипім,

Кристалічний фіолетовий (СМ) також використали для фарбування клітин в 9б-лункових планшетах. Після 70 відділення середовища в кожну лунку додавали 20мкл кристалічного фіолетового й струшували при кімнатній температурі протягом 1Охв. Потім планшети промивали декілька разів теплою водою й сушили. У кожну лунку додавали 100-200мкл (залежно від щільності клітин) ЗФР об./195 додецилсульфат натрію (505). Планшети інкубували при кімнатній температурі на вібраторі доти, поки клітини не були достатньо лізовані. Планшети зчитували при 540нм, щоб визначити відмінності в життєздатності клітин між різними досліджуваними групами.

Мікротитраційні імуноцитохімічні імуноферментні (МІСЕ) аналізи (де іа Мопієе, 1999) були проведені на клітинах 91 й 293. Клітини висівали в 96-лункові планшети, обробляли 109М тималфазином протягом 24год., фіксували гістологічно протягом ночі перед дослідженням, використовуючи МІСЕ-аналіз. Фіксовані клітини просочували 0,05950 сапоніном у трис-забуференому фізіологічному розчині (ТВ5) (5ОММ трис, рН7,5, 0,995 хлористий натрій) блокували з З,урегріоск-ТВ5 (Ріегсе, Коскіога, І) і потім інкубували протягом ночі при 49 з первинними антитілами до антигену ядра проліферуючої клітини (РСМА), БсіІ-2, п21/Л//маї-1, рб53, Равзі, Равзк,

ТМЕ-КІ або САРОН, кожне розведене до 0,5-1мкг/мл в ТВ5, що містить твін-20 й 0,595 бичачий сироватковий альбумін (ТВЗТ-ВЗА). Імунореактивність визначали, використовуючи пероксидазу хрону, кон'юговану вторинним антитілом (Ріегсе, Косктога, І) і розчинний субстрат тетраметилбензидин (ТМВ) (Ріегсе, КосКога, І).

Реакції зупиняли додаванням 1М сірчаної кислоти й вимірювали поглинання при 45Онм на приладі для зчитування с мікропланшет Зресігасоцпі (Раскага Іпвігитепі Со., Мегідеп, СТ). Потім щільність клітин вимірювали о фарбуванням прирослих клітин з барвником кумасі голубий і визначенням поглинання елюйованого барвника (де 1а Мопіе, 1999). Індекс МІСЕ склав розраховане співвідношення поглинання ТМВ і кумасі голубого, визначене в тій же культуральній лунці. Використали середнє значення - стандартне відхилення (50) результатів, отриманих від 16 повторюваних культуральних лунок, для міжгрупових статистичних порівнянь. Ме.

Первинні експерименти, у яких клітини 9 були оброблені протягом 24год. різними концентраціями б тималфазину, показали незначне ослаблення функціонування клітинних мітохондрій, як видно за МТ Т-аналізами (Фіг.1). Вимірювали мітохондріальну функцію, оскільки клітинна загибель може бути опосередкована скоріше б» дисфункцією мітохондрій, а не апоптозом або некрозом. Дослідження демонстрували подібні рівні життєздатності р. й МТТ-активності в обробленому наповнювачем контролі й оброблених тималфазином культурах (Фіг.1), вказуючи 32 на те, що тималфазин не має прямої цитотоксичної дії на клітини гліобластоми 9І., що співпадало з результатами - іп мімо. Подібні результати були отримані й у відношенні інших клітинних ліній, включаючи ниркові клітини 293 і нервові клітини ЗН-Зу5Бу (дані не наведені).

Оскільки тималфазин не має прямої цитотоксичної дії, були досліджені інші потенційні механізми, за якими « тималфазин може функціонувати, щоб інгібувати ріст гліобластом. Щодо цього досліджували експресію генних продуктів, які активують або апоптоз, або виживаність клітин, використовуючи експресію гена "хаускіпинг" як З с контроль. Дослідження проводили в 96-лункових планшетах, використовуючи мікротитраціоний імуноцитохімічний

І» імуноферментний (МІСЕ) аналіз, щоб генерувати дані від множинних повторюваних культур. Обробка тималфазином протягом 24 год привела до значно підвищених рівнів БазікК (44895), Базі (65,8995) і ТМЕ-К1 (22,18906) відносно оброблених наповнювачем контролів (р«0,01; Фіг.2). На відміну від цього, рівні Бсі-2 й ЗАРОН незначно піддавалися впливу обробки тималфазином. Дослідження проводилися також з використанням це. клітин 293, які демонстрували значне зниження рівня Бсі-2 (36,6790; р «0,01), але незначні зміни в рівнях -і експресії ГазК, Базі або ТМЕ-К1 (дані не наведені). Таким чином, результати МІСЕ-аналізів вказують, що на двох лініях клітин тималфазин діє за різними шляхами, щоб підвищити чутливість клітин до клітинної загибелі іс, шляхом апоптозу.

Ге) 50 Підтвердження здатності тималфазину підвищувати чутливість клітин 91 й 293 до апоптозу було отримано при дослідженні індукованого перекисом водню окисного стресу. Як визначено за МІ Т-аналізами, клітини 9І, ще оброблені тималфазином протягом 24год. і згодом перекисом водню протягом 24год., дійсно виявляли значну втрату життєздатності в порівнянні із клітинами 9, обробленими тільки перекисом водню протягом 24год. (Фіг.3). Клітини 9, оброблені тималфазином й 27О0мкМ перекисом водню, демонстрували зниження 22 функціонування мітохондрій на 26,696, як видно за МТТ-аналізом, у порівнянні із клітинами 91, обробленими

ГФ) тільки 270мкМ перекисом водню (Фіг.3). Подібні результати були отримані при використанні клітин 293 в аналізах як мішеней (дані не наведені). де Приклад 2: дослідження індукованого гранзимом апоптозу

Дослідження за допомогою МІСЕ-аналізу, описані вище, демонстрували індуковану тималфазином експресію 60 ТМЕ-Б1, Базі й БазЕБ у клітинах 9 гліобластом. Для того щоб визначити диференціальну чутливість гліобластомних клітин 9, оброблених (чи ні) тималфазином, до апоптозу, індукованого цитотоксичними

Т-лімфоцитами (СТІ), проводили експериментальні аналізи, у яких клітини 9 обробляли тималфазином як гостро протягом 24год., так і хронічно протягом 72год., після чого вони були вирощені, пересіяні в 96б-лункові чорні планшети (7,5х1ОУклітин/75мкл/лунку) і піддані дії 20000одиниць/мл стрептолізигчу О (5/0) плюс 10Онг бо рекомбінантного гранзиму В (реакційний об'єм 100мкл) протягом 1 або Згод. при 372С. Використали 510 замість перфорину, щоб зробити клітини проникними, а рекомбінантний гранзим В використали для стандартизації аналізу. Контрольні дослідження включали паралельні реакції, у яких 5І 0, гранзим В або обидва були виключені.

Щільність життєздатних клітин вимірювали, використовуючи АТФ люмінесцентний аналіз АТРІйе (РаскКага

Іпвіготепі Сотрапу, Мегідеп, СТ), який мав широкий лінійний динамічний діапазон, що корелює відносні світлові одиниці із щільностями клітин між 103 до 105 клітин на культуральну лунку.

Злоякісні пухлинні клітини знищуються іп мімо цитотоксичними Т-клітинами й макрофагами, які обновляються за допомогою прозапальних цитокінів, таких, як 1-2 й 1-12. Цитотоксичні Т-клітини знищують пухлинні клітини шляхом вивільнення перфорину, який викликає утворення отворів у мембранах клітин-мішеней, і гранзиму В, який 70 викликає ензиматичну деструкцію й загибель клітин-мішеней. Для вивчення потенційної ролі тималфазину в посиленні опосередкованого Т-клітинами знищення гліобластомних клітин 9Ї, використали аналіз іп міо, у якому оброблені тималфазином або наповнювачем клітини 91. інкубували із гранзимом В в присутності або за відсутності стрептолізину О (агента, що сприяє проникності) протягом 1 або Згод. Життєздатність вимірювали, використовуючи АТФ люмінесцентний аналіз, і всередині групи проводили порівняння, щоб визначити відносну 75 загибель, асоційовану з обробкою 5І Онгранзим В. Дослідження демонстрували значні зниження життєздатності клітин в оброблених тималфазином культурах, які були піддані впливу 5І Окнгранзим В, відносно оброблених тималфазином культур, підданих впливу 510, гранзиму В або наповнювача окремо (р«0,001; Фіг.АА і 48). Крім того, опосередкована гранзимом В загибель прогресувала в часі, як доведено істотно більш високими рівнями втрат клітин, які спостерігалися в аналізах, проведених після тригодинної в порівнянні з годинною інкубацією з З О-нгранзим В (Фіг.4А і 48). На відміну від цього, оброблені наповнювачем контрольні культури мали подібні рівні життєздатності при впливі ЗІ 0, гранзиму В, наповнювача або 5І Оггранзим В. У цих дослідженнях гострий (24год.) вплив тималфазину асоціювався із значно більш високими ступенями опосередкованої гранзимом В-5І 0 клітинної загибелі, у порівнянні з культурами, інкубованими з тималфазином протягом 72год. (хронічний вплив) перед аналізами (Фіг.4). Га

Приклад 3: вплив тималфазину на життєздатність клітин первинних культур нервових клітин

Досліджували первинні культури кортикальних нейронів, щоб полегшити відбір доз тималфазину, які не були б і9) токсичні для нормальних клітин мозку. Життєздатність клітин і мітохондріальну функцію вимірювали, використовуючи аналізи із кристалічним фіолетовим (СМ) і МТТ, оскільки попередні аналізи показали, що поглинання СМ і МТТ зростає лінійно зі збільшенням щільності клітин від 1 х107 до 5х10? клітин на лунку (деїа. с)

Мопіев, 2001 й 2000). Фу

Первинні клітини кортикальних нейронів, оброблені в 9б-лункових планшетах серійними розведеннями тималфазину (кінцеві концентрації знаходилися в діапазоні від 3,3 х10? до 1-109М), не виявляли зниження Ме) життєздатності клітин у використаних експериментальних умовах. Найвища використана концентрація їм- тималфазину (3,3х1077М) виявила З09о зниження життєздатності, як видно із МТ Т-аналізу. Однак ця доза вище, ніж встановлені експериментальна й клінічна дози. -

Приклад 4: ад'ювантна обробка тималфазином іп мімо щурячої гліобластоми

Клітини гліобластоми щура 9 одержували від Американської колекції типів культур (У/азпіпдіоп, ОС) і сертифікували як такі, що не містять патогенів. Клітини підтримували в модифікованому Дюльбеко середовищі «

Ігла (ОМЕМ) з додаванням 595 ембріональної телячої сироватки (ЕС5) і 2мММ глутаміну. Антибіотики не додавали в середовище. Перед ін'єкцією клітини промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином (ЗФР), З с відшаровували від поверхні культур і роз'єднували в одноклітинні суспензії з 0,2595 трипсином/0,0590

І» етилендіамінтетраоцтовою кислотою (ЕОТА). Розділені клітини промивали З рази безсироватковим середовищем

ОМЕМ й, нарешті, суспендували в безсироватковому середовищі ОМЕМ при щільності 5х109 життєздатних клітин/мл. Щільність життєздатних клітин визначали, використовуючи витиснення трипанового голубого й -1 15 гемоцитометричну камеру.

Експерименти проводили, щоб визначити, чи міг тималфазин, який доставляється окремо або в комбінації з - І ВСМИ, значно знижувати гліобластомне навантаження в порівнянні з обробкою бісхлоретилнітрозосечовиною с (ВСМО). Модель гліобластоми іп мімо генерували в дорослих щурів лінії опо Емапз (250-300г). Щурам давали наркоз за допомогою однократної внутрішньо очеревинної ін'єкції коктейлю, який містить 10Омг/кг кетаміну й (се) 50 100мг/кг ксилазину в 5095 етанолі. Після анестезії голову оббривали й підготовляли з повідонйодидом, і щура с поміщали в стереотактичну рамку для голови. Робили розріз по середній лінії, трепанаційний отвір Змм був просвердлений над фронтальною часткою, і 2мкл суспензії клітин гліоми 9 (загальне число клітин 10000) ін єкували безпосередньо в мозок, використовуючи шприц Натійоп, з'єднаний з голкою 26 розміру, що поміщається на глибину 3,5мм. Після видалення голки рану промивали стерильним фізіологічним розчином, 59 тварину звільняли від рамки, і шкіру скріплювали швами, які розсмоктуються. Щурів повертали в їх клітки й гФ) спостерігали за появою будь-яких ознак погіршення, включаючи втрату маси, зменшене споживання корму й води, 7 геміпарез, епілептичні напади або пасивність. При будь-яких наявних муках тварин піддавали евтаназії за допомогою 120Омг/кг пентобарбіталу натрію. Тварин спостерігали щодня й зважували щотижня. Емпірично ін'єкція 10000 клітин 9. вбивала 10095 тварин протягом 26 днів імплантації. бо Пухлині давали розвиватися протягом 5 днів з наступною протипухлинною обробкою. Щурів ділили на шість груп обробки: контроль із наповнювачем; низька доза (45мкг/кгь) тималфазину; висока доза (20Омкг/кг) тималфазину; низька доза тималфазинує«ВСМИ; висока доза тималфазинує«ВСМИ; і лише ВСМИ (9,4мг/кг).

Вводили ВСМИ у вигляді однократної внутрішньоочеревинної (ір) ін'єкції на день 6 після інтрацеребральної інокуляції пухлини. Щури, оброблені тималфазином, одержували однократні внутрішньоочеревинні ін'єкції бо тималфазину протягом З послідовних днів, починаючи із дня 6 після інокуляції пухлинних клітин. Щурів забивали на день 20 після інокуляції пухлини. Щурів вбивали за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції 12Омг/кг пентобарбіталу натрію. Мозки збирали, готовили гістологічні секції, фіксували зануренням в Нізіоспоісе (Атгезсо Со., Зо|оп, Опісо) і обробляли для заливання парафіном. Пухлинне навантаження оцінювали за великими блоками пухлини й гістологічними секціями, пофарбованим гематоксиліном й еозином. Гістологічні секції використали також у дослідженнях з імуногістохімічним фарбуванням, щоб детектувати запальні клітинні інфільтрати.

Модель гліобластоми: інтрацеребральна інокуляція дорослих щурів Гопд Емапз з 10000 клітин щурячої гліобластоми 9. відтворювано давала пухлини, які прогресивно збільшувалися й викликали загибель у межах 21 7/0 дня. Залежне від часу прогресування пухлинного росту й асоційовані клінічні симптоми були охарактеризовані в такий спосіб: (1) підвищена фізична активність при діаметрах пухлини 4-5мм на день 7; (2) гіперреактивність на день 14 при діаметрах пухлини 7-8 мм і асоційована внутрішньопухлинна геморагія, яка часто зустрічається; і (3) напівнепритомний стан при пухлинних масах 10-12мм, що супроводжується утворенням церебральної грижі на день 21 (Фіг.5). Гістологічні секції, пофарбовані гематоксиліном й еозином, підтвердили наявність більших /5 пухлинних мас, які складаються з інфільтративних злоякісних пухлинних клітин. Гістопатологічні дослідження корональних секцій по всьому мозку демонстрували, що в межах 5 днів інокуляції клітин 9 пухлинні клітини утворювали невеликі пухлинні маси, які були локалізовані в поверхневому корковому шарі й перекриваючій м'якій і павутинній оболонці. У межах 14 днів пухлинні маси поширюються на більш глибокі структури, включаючи базальні ганглії й стінки бічного шлуночка, і асоційовані з помірним набряком, але не утворенням грижі (зсувом структур середньої лінії). На день 21 пухлинні маси захоплюють майже повністю праву лобову частку зі змінними ступенями поширення в протилежну півкулю (Фіг.3). Велика пухлинна маса була асоційована з вираженим церебральним набряком, геморагією й утворенням грижі.

Напівкількісна гістологічна градуйована шкала була використана, щоб оцінити пухлинне навантаження для міжгрупових порівнянь: 0 - вилікування, немає залишкової пухлини; 1 - мікроскопічна пухлина («1мм), обмежена сч ов поверхневим корковим шаром; 2 - пухлинна маса, яка займає менше ніж 2595 поперечної секції півкулі (1-2мм); З - пухлинна маса, яка займає до 5095 поперечної секції півкулі (2-3мм) і поширюється в глибокі структури; 4 - о); масивне пухлинне навантаження із включенням 50-9095 поперечної секції півкулі, з утворенням грижі. Секції були закодовані й сортувалися одночасно двома різними фахівцями без знання групи обробки. Для підтвердження сумісності при сортуванні всі зразки були перемішані й знову переглянуті під кодом. Ге! зо Впливи тималфазину й ВСМИ на ріст гліобластоми (Фіг.б) Оскільки в попередніх дослідженнях спонтанні відторгнення пухлин не спостерігалися, всі експерименти закінчувалися на день 20 після імплантації клітин Ме гліобластоми 9І-. Щури, оброблені наповнювачем, мали таке же залежне від часу прогресування пухлинного росту (зу й клінічні симптоми, які спостерігалися в необроблених тварин. Щури, оброблені ВСМУ, мали значне зниження пухлинної маси відносно оброблених наповнювачем контролів. Однак відгуки були неоднорідними при майже ї- половині групи, що не проявляє очевидної терапевтичної відповіді. У тварин, що залишаються, пухлинні ї- навантаження знижувалися до 5095. У щурів, оброблених тільки тималфазином, спостерігався ріст пухлини й темпи клінічного погіршення, які були подібні до таких в контролі. Крім того, оброблені тималфазином щури мали граничне інтрацеребральне набрякання й істотно більш високий ступінь утворення грижі (тканина мозку, яка виступає через трепанаційний отвір) у порівнянні з усіма іншими групами, включаючи контролі. На відміну від « цього, група, яка одержувала тималфазин-ВСсМИ, мала найнижче навантаження об'ємистої пухлини з явним шв с доказом пухлинної регресії. Використовуючи стандартизовану кваліфікаційну схему для оцінки пухлинного навантаження, заявники демонстрували, що обробка однією ВСМИ значно знижувала пухлинне навантаження )» відносно обробки наповнювачем або тималфазином (низькою або високою дозою) (р«0,001) і що щури, оброблені або низькою (45мкг/кг), або високою (200мкг/кг) дозою тималфазину«ВСМИ, мали найнижчі середні пухлинні навантаження (Фіг.б6). Подальші дослідження підтверджували додане клінічне й патологічне поліпшення -і із зниженими пухлинними навантаженнями плюс 2595 частота вилікування в групі, обробленій тималфазином-ВСМИ (р«0,001;Фіг.7).

Ш- Гістопатологічний аналіз також демонстрував присутність лімфо-мононуклеарних запальних клітин, які со прилягають до пухлинного вогнища або знаходяться у його межах. У мозку оброблених наповнювачем або оброблених ВСМІ щурів інфільтрати були слабкими й в основному розподіленими в навколосудинному просторі. ік У щурів, оброблених тималфазином з ВСМИ або без неї, запальні клітинні інфільтрати були помітні й асоційовані

Ге з пухлинними масами, а також із прилеглою паренхімою й покриваючою м'якою й павутинною оболонкою.

Дослідження імуногістохімічного фарбування ідентифікували клітини як Т-лімфоцити й макрофаги. Щури, оброблені високою дозою тималфазину з ВСМИ або без неї, мали більш сильне церебральне набрякання, ніж в ЩУРИ, оброблені низькою дозою тималфазину. Дослідження гістопатологічного й імуногістохімічного фарбування підтвердили наявність більш великого набряку й запалення, асоційованого з пухлинними масами в групі, яка

Ф; одержувала високу дозу тималфазину. ка Посилання:

Р.Апагеопе, С.Сигваго, А.ОСгатеп?і, М.Магооці, Е.Регїті, 5. Таіагісо. "Іп міго еПесі ої (путовіп 51 апа іпіепегоп 9, 60 оп ТАТапа ТнНа2 суїокКіпе зупіпезів іп райепів м/йй спгопіс НПераййів С". доигпа! ої Міга! Нерайііз, 8 (2001) стор.194-201.

О.Адцатедаа, Вгаіп Титог Тгеаїтепів: ВСМИ (Сагтизвііпе), пЕр://мігшайнаїІв.сопт/рспи2. ст

МУМ.АЩШа й ін. Тпутовіп звійтиціайевз іпіепеиКіп-б ргодисіоп їйот гай зрієеп сеїЇв іп омійо.

Іпттипорпагтасоїіоду, 26(2), 1993, стор.171-179.

С.М.Вахемапіз й ін., Іпдисіоп ої ІутрпокКіпе-асіїмайєей Кійег асіїмйу іп тісе Бу ргооїйутовіп у. Сапсег Іттипої. 65 ІттипоїНег., 38(4), 1994, стор.281-286.

С.М.Вахемапів й ін., Еппапсетепі ої питап Т Іутрпосуїе Топсіоп Бу ргоїйутовзіп о: іпсгеазей ргодисіп ої іпсіепеиКіп-2 апа ехргезвіоп ої іпіегпеиКіп-2 гесеріоге іп погта! питап регірпега! Біоод Т ПутрПосуїез.

Іттипорпагтасо). Іттипоїйохісо)!., 12(4), 1990, стор.595-617.

У.Вешй, 9У.М. ЗспіегпоІ2 й .Мауег, Тпутозвіп со, (І) арріїісайоп апдтепів іттипе гезропзе апа дом/п-гедціа(евз їШтог меїдні апа огдап соІопігайоп іп ВАГ В/с-тісе. Сапсег Гек. 159(1), 2000, стор.9-13.

А.ВІійіси, Тпутозвзіп о, ЗсіСіопе Рпагптасеціїса!Ів. Сит. Оріп. Іпмевіїд. Огидв, З(5), 2002, стор.698-707.

В.Водеу й ін., Кеміем/у ої (Шутіс ПпПогтопез іп сапсег аіадповзіз апа ігеайтепі. пі. У.Іттипорпагтасо)., 22(4), 2000, стор.261-273.

В.Водеу, Тпутіс поптопевз іп сапсег аіадповіїсз апа ігеаїтепі. Ехреті. Оріп. Вісі. ТНег., 1(1), 2001, стор.93-107. 70 Е.С.Випіоп й М.О.Ргадовз, Маїїдпапі діотав. Сигт. Тгеаї. Оріїопе Опсої., 1(5), 2000, стор.459-468.

Н.С.Спап й ін. Тпе ейісасу ої (Шутовіп іп їйе (ігеайтепі ої сПпгопіс Пераїйів В »умігиз іптесіоп:. а теїа-апаїузів. АІїтепі. Рнагтасої. Тпег., 15(12), 2001, стор.1899-1905.

І-М. Спап, "Тпутовіп 01 ог (Ше (геайтепі ої спгопіс Пераїйів В мігив іпіесійоп: а тейа-апаїувів".

Оідевіїме Оізеазе УУеек, АЦапіа, Сеогадіа, Абзігасі 2910 (2001).

О.). Согдего й ін. Ргоїутовіп А еппапсез Питап пайга! КіПег сеї суюіохісйу: гоіе іп теадіайпо зідпа!з Тог МК асіїмну. ГутрпокКіпе СуїокКіпе Кез., 11(5), 1992, стор.277-285.

С.ра?і й ін., А зедиепііа! спето-гадіоіпегареціїс ігеайтепі ог райепів м/йй таїїдпапі діотавз: а рпазе

Ії ріої зішау. Апііїсапсег Кез., 20(18), 2000, стор.515-518.

З.М. де Іа Мопіє, М.Сапіиш й 9У.К.МУапаз, Місгощшег іттипосуїоспетіса! ЕГІЗА аззау. Віоїесппідцев, 26(6), 1999, стор.1073-1076, 1078.

З.М. ае а Мопіе й ін., Охідайме вігезв апа пурохіа-іКе іпішгу сацве АІгПеітег-уре тоіесшаг арпогтаїйіез іп сепіга! пегусив зувіет пешгопв. СеїЇ. Мої. І їТе 5сі., 57(10), 2000, стор.1471-1481.

З.М. де Іа Мопіе й ін., Е(Шапої ітраїгв іпзиїїп-вітианвеа тіоспопагіа! Тпсіоп іп сегереМаг дгапше пешйгопв. СеїЇ. Мої. І іТе 5сі., 58(12-13), 2001, стор.1950-1960. са

А.К.Оіх й ін., Іттипе детесів орзегуей іп райепів м/йй ргітагу таїїдпапі Бгаійп (штогв. У. Меигоїттигпої., (5) 100(1-2), 1999, стор.216-232.

Е.Сагасі, Р.Ріса, С.Казі, А.Т.Раїатага й С.Рамаїйї. СотБіпайоп (Пегару м/йп ВАКМ5 іп сапсег апа іптесііоиз дізеазез, Месі. Адеїіпо Оем. 96, 1997, стор.103-116.

Е.Сагасі й ін., Тпутовіп о іп (Ше ігеайтепі ої сапсег: їйот бавіс гевзеагсп (о сіїпіса! арріїсайоп. Ії Ф) дАтптипорнатттпасої., 22(12), 2000, стор.1067-1076. Фо

Е.Сагріп й ін., Ргоїйутозіп 51 еПесів, іп мійго, оп (Ше апійитог асіїміу апа суїоКкіпе ргодисіоп ої біос топосуїез їот соіогесіа! Штог райепів. пі. 9.Іттипорпагтавсо)., 19(6), 1997, стор.323-332. ме)

А.Р.Кпиїзеп й ін., Тпутовіп о вітиціагев таїйцигайоп ої СОЗ4-- віет сеїЇїв іп СОЗна сеїЇїв іп ап іп мйго М

Іутіс ерійеїйа огдап сосийиге тоае|. Іпії. ОУ.Іттипоргагтасої., 21(1), 1999, стор.15-26. 3о р.в.Масбопаїйа, Тептогоіотіде їог геситепі підп-огаде дііота. Зетіп. Опсої., 28(4, З,иррі. 13), 2001, стор.3-12. в

М.Мароїйапо й ін. Тгеайтепі ої зиргаїепіогіаї діюобіазіота тиййогте м/йй гадіоїйегару апа а сотбіпайоп ої ВСМІ апа (атохітеп: а рпазе ІІ зішау. 9У.Мейгоопсо)., 45(3), 1999, стор.229-235.

С.Міедег, А.Г.гови й М.Моїїв, А сотрагізоп ої ігеайтепі гезцйв ог гесипепі таїїдпапі діотав. Сапсег «Щ

Тгеаї. Кем., 26(6), 2000, стор.397-409.

РНузісіап'є ОезК Кеїегепсе, 48-е вид., (1994) с.651-653 "ВІСМИ". З с М.О. Ргадоз й УМ. І еміп, Віоіоду апа ігеаїтепі ої таїїдпапі дііота. Зетіп. Опсої., 27(3, З,иррі. 6), 2000, стор.1-10.

І» МУ.Коїй й М.УмеПег, Спетоїпегару апа іттипоїпегару ої таїїдпапі діюота: тоіесціаг теспапізтз апа сіїпіса регзресіїмев. СеїЇ. Мої. І Те Зсі., 56(5-6), 1999, стор.481-506.

А.Заріоїкі й ін. Оузгедціайоп ої іттипе сгезропзе оом/пуд пейгозигодіса! орегайоп5. Асіа

Апаевіпезіої. Зсапа., 44(1), 2000, стор.82-87. це. В.БГ.Зепіпа?гі, 2-Р.Зоттавдозвззві й Н.С.Тнотаз, ред., Іпіегпайопа! Меадісаї! Ргезв, с 379-383. -І К.Е.Зпегтап й 5.М.Зпегтап. "Іпіепегоп різ їутовіп с ігеайтепі ої спгопіс Пераїйів С іпіескйопо а теадіа-апаіузів", в ТПегаріевз ог Міга! Нераїйів. В.І.Зрапдею й ін., Іпіепеийкіп-1В апа (Путіс рерііде гедшайоп ої орішйагу апа діа! сеї суюКіпе ехргеззіоп апа сейшаг ргоїйегайоп. Апп. МУ Асай. озоі., со 070 917, 2000, стор.597-607. с М.В.Злеїп й 5.А.Зеїтаїе, СПагасіегігайоп ої (пе іттипогедшіаюгу ргорегіевз ої (путовіп 51 оп іпіепеийкіп-2 ргодисіоп апа іпіегіеиКіп-2 гесеріог ехргезвіоп іп погта! Пйпитап Іутрпосуїев. пі 3). Іттипорпагптасої., 11(7), 1989, стор.789-800.

М.Тіегпа й ін. А помеі! (Шйутозіп реріїде віітиціацгевз іпіепеиКіп-б геіеазе їот гаї Сб діота сеїв іп міго. Меогоїттипотоаціайоп, 4(3), 1997, стор.163-170. гФ) М.О.М/аїКег, 5.8.ОСгееп, О.Р.Вуаг, Е.АІехапдег, О.Ваїгдоп, М/.Н.ВгоокК5, МУ. Е.Нипі, С.5.МасСапу, з М.5.Мапнаїеу, 9У.МеаІеу, С.Омжепв, У.Капзопоїй, .Т.Кобрегізоп, МУК. Зпаріго, К.К.Зтіфй, О.В.ММівоп, Т.5Кіке. А гапдотілед сотрагізоп ої гадіоїегару апа пйгозоцгеаз їог Ше ігеайтепі ої таїдпнапі діота айег зигдегу, во МЕМ, 303, 1980, стор.1323-1329.

Claims (5)

Формула винаходу

1. Спосіб лікування гліобластоми, згідно з яким хлоретилнітрозосечовину вводять в комбінації з пептидом 695 тимозин- 1 (ТАТ). йй

2. Спосіб за п. 1, де хлоретилнітрозосечовина означає ВСМИ.

3. Спосіб за п. 2, де ВСМИ вводять у дозі 150-200 мг/м2.

4. Спосіб за п. 1, де пептид ТАТ означає тимозин- а 1 і вводять його в дозі від 0,001 мг/кг маси 95 тіла/день до 10 мг/кг маси тіла/день.

5. Спосіб за п. 4, де тимозин- а 1 вводять в дозі 0,02 мг/кг маси тіла/день. се (о, Ге) Фо Ге) ча м. « З с 1» -І -І (се) о 50 (Че) (Ф, ко бо б5